WO2017022759A1 - 免疫グロブリン結合性改変型タンパク質 - Google Patents

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WO2017022759A1
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amino acid
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immunoglobulin
lys
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正克 西八條
敬太 山下
修 小田原
健幸 土舘
昌行 高野
吉田　慎一
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株式会社カネカ
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    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
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    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/52—Sorbents specially adapted for preparative chromatography

Definitions

  • the present invention relates to a protein that specifically binds to a target substance, a ligand affinity separation matrix on which the protein is immobilized, and a separation and purification method using the matrix.
  • Monoclonal antibodies are mainly developed as antibody drugs, and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • a “monoclonal antibody” is an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Monoclonal antibodies produced by cultured cells are purified by various chromatographs to become pharmaceutical products.
  • affinity chromatography using a protein A affinity separation matrix is an indispensable process for the production of antibody drugs because antibodies can be purified from animal cell cultures in a single step with high purity.
  • Protein A is one of the cell wall proteins produced by the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus. Signal sequence S, five immunoglobulin binding domains (E domain, D domain, A domain, B) Domain, C domain) and an XM region which is a cell wall binding domain (Non-patent Document 1).
  • the protein A affinity separation matrix is prepared by immobilizing protein A on the separation matrix.
  • the protein A affinity separation matrix is generally expensive, and one of the reasons is that protein A itself is a recombinant protein that is produced in culture by a transformant containing a foreign gene and purified to a high purity. There are some.
  • the technology that can produce protein A with high culture productivity has industrial value, and its development is required.
  • Patent Documents 1 to 4 Many techniques have been developed to improve the functionality of protein A by modifying it through protein engineering. Examples of the modification of protein A include improvement of alkali resistance, improvement of antibody acid dissociation characteristics, and improvement of antibody binding capacity by introducing mutation at the immobilization point (Patent Documents 1 to 4).
  • a mutant protein obtained by introducing a plurality of mutations into a protein may have a decreased expression level in cells as compared with a wild type.
  • a method for preventing a decrease in the expression level of a protein by adding a highly expressed protein (tag sequence) to the N-terminus and producing the target protein as a fusion protein but the fusion protein contains an unnecessary tag sequence. Therefore, the activity of the target protein may be reduced.
  • the possibility that the activity of the target protein is reduced by removing the tag sequence from the fusion protein can be reduced, the number of steps for removing the tag sequence is increased, which is not efficient as a protein production method (Non-patent Document 2, Patent) Reference 5).
  • the present inventors designed many modified recombinants for protein A, obtained mutants using protein engineering techniques and genetic engineering techniques, and cultured the mutants. Productivity was evaluated. As a result, in two or more conjugates of domains derived from protein A, the properties of protein A such as antibody binding ability and alkali resistance are impaired by introducing mutations near the N-terminal of the most N-terminal domain. Thus, the present inventors have found that the culture productivity in the transformant can be improved and completed the present invention.
  • the present invention provides an amino acid derived from the most N-terminal domain in a protein having two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5.
  • a protein obtained by substituting an amino acid residue other than Arg for an amino acid residue corresponding to positions 4 and / or 7 of the C domain of a sequence, and culturing in a transformant as compared to before the substitution It relates to a protein with improved productivity.
  • the amino acid residue corresponding to position 4 of the C domain of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is Gln, Ala, Gly, Leu, Met, Phe, Pro, Val, Trp, Asn, Cys, Ser, Thr, A protein obtained by substituting for Tyr, Asp, Glu, His, or Lys is preferable.
  • Lys is preferably substituted with an amino acid residue other than Lys.
  • the present invention also relates to DNA encoding the protein.
  • the present invention also relates to a vector containing the DNA.
  • the present invention also relates to a transformant obtained by transforming a host cell with the vector.
  • the present invention also relates to a cell-free protein synthesis system using the DNA or a method for producing the protein using the transformant.
  • the present invention also relates to an affinity separation matrix obtained by immobilizing the protein as an affinity ligand on a carrier comprising a water-insoluble substrate.
  • An affinity separation matrix that binds to a protein containing the Fc region of an immunoglobulin is preferred.
  • the protein containing the Fc region of an immunoglobulin is preferably an affinity separation matrix which is an immunoglobulin G or an immunoglobulin G derivative.
  • the present invention also relates to a method for producing the affinity separation matrix, comprising a step of immobilizing the protein as an affinity ligand on a carrier made of a water-insoluble substrate.
  • the present invention also relates to a method for purifying a protein containing an immunoglobulin Fc region, comprising the step of adsorbing a polypeptide containing an immunoglobulin Fc region to the affinity separation matrix.
  • the protein of the present invention has improved culture productivity in transformants and can be produced economically and efficiently.
  • the protein of the present invention is an amino acid derived from the most N-terminal domain in a protein having two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5
  • a protein obtained by substituting an amino acid residue other than Arg for an amino acid residue corresponding to positions 4 and / or 7 of the C domain of a sequence, and culturing in a transformant as compared to before the substitution It is a protein with improved productivity.
  • the mutation for substituting an amino acid residue is described as a wild-type or non-mutated amino acid residue before the substitution position number, and the mutated amino acid residue after the substitution position number. Notation.
  • a mutation that replaces Gly at position 29 with Ala is referred to as G29A.
  • protein includes any molecule having a polypeptide structure, and a polypeptide chain that is fragmented or linked by peptide bonds is also encompassed by the term “protein”.
  • a “domain” is a higher-order structural unit of a protein, composed of several tens to several hundreds of amino acid sequences, and sufficient to express any physicochemical or biochemical function.
  • a domain particularly refers to a domain that binds to a protein containing an Fc region of an immunoglobulin.
  • the amino acid sequence derived from the domain refers to the amino acid sequence before substitution of amino acids.
  • the amino acid sequence derived from the domain is not limited to the wild-type amino acid sequence of the E, D, A, B, or C domain of protein A, but partially by amino acid substitution, insertion, deletion, and chemical modification. Even a modified amino acid sequence is included in the protein as long as it has a binding ability to the Fc region.
  • Examples of the amino acid sequence derived from the domain include amino acid sequences constituting E, D, A, B, and C domains of protein A of Staphylococcus described in SEQ ID NOs: 1 to 5, and protein A
  • Examples of the E, D, A, B, and C domains are proteins having an amino acid sequence in which a mutation that replaces Gly corresponding to position 29 of the C domain with Ala is introduced.
  • the Z domain in which the mutations A1V and G29A are introduced into the B domain also has an ability to bind to the Fc region, and therefore corresponds to the amino acid sequence derived from the domain.
  • the amino acid sequence derived from the domain is preferably a domain with high chemical stability or a variant thereof. Each domain can be aligned as shown in FIG. For example, the residue corresponding to position 31 of the C domain is the same position 31 in the A and B domains, and corresponds to position 29 in the E domain and position 34 in the D domain.
  • the amino acid sequence derived from each domain is an amino acid sequence in which an amino acid residue substitution that meets at least one of the following conditions (1) to (4) is introduced into the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 5 It is preferable that (1) The amino acid residue corresponding to position 29 of the C domain in each domain is Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Thr, Ser, Asp, Glu, Arg, His, or Met, (2) The amino acid residue corresponding to position 33 of the C domain in each domain is Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, His, or Met, (3) The amino acid residue corresponding to position 36 of the C domain in each domain is Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Glu, Arg, His, or Met, (4) The amino acid residue corresponding to position 37 of the C domain in each domain is One of Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Glu, Arg, His
  • the amino acid sequence derived from each domain is an amino acid sequence in which an amino acid residue substitution that meets at least one of the following conditions (1) to (4) is introduced into the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 5 It is more preferable that (1) The amino acid residue corresponding to position 29 of the C domain in each domain is One of Ala, Glu or Arg, (2) The amino acid residue corresponding to position 33 of the C domain in each domain is Leu, Thr, Glu, Gln, Arg, or His, (3) The amino acid residue corresponding to position 36 of the C domain in each domain is Either Ile or Arg, (4) The amino acid residue corresponding to position 37 of the C domain in each domain is One of Leu, Ile, Glu, Arg, or His.
  • sequence identity between the amino acid sequence derived from the domain and the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOS: 1 to 5 is preferably 85% or more, and 90% or more More preferably, it is more preferably 95% or more.
  • the protein of the present invention has two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5.
  • the number of domains contained in the protein of the present invention is 2 or more, preferably 3 or more, more preferably 4 or more, still more preferably 5 or more, and even more preferably 6 or more.
  • the number of domains contained in the protein of the present invention is 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 8 or less, and even more preferably 6 or less.
  • the amino acid sequences of the most N-terminal domain and the domain linked to the C-terminal side may be different.
  • the other domains except the most N-terminal domain are homodimers, homotrimers, etc., which are ligations of a single immunoglobulin-binding domain.
  • a protein with Lys attached to the end of the homopolymer, or a protein with Lys attached to the end of a heteropolymer such as a heterodimer or heterotrimer that is a conjugate of a plurality of immunoglobulin binding domains It may be.
  • Examples of the monomer protein linking method include a method of linking without intervening amino acid residues as a linker, or a method of linking with one or a plurality of amino acid residues, but is not limited to these methods.
  • the number of amino acid residues serving as a linker is not particularly limited, and is preferably one that does not destabilize the three-dimensional structure of the monomeric protein.
  • the “linker” in the present specification means a linker between domains, and is a linking part of linked monomeric proteins (single domains), that is, a C-terminal region and a C-terminal side of the N-terminal domain sequence. Refers to the region between the N-terminal regions of the domain sequence. In a protein in which N domains are linked in tandem, there are N-1 linkers. That is, the “linker” in the present specification is a region consisting of at least two amino acid residues of the C-terminal amino acid of the N-terminal domain to be linked and the N-terminal amino acid of the C-terminal domain.
  • the N-terminal / C-terminal sequence of the domain that does not take a specific secondary structure or is located at the boundary of the domain can be a linker.
  • the linker is, for example, about the N-terminal side of the immunoglobulin G binding domain of protein A, from the 1st to 6th position, preferably from the 1st to 5th position, more preferably from the 1st to 4th position, more preferably 1 It is an amino acid residue corresponding to the -3 position, more preferably the 1-2 position, and at least the N-terminal amino acid residue is included in the linker.
  • E domain and D domain are different in full length from C domain, the amino acid residue corresponding to the said amino acid in C domain corresponds to a linker.
  • the linker is an amino acid corresponding to positions 55 to 58, preferably 56 to 58, more preferably 57 to 58, of the C domain, for example, on the C-terminal side of the immunoglobulin G binding domain of protein A.
  • the amino acid residue at position 58 which is a residue and at least the C-terminus, is included in the linker.
  • amino acid residues corresponding to positions 4 and / or 7 of the C domain in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain are amino acid residues other than Arg. It is a protein obtained by substitution.
  • An amino acid substitution means a mutation that deletes the original amino acid and adds another amino acid of a different type at that position.
  • the amino acid residue corresponding to position 4 of the C domain which is substituted in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain, is specifically the 2nd position of the E domain of protein A described in SEQ ID NO: 1.
  • An amino acid residue, an amino acid residue at position 7 in the D domain of protein A described in SEQ ID NO: 2, an amino acid residue at position 4 in the A domain of protein A as set forth in SEQ ID NO: 3, and a protein A as set forth in SEQ ID NO: 4 The amino acid residue at position 4 of the B domain of A, and the amino acid residue at position 4 of the C domain of protein A described in SEQ ID NO: 5.
  • amino acid residue corresponding to position 7 of the C domain which is substituted in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain, is specifically the 5th position of the E domain of protein A described in SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid residue, amino acid residue at position 10 of the D domain of protein A described in SEQ ID NO: 2, amino acid residue at position 7 of the A domain of protein A described in SEQ ID NO: 3, protein A according to SEQ ID NO: 4 The 7th amino acid residue of the B domain of A, and the 7th amino acid residue of the C domain of protein A described in SEQ ID NO: 5.
  • “Corresponding” means that when the E, D, A, B, and C domains of protein A are aligned as shown in FIG.
  • Gln As amino acid residues other than Arg after substitution in the amino acid residue corresponding to position 4 of the C domain of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain, Gln, Ala, Gly, Leu, Met, Phe, Pro , Val, Trp, Asn, Cys, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His, Lys, Gln, Ala, Gly, Leu, Met, Phe, Pro, Val, Trp, Asn, Cys, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His, and Lys are preferable, and Gln and Lys are more preferable.
  • amino acid substitution mutations at positions corresponding to positions 4 and 7 of the C domain may be introduced singly or in combination.
  • the mutations to be combined are preferably the following combinations (1) to (4). (1) 4th: Lys, 7th: Lys (2) 4th: Gln, 7th: Lys (3) 4th: Gln, 7th: Thr (4) 4th: Lys, 7th: Thr
  • Amino acid residues other than the positions corresponding to positions 4 and 7 of the C domain of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain have improved culture productivity in transformants compared to before substitution. As long as it is not particularly limited.
  • the amino acid sequence derived from the second and subsequent domains from the N-terminal side is not particularly limited as long as the culture productivity in the transformant is improved as compared with that before substitution.
  • Amino acid sequences other than the positions corresponding to positions 4 and 7 of the C domain of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain, and amino acid sequences derived from the second and subsequent domains from the N-terminal side include Examples include functional variants that do not contain Lys other than the linker and C-terminal. Examples of such a mutant include C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R. Described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing of WO2012 / 133349. 5d.
  • Lys refers to six Lys corresponding to positions 4, 7, 35, 49, 50, and 58 of the C domain in the E, D, A, and B domains of protein A. In the protein A C domain only, it refers to the 7 Lys at positions 4, 7, 35, 42, 49, 50, and 58.
  • the amino acid sequence before the mutation is introduced is a sequence that has undergone a deletion mutation, for example, in the case of a sequence in which positions 1 to 4 are deleted, the number is not limited to the above.
  • Amino acid residues contained in amino acid sequences other than positions corresponding to positions 4 and 7 of the C domain of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain, and amino acid sequences derived from the second and subsequent domains from the N-terminal side Is not particularly limited, and may be a natural amino acid residue, a non-protein-constituting amino acid residue, or a non-natural amino acid residue. From the viewpoint of genetic engineering production, natural amino acid residues can be preferably used.
  • an amino acid residue having a functional group having a high reactivity in the coupling reaction at the time of immobilization for example, cysteine (Cys) having a thiol group (-SH) in the side chain is an amino acid residue to be substituted As inappropriate.
  • amino acid sequences other than the positions corresponding to positions 4 and 7 of the C domain of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain, and amino acid sequences derived from the second and subsequent domains from the N-terminal side are various. It may contain amino acid substitutions that improve function. Examples of such amino acid substitution include one or more Gly in the amino acid sequence derived from any one of the E, D, A, B, and C domains of protein A described in WO2010 / 110288. An amino acid substitution in which is substituted with an amino acid other than Ala. Further, in the amino acid sequence derived from at least one domain selected from the E, D, A, B, and C domains of protein A described in International Publication No.
  • amino acid substitutions that introduce at least one amino acid substitution mutation into amino acid residues at positions 37 to 29, amino acid residues 29 to 35 of the E domain, or amino acid residues 34 to 40 of the D domain. These are amino acid substitutions that can improve antibody elution properties by reducing affinity for the Fab region.
  • a mutation to be substituted is preferable.
  • Lys is substituted with an amino acid residue other than Lys.
  • the number of Lys substituted with amino acid residues other than Lys is preferably 1 or more. More preferably, it is more preferably 3 or more, still more preferably 4 or more, particularly preferably 5 or more, most preferably 6 or more, Most preferably, it is all Lys.
  • amino acid substitution is performed on all Lys (lysine residues) derived from any domain selected from E, D, A, B, and C domains of protein A described in International Publication No. 2014/046278 Examples include amino acid sequences that include two or more amino acid sequences into which mutations are introduced, the amino acid sequences are linked to each other by a linker, and at least one linker includes Lys (lysine residue) or Cys (cysteine residue). .
  • Arg arginine
  • the following 20 amino acid residues are preferably retained 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the identity of the amino acid sequence as a whole protein is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and more preferably 95% or more, compared to the amino acid sequence before mutation introduction.
  • the sequence identity of amino acid sequences can be analyzed by those skilled in the art by direct comparison of sequences, and specifically can be analyzed using commercially available sequence analysis software or the like.
  • the protein of the present invention may be a fusion protein obtained by fusing other proteins having different functions.
  • the fusion protein include, but are not limited to, a protein in which albumin or GST (glutathione S-transferase) is fused.
  • the protein of the present invention may be obtained by fusing a nucleic acid such as a DNA aptamer, a drug such as an antibiotic, and a polymer such as PEG (polyethylene glycol).
  • the present invention also relates to a DNA comprising a base sequence encoding a protein obtained by the above method.
  • the DNA may be any amino acid sequence obtained by translating the base sequence as long as it constitutes the above-mentioned protein.
  • Such DNA can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • the base sequence constituting the DNA may not be the same as the original base sequence as long as the codon may be replaced with a degenerate codon and it encodes the same amino acid when translated.
  • Introduction of site-specific mutations for modifying the base sequence of DNA can be performed using recombinant DNA technology, PCR method or the like as follows.
  • the introduction of mutations by recombinant DNA technology can be performed when, for example, appropriate restriction enzyme recognition sequences exist on both sides of the target site where mutations are desired in the gene encoding the protein of the present invention. It can be performed by a cassette mutation method in which the enzyme recognition sequence is cleaved with the restriction enzyme, the region including the site where mutation is desired is removed, and then the DNA fragment mutated only to the target site is inserted by chemical synthesis or the like. .
  • site-specific mutation by PCR is, for example, a double double-stranded plasmid in which PCR is performed using a double-stranded plasmid encoding a protein as a template and two kinds of synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + and ⁇ strands. This can be done by the primer method.
  • DNA encoding a protein having two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5 is obtained by ligating DNA encoding one domain. can get.
  • DNA is ligated by introducing an appropriate restriction enzyme recognition sequence into the base sequence and ligating double-stranded DNA fragmented with the restriction enzyme with DNA ligase.
  • restriction enzyme recognition sequence may be used, but a plurality of different types of restriction enzyme recognition sequences may be introduced.
  • the method for producing DNA encoding a protein having two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5 is not limited to the above method.
  • it can be prepared by applying the above-described mutation introduction method to DNA encoding protein A (for example, International Publication No. 2006/004067).
  • the sequence identity between the nucleotide sequences of DNAs encoding linked monomeric proteins is preferably 90% or less, more preferably 85% or less.
  • the “vector” of the present invention includes the above-described protein, or a base sequence encoding a partial amino acid sequence thereof, and a promoter operable in a host operably linked to the base sequence. Usually, it can be obtained by linking or inserting a gene encoding the above-described protein into an appropriate vector.
  • the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can replicate autonomously in the host, and plasmid DNA or phage DNA can be used as the vector.
  • vectors such as pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Japan) may be used.
  • plasmid vectors useful for expression of genes of the genus Brevibacillus include pUB110, which is known as a Bacillus subtilis vector, or pHY500 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-31682), pNY700 (Japanese Patent Laid-Open No. 4-278091). , PNU211R2L5 (Japanese Patent Laid-Open No. 7-170984), pHT210 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-133782), or pNCMO2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-238569) which is a shuttle vector of Escherichia coli and Brevibacillus bacteria. It is done.
  • the protein of the present invention can be obtained as a fusion protein with a known protein having an effect of assisting protein expression or an effect of facilitating purification.
  • the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.
  • a fusion protein can be produced using a vector comprising the DNA of the present invention and a DNA encoding MBP or GST linked together.
  • the “transformant” of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • methods for introducing recombinant DNA into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, or a polyethylene glycol method.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Coryne Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • the protein of the present invention is produced by culturing the above-described transformed cells in a medium, and producing and accumulating the protein of the present invention in the cultured cells (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cells). And the desired protein can be collected from the culture.
  • the protein of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cell in a medium, and in the cultured cell (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cell). It is also possible to produce and accumulate a fusion protein containing, collect the fusion protein from the culture, cleave the fusion protein with an appropriate protease, and collect the desired protein.
  • the method of culturing the transformant of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as the protein can be produced with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt, iron salt and the like are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol and neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie, phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), benzamideline, 4- (2-aminoethyl) ) -Benzenesulfonyl fluoride (AEBSF), Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenediamine etidium, and other inhibitors .
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, Hsp104 / ClpB may be used (for example, co-expression or fusion proteinization). And coexisting with the protein of the present invention).
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium, and culturing at a low temperature. is not.
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%
  • 2 ⁇ YT medium tryptone 1.6%, yeast extract 1 0.0%, NaCl 0.5%)
  • D medium Select Soyton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • TM medium peptone 1%, meat extract 0.5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, pH 7.0
  • 2SL medium peptone 4%, yeast extract 0.5%, glucose 2%, pH 7.2
  • a medium polypeptone 3.0%, yeast extract 0.5%, glucose 3%, magnesium sulfate 0.01%, Iron sulfate 0.001%, manganese chloride 0.001%, zinc chloride 0.0001%
  • the culture temperature is 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the protein of the present invention is cultured in the cultured cells (in the periplasm region) by aerobically culturing for several hours to several days under aeration and stirring conditions. Or accumulated in a culture solution (extracellular) and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the assembly produced by separating the cultured cells and the supernatant containing the secreted protein by a general separation method such as centrifugation or filtration after the completion of the culture.
  • the replacement protein can be recovered.
  • the cells when accumulated in cultured cells (including in the periplasm region), for example, the cells are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or filtration, and then the cells are sonicated.
  • the protein accumulated and produced in the cells can be recovered by crushing by a French press method and / or solubilizing by adding a surfactant or the like.
  • the protein of the present invention can be purified by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like alone or in appropriate combination.
  • Confirmation that the obtained purified substance is the target protein can be performed by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • the protein of the present invention can also be produced using a cell-free protein synthesis system using the DNA.
  • cell-free protein synthesis systems include those derived from prokaryotic cells, plant cells, and higher animal cells.
  • the protein of the present invention is characterized in that the culture productivity in the transformant is improved as compared with the aforementioned amino acid substitution.
  • “Cultivation productivity” can be rephrased as “protein expression level” and indicates the amount of the target recombinant protein per unit volume or per cell produced by culturing the transformant by the above-described method. For example, in the case of secretory production, it is the target protein concentration in the culture supernatant, and when the target recombinant protein is produced in the cell, it can be expressed by the number of cells or the target protein weight per cell weight.
  • the culture productivity in the transformant is improved compared to the protein before the introduction of the amino acid substitution mutation.
  • the transformant producing the protein before the mutation introduction and the amino acid substitution mutation When the transformant producing the introduced protein is cultured under the same conditions and then evaluated by the “culture productivity evaluation method” described later, the relative value is 5% or more higher, preferably 10% or more, more preferably Is more than 20% higher.
  • the culture productivity can be evaluated, for example, by the following method.
  • a transformant (control) that produces a protein before mutagenesis by the same host and the same transformation method and a transformant (evaluation sample) that produces a protein introduced with an amino acid substitution mutation are prepared and cultured under the same conditions. For example, by selecting a medium suitable for the host from the above-mentioned medium and culturing aerobically for several hours to several days at an appropriate culture temperature (for example, 20 to 37 ° C.) under aeration and stirring conditions, The protein of the invention is collected and collected in cultured cells (including in the periplasmic region) or in a culture solution (secretory production outside the cells).
  • the amount of protein contained in the obtained cultured cells or culture solution is quantified.
  • the quantification method include a method using high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC analysis an appropriate pretreatment is performed on the cultured cells or culture medium. For example, when accumulating in a cell, after crushing a cell with an ultrasonic crusher etc., after removing a cell residue by centrifugation, it filters with a filter. In the case of extracellular production, the cells are separated from the culture solution by centrifugation and filtered. Analyze the control, evaluation sample, and standard (highly purified, concentration-determined protein) by HPLC, and determine the protein concentration in the control and evaluation sample from the concentration of the standard and the analytical value (area value in the chromatogram). Further, the relative value is calculated by the following (formula 1).
  • the improvement of the culture productivity means that the relative value of the evaluation sample is 5% or more higher than that of the control, preferably 10% or more, more preferably 20% or more.
  • the protein of the present invention can be used as an affinity ligand having affinity for immunoglobulin.
  • An affinity separation matrix can be produced by a method comprising the step of immobilizing the protein of the present invention as an affinity ligand on a carrier comprising a water-insoluble substrate.
  • the “affinity ligand” is a substance that selectively collects (binds) a target molecule from a set of molecules based on the affinity between specific molecules represented by the binding of an antigen and an antibody. It is a term indicating (functional group), and in the present invention, it refers to a protein that specifically binds to immunoglobulin. In the present specification, the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • Immunoglobulin binding can be tested by a biosensor such as a Biacore system (manufactured by GE Healthcare Japan, Inc.) using the surface plasmon resonance principle, but is not limited thereto. As the measurement conditions, it is only necessary to detect a binding signal when protein A binds to the Fc region of an immunoglobulin. By measuring at a temperature of 20 to 40 ° C. (constant temperature) and under a neutral condition of pH 6 to 8. Can be easily evaluated.
  • an affinity constant (KA) or a dissociation constant (KD) can be used as the binding parameter.
  • the affinity constant for Fc of the protein of the present invention is determined by immobilizing human IgG on the sensor chip using the Biacore system and adding each domain variant to the channel under conditions of temperature 25 ° C. and pH 7.4. It can be obtained in an experimental system.
  • the affinity constant (KA) for human IgG is 1 ⁇ 10 5 (M ⁇ 1 ) or more, more preferably 1 ⁇ 10 6 (M ⁇ 1 ) or more, and even more preferably 1 ⁇ 10 7 ( A protein that is M ⁇ 1 ) can be preferably used.
  • the amino acid sequence before the mutation is preferably an amino acid sequence derived from the C domain of SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence before introducing the mutation is an amino acid sequence derived from the C domain of SEQ ID NO: 5, and the amino acid residue corresponding to position 29 is Ala, Arg, Glu, Ile, Leu, Met, More preferably, it is any one selected from Phe, Trp, and Tyr.
  • it is preferable that more than half of amino acid residues introduced into all Lys are substitution mutations to Arg, and it is more preferable that all substitution mutations to Arg.
  • chemical stability under alkaline conditions can be improved as compared to before mutation introduction.
  • the chemical stability under alkaline conditions can be determined using the binding activity to immunoglobulin as an index, or the stability of the polypeptide itself as a substance can also be determined as an index.
  • the chemical stability under alkaline conditions can be evaluated by, for example, comparing electrophoresis bands of the polypeptide before and after alkali treatment by electrophoresis. Is possible.
  • chemical stability can be compared by performing very general SDS-PAGE and analyzing band intensity by densitometry. Based on the band intensity analyzed by densitometry, the polypeptide of the present invention was allowed to stand in a 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution at 25 ° C. for 24 hours, and then compared to before treatment. It is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • Examples of the carrier composed of a water-insoluble substrate used in the present invention include inorganic carriers such as glass beads and silica gel, crosslinked polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene, crystalline cellulose, crosslinked Examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as cellulose, crosslinked agarose and crosslinked dextran, and organic-organic, organic-inorganic and other composite carriers obtained by a combination thereof.
  • GCL2000 which is a porous cellulose gel
  • Sephacryl S-1000 in which allyl dextran and methylene bisacrylamide are covalently crosslinked
  • Toyopearl which is a methacrylate-based carrier
  • Sepharose CL4B which is an agarose-based crosslinked carrier
  • Cellufine which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the method for immobilizing the ligand is not particularly limited as long as it is a method of covalently binding to the carrier by the conventional coupling method via the ⁇ -amino group of lysine present in the ligand. As a result, even if a part of the ligand is immobilized on the carrier via the N-terminal ⁇ -amino group, the ligand is immobilized at the end of the protein, so that the effect of the present invention is not reduced.
  • the support is activated by reacting the support with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine, sodium periodate, or the like (or on the support surface).
  • introducing a reactive functional group a method of immobilizing by performing a coupling reaction with a compound to be immobilized as a ligand, a condensation reagent such as carbodiimide in a system in which a compound to be immobilized as a carrier and a ligand exists, or
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier.
  • the affinity separation matrix of the present invention By using the affinity separation matrix of the present invention, it is possible to separate and purify proteins containing immunoglobulin Fc regions by affinity column chromatography purification methods.
  • the region to which the immunoglobulin binding domain binds has been broadly defined as Fab region (particularly Fv region) and Fc region, the three-dimensional structure of the antibody is already known.
  • the Fab region and the Fc region can be further modified (fragmentation, etc.) while retaining the three-dimensional structure of the binding region, and the present invention provides an immunoglobulin containing the Fab region and the Fc region without deficiency. It is not limited to molecules and derivatives thereof.
  • the “protein containing the Fc region of an immunoglobulin” is a protein containing a site on the Fc region side to which protein A binds, and if protein A can bind, it needs to be a protein that completely contains the Fc region. Absent.
  • a typical immunoglobulin-containing protein containing an Fc region includes, but is not limited to, immunoglobulin G or an immunoglobulin G derivative.
  • the “immunoglobulin G derivative” means, for example, a chimeric immunoglobulin G in which a part of a domain of human immunoglobulin G is replaced with a domain of immunoglobulin G of another species and fused, or human immunoglobulin G
  • the humanized immunoglobulin G in which the CDR (Complementarity Determining Regions) part of the antibody is replaced by the CDR part of another species antibody, the immunoglobulin G obtained by molecular modification of the sugar chain of the Fc region, and the Fv of the human immunoglobulin G It is a generic name for modified artificial proteins to which protein A can bind, such as artificial immunoglobulin G in which a region and an Fc region are fused.
  • a method for purifying a protein containing the Fc region of these immunoglobulins can be achieved by a procedure in accordance with an affinity column / chromatography purification method using a protein A column already present as a commercial product. That is, after adjusting a buffer containing a protein containing an immunoglobulin Fc region to be neutral, the solution is passed through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention, and the immunoglobulin Fc region is passed through. Adsorb protein containing. Next, an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed. At this point, the protein containing the Fc region of the desired immunoglobulin is adsorbed to the affinity separation matrix of the present invention in the column. Next, an acidic buffer adjusted to an appropriate pH (which may contain a substance that promotes dissociation from the matrix) is passed through the column, and the protein containing the Fc region of the desired immunoglobulin is eluted, High purity purification is achieved.
  • the affinity separation matrix of the present invention contains an appropriate strong acid or strong alkaline pure buffer (appropriate denaturing agent or organic solvent) that does not completely impair the function of the ligand compound or the carrier substrate. It may be reused by passing it through and washing it.
  • the present invention also relates to a protein obtained by the separation method using the affinity separation matrix.
  • This protein is preferably a protein containing the Fc region of an immunoglobulin.
  • the protein obtained using the above affinity separation matrix is obtained as a high-purity and high-concentration solution, and has the property that it retains the inherent activity such as the binding ability to the antigen without impairing it.
  • Various proteins obtained in the examples are expressed in the form of “alphabet showing domain-introduced mutation (Wild in wild type)”.
  • the wild-type C domain of protein A is referred to as “C-wild”
  • the C domain mutant into which mutation G29E has been introduced is referred to as “C-G29E”.
  • the notation of the mutant in which two kinds of mutations are introduced at the same time is written together using a slash.
  • the mutation G29E and the C domain mutant into which the mutation S13L is introduced are referred to as “C-G29E / S13L”.
  • a protein in which a plurality of single domains are linked is expressed by adding “d” to the linked number after a period.
  • a protein in which a mutation G29E and a C domain mutant introduced with a mutation S13L are linked in five is denoted as “C-G29E / S13L.5d”.
  • the second and subsequent domain mutations are described as described above, and the most N-terminal domain The mutation is added after the number of linkages.
  • a protein in which a mutation K04Q is introduced into the most N-terminal domain and a mutation K04R is introduced into the 2nd to 5th domains from the N-terminal side, and the C domain mutants are linked to each other is represented by “C-K04R. ".
  • Example 1 Evaluation of C domain mutant in which amino acid at position 4 was substituted C domain mutant of protein A in which Lys residue except for Lys-58 at C-terminal was replaced with another amino acid (C-K04R / K07R) /G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.2d, SEQ ID NO: 6) and C-K04Q / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • An expression plasmid of 2d (SEQ ID NO: 7) was prepared by the following procedure.
  • the DNA obtained by digesting the expression plasmid after subcloning with restriction enzymes PstI and XbaI was ligated to Brevibacillus expression vector pNCMO2 (manufactured by Takara Bio Inc.) digested with the same restriction enzymes, An expression plasmid was prepared in which DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 was inserted into Brevibacillus expression vector pNCMO2.
  • Escherichia coli JM109 strain was used for the preparation of the plasmid.
  • a DNA encoding 2d (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 9) was also synthesized in the same manner to prepare a plasmid.
  • Brevibacillus choshinensis strain SP3 (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed with the obtained plasmid, and a gene recombinant that secreted and produced a C domain mutant was bred.
  • the cells were subjected to shaking culture at 30 ° C. for 3 days in manganese 0.001% and zinc chloride 0.0001%.
  • the culture solution was collected and analyzed for turbidity at 600 nm using a spectrophotometer.
  • the concentration of the C domain mutant in the culture supernatant was measured by high performance liquid chromatography. The culture results are shown in Table 1.
  • C-K04Q / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R. 2d had high culture productivity (concentration of C domain mutant in the culture supernatant). The culture productivity in the transformant was improved by the amino acid substitution at position 4 of the C domain.
  • Example 2 Evaluation of C domain mutant in which amino acid at position 4 of N-terminal domain was substituted C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R Using the DNA encoding 5d as a template, the primer 1: 5′-TTCGCTGCAGATAACCAATTTAACCGTGAA-3 ′ (SEQ ID NO: 12) and the primer 2: 5′-ACTATTCTAGATTATTTTGGAGCTTGTGCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 13) by the PCR method, C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • This plasmid was sequenced using BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Life Technologies Japan Co., Ltd.) and Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies Japan Co., Ltd.), and mutations were introduced only at the target positions. confirmed.
  • Brevibacillus choshinensis SP3 strain was transformed in the same manner as in Example 1, and C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R. A transformant that secreted and produced 5d-K04Q was bred.
  • Example 3 Cultivation evaluation of C domain mutant in which amino acids at positions 4/7 of N-terminal domain were substituted (codon modification)
  • C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R Four types of mutants having different codons for the 4th and 7th arginine in the 5d N-terminal domain were prepared. Further, C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • Mutants having different codons for glutamine at position 4 in the N-terminal domain of 5d-K04Q were also prepared.
  • 5 types of DNA (Table 3) in which the nucleotide sequences encoding the amino acids at positions 4 and 7 of the sequence of primer 1 shown in Example 1 were substituted were totally synthesized by outsourcing (manufactured by Eurofin Genomics). .
  • C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R. 5d does not differ greatly in culture productivity even when codons are modified, and C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R. 5d-K04Q showed high culture production even when the codon was modified. This indicates that amino acid substitution, not codon modification, has an effect on culture productivity.
  • Example 4 Cultivation evaluation of C domain mutant in which amino acids at positions 4/7 of N-terminal domain were substituted
  • C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R Thirty-seven types of mutants in which amino acids were substituted at positions 4 and 7 of the 5d N-terminal domain were prepared (Table 4).
  • As PCR primers 37 types of DNA in which the nucleotide sequences encoding the amino acids at positions 4 and 7 of the sequence of primer 1 shown in Example 1 were substituted were outsourced (manufactured by Eurofin Genomics). Each mutant was cultured and evaluated in the same manner as in Example 1.
  • Example 5 Miniger culture evaluation of C domain mutant in which amino acids at positions 4/7 of N-terminal domain were substituted N-terminal with improved culture productivity produced in Example 2 and Example 3 Mutant C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R. 5d-K04Q (hereinafter referred to as K04Q), C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • K04Q 5d-K04Q
  • 5d-K07T (hereinafter referred to as K07T) and C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • a transformant producing 5d (hereinafter, referred to as a control) was transformed into C medium (1.5% peptone, 0.8% yeast extract, 2.0% glucose, 0.38% phosphate using a 5 L miniger.
  • the pH of the medium was controlled to be in the range of pH 7.0 to pH 7.2 from the start of the culture to the end of the culture, with respect to the control, higher culture production P at pH 7.9 to 8.0
  • the culture solution was collected over time, and the turbidity and the C domain mutant concentration in the culture supernatant were measured in the same manner as in Example 1. The results at 48 hours of culture are shown in Table 5.
  • the N-terminal mutant was higher in culture production than the protein before mutagenesis.
  • Example 6 Cultivation evaluation of C domain mutant in which N-terminal domain 4 / 7th amino acid was multiply substituted
  • C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R Four types of mutants were prepared in which amino acids at positions 4 and 7 of the 5d N-terminal domain were multiple substituted (Table 6).
  • PCR primers four types of DNAs in which the nucleotide sequences encoding the amino acids at positions 4 and 7 in the sequence of primer 1 shown in Example 1 were substituted were totally synthesized by outsourcing (manufactured by Eurofin Genomics). Each mutant was cultured and evaluated in the same manner as in Example 1.
  • Any of the multiple substitution mutants is C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • the culture productivity was improved more than 5d.
  • Example 7 Cultivation evaluation of C domain mutant in which amino acid at position 7 of N-terminal domain was substituted C domain mutant C-G29A.
  • C-G29A Compared to 2d, C-G29A. 2d-K07T had high culture productivity. From this, it was shown that the culture productivity improvement effect by the N-terminal mutation is not limited to the C domain mutant of C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • Example 8 C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • primer 3 5′-TTCGCATATGCGCATAACCGTTTTAACCGTGAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 18) and primer 4: 5′-TTTTCTGCAGTTATTATTTTTGGAGCTTTGCATCA-3 ′ (SEQ ID NO: 19) were used at the 5 ′ end by PCR.
  • primer 5 5′-TTCGCATATGGCAGATAACCAATTTAACCGTGAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 20) instead of primer 3, C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • 5d-K04Q was used as primer C: K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • primer 6 5′-TTCGCATATGGCAGATAACCGTTTTAACACTGAAC-3 ′ 5d-K07T was added to C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R.
  • primer 7 5'-TTCGCATATGGCAGATAACCAATTTAACACTGAAC-3 ' 5d-K04Q / K07T was amplified by PCR.
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes NdeI and PstI, and ligated to E. coli expression vector pUCNT (International Publication No. 94/03613) digested with the same restriction enzymes, and DNAs encoding the respective C domain mutants were An expression plasmid inserted into E. coli expression vector pUCNT was prepared. Using BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Life Technologies Japan Co., Ltd.) and Applied Biosystems 3130xl genetic analyzer (manufactured by Life Technologies Japan Co., Ltd.), the nucleotide sequence contained in this plasmid is determined, and mutations are introduced only at the target positions. Confirmed that. The obtained plasmid was transformed into Escherichia coli HB101 strain (manufactured by Takara Bio Inc.), and a transformant producing each C domain mutant was bred.

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Abstract

本発明は、遺伝子組換体での培養生産性が向上した抗体結合性タンパク質を提供する。本発明は、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の、Ｃドメインの４位および／または７位に対応するアミノ酸残基を、Ａｒｇ以外のアミノ酸残基に置換して得られるタンパク質であって、前記置換前と比較して形質転換体での培養生産性が向上しているタンパク質に関する。

Description

免疫グロブリン結合性改変型タンパク質
本発明は、目的物質に特異的に結合するタンパク質、タンパク質を固定化したリガンドアフィニティー分離マトリックス、および、該マトリックスを用いた分離精製方法に関する。
抗体医薬として開発されているのは、モノクローナル抗体が中心であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体である。培養細胞によって生産されたモノクローナル抗体は各種クロマトグラフィーによって精製されて、医薬品となる。クロマトグラフィーの中でも特にプロテインＡアフィニティー分離マトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィーは抗体を動物細胞培養物から一段階で高純度に精製できるため抗体医薬品の製造に必要不可欠な工程である。
プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（非特許文献１）。
プロテインＡアフィニティー分離マトリックスはプロテインＡを分離マトリックスに固定化することで調製される。プロテインＡアフィニティー分離マトリックスは一般的に製品価格が高価であるが、その理由の１つとして、プロテインＡ自体が外来遺伝子を含む形質転換体により培養生産され、高純度に精製された組換えタンパク質であることが挙げられる。高い培養生産性でプロテインＡを生産できる技術には産業的価値があり、その開発が求められている。
プロテインＡにタンパク質工学的に改変を加えて高機能化する技術も多数開発されている。プロテインＡの改変としては、例えば、アルカリ耐性向上、抗体酸解離特性の向上、固定化点への変異導入による抗体結合容量の向上などが挙げられる（特許文献１～４）。
一般的に、タンパク質に複数の変異を導入して得られる変異体タンパク質は、野生型と比較して細胞における発現量が低下することがある。Ｎ末端に高発現するタンパク質（タグ配列）を付加し、融合タンパク質として目的タンパク質を生産することによりタンパク質の発現量の低下を防ぐ方法が知られているが、融合タンパク質は不要なタグ配列を含むため、目的タンパク質の活性が低下する可能性がある。融合タンパク質からタグ配列を除去することにより目的タンパク質の活性が低下する可能性は低減できるが、タグ配列を除去する工程が増えるため、タンパク質の製造方法として効率的ではない（非特許文献２、特許文献５）。
国際公開第２００３／０８０６５５号 欧州特許第１１２３３８９号明細書 国際公開第２０１１／１１８６９９号 国際公開第２０１２／１３３３４９号 国際公開第２００９／１０１６７２号
Ｈｏｂｅｒ　Ｓ．他著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」２００７年、８４８巻、４０－４７頁 Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．他著、「Ｇｅｎｅ」、１９８８年、６７巻、３１－４０頁
形質転換体での培養生産性が向上した免疫グロブリン結合性改変型タンパク質を創出することを課題とする。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、プロテインＡについて数多くの改変型組換体を設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて変異体を取得し、その変異体の培養生産性を評価した。その結果、プロテインＡに由来するドメインの２個以上の連結体において、最もＮ末端側のドメインの、Ｎ末端付近に変異を導入することにより、抗体結合能やアルカリ耐性というプロテインＡの性質を損なうことなく、形質転換体での培養生産性を向上できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の、Ｃドメインの４位および／または７位に対応するアミノ酸残基をＡｒｇ以外のアミノ酸残基に置換して得られるタンパク質であって、前記置換前と比較して形質転換体での培養生産性が向上しているタンパク質に関する。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列のＣドメインの４位に対応するアミノ酸残基をＧｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓに置換して得られるタンパク質であることが好ましい。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列のＣドメインの７位に対応するアミノ酸残基をＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓに置換して得られるタンパク質であることが好ましい。
Ｎ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列において、ＬｙｓがＬｙｓ以外のアミノ酸残基に置換されていることが好ましい。
以下に示すアミノ酸残基：Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ｐｒｏ－２０、Ａｓｎ－２１、Ｌｅｕ－２２、Ｇｌｎ－２６、Ａｒｇ－２７、Ｐｈｅ－３０、Ｉｌｅ－３１、Ｌｅｕ－３４、Ｐｒｏ－３８、Ｓｅｒ－３９、Ｌｅｕ－４５、Ｌｅｕ－５１、Ａｓｎ－５２、Ｇｌｎ－５５、およびＰｒｏ－５７（残基番号はＣドメインに対応する）のうち、９０％以上が保持されていることが好ましい。
また、本発明は、前記タンパク質をコードするＤＮＡに関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターに関する。
また、本発明は、前記ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系、または前記形質転換体を用いる、前記タンパク質の製造方法に関する。
また、本発明は、前記タンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化して得られる、アフィニティー分離マトリックスに関する。
免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合するアフィニティー分離マトリックスであることが好ましい。
免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質が免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体であるアフィニティー分離マトリックスであることが好ましい。
また、本発明は、前記タンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定する工程を含む、前記アフィニティー分離マトリックスの製造方法に関する。
また、本発明は、前記アフィニティー分離マトリックスに免疫グロブリンのＦｃ領域を含むポリペプチドを吸着させる工程を含む、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製方法に関する。
本発明のタンパク質は、形質転換体での培養生産性が向上しており、経済的および効率的に製造可能である。
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインの配列比較表である。
本発明のタンパク質は、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の、Ｃドメインの４位および／または７位に対応するアミノ酸残基をＡｒｇ以外のアミノ酸残基に置換して得られるタンパク質であって、前記置換前と比較して形質転換体での培養生産性が向上しているタンパク質である。
本明細書において、アミノ酸残基を置換する変異は、置換位置の番号の前に野生型または非変異型のアミノ酸残基を記載し、置換位置の番号の後に変異したアミノ酸残基を記載することにより表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異はＧ２９Ａと記載する。
「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖も、「タンパク質」という用語に包含される。
一般的に、「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するのに十分なタンパク質の単位をいう。本発明においてドメインとは、特に、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合するドメインのことを示す。
ドメインに由来するアミノ酸配列は、アミノ酸を置換する前のアミノ酸配列を指す。ドメインに由来するアミノ酸配列は、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインの野生型アミノ酸配列のみに限定されず、アミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により部分的に改変されたアミノ酸配列であっても、Ｆｃ領域への結合能を有しているタンパク質である限りこれに含まれる。ドメインに由来するアミノ酸配列として、例えば、配列番号１～５に記載のスタフィロコッカスのプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインを構成するアミノ酸配列が挙げられ、また、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインに対して、Ｃドメインの２９位に対応するＧｌｙをＡｌａに置換する変異を導入したアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、ＢドメインにＡ１ＶとＧ２９Ａという変異を導入したＺドメインもＦｃ領域への結合能を有しているので、ドメインに由来するアミノ酸配列に該当する。ドメインに由来するアミノ酸配列は、化学安定性が高いドメイン、または、その変異体であることが好ましい。各々のドメインは、図１に示すような形でアラインメントすることができる。例えば、Ｃドメインの３１位に対応する残基は、Ａ、Ｂドメインでは、同じ３１位であり、Ｅドメインでは２９位、Ｄドメインでは３４位に対応する。
各ドメインに由来するアミノ酸配列は、配列番号１～５で示されるアミノ酸配列に対して、以下の（１）～（４）の少なくとも１つの条件に合致するアミノ酸残基置換が導入されたアミノ酸配列であることが好ましい。
（１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである。
各ドメインに由来するアミノ酸配列は、配列番号１～５で示されるアミノ酸配列に対して、以下の（１）～（４）の少なくとも１つの条件に合致するアミノ酸残基置換が導入されたアミノ酸配列であることがより好ましい。
（１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｇｌｕ、または、Ａｒｇのいずれかである、
（２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓのいずれかである、
（３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｉｌｅ、または、Ａｒｇのいずれかである、
（４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓのいずれかである。
ドメインに由来するアミノ酸配列と、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインとの配列同一性は８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
本発明のタンパク質は、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有する。本発明のタンパク質に含まれるドメインの数は２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上、さらにより好ましくは６個以上である。本発明のタンパク質に含まれるドメインの数は２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは８個以下、さらに好ましくは６個以下である。
本発明においては、最もＮ末端側のドメインと、そのＣ末端側に連結されるドメインのアミノ酸配列が異なっていてもよい。最もＮ末端側のドメインのＣ末端側に複数のドメインが連結される場合は、最もＮ末端側ドメインを除く他のドメインは単一の免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーの末端にＬｙｓが付与されたタンパク質であっても良いし、複数種類の免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーの末端にＬｙｓが付与されたタンパク質であってもよい。
単量体タンパク質の連結方法としては、リンカーとなるアミノ酸残基を介さず連結する方法、または、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されない。リンカーとなるアミノ酸残基数に特に限定されず、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものであることが好ましい。
本明細書中における「リンカー」は、ドメイン間のリンカーを意味し、連結された単量体タンパク質（単ドメイン）の連結部、すなわち、Ｎ末端側のドメイン配列のＣ末端領域とＣ末端側のドメイン配列のＮ末端領域の間の領域を指す。ドメインがタンデムにＮ個連結されたタンパク質において、リンカーはＮ－１個存在する。つまり、本明細書中における「リンカー」は、連結するＮ末端側のドメインのＣ末端アミノ酸と、Ｃ末端側のドメインのＮ末端アミノ酸の、少なくとも２個以上のアミノ酸残基からなる領域である。
特定の二次構造をとらない、または、ドメインの境界に位置する、ドメインのＮ末端側／Ｃ末端側の配列を、リンカーとすることが可能である。この場合、リンカーは、例えばプロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＮ末端側については、Ｃドメインの１位～６位、好ましくは１～５位、より好ましくは１～４位、さらに好ましくは１～３位、さらにより好ましくは１～２位に対応するアミノ酸残基であり、少なくともＮ末端のアミノ酸残基はリンカーに含まれる。なお、ＥドメインとＤドメインは、Ｃドメインと全長が異なるが、Ｃドメインにおける上記アミノ酸と対応するアミノ酸残基がリンカーに該当する。同様に、リンカーは、例えばプロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＣ末端側については、Ｃドメインの５５位～５８位、好ましくは５６～５８位、より好ましくは５７位～５８位に対応するアミノ酸残基であり、少なくともＣ末端である５８位のアミノ酸残基はリンカーに含まれる。
本発明のタンパク質は、２以上のドメインのうち、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の、Ｃドメインの４位および／または７位に対応するアミノ酸残基をＡｒｇ以外のアミノ酸残基に置換して得られるタンパク質である。アミノ酸の置換は、元のアミノ酸を削除し、その位置に、種類の異なる別のアミノ酸を追加する変異を意味する。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において置換される、Ｃドメインの４位に対応するアミノ酸残基とは、具体的には、配列番号１に記載のプロテインＡのＥドメインの２位のアミノ酸残基、配列番号２に記載のプロテインＡのＤドメインの７位のアミノ酸残基、配列番号３に記載のプロテインＡのＡドメインの４位のアミノ酸残基、配列番号４に記載のプロテインＡのＢドメインの４位のアミノ酸残基、配列番号５に記載のプロテインＡのＣドメインの４位のアミノ酸残基である。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において置換される、Ｃドメインの７位に対応するアミノ酸残基とは、具体的には、配列番号１に記載のプロテインＡのＥドメインの５位のアミノ酸残基、配列番号２に記載のプロテインＡのＤドメインの１０位のアミノ酸残基、配列番号３に記載のプロテインＡのＡドメインの７位のアミノ酸残基、配列番号４に記載のプロテインＡのＢドメインの７位のアミノ酸残基、配列番号５に記載のプロテインＡのＣドメインの７位のアミノ酸残基である。なお、「対応する」とは、図１に示すようにプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインをアラインした時に、縦列に同じ位置となることをいう。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列のＣドメインの４位に対応するアミノ酸残基における、置換後のＡｒｇ以外のアミノ酸残基としては、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓが挙げられ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓが好ましく、Ｇｌｎ、Ｌｙｓがより好ましい。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列のＣドメインの７位に対応するアミノ酸残基における、置換後のＡｒｇ以外のアミノ酸残基としては、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓが挙げられ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓが好ましく、Ｔｈｒ、Ｌｙｓがより好ましい。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｃドメインの４位、７位に対応する位置のアミノ酸置換変異はそれぞれ単独で導入されてもよく、組み合わせて導入されてもよい。組み合わせる変異は下記（１）～（４）の組み合わせが好ましい。
（１）４位：Ｌｙｓ、７位：Ｌｙｓ
（２）４位：Ｇｌｎ、７位：Ｌｙｓ
（３）４位：Ｇｌｎ、７位：Ｔｈｒ
（４）４位：Ｌｙｓ、７位：Ｔｈｒ
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列のＣドメインの４位および７位に対応する位置以外のアミノ酸残基は、置換前と比較して形質転換体での培養生産性が向上している限り、特に限定されない。また、Ｎ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列も、置換前と比較して形質転換体での培養生産性が向上している限り、特に限定されない。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列のＣドメインの４位および７位に対応する位置以外のアミノ酸配列、およびＮ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列としては、ドメイン間のリンカー、Ｃ末端以外にＬｙｓを含まない機能的変異体が挙げられる。このような変異体としては、例えば、国際公開第２０１２／１３３３４９号の配列表の配列番号８に記載のＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄが挙げられる。ここで、Ｌｙｓは、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂドメインにおける、Ｃドメインの４、７、３５、４９、５０、および、５８位に対応する６つのＬｙｓのことを指す。プロテインＡのＣドメインの場合のみ、４、７、３５、４２、４９、５０、および、５８位の７つのＬｙｓのことを指す。ただし、変異を導入する前のアミノ酸配列が欠失変異を受けた配列の場合、例えば１～４位が欠失した配列の場合は、上述の数に限定されない。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列のＣドメインの４位および７位に対応する位置以外のアミノ酸配列、およびＮ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列において含まれるアミノ酸残基は、特に限定されず、天然型アミノ酸残基、非タンパク質構成アミノ酸残基や非天然アミノ酸残基であってもよい。遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸残基を好適に用いることができる。ただし、固定化時のカップリング反応での反応性が高い官能基を側鎖に有するアミノ酸残基、例えば、チオール基（－ＳＨ）を側鎖に有するシステイン（Ｃｙｓ）は、置換するアミノ酸残基としては不適である。
前述の、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列のＣドメインの４位および７位に対応する位置以外のアミノ酸配列、およびＮ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列は、各種機能を改良するアミノ酸置換を含んでいてもよい。このようなアミノ酸置換としては、例えば、国際公開第２０１０／１１０２８８号に記載の、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインのいずれかのドメインに由来するアミノ酸配列において１以上のＧｌｙをＡｌａ以外のアミノ酸に置換するアミノ酸置換が挙げられる。また、国際公開第２０１１／１１８６９９号に記載の、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインから選ばれる少なくとも１つのドメインに由来するアミノ酸配列において、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインの３１～３７位のアミノ酸残基、Ｅドメインの２９～３５位のアミノ酸残基、又はＤドメインの３４～４０位のアミノ酸残基に少なくとも１つのアミノ酸置換変異を導入するアミノ酸置換が挙げられる。これらは、Ｆａｂ領域への親和性を低下して抗体溶出特性を改善できるアミノ酸置換である。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列のＣドメインの４位および７位に対応する位置以外のアミノ酸配列、およびＮ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列において含まれていてもよい具体的なアミノ酸置換変異の例を、以下に示す。
（１）最もＮ末端側以外のドメインのＤ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの４位に対応するＬｙｓを、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇに置換する変異であることが好ましい。
（２）最もＮ末端側以外のドメインのＤ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの７位に対応するＬｙｓを、Ａｓｐ、Ａｒｇ、またはＧｌｕに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇに置換する変異であることが好ましい。
（３）Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの３５位に対応するＬｙｓを、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇ、またはＨｉｓに置換する変異であることが好ましい。
（４）Ｃドメインにおける４２位に対応するＬｙｓを、Ａｒｇに置換する変異が挙げられる。
（５）Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの４９位に対応するＬｙｓを、ＡｒｇまたはＧｌｎに置換する変異が挙げられる。
（６）Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの５０位に対応するＬｙｓを、ＡｒｇまたはＨｉｓに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇに置換する変異であることが好ましい。
（７）Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインにおける、Ｃドメインの５８位に対応するＬｙｓを、Ａｒｇ、またはＧｌｙに置換する変異が挙げられ、Ａｒｇに置換する変異であることが好ましい。ただし、このアミノ酸残基がリガンドのＣ末端（付近）に位置する場合においては、先述の通り、変異を導入せずにＬｙｓを残してもよい。
Ｎ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列においては、ＬｙｓがＬｙｓ以外のアミノ酸残基に置換されていることが好ましい。Ｃドメインの４、７、３５、４２、４９、５０、５８位に対応するＬｙｓのうち、Ｌｙｓ以外のアミノ酸残基に置換されているＬｙｓの数は、１個以上であることが好ましく、２個以上であることがより好ましく、３個以上であることがさらに好ましく、４個以上であることがさらにより好ましく、５個以上であることが特に好ましく、６個以上であることが最も好ましく、全てのＬｙｓであることがさらに最も好ましい。
Ｎ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列において、ＬｙｓをＬｙｓ以外のアミノ酸残基に置換して得られるアミノ酸配列としては、例えば、国際公開第２０１２／１３３３４２号に記載の、以下のアミノ酸配列：ＲＦＸ１Ｘ２ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＸ３ＰＮＬＴＥＥＱＲＮＸ４ＦＩＱＸ５ＬＸ６Ｘ７Ｘ８ＰＳＶＳＲＥＸ９ＬＡＥＡＸ１０Ｘ１１ＬＮＤＡＱＡＰＸ１２（前記アミノ酸配列中、Ｘ１＝Ｄ，Ｅ，Ｎ，又はＱ；Ｘ２＝Ｅ，又はＲ；Ｘ３＝Ｌ，Ｍ，又はＩ；Ｘ４＝Ａ，Ｅ，Ｆ，Ｒ，Ｙ，又はＷ；Ｘ５＝Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，又はＶ；Ｘ６＝Ｈ，Ｉ，又はＲ；Ｘ７＝Ｄ，Ｉ，又はＲ；Ｘ８＝Ｄ，又はＥ；Ｘ９＝Ｉ，Ｌ，又はＶ；Ｘ１０＝Ｒ，又はＱ；Ｘ１１＝Ｈ，又はＲ；Ｘ１２＝Ｒ，Ｇ，又はＫである）が挙げられる。また、国際公開第２０１２／１３３３４９号に記載の、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインのいずれかのドメインに由来したアミノ酸配列の全てのＬｙｓ（リジン残基）にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有し、かつ、末端にＬｙｓを付与したアミノ酸配列が挙げられる。また、国際公開第２０１４／０４６２７８号に記載の、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインから選択されるいずれかのドメインに由来し、全てのＬｙｓ（リジン残基）にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を２以上含み、前記アミノ酸配列同士がリンカーによって連結されており、かつ、少なくとも１つのリンカーがＬｙｓ（リジン残基）またはＣｙｓ（システイン残基）を含むアミノ酸配列が挙げられる。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列、及びＮ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｌｙｓの置換変異のうち、半数以上がアルギニン（Ａｒｇ）への置換変異であることが好ましい。これは、ＡｒｇはＬｙｓと物性が似た塩基性アミノ酸であり、ＬｙｓをＡｒｇに置換する場合には、タンパク質全体の物性に与える影響が比較的小さいからである。
本発明のタンパク質において、次に示す２０個のアミノ酸残基が、９０％以上保持されていることが好ましく、９５％以上保持されていることがより好ましい。Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ｐｒｏ－２０、Ａｓｎ－２１、Ｌｅｕ－２２、Ｇｌｎ－２６、Ａｒｇ－２７、Ｐｈｅ－３０、Ｉｌｅ－３１、Ｌｅｕ－３４、Ｐｒｏ－３８、Ｓｅｒ－３９、Ｌｅｕ－４５、Ｌｅｕ－５１、Ａｓｎ－５２、Ｇｌｎ－５５、Ｐｒｏ－５７（残基番号はＣドメインに対応する）。
さらに、タンパク質全体としてのアミノ酸配列の同一性が、変異導入前のアミノ酸配列と比較して８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、当業者であれば配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
本発明のタンパク質は、機能の異なる他のタンパク質とを融合して得られる融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）が融合したタンパク質を挙げることができるが、これらに限定されない。また、本発明のタンパク質は、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子とを融合して得られるものであってもよい。
本発明は、上記方法により得られたタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡにも関する。ＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、上述のタンパク質を構成するものであればいずれでも良い。そのようなＤＮＡは、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該ＤＮＡを構成する塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。
ＤＮＡの塩基配列を改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、タンパク質をコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。
配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質をコードするＤＮＡは、１つのドメインをコードするＤＮＡを連結することにより得られる。例えば、ＤＮＡの連結は、塩基配列に適当な制限酵素認識配列を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することにより行われる。制限酵素認識配列は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素認識配列を導入することもできる。
配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質をコードするＤＮＡを作製する方法は、上記の方法に限らない。例えば、プロテインＡをコードするＤＮＡ（例えば、国際公開第２００６／００４０６７号）に上記の変異導入法を適用することで作製することも可能である。なお、多量体タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体タンパク質をコードする塩基配列が同一の場合には、形質転換した際に宿主細胞内でＤＮＡの相同組換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下であることが好ましく、８５％以下であることがより好ましい。
本発明の「ベクター」は、前述したタンパク質、または、その部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、前述したタンパク質をコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）のベクターなどが挙げられる。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとしては、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）などが挙げられる。
本発明のタンパク質は、タンパク質発現を補助する作用、または、精製を容易にする作用がある公知の蛋白質との融合タンパク質として取得することができる。該タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。本発明のＤＮＡとＭＢＰ或いはＧＳＴ等をコードするＤＮＡとを連結した状態で含むベクターを使用して、融合タンパク質を生産することができる。
本発明の「形質転換体」は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。
宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。
また、本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質を生成蓄積させ、該培養物から該融合タンパク質を採取し、該融合タンパク質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することによっても製造することができる。
本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、該タンパク質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわちＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。
さらに、本発明のタンパク質を正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用しても良い（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のタンパク質と共存させる）。なお、本発明のタンパク質の正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン　１％、酵母エキス　０．５％、ＮａＣｌ　１％）、２×ＹＴ培地（トリプトン　１．６％、酵母エキス　１．０％、ＮａＣｌ　０．５％）、Ｄ培地（セレクトソイトン　１．６％、酵母エキス　１．０％、ＮａＣｌ　０．５％）等が挙げられる。
ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＴＭ培地（ペプトン　１％、肉エキス　０．５％、酵母エキス　０．２％、グルコース　１％、ｐＨ７．０）、２ＳＬ培地（ペプトン　４％、酵母エキス　０．５％　、グルコース　２％、ｐＨ７．２）、Ａ培地（ポリペプトン　３．０％、酵母エキス　０．５％、グルコース　３％、硫酸マグネシウム　０．０１％、硫酸鉄　０．００１％、塩化マンガン　０．００１％、塩化亜鉛　０．０００１％）等が挙げられる。
また、培養温度は、１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明のタンパク質を、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
組換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。
また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。
本発明のタンパク質の精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。
得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
本発明のタンパク質は、前記ＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系を用いて製造することもできる。このような無細胞タンパク質合成系の例として、原核細胞由来、植物細胞由来、高等動物細胞由来の合成系が挙げられる。
本発明のタンパク質は、前述のアミノ酸置換前と比較して形質転換体での培養生産性が向上していることを特徴とする。「培養生産性」とは、「タンパク質発現量」と言い換えることができ、形質転換体を上述の方法で培養して生産される単位体積あたり、もしくは細胞あたりの目的組換えタンパク質の量を示す。例えば、分泌生産であれば、培養上清中の目的タンパク質濃度であり、細胞内に目的組換えタンパク質が生産され場合は、細胞数当たり、もしくは細胞重量当たりの目的タンパク質重量で示すことができる。「アミノ酸置換変異導入前のタンパク質と比較して形質転換体での培養生産性が向上している」とは、具体的には、変異導入前のタンパク質を生産する形質転換体とアミノ酸置換変異を導入したタンパク質を生産する形質転換体を同条件で培養後、後述の「培養生産性の評価方法」で評価した場合、相対値が５％以上高いことであり、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上高いことである。
培養生産性は、例えば以下の方法で評価できる。
［培養生産性の評価方法］
同じ宿主及び同じ形質転換方法で変異導入前のタンパク質を生産する形質転換体（対照）とアミノ酸置換変異を導入したタンパク質を生産する形質転換体（評価サンプル）を準備し、同じ条件で培養する。例えば、上述した培地の中から宿主に適した培地を選択し、適当な培養温度（例えば、２０～３７℃）で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより、本発明のタンパク質を、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養液（細胞外への分泌生産）に蓄積させて回収する。得られた培養細胞もしくは培養液に含まれるタンパク質量を定量する。定量方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法が挙げられる。ＨＰＬＣ分析をする場合は、培養細胞もしくは培養液に適切な前処理を実施する。例えば、細胞内に蓄積する場合は、超音波破砕機などで細胞破砕を実施した後、遠心分離により、細胞残渣を除去した後、フィルターろ過する。細胞外への分泌生産の場合は、培養液から遠心分離により菌体を分離し、フィルターろ過する。対照と評価サンプルと標準品（高度に精製され、濃度決定されたタンパク質）をＨＰＬＣ分析し、標準品の濃度と分析値（クロマトグラムのエリア値）から、対照と評価サンプルに含まれるタンパク質濃度を算出し、さらに、下記（式１）で相対値を算出する。培養生産性が向上しているとは、対照と比較して、評価サンプルの相対値が５％以上高いことであり、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上高いことである。
（式１）相対値（％）＝［対照のタンパク質濃度］÷［評価サンプルのタンパク質濃度］
本発明のタンパク質は、免疫グロブリンに対して親和性を有するアフィニティーリガンドとして利用できる。本発明のタンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定化する工程を含む方法により、アフィニティー分離マトリックスを製造できる。
ここで、「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
「免疫グロブリン結合性」は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、プロテインＡが免疫グロブリンのＦｃ領域に結合した時の結合シグナルが検出できれば良く、温度２０～４０℃（一定温度）にて、ｐＨ６～８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫＡ）や解離定数（ＫＤ）を用いることができる（永田他著、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京、１９９８年、４１頁）。本発明のタンパク質のＦｃに対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒトＩｇＧへの親和定数（ＫＡ）が１×１０５（Ｍ－１）以上、より好ましくは１×１０６（Ｍ－１）以上、さらに好ましくは１×１０７（Ｍ－１）であるタンパク質を好適に用いることができる。
アルカリ条件下での化学的安定性の高いアフィニティーリガンドとするためには、変異を導入する前のアミノ酸配列が、配列番号５のＣドメインに由来するアミノ酸配列であることが好ましい。さらには、変異を導入する前のアミノ酸配列が、配列番号５のＣドメインに由来するアミノ酸配列であり、かつ、２９位に対応するアミノ酸残基がＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒから選択されるいずれかであることが、より好ましい。また、全てのＬｙｓに対して導入されるアミノ酸残基のうち半数以上がＡｒｇへの置換変異であることが好ましく、全てがＡｒｇへの置換変異であることがより好ましい。全てがＡｒｇへの置換変異である場合に、アルカリ条件下での化学的安定性が、変異導入前と比較して向上し得る。
ここで、アルカリ性条件下における化学的安定性は、免疫グロブリンに対する結合活性を指標として決定することもできるし、ポリペプチド自体の物質としての安定性を指標として決定することもできる。ポリペプチド自体の物質としての安定性を指標とする場合、例えば、電気泳動法によって、アルカリ処理前後のポリペプチドの泳動バンドを比較することで、アルカリ性条件下における化学的安定性を評価することが可能である。具体的には、ごく一般的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、デンシトメトリーによるバンド強度を解析することによって化学的安定性を比較可能である。デンシトメトリーによって分析したバンド強度を基準にすると、本発明のポリペプチドは、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で、２５℃で２４時間静置した後、当該処理をする前と比較して、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることが最も好ましい。
本発明に用いる水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、メタクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
リガンドの固定化方法については、リガンドに存在するリジンのεアミノ基を介して、従来のカップリング法で担体に共有結合する方法であれば、特に限定されない。また、結果的に、一部のリガンドがＮ末端のαアミノ基を介して担体に固定化されても、タンパク質の末端で固定化されるので、本発明の効果が低下することはない。カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入しても良いし、担体にリガンドを直接固定化しても良い。
本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質をアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。免疫グロブリン結合性ドメインが結合する領域をＦａｂ領域（特にＦｖ領域）、および、Ｆｃ領域、というように広く定義したが、抗体の立体構造はすでに既知であるので、タンパク質工学的に、プロテインＡが結合する領域の立体構造を保持しつつＦａｂ領域やＦｃ領域にさらなる改変（断片化など）を施すことは可能であり、本発明は、Ｆａｂ領域、および、Ｆｃ領域を、不足なく含有する免疫グロブリン分子、および、その誘導体に限定されるものでもない。したがって、「免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質」とは、プロテインＡが結合するＦｃ領域側の部位を含むタンパク質のことであり、プロテインＡが結合できれば、Ｆｃ領域を完全に含むタンパク質である必要はない。
代表的な免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質としては、免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ここで、「免疫グロブリンＧ誘導体」とは、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧや、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｇ　Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどの、プロテインＡが結合し得る改変型人工タンパク質を総称する名称である。
これらの免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製法は、すでに市販品として存在するプロテインＡカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる。すなわち、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液（該マトリックスからの解離を促進する物質を含む場合もある）をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
また、本発明は、上記のアフィニティー分離マトリックスを使用した分離方法により得られる、タンパク質に関する。このタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質であることが好ましい。上記のアフィニティー分離マトリックスを使用して得られるタンパク質は、高純度かつ高濃度の溶液として得られ、抗原に対する結合力などの本来有する活性を損なうことなく保持しているという性質を有する。
以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。本実施では、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。（１）Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ　Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）。（２）村松正實　編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。また、本実施例で用いる試薬、制限酵素等については特に明記しない限り、市販品を用いた。
実施例で取得した各種タンパク質を「ドメインを示すアルファベット－導入した変異（野生型ではＷｉｌｄ）」の形で表記する。例えば、プロテインＡの野生型Ｃドメインは「Ｃ－ｗｉｌｄ」、変異Ｇ２９Ｅを導入したＣドメイン変異体は「Ｃ－Ｇ２９Ｅ」と表記する。２種類の変異を同時に導入した変異体の表記は、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および、変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体は「Ｃ－Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ」と表記する。また、単ドメインを複数連結したタンパク質は、ピリオドの後に、連結した数に「ｄ」をつけて表記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および、変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体を５連結したタンパク質は「Ｃ－Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ．５ｄ」と表記する。また、最もＮ末端側のドメインと、Ｎ末端側から２番目以降のドメインに別の変異が導入されている場合は２番目以降のドメインの変異は前述の通り表記し、最もＮ末端側のドメインの変異を連結数の後ろに付け加えて表記する。例えば、最もＮ末端側ドメインに変異Ｋ０４Ｑを導入し、Ｎ末端側から２～５番目のドメインに変異Ｋ０４Ｒを導入した、Ｃドメイン変異体を５連結したタンパク質は、「Ｃ－Ｋ０４Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑ」と表記する。
（実施例１）４位のアミノ酸が置換されたＣドメイン変異体の評価
Ｃ末端のＬｙｓ－５８を除くＬｙｓ残基を別のアミノ酸に置換したプロテインＡのＣドメイン変異体（Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．２ｄ、配列番号６）及びＣ－Ｋ０４Ｑ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．２ｄ（配列番号７）の発現プラスミドを以下の手順で調製した。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．２ｄをコードし、５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号８）を外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社製）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社製）で消化して取得したＤＮＡを、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製）へライゲーションし、配列番号６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を用いた。
Ｃ－Ｋ０４Ｑ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．２ｄ（配列番号７）をコードするＤＮＡ（配列番号９）についても同様に全合成し、プラスミドを調製した。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（タカラバイオ社製）を得られたプラスミドで形質転換し、Ｃドメイン変異体を分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン　３．０％、酵母エキス　０．５％、グルコース　３％、硫酸マグネシウム　０．０１％、硫酸鉄　０．００１％、塩化マンガン　０．００１％、塩化亜鉛　０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。培養後、培養液を採取し、分光光度計を用いて６００ｎｍにおける濁度を分析した。また、培養液から遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中のＣドメイン変異体の濃度を測定した。培養結果を表１に示す。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．２ｄと比較してＣ－Ｋ０４Ｑ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．２ｄは培養生産性（培養上清中のＣドメイン変異体の濃度）が高かった。Ｃドメインの４位のアミノ酸置換により形質転換体での培養生産性が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例２）Ｎ末端側ドメインの４位のアミノ酸が置換されたＣドメイン変異体の評価
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ（配列番号１０）をコードし、５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号１１）を外注によって全合成した（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製）。このＤＮＡを用いて実施例１と同様にプラスミドを調製し、遺伝子組換え体を育種した。
また、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄをコードするＤＮＡを鋳型として、プライマー１：５’－ＴＴＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＡＣＣＧＴＧＡＡ－３’（配列番号１２）と、プライマー２：５’－ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴ－３’（配列番号１３）を用いて、ＰＣＲ法にて、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄのＮ末端ドメインのみがＫ０４Ｑに置換されたＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４ＱをコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで消化し、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２へライゲーションし、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４ＱをコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。このプラスミドについて、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）を用いてシーケンスを行い、目的位置にのみ変異が導入されていることを確認した。また、実施例１と同様にしてブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株に形質転換し、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑを分泌生産する形質転換体を育種した。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄを生産する形質転換体及びＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑを生産する形質転換体を実施例１と同様に培養し、培養液を評価した（ｎ＝３で実施した）。結果（ｎ＝３の平均値）を表２に示す。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄと比較して、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑは培養生産性が高かった。５ドメインのうち、Ｎ末端ドメインの４位のみをアミノ酸置換することにより培養生産性が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例３）Ｎ末端側ドメインの４位／７位のアミノ酸が置換されたＣドメイン変異体の培養評価（コドンの改変）
実施例１と同様にして、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄのＮ末端側ドメインの４位及び７位のアルギニンのコドンが異なる変異体を４種類作製した。また、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４ＱのＮ末端側ドメインの４位のグルタミンのコドンが異なる変異体も作製した。ＰＣＲプライマーは実施例１に示したプライマー１の配列の４位、７位のアミノ酸をコードする塩基配列を置換したＤＮＡ（表３）を５種類、外注で全合成した（ユーロフィンジェノミクス社製）。各変異体を生産する形質転換体を実施例１と同様に培養し、培養液を評価した（ｎ＝３で実施した）。結果（ｎ＝３の平均値）を表３に示す。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄはコドンを改変しても培養生産性は大差なく、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑはコドンを改変しても培養生産が高かった。このことから、培養生産性にはコドンの改変ではなくアミノ酸置換が影響していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例４）Ｎ末端側ドメインの４位／７位のアミノ酸が置換されたＣドメイン変異体の培養評価
実施例１と同様にして、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄのＮ末端側ドメインの４位及び７位をアミノ酸置換した変異体を３７種類作製した（表４）。ＰＣＲプライマーは実施例１に示したプライマー１の配列の４位、７位のアミノ酸をコードする塩基配列を置換したＤＮＡを３７種類、外注で全合成した（ユーロフィンジェノミクス社製）。各変異体を実施例１と同様に培養、評価した。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄの培養上清中のＣドメイン変異体の濃度を１００％とした時の相対値で各変異体の培養生産性を評価した。結果を表４に示す。
実施例１で示したＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑだけでなく、複数の変異体で培養生産性が向上していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例５）Ｎ末端ドメインの４位／７位のアミノ酸が置換されたＣドメイン変異体のミニジャー培養評価
実施例２及び実施例３で作製した培養生産性が向上したＮ末端変異体Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑ（以下、Ｋ０４Ｑと示す）、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０７Ｔ（以下、Ｋ０７Ｔと示す）及び、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ（以下、対照と示す）を生産する形質転換体を５Ｌミニジャーを用いて、Ｃ培地（ペプトン１．５％、酵母エキス０．８％、グルコース２．０％、リン酸塩０．３８％、硫酸マグネシウム・七水和物０．０４％、硫酸マンガン・五水和物０．００４％、硫酸鉄・七水和物０．００４％、硫酸亜鉛・七水和物０．０００４％、ディスホームＣＣ－１１８　７５０ｐｐｍ、ｐＨ７．２、培養開始後６時間目からグルコースを連続添加（３．８％分）で好気的条件下で培養した。培養温度は培養開始から１３．５時間目まで３４℃で培養し、その後３０℃に温度シフトした。培地のｐＨは、培養開始から培養終了までｐＨ７．０～ｐＨ７．２の範囲となるように制御した。なお、対照に関してはより高い培養生産性となるｐＨ７．９～８．０でｐＨを制御した。培養液を経時的に採取し、実施例１と同様に濁度及び培養上清中のＣドメイン変異体濃度を測定した。培養４８時間目の結果を表５に示す。
ミニジャー培養においても、Ｎ末端変異体は変異導入前のタンパク質と比較して培養生産が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（実施例６）Ｎ末端ドメイン４位／７位アミノ酸が多重置換されたＣドメイン変異体の培養評価
実施例３と同様にして、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄのＮ末端側ドメインの４位及び７位をアミノ酸を多重置換した変異体を４種類作製した（表６）。ＰＣＲプライマーは実施例１に示したプライマー１の配列の４位、７位のアミノ酸をコードする塩基配列を置換したＤＮＡを４種類、外注で全合成した（ユーロフィンジェノミクス社製）。各変異体を実施例１と同様に培養、評価した。
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄの培養上清中のＣドメイン変異体の濃度で各変異体の培養生産性を評価した（ｎ＝３で実施した）。結果（ｎ＝３の平均値）を表６に示す。
いずれの多重置換変異体もＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄよりも培養生産性が向上していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（実施例７）Ｎ末端ドメインの７位のアミノ酸が置換されたＣドメイン変異体の培養評価
Ｃドメイン変異体Ｃ－Ｇ２９Ａ．２ｄ（配列番号１４）をコードするＤＮＡ（配列番号１５）及びＮ末端ドメイン変異体Ｃ－Ｇ２９Ａ．２ｄ－Ｋ０７Ｔ（配列番号１６）をコードするＤＮＡ（配列番号１７）を用いて、実施例１と同様にして、プラスミドを調製し、形質転換体を育種した。ＤＮＡはいずれも５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイト付与し、外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。それぞれの形質転換体を実施例１と同様に培養、評価した（ｎ＝３で実施した）。結果（ｎ＝３の平均値）を表７に示す。
Ｃ－Ｇ２９Ａ．２ｄと比較して、Ｃ－Ｇ２９Ａ．２ｄ－Ｋ０７Ｔは培養生産性が高かった。このことから、Ｎ末端変異による培養生産性向上効果はＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０ＲのＣドメイン変異体に限定されないことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（実施例８）Ｎ末端側ドメインの４位／７位のアミノ酸が置換されたＣドメイン変異体の大腸菌での培養評価
Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ（配列番号１０）をコードし、５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号１１）を外注によって全合成した（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社製）。このＤＮＡを鋳型として、プライマー３：５’－ＴＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＡＣＣＧＴＴＴＴＡＡＣＣＧＴＧＡＡＣ－３’（配列番号１８）と、プライマー４：５’－ＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴＣＡ－３’（配列番号１９）を用いてＰＣＲ法にて、５’末端にＭｅｔ及びＮｄｅＩ認識サイト、３’末端にＰｓｔＩ認識サイトを付与したＤＮＡをＰＣＲで増幅した。さらに、プライマー３に代えて、プライマー５：５’－ＴＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＡＣＣＧＴＧＡＡＣ－３’（配列番号２０）を用いて、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑをプライマー６：５’－ＴＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＡＣＣＧＴＴＴＴＡＡＣＡＣＴＧＡＡＣ－３’（配列番号２１）を用いて、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０７Ｔを、プライマー７：５’－ＴＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＡＣＡＣＴＧＡＡＣ－３’（配列番号２２）を用いて、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑ／Ｋ０７ＴをそれぞれＰＣＲで増幅した。
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで消化し、同じ制限酵素で消化した大腸菌発現用ベクターｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号）へライゲーションし、それぞれのＣドメイン変異体をコードするＤＮＡが大腸菌発現用ベクターｐＵＣＮＴに挿入された発現プラスミドを調製した。ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）を用いてこのプラスミドに含まれる塩基配列の決定を行い、目的位置にのみ変異が導入されていることを確認した。得られたプラスミドをエシェリヒア・コリＨＢ１０１株（タカラバイオ株式会社製）に形質転換し、それぞれのＣドメイン変異体を生産する形質転換体を育種した。
それぞれのＣドメイン変異体を生産する形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５０ｍＬのＤ培地（セレクトソイトン　１．６％、酵母エキス　１．０％、塩化ナトリウム　０．５％）にて、３７℃で２４時間の振盪培養を行った。培養後、培養液を採取し、分光光度計を用いて６００ｎｍにおける濁度を分析した。各培養液を遠心分離して上清を除去して菌体を取得し、超音波ホモジナイザーにより菌体を破砕処理し、破砕処理液を遠心分離して無細胞抽出液を得た。高速液体クロマトグラフィーで無細胞抽出液中のＣドメイン変異体の濃度を測定した。なお、培養はｎ＝３で実施した。測定結果（ｎ＝３の平均値）を表８に示す。
組換え大腸菌で生産した場合も、Ｃ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄに比べて、いずれのＮ末端変異体も培養生産性が高かった。このことから、Ｎ末端変異による培養生産性向上効果はブレビバチルスを宿主とした場合に限られないことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008

Claims (14)

  1. 配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、
    最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の、Ｃドメインの４位および／または７位に対応するアミノ酸残基を、Ａｒｇ以外のアミノ酸残基に置換して得られるタンパク質であって、前記置換前と比較して形質転換体での培養生産性が向上しているタンパク質。
  2. 最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の、Ｃドメインの４位に対応するアミノ酸残基を、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓに置換して得られる、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の、Ｃドメインの７位に対応するアミノ酸残基を、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓに置換して得られる、請求項１に記載のタンパク質。
  4. Ｎ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列において、ＬｙｓがＬｙｓ以外のアミノ酸残基に置換されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. 以下に示すアミノ酸残基：
    Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ｐｒｏ－２０、Ａｓｎ－２１、Ｌｅｕ－２２、Ｇｌｎ－２６、Ａｒｇ－２７、Ｐｈｅ－３０、Ｉｌｅ－３１、Ｌｅｕ－３４、Ｐｒｏ－３８、Ｓｅｒ－３９、Ｌｅｕ－４５、Ｌｅｕ－５１、Ａｓｎ－５２、Ｇｌｎ－５５、およびＰｒｏ－５７（残基番号はＣドメインに対応する）のうち、９０％以上が保持されている、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
  7. 請求項６に記載のＤＮＡを含むベクター。
  8. 請求項７に記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  9. 請求項６に記載のＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系、または請求項８に記載の形質転換体を用いる、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
  10. 請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化して得られる、アフィニティー分離マトリックス。
  11. 免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とする、請求項１０に記載のアフィニティー分離マトリックス。
  12. 免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質が免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体である、請求項１１に記載のアフィニティー分離マトリックス。
  13. 請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定する工程を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のアフィニティー分離マトリックスの製造方法。
  14. 請求項１０～１２のいずれか１項に記載のアフィニティー分離マトリックスに免疫グロブリンのＦｃ領域を含むポリペプチドを吸着させる工程を含む、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製方法。
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WO2018180204A1 (ja) 安定性改良型免疫グロブリン結合性ペプチド

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