CN102895960A - 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质 - Google Patents

包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质 Download PDF

Info

Publication number
CN102895960A
CN102895960A CN2012102733987A CN201210273398A CN102895960A CN 102895960 A CN102895960 A CN 102895960A CN 2012102733987 A CN2012102733987 A CN 2012102733987A CN 201210273398 A CN201210273398 A CN 201210273398A CN 102895960 A CN102895960 A CN 102895960A
Authority
CN
China
Prior art keywords
domain
spa
affinity chromatography
terminal
disappearance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2012102733987A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102895960B (zh
Inventor
S·斯佩克特
R·史密斯
J·奥兰多
N·比安
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EMD Millipore Corp
Original Assignee
Millipore Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Millipore Corp filed Critical Millipore Corp
Priority to CN201610022037.3A priority Critical patent/CN105457612B/zh
Publication of CN102895960A publication Critical patent/CN102895960A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102895960B publication Critical patent/CN102895960B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及层析基质，其包括基于免疫球蛋白结合蛋白如金黄色葡萄球菌A蛋白(SpA)的一个或多个结构域的配体，也涉及它们的使用方法。

Description

包括基于金黄色葡萄球菌A蛋白的新配体的层析基质
相关申请
本申请要求2011年6月8日提交的美国临时专利申请61/494701的优先权，在此通过援引的方式将其全部内容并入本申请。
发明领域
本发明涉及层析基质，其包括基于免疫球蛋白结合蛋白(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)A蛋白(SpA))的一个或多个结构域的配体，也涉及它们的使用方法。
背景技术
用于亲和层析的配体通常对于靶分子具有高选择性，从而能够以高产率、高纯度、快速且经济的方式纯化靶分子。基于金黄色葡萄球菌A蛋白的试剂和层析介质已经在亲和层析领域得到广泛应用，用于捕获和纯化抗体和含有Fc的蛋白；由于其能够结合IgG，且不会显著影响免疫球蛋白与抗原的亲和力，因此在规模化分析抗体检测方法中也得到广泛应用。
因此，包含A蛋白配体的各种试剂和介质已经建立起来并通过商业途径可以获得，例如，
Figure BSA00000758692300011
-vA High Capacity、
Figure BSA00000758692300012
-vA Ultra和
Figure BSA00000758692300013
UltraPlus(MILLIPORE)和Protein A SepharoseTM、MabSelectTM、MabSelectXtraTM、MabSelect SuReTM(GE HEALTHCARE)、MabSelect SuReTM LX和Poros MasCapture ATM(LIFE TECHNOLOGIES)。
为了保持层析配体(包括配体结合型固相支持物如结合SpA的层析基质)的选择性，基质需要进行清洗，而且通常在酸性或碱性条件下清洗，如用氢氧化钠(NaOH)。例如，用于基质清洗和再生的标准过程是碱性原位清洗(CIP)方法，其通常包括用浓度为0.05M-1M的NaOH处理结合配体的基质，使pH范围位于12.7-14.0。一般来讲，将亲和层析基质进行重复原位清洗循环会导致基质对靶分子的结合能力随清洗时间的延长而显著丧失，从而整个过程需要更多量的通常很昂贵的与基质结合的配体。由于这样会导致纯化过程更加昂贵并且时间延长，因此既不够经济也不是所期望的。
发明内容
基于A蛋白的层析基质之前在现有技术中已有描述，其表现出在碱性条件下处理后对于靶分子的结合能力下降。参见，如公开号为20100221844的美国专利出版物描述的亲和层析基质以多点连接的方式将野生型(wt)SpA的B或Z结构域结合到基质上，即使用0.5M NaOH处理5小时或更长时间，其也能达到起始结合能力的95％。此外，公开号为20100048876的美国专利出版物描述了一种结合了野生型SpA的C结构域和含有3-6个氨基酸缺失的C结构域的亲和层析基质，用0.5M NaOH处理约5小时，其达到起始结合能力的95％。这些配体通过半胱氨酸引导的单点连接方式固定到基质上。进一步地，已经有文献描述了结合在一个或多个天冬氨酸位点含有突变的A蛋白的层析基质，在碱性条件下处理后，其基质显示出结合能力相对于野生型SpA有所下降，其通过单点连接方式固定到基质上。参见如US专利6831161。
尽管前述提到的亲和层析基质在苛性条件(caustic conditions)下处理后，似乎显示出对于靶分子的结合能力有所下降，但在苛性条件下处理后，其中许多基质显示出很大程度的配体片段化，如使用SDS-PAGE和/或尺寸排阻层析(SEC)可以观察到。由于很大程度的配体片段化产生的配体小片段难以从靶分子中去除和分离，从而增加潜在的免疫原性片段与治疗性靶分子共纯化的可能，因此这种片段化是不利的。此外，很大程度的片段化导致加剧基质与靶分子结合能力的下降。
本发明提供了亲和层析配体和结合该配体的基质，其中所述配体基于一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白(SpA)的结构域，该结构域具有从N末端第1位或第2位起始的缺失突变。这些配体和基质在纯化使用时的片段化问题相对于之前描述的配体有所下降，这一点通过SDS-PAGE和/或SEC技术可以证实，从而使得它们成为用于亲和层析的更有吸引力和更加经济的选择。
本发明的一个方面提供了亲和层析基质，其包括具有缺失突变的一个或多个SpA蛋白B结构域，具有缺失突变的一个或多个SpA蛋白C结构域或具有缺失突变的一个或多个SpA蛋白Z结构域，其中一个或多个结构域结合到固相支持物上。
在一个实施方式中，本发明的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其中所述配体包含一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白(SpA)B结构域，其中至少一个B结构域包含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。在另一实施方式中，本发明的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其中所述配体包含一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白(SpA)的C结构域，其中至少一个C结构域包含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。
在另一实施方式中，本发明的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其中所述配体包含一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白(SpA)的Z结构域，其中至少一个Z结构域包含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。
在又一实施方式中，本发明的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其中所述配体包含两个或更多个B结构域，两个或更多个C结构域或两个或更多个Z结构域，或B、C和Z结构域的任意组合，其中至少一个B、C或Z结构域包含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。
在本发明的各种实施方式中，每个配体上多于一个位点连接到固相支持物(即多点连接)。
在本发明的各种实施方式中，所述配体或含有配体的基质经0.5MNaOH处理至少5小时后，配体相对于其野生型对应物显示出降低的片段化，这通过SDS-PAGE或尺寸排阻层析(SEC)可以确定。
在本发明的一些实施方式中，所述配体包含N末端3个氨基酸缺失，N末端4个氨基酸缺失，或N末端5个氨基酸缺失，其中配体上多于一个位点连接到固相支持物，从而形成亲和层析基质。
在一特定的实施方式中，配体具有SEQ ID NO：13-42、SEQ ID NO：55-84和SEQ ID NO：93-94中任一所示的氨基酸序列。
在另一实施方式中，本发明的配体具有下列结构：[(X)n，(Y)m]n+m，其中X代表SpA蛋白的B结构域、Z结构域或C结构域，n代表从零至(m-1)范围的结构域数目，Y代表N末端缺失至少3个连续氨基酸的SpA蛋白B结构域、Z结构域或C结构域，m代表范围是1-8的Y结构域的数目，其中所述配体多于一个位点连接到固相支持物(如层析基质)。
在本发明的一些实施方式中，所述配体包含SpA蛋白的两个B结构域或两个Z结构域或两个C结构域，或一个B和一个C结构域，或一个B和一个Z结构域，或一个C和一个Z结构域，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个连续氨基酸缺失。应该理解，各种结构域可以任意顺序分布。
在另一实施方式中，本发明的配体包含三个B结构域或三个Z结构域或三个C结构域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个连续氨基酸缺失。
在又一实施方式中，本发明的配体包含四个B结构域或四个Z结构域或四个C结构域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个连续氨基酸缺失。
在又一实施方式中，本发明的配体包含五个B结构域或五个Z结构域或五个C结构域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个连续氨基酸缺失。
在又一实施方式中，本发明的配体包含六个B结构域或六个Z结构域或六个C结构域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个连续氨基酸缺失。
在又一实施方式中，本发明的配体包含七个B结构域或七个Z结构域或七个C结构域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个连续氨基酸缺失。
在进一步的实施方式中，本发明的配体包含八个B结构域或八个Z结构域或八个C结构域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个连续氨基酸缺失。
此外，本发明提供了亲和层析基质的使用方法。因此，提供了从样品中亲和纯化一种或多种靶分子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白)的方法，所述方法包含下列步骤：(a)提供包含一种或多种靶分子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白)的样品；(b)在使一种或多种靶分子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白)结合到基质上的条件下将样品与本发明的基质接触；和(c)在适宜的条件如适宜的pH条件下，通过洗脱回收一种或多种结合的靶分子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白)。
在一些实施方式中，本发明的亲和层析基质经0.5M NaOH温育5小时或10小时或15小时或20小时或25小时或30小时后保留了初始靶分子结合能力的至少95％。
在特定实施方式中，本发明的亲和层析基质经0.5M NaOH温育5小时后保留了初始结合能力的至少95％。
在又一实施方式中，本发明的亲和层析基质经0.1M NaOH温育25小时后保留了初始靶分子结合能力的至少95％；经0.3M NaOH温育25小时后保留了初始靶分子结合能力的至少85％；或经0.5M NaOH温育25小时后保留了初始靶分子结合能力的至少65％。
能被这里描述的不同配体结合的免疫球蛋白包括：如IgG、IgA和IgM，或包含抗体和任意抗体片段的、能与SpA结合的任意融合蛋白。
本发明还提供了编码本发明所描述的不同配体的核酸分子，以及包括所述核酸分子的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是原核细胞。在另外的实施方式中，宿主细胞是真核细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了基于SpA的亲和层析基质，其与免疫球蛋白Fab段的结合与野生型SpA配体相比发生了改变(升高或下降)，同时保留了与免疫球蛋白Fc段结合的能力。在一个实施方式中，本发明基于SpA的基质与免疫球蛋白Fab段的结合与野生型SpA相比出现下降。在一特定实施方式中，层析基质结合SpA配体，该配体包括在第29位以赖氨酸替代甘氨酸(对于SpA的B和C结构域)或替代丙氨酸(对于SpA的Z结构域)。
附图简述
图1描述了SpA的野生型(wt)IgG结合结构域以及Z结构域的氨基酸序列比对，如SEQ ID NO：1-6所示。
图2描述了含有编码带有A29K突变的二聚化Z结构域配体的核苷酸序列的pET11a质粒图谱，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：85(对照)，以及编码带有A29K突变和第二结构域包括N末端4个连续氨基酸缺失的二聚化Z结构域配体的核苷酸序列的pET11a质粒图谱，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：78。配体构建物进一步包括3’端的His-tag序列。
图3是考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，用于分析游离或固定化的二聚化Z和C配体经过或不经过0.5M NaOH苛性浸泡(caustic soak)25小时的片段化分布情况。SDS-PAGE胶各泳道解释如下：泳道1：分子量标志；泳道2：二聚化Z结构域配体不经过苛性处理(A29K，无缺失，序列如SEQID NO：85所示，用作对照，有His-tag)；泳道3：二聚化Z结构域配体对照经过0.5M NaOH浸泡25小时；泳道4：固定到琼脂糖层析树脂上的二聚化Z结构域配体对照经过0.5M NaOH浸泡25小时；泳道5：第二结构域N末端具有4个连续氨基酸缺失的二聚化Z结构域配体不经过碱性处理(A29K，第二结构域有缺失，序列如SEQ ID NO：78所示，有His-tag)；泳道6：SEQID NO：78所示的、有His-tag的二聚化Z结构域配体经过0.5M NaOH浸泡25小时；泳道7：有His-tag、固定到琼脂糖层析树脂上的、SEQ ID NO：78所示的二聚化Z结构域配体经过0.5M NaOH浸泡25小时；泳道8：用作对照的、无缺失的二聚化C结构域配体不经过苛性处理(氨基酸序列如SEQ IDNO：92所示；有His-tag)；泳道9：二聚化C结构域配体对照经0.5M NaOH浸泡25小时；泳道10：固定到琼脂糖层析树脂上的二聚化C结构域配体经0.5M NaOH浸泡25小时；泳道11：第二结构域N末端有缺失的二聚化C结构域配体(氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示，有His-tag)；泳道12：SEQ ID NO：35所示的、有His-tag的二聚化C结构域配体经0.5M NaOH浸泡25小时；泳道13：SEQ ID NO：35所示的、有His-tag的、固定到琼脂糖层析树脂上的二聚化C结构域配体经过0.5M NaOH浸泡25小时。
图4是上述图3概述的二聚化Z和C配体的尺寸排阻层析(SEC)结果。x轴代表保留时间，以分钟表示，小分子比大分子的保留时间长。y轴代表在280nm的紫外吸收值，以mAU表示。层析图上的方框表明第二结构域N末端有缺失的二聚化Z和C结构域配体经长时间碱性处理(如0.5MNaOH处理25小时)后的降低的片段化，箭头所示的二聚化Z和C结构域对照中存在的小片段。
图5是考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，用于分析游离或固定化的五聚化Z结构域配体经过或不经过0.5M NaOH苛性浸泡25小时的片段化分布情况。SDS-PAGE胶各泳道解释如下：泳道1：分子量标志；泳道2：具有A29K突变的、除第一结构域外其余均具有N末端4个连续氨基酸缺失的五聚化Z结构域配体，氨基酸序列如SEQ ID NO：84所示，不经过苛性处理；泳道3：SEQ ID NO：84所示的五聚化Z结构域配体经过0.5M NaOH浸泡25小时；泳道4：SEQ ID NO：84所示的、固定到琼脂糖层析树脂上的五聚化Z结构域配体经过0.5M NaOH浸泡25小时；泳道5：SEQ ID NO：91所示的五聚化Z结构域配体，用作对照，不经过苛性浸泡；泳道6：五聚化Z结构域配体对照经过0.5M NaOH浸泡25小时；泳道7：固定到琼脂糖层析树脂上的五聚化Z结构域配体对照经过0.5M NaOH浸泡25小时；进一步，泳道8、9和10：是重组SPA(rSPA)经过相似处理的结果，其中泳道8代表rSPA不经过苛性浸泡；泳道9代表rSPA经过0.5M NaOH浸泡25小时以及固定化的rSPA经过0.5M NaOH浸泡25小时。条带代表片段化，以箭头标出。
图6是上述图5概述的五聚化Z结构域配体的尺寸排阻层析(SEC)结果。x轴代表保留时间，以分钟表示，小分子比大分子的保留时间长。y轴代表在280nm的紫外吸收值，以mAU表示。证据表明：除第一结构域外其余均具有N端缺失的五聚化Z结构域配体经长时间苛性浸泡后的降低的片段化，这通过层析图上的方框可以看出，五聚化Z结构域对照中存在的小片段用箭头标出。进一步，rSPA的大量片段化也可以通过SEC观察到。
图7是上述图5概述的固定化五聚Z结构域配体的尺寸排阻层析(SEC)结果。x轴代表保留时间，以分钟表示，小分子比大分子的保留时间长。y轴代表在280nm的紫外吸收值，以mAU表示。证据表明：第二结构域N端缺失的固定化五聚Z结构域配体经长时间苛性浸泡后的降低的片段化，这通过层析图上的方框可以看出，五聚化Z结构域对照中存在的小片段用箭头标出。进一步，rSPA的大量片段化也可以通过SEC观察到。
图8是游离的二聚化Z结构域配体经长时间苛性浸泡后的尺寸排阻层析(SEC)结果，其中所述配体包括在二聚化配体的第二结构域N端缺失第一个(SEQ ID NO：87)，缺失前二个(SEQ ID NO：88)，缺失前三个(SEQID NO：69)或缺失前四个(SEQ ID NO：78)。x轴代表保留时间，以分钟表示，小分子比大分子的保留时间长。y轴代表在280nm的紫外吸收值，以mAU表示。证据表明，第二结构域N端缺失前三个或前四个氨基酸的二聚化配体经长时间苛性浸泡后的降低的片段化，以方框标出。第二结构域N末端无氨基酸缺失(SEQ ID NO：85)或缺失第一个或前二个氨基酸的二聚化配体经长时间苛性浸泡后出现片段化，通过箭头所指的层析片段可以显示出来。
图9比较了固定化C结构域五聚体经过反复苛性处理后保留的结合能力，其中一个五聚体配体的每个结构域都包括N末端四个氨基酸缺失，在五聚体中每个结构域都有G29K突变，并且第一位氨基酸均为丙氨酸(氨基酸序列如SEQ ID NO：93所示)；另一五聚体配体是具有G29K突变的野生型(氨基酸序列如SEQ ID NO：95所示)。x轴代表逐渐增加的处理时间，层析基质经过0.7M NaOH处理16个循环、每循环30分钟。y轴代表保留的结合能力百分数。
发明详述
本发明提供了结合基于SpA的一个或多个结构域的配体的亲和层析基质，其中所述单独存在或固定于基质的配体在用于纯化过程中时相对于SpA野生型结构域显示出降低的片段化。
基于SpA的层析配体先前已经有示例性描述，包括，如公开号为20100221844的美国专利出版物描述的亲和层析基质结合野生型(wt)SpA的B或Z结构域，其中配体上多于一个位点结合到层析基质上(即多点结合)；公开号为20100048876的美国专利出版物描述了一种结合野生型SpA的C结构域的层析配体，其能够与多种抗体的Fab段结合，并通过末端偶联基团在单一位点偶联到不溶性载体上；US6831161描述了基于SpA的碱性层析配体，其中一个或多个天冬氨酸残基进行了修饰。
如上述所讨论的，这些配体在碱性条件处理后结合能力出现下降，其中许多配体在纯化使用过程中出现片段化，例如，公开号为20100221844的美国专利出版物描述的配体很不尽人意。另一方面，本发明描述的配体与之前描述的配体相比，可成为蛋白纯化时强有吸引力的选择，因为它们经过蛋白纯化过程常规使用的碱性条件下再生和原位清洗(CIP)处理后的片段化降低。
为了公开的内容更容易理解，首先对一些术语进行定义。附加定义在详述中提出。
I、定义
本发明所用的术语“SPA”、“A蛋白”或“金黄色葡萄球菌A蛋白”是指从金黄色葡萄球菌中分离的、42Kda的多结构域蛋白。SpA通过称作X结构域的、其羧基端细胞壁结合结构域结合到细菌细胞壁上。在其氨基端包括五个免疫球蛋白结合结构域，被称为E、D、A、B和C(Sjodhal，Eur J Biochem.Sep 78(2)：471-90(1977)；Uhlen et al.，J Biol Chem.Feb259(3)：1695-702(1984))。其中每个结构域含有大约58个氨基酸残基，它们之间具有65-90％的氨基酸序列相同性。
SpA的E、D、A、B和C中的每一个结构域具有不同的Ig结合位点。
一个位点用于结合Fcγ(Ig中IgG类的恒定区)，另一位点用于结合特定Ig分子的Fab区(负责抗原识别的Ig区域)。已经有报道认为每个结构域都含有一Fab结合位点。SpA的非Ig结合区域位于C末端，被称作X区域或X-结构域。
SpA的Z结构域是SpA的B结构域的工程化改造类似物，其包括在第1位以缬氨酸替代丙氨酸以及在第29位以丙氨酸替代甘氨酸(Nisson，et al.，Protein engineering，Vo1.1，No.2，107-113，1987)。
编码SpA基因的克隆在US5151350中进行了描述，在此通过引用将其所有内容全部并入本申请。
本发明提供了结合基于SpA的配体的亲和层析基质，其中所述配体(游离的以及固定化的配体)在蛋白纯化过程中常规使用的再生和原位清洗处理之后表现出的降低的片段化，这通过SDS-PAGE和SEC能够观察到。
根据本发明的多个方面，亲和配体包含一个或多个B结构域或一个或多个Z结构域或一个或多个C结构域，或者它们的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包含从第1位或第2位起始的、N末端3个连续氨基酸或N末端4个连续氨基酸或N末端5个连续氨基酸缺失。
根据本发明的一些实施方式，亲和配体多于一个位点连接到层析基质上(即多点连接)。在特定实施方式中，本发明提供的亲和层析基质包含结合了SpA的一个或多个B结构域的亲和层析基质，其中配体多于一个位点连接到基质上，并且至少一个B结构域具有从野生型B结构域序列第1位或第2位起始的、N末端3个连续氨基酸或N末端4个连续氨基酸或N末端5个连续氨基酸缺失。
在另一实施方式中，本发明提供的亲和层析基质包含结合了SpA的一个或多个Z结构域的亲和层析基质，其中配体多于一个位点连接到基质上，并且至少一个Z结构域具有从野生型Z结构域序列第1位或第2位起始的、N末端3个连续氨基酸或N末端4个连续氨基酸或N末端5个连续氨基酸缺失。
在又一实施方式中，本发明提供的亲和层析基质包含结合了SpA的一个或多个C结构域的亲和层析基质，其中配体多于一个位点连接到基质上，并且至少一个C结构域具有从野生型C结构域序列第1位或第2位起始的、N末端3个连续氨基酸或N末端4个连续氨基酸或N末端5个连续氨基酸缺失。
在特定实施方式中，本发明提供了碱性条件下稳定的亲和层析配体，其包括SpA的5个C结构域，每个结构域包括一G29K突变和从第一位起始的N末端4个氨基酸缺失，而且五聚体形式包括一个额外的丙氨酸作为第一位氨基酸以利于蛋白翻译后加工的均一化。
在一些实施方式中，本发明的SpA配体进一步包括将第29位的甘氨酸替换为赖氨酸(对于B和C结构域)或将第29位的丙氨酸替换为赖氨酸(对于Z结构域)。
本发明所用的术语“亲本分子”或“野生型(wt)对应物”或“wt蛋白”或“wt结构域”是指天然状态的相应蛋白(SpA)或蛋白的结构域(如SpA的B、Z或C结构域)，其在本发明通常用作对照。本发明所用的野生型对应物相当于天然状态的SpA结构域，可以包括相应的SpA结构域中一个氨基酸的变化以改变与Fab的结合，否则，其序列与相应的野生型结构域完全相同。本发明的配体表现为相对于野生型对应物(即完全野生型或包括改变与Fab的结合的突变)的片段化降低(对于游离和固定化形式均如此)，其通过本发明实施例中的实验可以证实。在各种实施方式中，本发明基于B结构域或C结构域的配体的野生型对应物是SpA的野生型B结构域或SpA的野生型C结构域，其氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。在特定实施方式中，基于Z结构域的配体的野生型对应物是Z结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。在特定实施方式中，B、C或Z结构域的野生型对应物与上面提到的B、C或Z结构域序列基本上相同，只是在第29位有一突变，改变了结构域与Fab的结合。因此，在特定实施方式中，基于B结构域的配体的野生型对应物包括SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列(G29K)，基于C结构域的配体的野生型对应物包括SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列(G29K)以及基于Z结构域的配体的野生型对应物包括SEQ IDNO：48所示的氨基酸序列(A29K)。进一步，当本发明的配体包括多于一个结构域时，相应的野生型对应物包括相同数目的结构域，然而，可能包括一突变以改变与Fab的结合。因此，在特定实施方式中，本发明的五聚化C结构域配体的野生型对应物包括SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列。
术语“序列相同性”是指两核苷酸或氨基酸序列例如使用默认缺口权重(default gap weights)通过GAP或BESTFIT程序最佳匹配时，具有至少70％的序列相同性，或至少80％的序列相同性，或至少85％的序列相同性，或至少90％的序列相同性，或至少95％的序列相同性或者更高。序列比对时通常将一条序列作为对照序列(如亲本序列)，待测试序列与之相比较。当使用序列比对算法时，待测试序列与对照序列输入计算机，建立子序列坐标，如需要，进一步建立序列算法程序参数。然后序列比对算法基于建立的程序参数计算测试序列相对于对照序列的序列相同性百分比。
序列比对的最优匹配可以进行控制，如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)中的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)中的同源性匹配算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nal’l Acad.Sci.USA 48：443(1988)中的同源性匹配算法，通过这些算法的计算机互补(威斯康星遗传软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，TFASTA，Genetics Computer group，575 Science Dr.；Madison，Wis.)或通过目测(参见Ausubel ET a1.，Current Protocols in molecular biology)。适于确定序列相同性百分比和序列相似性算法的一个例子是BLAST算法，其在Altschul et a1.，J.Mol.Biol.215：403(1990)中进行了描述。执行BLAST分析的软件通过National Center for Biotechnology Information对公众开放(公众通过NationalInstitute of Health NCBI网址可以获得)。一般来讲，使用参数默认程序参数执行序列比对，虽然客户指定的参数也可以使用。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认字长(W)是3，期望值(E)是10，以及BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
本发明中可互换使用的术语“E结构域”、“SpA的E结构域”、“金黄色葡萄球菌A蛋白的E结构域”是指具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽，或者由例如SEQ ID NO：7所示核酸序列编码的多肽。“E结构域”是51个氨基酸构成的多肽，折叠形成三螺旋束结构。它能够通过螺旋1和2表面的氨基酸残基结合Fc，或者通过螺旋2和3表面的氨基酸残基结合Fab。
本发明中可互换使用的术语“D结构域”、“SpA的D结构域”、“金黄色葡萄球菌A蛋白的D结构域”是指具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽，或者由例如SEQ ID NO：11所示核酸序列编码的多肽。“D结构域”是61个氨基酸构成的多肽，折叠形成三螺旋束结构。它能够通过螺旋1和2表面的氨基酸残基结合Fc，或者通过螺旋2和3表面的氨基酸残基结合Fab。
本发明中可互换使用的术语“A结构域”、“SpA的A结构域”、“金黄色葡萄球菌A蛋白的A结构域”是指具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，或者由例如SEQ ID NO：8所示核酸序列编码的多肽。“A结构域”是58个氨基酸构成的多肽，折叠形成三螺旋束结构。它能够通过螺旋1和2表面的氨基酸残基结合Fc，或者通过螺旋2和3表面的氨基酸残基结合Fab。
本发明中可互换使用的术语“B结构域”、“SpA的B结构域”、“金黄色葡萄球菌A蛋白的B结构域”是指具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽，或者由例如SEQ ID NO：9所示核酸序列编码的多肽。“B结构域”是58个氨基酸构成的多肽，折叠形成三螺旋束结构。它能够通过螺旋1和2表面的氨基酸残基结合Fc，或者通过螺旋2和3表面的氨基酸残基结合Fab。
在一些实施方式中，本发明基于B结构域的配体包括N末端3个氨基酸的缺失，如具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。在另一实施方式中，本发明基于B结构域的配体包括N末端4个氨基酸的缺失，如具有SEQ IDNO：28所示的氨基酸序列。在又一实施方式中，本发明基于B结构域的配体包括N末端5个氨基酸的缺失(未显示序列)。
本发明中可互换使用的术语“C结构域”、“SpA的C结构域”、“金黄色葡萄球菌A蛋白的C结构域”是指具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽，或者由例如SEQ ID NO：10所示核酸序列编码的多肽。“C结构域”是58个氨基酸构成的多肽，折叠形成三螺旋束结构。它能够通过螺旋1和2表面的氨基酸残基结合Fc，或者通过螺旋2和3表面的氨基酸残基结合Fab。
在一些实施方式中，本发明基于C结构域的配体包括N末端3个氨基酸的缺失，如具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。在另一实施方式中，本发明基于C结构域的配体包括N末端4个氨基酸的缺失，如具有SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列。在又一实施方式中，本发明基于C结构域的配体包括N末端5个氨基酸的缺失(未显示序列)。
本发明中可互换使用的术语“Z结构域”、“SpA的Z结构域”、“金黄色葡萄球菌A蛋白的Z结构域”指三螺旋、58个氨基酸的多肽，是A蛋白的B结构域的突变体。Z结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。Z结构域在Nilsson et al.，Protein Engi.，1：107-113(1987)进行了示例性描述，通过引用将其全部内容并入本申请。
在一些实施方式中，本发明基于Z结构域的配体包括N末端3个氨基酸的缺失，如具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。在另一实施方式中，本发明基于Z结构域的配体包括N末端4个氨基酸的缺失，如具有SEQ IDNO：30所示的氨基酸序列。在又一实施方式中，本发明基于Z结构域的配体包括N末端5个氨基酸的缺失(未显示序列)。
在一些实施方式中，本发明的配体多于一个位点结合到固相支持物上(即多点结合)，其中配体在用于纯化过程中时显示出降低的片段化(适用于游离配体和固定化配体)，这通过SDS-PAGE或SEC可以证实。
本发明中使用的术语“降低的片段化”是指在纯化过程中，将游离配体分子或固定到固相支持物的配体分子在碱性条件下处理后，通过SDS-PAGE或SEC观察到的配体片段的数目和/或程度相对于野生型配体出现下降。在一些实施方式中，配体通过多点结合方式固定到固相支持物。片段化通常通过SDS-PAGE胶上存在相对于完整分子量的小分子量片段、或者通过SEC层析中具有不同保留时间的峰进行检测。
本发明的SpA配体表现出的降低的片段化，通过如下方式检测。例如，游离配体直接用0.1M NaOH、0.3M NaOH或0.5M NaOH处理25小时，然后调节pH至7.0，接下来通过SDS-PAGE或SEC标准方法进行分析。或者，固定到层析基质的配体经0.1M NaOH、0.3M NaOH或0.5M NaOH处理25小时。接下来将苛性上清与基质(如树脂)分离并中和至pH7。然后上清通过SDS-PAGE或SEC标准方法进行分析。对于SDS-PAGE，可以目测片段的相对光密度并与适宜的对照(如本发明中所描述的野生型SpA结构域或在第29位包括突变的SpA结构域)相比较。对于SEC，能够观察相对峰值并与适宜的对照(如本发明中所描述的野生型SpA结构域或在第29位包括突变的SpA结构域)相比较。
使用亲和层析基质的典型纯化过程包括每个循环后利用酸性或碱性溶液进行基质再生，后者是首选的。此外，典型过程也包括原位清洗(CIP)步骤，其使用酸性或碱性溶液清洁基质，首选用碱性溶液。因此，亲和层析基质在其使用过程中进行几个循环的再生和原位清洗步骤，导致其对于靶分子的结合能力随着时间的延长明显丢失。
本发明结合配体的层析基质除表现出在纯化使用过程中的降低的片段化外，其在碱性条件下是稳定的，因为经过再生和CIP步骤的长时间碱性处理后，其对于靶分子的结合能力随着时间的延长所出现的丢失是下降的。
本发明使用的术语“碱性稳定的”、“碱性稳定性”、“苛性稳定的”或“苛性稳定性”通常指本发明的单独或者固定到层析基质上的亲和配体耐受碱性条件下的反复再生和CIP循环而不丢失其结合活性的能力。一般来讲，认为固定本发明配体的基质本身，在0.5M NaOH中处理长达30小时，稳定性改变不超过5％。例如，在一些实施方式中，本发明的亲和配体能够耐受较长时间的常规碱性清洗，从而使得所述配体成为有吸引力的选择，尤其是对于昂贵、大规模纯化免疫球蛋白和含有Fc的蛋白等多种治疗用分子而言。
在一些实施方式中，碱性稳定性指本发明的配体或结合本发明配体的基质经0.05M、0.1M NaOH、0.3M NaOH或0.5M NaOH处理5小时后、或10小时后、或15小时后、或20小时后、或25小时后、或30小时后保留其初始结合能力的至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的能力。在另一实施方式中，碱性稳定性指经0.05M、0.1M NaOH、0.3M NaOH或0.5M NaOH处理5小时或7.5小时或10小时或15小时或20小时或25小时或30小时后初始结合能力的下降少于70％、或少于60％、或少于50％、或少于40％、或少于30％。在特定实施方式中，结合本发明配体的层析基质经0.5M NaOH处理5小时后，保留其初始结合能力的95％。在又一实施方式中，结合本发明配体的层析基质经0.1M NaOH处理25小时后，保留其初始结合能力的95％。在再一实施方式中，结合本发明配体的层析基质经0.3M NaOH处理25小时后，保留其初始结合能力的85％。在进一步的实施方式中，结合本发明配体的层析基质经0.5M NaOH处理25小时后，保留其初始结合能力的65％。
在一些实施方式中，本发明基于SpA的层析基质与包括野生型SpA结构域的基质相比，表现出增加的或改进的碱性稳定性。然而，在其它实施方式中，本发明基于SpA的层析基质在碱性条件下的稳定性不高于包括野生型对应物的配体的基质。举个例子，基于SpA的五聚化C结构域的配体在碱性条件下的稳定性不高于野生型五聚化C结构域对照。此种情况应该理解为，野生型及SpA结构域突变体包括G29K突变以降低Fab结合能力，但是这种突变本身却不影响其碱性稳定性(数据未显示)。
本领域技术人员通过常规和/或本发明描述的实验就能够方便的检测碱性稳定性。
本发明使用的术语“初始结合能力”指对基质进行碱性处理之前，单位体积的亲和层析基质(如包括亲和配体的基质)捕获的靶分子(如免疫球蛋白或含Fc的蛋白)的量。
在本发明一些实施方式中，包括本发明描述的配体的亲和层析基质(如含有一个或多个本发明描述的具有N末端缺失的SpA的B、Z或C结构域)在苛性条件下进行长时间处理后，其与包含相应的野生型SpA结构域对照的亲和层析基质相比，初始靶分子结合能力的丢失少于5％、或少于6％、或少于7％、或少于8％、或少于9％、或少于10％、或少于12％、或少于15％、或少于17％、或少于20％、或少于25％、或少于30％。在一些实施方式中，本发明的亲和层析基质在苛性条件下进行长时间处理后，其与包含相应的野生型SpA结构域对照的亲和层析基质相比，保留了初始靶分子结合能力的至少90％、或至少85％、或至少80％、或至少75％、或至少70％。然而，在一些实施方式中，本发明的亲和层析基质在苛性条件下进行长时间处理后，显示的结合能力与包含野生型对应物的基质相似。举个例子，包括SpA的五个或更多个C结构域的配体，其中每个结构域在N末端包括4个氨基酸的缺失，这种配体在碱性条件下的稳定性不高于其野生型C结构域对照。缺失体形式和野生型对应物都可以含有一G29K突变。进一步，在本发明描述的不同实施方式中，SpA配体可仅在多聚体第一结构域的N末端进一步包括一个单独的氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸，其中额外的氨基酸有助于翻译后加工的均一化。
亲和层析配体对于靶分子的结合能力可以通过本领域熟知的方法和此处描述的方法进行检测，如公开号为20100221844的美国专利中所描述的，通过引用的方式将其全部内容并入本申请。
本发明所用的术语“层析”是指将混合物中的目标靶分子(如免疫球蛋白或含Fc的蛋白)与其它分子分开并将其分离开来的一种动态分离技术。典型的层析方法是动态相(液体或气体)转运含目标靶分子的样品穿越或通过静态相(通常是固体)介质。对静态相的划分或亲和力的差别将不同的分子分开，而动态相在不同的时间将不同的分子转运出去。
本发明所用的术语“亲和层析”是指一种层析方法，其中待分离的靶分子通过其与靶分子特异性相互作用分子(如碱性条件下稳定的层析配体)之间的相互作用分离出来。在一个实施方式中，亲和层析包括将含有靶分子的样品(如免疫球蛋白或含Fc的蛋白)加入到本发明所描述的装载了基于SpA的配体的固相支持物中。
本发明所用的术语“A蛋白亲和层析”是指使用A蛋白或如这里描述的基于SpA的配体分开或分离物质，其中A蛋白或基于SpA的配体被固定化，如固定到固相支持物上。现有技术中已知的A蛋白亲和层析介质/树脂的例子包括将A蛋白固定到可控的多孔玻璃骨架上，如PROSEP ATM和PROSEPvATM介质/树脂(MILLIPORE)；将A蛋白固定到聚苯乙烯固相上，如POROS50ATM和Poros MabCapture ATM介质/树脂(APPLIED BIOSYSTEMS，INC.)；以及将A蛋白固定到琼脂糖固相支持物上，如rPROTEIN A SEPHAROSEFAST FLOWTM或MABSELECTTM介质或树脂(GE HEALTHCARE)。
除上述描述的基质以外，A蛋白也可以固定到疏水性交联多聚物上。参见如公开号为20080210615的美国专利出版物，通过引用的方式将其全部内容并入本申请，其中示例性描述了疏水性交联多聚物。不希望被理论约束，设想本发明涵盖的配体能固定到疏水性交联多聚物上，如公开号为20080210615的美国专利出版物中所描述的那样。
本发明可互换使用的术语“亲和基质”或“亲和层析基质”是指亲和层析配体(如SpA或其结构域)所结合的层析支持物。所述配体能够通过亲和作用结合与待纯化或待从混合物中分离的目标分子结合(如免疫球蛋白或含Fc的蛋白)。例如，本领域熟知的用于基于A蛋白的亲和层析的基于A蛋白的亲和层析基质包括固定到可控的多孔玻璃骨架上的A蛋白，如PROSEP ATM和PROSEP vATM树脂、High Capacity、Ultra和PROSEP UltraPlus(MILLIPORE)；固定到聚苯乙烯固相上的A蛋白，如POROS 50ATM和POROS MabCapture ATM(APPLIED BIOSYSTEMS)；或固定到琼脂糖固相上的A蛋白，例如rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOWTM或MABSELECTTM树脂(GE HEALTHCARE)。
术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(本发明中可互换使用)指具有基本的四肽链结构的蛋白，由两条重链和两条轻链组成，所述链例如通过链间二硫键被稳定住，其具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(本发明中可互换使用)指具有两多肽链结构的蛋白，由一条重链和一条轻链组成，所述链例如通过链间肽接头被稳定住，其具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”指包含稳定肽环的(如包含3到4个肽环)、重链或轻链多肽的球状结构域，例如，通过β-片层和/或链间二硫键被稳定住。本发明的结构域进一步指“恒定区”或“可变区”，基于如下：对于“恒定区”结构域而言，不同家族成员结构域内相对缺乏序列变异；对于“可变区”结构域而言，不同家族成员结构域内显著变异。抗体或多肽“结构域”在本领域通常与抗体或多肽“区域”可互换使用。抗体轻链“恒定区”结构域与“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区域或“CL”结构域可互换使用。抗体重链“恒定区”结构域与“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区域或“CH”结构域可互换使用。抗体轻链“可变区”结构域与“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区域或“VL”结构域可互换使用。抗体重链“可变区”结构域与“重链可变区”、“重链恒定结构域”、“VH”区域或“VH”结构域可互换使用。
免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆，并可以以单体或多聚形式存在，例如，IgM抗体以五聚体形式存在，和/或IgA抗体以单体、二聚体或多聚体形式存在。术语“片段”指抗体或抗体链的一部分，其比完整的抗体或抗体链包含更少的氨基酸残基。片段可以通过对完整的抗体或抗体链进行化学或酶学处理而得到。片段也可以通过重组方式得到。片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。
术语“抗原结合片段”指免疫球蛋白或抗体上与抗原结合或与完整抗体(即它们起源的完整抗体)竞争抗原结合(即特异性结合)的多肽区域。结合片段可通过重组DNA技术、或通过对完整免疫球蛋白的酶学或化学切割产生。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链和单链抗体。
也涵盖融合蛋白，包括将抗体或其片段作为融合蛋白的一部分。
本发明可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸分子”指任意长度的、多聚形式的核苷酸，是核糖核酸或脱氧核糖核酸。这些术语包括单链的、双链的或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基的多聚物、或其它天然的、化学上或生物学上可以修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。多核苷酸骨架包含糖和磷酸基团(其常规存在于RNA或DNA中)，或修饰的或替代的糖或磷酸基团。此外，双链多核苷酸分子可以通过化学合成的单链多核苷酸产物获得，或者通过合成互补链并在适宜条件下进行链退火，或者通过用合适的引物在DNA聚合酶作用下从头合成互补链。核酸分子具有多种不同形式，如基因或基因片断、一个或多个外显子、一个或多个内含子、mRNA、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的具有任意序列的DNA、分离的具有任意序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶，其它糖或连接基团，如氟代核糖、丙硫磷和核酸分支。本发明使用的“DNA”或“核酸序列”不仅包括碱基A、T、C和G，也包括它们的任何类似物或这些碱基的变体，如甲基化核苷酸或核苷酸修饰物如不带电的接头和丙硫磷，使用糖类似物，以及修饰和/或替代骨架结构，如聚酰胺。在特定实施方式中，核酸分子包含编码本发明所描述的SpA变体的核酸序列。
术语“Fc结合”“结合Fe段”或“与Fe段结合”指本发明描述的亲和配体与抗体恒定区(Fc)结合的能力。在一些实施方式中，本发明描述的配体以至少10-7M、或至少10-8M、或至少10-9M的亲和力与抗体(如人IgG1、IgG2或IgG4))的Fc段结合。
本发明使用的术语“Fab结合”或“结合Fab段”指本发明描述的亲和配体与抗体或免疫球蛋白分子的Fab段结合的能力。术语“Fab段结合降低”指本发明的基于SpA的配体与免疫球蛋白分子的Fab(或F(ab)2)的结合能力与其对照(如野生型SpA结构域)相比出现的任何下降，其中所述配体进一步包括一个或多个氨基酸的突变。在一些实施方式中，本发明的配体与其野生型对应物(用作对照)包括在第29位以甘氨酸替代丙氨酸或色氨酸。在特定实施方式中，本发明的配体包括在第29位包括赖氨酸。在特定实施方式中，本发明描述的配体与免疫球蛋白分子Fab段的结合无法通过现有技术和本发明中描述的常规方法进行检测。与免疫球蛋白分子的结合可通过本发明描述的熟知的方法进行检测，包括但不限于，例如，亲和层析和表面等离子共振分析。在一些实施方式中，本发明涵盖的免疫球蛋白结合蛋白以至少10-10M的亲和力与免疫球蛋白分子结合。
本发明使用的术语“N末端”指SpA结构域氨基酸序列的氨基末端，从每个结构域氨基酸序列的第1位或第2位起始，参见图1。然而，应理解为序列的第一个氨基酸之前可以加上一个甲硫氨酸或另一氨基酸以利于蛋白翻译后的均一加工，例如，丙氨酸、甘氨酸、或缬氨酸。本发明描述的SpA配体包括在SpA结构域N末端至少3个、或至少4个、或至少5个连续氨基酸的缺失(从B、C或Z结构域氨基酸序列的第1位或第2位起始，参见图1)。换句话说，此类配体在SpA的B、C或Z结构域包括第1-3位连续氨基酸、或第1-4位连续氨基酸、或第1-5未连续氨基酸的缺失；或此类配体在SpA的B、C或Z结构域包括第2-4位连续氨基酸、或第2-5位连续氨基酸、或第2-6位连续氨基酸的缺失(野生型SpA的B、C或Z结构域氨基酸序列见图1，其修饰为包括N末端缺失)。在特定实施方式中，本发明的配体包括5个C结构域，每个结构域包括从N末端第1位起始的4个连续氨基酸的缺失。
含有N末端3个连续氨基酸的缺失的SpA的B结构域氨基酸序列见SEQ ID NO：13，含有N末端4个连续氨基酸的缺失的SpA的B结构域氨基酸序列见SEQ ID NO：28，此外，含有N末端3个连续氨基酸的缺失的SpA的C结构域氨基酸序列见SEQ ID NO：14，含有N末端4个连续氨基酸的缺失的SpA的C结构域氨基酸序列见SEQ ID NO：29。进一步，含有N末端3个连续氨基酸的缺失的SpA的Z结构域氨基酸序列见SEQ ID NO：15，含有N末端4个连续氨基酸的缺失的SpA的Z结构域氨基酸序列见SEQ IDNO：30。
通常地，对于本发明描述的基于SpA配体的多聚体形式而言，单体形式配体的氨基酸序列进行简单重复就能够得到。然而，应该注意到，对于本发明的一些多聚体形式的配体而言，不需要所有的结构域都具有N末端缺失。例如，在一些实施方式中，多聚体形式的配体的第一个结构域不含有N末端缺失，然而，配体的随后的结构域含有N末端至少3个连续氨基酸的缺失、或N末端至少4个连续氨基酸的缺失、或N末端至少5个连续氨基酸的缺失。
本发明基于SpA的配体具有突出的、预料不到的性能，即在用于纯化过程中时表现出降低的片段化，这已经被本发明实施例所证实。值得注意的是，根据现有技术的教导并没有动机制造和使用这些配体。例如，公开号为20100048876的美国专利出版物描述了一种在SpA的C结构域缺失3-6个氨基酸的配体，然而，基于其教导(参见公开号为20100048876的美国专利的图2)，能够得出本发明描述的缺失突变体随着在苛性处理时间的延长，其结合能力的保留与野生型SpA的C结构域相比会很差。因此，基于该对比文件的教导，当其结合能力随着时间的延长与野生型对应物相比出现丢失时，不可能预见到使用SpA的C结构域缺失突变体。
方便起见，本申请参照的各种序列汇总于下面的表1中。
表1
Figure BSA00000758692300201
Figure BSA00000758692300211
Figure BSA00000758692300231
II、用作层析配体的基于SpA的分子的生产
本发明涵盖的基于SpA的亲和层析配体可通过现有技术已知的适宜的方法进行制备。
例如，作为起始步骤，利用如Sambrook、Fritsch和Maniatis撰写的名为分子克隆的实验手册中描述的标准遗传工程技术制备表达本申请所述的SpA配体分子的核酸。
在一些实施方式中，编码一个或多个具有N末端缺失的SpA结构域的核酸分子克隆入适当的载体以在适宜的诉主细胞中表达。适当的载体是本领域熟知的，通常包括突变体SpA编码序列转录和翻译必需的元件。
本发明所述的SpA分子可以从片段的氨基酸前体化学合成得到，所用方法是本领域熟知的，包括固相肽合成法，如Boc(叔丁氧羰基)或Fmoc(9-芴甲氧羰基)策略(参见如US6060596；4879378；5198531；5240680)。
本发明所述SpA分子的表达可以在多种类型的细胞中完成，例如真核宿主细胞如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞；以及原核细胞，如细菌，例如大肠杆菌(E.coli)。
在一些实施方式中，SpA分子可以表达于噬菌体表面，以使得每个噬菌体含有编码展示于噬菌体表面的单个SpA分子的DNA序列。SpA分子对免疫球蛋白的亲和力可以通过本领域标准技术及本发明描述的方法方便地进行检测，如ELISA和BiacoreTM2000标准(BIACORE AB，UppsalaSweden)。可以预期本发明的SpA分子对免疫球蛋白的结合亲和力至少与母本分子相当，其中该分子在使用过程中表现出降低的片段化，如本发明所描述的那样。
III、用于制备层析基质的的支持物
在一些实施方式中，本发明涵盖的SpA配体固定到支持物上，如固相支持物或液相支持物，以制备适于分离生物大分子如免疫球蛋白和含有Fc的蛋白的亲和层析基质。
在一些实施方式中，本发明的配体固定到固相支持物上。不希望被理论约束，设想任意适宜的固相支持物都可以用于结合本发明的配体。如，固相支持基质包括但不限于可控多孔玻璃、二氧化硅、氧化锆、氧化钛、琼脂糖、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚苯乙烯及其衍生物(如它们的合金)。固相支持物可以是多孔材料或无孔材料。
在一些实施方式中，固相支持物是多孔材料。用作固相支持物的多孔材料可以由亲水化合物、疏水化合物、疏油化合物、亲油化合物或它们的任意组合。多孔材料可以由单聚体或多聚体组成。适宜的多孔材料的例子包括但不限于聚醚砜、聚酰胺如尼龙、聚多糖例如琼脂糖和纤维素、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯纤维、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙烯醇、聚氯乙烯醚、聚碳酸酯、氟碳多聚物如聚(四氟乙烯-co-全氟(丙基乙烯基醚))、玻璃、二氧化硅、氧化锆、氧化钛、陶瓷、金属和它们的合金。
多孔材料可由有机或无机分子或有机和无机分子的组合构成，可以由一个或多个功能基团组成，如羟基基团、环氧基团、硫醇基团、氨基基团、羰基基团或羧酸基团，这些基团适于反应如形成共价键进一步进行化学修饰从而共价结合到蛋白上。在另一实施方式中，多孔材料可以不具有功能基团，但是包被有具有功能基团的材料层，如羟基基团、硫醇基团、氨基酸基团、羰基基团或羧酸基团。
在一些实施方式中，使用常规的亲和分离基质，如有机天然的、基于多聚物的基质，将一亲水性表面暴露到使用的液相介质中，如暴露羟基(--OH)、羧基(--COOH)、羰基(--CHO或RCO-R’)、酰胺(--CONH2，可能是N末端取代形式)、氨基(--NH2，可能是取代形式)、末端的寡聚或多聚乙烯氧基基团和，如果存在，也在其内表面。在一个实施方式中，多聚物，例如，可以基于多糖，如右旋糖苷、淀粉、纤维素、支链淀粉、琼脂糖等，利于方便的进行交联，如与双环氧化合物、环氧卤丙烷、烯丙基溴、烯丙基缩水甘油酯、1，2，3-三卤代低级碳氢化合物，以提供适宜的孔性和刚性。在另一实施方式中，固相支持物包含多孔琼脂糖珠。本发明使用的不同支持物通过现有技术已知的标准方法就可以方便的制备，例如反向悬浮凝胶，如文献Hjerten，Biochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)中所描述的。或者，基础基质可以是商品化的产品，如SepharoseTM FastFlow(GEHEALTHCARE，Uppsala，Sweden)。在一些实施方式中，特别是便于进行大规模分离，支持物可以增加其刚性，因此使基质更加适于在高流速时使用。
此外，固相基质可以基于合成的多聚体，如聚乙烯醇、聚乙烯酯、聚丙烯酸羟烷基酯、聚丙烯酸羟烷基甲酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。对于疏水多聚物，如基于二乙烯和单乙烯取代苯的基质，基质表面通常进行亲水化以将上述定义的亲水基团暴露到周围的液相环境中。此类多聚物通过标准方法易于制备，参见如Arshady，Chimica e L’Industria 70(9)，70-75(1988)。此外，可以使用商品化的产品，如SourceTM(GE HEALTHCARE，Uppsala，Sweden)和Poros(APPLIED BIOSYSTEMS，Foster City，CA)。
在另外的实施方式中，固相支持物包含无机性质的支持物，如二氧化硅、氧化锆、氧化钛和它们的合金。无机基质表面通常进行修饰以包含适宜的反应集团，以利于与SpA和其突变体的进一步反应。这样的例子包括CM Zirconia(Ciphergen-BioSepra)(CERGYPONTIOSE，France)和(MILLIPORE)。
在一些实施方式中，固相支持物可以是，例如，基于以可控多孔玻璃形式存在的氧化锆、氧化钛或二氧化硅，其可以修饰以包含反应基团和/或耐受苛性浸泡，以与配体偶联。
固相支持物形式的例子包括但不限于珠(球形或不规则形状)，中空纤维、固体纤维、板、胶、膜、盒、柱、条、片、盘或整块。
关于基质的形式，在一个实施方式中，它是多孔、整块的形式，其可以用无机材料如二氧化硅或有机材料如聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯纤维、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯醚和聚碳酸酯制备得到。对于整块基质而言，其可以通过多聚化或包被基层形成。
在替代的实施方式中，基质是多孔性或非孔性的珠状或粒状。粒状可以是球形的或非球形的并可以是磁性的或非磁性的。珠状或粒状的基质可以用作填充床或是悬浮形式。悬浮形式包括已知的膨胀床和纯悬浮液，其中颗粒或珠以游离形式去除。对于整块基质，填充床和膨胀床，通常按照常规浓度梯度层析方法分离。对于纯悬浮形式，采用分批模式。而且可以使用表面、片状、毛细管状、或滤膜状的固相支持物。
基质也可以是位于盒里的膜的形式。膜可以是平铺、螺旋或中空纤维形式。
在另一实施方式中，本发明的配体结合到可溶支持物上，如可溶的多聚物或水溶性多聚物。可溶性支持物的例子包括但不限于，生物多聚物如蛋白或核酸。在一些实施方式中，生物素可用作可溶性多聚物，如公开号为20080108053的美国专利出版物中所描述的。例如，生物素可以结合到配体上，如本发明的基于SpA的配体，其后与配体结合以用于分离目的蛋白，如抗体或其片段，如存在于粗混合物中的，然后目的蛋白通过生物素-配体-蛋白多聚物复合物的沉淀、以可逆或不可逆的形式分开并分离出来。多聚物也可以是合成的可溶性多聚物，例如，包括但不限于，含有负电荷基团(羧基或磺酸基)、正电荷基团(季胺、叔胺、仲胺、伯胺基团)的多聚物、疏水基团(苯基或丁基基团)、亲水基团(羟基或氨基基团)或上述基团的组合。合成可溶性多聚物的例子参见公开号为WO2008091740的PCT专利和公开号为US20080255027的US专利，通过引用的方式将其全部内容并入本申请。这些多聚物，在一种或多种条件下，如pH、导电性或温度，通过特定的物理变化可用于通过共沉淀、以可逆或不可逆的形式纯化目的蛋白。合成的可溶性多聚物可单独使用或与本发明的配体联合使用，用于通过共沉淀、以可逆或不可逆的形式捕获/纯化目的蛋白，如抗体或其片段。
在一些实施方式中，配体连接到多孔板形式的膜上。在另一实施方式中，配体组合到毛细管或微流体装置上。
IV、配体连接到支持物的方法
可使用任何适宜的方法将本发明的配体连接到支持物上，如本领域熟知的以及本发明描述的固相支持物。例如，在一些实施方式中，配体通过常规偶联技术、利用如配体上的氨基和/或羧基连接到支持物上。例如，双环氧化合物，环氧氯丙烷，CNBr，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等是熟知的偶联剂。在一些实施方式中，支持物与配体之间引入一间隔(spacer)，其能增进配体的可及性，并利于配体与支持物的化学偶联。
本发明涵盖的各种实施方式中，配体上多于一个位点连接到固相支持物上(即多点连接)，从到使得亲和层析基质经过长时间苛性处理后，配体的降低的片段化(对于游离配体和结合配体都如此)。
基于SpA的层析配体与固相支持物的连接可以通过已知的、多种不同的方法来实现，其中多数是本领域熟知的，以及本发明所描述的。参见，如Hermanson et al.，Immobilized Affinity Ligand Techniques，Academic Press，pp.51-136(1992)。
例如，蛋白配体可通过位于固相支持物表面或蛋白配体上的活性基团偶联到固相支持物上，例如羟基、硫醇、环氧、氨基、羰基或羧酸基团。可以通过已知的化学方法进行连接，包括但不限于，使用溴化氰(CNBr)、N-羟基丁二酯、环氧树脂(双环氧乙烷)活化及还原氨化。
例如，硫醇介导的蛋白偶联已经有文献报道。参见，如Ljungquist，et al.，Eur.J.Biochem.Vol 186，pp.558-561(1989)。该技术先前已经用于将SpA偶联到固相支持物上。既然野生型SpA不含有硫醇基团，可通过重组技术在SpA的C末端插入含有硫醇的Cys，从而实现连接。参见US6399750。通过这种机制已经生产了几种商业化的产品，如MabSelectTM、MabSelectTMXtra和MabSelectTM SuRe、MabSelectTM SuRe LX。据报道末端Cys仅与固相表面的环氧基团反应，因此SpA通过单个位点连接到固相支持物上。参见，如，Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry，CRCPress，2006，page 473。
在本发明的一些实施方式中，基于SpA的层析配体上多于一个位点连接到固相支持物上，通过任意的、多点连接方式。一般来讲，SpA含有丰富的游离氨基，因为其每个结构域存在大量赖氨酸。SpA结构域与固相支持物通过多点连接方式结合，如具有环氧或醛基的层析树脂，可以分别通过环氧开环或还原氨基、使SpA上赖氨酸的氨基基团反应来实现。在特定实施方式中，多点连接可通过SpA上天然存在的、具有游离的羟基基团的氨基酸，例如丝氨酸和酪氨酸，与含有环氧基团的支持物通过开环反应来实现。或者，多点连接可以通过下列方式实现：例如，通过SpA上天然存在的、具有游离的羧基基团的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸，与含有氨基基团的支持物通过例如N，N’-羰基二咪唑来实现。配体与支持物的多点连接也可以通过上述方式的组合来实现。
基于SpA的层析配体也可以通过关联机制连接到固相支持物上。例如，关联基团通过离子反应、疏水反应或其组合与目标配体发生非共价反应，从而将目标配体结合到固相表面。这有利于配体与固相基质的高效偶联，例如US7833723和US7846682中所描述的(在此通过引用将其所有内容全部并入本申请)，导致配体密度比没有关联基团的要高。适用于本发明的关联基团包括带电荷类的，如离子类；以及不带电荷类的，如疏水类。关联基团可以修饰固相支持物，例如通过与固相支持物直接进行共价连接。适于离子类的例子包括季胺、叔胺、仲胺、伯胺、磺酸基团、羧酸或其组合。适于疏水类的例子包括苯基、丁基、丙基或其组合。推测混合种类也可以使用。关联基团也可以与配体蛋白反应。因此关联基团与配体蛋白之间的相互作用可以由反应的混合物组成，如离子和疏水类。
关联基团可以通过固相支持物的功能基团与关联基团的功能基团之间的反应从而共价偶联到固相支持物上。适宜的功能基团包括但不限于氨基、羟基、巯基、羧基、亚胺、醛、酮、烯烃、炔、含氮基团、腈、环氧基、氰和活化的羧基基团。例如，琼脂糖珠含有羟基基团，其能与具有正电荷关联基团如缩水甘油三甲基氯化铵的环氧功能团反应。本领域技术人员能够预期，如果使用至少一种生物功能关联基团，多种关联基团可以偶联到固相支持物上。因此关联基团先后偶联到固相支持物上或单独直接偶联到固相支持物上。
在一些实施方式中，本发明提供了可通过中间接头偶联到固相支持物上的关联基团和/或蛋白配体。接头可包含至少一个偶联到连接部分的功能基团。连接部分可包含能偶联到功能基团上的任何分子。例如，连接部分可包括烷基、烯基或炔基中的任意一种。连接部分可包含长度为1-30个碳原子的碳链。在一些实施方式中，接头可由多于30个碳原子组成。连接部分可包含至少一个异类原子，如氮、氧或硫。连接部分可由分枝链、不分枝链或环形链组成。连接部分可被两个或更多个功能基团取代。
本领域技术人员完全有能力选择合适的缓冲条件以将配体蛋白偶联到固相支持物上。适宜的缓冲液包括：如醋酸钠、磷酸钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、氯化钠、氯化钾、硫酸钠等，或上述的任意组合，浓度范围为10mM-5M。在一些实施方式中，盐浓度范围是0.1M-1.5M。
其它适宜的缓冲液包括任何不含氨的缓冲液，如碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、磷酸盐和醋酸盐或上述的组合。当使用关联化学时，缓冲液的盐浓度依赖于使用的关联基团。例如，盐浓度范围可以是5nM-100mM。当使用带电荷类时，盐浓度为至少5nM但少于0.1M，至少5nM但少于0.01M，至少5nM但少于0.001M。在特定实施方式中，盐浓度为0.01M。当使用疏水类时，通常使用高盐浓度。因此，盐浓度可高于0.001M，高于0.01M，或高于0.1M。
在一些实施方式中，当使用关联化学时，反应在0℃-99℃的温度范围进行。在特定实施方式中，反应在低于60℃、低于40℃、低于20℃或低于10℃的温度下进行。本发明所述方法的一些实施方式在大约4℃的温度下进行。本发明所述方法的其它实施方式在20℃的温度下进行。
V、配体片段的降低的片段化分析
本发明提供了结合SpA配体的亲和层析基质，该配体基于一个或多个B、Z或C结构域，其中一个或多个结构域包含从N末端第1位或第2位起始的、3个或4个或5个连续氨基酸的缺失。在一些实施方式中，基于SpA的配体上多于一个位点连接到层析基质。
本发明基于预料不到的和令人惊奇的发现，即本发明所述的配体，游离形式以及固定到固相支持物上(如层析基质)时均表现出在纯化使用过程中经过长时间苛性处理后的降低的片段化。如上述所讨论的，这样的片段化不希望存在，因为其能导致无法区分SpA结构域的潜在免疫原性片段与潜在治疗性靶分子。进一步，该片段化使纯化过程更加昂贵，因为在纯化过程中需要使用更多配体。
亲和配体的片段化通过本领域已经公知的和本发明描述的方法能够方便的进行检测。这些方法包括但不限于SDS-PAGE和SEC。
十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)经常用于蛋白分子量分析。SDS是解聚和展开蛋白的洗涤剂。SDS结合到多肽上，以形成具有完全恒定的电荷与分子量比的复合物，因此在凝胶上的电泳迁移速度仅由复合物的大小来决定。分子量通过同时泳动的、已知分子量的标记蛋白来确定。凝胶经常规染色，可以观察到存在的不同分子量的生物分子。
尺寸排阻层析(SEC)是将溶液中的分子按照尺寸大小分开的方法。其通常用于大的或者巨大的分子复合物，如蛋白和工业化多聚物。通常通过UV-Vis或通过光散射检测不同分子量类别。对于UV-Vis而言，选择用于检测特定类别的特定波长。层析柱上观察到的特定分子量类别的洗脱顺序，以及对应峰值的强度，提供了类型以及相对量的信息。
如本发明中实施例所证实的那样，本发明的SpA配体经过苛性条件下处理后，相对于它们的野生型对应物而言，表现出降低的片段化。在显示降低的片段化的示例性试验中，本发明描述的具有N末端缺失的SpA配体与其野生型对应物都经0.5M NaOH处理25小时。然后溶液用酸中和至pH7。中和的溶液注射入SEC或装载到SDS-PAGE胶进行分析和比较。
在另一个显示降低的片段化的示范性实验中，包含连接至固体支持物(通过多点连接固定)上的具有N末端缺失的配体的亲和层析基质，如这里描述的，以及包含连接至固体支持物(通过多点连接固定)上的其野生型对应物的亲和层析基质，均暴露到0.5M NaOH中25小时。苛性溶液和基质(如，以树脂的形式)被分开，并且立即用酸中和至pH7.0。中和后的溶液注射到SEC或者加到SDS-PAGE凝胶用于分析和对比。
VI、配体的碱性稳定性分析
本发明描述的配体除了纯化使用过程中表现出降低的片段化以外，其也是碱性条件下稳定的。产生了结合本发明所描述的基于SpA的配体的层析基质以后，含有所述配体的基质的碱性稳定性可通过本领域标准技术及本发明描述的方法进行检测。
例如，固定到基质上的配体的碱性稳定性可通过用浓度约为0.5MNaOH常规处理进行检测，如本发明及公开号为20100221844的美国专利中所描述的，通过引用的方式将其全部内容并入本申请。
在一些实施方式中，碱性条件下稳定的SpA分子以及结合该分子的基质表现出“增加的”或“改进的”碱性稳定性，意味着分子及整合该分子的基质在碱性条件下经过长时间处理相对于它们的野生型对应物是稳定的。之前已经报道了整合基于SpA的野生型B、C或Z结构域的SpA配体或整合具有一个或多个Asp突变的SpA配体的层析基质在pH高于约10如高于约13-14的条件下，具有改进的碱性稳定性。然而，许多配体使用过程中，尤其是经过反复的CIP循环后，显示出降低的片段化，这通过SDS-PAGE胶上存在的片段或通过SEC能观察到。
在一些实施方式中，本发明的配体以及结合该配体的基质在碱性条件下并不比他们的野生型对应物更稳定，然而，它们表现出降低的片段化。本发明描述的一种此类配体是C结构域配体的五聚体形式，其每个结构域均包含N末端缺失，并且每个结构域均包含G29K突变。此类配体可进一步包含Ala作为五聚体的第一位氨基酸，以利于翻译后的均一加工。
本发明基于令人惊奇的和预料不到的新SpA配体的发现(游离形式以及固定到层析基质上)，其在纯化使用过程中除了经过长时间苛性条件下处理(如0.1M NaOH处理25小时或更长)保留至少95％的初始结合能力外，还相对于之前描述的许多配体表现出降低的片段化。在一些实施方式中，配体上多于一个位点结合到固相支持物，这些配体是基于SpA的B、C或Z结构域，其中配体具有从N末端第1位或第2位起始的3、4或5个连续氨基酸的缺失。
在一些实施方式中，经过100个循环后，每个循环包括用0.5M NaOH处理15分钟，本发明描述的SpA配体(即包括一个或多个B、C或Z结构域，或者它们的任意组合，其中至少一个B、C或Z结构域包含N末端至少3个连续氨基酸的缺失)保留的结合能力百分数至少是其野生型对应物的1.25倍多、1.5倍多、2倍多、2.5倍多或3倍多。
在一个实施方式中，固定化配体的碱性稳定性通过随着时间延长IgG结合能力的保留进行分析，测量方法如下：结合能力，称作Qd50％，通过基于初始IgG浓度的50％在UV280nm的吸收值得到装载体积的IgG浓度进行测量。首先测量层析基质(如装载到柱上的树脂)的初始Qd50％。然后层析基质(如装载到柱上的树脂)用0.5M NaOH、以0.8mL/分钟处理15分钟，进行约10个循环。再次测量Qd50％。重复该过程直至层析基质用0.5MNaOH处理约100个循环。最后一次测量Qd50％，来自包含本发明所描述的配体的亲和层析基质(即固定有配体的层析树脂)的结果与野生型SpA结构域的各类型比较。
在另一试验中，基质的苛性或碱性稳定性通过基质的静止吸收测量。将一定量的亲和层析基质(如树脂形式)在0.1M NaOH、0.3M NaOH或0.5MNaOH中轻轻旋转吸收25小时，测定吸收前和吸收NaOH后的IgG结合能力，就可以确定通过基质对IgG结合能力的保留体现的碱性稳定性。
VII、用本发明的层析基质纯化靶分子的方法
在一些实施方式中，本发明提供了使用本发明描述的亲和层析基质从混合物中纯化靶分子的方法。靶分子可以是被本发明提供的亲和配体识别的任意分子，其中配体偶联到固相支持物上(即层析基质)。靶分子的例子包括免疫球蛋白和含Fc的蛋白。免疫球蛋白可以是多克隆抗体或单克隆抗体或其功能片段。功能片段包含包括免疫球蛋白可变区的任意片段，其能特异性结合抗原，同时保留其特异性结合偶联到固相支持物的蛋白配体的能力。
在一些实施方式中，使用本发明描述的亲和层析基质分离目的靶分子的方法包括如下步骤：(a)将包含固定化的、具有选自由SEQ ID NO：13-42、SEQ ID NO：55-84和SEQ ID NO：93-95组成的组的氨基酸序列的、基于SpA的层析配体的固相支持物与包括靶分子的混合物在使靶分子特异性结合到配体上的条件下接触；和(b)改变条件使靶分子不再与配体结合，从而分离靶分子。
在一些实施方式中，改变步骤包括改变pH，以使靶分子不再与配体结合。在特定实施方式中，pH以一定方式改变以使比步骤(a)的pH条件酸性更强。例如，在一个实施方式中，步骤(a)在中性pH或约6-约8的pH范围进行；步骤(b)在酸性pH如约1-约5的pH范围进行。
在另一实施方式中，步骤(b)包含在使用过程中改变缓冲液的盐浓度，以使靶分子不再与配体结合。例如，在一个实施方式中，步骤(a)可使用高盐浓度如＞0.1M，步骤(b)可使用低盐浓度如＜0.1M。反过来，在一些实施方式中，步骤(a)可使用低盐浓度如＜0.1M，步骤(b)可使用高盐浓度。在另一实施方式中，缓冲液的pH和盐浓度都可以在步骤(a)和步骤(b)之间改变。
本领域技术人员容易确定靶分子与配体结合的适宜条件，因此能改变条件以中断靶分子配体的结合。
总体而言，推测本发明描述的配体可在常规使用天然状态的SpA和重组SpA的任何纯化过程或纯化过程链中使用。换句话说，希望用本发明描述的配体替代本领域现在使用的天然状态的SpA(如从金黄色葡萄球菌中分离的)和重组SpA(如重组表达的wt SpA)，以降低总体成本并减少潜在的免疫原性SpA片段与潜在的治疗性分子共纯化的风险。
在一些实施方式中，本发明涉及亲和层析纯化抗体的方法，所述方法包括下列步骤：过程进料与本发明的亲和层析基质接触，以结合进料中的一个或多个抗体；任选洗涤步骤；加入适宜的洗脱缓冲液以使结合的抗体从基质上释放出来；从洗脱液中回收一个或多个抗体。本发明描述的亲和层析基质也可以用于从培养液、上清以及发酵液中分离抗体。对于发酵液，使用亲和层析基质能够从宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、病毒、内毒素、营养液、细胞培养液的一种或多种成分如消泡剂和抗体以及产品相关的杂质如非折叠蛋白和聚合物中分离抗体。
在特定实施方式中，进料与本发明的亲和层析基质接触之前进行机械过滤，因此流动相是澄清的细胞培养液。适于吸收的条件是本领域技术人员熟知的。
在另一实施方式中，本发明涉及多步骤纯化抗体，其中包含在一个或多个快速纯化和/或精制抗体的连续步骤之后，用本发明的亲和层析基质进行捕获的步骤。在特定实施方式中，捕获步骤之后是疏水相互作用和/或离子交换层析和/或弱分离层析，以结合-洗脱或穿流的方式。在替代步骤中，捕获步骤之后是多模式阴离子或阳离子交换层析和/或弱分离层析，以结合-洗脱或穿流的方式。
在另一实施方式中，任何来自亲和层析基质的、过滤的、基于SpA的配体可以通过后续纯化步骤去除至可接受的水平，如降至对于天然A蛋白配体可以接受的水平。
总体而言，推测本发明的配体可以在通常利用A蛋白配体的任何过程中使用。
本发明进一步阐述了下面的实施例，这些实施例不应视为对本发明的限定。本申请通篇引用的所有参考文献、专利、公开的专利申请以及附图的全部内容均通过引用的方式并入本申请。
实施例
实施例1：制备具有一个或多个结构域、在N末端有4个连续氨基酸缺失的SpA配体
编码下列蛋白的合成基因从DNA2.0(Menlo Park，CA)获得。含有两个Z结构域的SpA二聚化蛋白，每个结构域在第29位含有一突变(A29K)以降低或消除与Fab的结合(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：85中)；含有两个Z结构域的SpA二聚化蛋白，每个结构域在第29位含有一突变(A29K)和第二个Z结构域含有N末端有4个连续氨基酸的缺失(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：78中)；
每个合成基因的5’末端包括一起始甲硫氨酸密码子，并且3’末端包括6个组氨酸密码子(SEQ ID NO：86)便于后续使用NiNTA柱进行纯化。每个基因的5’和3’末端分别含有Nde I和BamH I限制酶切位点。这些合成基因以及使用的表达载体即pET11a(EMD)，用Nde I和BamH I(NEWENGLAND BIOLABS，Ipswich，MA)消化，DNA片段进行0.7％的琼脂糖TAE凝胶电泳，切割合适的DNA片段并用QIAGEN的凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)纯化。纯化的片段用T4 DNA连接酶(NEW ENGLANDBIOLABS，Ipswich，MA)连入pET11a质粒或其它适宜的表达载体。
连接反应产物按照制造商的说明转化入大肠杆菌DH5a感受态(INVITROGEN，Carlsbad，CA)，涂布含有100μtg/ml氨苄青霉素的TechnovaLB平板，37℃培养过夜。为了得到纯化的DNA，挑取单克隆并在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中培养过夜。用QIAGEN(Valencia，CA)的快速小量制备试剂盒纯化DNA。重组质粒的鉴定使用Nde I和BamH I(NEWENGLAND BIOLABS，Ipswich，MA)进行限制性消化分析确认。图2显示了包括Z结构域二聚体构建物两个插入基因的质粒图谱。
此外，制备了表达含有5个Z结构域、每个结构域含有A29K突变的五聚体形式的SpA配体(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：91中)的构建物，以及含有5个Z结构域、每个结构域含有A29K突变并且除第一结构域外均含有N末端4个连续氨基酸缺失(的五聚体形式的SpA配体氨基酸序列显示于SEQ ID NO：84中)的构建物。
进一步，也制备了含有C结构域的二聚化SpA配体的构建物。制备了表达C结构域配体的二聚化构建物，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：92中；并且制备了表达2个C结构域配体的二聚化构建物，其中只有第二个C结构域在N末端4个连续氨基酸缺失，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：35中。这些C结构域二聚化配体在第29位无突变。
实施例2：基于SpA的配体的表达和纯化
如上面所讨论的，任何适宜的细菌表达系统都可用于表达本发明描述的各种SpA配体。例如，所述蛋白可使用pET载体如pET11a(EMD)、在大肠杆菌菌株如BL21(DE3)(PROMEGA，Madison WI)中表达。
从平板挑取单克隆并在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中在37℃培养过夜。过夜培养物进行100倍稀释接入新鲜的、含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，培养至600nm的光学密度约为0.8的细胞密度。加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，继续培养两小时。表达通过SDS-PAGE分析和免疫印迹确认。
离心(4000rpm，4℃，5分钟)收集细胞，重悬于含有20mM咪唑的3mL磷酸盐缓冲液中。超声裂解细胞，细胞碎片通过离心(4000rpm，4℃，30分钟)沉淀。使用Ni-NTA树脂(QIAGEN)纯化SpA配体，每3mL的柱处理25-30ml细胞裂解液。柱用含有20mM咪唑的30mL磷酸盐缓冲液洗涤两次，SpA用含有200mM咪唑的3mL磷酸盐缓冲液洗脱。SpA用18mega-Ohm
Figure BSA00000758692300351
水(MILLIPORE，Billerica，MA)、然后用10mM NaHCO3透析过夜。蛋白浓度通过基于理论消光系数(Pace et al.，Protein science4：2411(1995))的紫外分光光度计测定。
实施例3：基于SpA的配体与固相支持物的结合
按照实施例1和2的描述制备表达不同的配体之后，它们通过多点结合的方式固定到固相支持物上。
在示例性试验中，琼脂糖树脂(Sepharose 4B)(GE HEALTH CARE)按照之前描述的方法(Porath and Fornstedt，J.Chromatography，51：479(1979))使用环氧氯丙烷进行交联。接下来琼脂糖树脂与带正电荷的关联基团如阳离子按照下列方法进行反应：向10ml树脂中加入：5mL75％(wt)的缩水甘油三甲基氯化铵(GTMAC)、5mL
Figure BSA00000758692300361
水(MILLIPORE，Billerica，MA)和0.258克50％(wt)氢氧化钠。反应瓶于室温在Techne HB-1D杂交仪(BIBBY SCIENTIFIC，Burlington，NJ)上旋转过夜。然后过滤树脂，以10mL体积的
Figure BSA00000758692300362
水(MILLIPORE，Billerica，MA)洗涤三次。
树脂(10mL，滤饼)加入到含有3mL4.6M NaOH的杯中。混合物匀浆，然后加入4mL丁二醇二环氧甘油醚(BUDGE)。混合物于35℃旋转大约2小时。然后树脂用5×10mL的
Figure BSA00000758692300363
水(MILLIPORE，Billerica，MA)洗涤，并用2×10mL的10mM NaHCO3平衡。
紧跟于上述BUDGE活化步骤之后，向5mL过滤的珠饼中加入10ml10mM的NaHCO3溶液，该溶液含有2.5和2.3mg/mL浓度的含A29K突变的二聚化Z结构域配体(SEQ ID NO：85)或在第二个Z结构域含有N末端缺失的二聚化Z结构域配体(SEQ ID NO：78)。混合物置于玻璃瓶中，盖上盖，然后玻璃瓶在37℃旋转大约2小时。两小时后，树脂用10mL的水洗涤三次。过滤珠饼(10mL)加入到由1mL硫代甘油和9mL缓冲液组成的10mL溶液中，缓冲液含有0.2M NaHCO3和0.5M NaCl。混合物匀浆并在室温旋转过夜。然后将树脂用10mL的下列缓冲液洗涤3次：含有0.15M NaCl(pH8)和50mM醋酸(pH4.5)的0.1M Tris缓冲液。然后用10mL的
Figure BSA00000758692300365
水和10mL20％乙醇水溶液(v/v)洗涤树脂。终产物树脂使用前储存于20％乙醇水溶液(v/v)中。将二聚化C结构域配体偶联到固相支持物的方法与此处描述的二聚化Z结构域配体相类似。
将上述描述的5结构域配体(SEQ ID NO：91和84)偶联到琼脂糖树脂的方法除在偶联步骤中使用15mg/mL的配体以外，与上述过程类似。Z结构域五聚体不含有His-6标签。
实施例4：游离或固定化配体经苛性浸泡后收集上清进行SDS-PAGE分析
SDS-PAGE分析能够用于检测本发明所描述的游离或固定化配体经过长时间苛性浸泡后的片段化。SDS-PAGE方法描述如下。
Figure BSA00000758692300366
水中的SpA、中和后的苛性处理的配体溶液与中和的树脂溶液(每种含有约0.5mg/mL的蛋白)用Laemmli缓冲液(BIORAD，Hercules，CA)按照1∶1的比例进行稀释。样品于70℃孵育5分钟以确保蛋白充分变性。10μl每个样品加入到AnyKD胶(BIORAD，Hercules，CA)或15％的Tris-HCl Ready胶(BIORAD，Hercules，CA)。凝胶电泳在1×Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液中进行，200伏30分钟。然后SDS胶在Gelcode Blue染色剂(THERMOFISHER，Waltham，MA)中染色1小时，在
Figure BSA00000758692300371
水中脱色过夜。
实施例5：游离或固定化配体经苛性浸泡后收集上清进行SEC分析
除了上述SDS-PAGE分析以外，SEC(尺寸排阻层析)也能用于分析游离或固定化配体经过长时间苛性浸泡后的片段化。SEC试验描述如下。
SEC在Agilent 1100 HPLC系统(AGILENT，Santa Clara，CA)中进行。进行SEC-HPLC分析之前，水中的SpA对照、中和后的苛性浸泡的配体溶液(约0.5mg/mL)和中和的树脂溶液在13500RPM离心10分钟。20μl样品注入SEC柱(SEPAX Zenix 7.8mm X 300mm，SEPAXTECHNOLOGIES，INC.Newak，Delaware)。磷酸钠缓冲液(200mM，pH7.0)用作流动相，流速为1mL/分钟。来自Agilent的ChemStation软件用于获取和分析230nm及280nm的SEC数据。
实施例6：配体的苛性浸泡
配体按照实施例2描述的方法表达之后，所述配体进行碱性条件处理。
向1mL上述每种配体中(浓度为1mg/mL)，加入1mL的1M NaOH至终浓度为0.5M NaOH和0.5mg/mL配体。样品轻轻旋转25小时。然后溶液用32μL冰乙酸中和至pH约等于7。
图3显示了Z结构域和C结构域二聚化配体经过和不经过苛性浸泡后，通过SDS-PAGE进行的片段化分析。由图3可以看出，二聚化Z结构域配体(A29K无缺失，序列显示于SEQ ID NO：85，用作对照)在0.5M NaOH中苛性浸泡25小时后，表现出显著的片段化，其通过存在弥散以及存在7KDa左右的小片段(见泳道3)能够证明。相比之下，具有A29K突变以及在第二结构域缺失4个连续氨基酸的二聚化Z结构域配体(氨基酸序列为SEQ ID NO：78)在0.5M NaOH中苛性浸泡25小时后，大部分是完整的(见泳道6)。
相似的，不含突变的二聚化C结构域配体(氨基酸序列显示于SEQ IDNO：92，用作对照)在0.5M NaOH中苛性浸泡25小时后(见泳道9)，与氨基酸序列显示于SEQ ID NO：35的、第二结构域N末端缺失4个连续氨基酸的二聚化C结构域构建体相比(见泳道12)，在SDS-PAGE上表现出存在弥散以及存在7KDa左右的小片段。
此外，每个二聚化Z和C结构域配体均包括His-6标签。不经过苛性浸泡的配体显示于泳道2(二聚化Z结构域对照)、泳道5(具有N末端缺失的二聚化Z结构域配体)、泳道8(二聚化C结构域对照)、和泳道9(具有N末端缺失的二聚化C结构域配体)。
进一步通过SEC证明N末端缺失的二聚化Z和C结构域配体经苛性浸泡后的降低的片段化。图4以SEC色谱的形式显示了代表性的SEC试验的结果。由图4可以看出，Z结构域配体对照(具有SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列)与C结构域配体(具有SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列)表现出显著的片段化，这通过图4中色谱图上的箭头可以确定。相比之下，在第二结构域具有N末端缺失的二聚化Z和C结构域配体(Z结构域配体的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：78，C结构域配体的氨基酸序列显示于SEQID NO：35)表现出降低的片段化，这通过图4中色谱图上的方框可以确定。
此外，上述五聚体形式的Z结构域配体(即代表对照、具有SEQ IDNO：91所示氨基酸序列的五聚化Z结构域配体，和具有SEQ ID NO：84所示氨基酸序列的五聚化Z结构域配体，其代表除第一结构域外的其它结构域均含有N末端4个连续氨基酸缺失的五聚体)在0.5M NaOH中苛性浸泡25小时后，也通过SDS-PAGE进行片段化分析。
由图5的SDS-PAGE胶显示的数据可以看出，除第一结构域外的其它结构域均具有N末端4个连续氨基酸缺失的五聚化Z结构域配体(其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：84)在0.5M NaOH中处理25小时后，表现出的片段化(见泳道3)与氨基酸序列如SEQ ID NO：91所示的五聚化Z结构域配体对照(见泳道6)相比显著降低。如上述所讨论的，两种形式的五聚体均具有A29K突变。不经过浸泡的配体是完整的(泳道2和5)。
泳道8-10描述了纯化过程中常规使用的、重组SpA(rSPA)配体的片段化。rSpA配体经0.5M NaOH苛性浸泡25小时后，显示出甚至比Z结构域对照更高程度的片段化，这通过该蛋白在SDS-PAGE胶上近乎消失可以观察到(见泳道9)。不经过苛性条件下处理的rSPA配体显示于泳道8。
该结果提示本发明描述的具有N末端缺失的、基于Z结构域的配体远优于常规使用的SpA配体如rSPA。
具有N末端缺失的五聚化Z结构域配体在0.5M NaOH中苛性浸泡25小时后的降低的片段化进一步通过SEC进行确认，一个代表性试验的结果显示于图6中。
图6中的色谱表明，无氨基酸缺失的五聚体形式的Z结构域对照(SEQID NO：91)在较低分子量显示出清晰的可分辨峰，表明存在较小片段。相比之下，具有N末端缺失的五聚体形式的Z结构域(SEQ ID NO：84)与对照相比，显示出大大减少、程度更低的可分辨峰，代表更低程度的片段化。
常规使用的SpA配体，rSPA，显示出最强的片段化或断裂，根本没有完整分子保留下来。值得注意的是，SEC色谱结果与图5的SDS-PAGE分析结果一致，进一步证实rSPA配体经过长时间苛性条件下处理(如在0.5MNaOH中处理25小时)后片段化严重以至于在SEC色谱上看不到明显的片段。
实施例7：固定到树脂上的配体的碱性处理
前面实施例描述的各种配体结合到固相支持物(如琼脂糖层析树脂)，经过苛性条件下处理后评价其片段化。
对于每种使用的树脂而言，5mL一次性层析柱(EVERGREENSCIENTIFIC，Los Angeles，CA)中的1mL树脂用
Figure BSA00000758692300391
水测量。树脂在柱中使用，2CV(2mL)0.5M NaOH快速平衡，重悬并抽真空。重复用NaOH处理一次后，真空状态的树脂湿饼移入4mL测试管(THERMOFISHER，Waltham，MA)。将2mL0.5M NaOH加入柱中(底部有盖)，迅速移入具有相应树脂的测试管中。将盖住的测试管置于旋转仪并使测试管旋转25小时。碱性处理结束后，测试管中的物体倒入一次性柱中，收集滤液。将1.5mL滤液用50μl冰冷的酸中和，可用于进一步的SEC和SDS-PAGE分析。
固定化的二聚化Z和C结构域配体经过长时间苛性浸泡(如在0.5MNaOH中处理25小时)后的SDS-PAGE分析显示于图3中。总体而言，可以预期：如果配体固定到层析基质(如琼脂糖树脂)后在碱性条件下是稳定的，其不会显示出任何显著的片段化。
由图3的SDS-PAGE胶可以观察到，二聚化Z和C结构域配体固定化对照(氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：85和92，SDS-PAGE胶分别对应于泳道4和10)以及在第二结构域含有N末端缺失的、二聚化Z和C结构域固定化配体(氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：78和35，SDS-PAGE胶分别对应于泳道7和13)经过0.5M NaOH浸泡处理25小时后，都不显示任何可以检测的片段化，说明两者在碱性条件下都是稳定的。
固定化的五聚化Z结构域配体经过长时间苛性浸泡(如在0.5M NaOH中处理25小时)后的SDS-PAGE分析显示于图5中。由图5的SDS-PAGE胶可以观察到，除第一结构域外的其它结构域均含有N末端缺失的五聚化Z结构域配体(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：84，SDS-PAGE胶对应于泳道4)与其野生型五聚化Z结构域对照(SEQ ID NO：91和泳道7)相比，表现出的片段化大大降低。该结果说明：具有N末端缺失的固定化五聚化Z结构域配体比不含该突变的固定化五聚化Z结构域配体在苛性条件下更稳定。
进一步，常规使用的SpA配体(即rSPA)固定到琼脂糖层析树脂后，带有配体的树脂用0.5M NaOH处理25小时，片段化情况也通过SDS-PAGE进行了研究。由图5的SDS-PAGE的泳道10可以看出，固定化的rSPA经0.5M NaOH处理25小时后，显示出明显的片段化，表明其与五聚化Z结构域配体(泳道4和7)相比在苛性条件下不是很稳定。
基于图5的SDS-PAGE胶结果，结论如下：具有N末端缺失的固定化五聚化Z结构域配体经过长时间苛性处理后片段化最少，因此，与固定化五聚化Z结构域对照配体和固定化rSPA相比，其在苛性条件下最稳定。
固定化的五聚化Z结构域配体和rSPA配体的SDS-PAGE结果进一步通过SEC分析得到确认。代表性试验的结果以色谱图显示于图7中。由图7可以看出，SEQ ID NO：84的固定化Z结构域配体与SEQ ID NO：91所示的其野生型对应物相比，经过长时间苛性浸泡后表现出片段化，以方框表示，在色谱图上显示为可分辨的低分子量峰。进一步，与预期一致，固定化rSPA经过长时间苛性浸泡后表现出广泛片段化，这通过色谱图上广泛的、不可分辨的峰可以观察到。
实施例8：色谱基质经0.5M NaOH处理25小时之前和之后与免疫球蛋白静态结合能力的测量
上述亲和层析基质(即具有通过多点结合其上的固定化配体的树脂)经0.5M NaOH处理25小时之间和之后，进一步测试其静态结合能力。
在一个实施方式中，固定有上述的二聚化或五聚化Z或C结构域配体的每种层析基质(1mL体积)，经过0.1、0.3或0.5M NaOH处理25小时或不经过处理，在
Figure BSA00000758692300411
水(MILLIPORE，Billerica，MA)中制成10％的浆液。1mL每种浆液加入到以10mM的磷酸盐缓冲液配制，的15mL多克隆IgG(SERACARE，1mg/ml)中，室温旋转4小时。用280nm的紫外吸收测量苛性处理之前和之后的结合能力。保留IgG的结合能力百分比通过苛性处理后IgG的结合能力除以不经苛性处理的结合能力进行计算。表II概括了一个此类试验的结果。如表II中所概括的，SEQ ID NO：78所示的二聚化Z结构域配体与其野生型对应物相比(即SEQ ID NO：85所示的二聚化Z结构域配体)相比，经过0.5M NaOH苛性浸泡25小时后，显示出保留了更高的结合能力。
相似的，下面的表II还概括了SEQ ID NO：35所示的二聚化C结构域配体与SEQ ID NO：92所示的其野生型对应物相比，经过0.5M NaOH苛性浸泡25小时后，显示出保留了更高的结合能力。
表II
  固定到基质上的配体序列   基质保留的IgG静态结合能力％)
  SEQ ID NO：85   64
  SEQ ID NO：78   70
  SEQ ID NO：92   65
  SEQ ID NO：35   70
在进一步的实验中，测定了五聚化Z结构域配体经过0.1M NaOH、0.3MNaOH或0.5M NaOH处理25小时后的IgG结合能力。下面的表III概括了一个此类试验的结果。
表III显示了固定有A29K突变并且除第一结构域外的其余结构域均在N末端包括4个连续氨基酸缺失的、五聚化Z结构域配体(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：84)的基质，经过0.1M NaOH、0.3M NaOH或0.5M NaOH处理后保留IgG的结合能力百分比。如下述所概括的，具有五聚化Z结构域N末端缺失的配体基质经过0.1M NaOH处理25小时后，显示出高达95％的初始结合能力；经过0.3M NaOH处理25小时后，显示出高达85％的初始结合能力；经过0.5M NaOH处理25小时后，显示出高达65％的初始结合能力。
  NaOH浓度(M)   固定SEQ ID NO：84的基质保留的IgG静态结合能力
  0.1   95
  0.3   85
  0.5   65
实施例9：经0.5M NaOH处理之前和之后SpA对于IgG的捕获
在这个实验中，固定有除第一结构域外的其余结构域均具有4个连续氨基酸缺失的五聚化Z结构域配体的基质，与具有重组合成SpA(rSPA)的基质同时跟CHO-S流加液中的多克隆免疫球蛋白孵育，然后进行纯度检测，以表明本发明的配体以及重组SpA的杂质去除情况。
固定有rSPA(REPLIGEN，Waltham，MA)和Z结构域五聚体(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：84)的树脂样品分别装入直径为1cm和5cm层积床高度的层析柱中。用磷酸盐缓冲液(10mM磷酸钠)平衡后，层积树脂以50cm/hr的流速加入含有多克隆hIgG(SERACARE，5mg/ml)的CHO流加液。以5％的穿透容量装载达到90％后，树脂用PBS缓冲液和50mM NaOAc，pH5.5洗涤。之后结合的IgG用50mM NaOAc，pH3洗脱。收集组分并进行纯度分析。然后层积树脂用0.5M NaOH处理15分钟(流速100cm/hr)，再次与CHO流加液中的多克隆hIgG接触。然后树脂用PBS缓冲液和50mMNaOAc在pH5.5洗涤，IgG被洗脱下来用于进一步分析。
重复苛性处理和流加循环以收集足够的IgG用于后续离子交换步骤。滤取的A蛋白使用n-Protein A ELISA(REPLIGEN，Waltham，MA)、按照生产商提供的说明书进行定量。宿主细胞蛋白使用3G CHO HCP ELISA试剂盒(CYGNUS TECHNOLOGIES，Southport，NC)、按照生产商提供的说明书进行检测。DNA使用
Figure BSA00000758692300421
Reagent(LIFETECHNOLOGIES，Foster City，CA)进行检测。一个此类代表性试验的结果显示于表IV。
实施例10：通过阳离子交换和阴离子交换层析清理过滤的SpA配体并进一步移除DNA和宿主细胞蛋白
过滤配体的清理以及进一步从结合本发明的SpA配体或含有重组SpA，rSpA(REPLIGEN，Waltham，MA)配体的亲和层析基质的洗脱液中移除宿主细胞蛋白(HCP)和DNA，按如下方法检测。
按实施例8中描述的试验重复几次得到的洗脱液合并起来提供了使用阳离子交换层析进一步清除过滤配体和其它杂质的流加液。
Fractogel SO3-(MILLIPORE，Billerica，MA)装入柱床面积为1.0cm(i.d.)×7cm(床高度)的柱中。所述柱使用50mM NaOAc，pH4.5，4mS/cm平衡，将来自A蛋白洗脱液的、合并的IgG以140cm/hr装入。使用EQ缓冲液洗涤柱后，IgG用超过20倍柱体积的(线性梯度)、在50mM NaOAc溶解的0.5N NaCl洗脱下来。洗脱合并液按10ml每份收集，分析过滤配体、DNA和宿主细胞蛋白。
进一步收集来自Fractogel SO3 -柱的部分，以12mS/cm调整至pH7.6。该流加液以1mL/分钟的流速装入预平衡的(Tris，25mM，pH7.6，～1mS/cm)ChromaSorb装置(0.08mL，MILLIPORE，Billerica，MA)。每187柱体积收集成一份，进一步按照实施例8描述的方法分析过滤配体和宿主细胞蛋白。
如下面表IV所概括的，过滤的rSPA配体以及除第一结构域外的其它结构域均具有N末端4个连续氨基酸缺失的五聚化Z结构域配体(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：84)，经过阳离子交换和阴离子交换层析后能够清理至少于1PPM。此外，宿主细胞蛋白和DNA的去除符合工业标准，并且在两种情况下或多或少相等，也概括于下表中。
表IV
Figure BSA00000758692300441
实施例11：经长时间苛性浸泡后N末端氨基酸缺失的数目对于配体片段化的影响
在另一实施方式中，检测经长时间苛性浸泡后，从二聚化Z结构域配体的第二结构域N末端第1位开始分别缺失1、2、3或4个氨基酸，与二聚化Z结构域配体(A29K)相比较，缺失1、2、3或4个氨基酸对于配体片段化的影响。
一个试验结果在图8的色谱中进行了描述。图8显示了二聚化Z结构域配体的第二结构域N末端缺失的氨基酸数目对于片段化的影响，每种配体经过0.5M NaOH处理25小时的长时间苛性浸泡后，按照实施例5描述的方法进行SEC分析。
配体在0.5M NaOH浸泡25小时后，每个对照配体(SEQ ID NO：85)、第二结构域N末端仅缺失第一个氨基酸的配体(SEQ ID NO：87)、和第二结构域N末端缺失前两个氨基酸的配体(SEQ ID NO：88)显示出较低分子量片段，以箭头标出，证明存在片段化。然而，第二结构域N末端仅缺失前三个氨基酸的配体(SEQ ID NO：69)和第二结构域N末端仅缺失前4个氨基酸的配体(SEQ ID NO：78)显示低分子量的片段化显著下降，色谱图中以箭头标出，证明降低的片段化。
这些结果表明：基于A蛋白一个或多个结构域并且在一个或多个结构域的N末端缺失至少3个氨基酸的亲和配体经长时间苛性处理后，显示出降低的片段化，因此是亲和层析配体的优选。
实施例12：两者都具有non-Fab突变(G29K)的N末端缺失与野生型C结构域五聚体的保留结合能力比较
在这个试验中，测试了固定到聚乙烯醇层析基质的两种C结构域五聚体的保留结合能力，一种配体在5个结构域的每个结构域均具有N末端4个氨基酸的缺失(从第1位开始)，Ala作为五聚体序列的第一个氨基酸以利用翻译后的均一化加工，并具有G29K突变(氨基酸序列显示于SEQ IDNO：93)；另一种配体对应于具有G29K突变的其野生型对应物(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：95)。
所述配体通过多点连接固定到聚乙烯醇亲和层析树脂上(参见，如Herman et al.，Immobilized Affinity Ligand Techniques，Academic Press，pp.51-136(1992))，并测试经过重复NaOH处理后的保留的动态结合能力。
在一个试验中，层析基质装入柱中(0.66cm i.d.×1.0cm床高度)，通过标准色谱流动进行平衡，然后以60cm/hr施用30mg的多聚体人IgG(hIgG)。使用平衡缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液)充分洗去未结合蛋白，结合的IgG用洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸，pH3)以60cm/hr洗脱下来。接下来用0.7M NaOH原位清洗30分钟。再次平衡柱子，并将所述流动重复16次(总计经0.7M NaOH处理8小时)。随时间保留的结合能力通过测定IgG的洗脱总量(洗脱体积乘以UV280下测量的IgG浓度)被测量。相对于第一次流动时以NaOH处理0分钟的相对结合能力作图显示于图9。该试验重复3次得到相似的结果。如图9所示，两种C结构域五聚体，有或无缺失，经过长时间NaOH处理后，随着时间的延长显示出相似的保留结合能力。进一步，在另一实施方式中，无Ala、有G29K突变的C结构域五聚体(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：80)的保留结合能力与有G29K突变的其野生型对应物(氨基酸序列显示于SEQ ID NO：95)相比，具有相似的结果(数据未显示)。
根据说明书中以引用方式并入的参考文献的教导可以充分理解所述具体说明。说明中的实施方式为本发明的实施方式提供了解释，但不应视为对其范围的限制。本领域技术人员容易认识到多种其它实施方式也包含在本发明中。所有出版物和发明均通过引用的方式将其全部内容并入本申请。在某种程度上以引用方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致，本说明书优先于任何材料。本说明书引用的任何文献并不是认可这些文献是本发明的现有技术。
除非有特别指示，说明书以及权利要求中使用的表达成分、细胞培养液、处理条件以及其它含量的数值，应被理解为在所有情形下都可使用术语“大约”进行修饰。因此，除非有相反的指示，数量参数是近似值，并且可以随本发明力求得到的目标性能进行变化。除非有特别指示，术语“至少”在一系列因素之前应被理解为指该系列的每一个因素。本领域技术人员只要通过常规试验，即能认识到或能够确定这里所述的本发明具体实施方式的许多等同替代方式。这些等同替代方式涵盖于下述权利要求书中。
不脱离本发明的实质和范围能够作出多种修饰或变形，这对于本领域技术人员是显而易见的。本发明描述的特定实施方式仅通过实施例的方式提供，不应视为对本发明的限制。说明书和实施例只是示例，本发明的真正保护范围和实质内容通过下面的权利要求书进行显示。
Figure ISA00000758692500011
Figure ISA00000758692500021
Figure ISA00000758692500031
Figure ISA00000758692500041
Figure ISA00000758692500051
Figure ISA00000758692500081
Figure ISA00000758692500091
Figure ISA00000758692500101
Figure ISA00000758692500111
Figure ISA00000758692500131
Figure ISA00000758692500141

Claims (20)

1.包含一个或多个葡萄球菌A蛋白(SpA)C结构域的亲和层析配体，其中至少一个C结构域包含从N末端第1位或第2位起始的至少3个连续氨基酸的缺失。
2.包含一个或多个葡萄球菌A蛋白(SpA)B结构域的亲和层析配体，其中至少一个B结构域包含从N末端第1位或第2位起始的至少3个连续氨基酸的缺失。
3.包含一个或多个葡萄球菌A蛋白(SpA)Z结构域的亲和层析配体，其中至少一个Z结构域包含从N末端第1位或第2位起始的至少3个连续氨基酸的缺失。
4.权利要求1、2或3的亲和层析配体，其中所述配体经0.5M NaOH处理至少5小时后相对于野生型对应物显示出降低的片段化。
5.包含连接到固相支持物的权利要求1、2或3的亲和层析配体的亲和层析基质。
6.权利要求5的亲和层析基质，其中所述配体连接到固相支持物时，经0.5M NaOH处理5小时后相对于野生型对应物显示出降低的片段化。
7.权利要求1、2或3的亲和层析配体，其中所述配体的一个或多个结构域进一步包含第29位氨基酸的突变以减少Fab的结合。
8.权利要求7的亲和层析配体，其中所述氨基酸突变包含将甘氨酸残基或丙氨酸残基替换为赖氨酸残基。
9.权利要求5的亲和层析基质，其中亲和层析配体通过多点连接方式连接到所述固相支持物。
10.权利要求1的亲和层析配体，其中所述亲和层析配体包含2、3、4、5、6、7或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)C结构域，其中至少一个C结构域包含从第1位或第2位起始的N末端3个连续氨基酸的缺失或N末端4个连续氨基酸的缺失或N末端5个连续氨基酸的缺失。
11.权利要求3的亲和层析配体，其中所述亲和层析配体包含2、3、4、5、6、7或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)Z结构域，其中至少一个Z结构域包含从第1位或第2位起始的N末端3个连续氨基酸的缺失或N末端4个连续氨基酸的缺失或N末端5个连续氨基酸的缺失。
12.权利要求2的亲和层析配体，其中所述亲和层析配体包含2、3、4、5、6、7或更多个葡萄球菌A蛋白(SpA)B结构域，其中至少一个B结构域包含从第1位或第2位起始的N末端3个连续氨基酸的缺失或N末端4个连续氨基酸的缺失或N末端5个连续氨基酸的缺失。
13.从样品中亲和纯化一种或多种靶分子的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供包含一种或多种靶分子的样品；
(b)在使所述一种或多种靶分子结合到所述基质上的条件下将所述样品与权利要求5所述基质接触；和
(c)通过洗脱回收所述一种或多种结合的靶分子。
14.权利要求5的亲和层析基质，其中所述基质经0.5M NaOH处理5小时后保留了初始结合能力的至少95％。
15.权利要求5的亲和层析基质，其中所述基质经0.1M NaOH处理25小时后保留了初始结合能力的至少95％。
16.包含如下结构的亲和配体：
[(X)n，(Y)m]n+m，
其中X代表SpA蛋白B结构域、Z结构域或C结构域，
n代表从零至(m-1)范围的结构域数目，
Y代表N末端缺失至少3个连续氨基酸的SpA蛋白B结构域、Z结构域或C结构域，
m代表范围是1-8的Y结构域数目，所述配体通过多点连接方式连接到固相支持物。
17.包含两个或更多个SpA蛋白B结构域或两个或更多个SpA蛋白C结构域或两个或更多个SpA蛋白Z结构域或B，Z或C结构域按照任意顺序的任意组合的亲和层析配体，其中至少一个B，C或Z结构域包含从N末端第1位或第2位起始的至少3个连续氨基酸的缺失。
18.权利要求17的亲和层析配体，其中所述配体经0.5M NaOH处理5小时后，相对于无任何缺失的配体显示出降低的片段化。
19.权利要求5或9的亲和层析基质，其中所述固相支持物选自由可控多孔玻璃、二氧化硅、氧化锆、氧化钛、琼脂糖、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚苯乙烯及其衍生物组成的组。
20.碱性条件下稳定的亲和层析配体，其包含至少5个C结构域，其中每个所述结构域包含减少Fab结合的突变以及从N末端第1位开始的4个氨基酸的缺失。
CN201210273398.7A 2011-06-08 2012-06-08 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质 Active CN102895960B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610022037.3A CN105457612B (zh) 2011-06-08 2012-06-08 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161494701P 2011-06-08 2011-06-08
US61/494,701 2011-06-08

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610022037.3A Division CN105457612B (zh) 2011-06-08 2012-06-08 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102895960A true CN102895960A (zh) 2013-01-30
CN102895960B CN102895960B (zh) 2016-02-10

Family

ID=46229293

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610022037.3A Active CN105457612B (zh) 2011-06-08 2012-06-08 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质
CN201210273398.7A Active CN102895960B (zh) 2011-06-08 2012-06-08 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610022037.3A Active CN105457612B (zh) 2011-06-08 2012-06-08 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质

Country Status (13)

Country Link
US (5) US8754196B2 (zh)
EP (2) EP2532672B1 (zh)
JP (4) JP5756428B2 (zh)
KR (3) KR101464040B1 (zh)
CN (2) CN105457612B (zh)
AU (3) AU2012366229C1 (zh)
DK (2) DK2532672T3 (zh)
ES (2) ES2710204T3 (zh)
IL (2) IL229774A (zh)
RU (2) RU2595430C2 (zh)
SG (3) SG186552A1 (zh)
TW (3) TWI570134B (zh)
WO (1) WO2013109302A2 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105073769A (zh) * 2013-03-14 2015-11-18 Emd密理博公司 利用基于a蛋白的色谱增加蛋白纯度的方法
CN105518020A (zh) * 2013-09-04 2016-04-20 Emd密理博公司 清洗基于a蛋白的亲和色谱柱的方法
CN106596822A (zh) * 2016-12-16 2017-04-26 南京市产品质量监督检验院 一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法
CN107531799A (zh) * 2015-04-13 2018-01-02 富士胶片株式会社 短链肽固定化载体的制造方法及短链肽固定化载体
CN112210013A (zh) * 2019-07-03 2021-01-12 拜奥普罗塞亚科技有限责任公司 碱耐受性亲和色谱配体
WO2024045430A1 (zh) * 2022-09-01 2024-03-07 西安蓝晓科技新材料股份有限公司 一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040067532A1 (en) 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
CA3187687A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8592555B2 (en) 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
SG162687A1 (en) 2008-12-24 2010-07-29 Millipore Corp Caustic stable chromatography ligands
SG186552A1 (en) * 2011-06-08 2013-01-30 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands
US9657055B2 (en) 2011-11-30 2017-05-23 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Affinity chromatography matrix
WO2014004103A1 (en) 2012-06-29 2014-01-03 Emd Millipore Corporation Methods for inactivating viruses during a protein purification process
EP2682168A1 (en) 2012-07-02 2014-01-08 Millipore Corporation Purification of biological molecules
PL2811983T3 (pl) 2012-09-17 2019-10-31 Grace W R & Co Funkcjonalizowany, złożony z cząstek materiał nośnikowy i sposoby jego wytwarzania i zastosowania
WO2014058570A1 (en) 2012-09-17 2014-04-17 Alltech Associates, Inc. Chromatography media and devices
CN105377880B (zh) * 2013-07-10 2020-08-07 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 突变的免疫球蛋白结合多肽
ES2887110T3 (es) * 2014-01-16 2021-12-21 Grace W R & Co Medios para cromatografía de afinidad y dispositivos para cromatografía
CN107847907A (zh) 2014-05-02 2018-03-27 格雷斯公司 官能化载体材料以及制备和使用官能化载体材料的方法
EP2985076B1 (en) * 2014-08-15 2022-03-30 Merck Patent GmbH Purification of immunoglobulins from plasma
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
CN104399283B (zh) * 2014-12-04 2016-02-17 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的制备方法
CN104645949B (zh) * 2015-02-04 2017-01-25 浙江大学 一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法
EP3255058B1 (en) 2015-02-05 2021-03-24 Mitsubishi Chemical Corporation Protein having affinity to immunoglobulin, and affinity separation medium and column for liquid chromatography using same
CA2975362A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Navigo Proteins Gmbh Egfr binding proteins comprising ubiquitin muteins
GB201503578D0 (en) 2015-03-03 2015-04-15 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Sanitization method for affinity chromatography matrices
EP3276002B1 (en) * 2015-03-26 2020-04-29 JSR Corporation Immunoglobulin-binding protein and affinity carrier using same
EP3302784B1 (en) 2015-06-05 2021-10-06 W.R. Grace & Co.-Conn. Adsorbent bioprocessing clarification agents and methods of making and using the same
BR112018000477A2 (pt) * 2015-07-16 2018-09-18 Navigo Proteins Gmbh proteína de ligação de imunoglobulina não natural, composição, uso da proteína de ligação de ig não natural, método de purificação de afinidade de imunoglobulinas, método de geração de uma proteína de ligação de imunoglobulina não natural, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou um hospedeiro não humano, e método para a produção de uma proteína de ligação de imunoglobulina não natural
JP2018520675A (ja) 2015-07-20 2018-08-02 ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ ジユビキチン変異タンパク質をベースとした新規結合タンパク質及びその生成方法
GB201515339D0 (en) * 2015-08-28 2015-10-14 Ge Healthcare Bio Sciences Ab A seperation matrix and a method of seperating antibodies
US10697983B2 (en) * 2015-09-08 2020-06-30 Merck Patent Gmbh Methods of evaluating quality of media suitable for removing anti-A or anti-B antibodies
US10697982B2 (en) * 2015-09-08 2020-06-30 Merck Patent Gmbh Methods of evaluating quality of a chromatography media which binds anti-A or anti-B antibodies
CN105413644A (zh) * 2015-12-02 2016-03-23 南昌大学 基于特异结合黄曲霉毒素单域重链抗体的亲和吸附材料
KR101993845B1 (ko) * 2016-02-18 2019-06-28 (주)에이피테크놀로지 알칼리 저항성이 증대된 항체 친화성 리간드
AU2017260274A1 (en) 2016-05-04 2018-11-01 Navigo Proteins Gmbh Targeted compounds for the site-specific coupling of chemical moieties comprising a peptide linker
CN109071613A (zh) 2016-05-11 2018-12-21 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离基质
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
JP7106187B2 (ja) 2016-05-11 2022-07-26 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを保存する方法
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
ES2914278T3 (es) * 2016-05-11 2022-06-08 Cytiva Bioprocess R & D Ab Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US11753438B2 (en) 2016-05-11 2023-09-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
KR101857953B1 (ko) * 2016-07-06 2018-05-16 아미코젠주식회사 알칼리 내성이 증가된 변이 면역글로불린 결합 단백질
CN109963864B (zh) 2016-08-11 2024-01-02 瑞普利金公司 用于亲和色谱的碱性稳定性fc结合蛋白
EP3551646A1 (en) 2016-12-12 2019-10-16 HurraH S.à r.l. Compositions and methods for increasing the immunoglobulin binding capacities of immunoglobulin-binding polypeptides and oligopeptides
GB201708277D0 (en) * 2017-05-24 2017-07-05 Ge Healthcare A Recombinant protein
JP7355729B2 (ja) 2017-08-07 2023-10-03 レプリゲン・コーポレイション Ｃ末端ヘリカル領域にシステインを有するｆｃ結合タンパク質
US11414466B2 (en) 2017-11-07 2022-08-16 Navigo Proteins Gmbh Fusion proteins with specificity for ED-B and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer
EP3708667A4 (en) 2017-11-09 2021-11-17 Tosoh Corporation IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEINS
KR102055708B1 (ko) 2018-06-26 2019-12-13 동일플랜트 주식회사 스팀 배기관에 삽입된 히트파이프를 이용한 드래프트 방식 복수기
WO2020040307A1 (ja) 2018-08-24 2020-02-27 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
GB201904125D0 (en) 2019-03-26 2019-05-08 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method for sanitization of a chromatography column
EP4034870A1 (en) * 2019-09-24 2022-08-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for chromatography use and regeneration
EP3875472A1 (en) * 2020-03-06 2021-09-08 Navigo Proteins Gmbh Novel immunoglobulin binding polypeptides
GB202113626D0 (en) 2021-09-24 2021-11-10 Cytiva Bioprocess R & D Ab FC binding polypeptides
GB202203478D0 (en) 2022-03-14 2022-04-27 Cytiva Bioprocess R & D Ab Vh3 binding polypeptides

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1564286A1 (en) * 2004-02-11 2005-08-17 Université de Liège Hybrid proteins of beta-lactamase class A
WO2007138328A2 (en) * 2006-05-31 2007-12-06 The University Of Bath Novel applications for staphylococcus aureus sbi protein
CN101522278A (zh) * 2006-09-29 2009-09-02 通用电气健康护理生物科学股份公司 用于抗体分离的包含来自金黄色葡萄球菌a蛋白的结构域c的层析配体
CN101704879A (zh) * 2008-08-11 2010-05-12 米利波尔公司 具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白
CN101775069A (zh) * 2008-12-24 2010-07-14 米利波尔公司 腐蚀稳定性色谱分析用配体

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8204810L (sv) 1982-08-23 1984-02-24 Pharmacia Fine Chemicals Ab Hybrid-dna-molekyl, transformerad mikroorganism och sett att framstella protein a
US5151350A (en) 1982-10-27 1992-09-29 Repligen Corporation Cloned genes encoding recombinant protein a
US4617266A (en) 1983-04-28 1986-10-14 Genex Corporation Production of Protein A
NZ218050A (en) 1985-11-13 1989-05-29 Wistar Inst Test for the presence of htlv-1v
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
US5260373A (en) 1987-03-13 1993-11-09 Repligen Corporation Immobilized immunoglobulin-binding proteins
US5084559A (en) 1987-03-27 1992-01-28 Repligen Corporation Protein a domain mutants
US5089473A (en) 1988-08-29 1992-02-18 Monsanto Company Somatotropin variants and their use
GB8902770D0 (en) 1989-02-08 1989-03-30 Bioprocessing Ltd Improvements in or relating to supports for immunoaffinity separations
US4879378A (en) 1989-03-30 1989-11-07 Union Carbide Chemicals And Plastics Company Inc. Polysiloxanes with pendant sterically hindered phenol moiety connected to the silicon atom via a carbonylyoxy-containing link
US5401650A (en) 1990-10-24 1995-03-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A
US5198531A (en) 1991-06-14 1993-03-30 Research Diagnostic Antibodies Polymeric resin for peptide synthesis
EP0550771B1 (en) 1991-07-25 1999-09-29 Oriental Yeast Co., Ltd. Immunoglobulin-binding artificial protein
US5240680A (en) 1991-12-19 1993-08-31 Chiron Corporation Automated apparatus for use in peptide synthesis
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
SE9503925D0 (sv) 1995-11-07 1995-11-07 Pharmacia Biotech Ab Separationsmedium för IgG
AU2429397A (en) 1996-03-29 1997-10-22 David S. Terman Polymerized staphylococcal protein a for treatment of diseases
US6013763A (en) 1996-06-04 2000-01-11 Genentech, Inc. Peptide variants of protein A
US5856452A (en) 1996-12-16 1999-01-05 Sembiosys Genetics Inc. Oil bodies and associated proteins as affinity matrices
EP1042459A4 (en) 1997-12-24 2003-07-23 Diatech Pty Ltd BIFUNCTIONAL MOLECULES
GB9823071D0 (en) 1998-10-21 1998-12-16 Affibody Technology Ab A method
US6589529B1 (en) 1998-10-30 2003-07-08 Children's Hospital Medical Center Rotavirus subunit vaccine
US6602977B1 (en) 1999-04-19 2003-08-05 Biovitrum Ab Receptor structures
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
EP2017343A3 (en) 1999-05-15 2009-01-28 University of California, San Diego Protein A based binding domains with desirable activities
US7163686B1 (en) 1999-05-15 2007-01-16 The Regents Of The University Of California Protein A based binding domains with desirable activities
WO2003057881A1 (fr) 2001-12-28 2003-07-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede de stabilisation d'une proteine
US7709209B2 (en) 2002-03-25 2010-05-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Protein ligands
SE0200943D0 (sv) 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
US7083948B1 (en) 2002-12-24 2006-08-01 Immunex Corporation Polypeptide purification reagents and methods for their use
PT1601697E (pt) 2003-02-28 2007-09-04 Lonza Biologics Plc Purificação de anticorpos através de proteína a e cromatografia de troca iónica.
GB0304576D0 (en) 2003-02-28 2003-04-02 Lonza Biologics Plc Protein a chromatography
DK1641818T3 (da) 2003-07-04 2009-03-16 Affibody Ab Polypeptider der har bindingsaffinitet for HER2
US7956165B2 (en) 2003-07-24 2011-06-07 Affisink Biotechnology Ltd. Compositions and methods for purifying and crystallizing molecules of interest
AU2004278311A1 (en) 2003-10-03 2005-04-14 Genentech, Inc. IGF binding proteins
CA2570253A1 (en) 2004-07-06 2006-01-12 Kaneka Corporation Process for producing protein a-like protein with use of brevibacillus genus bacaterium
US8728828B2 (en) 2004-12-22 2014-05-20 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Purification of immunoglobulins
WO2006070416A1 (en) 2004-12-30 2006-07-06 Fondazione Santa Lucia I.R.C.C.S. An immunoprecipitation-based method to purify and characterise biological macromolecular complexes
EP1869071B1 (en) 2005-03-01 2010-12-01 Affibody AB Tnf-alpha binding polypeptide, uses thereof and methods employing it
JP2006304633A (ja) 2005-04-26 2006-11-09 Apro Life Science Institute Inc イムノグロブリン結合タンパク質
ES2405079T3 (es) * 2005-06-17 2013-05-30 Wyeth Llc Métodos para purificar anticuerpos de la región Fc
JP2009503115A (ja) 2005-08-03 2009-01-29 アールキュー バイオサイエンス インク ＩｇＡ及びＩｇＭを媒介する腎臓症を診断するための方法及び組成物
JP5475284B2 (ja) 2005-08-03 2014-04-16 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 親水性架橋ポリマー
US8440191B2 (en) 2005-11-18 2013-05-14 Tufts Medical Center Clearance of abnormal IGA1 in IGA1 deposition diseases
EP1974215B1 (en) 2006-01-06 2017-12-27 EMD Millipore Corporation Affinity chromatography matrices and methods of making and using the same
WO2007097361A1 (ja) 2006-02-21 2007-08-30 Protenova Co., Ltd. イムノグロブリン親和性リガンド
US20080096819A1 (en) 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
JP5004165B2 (ja) 2006-10-10 2012-08-22 独立行政法人産業技術総合研究所 タンパク質の配向制御固定化に適したタンパク質
EP2099932A4 (en) 2006-12-06 2009-11-18 Repligen Corp NUCLEIC ACIDS ENCODING THE RECOMBINANT PROTEIN A
US8362217B2 (en) 2006-12-21 2013-01-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
EP2120915B1 (en) 2007-01-22 2011-09-28 Genentech, Inc. Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies
JP2008266221A (ja) 2007-04-20 2008-11-06 National Institute Of Advanced Industrial & Technology アミノ末端１箇所で配向制御固定化された固定化タンパク質
JP5522723B2 (ja) 2007-05-21 2014-06-18 ノマディックバイオサイエンス株式会社 新規ポリペプチド，アフィニティークロマトグラフィー用材，及びイムノグロブリンの分離及び／又は精製方法
SG149759A1 (en) 2007-07-10 2009-02-27 Millipore Corp Media for affinity chromatography
JP2009071766A (ja) 2007-09-18 2009-04-02 Panasonic Corp 受信端末装置
CN102027010A (zh) 2008-05-15 2011-04-20 诺沃-诺迪斯克有限公司 抗体纯化方法
JP5677943B2 (ja) 2008-06-05 2015-02-25 アフィボディ・アーベーＡｆｆｉｂｏｄｙ Ａｂ ポリペプチド
CN102272145B (zh) 2009-01-12 2014-07-30 通用电气健康护理生物科学股份公司 亲和色谱基质
EP2412809B1 (en) 2009-03-24 2017-08-09 Kaneka Corporation Protein having affinity for immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
EP2646126A4 (en) * 2010-11-29 2014-12-17 Ge Healthcare Bio Sciences Ab AFFINITY CHROMATOGRAPHY MATRIX
EP2654915B1 (en) 2010-12-20 2018-10-24 GE Healthcare BioProcess R&D AB Affinity chromatography matrix
WO2012133349A1 (ja) * 2011-03-25 2012-10-04 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用タンパク質
SG186552A1 (en) * 2011-06-08 2013-01-30 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1564286A1 (en) * 2004-02-11 2005-08-17 Université de Liège Hybrid proteins of beta-lactamase class A
WO2007138328A2 (en) * 2006-05-31 2007-12-06 The University Of Bath Novel applications for staphylococcus aureus sbi protein
CN101522278A (zh) * 2006-09-29 2009-09-02 通用电气健康护理生物科学股份公司 用于抗体分离的包含来自金黄色葡萄球菌a蛋白的结构域c的层析配体
CN101704879A (zh) * 2008-08-11 2010-05-12 米利波尔公司 具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白
CN101775069A (zh) * 2008-12-24 2010-07-14 米利波尔公司 腐蚀稳定性色谱分析用配体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAREN L.ATKINS等: "S.aureus IgG-binding proteins SpA and Sbi:Host specificity and mechanisms of immune complex formation", 《MOLECULAR IMMUNOLOGY》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105073769A (zh) * 2013-03-14 2015-11-18 Emd密理博公司 利用基于a蛋白的色谱增加蛋白纯度的方法
CN105073769B (zh) * 2013-03-14 2019-09-10 Emd密理博公司 利用基于a蛋白的色谱增加蛋白纯度的方法
CN105518020A (zh) * 2013-09-04 2016-04-20 Emd密理博公司 清洗基于a蛋白的亲和色谱柱的方法
US11014129B2 (en) 2013-09-04 2021-05-25 Emd Millipore Corporation Methods of cleaning a protein A based affinity chromatography column
CN114560906A (zh) * 2013-09-04 2022-05-31 Emd密理博公司 清洗基于a蛋白的亲和色谱柱的方法
CN107531799A (zh) * 2015-04-13 2018-01-02 富士胶片株式会社 短链肽固定化载体的制造方法及短链肽固定化载体
US10927188B2 (en) 2015-04-13 2021-02-23 Fujifilm Corporation Method for producing short-chain peptide-immobilized carrier, and short-chain peptide-immobilized carrier
CN107531799B (zh) * 2015-04-13 2021-11-26 富士胶片株式会社 短链肽固定化载体的制造方法及短链肽固定化载体
CN106596822A (zh) * 2016-12-16 2017-04-26 南京市产品质量监督检验院 一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法
CN106596822B (zh) * 2016-12-16 2018-01-19 南京市产品质量监督检验院 一种食品中金黄色葡萄球菌苯酚可溶性调控蛋白的检测方法
CN112210013A (zh) * 2019-07-03 2021-01-12 拜奥普罗塞亚科技有限责任公司 碱耐受性亲和色谱配体
WO2024045430A1 (zh) * 2022-09-01 2024-03-07 西安蓝晓科技新材料股份有限公司 一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
KR101928697B1 (ko) 2018-12-12
RU2013154493A (ru) 2015-07-20
RU2595430C2 (ru) 2016-08-27
EP3053931B1 (en) 2019-01-02
JP6586131B2 (ja) 2019-10-02
JP2018021038A (ja) 2018-02-08
JP6018120B2 (ja) 2016-11-02
AU2012366229C1 (en) 2017-03-09
JP2017019792A (ja) 2017-01-26
US9376474B1 (en) 2016-06-28
EP3053931A2 (en) 2016-08-10
CN105457612B (zh) 2018-08-21
JP6189493B2 (ja) 2017-08-30
AU2017200616A1 (en) 2017-02-23
TW201305191A (zh) 2013-02-01
US20160168194A1 (en) 2016-06-16
EP2532672B1 (en) 2018-04-04
US20150252085A1 (en) 2015-09-10
TWI570134B (zh) 2017-02-11
US8895706B2 (en) 2014-11-25
TW201542586A (zh) 2015-11-16
US8754196B2 (en) 2014-06-17
EP2532672A2 (en) 2012-12-12
US9234010B2 (en) 2016-01-12
KR20140044348A (ko) 2014-04-14
TWI638828B (zh) 2018-10-21
KR101844107B1 (ko) 2018-03-30
AU2012366229B2 (en) 2016-11-17
KR20180035201A (ko) 2018-04-05
KR101464040B1 (ko) 2014-11-20
DK3053931T3 (en) 2019-03-04
ES2671722T3 (es) 2018-06-08
AU2012366229A1 (en) 2013-11-07
JP2014193892A (ja) 2014-10-09
SG10201604559TA (en) 2016-07-28
CN105457612A (zh) 2016-04-06
TWI596108B (zh) 2017-08-21
TW201716427A (zh) 2017-05-16
WO2013109302A3 (en) 2013-10-17
EP2532672A3 (en) 2013-04-03
SG186552A1 (en) 2013-01-30
KR20120137259A (ko) 2012-12-20
IL229774A (en) 2017-08-31
US20130046056A1 (en) 2013-02-21
US9018305B2 (en) 2015-04-28
JP2012254981A (ja) 2012-12-27
ES2710204T3 (es) 2019-04-23
JP5756428B2 (ja) 2015-07-29
EP3053931A3 (en) 2016-10-26
IL253992B (en) 2019-01-31
AU2019200368B2 (en) 2021-03-11
SG10201604554WA (en) 2016-07-28
WO2013109302A2 (en) 2013-07-25
US20150080558A1 (en) 2015-03-19
DK2532672T3 (en) 2018-06-14
AU2017200616B2 (en) 2018-11-01
RU2644680C1 (ru) 2018-02-13
CN102895960B (zh) 2016-02-10
US20140296434A1 (en) 2014-10-02
IL253992A0 (en) 2017-10-31
AU2019200368A1 (en) 2019-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102895960B (zh) 包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质
KR101855714B1 (ko) 항체의 선택적 농축
KR20130018699A (ko) 친화성 크로마토그래피용 충전제 및 면역글로불린을 단리하는 방법
KR20210049802A (ko) 이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 어피니티 담체
KR102468989B1 (ko) IgG 결합 펩타이드를 포함하는 고상 담체 및 IgG의 분리 방법
WO2020075670A1 (ja) ＩｇＧ結合性ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant