CN112210013A - 碱耐受性亲和色谱配体 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及色谱配体以及制备和使用所述色谱配体的方法，所述色谱配体包括葡萄球菌蛋白A(SPA)的一个或多个域或其任何功能变体。

Description

碱耐受性亲和色谱配体
技术领域
本公开总体上涉及亲和色谱配体以及制备和使用所述亲和色谱配体的方法。
背景技术
亲和色谱是一种基于配体(即，亲和配体)与所关注分子之间的相互作用而从混合物中分离所关注分子的群的方法。亲和配体通常固定在固相载体上以形成固定相。含有所关注分子的流动相穿过固定相。由于特定相互作用，所关注分子可以与固定相结合。最后，应用洗脱过程以从固定相释放所结合分子。亲和色谱通常是分离生物产物的优选方法。
在现代生物技术和制药行业中，为了降低成本，再利用亲和色谱配体通常很重要。因此，需要开发可以多次再利用的亲和色谱配体。
发明内容
本公开涉及色谱配体以及制备和使用所述色谱配体的方法，所述色谱配体包括葡萄球菌蛋白A(SPA)的一个或多个域或其任何功能变体。
在一些方面，本公开涉及一种多肽，所述多肽包括免疫球蛋白(Ig)结合域。在一些实施例中，Ig结合域包括与SEQ ID NO:6至少60％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，与SEQ ID NO:6的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的。
在一些实施例中，所述氨基酸序列满足所述以下条件之一：
(1)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1至少80％相同，其中与SEQ ID NO:1的S44和N55相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；
(2)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少80％相同，其中与SEQ ID NO:2的S43和N54相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；
(3)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3至少80％相同，其中与SEQ ID NO:3的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；
(4)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少80％相同，其中与SEQ ID NO:4的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；
(5)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5至少80％相同，其中与SEQ ID NO:5的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；或
(6)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6至少80％相同，其中与SEQ ID NO:6的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:1的S44、SEQ ID NO:2的S43、SEQ ID NO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸是疏水的。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ ID NO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ ID NO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸是疏水的。
在一些实施例中，(1)与SEQ ID NO:1的S44、SEQ ID NO:2的S43、SEQ ID NO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸以及(2)与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ ID NO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ IDNO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸两者均是疏水的。
在一些实施例中，所述Ig结合域包括以下氨基酸序列之一：
(1)与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:1的位置44和位置55处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(2)与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:2的位置43和位置54处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(3)与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:3的位置41和位置52处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(4)与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:4的位置41和位置52处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(5)与SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:5的位置41和位置52处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(6)与SEQ ID NO:6相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:6的位置41和位置52处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:1的S44、SEQ ID NO:2的S43、SEQ ID NO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸为Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Try或Trp。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:1的S44、SEQ ID NO:2的S43、SEQ ID NO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸为Ala或Val。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ ID NO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ ID NO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸为Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Try或Trp。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ ID NO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ ID NO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸为Ala或Val。
在一些实施例中，与SEQ ID NO:1的S44、SEQ ID NO:2的S43、SEQ ID NO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸为Ala，并且与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ ID NO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ IDNO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸为Val。
在一些实施例中，所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO:11、30、31或32至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
在一些实施例中，所述多肽包括至少约2个、3个、4个或5个Ig结合域。
在一些实施例中，每个Ig结合域包括与SEQ ID NO:1-6中的任一个至少80％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述多肽包括5个Ig结合域。在一些实施例中，每个Ig结合域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的氨基酸序列，并且每个Ig结合域中与SEQ ID NO:6的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的。
在一些实施例中，至少两个Ig结合域是相同的。在一些实施例中，至少两个Ig结合域是不同的。
在一些实施例中，至少两个相邻Ig结合域由至少一个间隔子域分离。在一些实施例中，所述间隔子域包括α螺旋、螺旋束或L9连接螺旋。
在一些方面，本公开涉及一种载体，所述载体包括编码如本文所描述的所述多肽的多核苷酸。
在一些方面，本公开涉及一种色谱配体，所述色谱配体包括如本文所描述的所述多肽。
在一些实施例中，所述色谱配体被固定在固相载体上。在一些实施例中，所述固相载体选自由以下组成的组：多糖(例如，琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、海藻酸或淀粉)、共聚物、天然聚合物或合成聚合物、二氧化硅、玻璃、塑料、金属和陶瓷。在一些实施例中，所述固相载体呈微珠粒、纳米珠粒、膜、水凝胶或纤维的形式。
在一些实施例中，在0.5M NaOH溶液中孵育24小时之后，所述色谱配体保留Ig结合能力的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，在0.5M NaOH溶液中孵育24小时到36小时之后，所述色谱配体保留Ig结合能力的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一些方面，本公开涉及一种亲和色谱基质，所述亲和色谱基质包括多个如本文所描述的所述多肽。在一些实施例中，所述多肽共价偶联到固相载体。在一些实施例中，所述固相载体选自由以下组成的组：多糖(例如，琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、海藻酸、淀粉)、共聚物、天然聚合物或合成聚合物、二氧化硅、玻璃、塑料、金属和陶瓷。在一些实施例中，所述固相载体呈微珠粒、纳米珠粒、膜、水凝胶或纤维的形式。
在一些实施例中，在0.5M NaOH溶液中孵育24小时之后，所述基质保留Ig结合能力的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，在0.5M NaOH溶液中孵育24小时到36小时之后，所述基质保留Ig结合能力的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一方面，本公开提供了一种SPA Ig结合域的变体，其中用疏水残基取代所述SPAIg结合域的至少一个亲水残基。在一些实施例中，所述亲水残基为丝氨酸(Ser)或天冬酰胺(Asn)，而所述疏水残基选自由Ala、Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Phe和Trp组成的组。
在一些实施例中，本公开提供了一种亲和配体，所述亲和配体包括如本文所描述的SPA Ig结合域的变体中的一种或多种变体。在一些实施例中，所述亲和配体表现出极高的碱耐受性，并且在由碱处理之后可以保留其Ig结合能力。
在一些实施例中，本公开还提供了一种亲和色谱介质，所述亲和色谱介质包括作为所述亲和配体的SPA Ig结合域的所述变体和固体支持基质。
在一方面，本公开涉及一种具有改进的碱耐受性的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白，所述Ig结合蛋白对IgG、IgA和IgM的免疫球蛋白分子具有亲和力，所述Ig结合蛋白包括衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A的E(SEQ ID NO:1)、D(SEQ ID NO:2)、A(SEQ ID NO:3)、B(SEQ IDNO:4)、C(SEQ ID NO:5)或Z(SEQ ID NO:6)的Ig结合域或其任何功能片段或变体中的一个或多个Ig结合域。在一些实施例中，位于位置R1和R2处的一个或两个氨基酸残基突变为选自由Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr和Trp组成的组的疏水残基。
在一些实施例中，位置R1是与域A(SEQ ID NO:3)的Ser41、域B(SEQ ID NO:4)的Ser41、域C(SEQ ID NO:5)的Ser41、域Z(SEQ ID NO:6)的Ser41、域E(SEQ ID NO:1)的Ser44或域D(SEQ ID NO:2)的Ser43相对应的保守残基或域A、B、C、D、E和Z的任何功能变体中的等效丝氨酸残基。
在一些实施例中，位置R2是与域A(SEQ ID NO:3)的Asn52、域B(SEQ ID NO:4)的Asn52、域C(SEQ ID NO:5)的Asn52、域Z(SEQ ID NO:6)的Asn52、域E(SEQ ID NO:1)的Asn55或域D(SEQ ID NO:2)的Asn54相对应的保守残基或域A、B、C、D、Z和E的任何功能变体中的等效天冬酰胺残基。
在一些实施例中，蛋白质的序列可以包括两个或更多个相同的Ig结合域。在一些实施例中，蛋白质的序列可以包括两个或更多个不同的Ig结合域。
在一些实施例中，蛋白质的序列可以包括并非Ig结合域的一部分的一个或多个另外的残基或序列。
在一方面，本公开涉及一种亲和色谱基质，所述亲和色谱基质包括多个如本文所描述的所述Ig结合蛋白。在一些实施例中，所述Ig结合蛋白共价偶联到固相载体，其中所述固相载体选自：多糖(包含例如，琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、海藻酸、淀粉和共聚物)、天然聚合物或合成聚合物、二氧化硅、玻璃、塑料、金属和陶瓷。在一些实施例中，所述固相载体呈微珠粒、纳米珠粒、膜、水凝胶或纤维的形式。
在一些实施例中，在0.5M NaOH溶液中孵育24小时之后，所述基质保留其原始Ig结合能力的约80-100％。
在一方面，本公开涉及亲和配体和包括如本文所描述的所述亲和配体的所述色谱介质。所述亲和配体是可以具有Ig结合域中的一个或多个Ig结合域的Ig结合蛋白，并且因此对包含例如IgG和Fc融合蛋白的免疫球蛋白蛋白质具有高亲和力。所述亲和配体的所述Ig结合域可以衍生自来自金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的所述Ig结合域或其任何功能片段或变体。本公开提供了包括所述Ig结合域的所述经过修饰的版本的表现出非凡的碱耐受性的亲和配体。
如本文所使用的，在适用的情况下，术语“约”是指所测量数值的+/-20％、优选地+/-10％、更优选地+/-5％或甚至更优选地+/-1％的偏差。
如本文所使用的，术语“蛋白质域”或“域”是指蛋白质的结构稳定的单元或区。与无规卷曲或无序环不同，域在非变性条件下具有稳定且可识别的三维结构。
如本文所使用的，术语“间隔子域”是指分离两个域的蛋白质域(例如，免疫球蛋白结合域)。间隔子域不是无规卷曲或无序环。
如本文所使用的，术语“蛋白质A免疫球蛋白结合域”或“SPA免疫球蛋白结合域”是指葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白结合域(例如，域B、C、A、E、D)或其功能变体(例如，域Z、域ZD36H)。
如本文所使用的，术语“配体”和“亲和配体”可互换地使用，并且是指对另一个分子具有特异性结合能力的分子。
如本文所使用的，术语“色谱”是指利用色谱的原理并且包含基于例如批、柱以及膜的色谱的分离技术。
如本文所使用的，术语“亲和色谱”是指使用亲和配体结合并且纯化靶分子的色谱。
如本文所使用的，术语“亲和介质”和“亲和基质”可互换地使用，并且是指具有固体基质以及固定在所述固体基质上的亲和配体的色谱介质。
如本文所使用的，术语“固相载体”和“固体基质”可互换地使用，并且是指呈但不限于珠粒、膜、管、多孔颗粒、无孔颗粒、整体凝胶或纤维的形式的不溶性材料。在一些实施例中，用于色谱的固相载体通常利用以下制备：多糖(例如，琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、壳聚糖和海藻酸)、合成聚合物(例如，聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基丙烯酸丁酯)(PnBMA)和聚苯乙烯(PS))、磁性金属、陶瓷、二氧化硅、羟基磷灰石和/或氧化锆基材料。
如本文所使用的，术语“偶联(couple/coupling/coupled)”是指配体分子与固相载体的共价连接。
如本文所使用的，术语“免疫球蛋白结合域”是指可以与免疫球蛋白的恒定区(例如，IgG的Fc)结合的域。
如本文所使用的，术语“Fc”或“Fc区”是指免疫球蛋白分子的“片段可结晶”区。
如本文所使用的，术语“Fc结合域”是指对免疫球蛋白的Fc区具有高亲和力的蛋白质域。
如本文所使用的，术语“蛋白质A”或“SPA”是指由金黄色葡萄球菌中的基因spa编码的42kDa表面蛋白。蛋白质A的Ig结合域也被称为Fc结合域，其包含例如域E(SEQ ID NO:1)、D(SEQ ID NO:2)、A(SEQ ID NO:3)、B(SEQ ID NO:4)和C(SEQ ID NO:5)。
如本文所使用的，术语“蛋白质Z”、“域Z”和“Z域”(SEQ ID NO:6)可互换地使用，以指代蛋白质A的域B的经过修饰的版本。
如本文所使用的，蛋白质或蛋白质域的术语“功能变体”或“变体”是指保留蛋白质或蛋白质域的基本上类似的功能(例如，与Fc结合，有效地分离免疫球蛋白结合域)的变体蛋白质或变体蛋白质域。在一些实施例中，蛋白质或蛋白质域的功能变体的序列具有与所述蛋白质或所述蛋白质域至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列。
如本文所使用的，术语“非Ig结合区”是指亲和配体中任何Ig结合域(例如，E域、D域、A域、B域、C域或Z域)之外的氨基酸序列的片段。非Ig结合区对免疫球蛋白分子不具有结合活性。
如本文所使用的，术语“连接子”是指连接两个邻近域的氨基酸残基的片段或位于多肽的末端的氨基酸残基的片段。
如本文所使用的，术语“亲本分子”是指呈在基于本文所描述的方法进行修饰之前的形式的蛋白质。
如本文所使用的，术语“碱(base)”是指在水溶液中释放氢氧根(OH-)离子的物质。碱性溶液的pH高于7.0。氢氧根是化学式为OH-的双原子阴离子。其由通过共价键保持在一起的氧原子和氢原子组成，并且承载负电荷。一些常见的碱包含例如NaOH、KOH和NH4OH(氢氧化铵)。
如本文所使用的，术语“碱(alkali)”是指碱金属或碱土金属的氢氧化物。碱溶液是pH高于7.0的碱性溶液。在一些实施例中，pH高于8.0、优选地pH高于10.0并且更优选地pH高于12.0。碱均为在溶解于水时形成氢氧根离子(OH-)的阿伦尼乌斯碱(Arrheniusbases)。一些常见的碱包含例如NaOH、KOH、Ca(OH)2或Mg(OH)2。
本公开的一个重要目的是提供一种在接触浓缩NaOH溶液延长的时间段之后保留其Ig结合能力的免疫球蛋白(Ig)结合蛋白。此NaOH处理被称为原位清洁(CIP)。所述CIP很重要，因为其可以有效去除包含宿主细胞蛋白、病毒、DNA和粘附在基质上的其它物质的痕量污染物。在亲和色谱配体或包括所述亲和色谱配体的色谱介质以再利用之前，需要执行此过程。然而，利用NaOH溶液或其它碱处理亲和色谱配体可能不利地影响亲和色谱配体的Ig结合能力。为了减少不利影响，已经采用了基于结构的蛋白质设计以标识对葡萄球菌蛋白A(SPA)的Ig结合域的结构稳定性来说重要的潜在残基，并且对具有各种突变的大量SPA域进行了测试。本公开提供了在大量实验和广泛建模之后如图1所示的两个氨基酸紧密接近Ig结合域的填充核，并且使这些氨基酸突变为疏水氨基酸可以显著提高碱耐受性或碱耐受性(例如，NaOH耐受性)。本公开进一步示出了，包括在这些位置处具有突变的Ig结合域的亲和色谱配体已经被确定具有优异的碱耐受性以维持多个原位清洁(CIP)循环。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可以使用其它在本领域已知的合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过引用以其整体并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。
本发明的其它特征和优点将通过以下详细描述和附图以及通过权利要求变得显而易见。
附图说明
图1示出了葡萄球菌蛋白A的Ig结合域(E、D、A、B、C和Z)的序列比对。所述序列在SEQ ID NO:1-6中列示。突出显示了位置R1和R2处的两个保守亲水残基。
图2示出了两个关键残基R1(域B中的Ser41或其它域中的等效残基)和R2(域B中的Asn52或其它域中的等效残基)的3D立体布置。每个Ig结合域被填充到三螺旋束中。域的疏水核被示出为呈棒状模式(stick-mode)。两个亲水残基的侧链指向所折叠域的疏水核。
图3示出了在分别将位于R1和R2处的两个保守亲水残基替换为两个疏水残基之后，葡萄球菌蛋白A的IgG结合域的代表性突变体形式。两个新的疏水残基的侧链面向蛋白质的疏水核。核的疏水性增加将增加三螺旋束的填充稳定性，从而使蛋白质的物理稳定性增加。
图4示出了分别包含域B、Z、C(具有G29A突变)和Z(具有S41A/N52V突变)的几个SPAIg结合域在30℃下的CD光谱。
图5示出了具有突变的各种SPA IgG结合域的IgG结合能力的变化，所述SPA IgG结合域包含具有S41A突变的Z域、具有S41V突变的Z域、具有N52V突变的Z域、具有N52L突变的Z域、具有S41A/N52V突变的Z域、具有S41V/N52V突变的Z域、具有S41A/N52L突变的Z域、Z域以及具有G29A突变的C域。
图6示出了用于测试碱耐受性的原位清洁(CIP)测试方案。
图7示出了在0.5M NaOH处理的多个循环之后，各种色谱树脂的动态结合能力(DBC)的变化。将包括具有S41A/N52V突变的Z域的色谱树脂与MabSelect SuRE和MabSelectSuRe LX进行了比较，所述MabSelect SuRE和MabSelect SuRe LX是购自通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences)的两种可商业获得的树脂。
图8示出了使用Clustal Omega在域Z(SEQ ID NO:6)、域C(SEQ ID NO:5)、域9B(SEQ ID NO:30)、域9F(SEQ ID NO:31)、域8E(SEQ ID NO:32)与域8C(SEQ ID NO:33)之间进行的多序列比对的结果。
图9列出了如本公开中所描述的几个序列。
具体实施方式
在治疗性抗体的领域中，蛋白质A亲和色谱通常用于制造过程。蛋白质A色谱介质通常采用捕获免疫球蛋白(Ig)分子的Ig结合蛋白作为配体。蛋白质A配体衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)。天然SPA是细胞壁锚定的42kDa蛋白，含有五个Ig结合域(指定为域E(SEQ ID NO:1)、域D(SEQ ID NO:2)、域A(SEQ ID NO:3)、域B(SEQ ID NO:4)和域C(SEQ IDNO:5))。所述五个Ig结合域是高度同源的并且具有类似的Ig结合能力。在五个Ig结合域中，域B和C由于其高结构稳定性而通常用作用于抗体纯化的色谱配体。
单个氨基酸突变G29A(即，位置29处的甘氨酸残基被取代为丙氨酸)使域B对利用氢氧化钠(NaOH)进行的处理具有抗性(Bjorn Nilsson等人基于葡萄球菌蛋白A的合成IgG结合域(A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A),《蛋白质工程(Protein Engineering)》,第1卷,第2期,第107-113页,1987)。这种经过修饰的域B通常被称为域Z(SEQ ID NO:6)。域Z的序列被示出在图1中。也对NaOH处理具有抗性的域C通常也用于抗体纯化。域C和其功能片段或变体描述于例如US 8329860中，所述专利通过引用以其整体并入。
重组域B、域Z、域C或其功能变体可以用作色谱配体。配体通常具有多个串联的Ig结合域。大多数可商业获得的SPA配体具有4个或5个串联的重复域，并且每个配体可以容纳溶液中的约2个IgG分子。SPA的每个IgG结合域均具有紧凑的3螺旋结构，其中在末端处仅具有几个非螺旋残基。
在治疗性抗体的工业生产期间，SPA基质通常会被回收以最小化生产成本。针对每个再利用循环，均用浓缩NaOH溶液对SPA基质进行处理，以有效去除包含宿主细胞蛋白、病毒、DNA和粘附在基质上的其它物质的痕量污染物。当SPA基质被保持在位(例如，柱)时，此NaOH处理就被称为原位清洁(CIP)。标准CIP程序包含例如，用0.1-0.5M NaOH对蛋白质A基质进行处理，持续5到30分钟(例如，约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟或30分钟)。因此，NaOH耐受性或碱耐受性SPA配体对于工业使用非常重要。
已经进行了广泛的建模以确定哪些氨基酸对于提高NaOH耐受性或碱耐受性是重要的。蛋白质或单个域中的大多数具有疏水核，所述疏水核提供了蛋白质的结构稳定性。对于溶剂以及与环境接触的极性表面来说，疏水核的残基通常是不可接近的。在水性环境中，这些疏水残基的初始相互作用导致形成与良好定义的二级结构的紧凑折叠。利文索尔原理(Levinthal's Principle)推断，蛋白质折叠过程不是对所有可能构象空间的随机采样，相反特定途径由即使在变性环境中也维持残余蛋白质相互作用的天然和非天然疏水性氨基酸残基簇引发(Levinthal,Cyrus(1969),“如何优雅地折叠(How to Fold Graciously)”,生物系统中的穆斯堡尔谱学(Mossbauer Spectroscopy in Biological Systems)：于伊利诺伊州蒙蒂塞洛阿勒顿酒店(Allerton House,Monticello,Illinois)举行的会议的会议记录:22–24)。所述结构显示出SPA的所有IgG结合域共享相同的疏水核。有趣的是，有两个保守亲水残基的侧链指向疏水核(图2)。结构分析表明，将两个保守亲水残基取代为疏水残基将降低结构的自由能并且因此增加域的稳定性(图3)。
本公开部分地基于来自结构分析的观察和以下实验结果：位于R1和R2(图1)处的氨基酸(例如，与Z域(SEQ ID NO:6)的S41和N52相对应的氨基酸)紧密接近Ig结合域的填充核，并且使这些氨基酸突变为疏水氨基酸可以显著提高碱耐受性(例如，NaOH耐受性)。因此，本公开提供了具有改进的碱抗性的SPA配体的各种变体。这些多肽还可以容易地在重组表达系统中表达，因此特别适合于工业使用。
免疫球蛋白结合域
本公开提供了包括一个或多个免疫球蛋白结合域的色谱配体。术语“免疫球蛋白结合域”是指可以与免疫球蛋白的恒定区结合的域。因此，免疫球蛋白结合域可以与免疫球蛋白结合并且还可以与Fc融合蛋白结合。在一些实施例中，免疫球蛋白结合域是IgG结合域。
色谱配体中的免疫球蛋白结合域可以是如本文所描述的任何免疫球蛋白结合域。例如，免疫球蛋白结合域可以是衍生自葡萄球菌蛋白A的域B、C、A、E、D或其变体。免疫球蛋白结合域还可以是域Z或其变体。天然SPA显示出中度碱耐受性。在五个域中，域B和C由于其较高的氢氧化物抗性而通常被用作色谱配体。域Z为蛋白质A的域B的功能变体。域Z具有3螺旋束，所述3螺旋束具有约58个氨基酸。具有两个点突变(即，如相比于B域的A1V和G29A)的Z域(SEQ ID NO:6)退出与亲本分子域B相比更高的碱耐受性。本公开提供了具有甚至更高的碱耐受性的免疫球蛋白结合域。
本公开涉及经过工程化的免疫球蛋白(Ig)结合域(例如，SPA免疫球蛋白结合域)。对SPA免疫球蛋白结合域的修饰可以包含点突变、缺失或插入。在一些实施例中，经过工程化的免疫球蛋白结合域可以用作色谱介质的用于分离免疫球蛋白，例如，IgG、IgA或IgM的亲和配体。在一些实施例中，经过工程化的Ig结合域相比于如本文所描述的未经修饰的Ig结合域(例如，相比于其亲本版本)具有更高的碱耐受性。
广泛建模显示，SPA的所有Ig结合域共享相同的疏水核。蛋白质的疏水核可以维持蛋白质的结构完整性，因为结构稳定的蛋白质或域通常抵靠疏水核折叠(Kalinowska等人“疏水核是蛋白质中的通用结构元素吗？(Is the hydrophobic core a universalstructural element in proteins)”《分子建模杂志(Journal of molecular modeling)》23.7(2017):205)。当蛋白质接触如碱、酸、尿素或胍等变性剂时，蛋白质的疏水核保持为折叠的或部分折叠的。换言之，蛋白质的疏水核可以抵抗变性剂并且在一定程度上维持结构完整性。在变性蛋白或域在水溶液中的再折叠过程期间，疏水核充当晶种。因此，完整的疏水核促进变性蛋白的折叠过程。增强蛋白质或域的核的疏水性将可能提高其折叠/再折叠能力。
SPA的所有五个Ig结合域与三螺旋束共享相同的结构，其在三螺旋的界面处抵靠疏水核折叠(图2和图3)。有趣的是，SPA Ig结合域的疏水核在两个末端处含有两个保守亲水残基(在图1中突出显示为R1和R2)。两个亲水残基在域A、B、C和Z中为Ser41和Asn52、在域E中为Ser44和Asn55或在域D中为Ser43和Asn54。为了描述的简单起见，所述两个残基在本公开中被命名为R1和R2(图1)。与附近的其它亲水残基不同，R1和R2的侧链指向疏水核，与其它周围残基无任何离子相互作用。具有疏水残基的R1和/或R2的点突变可以增加核的疏水性。折叠核的增强的疏水性可以增强SPA Ig结合域的结构稳定性。
在一些实施例中，本公开提供了SPA的Ig结合域的几种变体。位于R1或R2处的至少一种亲水氨基酸突变为疏水氨基酸。经过突变的域显示出与亲本版本相比增加的碱耐受性。如本文所使用的，术语“疏水氨基酸”是指侧链为疏水性的氨基酸。一些常见的疏水氨基酸包含例如，Ala、Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Phe和Trp。
在一些实施例中，经过突变的域是从SPA的B域修饰而来的。在一些实施例中，经过突变的域是从Z域修饰而来的。在一些实施例中，经过突变的域是从SPA的C域修饰而来的。在一些实施例中，经过突变的域是从SPA的D域修饰而来的。在一些实施例中，经过突变的域是从SPA的A域修饰而来的。在一些实施例中，经过突变的域是从SPA的E域修饰而来的。
在一些实施例中，位于R1(Ser)和R2(Asn)处的两个保守亲水残基发生突变(图1)。所述两个残基的侧链指向蛋白质域的螺旋束的疏水核(图2)。所述两个残基分别位于两个螺旋的末端处，并且其R1(Ser)和R2(Asn)的侧链与周围的残基未发生氢键相互作用。实验显示，两个残基的突变既不会破坏螺旋束的结构也不会影响域的Ig结合能力。
在一些方面，本公开提供了一种SPA的具有一个或多个点突变的其中用疏水残基(例如，Ala、Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Phe或Trp)取代R1丝氨酸残基的Ig结合域。
在一些方面，本公开提供了一种SPA的具有一个或多个点突变的其中用疏水残基(例如，Ala、Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Phe或Trp)取代R2天冬酰胺残基的Ig结合域。
在一些方面，本公开提供了一种SPA的具有两个突变的其中用疏水残基(例如，Ala、Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Phe或Trp)取代R1丝氨酸残基和R2天冬酰胺残基的Ig结合域。
因此，本公开提供了一种经过工程化的Ig结合域。在一些实施例中，Ig结合域包括与SEQ ID NO:1至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的S44和N55的氨基酸中的一个或两个氨基酸为疏水的。
在一些实施例中，Ig结合域包括与SEQ ID NO:2至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:2的S43和N54的氨基酸中的一个或两个氨基酸为疏水的。
在一些实施例中，Ig结合域包括与SEQ ID NO:3至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:3的S41和N52的氨基酸中的一个或两个氨基酸为疏水的。
在一些实施例中，Ig结合域包括与SEQ ID NO:4至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:4的S41和N52的氨基酸中的一个或两个氨基酸为疏水的。
在一些实施例中，Ig结合域包括与SEQ ID NO:5至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:5的S41和N52的氨基酸中的一个或两个氨基酸为疏水的。
在一些实施例中，Ig结合域包括与SEQ ID NO:6至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:6的S41和N52的氨基酸中的一个或两个氨基酸为疏水的。
如本文所使用的，序列中的“对应于”参考序列中的参考氨基酸的氨基酸意指位于等效位置处的在将所关注的序列与参考序列进行比对之后的氨基酸。在生物信息学中，序列比对通常用于标识类似区，所述类似区可能是序列之间的功能、结构或进化关系的结果。
在一些实施例中，疏水氨基酸为Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Try或Trp。在一些实施例中，疏水氨基酸为Ala或Val。在一些实施例中，疏水氨基酸为Leu。
在一些实施例中，包括位于R1和/或R2处的突变的突变型Ig结合域与亲本分子相比具有更高的碱耐受性。
在一些实施例中，域Z可以具有选自由D36H、G9H、H18S、N23T、F30A、N28A、D36H、N3H、N6D和N23S组成的组的突变中的一个或多个突变。因此，在一些实施例中，Ig结合域可以具有一个或多个另外的突变。例如，Ig结合域中与Z域(SEQ ID NO:6)的D36相对应的氨基酸为H；与Z域的G9相对应的氨基酸为H；与Z域的H18相对应的氨基酸为S；与Z域的N23相对应的氨基酸为T；与Z域的F30相对应的氨基酸为A；与Z域的N28相对应的氨基酸为A；与Z域的N3相对应的氨基酸为H；与Z域的N6相对应的氨基酸为D和/或与Z域的N23相对应的氨基酸为S。在一些实施例中，Ig结合域中与Z域的N3相对应的氨基酸为H；与Z域的N6相对应的氨基酸为D并且与Z域的N23相对应的氨基酸为S。在一些实施例中，Ig结合域中与Z域的D36相对应的氨基酸为H。
在一些实施例中，甘氨酸连接子(例如，六个甘氨酸残基)可以插入到Z域的第二环(Z(6G))。
在一些实施例中，域C上的保守残基Gly29可以发生突变。域C中的Gly29的突变描述于例如欧盟专利2412809B1和美国专利9403883B2中，所述专利通过引用以其整体并入本文。因此，在一些实施例中，Ig结合域中与C域(SEQ ID NO:5)的G29相对应的氨基酸并非Gly。在一些实施例中，Ig结合域中与C域(SEQ ID NO:5)的G29相对应的氨基酸为Ala。在一些实施例中，Ig结合域中与C域(SEQ ID NO:5)的G29相对应的氨基酸为Lys。
在一些实施例中，免疫球蛋白结合域是本文所描述的免疫球蛋白结合域(例如，域Z和域C)中的一个或多个免疫球蛋白结合域的融合多肽。在一些实施例中，N末端部分衍生自Z域(例如，约或至少20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个或38个氨基酸)。在一些实施例中，C末端部分衍生自C域(例如，约或至少20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个或38个氨基酸)。在一些实施例中，N末端部分衍生自Z域(SEQ ID NO:6)的N末端的前28个氨基酸。在一些实施例中，C末端部分衍生自C域(SEQ IDNO:5)的C末端的最后30个氨基酸。
在一些实施例中，Ig结合域中与Z域(SEQ ID NO:6)的N23相对应的氨基酸为Thr。在一些实施例中，Ig结合域中与Z域(SEQ ID NO:6)的N28相对应的氨基酸为Gln。在一些实施例中，Ig结合域中与C域(SEQ ID NO:5)的G29相对应的氨基酸为Lys。在一些实施例中，Ig结合域中与C域(SEQ ID NO:5)的V40相对应的氨基酸为Gln。在一些实施例中，Ig结合域中与C域(SEQ ID NO:5)的S41相对应的氨基酸为Ala。在一些实施例中，Ig结合域中与C域(SEQID NO:5)的N52相对应的氨基酸为Val。
如本文所使用的，变体免疫球蛋白结合域可以为多肽，所述多肽具有与如本公开中所描述的免疫球蛋白结合域(例如，域B、C、A、E、D、Z、9B、9F、8E或8C)至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施例中，除了Ig结合域具有如本文所描述的位于R1和/或R2处的突变或如本文所描述的一些其它突变之外，Ig结合域具有与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、30、31、32或33相同的序列。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对序列进行比对以用于最佳比较的目的(例如，可以在第一氨基酸和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)。出于比较的目的而比对的参考序列的长度为参考序列的长度的至少80％，并且在一些实施例中为至少90％、95％或100％。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在所述位置处是相同的(如本文所使用的，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数量的考虑了空位的数量和每个空位的长度的函数，需要引入所述函数以进行两个序列的最佳比对。出于本发明的目的，序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用其中空位罚分为12、空位延伸罚分为4并且移码空位罚分为5的Blossum 62评分矩阵来完成。
色谱配体
多肽可以具有一个或多个免疫球蛋白结合域。色谱配体可以具有如本文所描述的至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个免疫球蛋白结合域。在一些实施例中，IgG结合域是连续连接的，在结合域之间不存在另外的连接序列。
在一些实施例中，亲和配体可以包括1个到10个、优选地2个到9个、更优选地3个到8个并且最优选地4个到7个Ig结合域，所述Ig结合域在任何两个相邻域之间用另外的连接子区连接或没有用另外的连接子区连接。在一些实施例中，亲和配体可以包括相同域的相同拷贝或由所述相同拷贝组成。在一些实施例中，亲和配体可以包括相同或不同的Ig结合域或由所述相同或不同的Ig结合域组成。
在一些实施例中，Ig结合蛋白包括具有如本文所描述的突变的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个经过突变的Ig结合域。在一些实施例中，蛋白质内的每个Ig结合域包括如本文所描述的位于R1或R2处的至少一个点突变。在一些实施例中，亲和色谱配体包括如本文所描述的位于R1或R2处的具有至少一个点突变的至少一个经过修饰的Ig结合域。
在一些实施例中，Ig结合亲和配体具有与SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、30、31、32或33至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施例中，亲和配体中的至少1个、2个、3个、4个或5个Ig结合域在R1和/或R2处具有突变。
在一些实施例中，色谱配体可以共价连接到固相载体。固相载体可以是微颗粒、纳米颗粒、水凝胶、整体凝胶、膜、塑料、玻璃或金属表面等。在一些实施例中，Ig结合亲和配体可以以单连接方式或多连接方式共价固定到固相载体。
在一些实施例中，经过工程化的亲和配体还可以含有与Ig结合功能不相关的另外的氨基酸或序列片段。例如，可以将亲和标签或连接子区添加到蛋白质的末端。在一些实施例中，经过工程化的配体可以含有其它修饰，包含但不限于二硫键合、乙酰化、糖基化以及与其它分子的缀合。在一些实施例中，色谱配体可以具有另外的残基或组分，例如半胱氨酸残基或多聚组氨酸标签。这些另外的残基或组分可以用于例如将色谱配体连接到支持基质、固体表面或珠粒。半胱氨酸残基可以用于固定。多聚组氨酸标签可以用于纯化色谱配体。半胱氨酸残基和多聚组氨酸标签描述于例如Kimple等人“用于蛋白质纯化的亲和标签的概述(Overview of affinity tags for protein purification)”《最新蛋白质科学实验指南(Current Protocols in Protein Science)》(2004):9-9；Magdeldin等人“亲和色谱:原理和应用(Affinity chromatography:Principles and applications)”克罗地亚新技术研究所(InTech,Croatia)S.Magdeldin,(2012):1-28；所述文献中的每一个均通过引用以其整体并入。
在一些实施例中，在接触0.1-0.5M碱(例如，NaOH)溶液一段时间(例如，累积1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、35小时、36小时或48小时)之后，Ig结合亲和配体可以保留其Ig结合能力的60％到100％、优选地70％到100％、更优选地80％到100％、最优选地90％到100％。在一些实施例中，所述一段时间为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、35小时、36小时或48小时。在一些实施例中，所述一段时间为少于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、35小时、36小时或48小时。在一些实施例中，Ig结合亲和配体可以保留至少70％、75％、80％、85％或90％的Ig结合能力。在一些实施例中，碱(例如，NaOH)溶液的浓度为约0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M。在一些实施例中，碱(例如，NaOH)溶液的浓度为至少0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M。
对于所结合免疫球蛋白(例如，IgG)，亲和配体可以具有高回收率。在一些实施例中，回收率超过70％、80％、90％、95％、95％、96％、97％、98％或99％。如本文所使用的，回收率是指可以在某些条件下洗脱的免疫球蛋白(例如，IgG)占可以从色谱中洗脱的总量免疫球蛋白的百分比。在一些实施例中，可以从色谱中洗脱的总量免疫球蛋白由可以在pH 2-3下洗脱的免疫球蛋白的总量决定。
回收率可以高于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，回收率为85％-99％、90％-99％或95％-99％。
可以在蛋白质表达系统，如毕赤酵母、大肠杆菌或本领域已知的任何其它适当的表达系统中表达本文所描述的亲和配体。在一些实施例中，可以使用pET21a或pET28b载体表达配体。在一些实施例中，可以通过使用色谱技术，如离子交换、亲和、尺寸排阻和凝胶过滤对所表达的亲和配体进行纯化。在一些实施例中，经过纯化的蛋白质被缓冲液交换为具有约中性pH的无胺且无还原剂的缓冲液。在一些实施例中，经过纯化的蛋白质可以被浓缩或稀释到适合于偶联到固相载体的适当浓度。
间隔子域
间隔子域是在水性溶液中具有折叠的三维结构的结构稳定的蛋白质域。间隔子域可以物理分离相邻免疫球蛋白结合域并且充当间隔子。在一些实施例中，间隔子域具有多于5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个或40个氨基酸残基。在一些实施例中，间隔子域具有少于90个、80个、60个、50个、40个或30个氨基酸残基。在一些实施例中，间隔子域的长度或直径(例如，其被适当折叠时的最大直径)可以小于
Figure BDA0002565902240000221
或
Figure BDA0002565902240000222
在一些实施例中，多肽具有至少两个免疫球蛋白结合域和至少一个间隔子域，其中每两个相邻免疫球蛋白结合域由至少一个间隔子域分离。在一些实施例中，多肽为融合多肽。在一些实施例中，色谱配体可以具有被间隔子域在空间上分离的多个免疫球蛋白结合域。
间隔子域由于其结构刚度可以在溶液中物理地分离两个相邻免疫球蛋白结合域。如本文所使用的，术语“相邻免疫球蛋白结合域”是指彼此靠近的两个免疫球蛋白结合域，并且其可以由间隔子域分离。
在一些实施例中，亲和配体是包括免疫球蛋白结合域(例如，Ig结合域)和非Ig结合域(例如间隔子域)的嵌合融合蛋白。在一些实施例中，融合蛋白含有Ig结合域的多个拷贝。在一些实施例中，融合蛋白含有非Ig结合域的多个拷贝。
在一些实施例中，间隔子域并非无规卷曲或无序环。在一些实施例中，间隔子域并非处于本文所描述的任何洗脱pH(例如，约3到约7、约4到约7、约4.5到约7)下的无规卷曲或无序环。
间隔子域的一个重要方面在于其结构稳定性。结构稳定性是指在适当条件范围下良好定义的三级结构，所述条件包含pH、离子强度和水性溶液中的用于色谱的缓冲液组分。在一些实施例中，结构稳定性还意味着在亲和配体结合抗体的条件下，间隔子域的核在溶液中不形成无规卷曲结构。间隔子域的目的是有效保持相邻免疫球蛋白域之间的一定距离。
相比之下，在两个蛋白质域之间添加柔性多肽连接子是重组表达融合蛋白或嵌合蛋白的常用方法。连接子通常被设计成柔性的，例如Gly和Ser残基的混合物。这些连接子通常不能防止侧翼域在溶液中彼此接触。
在一些实施例中，间隔子域是小蛋白质域，其大小与免疫球蛋白结合域(例如Z域)大致相同。在一些实施例中，S域的大小类似于或大于SPA免疫球蛋白结合域的大小。
在一些实施例中，间隔子域为水溶性的。在这些情况下，暴露在间隔子域的表面上的氨基酸优选地为亲水的。
在一些实施例中，间隔子域可以在强酸性和强碱性条件下存活，因此在低和高pH条件下具有结构稳定性。在一些实施例中，间隔子域在极端条件(例如，强碱性或酸性溶液)下变性之后，可以在中性条件下容易地再折叠成适当结构。
在一些实施例中，间隔子域为单α螺旋域。出于几种原因，单α螺旋域是间隔子域的良好选择。首先，单α螺旋域是具有稳定结构的最小域。其次，在纯化过程期间，其在酸或碱变性之后可以容易地再折叠。第三，其具有待整合到配体中的完美N-C朝向。最后，其大小/长度可以根据需要容易地控制。
在一些实施例中，间隔子域可以是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的核糖体蛋白L9的中央连接螺旋(例如，SEQ ID NO:23)。在一些实施例中，间隔子域可以是胰高血糖素的螺旋区段(胰高血糖素的氨基酸7-26；例如，SEQ ID NO:24)、钙调蛋白的连接螺旋(钙调蛋白的氨基酸68-90；例如，SEQ ID NO:25)或来自肌球蛋白-10的单α螺旋域(SAH)(肌球蛋白-10的氨基酸813-909；例如，SEQ ID NO:26)。在一些实施例中，间隔子域是小蛋白质，如Sumo域(α螺旋和β片层；例如，SEQ ID NO:27)、EGF域(β片层；例如，SEQ ID NO:28)或Rad23A的泛素缔合(UBA)域(例如，SEQ ID NO:29)。
在一些实施例中，间隔子域可以是具有与本公开中所描述的任何间隔子域至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列的肽。
在一些实施例中，间隔子域为非Ig结合域。在一些情况下，间隔子域对免疫球蛋白或IgG不具有亲和力。其不影响邻近免疫球蛋白结合域的结构稳定性，并且不干扰免疫球蛋白结合域在NaOH原位清洁(CIP)之后的再折叠。
在一些实施例中，间隔子域在生理条件或变性条件下不与相邻免疫球蛋白结合域相互作用(例如，间隔子域将不与相邻免疫球蛋白结合域结合，并且将不会阻断免疫球蛋白结合域与IgG之间的结合)。间隔子域不会引起免疫球蛋白结合域聚集或变性。
在一些实施例中，间隔子域是折叠的蛋白质域，是具有三维结构的蛋白质域，是一条α螺旋，是螺旋束，是β结构蛋白质，是混合α-β结构蛋白质或者是球状蛋白质。在一些情况下，间隔子域不具有免疫球蛋白结合亲和力，是水溶性的，不是溶液中的无规卷曲，不是溶液中的无序环和/或不干扰免疫球蛋白结合域的功能。
色谱基质
本公开还提供了用于亲和分离抗体的色谱基质。基质可以包含共价偶联到固相载体的亲和配体。亲和配体可以是本文所描述的任何亲和配体。
基质的固相载体可以由任何种类的适合的材料制成，所述材料包含多糖(例如，琼脂糖、纤维素、淀粉、右旋糖酐)、有机聚合物(例如，聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚羟烷基甲基丙烯酸酯)或无机聚集体(例如，二氧化硅)。色谱基质可以呈珠粒(例如，基本上球形颗粒)、膜或整体凝胶的形式。在一些实施例中，本文所描述的亲和配体可以以单连接方式(例如，利用一个连接点)共价偶联到基质支持物上。在一些其它情况下，亲和配体可以利用多个连接点共价偶联到支持物上。
在一些实施例中，固相载体为交联的琼脂糖树脂。在一些实施例中，琼脂糖珠粒用乙二醇二甘油醚活化。为了偶联配体，将如本文所描述的配体溶解于缓冲液中，并且然后与活化的琼脂糖珠粒混合。然后收获所偶联珠粒。可以用乙醇胺灭活珠粒上的剩余环氧基。然后在使用之前用去离子水进一步洗涤珠粒。
在一些实施例中，如本文所描述的亲和色谱介质可以用于分离IgG、IgA、IgM或一些其它免疫球蛋白或其片段。在一些实施例中，如本文所描述的亲和色谱介质可以用于纯化Fc融合蛋白。包括配体和固相载体的亲和色谱介质可以具有各种形式，例如珠粒、膜、水凝胶或纳米颗粒。固相载体可以用各种材料制成，如琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、二氧化硅、合成聚合物、陶瓷和金属。并且固相载体可以用多种材料涂覆、修饰或缀合，这可以为待固定的亲和配体提供缀合位点。
在一些实施例中，包括如本文所描述的Ig结合蛋白的亲和色谱介质具有优越的碱耐受性。在一些实施例中，在接触0.1-0.5M碱(例如，NaOH)溶液一段时间(例如，累积1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、35小时、36小时或48小时)之后，亲和色谱介质可以保留其Ig结合能力的60％到100％、优选地70％到100％、更优选地80％到100％、最优选地90％到100％。在一些实施例中，所述一段时间为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、35小时、36小时或48小时。在一些实施例中，所述一段时间为少于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、35小时、36小时或48小时。在一些实施例中，亲和色谱介质可以保留至少70％、75％、80％、85％或90％的Ig结合能力。在一些实施例中，碱(例如，NaOH)溶液的浓度为约0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M。在一些实施例中，碱(例如，NaOH)溶液的浓度为至少0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M。
在一些实施例中，碱处理之后剩余结合能力的百分比由动态结合能力(DBC)决定。动态结合能力(DBC)可以通过以下等式计算：
DBC(mg/mL)＝Co×(Vi-V0)/CV，
其中Co为抗体原料的浓度，Vi为所注入样品的直到10％断点的总体积，V0为从注入点到检测器的空隙体积，并且CV为柱体积。可以通过例如在柱注入期间UV280读数的急剧转向确定10％的突破点，其中达到了最大UV280读数的10％。
在一些实施例中，在碱(例如，NaOH)处理之前，亲和色谱介质的DBC为至少50mg/ml、55mg/ml、56mg/ml、57mg/ml、58mg/ml、59mg/ml、60mg/ml、61mg/ml、62mg/ml、63mg/ml、64mg/ml或65mg/ml。在一些实施例中，在由碱(例如，NaOH)处理一段延长的时间(例如，累积1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、35小时、36小时或48小时)之后，亲和色谱介质的DBC为至少40mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、51mg/ml、52mg/ml、53mg/ml、54mg/ml、55mg/ml、56mg/ml、57mg/ml、58mg/ml、59mg/ml、60mg/ml、61mg/ml、62mg/ml、63mg/ml、64mg/ml或65mg/ml。在一些实施例中，所述一段时间为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、35小时、36小时或48小时。在一些实施例中，所述一段时间为少于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、35小时、36小时或48小时。
在一些实施例中，色谱介质具有优异的碱(例如，NaOH)抗性，这是多轮CIP(原位清洗)所需要的。因此，在一些实施例中，可以在伴随CIP(例如，用0.1-0.5M NaOH清洗)处理的多个循环中使用与亲和配体偶联的色谱基质。CIP处理可以有效清洁色谱介质，而不会显著影响结合能力。
在一些实施例中，在几个CIP循环(例如，约或至少20个、40个、60个、80个、100个、120个、140个、160个、180个或200个CIP循环)之后，亲和色谱介质可以保留其Ig结合能力的至少70％、75％、80％、85％、90％或95％(例如，由DBC所测量的)。在一些实施例中，在100个CIP循环之后，亲和色谱介质可以保留其Ig结合能力的至少80％或82％。在一些实施例中，每个CIP循环涉及用约0.5M NaOH处理色谱介质，持续约或至少5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟或30分钟(例如，约或至少15分钟)。
色谱过程
色谱基质可以用于纯化免疫球蛋白，例如，IgG、IgA、IgM、IgE或其片段。本公开还提供了色谱过程，其中可以通过与色谱基质结合使靶免疫球蛋白从溶液中分离。如本领域的技术人员将容易理解的，表示为洗脱剂的溶液需要穿过亲和基质以释放或洗脱基质上的所结合蛋白。
在一些实施例中，通过具有如本公开所描述的适当洗脱pH(例如，pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH 4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4或pH 6.5或处于pH 4.0到pH 6.0的范围内)的溶液洗脱基质上的所结合抗体(例如，IgG)。
在一些实施例中，本文所描述的色谱配体允许在相对温和的条件下洗脱所结合抗体(例如，IgG)，所述相对温和的条件例如，高于pH 4.0、高于pH 4.1、高于pH 4.2、高于pH4.3、高于pH 4.4、高于pH 4.5、高于pH 4.6、高于pH 4.7、高于pH 4.8、高于pH 4.9、高于pH5.0、高于pH 5.1、高于pH 5.2、高于pH 5.3、高于pH 5.4、高于pH 5.5、高于pH 5.6、高于pH5.7、高于pH 5.8、高于pH 5.9或高于pH 6.0。
在一些实施例中，抗体首先与亲和基质结合。使用具有从约pH 8.0到约pH 3.0的pH的大致线性梯度的溶液洗脱所结合抗体。因此，在一些实施例中，当洗脱pH处于本公开中描述的任何适当pH范围内(例如，处于pH 4.0到pH 6.0的范围内；或高于pH 4.0、高于pH4.1、高于pH 4.2、高于pH 4.3、高于pH 4.4、高于pH 4.5、高于pH 4.6、高于pH 4.7、高于pH4.8、高于pH 4.9、高于pH 5.0、高于pH 5.1、高于pH 5.2、高于pH 5.3、高于pH 5.4、高于pH5.5、高于pH 5.6、高于pH 5.7、高于pH 5.8、高于pH 5.9、高于pH 6.0、高于pH 6.1、高于pH6.2、高于pH 6.3、高于pH 6.4或高于pH 6.5，其中最大洗脱为pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH6.3、pH 6.4或pH 6.5)时，收集基质上的所结合抗体(例如，IgG)。
在一些其它实施例中，可以使用逐步洗脱。例如，使用第一缓冲液洗涤色谱基质，并且使用第二缓冲液洗脱免疫球蛋白。第二缓冲液可以具有如本公开中所描述的适当pH(例如，pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH 4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH6.0)。在一些情况下，可以使用第三缓冲液确定可以从色谱中洗脱的抗体的总量，这可以用于验证总洗脱或产率。第三缓冲液的pH应低于第二缓冲液的pH(例如，pH 2.0、pH 2.1、pH2.2、pH 2.3、pH 2.4、pH 2.5、pH 2.6、pH 2.7、pH 2.8、pH 2.9、pH 3.0或低于pH 2.0)。
本公开还提供了纯化免疫球蛋白的方法。所述方法包含以下步骤：使本文所描述的色谱配体与包括免疫球蛋白的溶液接触；用第一缓冲液洗涤色谱配体；以及用具有所选pH的第二缓冲液洗脱免疫球蛋白。所述所选pH可以是如本公开中所描述的任何pH。
本公开还提供了纯化免疫球蛋白的方法。所述方法包含以下步骤：使本文所描述的色谱配体与包括免疫球蛋白的溶液接触；用缓冲液洗涤色谱配体，其中所述缓冲液具有随时间变化的线性pH梯度；以及收集处于所选pH下的免疫球蛋白。线性pH梯度可以为约pH8.0到约pH 3.0。在一些实施例中，所选pH为约6.0到约4.0(例如，约6.0到约4.5或约6.0到约4.7)。
在一些实施例中，回收率在各种所描述的条件下可以大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
实例
本发明在以下实例中进行了进一步描述，所述实例不限制权利要求中所描述的本发明的范围。
实例1：Z域的诱变
采用了基于结构的蛋白质设计来标识对于葡萄球菌蛋白A(SPA)的Ig结合域的结构稳定性而言重要的潜在残基。针对优越的碱耐受性和高Ig结合能力对Z域的约12个突变体进行了测试。
根据建模和实验，SPA的Ig结合域的R1和R2残基被标识为是重要的。这两个残基突变为几种代表性疏水氨基酸。设计了在Ser 41或Asn 52处具有单突变的Z域以及在Ser 41和Asn 52处具有双突变的Z域。所述突变在表1中列出。野生型Z域的氨基酸序列在SEQ IDNO:6中列示，并且具有突变的Z域在SEQ ID NO:7-13中列示。
表1.Z域的点突变
突变体 单突变 双突变 SEQ ID NO
1 S41A 7
2 S41V 8
3 N52L 9
4 N52V 10
5 S41A、N52V 11
6 S41V、N52V 12
7 S41A、V52L 13
实例2.经过突变的Z域的基因合成
Z域变体的氨基酸序列被反向翻译成DNA序列。对大肠杆菌表达系统执行了密码子优化。还包含了表现出高碱耐受性的C域突变体(具有G29A突变的C域)(Kazunobu等人“经过工程化的蛋白质A作为免疫球蛋白亲和配体的显著碱稳定性：具有仅一个氨基酸取代的C域(Remarkable alkaline stability of an engineered protein A as immunoglobulinaffinity ligand:C domain having only one amino acid substitution)”,《蛋白质科学(Protein Sci.)》2013年9月；22(9):1230–1238)，以用于比较目的。针对每个配体，构建了具有2个SPA域或5个SPA域的构建体。还向每个多肽的C末端添加了多聚组氨酸标签和单个半胱氨酸残基。将经过合成的基因克隆到pET21a或pET28b载体中。使用了两个域或五个域的蛋白质作为亲和配体以测试人IgG结合活性。对表达盒进行测序以确认所插入基因的氨基酸序列。所合成基因中的一些所合成基因的氨基酸序列在表2中列出。
表2.Ig结合亲和配体
突变 SEQ ID NO:
1 Z域(没有突变) 14
2 G29A(具有G29A突变的C域) 15
3 S41A(Z域) 16
4 S41V(Z域) 17
5 N52L(Z域) 18
6 N52V(Z域) 19
7 S41A、N52V(Z域) 20
8 S41V、N52V(Z域) 21
9 S41A、V52L(Z域) 22
实例3.Ig结合蛋白的蛋白质表达
将携带Ig结合蛋白的基因的pET21a和pET28b构建体引入到大肠杆菌BL21细胞中。简言之，将约10ng的与每个基因相对应的经过纯化的pET28b质粒与100μL新鲜制备的感受态BL21细胞混合。在冰上孵育20分钟之后，使细胞在42℃下热休克，持续50秒。然后将细胞置于冰上30分钟，然后将其转移到37℃的2mL的LB培养基中。将细胞培养约2小时，并且涂布在具有50μg/mL浓度的卡那霉素的LB琼脂板上。在37℃下孵育LB琼脂板，持续约16小时。
为了进行表达测试，挑选了每个平板上的四个菌落，并且将所述菌落转移到具有2mL的含卡那霉素的LB培养基的四个培养管中。将细胞培养过夜以达到汇合率。制备了具有含醌那霉素的2mL新鲜LB培养基的四个新培养管，并且移入了约200μL的过夜培养物。使细胞生长以达到约0.5的O.D.600(600nm波长的光密度)。向每个管中添加约4μL的0.5M异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，以达到1mM的最终浓度。细胞继续生长另外4小时。在IPTG诱导之后，通过以12,000rcf(相对离心力)向下旋转2分钟收获细胞。将所沉淀细胞重悬于400uL的缓冲液A(20mM Tris、pH 8.0、NaCl 0.5M、EDTA 1mM)中。在冰上对细胞溶液进行简要的超声处理以使细胞裂解。以最高速度将经过超声处理的溶液离心以使细胞碎片沉淀。收集上清液并且保存，以用于Ni-NTA纯化。简言之，用约40μL的Ni-NTA琼脂糖树脂(来自德国希尔登凯杰公司(Qiagen,Hilden,Germany))对上清液溶液进行孵育，持续约2小时。收集树脂并且用缓冲液A洗涤5次。最后，用100μL的缓冲液B(Tris 20mM、pH 8.0、咪唑0.3M、NaCl150mM)将树脂洗脱三次。使经过池化的洗脱级分在4-20％SDS-page凝胶上运行。凝胶上清晰地显示出与12kDa相对应的清晰条带。对于每种构建体的四个菌落，选择表达最强的一个菌落以进行大规模表达。
为了进行大规模表达，在具有底部挡板的四个1-L摇瓶中制备了约2L的LB培养基。使200mL的起始培养物生长过夜，并且均匀地转移到1-L烧瓶中。所有程序与小规模测试表达基本上相同。然而，针对Ni-NTA纯化，使用了20mL经过预填充的Ni-NTA柱代替间歇式树脂。简言之，用AKTA(通用电气医疗集团生命科学部)以2mL/min的速度将细胞裂解物的上清液注入到柱中。洗脱之后，用缓冲液C(50mM柠檬酸盐、pH 4.5)将蛋白质透析过夜。用20mL经过预填充的CM柱使经过透析的蛋白质溶液经受阳离子交换色谱。以2mL/min的速度将蛋白质溶液注入到柱中，并且用0-100％的缓冲液D(50mM柠檬酸盐、pH 4.5、NaCl 0.5M)洗脱。对与蛋白质相对应的级分进行池化。用SDS-page分析蛋白质的纯度。
结果证实突变不影响SPA域的表达效率。具有如表2中列出的突变的所有Z域均具有高表达效率，并且适用于工业使用。
实例4.Ig结合蛋白的CD光谱
圆二色谱(CD)是用于快速评估蛋白质的二级结构和折叠特性的优异方法。简言之，α螺旋结构在222nm和208nm处具有负带并且在193nm处具有正带，而无序蛋白在210nm以上具有低椭圆率并且在195nm附近具有负带。在某些条件下，同一亲本蛋白的各种变体的CD光谱可以反映这些突变的结构稳定性。
在本实验中，测量了野生型B域多肽、C域多肽、Z域多肽和代表性Z域突变体的CD光谱。简言之，用P10脱盐柱(通用电气公司)对SPA域的经过纯化的多肽进行脱盐，并且所述多肽基本上处于纯水中。通过二辛可宁酸(BCA)测定法(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)的Pierce BCA蛋白质测定试剂盒)确定蛋白质浓度。每种蛋白质的最终浓度被调节到0.01mM。在JASCO J-710CD分光偏振计上在1mm石英比色皿中收集CD光谱。收集190nm与260nm之间的数据，并且进行速度为100nm/min并且常数为1秒的10次扫描，并且针对每个光谱进行求平均。所得光谱示出于图4中。
如所预期的，具有S41A/N52V突变的Z域在溶液中具有较高百分比的α螺旋结构，这表明具有S41A/N52V突变的Z域中的α螺旋结构比其它Ig结合域更稳定。
实例5.偶联到琼脂糖基质
从琼脂糖珠粒技术公司(Agarose Beads Technologies)(西班牙)购买交联的琼脂糖4B树脂。所述树脂充当本文所描述的新型Ig结合蛋白的基础基质。首先，用乙二醇二甘油醚活化琼脂糖珠粒。针对1.2mL树脂，添加约2mL的0.5M NaOH溶液。添加约0.6mL的乙二醇二甘油醚(技术级，购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))。在23.5℃下剧烈混合珠粒溶液，持续18小时。活化之后，用去离子(DI)水和70％乙醇交替洗涤珠粒5次。偶联之前，将珠粒储存于4℃的DI水中。
为了偶联配体，首先使蛋白质溶解于缓冲液E中以达到最终浓度5mg/mL，所述缓冲液为Na2CO3 0.1M、pH 7.8、EDTA 5mM、Na2SO4 0.5M、2-β-巯基乙醇(2-beta-mecaptanolethanol)5mM。在偶联之前，用含有G-50右旋糖酐树脂的脱盐柱立即使蛋白质溶液脱盐。针对偶联反应，将约3.0mL的蛋白质溶液与经过环氧活化的琼脂糖珠粒混合。在30℃下搅动蛋白质珠粒溶液，持续约20小时。
通过用缓冲液F(Tris 100mM、pH 8.0、NaCl 1M)和DI水洗涤6次，收获所偶联珠粒。在30℃下，用3mL的pH 9.0的2M乙醇胺灭活珠粒上剩余环氧基，持续6小时。使用之前，用至少20mL的DI水进一步洗涤珠粒。
实例6.柱填充
将配体偶联的树脂填充到内直径为0.76cm并且长度为0.25cm的1mL柱体中。首先使树脂浆液平衡并且沉降在缓冲液G(Tris 20mM、pH 7.5、NaCl 300mM、EDTA 5mM)中。树脂的压缩率为约1.2，其中约1.2ml的所沉降树脂浆液被填充到1ml柱体中。用缓冲液G使经过填充的柱以0.5-2.0ml/min的各种流动速率运行，并且利用盐栓测定对填充的质量进行测试。确认并且分析了导电峰的对称性，以确保对柱的成功填充。
实例7.利用NaOH浸泡进行的碱耐受性测试
在浸泡于0.5M NaOH溶液中之前和之后，针对人IgG的动态结合能力对经过填充的1ml柱进行了测试。为了测量NaOH浸泡之前的动态结合能力(DBC)，在AKTA纯色谱系统(通用电气医疗集团科学部)上连接经过填充的1ml柱。将经过纯化的人IgG(可注入IVIG)稀释到2.5mg/ml的浓度。通过以1.0ml/min的速度将约1ml的IgG溶液注入到旁路确定了IgG溶液的空隙体积和OD280读数的最大值。空隙体积被记录为IgG溶液从注入点到达UV检测器的体积。UV280的峰值被记录为IgG溶液的最大UV吸收。
在NaOH浸泡之前，首先测量了柱的DBC。以0.25mL/min的流动速率将相同的IgG溶液注入到每个柱中，所述流动速率与4分钟的驻留时间相对应。通过在柱注入期间UV280读数的急剧转向确定了10％的突破点，其中达到了最大UV280读数的10％。在10％突破点时停止注入。通过以下等式计算了动态结合能力(DBC)：
DBC(mg/mL)＝Co×(Vi-V0)/CV，
其中Co为抗体原料的浓度，Vi为所注入样品的直到10％断点的总体积，V0为从注入点到检测器的空隙体积，并且CV为在此情况下为1ml的柱体积。
为了确定NaOH浸泡之后的DBC，用注射器对柱手动注入了约8ml的0.5M NaOH溶液。在将柱在NaOH溶液中浸泡约24小时或35小时之后，通过注入大量1X PBS对柱进行了洗涤。然后如上文所描述的利用IgG动态结合能力对柱进行了测试。
各个柱的在0.5M NaOH浸泡之前和之后的所产生DBC在表3中列出。
表3
Figure BDA0002565902240000341
DBC变化的总结还在图5上进行了展示。位于R1或R2处的所有单突变均有助于树脂的碱耐受性的提高。并且位于R1和R2处的双突变更显著地提高了碱耐受性。选择与双突变S41A、N52V相对应的IgG结合域变体，以供在实例7的CIP循环期间进行进一步DBC测试。
实例7.CIP循环期间的DBC变化
基于结果，选择了与最具碱抗性的突变体(具有S41A/N52V突变的Z域)相对应的树脂以进行CIP测试。MabSelect SuRE(通用电气医疗集团科学部，目录号：GE17-5438-01)和MabSelect SuRe LX(通用电气医疗集团科学部，目录号：GE17-5474-02)的树脂是目前可商业获得的最受欢迎的亲和色谱基质。出于比较的目的，使用了这些树脂。简言之，如上文所描述的，将所有树脂填充到1mL柱柱体中。使用了浓度为2.5mg/ml的经过纯化的人IgG溶液作为结合样品。针对样品注入，应用了4分钟的驻留时间。柱平衡和IgG结合缓冲液是一条AKTA A11缓冲液线(1X PBS、pH 7.6)。IgG洗脱缓冲液处于AKTA A12缓冲液线(0.1M柠檬酸盐、pH 3.0)上。CIP缓冲液处于AKTA B1缓冲液线(0.5M NaOH)上。并且所有柱均在AKTA上以相同的程序和参数运行。基于如本文所描述的方法对DBC进行了计算。
CIP方案被示出在图6中。简言之，在每个柱上用0.5M NaOH进行了总共200个CIP循环，其中接触时间为15分钟，并且每20个CIP循环都用IgG溶液进行DBC测量。
DBC变化的结果展示在图7中。结果显示，用具有双突变S41A/N52V的Z域制备的树脂与受欢迎的商业化蛋白质A树脂中的一些相比具有更高的碱耐受性。
实例8.对于更多突变体序列的碱耐受性测试
蛋白质A的B域和C域两者均表现出高碱耐受性。通过分析所有可用蛋白质AIgG结合域的序列，表明B域的N末端一半和C域的C末端一半显著有助于蛋白质A配体的碱耐受性。因此，用Z域的N末端一半和C域的C末端一半创建了几种更多的Z域融合变体和C域融合变体。所有这些新蛋白质A突变体在S41或N52(位置编号基于C域(SEQ ID NO:5)或Z域(SEQ IDNO:6))处包含至少一个突变。表4中列出了新Z/C域融合变体的SEQ ID NO。在域Z、域C与新Z/C域融合变体之间进行了多序列比对，如图8所展示的。简言之，将每个经过突变的Z/C域连接以产生2-重复或6-重复串联构建体，并且将其克隆到表达载体pET21b中。将携带Z/C域重复的pET表达构建体转化成BL21大肠杆菌菌株以进行蛋白质表达。
在37℃下在溶菌肉汤(LB)培养基中对经过转化的大肠杆菌菌株进行培养。为了诱导靶蛋白质表达，当大肠杆菌细胞的密度达到0.5的OD600时，向培养基中添加最终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)。同时，将培养物的温度调节到28℃以诱导蛋白质表达。在诱导16小时之后，通过离心收获大肠杆菌细胞，并且在蛋白质纯化之前将细胞沉淀物储存于-20℃下。
使含有所表达Z/C域变体的大肠杆菌沉淀物解冻并且溶解于1X PBS缓冲液中。在4-10℃下对细菌溶液进行彻底超声处理以使细胞裂解。以高速将经过超声处理的溶液离心以分离细菌碎屑和上清液。保留所澄清的上清液以用于蛋白质纯化。简言之，首先用柠檬酸粉末将上清液调节到pH 4.6。添加另外的水以降低溶液的电导率。以1ml/min的流动速率将经过pH调节的上清液注入到5ml CM琼脂糖凝胶阳离子交换柱中。用大量柠檬酸盐缓冲液(50mM柠檬酸、pH 4.6、50mM NaCl)洗涤之后，用高盐缓冲液(50mM柠檬酸、pH 4.6、600mMNaCl)洗脱柱。用SDS-PAGE电泳验证所洗脱蛋白质。
用碳酸钠将含有经过纯化的蛋白质的溶液调节到pH 8.0。将蛋白质固定到经过环氧化物活化的琼脂糖树脂上，并且如上文所描述的将树脂填充到1ml柱中。
在浸泡于0.5M NaOH溶液中之前和之后，针对人IgG的动态结合能力对柱进行测试。为了测量NaOH浸泡之前的动态结合能力(DBC)，在AKTA(通用电气医疗集团科学部)上连接经过填充的1ml柱。将经过纯化的人IgG(可注入IVIG)稀释到2.5mg/ml的浓度。通过以1.0ml/min的流动速率将约1ml的IgG溶液注入到旁路确定了IgG溶液的空隙体积和OD280读数的最大值。空隙体积被记录为IgG溶液从注入点到达UV检测器的体积。UV280的峰值被记录为IgG溶液的最大UV吸收。
在NaOH浸泡之前，首先测量了柱的DBC。以0.25mL/min的流动速率将相同的IgG溶液注入到每个柱中，所述流动速率与4分钟的驻留时间相对应。通过在柱注入期间UV280读数的急剧转向确定了10％的突破点，其中达到了最大UV280读数的10％。在10％突破点时停止注入。如下确定了动态结合能力(DBC)：
DBC(mg/mL)＝Co×(Vi-V0)/CV，
其中Co为抗体原料的浓度，Vi为注入的到达10％突破点的原料的体积，V0为从注入点到检测器的空隙体积，并且CV为柱体积(在此情况下为1ml)。
为了确定NaOH浸泡之后的DBC，用注射器对柱手动注入了约8ml的0.5MNaOH溶液。在将柱在NaOH溶液中浸泡约24小时之后，通过注入大量1X PBS对柱进行了洗涤。然后如上文所描述的利用IgG动态结合能力对柱进行了测试。
在0.5M NaOH浸泡之前和之后各个柱的所产生DBC在表5中列出。
表4.用于亲和配体的Z/C域融合突变体的序列
Z/C突变体 SEQ ID NO
1 S41A，域9B 30
2 S41L，域9F 31
3 S41A、N52V，域8E 32
4 G29K，域8C 33
表5.Z/C域变体的DBC测试
Figure BDA0002565902240000371
选择了在S41或N52处不包括突变的G29K(8C)作为对照序列。0.5M氢氧化钠浸泡之后DBC测试的结果显示，在S41和N52处包括一个或两个突变的配体与对照配体相比具有更好的碱耐受性。在具有S41和/或N52突变的配体中，9B(SEQ ID NO:30)表现出最佳的碱耐受性。与先前的测试一起考虑，其表明了在S41或N52处包括至少一个突变的Z/C融合域具有同等或更好的碱耐受性。
其它实施例
应理解，虽然已经结合其具体实施方式对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改都处于以下权利要求书的范围内。

Claims (27)

1.一种多肽，其包括免疫球蛋白(Ig)结合域，其中所述Ig结合域包括与SEQ ID NO:6至少60％相同的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO:6的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述氨基酸序列满足所述以下条件之一：
(1)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1至少80％相同，其中与SEQ ID NO:1的S44和N55相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；
(2)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少80％相同，其中与SEQ ID NO:2的S43和N54相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；
(3)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3至少80％相同，其中与SEQ ID NO:3的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；
(4)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少80％相同，其中与SEQ ID NO:4的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；
(5)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5至少80％相同，其中与SEQ ID NO:5的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的；或
(6)所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6至少80％相同，其中与SEQ ID NO:6的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中与SEQ ID NO:1的S44、SEQ ID NO:2的S43、SEQ IDNO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸是疏水的。
4.根据权利要求2所述的多肽，其中与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ IDNO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ ID NO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸是疏水的。
5.根据权利要求2所述的多肽，其中(1)与SEQ ID NO:1的S44、SEQ IDNO:2的S43、SEQID NO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸以及(2)与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ ID NO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ ID NO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸两者均是疏水的。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的多肽，其中所述Ig结合域包括以下氨基酸序列之一：
(1)与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:1的位置44和位置55处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(2)与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:2的位置43和位置54处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(3)与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:3的位置41和位置52处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(4)与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:4的位置41和位置52处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(5)与SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:5的位置41和位置52处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外；
(6)与SEQ ID NO:6相同的氨基酸序列，除了SEQ ID NO:6的位置41和位置52处的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的之外。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中与SEQ ID NO:1的S44、SEQ ID NO:2的S43、SEQ ID NO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸为Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Try或Trp。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中与SEQ ID NO:1的S44、SEQ ID NO:2的S43、SEQ ID NO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸为Ala或Val。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ ID NO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ ID NO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸为Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Try或Trp。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ ID NO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ ID NO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸为Ala或Val。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中与SEQ ID NO:1的S44、SEQ ID NO:2的S43、SEQ ID NO:3的S41、SEQ ID NO:4的S41、SEQ ID NO:5的S41或SEQ ID NO:6的S41相对应的氨基酸为Ala，并且与SEQ ID NO:1的N55、SEQ ID NO:2的N54、SEQ ID NO:3的N52、SEQ ID NO:4的N52、SEQ ID NO:5的N52或SEQ ID NO:6的N52相对应的氨基酸为Val。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO:11、30或32至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括至少2个、3个、4个或5个Ig结合域，其中每个Ig结合域包括与SEQ ID NO:1-6中的任一个至少80％相同的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括5个Ig结合域，其中每个Ig结合域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的氨基酸序列，并且每个Ig结合域中与SEQID NO:6的S41和N52相对应的氨基酸中的一个或两个氨基酸是疏水的。
15.根据权利要求13或14所述的多肽，其中至少两个Ig结合域是相同的。
16.根据权利要求13或14所述的多肽，其中至少两个Ig结合域是不同的。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的多肽，其中至少两个相邻Ig结合域由至少一个间隔子域分离。
18.根据权利要求17所述的多肽，其中所述间隔子域包括α螺旋、螺旋束或L9连接螺旋。
19.一种载体，其包括编码根据权利要求1至18中任一项所述的多肽的多核苷酸。
20.一种色谱配体，其包括根据权利要求1至18中任一项所述的多肽。
21.根据权利要求20所述的色谱配体，其中所述色谱配体被固定在固相载体上。
22.根据权利要求20所述的色谱配体，其中所述固相载体选自由以下组成的组：多糖(例如，琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、海藻酸或淀粉)、共聚物、天然聚合物或合成聚合物、二氧化硅、玻璃、塑料、金属和陶瓷，并且其中所述固相载体呈微珠粒、纳米珠粒、膜、水凝胶或纤维的形式。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的色谱配体，其中在0.5M NaOH溶液中孵育24小时之后，所述色谱配体保留Ig结合能力的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％。
24.根据权利要求20至22中任一项所述的色谱配体，其中在0.5M NaOH溶液中孵育24小时到36小时之后，所述色谱配体保留Ig结合能力的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％。
25.一种亲和色谱基质，其包括多个根据权利要求1至18中任一项所述的多肽，其中所述多肽共价偶联到固相载体，其中所述固相载体选自由以下组成的组：多糖(例如，琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、海藻酸、淀粉)、共聚物、天然聚合物或合成聚合物、二氧化硅、玻璃、塑料、金属和陶瓷，并且其中所述固相载体呈微珠粒、纳米珠粒、膜、水凝胶或纤维的形式。
26.根据权利要求25所述的基质，其中在0.5M NaOH溶液中孵育24小时之后，所述基质保留Ig结合能力的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％。
27.根据权利要求25所述的基质，其中在0.5M NaOH溶液中孵育24小时到36小时之后，所述基质保留Ig结合能力的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％。
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