JP6184463B2 - 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド - Google Patents
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Description
具体的方法として、タンパク質が培養細胞内(ぺリプラズム領域内を含む)に蓄積される場合には、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および/または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。組換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。
野生型プロテインAをコードする発現ベクターpNK3262NXを鋳型とし、配列番号19〜20のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行い、C−wild(配列番号5)をコードするDNA断片(177bp)を増幅した。鋳型に用いたpNK3262NXは、すでに公知であるpNK3260の一部を改変したプロテインA発現ベクターであり、細胞壁結合ドメインXの一部などを除いた野生型プロテインAをコードしている(国際公開第WO06/004067号公報)。本実施例によって得られた、C−wildをコードする塩基配列を配列番号21に示した。なお、配列番号19〜20に示すオリゴヌクレオチドプライマーは、これを用いて増幅したDNAが、C−wildをコードする遺伝子の外側に、BamHI、および、EcoRIの制限酵素認識部位を有するように、また、C−wildのC末端側(Lys−58の後ろ)にCys残基を有するように設計した。
図1に示すように、B−wildのアミノ酸配列(配列番号4)は、C−wildにT23N、V40Q、K42A、E43N、I44Lの変異が導入されることで得られる配列である。よって、B−wildをコードするDNAは、C−wildをコードするDNA(配列番号21)にT23N、V40Q、K42A、E43N、I44Lの変異を導入することで調製した。実施例1で得られたC−wild発現プラスミドを鋳型として、配列番号22〜23に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、クイックチェンジ法にてC−wildにT23Nの変異が導入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むプラスミドを得た。さらに、得られたプラスミドを鋳型として、配列番号24〜25に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、同様にクイックチェンジ法にてV40Q、K42A、E43N、I44Lの変異を導入し、B−wildをコードする遺伝子を含む、GST融合型B−wild発現プラスミドを得た。
実施例1で得たC−wild発現プラスミド、および、実施例2で得たB−wild発現プラスミドを鋳型として、表1に示す配列番号27〜52のプライマーを用い、クイックチェンジ法にて変異体をコードする各種遺伝子を得た。
実施例1〜3で得られた、C−wild、各種C−G29X、B−wild、および、各種B−G29Xの各々の発現プラスミドDNA塩基配列の確認は、DNAシークエンサー3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)を用いて行った。BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドDNAのシークエンシングPCR反応を行い、そのシークエンシング産物を精製し、配列解析に用いた。
実施例3で得られた、各種C−G29X/B−G29XをGST融合タンパク質として発現する、各々の形質転換体を、アンピシリンを含むLB培地にて、37℃で終夜培養した。該培養液(5mL)を、2×YT培地(200mL、アンピシリン含有)に接種し、37℃で約1時間培養した。終濃度0.1mMになるようIPTG(イソプロピル1−チオ−β−D−ガラクシド)を添加し、さらに、37℃にて18時間培養した。
実施例5で得られた、GST融合タンパク質を含む各々の無細胞抽出液から、GSTに対して親和性のあるGSTrap FFカラム(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製)を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、GST融合タンパク質を精製(粗精製)した。各々の無細胞抽出液をGSTrap FFカラムに添加し、標準緩衝液(20mM NaH2PO4−Na2HPO4、150mM NaCl,pH7.4)にてカラムを洗浄、続いて溶出用緩衝液(50mM Tris−HCl、20mM Glutathione、pH8.0)にて目的のGST融合タンパク質を溶出した。
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーBiacore 3000(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製)を用いて、取得した各種C−G29X/B−G29Xの免疫グロブリンとの親和性を解析した。本実施例では、ヒト血漿から分画したヒト免疫グロブリンG製剤(以後は、ヒトIgGと記する)を利用した。ヒトIgGをセンサーチップに固定化し、各種C−G29X/B−G29Xをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ヒトIgGのセンサーチップCM5への固定化は、N−hydroxysuccinimide(NHS)、および、N−ethyl−N’−(3−dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochroride(EDC)を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはEthanolamineを用いた(センサーチップや固定化用試薬は、全てGEヘルスケア・ジャパン株式会社製)。ヒトIgG溶液は、ガンマガード(バクスター社製)を標準緩衝液(20mM NaH2PO4−Na2HPO4、150mM NaCl、pH7.4)に1.0mg/mLになるよう溶解して調製した。ヒトIgG溶液を、固定化用緩衝液(10mM CH3COOH−CH3COONa、pH4.5)で100倍に希釈し、Biacore 3000付属のプロトコルに従い、ヒトIgGをセンサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、EDC/NHSにより活性化した後にEthanolamineを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。各種C−G29X/B−G29Xは、ランニング緩衝液(20mM NaH2PO4−Na2HPO4、150mM NaCl、0.005% P−20、pH7.4)を用いて、10〜1000nMの範囲で適宜調製し(各々について、異なるタンパク質濃度の溶液を3種類調製)、各々のタンパク質溶液を、流速20μL/minで30秒間センサーチップに添加した。測定温度25℃にて、添加時(結合相、30秒間)、および、添加終了後(解離相、60秒間)の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、50mM NaOH(15秒間)を添加してセンサーチップを再生した(センサーチップ上に残った添加タンパク質の除去が目的であり、固定化したヒトIgGの結合活性がほぼ完全に戻ることを確認した)。得られた結合反応曲線(リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線)に対して、システム付属ソフトBIA evaluationを用いた1:1の結合モデルによるフィッティング解析を行い、結合速度定数(kon)、解離速度定数(koff)、親和定数(KA =kon/koff)、および、解離定数(KD=koff/kon)を算出した。表2に示したように、各種C−G29XのヒトIgGに対する結合パラメータは、C−wild(比較例1)と同程度であった。具体的には、ヒトIgGに対する解離定数は、いずれのC−G29Xに関しても、10−8Mオーダーであった。各種B−G29Xに関しても、同様の結果が得られた。
本発明における「Fab領域への親和性」については、免疫グロブリンのFc領域を含まないFabフラグメントを用いて調べた。
取得した各種Cドメイン変異体のIgG−Fabとの親和性の解析に関しても、実施例7と同様に、Biacore 3000を用いて実施した。
各種B−G29Xのアルカリ耐性については、アルカリ性条件下で一定時間インキュベートする処理を行った後の、ヒトIgGに対する結合量の低下度合い(ヒトIgGに対する残存結合活性)を比較することで評価した。
各種C−G29Xのアルカリ耐性に関しても、実施例10と同様の手法にて評価を行った。ただし、アルカリ処理時のインキュベートの時間が実施例10とは異なり、30℃にて25時間のインキュベートを行った。
C−G29Vを5連結したタンパク質のアミノ酸配列(配列番号57)から逆翻訳を行い、該タンパク質をコードする塩基配列を設計した。該タンパク質のコドン使用頻度が、ブレビバチルス・チョウシネンシスHPD31株で大量に発現している細胞表層タンパク質であるHWP(Ebisu S.著、「J.Bacteriol.」、1990年、172号、1312−1320頁)のコドン使用頻度に近くなるように、かつ、5個の各ドメイン間での塩基配列の配列同一性が低くなるように考慮して、コドンを分配した。また、5連結ドメインをコードする配列の5’側にPstI、および、3’側にXbaIの制限酵素認識部位を作製した。DNA断片の作製はタカラバイオ社に依頼した。作製したDNA断片の配列を配列番号58に記した。
実施例12により得られたブレビバチルス・チョウシネンシスFY−1組換え菌を、60μg/mLのネオマイシンを含む5mLの3YC培地(ポリペプトン 3%、酵母エキス 0.2%、グルコース 3%、硫酸マグネシウム 0.01%、硫酸鉄 0.001%、塩化マンガン 0.001%、塩化亜鉛 0.0001%)にて、30℃で3日間の振盪培養を行った。
実施例13にて作製したプラスミドpNK3262−C−G29Vから、5連結したC−G29Vをコードする遺伝子を5分割し、各ドメインのVal−29を含むようにDNA断片を調製した。ドメイン1はPstIとNarI、ドメイン2はNarIとHindIII、ドメイン3はHindIIIとMluI、ドメイン4はMluIとBglII、ドメイン5はBglIIとXbaI(NarIのみTOYOBO社製、他はTakara社製)でそれぞれ消化し、アガロースゲルで分画精製して、各々のDNA断片を取得した(配列番号59〜63)。
実施例1で得られたC−Wild、および、実施例2で得られたB−wildの発現プラスミドを有する各々の形質転換体についても、実施例5〜6と同様の方法で、C−Wild、および、B−wildの精製タンパク質溶液を得た。また、配列番号96〜97のプライマーを用いて、実施例3と同様の手法にて、C−G29A、および、B−G29Aの発現プラスミドを有する各々の形質転換体を得た。C−G29Aのタンパク質配列を配列番号98に、B−G29Aのタンパク質配列を配列番号99に示す。実施例3と同様の方法で、コードDNAの塩基配列を確認し、実施例5〜6と同様の方法で、C−G29A、および、B−G29Aの精製タンパク質溶液を得た。C−wild、および、C−G29Aについては、各種C−G29Xと同様に、対照実験として、実施例7、9、11と同じ工程の実験を実施した。B−wild、および、B−G29Aについては、各種B−G29Xと同様に、対照実験として、実施例7、10と同じ工程の実験を実施した。
野生型プロテインAをコードする発現ベクターpNK3262NXを鋳型とし、配列番号100および101のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行い、C−wildの前半部分を増幅した。また、配列番号102および103のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行い、C−wildの後半部分を増幅した。両PCR断片を精製後、混合して、配列番号100および103のオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングする部位にて両断片をオーバーラップさせ、これを鋳型として、配列番号101および102のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて2回目のPCRを実施した。前記の操作により、C−wildの前半と後半が入れ替わり、かつ、両端にHindIII認識部位が存在する配列番号104のDNA断片を作製した。得られたDNA断片をHindIII(Takara社製)により消化後、精製回収を行った。
Claims (25)
- 配列番号5に記載のプロテインAのCドメインに由来するアミノ酸配列において、
Cドメインの29位に対応するGlyを、Val、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Asp、Glu、His、Met、Cys、Asn、およびGlnからなる群から選択されるアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有し、
配列番号5に記載のアミノ酸配列と90%以上のアミノ酸の配列同一性を示し、かつ、
該GlyをAlaに置換したアミノ酸配列を有するタンパク質に比べて、免疫グロブリンのFab領域に対する親和性が低下していること
を特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。 - 前記Cドメインの29位に対応するGlyを、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、およびMetからなる群から選択されるアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のタンパク質。
- 変異導入前のアミノ酸配列が、配列番号5に記載のアミノ酸配列である、請求項1または2に記載のタンパク質。
- 変異導入前のアミノ酸配列からなるタンパク質と比較してアルカリ性条件下での化学的安定性が向上していることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 変異導入後のアミノ酸配列が、配列番号6〜18のいずれかに記載のアミノ酸配列である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質を2個以上連結した、複数ドメインからなるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の、種類の異なるタンパク質を2種類以上連結した、複数ドメインからなるタンパク質。
- ドメインの数が2〜5個である、請求項6または7に記載の複数ドメインからなるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質、または、請求項6〜8のいずれか1項に記載の複数ドメインからなるタンパク質をコードするDNA。
- 連結されているドメインを構成する塩基配列の配列同一性が90%以下であることを特徴とする、請求項9に記載のDNA。
- 請求項9または10に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項11に記載のベクターを宿主に形質転換して得られる形質転換体。
- 宿主がグラム陽性菌であることを特徴とする、請求項12に記載の形質転換体。
- グラム陽性菌がブレビバチルス属細菌であることを特徴とする、請求項13に記載の形質転換体。
- ブレビバチルス属細菌がブレビバチルス・チョウシネンシスであることを特徴とする、請求項14に記載の形質転換体。
- 請求項12〜15のいずれか1項に記載の形質転換体、または、請求項9または10に記載のDNAを用いた無細胞タンパク質合成系を用いる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質、または、請求項6〜8のいずれか1項に記載の複数ドメインからなるタンパク質の製造方法。
- 形質転換体の細胞内及び/又はペリプラズム領域内にタンパク質を蓄積すること、及び/又は、形質転換体の細胞外にタンパク質を分泌することを特徴とする、請求項16に記載の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質、または、請求項6〜8のいずれか1項に記載の複数ドメインからなるタンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティー分離マトリックス。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質に結合することを特徴とする、請求項18に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質が、抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体のいずれかである、請求項19に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体が、IgG、および、IgG誘導体のいずれかである、請求項20に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の分離における、請求項18〜21のいずれか1項に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。
- 請求項18〜21のいずれか1項に記載のアフィニティー分離マトリックスを用いる免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の精製方法。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質が、抗体、抗体誘導体、断片抗体、および断片抗体誘導体からなる群から選択されるいずれかである、請求項23に記載の精製方法。
- 抗体、抗体誘導体、断片抗体、および断片抗体誘導体が、IgG、またはIgG誘導体である、請求項24に記載の精製方法。
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