JP2012254981A - 新規なスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcusaureus)プロテインAベースのリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)プロテインAなどの免疫グロブリン結合タンパク質の1つ以上のドメインをベースとするリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックス、およびこれらを使用する方法。
【選択図】なし
Description
本出願は、参照によりその全容が本明細書に組み込まれている、2011年6月8日付で出願された米国仮特許出願第61/494,701号の優先権の利点を主張するものである。
本発明は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)プロテインA(SpA)などの免疫グロブリン結合タンパク質の1つ以上のドメインをベースとするリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックス、およびこれらを使用する方法に関する。
アルカリ条件を用いた処理の後における標的分子に対する結合能の消失に低減を示すようである、プロテインAベースのクロマトグラフィーマトリックスが当技術分野で以前に記載されている。例えば、5時間以上の0.5M NaOHへの曝露の後でさえ最大95%の初期結合能を示す、マトリックスと多点結合し、SpAの野生型(wt)BまたはZドメインを取り込んだアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを記載する、米国特許公開第20100221844号を参照。さらに、米国特許公開第20100048876号は、約5時間の0.5Mへの曝露の後に最大95%の初期結合能を示すようである、SpAの野生型Cドメインおよびアミノ酸残基3から6の欠失を含有するCドメインを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスを記載する。これらのリガンドは、マトリックスとのシステイン誘導単一点結合によって固定される。さらに、タンパク質の1つ以上のアスパラギン残基に突然変異を含有するプロテインAドメインを取り込み、マトリックスがアルカリ条件への曝露の後に、野生型SpAに対する結合能の消失に低減を示すようであり、単一点結合によってマトリックスに固定されているようである、クロマトグラフィーマトリックスが記載されている。例えば、米国特許第6,831,161号を参照。
本明細書で使用する用語「SpA」、「プロテインA」または「スタフィロコッカス・アウレウスプロテインA」は、細菌スタフィロコッカス・アウレウスから単離した42Kdaのマルチドメインタンパク質を指す。SpAは、Xドメインと呼ばれるそのカルボキシ末端細胞壁結合領域を介して細菌細胞壁と結合する。アミノ末端領域において、それは、E、D、A、B、およびCと呼ばれる5つの免疫グロブリン結合ドメインを含む(Sjodhal、Eur J Biochem.Sep 78(2):471−90頁(1977);Uhlenら、J Biol Chem.Feb 259(3):1695−702頁(1984)。これらのドメインのそれぞれは約58アミノ酸残基を含有し、これらは65−90%のアミノ酸配列同一性を共有する。
本発明によって包含されるSpAベースのアフィニティークロマトグラフィーリガンドは、当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して作製することができる。
いくつかの実施形態において、本発明によって包含されるSpAリガンドを、担体、例えば固形担体または可溶性担体上に固定して、例えば、免疫グロブリンおよびFc含有タンパク質などの生体分子の分離に適したアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを生成する。
任意の適切な技法を、担体、例えば当技術分野でよく知られており本明細書に記載する担体を含めた固形担体に、本明細書に記載するリガンドを結合させるために使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、例えばリガンド中に存在するアミノおよび/またはカルボキシ基を使用する従来のカップリング技法によって、担体にリガンドを結合させることが可能である。例えば、ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、CNBr、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)などが、よく知られているカップリング試薬である。いくつかの実施形態において、スペーサーを担体とリガンドの間に導入し、これによってリガンドの利用性を改善し、担体とリガンドの化学的カップリングを容易にする。
本発明は、1つ以上のB、ZまたはCドメインベースのSpAリガンドを取り込んだアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供し、1つ以上のドメインは位置1または位置2で始まる、N末端からの3つのまたは4つのまたは5つの連続アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態において、SpAベースのリガンド上の2箇所以上の部位がクロマトグラフィーマトリックスと結合する。
精製プロセスにおける使用中に低減した断片化を示すこと以外に、本明細書に記載するリガンドはさらにアルカリ安定性である。本明細書に記載するSpAベースのリガンドを取り込んだクロマトグラフィーマトリックスの生成後、リガンドを含有するマトリックスのアルカリ安定性は、当技術分野で標準的な技法および本明細書に記載する技法を使用してアッセイすることができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを使用して、混合物から標的分子を精製する方法を提供する。標的分子は、本明細書で提供するアフィニティーリガンドにより認識される任意の分子であってよく、リガンドは固形担体(すなわち、クロマトグラフィーマトリックス)にカップリングする。標的分子の例は、免疫グロブリンおよびFc含有タンパク質を含む。免疫グロブリンは、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはこれらの機能性断片であってよい。機能性断片は、固形担体にカップリングしたタンパク質リガンドと特異的に結合するその能力を同時に保持しながら、その抗原に依然として特異的に結合する可変領域を含む免疫グロブリンの任意の断片を含む。
4つの連続したアミノ酸のN末端欠失を有する1つ以上のドメインを含むSpAリガンドの生成
以下のタンパク質をコードする合成遺伝子をDNA2.0(Menlo Park、CA)から得た。2つのZドメインであって、それぞれのドメインが位置29にFab結合を低減または排除するための突然変異(A29K)を含有するドメインを含有するSpAダイマータンパク質(配列番号85で示すアミノ酸配列)、および2つのZドメインであって、それぞれのドメインがA29K突然変異を含有し、第二ZドメインがN末端から4つの連続したアミノ酸を欠失する欠失を含有するドメインを含有するSpAダイマータンパク質(配列番号78で示すアミノ酸配列)。
SpAベースのリガンドの発現および精製
前に論じたように、任意の適切な細菌発現系を、本明細書に記載する様々なSpAリガンドの発現に使用することができる。例えば、pET11a(EMD)などのpETベクターを使用して、株BL21(DE3)(PROMEGA、Madison WI)などのエシェリキア・コリ(Escherchia coil)株において、タンパク質を発現させることが可能である。
固形担体へのSpAベースのリガンドの結合
実施例1および2中に記載したような様々なリガンドの生成および発現の後、それらを多点結合により固形担体に固定した。
遊離または固定リガンドの苛性浸漬後に回収した上清のSDS−PAGE分析
長時間の苛性曝露後の、本明細書に記載する遊離および固定リガンドの断片化を検出するのに、SDS−PAGE分析を使用することができる。SDS−PAGE手法は以下に記載する。
遊離または固定リガンドの苛性浸漬後に回収した上清のSEC分析
前に記載したSDS−PAGE分析以外に、長時間の苛性浸漬後の遊離および固定リガンドの断片化分析に、SEC(サイズ排除クロマトグラフィー)を使用することもできる。SEC実験は以下に記載する。
リガンドの苛性浸漬
実施例2中に記載したリガンドの発現後、リガンドはアルカリ条件に曝す。
樹脂上に固定されたリガンドの苛性浸漬
前述の実施例中に記載した様々なリガンドを、固形担体(例えば、アガロースクロマトグラフィー樹脂)とのそれらの結合後に、苛性曝露後の断片化に関して評価する。
25時間0.5M NaOHへの曝露前後の免疫グロブリンに対するクロマトグラフィーマトリックスの静的結合能の測定
前に記載したアフィニティークロマトグラフィーマトリックス(すなわち、多点結合によって固定樹脂をその上に有する樹脂)を、25時間0.5M NaOHへの曝露前後の、それらの静的結合能に関してさらに試験する。
0.5M NaOHへの曝露前後のIgGのSpA捕捉
この実験では、第一ドメイン以外の全てが4つの連続したアミノ酸の欠失を有するZドメインリガンドのペンタマーが固定されたマトリックスを使用して、無CHO−Sフィードにおけるポリクローナル免疫グロブリンの精製を、組換えにより合成したSpA(rSPA)を有するそれと共に調べて、本発明によるリガンドは不純物を除去する際に組換えSpAと同程度に働くことを実証する。
カチオン交換およびアニオン交換クロマトグラフィーを使用した、浸出SpAリガンドの排除ならびにDNAおよび宿主細胞タンパク質のさらなる除去
本発明によるSpAリガンドまたは組換えSpA、rSPAを含有するリガンド(REPLIGEN、Waltham、MA)のいずれかを取り込んだクロマトグラフィーアフィニティーマトリックスの溶出プールからの、浸出リガンドの排除ならびに宿主細胞タンパク質(HCP)およびDNAのさらなる除去を以下のように調べる。
長時間の苛性浸漬後のリガンドの断片化に対するN末端アミノ酸欠失数の影響
別の実験では、1、2、3または4つのアミノ酸残基を、位置1で始めダイマーZドメインリガンドの第二ドメインのN末端から欠失させ、長時間の苛性浸漬後のリガンドの断片化に対する1、2、3または4つのアミノ酸欠失の影響を、対照ダイマーZドメインリガンド(A29K)と比較して決定した。
いずれも非Fab突然変異(G29K)を有するN末端欠失と野生型Cドメインペンタマーの保持結合能の比較
この実験では、ポリビニルアルコールベースのクロマトグラフィーマトリックスに固定された2つのCドメインペンタマーリガンド、5ドメインそれぞれにおいて4アミノ酸の(位置1で始まる)N末端欠失、同種の翻訳後プロセシングを容易にするためのペンタマー配列の正に第一のアミノ酸としてアラニンおよびG29K突然変異を有する1つのリガンド(そのアミノ酸配列は配列番号93で示す)、およびG29K突然変異を有するその野生型対応物に相当するもう1つのリガンド(そのアミノ酸配列は配列番号95で示す)の保持結合能を調べる。
Claims (20)
- 1つ以上のスタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA(SpA)のCドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、少なくとも1つのCドメインが、位置1または位置2で始まる、N末端からの少なくとも3つの連続したアミノ酸の欠失を含む、アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- 1つ以上のスタフィロコッカスプロテインA(SpA)のBドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、少なくとも1つのBドメインが、位置1または位置2で始まる、N末端からの少なくとも3つの連続したアミノ酸の欠失を含む、アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- 1つ以上のスタフィロコッカスプロテインA(SpA)のZドメインを含むアフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、少なくとも1つのZドメインが、位置1または位置2で始まる、N末端からの少なくとも3つの連続したアミノ酸の欠失を含む、アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- 少なくとも5時間の0.5M NaOHへの曝露後に、野生型対応物に比べて、低減した断片化を示す、請求項1、2または3に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- 固形担体と結合されている請求項1、2または3に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンドを含む、アフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
- 固形担体と結合された時にリガンドが、5時間の0.5M NaOHへの曝露後に、野生型対応物に比べて、低減した断片化を示す、請求項5のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
- リガンドの1つ以上のドメインが位置29に、Fab結合を低減するアミノ酸突然変異をさらに含む、請求項1、2または3に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- アミノ酸突然変異が、リジンアミノ酸残基によるグリシンアミノ酸残基またはアラニンアミノ酸残基の置換を含む、請求項7のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- アフィニティークロマトグラフィーリガンドが多点結合によって固形担体と結合されている、請求項5のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
- 2、3、4、5、6、7つまたはこれらを超える、スタフィロコッカスプロテインA(SpA)のCドメインを含み、少なくとも1つのCドメインが、位置1または位置2で始まる、N末端からの3つの連続したアミノ酸の欠失、またはN末端からの4つの連続したアミノ酸の欠失、またはN末端からの5つの連続したアミノ酸の欠失を含む、請求項1に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- 2、3、4、5、6、7つまたはこれらを超える、スタフィロコッカスプロテインA(SpA)のZドメインを含み、少なくとも1つのZドメインが、位置1または位置2で始まる、N末端からの3つの連続したアミノ酸の欠失、またはN末端からの4アミノ酸の欠失、またはN末端からの5つの連続したアミノ酸の欠失を含む、請求項3に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- 2、3、4、5、6、7つまたはこれらを超える、スタフィロコッカスプロテインA(SpA)のBドメインを含み、少なくとも1つのBドメインが、位置1または位置2で始まる、N末端からの3つの連続したアミノ酸の欠失、またはN末端からの4アミノ酸の欠失、またはN末端からの5つの連続したアミノ酸の欠失を含む、請求項2に記載のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- 試料から1つ以上の標的分子をアフィニティー精製する方法であって、
(a)1つ以上の標的分子を含む試料を提供するステップ、
(b)1つ以上の標的分子がマトリックスと結合するような条件下において試料を請求項5に記載のマトリックスと接触させるステップ、および
(c)溶出によって1つ以上の結合されている標的分子を回収するステップ
を含む、方法。 - 0.5M NaOH中での5時間の温置後に、その初期結合能の少なくとも95%を保持する、請求項5のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
- 0.1M NaOH中での25時間の温置後に、その初期結合能の少なくとも95%を保持する、請求項5のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
- 構造式:
[(X)n、(Y)m]n+m
を含むアフィニティーリガンドであって、
式中、XがSpAのBドメイン、ZドメインまたはCドメインを表し、
nがゼロから(m−1)の範囲のドメイン数を表し、
Yが、少なくとも3つの連続したアミノ酸をN末端から欠失している、SpAのBドメインまたはZドメインまたはCドメインを表し、
mが1から8の範囲のYドメイン数を表し、リガンドは多点結合によって固形担体と結合されている、アフィニティーリガンド。 - アフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、2つ以上の、SpAのBドメイン、または2つ以上の、SpAのCドメイン、または2つ以上の、SpAのZドメイン、または任意の順序における、B、ZもしくはCドメインの任意の組合せを含み、B、CまたはZドメインの少なくとも1つが、位置1または位置2で始まる、N末端からの少なくとも3アミノ酸の欠失を含む、アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- 5時間の0.5M NaOHへの曝露後に、いかなる欠失も含まないリガンドに比べて、低減した断片化を示す、請求項17のアフィニティークロマトグラフィーリガンド。
- 固形担体が、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコールおよびポリスチレンならびにこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項5または請求項9に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス。
- アルカリ安定性アフィニティークロマトグラフィーリガンドであって、少なくとも5つのCドメインを含み、前記ドメインのそれぞれが、Fab結合を低減する突然変異および位置1で始まる、N末端からの4アミノ酸の欠失を含む、アルカリ安定性アフィニティークロマトグラフィーリガンド。
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