WO2018009006A1 - 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질 - Google Patents

알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질 Download PDF

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WO2018009006A1
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조양호
박소영
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Definitions

  • the present invention relates to a mutant immunoglobulin binding protein with increased alkali resistance, and more particularly, in the domain A of Staphylococcus protein A or a functional variant thereof, an amino acid at a specific position is mutated and compared to a parent molecule. It relates to immunoglobulin binding proteins that exhibit increased chemical stability at alkaline pH values.
  • the monoclonal antibody (monoclonal ant ibody) is secreted into the medium during the culture of genetically engineered animal cells, and is present in a very low concentration of a mixture of proteins secreted from the cell itself and proteins in the medium. Therefore, removal of impurities other than the monoclonal antibody of interest is an important step in antibody production.
  • the monoclonal antibody isolation and purification process is mainly performed by af ini ty chromatography using protein A, an antibody-affinity ligand (ant ibody af f ini ty l igand) capable of selectively recovering only monoclonal antibodies from the medium. It is used.
  • cleaning-in-place is performed to remove various contaminants such as nucleic acids, lipids, proteins and microorganisms remaining in the resin.
  • NaOH is one of the most widely used resin cleaners.
  • protein-based purification resins are vulnerable to alkalis, making it difficult to use NaOH. Since protein A is relatively stable in alkaline conditions, it is washed with NaOH, but protein improvement studies have been conducted to develop protein A, which is stable even in alkaline conditions, in order to increase the cleaning rate.
  • Protein A is a cell surface protein of Staphylococcus aureus and has high homology. It consists of five domains (E, D, A, B, C domains).
  • the domain has a structure consisting of three anti-parallel helices and two loops located in the middle of the helix, and consists of about 58 amino acid residues.
  • Zurrich modeled the albumin binding domain (streptococcal albumin—binding domain) derived from the Streptococcal strain, replacing all Asn residues with other amino acids based on the information that Asn residues are sensitive to alkali.
  • streptococcal albumin—binding domain derived from the Streptococcal strain, replacing all Asn residues with other amino acids based on the information that Asn residues are sensitive to alkali.
  • a protein having high stability and thermal stability against 0.5N NaOH was obtained (Gul ich et. Al., J Biotechnol, 28 (2), 169-178 (2000)).
  • Lin-Hult developed Protein A, which maintains its structural stability even with repeated alkali treatment using a bypass mutagenesis approach.
  • F30 of the Z domain (G29A variant of the B domain) is present in the third helix position, which is a residue that does not interfere with antibody binding but affects structural stability. Indeed, when F30 was substituted with Ala, the affinity of IgG was similar to that of the wild type, but the structural stability was reduced, resulting in weak alkali resistance.
  • Z (F30A) as a template and replacing Asn residues with other residues other than Asn present in the same position of other domains (E, D, A, C domains), that is, N23T, N28A, N6A, and N11S. When it did, it confirmed that stability increased in alkaline conditions.
  • Korean Patent No. 10-1307651 describes a mutant immunoglobulin binding protein that is changed to N3A / N23T or N3A / N6D / N23T of B domain or Z domain and has increased chemical stability at alkaline pH compared to the parent molecule. .
  • US9051375 describes mutant sequences with increased alkali resistance by replacing histidine, serine, aspartic acid, and threonine at three positions of N3, N6, and N23 of the Z domain.
  • US Patent Publication No. US20100048876 describes a chromatographic matrix comprising a C domain and a wild-type C domain from which the residues 3 to 6 are removed from the N terminus, which increases stability to alkalis. It was.
  • Korean Patent Registration No. 10-1464040 describes affinity chromatography ligands and matrices of two to five C, B or Z domains containing three or four consecutive amino acid deletions starting at the first amino acid from the N-terminus.
  • an object of the present invention is characterized in that the amino acid residues at any one or more positions selected from the group consisting of the 18th, 36th, 43rd, and 52th in the protein or functional variant thereof defined by SEQ ID NO: 2 are mutated.
  • an immuno-binding protein called immunoglobulin.
  • Another object of the present invention is to provide a multimer comprising the mutated protein units and comprising two or more repeat units.
  • the immunoglobulin - to provide a polynucleotide comprising a base sequence expensive Im "the binding protein or the oligomer
  • the immunoglobulin - is to provide a polynucleotide comprising a base sequence expensive Im "the binding protein or the oligomer
  • Another object of the present invention is to provide a vector containing the 3 ⁇ 4 Li nucleotides will be.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a matrix for chromatography in which a plurality of ligands comprising the immunoglobulin-binding protein are coupled to a solid support.
  • the present invention provides a protein or functional variant thereof defined in SEQ ID NO: 2 at any one or more positions selected from the group consisting of 18th, 36th, 43rd and 52nd Provided are immunoglobulin proteins characterized by mutated amino acid residues.
  • the present invention provides a multimer comprising the mutated protein unit and comprising two or more repeating units.
  • the present invention provides a polynucleotide comprising a base sequence encoding the immunoglobulin-binding protein or the multimer.
  • the present invention provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention provides a transformant transformed with the vector.
  • the present invention provides a matrix for chromatography in which a plurality of ligands comprising the immunoglobulin-binding protein are coupled to a solid support.
  • a method for isolating immunoglobulins in which a mutant protein according to claim 1 or a multimer according to claim 6 or a matrix according to claim 11 is used.
  • a chromatography method in which one or more target compounds are separated from a liquid by adsorption of a mutant protein according to system 1 or a multimer according to claim 6 or a matrix according to claim 11. do.
  • an immunoglobulin protein isolated by the above method is provided.
  • a target compound separated by the above method there is provided.
  • the present invention is immunoglobulin characterized in that the amino acid residue at any one or more positions selected from the group consisting of the 18th, 36th, 43rd and 52nd in the protein or functional variant thereof defined in SEQ ID NO: 2 Provide binding proteins. example.
  • the inventors have molecularly designed a recombinant protein variant in which the amino acid of the A domain of Protein A is substituted with another amino acid, using the protein engineering method and the genetic engineering method to obtain the variant from the transformed cell, and the alkaline conditions of the variant.
  • the present invention was completed by comparing and examining the antibody binding activity under the following conditions.
  • protein is used interchangeably with “polypeptide” or “peptide” and refers to a polymer of amino acid residues, for example as commonly found in natural proteins.
  • nucleic acid or “polynucleotide” refers to a deoxyribonucleotide or ribonucleotide in the form of a single- or double-strand.
  • known analogues of natural nucleotides that are localized to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides are also included.
  • expression refers to the production of a protein or nucleic acid in a cell.
  • the one letter (three letter) amino acid means the following amino acids in accordance with standard abbreviation provisions in the field of biochemistry:
  • amino acid letter amino acid position (amino acid letter) (amino acid letter)
  • amino acid letter amino acid previously indicated at the corresponding amino acid position of the naturally occurring polypeptide is replaced with the amino acid indicated later.
  • N23R indicates that the asparagine corresponding to 23 of the native polypeptide is substituted with arginane.
  • the '()' sign means 'or'.
  • the present invention amino acid at any one or more positions selected from the group consisting of 18, 36, 43 and 52 in the amino acid sequence derived from at least one domain selected from the k, B, C or Z domain of protein A It relates to a protein having an affinity for immunoglobulins, wherein the residue is a mutated protein substituted with a chemical stability in alkaline conditions compared to the protein before the introduction of the mutation. It is preferable that the amino acid sequence derived from the domain before mutation introduction is an nucleotide sequence of the A domain of the protein A of SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence derived from the A domain of the protein A of SEQ ID NO: 2.
  • the mutant protein comprises the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 2 or is a functional variant thereof.
  • “Functional variants” include all similar sequences that include one or more additional mutations in the amanoic acid position that do not affect the enhanced chemical stability or immunoglobulin affinity of the mutant protein in an environment of increased pH value.
  • the amino acid residue corresponding to position 18 of the A domain in each domain is Asn
  • the amino acid residue corresponding to the 23 position of the A domain in each domain is Asn, in each domain.
  • the amino acid residue at position 28 of the A domain is Asn
  • the amino acid residue at position 36 of the A domain in each domain is Asp
  • the amino acid residue at position 43 of the A domain in each domain is Asn
  • the amino acid residue corresponding to position 52 of the A domain in each domain is Asn.
  • the amino acid substitution mutation introduced into each domain of Staphylococcus protein A is a mutation (N18H) which replaces Asn at position 18 of the A domain with Hi s, Asp corresponding to position 36 of the A domain.
  • N18H a mutation for Val
  • Asn corresponding to position 43 of the A domain with Tyr or Leu N43Y / L
  • Ser N52S
  • the variant A domain of the present invention is a polypeptide in which the 18th asparagine is substituted with histidine in the polypeptide represented by SEQ ID NO:
  • AEP1 SEQ ID NO: 3, N18H
  • the 36th aspartic acid substituted with valine herein referred to as AEP4, SEQ ID NO: 4, D36V
  • 43rd asparagine substituted with tyrosine Preferred herein are AEP5, SEQ ID NO: 5
  • the present invention further includes amino acid residue mutations at 23rd and / or 28th positions in addition to the amino acid mutation at any one or more positions selected from the 18th, 36th, 43rd and 52nd groups.
  • the mutation at the 23rd position is selected from the group consisting of N23T, N23A, N23E, N23H, N23K, N23L, N23P, N23S and N23Y, and the mutation at the 28th position is N28W, N28G, N28R , N28F and N28I may be characterized in that it is characterized in that, more preferably the 23rd asparagine is substituted with leucine polypeptide (referred to herein as AEP2, SEQ ID NO: 7, N23L), 28th As Paragin may be a polypeptide substituted with tryptophan (hereinafter referred to as AES3, SEQ ID NO: 8, N28W).
  • AEP2 leucine polypeptide
  • AES3 polypeptide substituted with tryptophan
  • the present invention also provides a mutant protein in which the amino acid at the 18th, 23rd, 28th, 36th, 43rd and 52nd positions is substituted in the protein defined in SEQ ID NO: 2 or a functional variant thereof.
  • the protein may preferably be a protein defined by SEQ ID NO: 9 comprising a N18H, N23L, N28W, D36V, N43Y and N52S variant in a protein defined in SEQ ID NO: 2 or a functional variant thereof.
  • the mutant proteins of the present invention are protein ligands that specifically bind to Fc fragments of immunoglobulins such as IgG, IgA, IgD, IgE and IgM, and maintain a longer affinity under alkaline conditions than the parent molecule.
  • Increased alkali resistance of the mutant proteins according to the present invention is practiced This is illustrated in the example.
  • the variants in which the alkali resistance was increased through the first and second improvement of the wild type A domain were collected. Finally, the residues having the highest alkali resistance at each residue were collected, and the alkali resistance was much higher than that of the wild type A domain.
  • Increased variants have been developed. Specifically, the primary improvement was to prepare a mutant library using wild-type A domain base (SEQ ID NO: 1) using an error-prone error prone PCR method and search for mutations with increased alkali resistance compared to wild-type.
  • mutants substituted with other amino acids at the N18, N23, N28, D36, N43, and N52 positions of the wild type A domain polypeptide could be selected. Specifically, the mutants were selected such that N18 is substituted with histidine, N23 is substituted with leucine, N28 is substituted with tryptophan, D36 is substituted with valine, N43 is substituted with tyrosine, and N52 is substituted with serine. .
  • the present invention provides multimeric proteins such as dimers, trimers, tetramers, and pentamers to which the above-described protein monomers are bound.
  • the multimers of the invention also comprise one or more of the E, D, A, B and C domains of Staphylococcus protein A.
  • the resin is commercialized (Mabselect Sure, GE Heal thcare Co.) and Comparing the alkali resistance, it was confirmed that the alkali resistance is superior to the commercialized resin.
  • the present invention provides a polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the immunoglobulin-binding protein or the multimer, a recombinant expression vector comprising the polynucleotide.
  • a recombinant expression vector is a vector capable of expressing a target protein or target nucleic acid (RNA) in a suitable host cell, and includes an essential regulatory element operably linked to express a polynucleotide (gene) insert.
  • the term “operably l inked” refers to a funct in which a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a desired protein or RNA are functionally linked to perform a general function. ional l inkage). That is, it means that a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA (for example, a polynucleotide sequence encoding a variant A domain of the present invention) is linked in such a way that gene expression is enabled by an expression control sequence.
  • the promoter and the nucleic acid sequence encoding the protein or RNA must be operably linked to affect the expression of the encoding nucleic acid sequence.
  • Operative linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation employs enzymes commonly known in the art.
  • the recombinant expression vector of the present invention is characterized in that it comprises a polynucleotide encoding the variant A domain.
  • the polynucleotide sequence cloned in the vector according to the present invention may be operably linked to an appropriate expression control sequence.
  • the operably linked gene sequence and expression control sequence may be included in a single expression vector containing a selection marker and / or a replica icat ion or igin for selecting a host cell comprising the vector. have.
  • the expression vector includes an expression control sequence and a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion as necessary and can be prepared in various ways according to the purpose.
  • the expression control sequence refers to a DNA sequence that operably regulates the expression of a ' linked polynucleotide sequence in a particular host cell.
  • Such regulatory sequences include promoters for conducting transcription, any operator sequence for controlling transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, sequences controlling termination of transcription and translation, initiation codons, termination codons, polyadenes Nylation signals, enhancers, and the like.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the signal sequence includes a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, etc., when the host is Escherichia, and an ⁇ -amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc., when the host is Bacillus, and MF, when the host is a yeast.
  • a signal sequence ⁇ SUC2 signal sequence and the like, if the host is an animal cell, insulin signal sequence, a-interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence and the like can be used, but is not limited thereto.
  • the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it is a vector commonly used in the cloning field, and examples thereof include, but are not limited to, plasmid vector, cosmid vector, bacteriophage vector, and viral vector.
  • the plasmids include E. coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC118 and pUC119, pET-22b (+)), Bacillus subtilis-derived plasmids (pUBllO and pTP5), and yeast-derived plasmids ( ⁇ 13, ⁇ 24 and YCp50).
  • E. coli-derived plasmids pBR322, pBR325, pUC118 and pUC119, pET-22b (+)
  • Bacillus subtilis-derived plasmids pUBllO and pTP5
  • yeast-derived plasmids ⁇ 13, ⁇ 24 and YCp50
  • an animal virus such as a retrovirus, adenovirus or vaccinia virus, an insect virus such as baclovirus, and the like may be used, but are not limited thereto.
  • the present invention provides a transformant transformed by the expression vector.
  • Such transformation includes any method of introducing a nucleic acid (polynucleotide encoding a variant A domain of the present invention) into an organism, cell, tissue or organ, and is a standard suitable for host cells as known in the art. Can be done by selecting a technology have. These methods include electroporation, plasma fusion, calcium phosphate (CaP0 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, silicon carbide whiskers, sonication, and agro. Bacterial mediated transformation, polyethylenglycol (PEG) precipitation, dextran sulfate, lipofectamine, heat shock, particle gun bombardment, etc. may be included.
  • a nucleic acid polynucleotide encoding a variant A domain of the present invention
  • the host cell is a prokaryotic or eukaryotic containing heterologous DNA introduced into the cell by any means (e.g., electrostriation, calcium phosphatase precipitation, microinjection, transformation, viral infection, etc.). It means a cell.
  • the host cell is any type of unicellular organism commonly used in the cloning field, for example, prokaryotic microorganisms such as various bacteria (eg, Clostridia genus, Escherichia coli, etc.), lower eukaryotic microorganisms such as yeast and tortilla cells.
  • Cells derived from higher eukaryotes, including plant cells, vesicles, and the like may be used as host cells, but are not limited thereto. Since the expression amount and the expression of the protein are different depending on the host cell, those skilled in the art can select and use the most suitable host cell as desired.
  • the host cell is Clostridia spp. (Eg Clostridium acetobutyl icum, Clostridium bei jerincki i, Clostridium saccharoperbuty 1 acet oni cum, or Clostridium saccharobuty 1 i cum, etc.), the genus Escherichia spp. ., The genus Acetobacter spp.
  • variant A domain polypeptides proteins
  • variant A domain polypeptides can be extracted from nature or constructed by genetic engineering methods.
  • nucleic acids encoding the variant A domain polypeptides are constructed according to conventional methods.
  • the nucleic acid can be constructed by PCR amplification using an appropriate primer.
  • DNA sequences may be synthesized using standard methods known in the art, for example, using an automated DNA synthesizer (available from Biosearch or Applied Biosystems).
  • the constructed nucleic acid is inserted into a vector comprising one or more expression ion control sequences (eg, promoters, enhancers, etc.) that are operably linked thereto to regulate expression of the nucleic acid.
  • the host cell is transformed with the recombinant expression vector formed therefrom.
  • the resulting transformant can be obtained by culturing and recovering from the culture.
  • the culture may mean culture supernatant, cultured cells or cultured cells or lysate of cells or cells. After cultivation, when the improved protein of the present invention is produced in cells or in cells, the protein is collected by crushing the cells or cells using sonication, freezing and thawing, etc.
  • the culture medium is used as it is or the cells or cells are removed by centrifugation or the like.
  • separation and purification of mutated A domain proteins can be performed using protein separation methods using various chromatographic methods as they are, or by slightly modifying them according to experimental purposes, using the properties of A domains previously known.
  • variation A by affinity chromatography method using specific binding properties such as the binding force between the histidine peptide and the nickel column component or the binding force between the cellulose, cel lulose binding domain (CBD) and fibrin, etc. It is also possible to purify the domain.
  • the improved protein of the present invention isolated and purified is a protein consisting of an amino acid sequence of interest
  • a sample including the protein is analyzed.
  • SDS—PAGE, western blotting, mass spectrometry, amino acid analysis, amino acid sequencer, and the like can be used.
  • substantial ly ly pure polypeptide &quot It is meant that the polypeptide according is substantially free of any other protein derived from the host cell.
  • Immobilization of the mutant A domain can be prepared by conventional methods known in the art, and examples of the carrier include natural polymers such as fibrin, starch, dextran, and agarose; Synthetic polymers such as polyacrylamide, polyacrylate, polymethacylate, and Euphorgit CXEupergit C; Or silica, bentonite, minerals such as metal, or the like. It is also possible to bind the variant A domain to these carriers by covalent bonds, ionic bonds, hydrophobic bonds, physical adsorption, microencapsulation and the like. In addition, these carrier-enzyme conjugates can also immobilize the variant A domain by forming covalent bonds by the action of glutaraldehyde, cyanogen bromide and the like.
  • the present invention also provides a matrix for chromatography in which a plurality of ligands comprising the immunoglobulin-binding proteinol are coupled to a solid support.
  • the matrix according to the invention may comprise any of the above mentioned mutant proteins as ligands, preferably the ligands present on the solid support may be such multimers.
  • the solid support of the matrix according to the invention can be of any suitable known kind.
  • aqueous medium used Hydroxy (-0H), carboxy (-C00H), carboxamido (-C0 H2, possibly N-substituted) ), Based on polymers exposing amino (-NH2, possibly in substituted form), oligo- or polyethyleneoxy groups.
  • the polymer may be, for example, polysaccharides such as dextran, starch, cellulose, pullulan, agarose, advantageously, for example bisepoxide, epihalohydrin, 1,2,3-trihal Based on cross-linked polysaccharides with lower hydrocarbons substituted with, a suitable porosity and strength can be provided.
  • the solid support is porous agarose beads.
  • the support used in the present invention can be easily prepared according to standard methods such as inverse suspension gelatinization (S Hjerten: Biochem Biophys Acta 79 (2), 393-398 (1964)).
  • based matrix is a commercially available product such as Sepharose® FF (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden).
  • the support which is particularly advantageous for large scale separation, is deformed to increase its strength, making the matrix more suitable for high flow rates.
  • the solid support of the present invention may be based on synthetic polymers such as polyvinyl alcohol, polyhydroxyalkyl acrylate, polyhydroxyalkyl methacrylate, polyacrylamide, polymethacrylamide and the like.
  • hydrophobic polymers such as matrices based on divinyl and monovinyl-substituted benzenes
  • the surface of the matrix is often hydrophilized to expose the hydrophilic groups as described above with the surrounding aqueous liquid.
  • Such polymers are readily prepared according to standard methods and are described, for example, in "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerizat ion", R. Arshady: Chi mica e L 'Industria 70 (9), 70-75 (1988). See)).
  • Source trademark
  • the solid support according to the present invention may include an inorganic support such as silica or zirconium oxide, or the solid support may be in the form of a surface, a chip, a capillary tube, or a filter.
  • the matrix may be in the form of a porous monolith.
  • the matrix is bead or particulate, which may be porous or nonporous.
  • Suspended forms include those known as expanded beds and pure suspensions in which the particles or beads move freely. In the case of monomoths, packed beds and expanded beds, the separation process is usually carried out after conventional chromatography via a concentration gradient.
  • the ligand can be attached to the support, for example, via conventional coupling techniques using amino groups and / or carboxy groups present in the ligand. Bisepoxide, epichlorohydrin, CNBr, N-hydroxysuccinimide (NHS) and the like are well known coupling agents. Between the support and the ligand, molecules known as spacers can be introduced, which will enhance the utilization of the ligand and facilitate the chemical coupling of the ligand to the support. Alternatively, the ligand may be attached to the support by noncovalent bonding, such as physical adsorption or biospecific adsorption.
  • the present invention provides a method for isolating immunoglobulins, such as IgG, IgA and / or IgM, wherein the mutant protein, multimer or matrix according to the invention is used.
  • it may be a method of isolating immunoglobulins using a matrix. More specifically, the immunoglobulin isolation method of the present invention
  • Step a) is characterized by providing a solution containing an immunoglobulin as a sample.
  • 'immunoglobulin immunglobulin
  • 'immunoglobulin plays an important role in immunity of serum components, and refers to the generic name of the protein that acts as an antibody.
  • the basic structure is molecular weight
  • One pair of about 23,000 L chains (light chains) and one pair of H chains (heavy chains) of 50,000 to 70,000 pairs are joined by SS bridges, depending on the type of H chain, IgG, IgA, IgM, IgD,
  • the step b) is characterized in that the sample of step a) is adsorbed with the mutant protein or multimer or matrix.
  • the mutant protein comprises the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 2 or is a functional variant thereof, the multimer is a protein comprising a mutated protein unit and containing two or more repeating units, the matrix It is meant that the plurality of ligands, including immunoglobulin-binding proteins, is a matrix for chromatography coupled to a solid support. Addition c) is characterized in that to remove the unbound contaminants by washing the chromatography matrix of step b).
  • the matrix is washed with an aqueous solution or an alkaline agent used in the sample to remove unbound substances or contaminants.
  • Step d) is characterized in that to recover the target molecule in the matrix of step c).
  • the target molecule is isolated by passing a solution having high affinity with the eluent or the target molecule through the matrix to which the unbound material or contaminant is removed.
  • the immunoglobulin may be isolated.
  • the present invention provides a chromatographic method wherein one or more target compounds are separated from the liquid by adsorption to the mutant protein or multimer or matrix described above. It includes.
  • the desired product may be an isolated compound or liquid.
  • affinity chromatography a widely used and well known separation technique.
  • a solution comprising a target compound, preferably an antibody as described above is passed through the separation matrix in a first step under conditions that allow the target compound to be adsorbed to the ligands present on the separation matrix.
  • Such conditions are controlled, for example, by pH and / or salt concentration, ie the ionic strength in the solvent. Care must be taken not to exceed the capacity of the matrix, i.e. slow down the flow to ensure satisfactory adsorption.
  • other components of the solution will in principle pass through unblocked.
  • the matrix is then washed by using an aqueous solution or the like to remove retained and / or loosely bound material. This matrix is most advantageously used through a washing step using an alkaline formulation, as described above.
  • a solution of System 2 called the eluent
  • eluent a solution of System 2
  • Such conditions are usually provided by changes in pH, salt concentration, ie ionic strength, hydrophobicity, and the like.
  • Various elution methods are known, such as gradient elution and stepwise elution. Elution may be possible with a second solution comprising a competition substance that will replace the desired antibody on the matrix.
  • affinity chromatography see, for example, Wilchek, M., and Chaiken, 1. 2000, An overview of af inity chromatography, Methods Mol. Biol. 147: 1-6.
  • the present invention see, for example, Wilchek, M., and Chaiken, 1. 2000, An overview of af inity chromatography, Methods Mol. Biol. 147: 1-6.
  • Step a) is characterized by providing a solution containing a target compound as a sample.
  • 'Target compound' of the present invention means a protein that is purified by a mutant immunoglobulin-binding protein with increased alkali resistance, and may preferably be an immunoglobulin.
  • Step b) is characterized in that the sample of step a) is passed through the mutant protein or multimer or matrix to adsorb the target compound to the ligand on the matrix.
  • Step c) is characterized in that to remove the loosely bound material and unbound material by washing the chromatography matrix of step b).
  • the matrix is washed with an aqueous solution or an alkaline agent used in the sample to remove loosely bound, unbound or contaminants.
  • Step d) is characterized in that the eluting agent is passed over the matrix of step c) to elute the target compound.
  • the target compound is separated by passing a solution having high affinity with the eluent or the target compound through the matrix to which the unbound material or contaminant is removed. More preferably, it may be to isolate the immunoglobulin protein.
  • the present invention provides an immunoglobulin protein isolated by the above immunoglobulin isolation method.
  • the present invention also provides a target compound separated by the above chromatography method.
  • the immunoglobulin-binding protein is the same as described above.
  • the present invention can provide immunoglobulin-binding protein ligands and matrices for antibody purification that have improved alkali resistance and improved stability against many alkali washings.
  • 1 is information of residues selected through improved experiments for increasing alkali resistance.
  • 2 is a graph showing increased alkali resistance of variant A domains selected through improvement.
  • 3 is a graph comparing the alkali resistance of the mutant A domain (mAF) and the wild type A domain (wAd) reflecting all of the residues contributing to alkali resistance.
  • FIG. 4 is a graph comparing the commercialized resin (Mabselect sure) and the alkali resistance after preparing a variant A domain tetramer (1 ⁇ 2AF) reflecting all residues contributing to alkali resistance.
  • the sequence encoding the Fc polypeptide from human IgGl was found through Blast at the NCBI site (GenBank accession no. Y 14735) and synthesized by Cosmojintech (Daejeon, Korea).
  • the pET-Fc plasmid was prepared by inserting the Fc gene obtained in Example ⁇ 2-1> into the Ndel and Xhol restriction enzyme recognition sites of pET29a (+) vector (Stratagene, USA). All. In detail, it is as follows.
  • the Fc gene DNA product obtained through the synthesis in Example ⁇ 1-1> was digested with restriction enzymes Ndel and Xh, purified using a purification kit (QIAEX Gel Extract ion Kit; Qiagen, Germany) and used as an insert DNA. It was.
  • a DNA fragment obtained by digesting the pET29a (+) vector DNA with restriction enzymes Ndel and Xh and dephosphorylation with CIP was used as the vector DNA.
  • the inserted DNA and the vector DNA were conjugated (l igat ion) at 16 ° C. for 12-16 hours using a T4 DNA ligase (Roche, Germany), followed by electroporation using the conjugate solution. Transformation was performed to the E. coli BL21 (DE3) strain for expression. Transformants were selected by plating the strain on LB agar medium containing kanamycin antibiotic at a concentration of 40 ug / raL and overnight incubation at 37 ° C. By separating the plasmid from the transformant and determining the base sequence of the inserted DNA, a pET-Fc plasmid containing the Fc gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 was prepared. The pET-Fc plasmid expresses the wild type Fc protein represented by SEQ ID NO: 13.
  • E. coli BL2KDE3 transformants In order to spawn E. coli BL2KDE3) transformants, 5 mL of LB liquid medium containing kanamycin antibiotics was inoculated into 50 mL conical ribs dispensed, followed by shaking culture at 37 ° C and 200 rpm for 16 hours.
  • the flask culture was centrifuged (4 ° C, 10000 rpm, 30 minutes) to recover the cells, and then suspended in a 10 mL solution of PBS buffer (pH 7.4) (Intron Bao Technology, South Korea) and ultrasonic grinder at 4 ° C. Crushed for 15 minutes and centrifuged at 4 ° C, 10,000 rpm conditions for 30 minutes to take only the supernatant.
  • washing buffer (20 mM Na3 ⁇ 4P0 4 , 30 mM NaCl, 20 mM
  • Staphylococcus aureus 7ret / sy> A-domain expression vector of derived protein A
  • a gene containing an HQ tag was synthesized by a Cosmogenetech (Daejeon, Korea) company in consideration of protein purification in the A domain gene, which is the third domain of Protein A derived from Staphylococcus aureus).
  • the pBC-wAd plasmid was prepared by inserting the A domain gene obtained in Example ⁇ 1-1> into the Ndel and Notl restriction enzyme recognition sites of the pBC KS (+) vector (Stratagene, USA). In detail, it proceeded as follows.
  • the wAd gene DNA product obtained through the synthesis in Example ⁇ 2-1> was digested with restriction enzymes Ndel and Not l, and then purified by a purification kit (QIAEX Gel Ext Ract i on Ki t; Qi agen, Germany). This was used as insertion DNA.
  • a DNA fragment digested with pBC KS (+) vector DNA with restriction enzymes Ndel and Notl and dephosphorylated with CIP was used as vector DNA.
  • the shovel mip and vector DNA were conjugated (l igat i on) at 16 ° C. for 12-16 hours using T4 DNA ligase (Roche, Germany), followed by electroporation using the conjugate ( e lectrophorat ion) was transformed into E. coli DH5 a strain.
  • Transformants were selected by plating the strain on LB agar medium containing chloramphenicol antibiotics at a concentration of 20 ug / mL and overnight incubation at 37 ° C.
  • the plasmid was isolated from the transformant to determine the base sequence of the inserted DNA, thereby preparing a pBC-wAd plasmid containing the wild type A domain gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the pBC-wAd plasmid expresses the wild type A domain protein represented by SEQ ID NO: 2.
  • the mutant library was prepared by performing an error prone polymerase chain reaction (error prone PCR) to artificially induce random mutations in the nucleotide sequence of the synthesized wAd gene.
  • error prone PCR error prone polymerase chain reaction
  • the manufacturing process of the specific mutation library is as follows. Error-induced polymerase chain reaction was induced by 1 to 2 mutations per 1000 bp using Divers ityRandom Mutagenesis kit (Clontech, USA), and the composition of PCR reaction solution was 1 ng of pBC- as template DNA.
  • wAd plasmid each with 10 ⁇ > 1 EP-F primer (SEQ ID NO: 14), ⁇ 7 primer (SEQ ID NO: 15), 40 ⁇ dGTP, Diversi ty dNTP mix, TITANIUM Taq polymerase It was.
  • the PCR was performed using Takara PCR Thermal Cycler (Takara, Japan), banung condition the banung mixture at 94 ° C for 30 seconds, pre-modified and denaturation of 30 sec at 94 ° C, 30 seconds annealing at 55 ° C and The reaction was repeated for 16 minutes at 68 ° C. for 3 minutes and then post-polymerized at 68 ° C. for 1 minute.
  • PCR products of each mutant wAd gene obtained through the error-prone polymerase chain reaction under the above conditions were digested with restriction enzymes Ndel and Not l and purified using QIAEX Gel Extract ion Ki t (Qiagen, Germany).
  • the DNA was used as the inserted DNA, and a 3.4 kb DNA fragment recovered by cleaving the pBC-KS (+) plasmid with restriction enzymes Ndel and Notl was used as the vector DNA.
  • the above insertion pressure DNA and vector DNA were conjugated at 16 ° C. for 16 hours using T4 DNA ligase (New England Biolabs, Sweden), and then transformed into E. coli DH5 a strain by electroporation using the conjugate solution.
  • Random strain libraries were prepared by plating the strains in LB agar medium containing 20 ug / mL chloramphenicol antibiotics and overnight incubation at 37 ° C.
  • E. coli DH5 a transformant containing the mutant-mutated wAd gene was inoculated into a 96-deep well plate (Bionia, Korea) dispensed with 600 ii LB medium containing chloramphenicol antibiotics, 37 ° C, shaking culture for 18 hours at 280 rpm conditions. Specific protein purification was performed using the Promega HisLink TM 96 Protein Purifion ion System (Promega, USA). Add 60 uL of FastBreak TM Cel l Lysis Reagent, 10X / DNase I solut ion to 600 cultures, add 45 i L of HisLink TM Res in to each well and mix for 30 minutes at 100 rpm.
  • the reaction solution and the resin were transferred to a Filtrat ion plate, and the Vac-Man Vacuum Mani fold (Promega, US)
  • the filter was applied by applying vacuum for 10 seconds.
  • Elution buffer 100 mM HEPES, 50 mM Imidazole, pH 7.5
  • wAd variants were coupled to N-hydroxysuccinimide (NHS) —Activated sepharose 4 Fast f low (GE Heal thcare, Sweden) in 96-well plates.
  • Fc 150 n L (59.5 yg / mL) purified in Example ⁇ 1-3> was transferred to a Filtrat ion plate containing wAd variants coupled to the NHS-act ivated Sepharose beads and 100 at room temperature. It was reacted for 1 hour at rpm. Unbound Fc protein was removed by vacuum, and the PBS buffer 150 was dispensed and washed by vacuum. This washing process was repeated three times.
  • Elution buffer (0.1 M GlycineHCl, pH 3.0) was added to 150 uL and reacted at room temperature for 30 seconds, followed by vacuum for 1 minute to receive protein in a new 96-well plate. Filtrat ion plates treated with elution buffer were dispensed with 150 ii L of PBS buffer and washed under vacuum. This washing process was repeated three times. The new 96-well plate to which the supernatant was transferred was measured using a Synergy HTX mul t-mode reade (BioTek, USA) to measure the amount of Fc protein at 0D 280 .
  • Synergy HTX mul t-mode reade BioTek, USA
  • the six variants were determined by nucleotide sequence determination of the gene, AEP N18H) (SEQ ID NO: 3), AEP4 (D36V) (SEQ ID NO: 4), AEP5 (N43Y) (SEQ ID NO: 5), AEP6 (N52S) (SEQ ID NO: 6), It was confirmed that the mutation was AEP2 (N23T) (SEQ ID NO: 7), AEP3 (N28W) (SEQ ID NO: 8).
  • a library of site-mutated mutants for the six amino acid residues (N18, N23, N28, D36, N43, N52) selected in Example 3 was prepared. It was. Specifically, 18-F primer (SEQ ID NO: 16) and 18—R primer (SEQ ID NO: 16) were inserted into the template of AEP1 (SEQ ID NO: 3) inserted into the pBC KS (+) vector to prepare a library containing the 18th amino acid mutation. No. 17), pFU-x React ion buffer, 10 mM dNTP, pFU- ⁇ polymerase was carried out by adjusting the final volume to 50.
  • the reaction conditions were pre-denaturation of the reaction mixture at 95 ° C for 1 minute, denaturation at 50 ° C at 95 ° C, annealing at 50 ° C at 53 ° C, and polymerization at 68 ° C for 3 minutes. Post-polymerization at 68 ° C. for 10 minutes after repeated rounds.
  • the PCR product of the above condition was obtained and treated with restriction enzyme Dpnl for 18 hours, and purified by purification kit (PCR pur ifi cat ion Ki t; Cosmojintech, Korea), which was immediately transformed into E. coli DH5 by electrophorat ion. Transformation was performed to strain a.
  • strains were prepared by smearing the strain in LB agar medium containing 20 ug / mL concentration of chloramphenicol antibiotics and incubating overnight at 37 ° C. Thereafter, AEP4 (SEQ ID NO: 4), AEP5 SEQ ID NO: 5), AEP6 (SEQ ID NO: 6), AEP2 (SEQ ID NO: 7), and AEP3C sequences inserted in the pBC KS (+) vector in the same manner as described above No.
  • AES (N23A), AES (N23E), AES (N23H), AES (N23K), and AES (N23L) variants showed increased non-alkali resistance.
  • AESCN23P AES (N23S), AES (N23Y), AES (N28G), AES (N28R), AES (N28F), AES (N28I), AES (N43L) were additionally selected (FIG. 2).
  • the residues having the highest residual activity at the mutant residue positions were intended to be introduced into wAd.
  • the N18H / N23L / N28W / D36V / N43Y / N52S variant was designed as a variant, named mAF (SEQ ID NO: 9), and the gene including the HQ tag was synthesized by Cosmojintech (Daejeon, Korea).
  • Example ⁇ 5-1> The mAF gene obtained in Example ⁇ 5-1> was cloned into pBC KS (+) vector (Stratagene, USA) in the same manner as in Example ⁇ 1-2> to prepare a pBC-mAF plasmid. .
  • the pBC-mAF plasmid expresses the mAF protein represented by SEQ ID NO: 10.
  • mAF gene was prepared as a tetramer by performing polymerase chain reaction. Detailed description was carried out as follows. To prepare mAF tetramers, PCR was performed using raAF as a template and randomly following genes using mAF2-F primer (SEQ ID NO: 28) and mAF2-R primer (SEQ ID NO: 29). . The composition of PCR reaction solution was adjusted with each template DNA, primer, pfu-x buffer, dNTPs mix, pfu- ⁇ polymerase, and final volume was adjusted to 100 ⁇ 1. It was performed by.
  • the reaction conditions were performed by pre-denaturation at 96 ° C for 2 minutes at 30 ° C and 30 minutes at 96 ° C, annealing at 30 ° C at 54 ° C, and polymerization at 72 ° C for 1 minute. Post-polymerization at 72 ° C. for 5 minutes after repeated rounds.
  • the obtained PCR product was purified using the purification kit QIAEX Gel Extract ion Ki t (Qiagen, Germany).
  • the mAF gene was conjugated for 12-16 hours at 16 ° C. using T4 DNA ligase (Roche, Germany), followed by purification kit (QIAEX Gel Extract ion Ki t; Qi agen, Germany). 0.72 kb tetramer mAF gene product was recovered.
  • PCR was performed in the same manner as the above method using the recovered tetrameric mAF gene as a template and 4mAF-F primer (SEQ ID NO: 30) and 4mAF_R primer (SEQ ID NO: 31).
  • the obtained PCR product was recovered from a 0.72 kb tetrameric mAF gene DNA product using a purification kit (QIAEX Gel Extract ion Kit; Qiagen, Germany), and digested with restriction enzymes Ndel and Xh, followed by a 0.72 kb tetramer.
  • mAF gene DNA was purified using a purification kit (QIAEX Gel Extract ion Kit; Qiagen, Germany) and used as the insert DNA.
  • a DNA fragment obtained by digesting the pET29a (+) vector DNA with restriction enzymes Ndel and Xh and dephosphorylation with CIP was used as the vector DNA.
  • the inserted DNA and the vector DNA were conjugated (l igat ion) at 16 ° C. for 12-16 hours using T4 DNA ligase (Roche, Germany), followed by electroporation using the conjugate solution ( E. coli BL21 (DE3) strain was transformed with electrophorat ion).
  • Transformants were selected by spreading the strain on LB agar medium containing kanamycin antibiotic at a concentration of 40 ug / mL and incubating overnight at 37 ° C.
  • a pET-4mAF plasmid containing the 4mAF gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 was prepared.
  • the pET-4mAF plasmid expresses the variant protein 4mAF represented by SEQ ID NO: 32.
  • Escherichia coli BL21Q 3 5 mL of TB liquid medium containing kanamycin antibiotic was inoculated into a 50 mL test tube in which the transformant was spawned, followed by shaking culture at 37 ° C. and 200 rpm for 16 hours.
  • IPTGU sopropyl- ⁇ - ⁇ ) —thio-galactopyranoside was added so that 1 mM was shaken at 37 ° C., 200 rpm for 18 hours.
  • the flask culture was centrifuged (4 ° C, 10000 rpm, 30 minutes) to recover the cells, and then suspended in a 20 mL solution of PBS buffer (pH 7.4) (Intron Biotechnology, Korea) at 4 ° C Crush for 30 minutes with an ultrasonic grinder and centrifuge for 30 minutes at 4 ° C, 10,000 rpm to take only the supernatant.
  • PBS buffer pH 7.4
  • Elution buffer (20 mM Na3 ⁇ 4PO 4 , 30 mM NaCl, 300 mM Imidazole pH) after 25 mL
  • Example ⁇ 6-2> 4 mAF purified in Example ⁇ 6-2> was coupled to NHS (N-hydroxysuccinimide) -AcUvated sepharose 4 Fast f low (GE Heal thcare, Sweden).
  • the prepared 4mAF resin was compared to alkali resistance with commercialized resin MabSelect Sure (GE Healthcare Licensence, Inc., USA), which is known to have high alkali resistance.
  • Di sposabl ec s was added 100 ul of resin and 5 mL of 0.5N NaOH, sealed and slowly shaken to proceed with alkali treatment.
  • the present invention can provide an immunoglobulin-binding protein ligand and a matrix for antibody purification with improved alkali resistance and improved stability against a large number of alkali washings, and thus has excellent industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질에 관한 것 으로, 보다 상세하게는 스타필로코쿠스 단백질 Α의 도메인 A 또는 이의 기능적 변 이체에 있어서 특정 위치에서의 아미노산이 돌연변이 되어 모분자에 비해 알칼리 pH 값에서 증가된 화학적 안정성을 나타내는 면역글로불린 결합 단백질에 관한 것 이다. 본 발명은 내알칼리성이 향상되어 다수의 알칼리 세정에 대한 안정성이 향상 된 항체 정제용 면역글로불린-결합 단백질 리간드 및 매트릭스를 제공할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질
[기술분야]
본 출원은 2016년 7월 6일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0085721호 를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 ¾체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질에 관한 것 으로, 보다 상세하게는 스타필로코쿠스 단백질 A의 도메인 A 또는 이의 기능적 변 이체에 있어서 특정 위치에서의 아미노산이 돌연변이 되어 모분자에 비해 알칼리 pH 값에서 증가된 화학적 안정성을 나타내는 면역글로불린 결합 단백질에 관한 것 이다.
【배경기술】
단클론항체 (monoclonal ant ibody)는 유전자 조작된 동물세포의 배양 시， 배 지 중으로 분비되며， 세포 자체에서 분비되는 여러 단백질들과 배지 내의 단백질 들이 섞여 매우 낮은 농도로 존재하게 된다. 따라서 목적 단클론 항체 이외의 불순 물 제거가 항체생산에서 중요한 단계이다. 단클론항체 분리정제공정은 배지로부터 단클론항체만 선택작으로 회수할 수 있는 항체친화성 리간드 (ant ibody af f ini ty l igand)인 단백질 A를 이용한 친화성 크로마토그래피 (af f ini ty chromatography)가 주로 사용되고 있다. 항체 정제 후에는 레진에 남아있는 핵산, 지질, 단백질， 미생물과 같은 다양 한 오염물질을 제거하기 위한 세정 (cleaning-in-place , CIP)을 실시한다. 일반적으 로 레진의 세정제 중 가장 광범위하게 사용되는 물질이 NaOH이다. 그러나 단백질 기반 정제용 레진은 알칼리에 취약하기 때문에 NaOH를 사용하기 힘들다. 단백질 A 는 비교적 알칼리 조건에서도 안정하기 때문에 NaOH로 세척을 하나， 좀 더 세척율 을 높이기 위하여 알칼리 조건에서도 안정한 단백질 A를 개발하기 위한 단백질 개 량 연구들이 진행되어 왔다. 단백질 A는 포도상 구균의 세포 표면 단백질로서 높은 상동성을 지니고 있는 다섯 개의 도메인 (E, D, A, B, C 도메인)으로 이루어져 있다. 도메인은 세 개의 반 평행 헬릭스와 헬릭스 중간에 위치하고 있는 두 개의 루프로 이루어진 구조를 지니 고 있으며, 약 58개 아미노산 잔기로 이루어져 있다. 귤리히는 스트렙토코칼 균주 유래의 알부민 결합 도메인 (streptococcal albumin—결합 domain)을 모델로 하여， Asn잔기가 알칼리에 민감하다는 정보를 기반으로 모든 Asn잔기를 다른 아미노산으 로 치환하였다. 그 결과， 0.5N NaOH에 대한 안정성과 열 안정성이 높은 단백질을 얻을 수 있었다 (Gul ich et . al . , J Biotechnol , 28(2) , 169-178(2000) ) . 린휼트는 우회 돌연변이 방법 (bypass mutagenesi s approach)을 이용하여 반복적인 알칼리 처 리에도 구조적 안정성이 유지되는 Protein A를 개발하였다. 자세히 설명하면, Z 도 메인 (B 도메인의 G29A 변이체)의 F30은 세 번째 헬릭스 위치에 존재하고 있어, 항 체 결합에는 간섭을 주진 않지만， 구조적 안정성에는 영향을 주는 잔기이다. 실제 로， F30을 Ala로 치환하였을 경후， IgG의 친화력이 와일드 타입과 비슷하지만, 구 조적인 안정성이 감소되어 알칼리에 대한 내성이 약해졌다. Z(F30A)를 주형으로 하 여 Asn잔기를 다른 도메인 (E, D, A, C 도메인)의 동일 위치에 존재하는 Asn외의 다 른 잔기로 치환하였을 때에, 즉 N23T, N28A, N6A, N11S로 바뀌었을 때에， 알칼리 조건에서 안정성이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 N21A, N43E, N52A의 경우에 는 와일드 타입보다 알칼리 내성이 떨어지는 것으로 보아, 단순히 Asn을 다른 잔기 로 치환하는 것 외에 어떤 잔기로 치환이 되었는지도 중요하다 (Linhult et . al . , Proteins , 55(2) , 407-416(2004) ) . 한국 등록 특허 번호 10-1307651는 B 도메인 혹은 Z 도메인의 N3A/N23T또는 N3A/N6D/N23T 로 바뀐 돌연변이 면역글로블로린 결합 단백질을 기재하고 있으며, 모분자에 비해 알칼리 pH에서 화학적 안정성이 증가되었다. 미국 등톡 특허 번호 US9051375는 Z 도메인의 N3, N6, N23의 세 위치에 히스티딘， 세린， 아스파틱산， 트 레오닌으로 치환하여 알칼리 내성이 증가된 돌연변이 서열들을 기재하였다. 다른 발명으로는， 미국 특허 공개 번호 US20100048876는 N 말단으로부터 3 번잔기부터 6번잔기를 없앤 C 도메인과 야생형 C 도메인을 포함하는 크로마토그래 피 매트릭스를 기재하고 있으며， 이 매트릭스는 알칼리에 대한 안정성이 증가하였 다. 한국 특허 등톡 번호 10- 1464040은 N-말단으로부터 첫 번째 아미노산에서 시작 하여 3 또는 4개의 연속적 아미노산 결실을 포함하는 2개 내지 5개의 C 도메인， B 도메인 혹은 Z 도메인의 친화성 크로마토그래피 리간드 및 매트릭스를 기재하고 있 으며， 이 매트릭스는 알칼리 조건에서 야생형 리간드에 비해 리간드 분해가 적다는 특징이 있다. 위와 같이， 개별 단백질 A 리간드로서， 아스파라진 잔기에 대해 몇 개의 특 정 아미노산에 대해서 치환을 진행하거나, N 말단의 잔기를 없앰으로써 알칼리 내 성 증가를 확인하였지만, 치환잔기에 따라 알카리 내성에 영향을 미치는 적을 고려 할 때， 그 영향은 제한적일 수밖에 없다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에， 본 발명자들은 무작위 돌연변이 방법을 이용하여 아스파라진 외에 다 른 잔기들에도 무작위로 다양한 아미노산으로 치환을 시킴으로써 알칼리 내성이 증 가된 단백질 A 리간드를 발명하고자 예의 노력을 기울인 결과, 단백질 A의 도메인 A 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 18번째， 36번째, 43번째 및 52번째로 이루어 진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 돌연변이 되면， 알칼리 내성이 증가된 면역글로불린 -결합 단백질을 얻을 수 있음을 발견하고 본 발 명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변 이체에 있어서 18번째， 36번째, 43번째 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 면역글로 불린 -결합 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이된 단백질 단위를 포함하며 반복 단위 를 둘 이상포함하는 다량체를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 면역글로불린 -결합 단백질 또는 상기 다량체를 임 "호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 ¾리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 백터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이 다. 본 발명의 다른 목적은 상기 면역글로불린 -결합 단백질을 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체에 커플링된 크로마토그래피용 매트릭스를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 제 1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 제 6항에 따른 다 량체 또는 제 11항에 따른 매트릭스가 사용되는 면역글로불린의 단리 방법을 제공하 는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 제 1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 제 6항에 따른 다 량체 또는 제 11항에 따른 매트릭스의 흡착에 의하여 액체로부터 하나 이상의 표적 화합물이 분리되는 크로마토그래피 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기의 방법으로 단리된 면역글로불린 단백질을 제공 하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기의 방법으로 분리된 표적 화합물을 제공하는 것 이다.
【기술적 해결방법】
상기한 본 발명의 목적올 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 18번째， 36번째， 43번째 및 52번째로 이 루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 면역글로불린 단백질을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 돌연변이된 단백질 단위를 포함하며 반복 단위를 둘 이상 포함하는 다량체를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 면역글로불린 -결합 단백질 또는 상기 다량체를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 백터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 면역글로불린 -결합 단백질을 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체에 커플링된 크로마토그래피용 매 트릭스를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 제 1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 제 6항에 따른 다량체 또는 제 11항에 따른 매트릭스가 사용되는 면역글로불린의 단 리 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 계 1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 제 6항에 따른 다량체 또는 제 11항에 따른 매트릭스의 흡착에 의하여 액체로부터 하 나 이상의 표적 화합물이 분리되는 크로마토그래피 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 상기의 방법으로 단리된 면역글로 불린 단백질을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 상기의 방법으로 분리된 표적 화합 물을 제공한다. 이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 18번째， 36번째， 43번째 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위 치에서의 아미노산 잔기가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 면역글로불린 -결합 단백 질을 제공한다. 본. 발명자들은, 단백질 A의 A 도메인의 아미노산에 다른 아미노산으로 치환 시킨 재조합 단백질 변이체를 분자 설계하고， 단백질 공학적 방법 및 유전자 공학 적 방법을 사용하여 상기 변이체를 형질 전환 세포로부터 취득하고， 상기 변이체의 알칼리 조건하에서의 항체결합 활성을 비교 검토함으로써， 본 발명을 완성하였다. 본 명세서에서 용어 "단백질' '은 "폴리펩타이드 (polypeptide)" 또는 "펩타이 드 (peptide)"와 호환성 있게 사용되며， 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 본 발명에서 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드'' 는 단일 -또는 이중-가닥의 형 태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없 는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 흔성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 본 명세서에서 용어 "발현 (expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵 산의 생성을 의미한다. 본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자 (삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:
A(Ala): 알라닌 ; C(Cys): 시스테인; D(Asp)：아스파르트산; E(Glu): 글루탐 산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피 를라이신; P(Pro): 프를린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg)： 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인， V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신. 본 명세서에 표기되는 "(아미노산일문자) (아마노산위치) (아미노산일문자) "는 천연형 폴리펩타이드의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기 된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 예를 들면, N23R은 천연형 폴리펩타이 드의 23번에 해당하는 아스파라긴이 아르기난으로 치환된다는 것을 가리킨다. 또한 후행 표기된 아미노산에서 '사선 (/)' 표시는 '또는' 을 의미한다. 본 발명은， 단백질 A의 k, B , C 또는 Z 도메인에서 선택되는 적어도 1개의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열에 있어서， 18 ,36， 43 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 치환된 돌연변이 단 백질이며， 변이 도입 전의 단백질과 비교하여 알칼리 조건에서 화학적 안정성이 증 가된 것을 특징으로 하는 면역글로불린에 친화성을 갖는 단백질에 관한 것이다. 변이 도입 전의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열이 , 서열번호 1에 기재된 단백질 A의 A 도메인의 염기서열， 또는 서열번호 2에 기재된 단백질 A의 A 도메인 에서 유래하는 아미노산 서열인 것이 바람직하다. 본 발명에서 상기 돌연변이 단백질은 서열번호 2에 정의된 아미노산 서열을 포함하거나 이의 기능적 변이체이다. "기능적 변이체" 는 증가된 pH 값의 환경에 서 돌연변이 단백질의 향상된 화학적 안정성 또는 면역글로불린에 대한 친화성에는 영향을 주지 않는 아마노산 위치에서 하나 이상의 추가 변이를 포함하는 모든 유사 한 서열을 포함한다ᅳ 변이 도입 전의 아미노산 잔기에 있어서， 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 18 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asn , 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 23 위 치에 대옹하는 아미노산 잔기가 Asn, 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 28 위치에 대웅하는 아미노산 잔기가 Asn, 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 36 위치에 대웅 하는 아미노산 잔기가 Asp , 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 43 위치에 대웅하는 아미노산 잔기가 Asn, 또는 각 도메인에 있어서의 A 도메인의 52 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asn인 것이 바람직하다.
본 발명에서 스타필로코쿠스 단백질 A의 각 도메인에 도입되는 아미노산 치 환 변이가 A 도메인의 18 위치에 대움하는 Asn를 Hi s로 치환하는 변이 (N18H) , A 도 메인의 36 위치에 대응하는 Asp를 Val로 치환하는 변이 (D36V) , A 도메인의 43 위치 에 대응하는 Asn를 Tyr 또는 Leu로 치환하는 변이 (N43Y/L) 및 A 도메인의 52 위치 에 대웅하는 Asn를 Ser로 치환하는 변이 (N52S)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게, 본 발명의 상기 변이 A 도메인은 상기 서열번호 2로 표시 되는 폴리펩타이드에서 18번째 아스파라긴이 히스티딘으로 치환된 폴리펩타이드 (본 명세서에서 AEP1로 칭함, 서열번호 3， N18H) , 36번째 아스파르트산이 발린으로 치 환된 폴리펩타이드 (본 명세서에서 AEP4로 칭함， 서열번호 4 , D36V) , 43번째 아스파 라긴이 티로신으로 치환된 폴리펩타이드 (본 명세서에서 AEP5로 칭함, 서열번호 5 , N43Y/L) , 52번째 아스파라긴이 세린으로 치환된 폴리펩타이드 (본 명세서에서 AEP6 으로 칭함, 서열번호 6， N53S)가 바람직하다. 본 발명은 또한， 상기 18번째， 36번째， 43번째 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 변이 외에 23번째 및 /또는 28번째 위치에서의 아미노산 잔기 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특장으로 하는 면역글 로불린 -결합 단백질을 제공한다. 바람직하게는， 상기 23번째 위치에서의 돌연변이는 N23T, N23A, N23E , N23H, N23K, N23L , N23P, N23S 및 N23Y로 이루어진 군에서 선택되며， 상기 28번째 위치에 서의 돌연변이는 N28W, N28G, N28R, N28F 및 N28I로 이루어진 군에서 선택되는 것 올 특징으로 할 수 있으며， 더욱 바람직하게는 23번째 아스파라긴이 루신으로 치환 된 폴리펩타이드 (본 명세서에서 AEP2로 칭함， 서열번호 7， N23L) , 28번째 아스파라 긴이 트립토판으로 치환된 폴리펩타이드 (본 명세서에서 AES3로 칭함， 서열번호 8， N28W)일 수 있다. 본 발명은 또한 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있 어서， 18번째， 23번째， 28번째， 36번째， 43번째 및 52번째 위치의 아미노산이 모두 치환된 돌연변이 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 바람직하게는 서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서, N18H, N23L , N28W, D36V, N43Y 및 N52S 변이를 포함하는 서열번 호 9로 정의되는 단백질일 수 있다. 본 발명의 상기 돌연변이 단백질들은 IgG, IgA, IgD , IgE 및 IgM과 같은 면 역글로불린의 Fc 단편에 특이적으로 결합하는 단백질 리간드이며， 모분자보다 알칼 리 조건에서 더 장기간 친화성이 유지된다. 본 발명에 따른 상기 돌연변이 단백질의 증가된 알칼리 내성은 명세서 실시 예에 잘 나타나 있다. 본 발명의 실시예에서는 야생형 A 도메인의 1 , 2차 개량을 통하여 알칼리 내성이 증가된 변이체들을 발명하였으며, 최종적으로 각 잔기에서 가장 알칼리 내 성이 높은 잔기들을 모아 알칼리 내성이 야생형 A 도메인에 비해 월등히 증가한 변 이체를 개발하였다. 구체적으로 1차 개량은 야생형 A 도메인 염기 (서열번호 1)를 에러 유발성 중 합효소연쇄반웅 (error prone PCR) 방법을 이용하여 돌연변이 라이브러리를 제조하 고 야생형 대비 알칼리 내성이 증가된 변이를 탐색하여， 야생형 A 도메인 폴리펩타 이드 (서열번호 2)의 N18 , N23 , N28 , D36 , N43 , N52 위치에서 다른 아미노산으로 치 환된 돌연변이들을 선별할 수가 있었다. 구체체적으로 상기 돌연변이는 N18이 히스 티딘으로 치환， N23이 루신으로 치환， N28이 트립토판으로 치환， D36이 발린으로 치환， N43이 티로신으로 치환， N52가 세린으로 치환되는, 돌연변이체들이 선별되었 다.
2차 개량은 상기 1차 개량으로 선정된 6개의 아미노산 잔기 (N18H, N23L N28W, D36V, N43Y, N52S)에 대한 추가적인 개량을 위해 위치포화 돌연변이 라이브 러리를 제조하고 알칼리 내성이 증가된 변이체들을 탐색한 결과, 야생형 A 도메인 폴리펩타이드 (서열번호 2)의 N23 , N28 , N43 위치에서 추가적으로 다른 아미노산으 로 치환된 돌연변이들을 선별할 수가 있었다. 구체적으로 상기 돌연변이는 N23이 알라닌. 글루탐산， 히스티딘， 라이신， 류신， 프롤린， 세린， 티로신으로 치환， N28 이 글라이신, 아르기닌， 페닐알라닌， 이소류신으로 치환， N43이 류신으로 치환되는 돌연변이들이 선별되었다. 본 발명의 실시예에서 제조한 상기 변이체들의 알칼리 내성을 분석하여， 각 위치에서 가장 내성이 높았던 치환잔기를 모두 도입한 mAF (서열번호 9)를 발명하였 고， 이것은 야생형에 비해 알칼리 내성이 월등히 증가되었음을 확인하였다. 본 발명은 또한， 상기 설명한 돌연변이된 단백질 단위를 포함하며 반복 단위 를 둘 이상 포함하는 다량체를 제공한다. 즉， 상기한 단백질 단량체가 결합된 이량 체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체 단백질을 제공한다. 본 발명의 상기 다량체는 또한 스타필로코쿠스 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 상기 서열번호 9의 단백질이 결합된 사량체 (4mAF로 칭함， 서열번호 11)를 만들어 레진에 고정화한 후， 상업화된 레진 (Mabselect Sure, GE Heal thcare사)과 알칼리 내성을 비교하였을 때에 상업화된 레 진에 비해 알칼리 내성이 우수함을 확인하였다. 한편， 본 발명은 상기 면역글루불린 -결합 단백질 또는 상기 다량체를 암호화 하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터를 제공한다. 본 발명에서 용어 "재조합 발현백터" 란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산 (RNA)을 발현할 수 있는 백터로서， 폴리뉴클레오티드 (유전자) 삽입 물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제 물을 말한다/ 본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된 (operably l inked) "는 일반적 기 능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 ( funct ional l inkage)되어 있는 것을 말한다. 즉, 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어 본 발명의 변이 A 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열)이 발현 조절 서열에 의해 유전자 발현이 가능하게 되는 방 식으로 연결된 것을 의미하는 것으로， 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코 딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어야 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 백터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전 자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며， 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당 해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 본 발명의 재조합 발현백터는 상기 변이 A 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레 오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따라 백터 내에 클로닝된 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으 며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절서열은 백터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커 및 /또는 복제 기원 (repl icat ion or igin)올 같이 포함하고 있는 하나의 발현 백터 내에 포함될 수 있다. 또한 상기 발현백터는 발현조절 서열 및 필요에 따라 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 발현 조절 서열 (expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게' 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열 은 전사를 실시하기 위한 프로모터， 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서 열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열， 전사 및 해독의 종결을 조절 하는 서열， 개시코돈, 종결코돈， 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 상기 백터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열， OmpA 시그널 서열 등이， 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α -아밀라아제 시그널 서열， 서브틸리신 시그널 서열 등이， 숙주가 효모인 경우에는 MF a 시그널 서열ᅳ SUC2 시 그널 서열 등이， 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, a -인터페론 시 그널 서열， 항체 분자 시그널 서열 등올 이용할 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 발현백터는 클로닝분야에서 통상적으로 사용되는 백터라면 그 종 류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 플라스미드 백터， 코즈미드 백터， 박테리 오파아지 백터 및 바이러스 백터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+) ) , 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드 (pUBllO 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (ΥΕρ13, ΥΕρ24 및 YCp50) 등이 있으며， 상기 바이러스는 레트로바이러 스， 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물바이러스, 배클로바이러스 와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 상기 발현백터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환은 핵산 (본 발명의 변이 A 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오 티드)을 유기체， 세포， 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야 에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기칟공법 (electroporation), 원형질 융합， 인산 칼슘 (CaP04) 침전, 염화 칼슘 (CaCl2) 침전， 실리콘 탄화물 위스터 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리 (sonication), 아그로 . 박테리아 매개된 형질전환， PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법, 덱스트란 설페이트， 리포펙타민， 열충격 (heat shock)법， 입자 총 층격법 (particle gun bombardment ) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 상기 숙주세포 (host cell)는 임의의 수단 (예: 전기층격법， 칼슘 포스파타제 침전법, ᅳ미세주입법， 형질전환법， 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이 종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다. 본 발명에서 상기 숙주세포는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종 류의 단세포 유기체， 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia속， 대장균， 등) 등 의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤층 세포， 식물 세포， 포 유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며， 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나 타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있 다. 본 발명에서 상기 숙주세포는 클로스트리디아 속 (Clostridia spp., 예컨대， Clostridium acetobutyl icum, Clostridium bei jerincki i , Clostridium saccharoperbuty 1 acet oni cum , 또는 Clostridium saccharobuty 1 i cum 등)， 에세리치 아 속 (Escherichia spp.), 아세토박터 속 (Acetobacter spp. , 예컨대 Acetobacter turbidans, Acetobacter pasteurianus 등)， 아에로모나스 속 (Aeromonas sp . ) , 알 칼리제네스 속 (Alcaligenes spp . ) , 아파노클라디움 속 (Aphanocladium spp.), 바실 러스 속 (Bacillus spp.), 세팔로스포리움 속 (Cephalospor ium spp.), 플라보박테리 움 속^^^！ ；^ 皿 spp.), 클루이베라 속 (Kluyvera spp.), 미코폴라나 속 (Mycoplana spp.), 프로타미노박터 속 (Protaminobacter spp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas spp. ) 및 잔토모나스 속 (Xanthomonas spp. , 예컨대 Xanthomonas citri 등)으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 속 (genus) 미생물일 수 있으 며， 이에 제한되지 않는다.. 본 발명에 따른 변이 A 도메인 폴리펩타이드 (단백질)는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면， 통상적인 방법에 따라 상기 변이 A 도메인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프 라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공 지된 표준 방법에 의해， 예컨대， 자동 DNA 합성기 (Biosearch 또는 Appl ied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operat ively l inked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열 (express ion control sequence) (예: 프로모터， 인핸서 등)을 포함하는 백터에 삽입시키고， 이로부터 형성된 재조합 발현 백터로 숙주세포 를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 배양해， 그 배양물로부터 회수함으로써 얻을 수 있다. 배양물이란 배양상청， 배양 세포 혹은 배양균체 또는 세포 혹은 균 체의 파쇄물을 의미할 수 있다. 배양 후， 본 발명의 개량형 단백질이 균체내 또는 세포 안에 생산되는 경우에는 초음파 처리， 동결 융해를 반족처리 등을 이용하여 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 단백질을 채취한다. 또， 그 단백질이 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는， 배양액을 그대로 사용하던지， 원심분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후， 변이 A 도메인 단백질의 분리정제는 기존에 밝 혀진 A 도메인의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리 방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 사용 가능하다. 또한， 히스티딘 펩티드와 니켈 컬럼 성분과의 결합력 또는 섬유소 결합부위 (cel lulose 결 합 domain, CBD)， 섬유소와의 결합력 등과 같은 특정 결합력 성질을 이용한 친화성 크로마토그래피 (aff inity chromatography) 방법에 의해 변이 A 도메인을 정제하는 것도 가능하다. 분리정제 한 본 발명의 개량형 단백질이， 목적대로의 아미노산 서열로 이루 어진 단백질인지를 확인하기 위해, 그 단백질을 포함한 시료를 분석 한다. 분석 방 법으로서는， SDS— PAGE, 웨스턴 블로팅， 질량 분석, 아미노산 분석， 아미노산 시퀀 서- 등을 이용할 수 있다 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드 (substant ial ly pure polypept ide) " 라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질 도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniat is et al . , Molecular Cloning; A laboratory Manual , Cold Spring Harbor laboratory, 1982； Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, N.Y. , Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymo 1 ogy , Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymo 1 ogy , Guthrie & Fink(eds . ) , Academic Press, San Diego, Calif, 1991； 및 Hitzeman et al. , J. Biol. Chem. , 255:12073—12080, 1990. 본 발명의 변이 A 도메인은 유리 (free) 상태뿐만 아니라 고정화시킨 상태로 사용하는 것이 가능하다. 변이 A 도메인의 고정화는 당업계에 공지된 통상적인 방 법에 의해 제조가 가능한데， 담체로서는 섬유소， 전분, 덱스트란， 아가로즈 (agarose) 등의 천연 폴리머 ; 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide)， 폴리아크릴레 이트 (polyacrylate), 폴리메타크릴레이트 (polymethacylate)， 유퍼짓 CXEupergit C) 등의 합성 폴리머; 또는 실리카 (silica), 벤토나이트 (bentonite), 금속과 같은 미 네랄 등이 사용 가능하다. 또한， 이들 담체에 공유결합, 이온결합， 소수성결합， 물 리적 흡착， 마이크로 인캡술레이션 (microencapsulation) 등에 의해 변이 A 도메인 을 결합시키는 것이 가능하다. 아울러， 이들 담체 -효소 결합체가 글루타르알데히드 (glutaraldehyde), 시아노겐 브로마이드 (cyanogen bromide) 등의 작용에 의해 공유 결합을 형성함으로써 변이 A 도메인을 고정화시키는 것도 가능하다. 또한, 변이 A 도메인을 따로 정제할 필요가 없이 변이 A 도메인을 함유한 미생물 세포를 그대로 고정화하여 사용하는 것도 가능하다. 이와 같은 전세포 고정화 (whole cell immobilization)시 미생물에 함유된 변이 A 도메인의 반웅성을 높이기 위하여 세포 에 구멍을 내거나 표면발현 등의 기술을 적용할 수도 있다. 본 발명은 또한 상기 면역글로불린 -결합 단백질올 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체에 커플 된 크로마토그래피용 매트릭스를 제공한다. 본 발명에 따른 매트릭스는 리간드로서 상기한 어떠한 형태의 돌연변이 단백 질도 포함할 수 있으며， 바람직하게는 고체 지지체상에 존재하는 리간드가 상기 다 량체일 수 있다. 본 발명에 따른 매트릭스의 고체 지지체는 모든 적합한 공지된 종류의 것일 수 있다. 통상적인 친화성 분리 매트릭스는 종종 유기 성질이며， 사용된 수성 매질 로 친수성 표면을 노출시키는， 즉 자신의 외부로 그리고 존재한다면 내부 표면상에 도 역시 히드록시 (-0H) , 카르복시 (-C00H) , 카르복스아미도 (-C0 H2 , 아마도 N-치환 된 형태로)， 아미노 (-NH2, 아마도 치환된 형태로) , 올리고- 또는 폴리에틸렌옥시기 를 노출시키는 중합체를 기제로 한다. 상기 중합체는 예를 들면, 덱스트란， 전분， 셀를로오스, 풀루란, 아가로오스 등의 다당류, 유리하게는 예를 들어 비스에폭시 드， 에피할로히드린, 1 ,2,3-트리할로 치환된 저급 탄화수소와 함께 가교결합된 다 당류를 기제로 하여， 적합한 다공성 및 강도를 제공할 수 있다. 바람직하게는 상기 고체 지지체가 다공성 아가로오스 비드이다. 본 발명에 사용된 지지체는 역 ( inverse) 현탁액 겔라틴화 등 표준적 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다 (S Hjerten: Biochem Biophys Acta 79(2) , 393-398(1964) ) . 이와 다르게는， 기제 매트 릭스가 시판되는 제품, 예컨대 세파로오스 (상표) FF(Amersham Biosciences , 스웨덴 웁살라 소재)이다. 대규모 분리에 특히 유리한 지지체는 그 강도를 증가시키도록 적웅시켜서 매트릭스를 높은 유속에 대해서 더 적합하게 한다. 한편, 본 발명의 상기 고체 지지쎄는 폴리비닐 알코올， 폴리히드록시알킬 아 크릴레이트， 폴리히드록시알킬 메타크릴레이트， 폴리아크릴아미드， 폴리메타크릴아 미드 등의 합성 폴리머를 기제로 할 수 있다. 디비닐 및 모노비닐-치환된 벤젠을 기제로 한 매트릭스와 같은 소수성 폴리머의 경우에는， 매트릭스 표면이 종종 친수 성화되어 둘러싼 수성 액체로 상기한 바와 같은 친수성기를 노출시킨다. 이러한 폴 리머는 표준적 방법에 따라 용이하게 제조하며， 예를 들면 문헌 ( "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerizat ion" , R. Arshady: Chi mica eL' Industria 70(9) , 70-75(1988) )을 참조한다. 이와 다르게는, 시판되는 제품， 예 를 들면 소스 (Source , 상표) (Amersham Biosciences , 스웨덴 웁살라 소재)가 사용된 다. 또한， 본 발명에 따른 상기 고체 지지체는 실리카， 산화지르코늄 등의 무기 성질의 지지체를 포함하며， 또는 고체 지지체가 표면， 칩， 모세관 또는 필터 등의 다른 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 매트릭스의 모양과 관련하여, 매트릭스는 다공성 모노리쓰 (monol i th)의 형태일 수 있다. 또는， 매트릭스가 다공성 또는 비다공성일 수 있는 비드형 또는 입자형이다. 비드 또는 입자형 매트릭스가 꽉찬 베드로서 또는 현탁된 형태로 사용될 수 있다. 현탁된 형태는 확장된 베드 및 순수한 현탁액으로 알려진 것들을 포함하며, 그 안에서 입자 또는 비드는 자유롭게 움직인다. 모노뫼쓰， 꽉찬 베드 및 확장된 베드의 경우， 분리 과정은 농도 구배를 통한 통상적인 크로마토그 래피 이후에 하는 것이 보통이다. 리간드는 예를 들어 리간드에 존재하는 아미노기 및 (또는) 카르복시기를 사 용하는 통상적인 커플링 기술을 통해 지지체에 부착될 수 있다. 비스에폭시드， 에 피클로로히드린， CNBr , N-히드록시숙신이미드 (NHS) 등은 잘 알려진 커플링제이다. 지지체와 리간드 사이에， 스페이서로서 알려진 분자를 도입할 수 있으며， 이는 리 간드의 활용도를 향상시키고 리간드의 지지체로의 화학적 커플링을 용이하게 할 것 이다. 이와 다르게는， 리간드는 물리적 흡착 또는 생물특이적 흡착 등의 비공유결 합에 의하여 지지체에 부착될 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이 단백질， 다량체 또는 매트릭스가사용되 는， IgG, IgA 및 (또는) IgM 등의 면역글로불린을 단리하는 방법을 제공한다. 바람 직하게는 매트릭스를 사용하여 면역글로불린을 단리하는 방법일 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 면역글로불린 단리 방법은
a) 면역글로불린을 포함하는 용액을 시료로서 제공하는 단계;
b) 상기 시료를 상기의 돌연변이 단백질 또는 다량체 또는 매트릭스와흠착 시키는 단계;
c) 상기 크로마토그래피 매트릭스를 세척하여， 미결합 오염물질을 제거하는 단계 ; 및
d) 상기 매트릭스에서 표적 분자를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 각 단계에 대하여 상세히 설명한다. 상기 a) 단계는 면역글로불린을 포함하는 용액을 시료로서 제공하는 것을 특 징으로 한다. 본 발명에서 '면역글로불린 ( immunoglobul in)' 은 혈청성분 중 면역에 중요 한 역할을 하며， 항체 작용을 하는 단백질의 총칭을 의미한다. 기본구조는 분자량 약 2만 3000의 L사슬 (가벼운 사슬) 1쌍과 5만 ~7만의 H사슬 (무거운 사슬) 1쌍이 S-S 다리걸침에 의해 결합된 것으로， H 사슬의 종류에 따라 IgG, IgA, IgM, IgD, IgE로 분류된다 상기 b) 단계는 a) 단계의 시료를 상기의 돌연변이 단백질 또는 다량체 또는 매트릭스와 흡착시키는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 시료에 포함되어 있는 면역글로불린이 매트릭스 상에 존재하는 리간드에 흡착될 수 있는 조건 (예를 들어， pH, 염 농도 등)을 설정한 뒤， 시료의 흐름을 층분히 느리게 하여 매트릭스를 통과시켜， 면역글로불린이 매트릭스에 층분 히 흡착되도록 한다. 본 발명에서 앞서 설명한 바와 같이， 돌연변이 단백질은 서열번호 2에 정의 된 아미노산 서열을 포함하거나 이의 기능적 변이체이고， 다량체는 돌연변이된 단 백질 단위를 포함하며 반복 단위를 둘 이상 포함하는 단백질이며， 매트릭스는 면역 글로불린 -결합 단백질을 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체에 커플링된 크로마 토그래피용 매트릭스인 것을 의미한다. 상가 c) 단계는 b) 단계의 크로마토그래피 매트릭스를 세척하여， 미결합 오 염물질을 제거하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 매트릭스에 시료에 사용된 수용액 또는 알칼리성 제제 등올 이 용하여 매트릭스를 세척하여 미결합된 물질 또는 오염 물질을 제거하는 것을 특징 으로 한다. 상기 d) 단계는 c) 단계의 매트릭스에서 표적 분자를 회수하는 것을 특징으 로 한다.
바람직하게는 미결합 물질 또는 오염 물질이 제거된 매트릭스에 용출제 또는 표적 분자와 친화성이 높은 용액을 통과시켜， 표적 분자를 단리시키는 것을 특징으 로 한다. 보다 바람직하게는 면역글로불린 ( immunoglobul in)올 단리시키는 것일 수 있다. 따라서， 본 발명은 하나 이상의 표적 화합물이 상기한 돌연변이 단백질 또는 다량체 또는 매트릭스에 흡착됨으로써 액체로부터 분리되는, 크로마토그래피 방법 을 포함한다. 원하는 생성물이 분리된 화합물 또는 액체일 수 있다. 따라서, 본 발 명의 이런 측면은 널리 사용되고 잘 알려진 분리 기술인 친화성 크로마토그래피에 관한 것이다. 간단하게 설명하면， 제 1 단계에서 표적 화합물， 바람직하게는 상술한 바와 같은 항체를 포함하는 용액을 표적 화합물이 분리 매트릭스 상에 존재하는 리 간드에 흡착될 수 있는 조건하에서 분리 매트릭스를 통과시킨다. 이러한 조건은 예 를 들면 pH 및 (또는) 염 농도, 즉 용멕 중의 이온 세기에 의하여 조절된다. 매트릭 스의 용량을 초과하지 않도록 주의해야 하는데， 즉 만족스러운 흡착이 가능하도록 층분히 흐름을 느리게 하여야 한다. 이 단계에서， 그 용액의 다른 성분들은 원칙적 으로 막히지 않고 통과할 것이다. 필수적인 것은 아니나, 보유된 물질 및 (또는) 느 슨하게 결합된 물질을 제거하기 위하여 그 후 매트릭스는 수용액 사용하는 등에 의 하여 세척한다. 본 매트릭스는 상술한 바와 같이 , 알칼리 제제를 사용하는 세척 단 계를 통해 가장 유리하게 사용된다. 다음 단계에서， 용출제로 칭하는 계 2 용액을 표적 화합물의 탈착， 즉 방출을 가능케 하는 조건하에 매트릭스 위로 통과시킨다. 이러한 조건은 pH, 염 농도, 즉 이온 세기， 소수성 등의 변화에 의하여 통상 제공 된다. 구배 용출 및 단계식 용출 등 여러 가지 용출 방법이 알려져 있다. 용출은 매트릭스 상에서 원하는 항체를 대체할 경쟁 물질을 포함하는 제 2 용액에 의해 가 능할 수 있다. 친화성 크로마토그래피의 원리의 일반적 개관은 예를 들면 문헌 (Wi lchek, M. , and Chaiken, 1 . 2000, An overview of aff inity chromatography, Methods Mol . Biol . 147: 1-6)을 참조한다. 본 발명은
a) 표적 화합물을 포함하는 용액을 시료로서 제공하는 단계;
b) 상기 시료를 상기의 돌연변이 단백질 또는 다량체 또는 매트릭스를 통과 시켜， 표적 화합물을 매트릭스 상의 리간드에 흡착시키는 단계;
c) 상기 크로마토그래피 매트릭스를 세척하여 느슨하게 결합된 물질 및 미결 합된 물질을 제거하는 단계; 및
d) 용출제를 상기 매트릭스 위로 통과시켜 표적 화합물을 용출시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 표적 화합물이 분리되는 방법， 즉 크로마토그래피 방법을 제 공한다. 각 단계에 대하여 상세히 설명한다. 상기 a) 단계는 표적 화합물을 포함하는 용액을 시료로서 제공하는 것을 특 징으로 한다.
본 발명의 '표적 화합물' 은 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 -결합 단백질에 의해 정제되어 나오는 단백질을 의미하며， 바람직하게는 면역글로불린일 수 있다. 상기 b) 단계는 a) 단계의 시료를 상기의 돌연변이 단백질 또는 다량체 또는 매트릭스를 통과시켜， 표적 화합물을 매트릭스 상의 리간드에 흡착시키는 것을 특 징으로 한다.
앞서 설명한 바와 같이， 바람직하게는 시료에 포함되어 있는 표적 화합물이 매트릭스 상에 존재하는 리간드에 흡착될 수 있는 조건 (예를 들어， pH , 염 농도 등 )올 설정한 뒤， 시료의 흐름을 충분히 느리게 하여 매트릭스를 통과시켜， 면역글로 불된이 매트릭스에 층분히 흡착되도록 한다. 상기 c) 단계는 b) 단계의 크로마토그래피 매트릭스를 세척하여 느슨하게 결 합된 물질 및 미결합된 물질을 제거하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 매트릭스에 시료에 사용된 수용액 또는 알칼리성 제제 등을 이 용하여 매트릭스를 세척하여 느슨하게 결합된 물질， 미결합된 물질 또는 오염 물질 을 제거하는 것을 특징으로 한다. 상기 d) 단계는 용출제를 c) 단계의 매트릭스 위로 통과시켜 표적 화합물을 용출시키는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 미결합 물질 또는 오염 물질이 제거된 매트릭스에 용출제 또는 표적 화합물과 친화성이 높은 용액을 통과시켜, 표적 화합물을 분리시키는 것을 특 징으로 한다. 보다 바람직하게는 면역글로불린 단백질을 분리시키는 것일 수 있다. 본 발명은 상기의 면역글로불린 단리 방법으로 단리된 면역글로불린 단백질 을 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 크로마토그래피 방법으로 분리된 표적 화합물을 제공 한다. 상기.면역글로불린 -결합 단백질은 앞서 설명한 바와 동일하다. 【유리한 효과]
본 발명은 내알칼리성이 향상되어 다수의 알칼리 세정에 대한 안정성이 향상 된 항체 정제용 면역글로불린 -결합 단백질 리간드 및 매트릭스를 제공할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 알칼리 내성 증가를 위한 개량실험을 통해 선별된 잔기의 정보이다. 도 2는 개량을 통해 선별된 변이 A 도메인들의 알칼리 내성 증가를 나타내는 그래프이다.
도 3은 알칼리 내성에 기여하는 잔기들을 모두 반영한 변이 A 도메인 (mAF)과 야생형 A 도메인 (wAd)의 알칼리 내성을 비교한 그래프이다.
도 4는 알칼리 내성에 기여하는 잔기들을 모두 반영한 변이 A 도메인 사량체 (½AF)를 레진으로 제작한 후에， 상업화 레진 (Mabselect sure)과 알칼리 내성을 비 교한 그래프이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
개량을 위한 재조합 면역글로불린 G의 Fc 단백질 제조 <1-1> 면역글로불린 G의 Fc 도메안 유전자 합성
인간의 IgGl로부터의 Fc 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 NCBI 사이트의 Blast를 통해 찾았고 (GenBank accession no . Y 14735) 코스모진텍 (대전， 한국) 회사 에 의뢰하여 합성하였다.
<1-2> pET-Fc 플라스미드의 제조
pET-Fc 플라스미드는 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 Fc 유전자를 pET29a (+) 백터 (Stratagene사， 미국)의 Ndel과 Xhol 제한효소 인식부위에 삽입하여 제조하였 다. 자세하게는 하기와 같다. 상기 실시예 <1-1>에서 합성을 통해 얻은 Fc 유전자 DNA 산물을 제한효소 Ndel과 Xh 로 절단한 후， 정제 키트 (QIAEX Gel Extract ion Kit ; Qiagen사， 독일) 로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하였다. 또한， pET29a (+) 백터 DNA를 제한효소 Ndel과 Xh이으로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 백터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 백터 DNA를 T4 DNA 리가제 (Roche사, 독일)를 이용하여 16°C에서 12-16시간 동안 접합 ( l igat ion)시킨 후， 상기 접합액을 이용하여 전기천공법 (electrophorat ion)으로 발현용 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 40 u g/raL 농도의 카나마이신 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하 여 37°C에서 하룻밤 정치배양을 함으로써 형질전환체를 선별하였다. 이 형질전환체 로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써, 서열번호 12 의 염기서열을 갖는 Fc 유전자를 포함하는 pET-Fc 플라스미드를 제조하였다. 상기 pET-Fc 플라스미드는 서열번호 13로 표시되는 야생형 Fc 단백질을 발현한다.
<1-3> 니켈-친화성 레진을 이용한 단백질 정제
대장균 BL2KDE3) 형질전환체를 종균배양하기 위해 카나마이신 항생제가 함 유된 LB 액체배지 5 mL이 분주 된 50 mL의 코니칼 류브에 접종한 후， 37°C , 200 rpm 조건으로 16시간 진탕배양하였다. 상기 배양액을 LB 액체배지 200 mL이 분주된 500 mL 삼각 플라스크에 종균배양액의 l )(v/v)를 접종한 후， 37°C， 200 rpm으로 진 탕배양하여 약 OD600=0.6에서 최종농도가 1 mM이 되도록 IPTG isopropyl-β -D-thio- galactopyranoside)를 첨가하여 37°C , 200 rpm, 18시간 동안 추가 진탕배양하였다. 이 플라스크 배양액을 원심분리 (4°C , 10000 rpm, 30분)하여 균체를 회수한 후 PBS 버퍼 (pH 7.4) (인트론 바아오테크놀로지， 한국) 10 mL의 용액에 현탁하여 4°C에서 초음파 분쇄기로 15분 동안 파쇄하고 4°C , 10,000 rpm 조건으로 30분 동안 원심분 리하여 상등액만을 취했다. 니켈 친화성 레진인 NiNTA Chelat ing Agarose CL- 6B( Incospharm사， 한국) 1 mL을 층진시킨 컬럼에 5 mL의 결합버퍼 (20 mM NaH2P04,
30 mM NaCl , 10 mM Imidazole pH 7.4)를 흘려주고 상기의 상등액 2.5 mL과 결합 버 퍼 5 mL을 섞은 후 컬럼에 흘려준다. 세척버퍼 (20 mM Na¾P04, 30 mM NaCl , 20 mM
Imidazole pH 7.4) 5 mL을 흘려준 뒤 용출버퍼 (20 mM NaH2P04 ) 30 mM NaCl , 300 mM
Imidazole pH 7.4) 2.5 mL을 15 mL의 conical tube에 받는다. 정제된 단백질은 PD10 column을 이용하여 desal t ing을 진행하였다. <실시예 2>
스타필로코쿠스 아우레우스 7ret/sy>유래 단백질 A의 A도메 인 발현백터 제작
<2-1> A도메인 유전자 합성
스타필로코쿠스 아우레우스 aureus) 유래의 단백질 A의 세 번째 도메인인 A 도메인 유전자에 차후 단백질 정제를 고려하여 HQ tag를 포함시킨 유전자를 코스모진텍 (대전， 한국) 회사에 의뢰하여 합성하였다.
<2-2> pBC-wAd플라스미드의 제조
pBC-wAd 플라스미드는 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 A 도메인 유전자를 pBC KS (+) 백터 (Stratagene사， 미국)의 Ndel과 Not l 제한효소 인식부위에 삽입하여 제 조하였다. 자세하게는 하기와 같이 진행하였다. 상기 실시예 <2-1〉에서 합성올 통 해 얻은 wAd 유전자 DNA 산물을 제한효소 Ndel과 Not l로 절단한 후， 정제 키트 (QIAEX Gel Ext ract i on Ki t ; Qi agen사, 독일)로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하 였다. 또한, pBC KS (+) 백터 DNA를 제한효소 Ndel과 Not l로 절단하고 CIP로 탈인산 화시킨 DNA 단편을 백터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽밉 DNA와 백터 DNA를 T4 DNA 리가제 (Roche사， 독일)를 이용하여 16°C에서 12~16시간 동안 접합 ( l igat i on)시킨 후, 상기 접합액을 이용하여 전기천공법 (e lectrophorat ion)으로 대장균 DH5 a균주 에 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 u g/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 37°C에서 하룻밤 정치배양을 함으로써 형질전환체 를 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열 을 결정함으로써， 서열번호 1의 염기서열을 갖는 야생형 A 도메인 유전자를 포함하 는 pBC-wAd 플라스미드를 제조하였다. 상기 pBC-wAd 플라스미드는 서열번호 2로 표 시되는 야생형 A 도메인 단백질을 발현한다.
<실시예 3>
에러 유발성 중합효소연쇄반응 (error prone PCR)방법을 이용한 wAd 개량 <3-1> 에러 유발성 증합효소연쇄반웅 (error prone PCR)에 의한 wAd 변이체 라이브러리의 제작
합성한 wAd 유전자의 염기서열에 인위적으로 무작위 돌연변이를 유발하기 위 해 에러 유발성 중합효소연쇄반웅 (error prone PCR)을 수행함으로써 돌연변이 라이 브러리를 제조하였다. 구체적인 돌연변이 라이브러리의 제조과정은 다음과 같다. 에러 유발성 증합효소 연쇄반웅은 Divers ityRandom Mutagenesis ki t (클론텍， 미국) 를 사용하여 1000 bp당 1-2개의 돌연변이가 일어나도톡 유도하였고, PCR 반웅액의 조성은 주형 DNA로서 1 ng의 pBC-wAd 플라스미드， 각 10 ρηκ>1의 EP-F 프라이머 (서 열번호 14)와 Τ7 프라이머 (서열번호 15)， 40 μ Μ dGTP, Diversi ty dNTP mix , TITANIUM Taq polymerase로 최종부피는 100 로 조정하여 수행하였다. PCR은 Takara PCR Thermal Cycler (다카라， 일본)를 사용하였고， 반웅조건은 반웅 혼합액 을 94°C에서 30초 동안 전 -변성시키고 변성을 94°C에서 30초， 어닐링을 55°C에서 30초 및 중합을 68°C에서 3분 동안 수행하는 반웅을 16희 반복한 후 68°C에서 1분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건의 에러 유발성 중합효소 연쇄반웅을 통해 얻은 각 각의 변이 wAd 유전자의 PCR 산물을 제한효소 Ndel과 Not l로 절단한 후 QIAEX Gel Extract ion Ki t (퀴아젠， 독일)를 사용하여 정제한 후 삽입 DNA로 사용하였고， pBC- KS (+) 플라스미드를 제한효소 Ndel과 Not l로 절단하여 회수한 3.4 kb 크기의 DNA 단편을 백터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽압 DNA와 백터 DNA를 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs , 스웨덴)를 이용하여 16°C에서 16시간 동안 접합시킨 후， 상기 접 합액을 이용하여 전기천공법으로 대장균 DH5 a 균주의 형질전환을 수행하였다. 상 기 균주를 20 u g/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하 여 37°C에서 하룻밤 정치배양을 함으로써 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하였 다.
<3-2> 알칼리 내성이 증가된 변이체 선발
상기 돌연변이가 유발된 변이 wAd 유전자가 포함된 대장균 DH5 a 형질전환체 를 클로람페니콜 항생제가 함유된 LB 액체배지 600 ii L씩 분주된 96-딥 웰 플레이 트 (바이오니아， 한국)에 접종한 후， 37°C , 280 rpm 조건으로 18시간 동안 진탕배양 하였다. 구체적인 단백질 정제 과정은 Promega Hi sLink™ 96 Protein Puri f icat ion System(Promega사， 미국)을 사용하여 진행하였다. 600 의 배양액에 60 u L의 FastBreak™ Cel l Lysis Reagent , 10X /DNase I solut ion을 넣고 45 i L의 HisLink ™ Res in을 각 웰에 장착시킨 다음 100 rpm 조건으로 30분 동안 섞어준다 . 반응액 과 레진은 Fi ltrat ion 플레이트에 옮기고, Vac-ManVacuum Mani fold(Promega사， 미 국)를 이용하여 10초 동안 진공을 가해 필터링하였다. 다음으로 250 ii L의 wash bufffer를 96웰에 첨가한 뒤 10초간 진공을 가한다. 같은 방법으로 3회 세척하였 다. 플레이트에 용출 버퍼 (100 mM HEPES, 50 mM Imidazole , pH 7.5)를 200 ii L를 첨가하여 10분 동안 반웅시킨 뒤 1분간 진공을 주어 새로운 96-웰 플레이트에 정제 된 단백질을 받았다. 정제한 wAd 변이체들을 96-웰 플레이트에서 NHS(N-hydroxysuccinimide)— Act ivated sepharose 4 Fast f low(GE Heal thcare사， 스웨덴)에 커플링하였다. 실시 예 <1— 3>에서 정제한 Fc 150 n L(59.5 y g/mL)를 상기 NHS-act ivated 세파로오즈 비드에 커플링된 wAd 변이체들이 포함되어 있는 Fi ltrat ion 플레이트에 옮기고 상 온에서 100 rpm으로 1시간 동안 반웅시켰다. 비결합한 Fc 단백질은 진공을 주어 제 거하고， PBS 버퍼 150 를 분주하고 진공을 가해 세척하였다. 이 세척과정을 3회 반복하였다. 용출 버퍼 (0.1 M GlycineHCl , pH 3.0)를 150 u L 넣고 상온에서 30초 동안 반웅시킨 뒤 1분간 진공을 주어 새로운 96-웰 플레이트에 단백질을 받았다. 용출 버퍼를 처리했던 Fi ltrat ion 플레이트는 PBS 버퍼 150 ii L를 분주하고 진공을 가해 세척하였다. 이 세척과정을 3번 반복하였다. 상기 상등액을 옮긴 새로운 96- 웰 플레이트는 Synergy HTX mul t i-mode reade(BioTek, 미국)기를 사용학여 0D280에 서 Fc 단백질 양을 측정하였다. wAd 변이체들의 알칼리 내성을 확인하기 위해서 Fi ltrat ion 플레이트에 들어있는 wAd 변이체 레진에 0.5 N NaOH를 150 ii L를 첨가 하여 상온에서 100 rpm으로 6시간 동안 반응시켰다. 그 후， PBS 버퍼로 3회 세척하 고 상기와 같은 방법으로 잔존하는 Fc 결합 활성을 분석하였다. 상기 실시예 <3-3>의 mAEP 변이체들의 0.5N NaOH 처리하기 전과 후의 흡광도 값을 비교하여 wAd보다 알칼리 내성이 증가된 wAd 개량 단백질을 선발하였다. 6개 변이체는 유전자의 염기서열 결정을 통하여 AEP N18H) (서열번호 3)， AEP4(D36V) ( 서열번호 4) , AEP5(N43Y) (서열번호 5) , AEP6(N52S) (서열번호 6) , AEP2(N23T) (서열 번호 7)， AEP3(N28W) (서열번호 8) 으로 돌연변이 되었음을 확인하였다.
<실시예 4>
위치포화 돌연변이 (site-saturat ion mutagenesis) 방법을 이용한 wAd 개량 <4-1>위치포화 돌연변이 (site-saturat ion mutagenesis) 의한 wAd변이체 라 이브러리의 제작
추가적으로 알칼리 내성을 부여하기 위하여 실시예 <3 2>에서 선정된 6개의 아미노산 잔기 (N18 , N23 , N28 , D36 , N43 , N52)에 대해 위치포화 돌연변이 (si te- saturat ion mutagenesi s) 라이브러리를 제조하였다. 구체적으로， 18번째 아미노산 이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 pBC KS (+) 백터에 삽입되어있는 AEP1 (서 열번호 3)를 주형으로 18-F 프라이머 (서열번호 16)와 18— R 프라이머 (서열번호 17)， pFU-x React ion 버퍼 ， 10 mM dNTP ， pFU-χ polymerase로 최종 부피는 50 로 조 정하여 수행하였다. 반응조건은 반응 흔합액을 95°C에서 1분 동안 전 -변성시키고 변성을 95°C에서 50초, 어닐링을 53°C에서 50초 및 중합을 68°C에서 3분 동안 수행 하는 반응을 18회 반복한 후 68°C에서 10분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건의 PCR 산물을 획득하여 제한효소 Dpnl으로 18시간 동안 처리하였고， 정제키트 (PCR pur i f i cat ion Ki t ; 코스모진텍， 한국)로 정제하여 이를 바로 전기천공법 (electrophorat ion)으로 대장균 DH5 a균주에 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 u g/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 37°C에서 하룻밤 정치배양함으로써 위치포화들연변이 라이브러리를 제조하였다. 그 후 상기 서술한 방법과 동일한 방법으로 pBC KS (+) 백터에 삽입되어있는， AEP4(서열번호 4)， AEP5 서열번호 5)， AEP6(서열번호 6)， AEP2(서열번호 7)， AEP3C 서열번호 8)를 주형으로 각각 36-F 프라이머 (서열번호 20)와 36-R 프라이머 (서열번 호 21)， 43-F 프라이머 (서열번호 22)와 43-R 프라이머 (서열번호 23)， 52-F 프라이 머 (서열번호 24)와 52-R 프라이머 (서열번호 25)， 23-F 프라이머 (서열번호 26)와 23-R 프라이머 (서열번호 27)， 28-F 프라이머 (서열번호 28)와 28-R 프라이머 (서열번 호 29)를 사용하여 라이브러리를 제작하였다.
<4-2> 알칼리 내성이 증가된 변이체 선발
<3-2>에서 진행한 동일한 방법을 이용하여 라이브러리를 탐색한 결과 wAd 대 비 알칼리 내성이 증가한 변이체로 AES(N23A) , AES(N23E) , AES(N23H) , AES(N23K) , AES(N23L) , AESCN23P) , AES(N23S) , AES(N23Y) , AES(N28G) , AES(N28R) , AES(N28F) , AES(N28I ) , AES(N43L)이 추가적으로 선발되었다 (도 2) .
<실시예 5>
최종 알칼리 내성이 증가된 mAd 변이체 개발 <5-l> mAF 유전자 합성
상기 실시예 4에서 선발된 치환잔기를 참고하여 돌연변이 잔기위치에 가장 잔존 활성이 높았던 잔기들올 wAd에 도입하고자 하였다. 변이체로 N18H/N23L/N28W/D36V/N43Y/N52S 변이체를 디자인하여 mAF (서열번호 9)로 명명하고 HQ tag를 포함한 유전자를 코스모진텍 (대전， 한국) 회사에 의뢰하여 합성하였다.
<5-2> pBC-mAF플라스미드의 제조
상기 실시예 <5-1>에서 수득한 mAF 유전자를 상기 실시예 <1-2〉의 방법과 동 일하게 pBC KS(+) 백터 (Stratagene사， 미국)에 클로닝 하여 pBC— mAF 플라스미드를 제조하였다. 상기 pBC-mAF 플라스미드는 서열번호 10으로 표시되는 mAF 단백질을 발현한다.
<5-3> 변이 단백질 mAF 단량체의 알칼라내성 비교
상기 실시예 <1-4>와 같은 방법으로 단백질 정제를 하였고 <실시예 3〉과 동 일한 방법으로 시간에 따른 알칼리 내성을 비교하였다 (도 3) . 그 결과 도 3에서 보는 바와 같이， 본원 발명의 mAF 단백질은 0.5N NaOH에 24시간 처리 후 활성을 비교하였을 때， 야생형 아미노산 서열을 갖는 wAd 단백질에 비해， 약 7배 이상 알칼리 내성이 증가하였음을 확인하였다.
<실시예 6>
mAF사량체의 알칼리 내성 조사 <6-1> pET-4mAF 플라스미드의 제조
실시예 <5-3〉의 정확한 알칼리 내성 결과를 확인하기 위해 중합효소 연쇄반 응을 수행함으로서 mAF 유전자를 사량체로 제조하였다. 자세하기는 하기와 같이 진 행하였다. mAF 유전자 사량체를 제조하기 위하여， raAF를 주형으로 하고 mAF2-F 프라이 머 (서열번호 28)와 mAF2-R 프라이머 (서열번호 29)를 사용하여 유전자를 랜덤하게 이어 사량체를 만드는 PCR을 수행하였다. PCR 반응액의 조성은 각각의 주형 DNA, 프라이머， pfu-x 버퍼， dNTPs mix , pfu-χ polymerase로 최종부피는 100 μ 1로 조정 하여 수행하였다. PCR 반웅조건은 반웅 흔합액올 96°C에서 2분 동안 전 -변성시키고 변성을 96°C에서 30초, 어닐링을 54°C에서 30초 및 중합을 72°C에서 1분 동안 수행 하는 반응을 25회 반복한 후 72°C에서 5분 동안 후-중합시켰다. 얻어진 PCR산물은 정제 키트 QIAEX Gel Extract ion Ki t (퀴아젠， 독일)를 사용하여 정제하였다. 상기 mAF 유전자는 T4 DNA 리가제 (Roche사， 독일)를 이용하여 16°C에서 12-16시간 동안 접합 ( l igat ion)시킨 후， 정제 키트 (QIAEX Gel Extract ion Ki t ; Qi agen사， 독일)로 0.72 kb 크기의 사량체 mAF 유전자 산물을 회수하였다. 상기 회수한 사량체 mAF 유 전자를 주형으로 하고 4mAF-F 프라이머 (서열번호 30)와 4mAF_R 프라이머 (서열번호 31)를 사용하여 상기 방법과 동일하게 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 정제 키트 (QIAEX Gel Extract ion Kit ; Qiagen사， 독일)로 0.72 kb 크기의 사량체 mAF 유 전자 DNA 산물을 회수하였고, 제한효소 Ndel과 Xh이로 절단한 후， 0.72 kb 크기의 사량체 mAF 유전자 DNA를 정제 키트 (QIAEX Gel Extract ion Ki t ; Qiagen사， 독일)로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하였다. 또한， pET29a(+) 백터 DNA를 제한효소 Ndel 과 Xh이으로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 백터 DNA로 사용하였다. 상 기의 삽입 DNA와 백터 DNA를 T4 DNA 리가제 (Roche사, 독일)를 이용하여 16°C에서 12~16시간 동안 접합 ( l igat ion)시킨 후， 상기 접합액을 이용하여 전기천공법 (electrophorat ion)으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환을 수행하였다. 상기 균 주를 40 u g/mL 농도의 카나마이신 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 37°C 에서 하룻밤 정치배양함으로써 형질전환체들을 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써， 서열번호 11의 염기 서열올 갖는 4mAF 유전자를 포함하는 pET-4mAF 플라스미드를 제조하였다. 상기 pET-4mAF 플라스미드는 서열번호 32로 표시되는 변이 단백질 4mAF를 발현한다.
<6-2> 니켈-친화성 레진을 이용한 변이 단백질 mAF사량체의 정제
대장균 BL21Q 3) 형질전환체를 종균배양하기 위해 카나마이신 항생제가 함 유된 TB 액체배지 5 mL이 분주된 50 mL의 테스트 튜브에 접종한 후， 37°C， 200 rpm 조건으로 16시간 진탕배양하였다. 상기 배양액을 TB 액체배지 500 mL이 분주된 2000 mL 삼각 플라스크에 종균배양액의 1 %(v/v)를 접종한 후， 37°C， 200 rpm으로 진탕배양하였고， 약 0D600=0.6에서 최종농도가 1 mM이 되도록 IPTGU sopropyl-β -Ι)— thio-galactopyranoside)를 첨가하여 37°C , 200 rpm, 18시간 동안 진탕배양하였다. 이 플라스크 배양액을 원심분리 (4°C , 10000 rpm, 30분)하여 균체를 회수한 후 PBS 버퍼 (pH 7.4) (인트론 바이오테크놀로지， 한국) 20 mL의 용액에 현탁하여 4°C에서 '초음파 분쇄기로 30분 동안 파쇄하고 4°C , 10 , 000 rpm 조건으로 30분 동안 원심분 리하여 상등액만을 취한다. Ni NTA Chel at ing Agarose CL-6B (인코스팜사, 한국) 5raL을 층진시킨 컬럼에 25 mL의 결합 버퍼 (20 mM NaH2P04 l 30 mM NaCl , 10 mM
Imidazole pH 7.4)를 홀려주고 상기의 상등액 20 mL과 결합 버퍼 40 mL을 섞은 후 컬럼에 홀려준다. 세척 버퍼 (20 mM Na¾P04 , 30 mM NaCl , 20 mM Imidazole pH 7.4)
25 mL을 홀려준 뒤 용출 버퍼 (20 mM Na¾P04, 30 mM NaCl , 300 mM Imidazole pH
7.4) 40 mL을 50 mL의 coni cal tube에 받는다. 정제된 단백질은 PD10 column을 이 용하여 desal t ing을 진행하였다.
<6-3> 변이 단백질 mAF사량체의 알칼리 내성 비교
실시예 <6-2>에서 정제한 4mAF를 NHS(N-hydroxysuccinimide)-AcUvated sepharose 4 Fast f low(GE Heal thcare사， 스웨덴)에 커플링하였다. 제작된 4mAF 레 진을 알칼리 내성이 높은 것으로 알려진 상업화된 레진 MabSelect Sure(GE Healthcare Li fe Sci cences사, 미국)와 알칼리 내성을 비교하였다. Di sposabl e c이醒 s(TherraoFi sher사, 미국)에 레진 100 ul와 5 mL의 0.5N NaOH를 넣고， 밀봉한 후 천천히 흔들어 주면서 알칼리 처리를 진행하였다. 일정시간 후에는 밀봉을 없애 고 NaOH를 중력으로 흘려주어 제거한 뒤， PBS 버퍼 (PH 7.4) (인트론 바이오테크놀로 지， 한국)로 레진을 5회 세척하였다ᅳ 2 mg/mL의 토끼 유래의 정제항체 (영인프런티 어， 한국) 5 mL을 레진과 섞어준 뒤에 다시 밀봉한 뒤， 천천히 흔들어 주면서 3시 간동안 실온에서 결합반응시켰다. 비결합한 항체 단백잘은 중력으로 흘려주어 제거 하고， PBS 버퍼로 3회 세척하였다. 용출 버퍼 (0.1 M GlycineHCl , pH 3.0) 3 mL을 홀려주어 결합된 항체를 분리하였다. 분리된 항체는 중성화 버퍼 ( 1M Tri s-HCl , pH
8.5) 300 ul가 들어있는 튜브에 전량을 받고 회수된 단백질 양을 측정하였다. 결합 분석이 끝난 뒤에는 용출 버퍼와 PBS버퍼로 교대로 세척하고 다시 5 mL의 0.5 N NaOH와 흔합하여 추가적으로 알칼리 처리하였다. 그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 , 본원 발명의 4mAF 레진은 산업용으로 널 리 사용되고 있는 MabSelect Sure에 비해， 알칼리 내성이 우수한 것을 확인하였다. 100시간 동안 알칼리 처리시 4mAF의 잔존활성은 33%로 MabSelect Sure비해 1.4배 높았다. 【산업상 이용가능성】
본 발명은 내알칼리성이 향상되어 다수의 알칼리 세정에 대한 안정성이 향상 된 항체 정제용 면역글로불린 -결합 단백질 리간드 및 매트릭스를 제공할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
서열번호 2로 정의된 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 18번째， 36 번째, 43번째 및 52번째로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 면역글로불린ᅳ결합 단백질.
【청구항 2】
계 1항에 있어서, 상기 돌연변이는 N18H , D36V, N43Y/L 및 N52S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역글로불린 -결합 단백질.
【청구항 3]
겨 U항에 있어서, 상기 단백질 또는 이의 기능적 변이체에 있어서 23번째 및 28번째로 이루어진 ·에서 선택된 어느 하나 이상의 위치에서의 아미노산 잔기 돌 연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린-결합 단백질.
【청구항 4]
제 3항에 있어서， 상기 23번째 위치에서의 돌연변이는 N23T, N23A, N23E , N23H , N23K, N23L, N23P, N23S 및 N23Y로 이루어진 군에서 선택되며， 상기 28번째 위치에서의 돌연변이는 N28W, N28G, N28R, N28F 및 N28I로 이루어진 군에서 선택되 는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 -결합 단백질.
【청구항 5】
제 3항에 있어서， 상기 면역글로불린 -결합 단백질은 서열번호 9로 정의된 아 미노산 서열을 갖는 것올 특징으로 하는 면역글로불린 -결합 단백질. .
【청구항 6】
제 1항에서 정의된 돌연변이된 단백질 단위를 포함하며 반복 단위를 둘 이상 포함하는 다량체 .
【청구항 7】
제 6항에 있어서, 스타필로코쿠스 단백질 A의 E, D , A, B 및 C 도메인 중 하 나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다량체.
【청구항 8]
제 1항의 면역글로불린 -결합 단백질 또는 계 6항의 다량체를 암호화하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 9]
제 8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터 .
【청구항 10】
제 9항의 백터로 형질전환된 형질전환체.
【청구항 11]
제 1항의 면역글로불린 -결합 단백잘을 포함하는 복수의 리간드가 고체 지지체 에 커플링된 크로마토그래피용 매트릭스.
【청구항 12]
제 1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 계 6항에 따른 다량체 또는 제 11항에 따 른 매트릭스가사용되는 면역글로불린의 단리 방법 .
【청구항 13】
게 1항에 따른 돌연변이 단백질 또는 제 6항에 따른 다량체 또는 제 11항에 따 른 매트릭스의 흡착에 의하여 액체로부터 하나 이상의 표적 화합물이 분리되는 크 로마토그래피 방법.
【청구항 14]
제 12항의 방법으로 단리된 면역글로불린 단백질.
【청구항 15]
제 13항의 방법으로 분리된 표적 화합물.
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