CN103228328A

CN103228328A - 亲和色谱基质

Info

Publication number: CN103228328A
Application number: CN2011800565779A
Authority: CN
Inventors: T.毕约克曼; G.罗德里戈
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2010-11-29
Filing date: 2011-11-28
Publication date: 2013-07-31
Also published as: EP2646126A4; US20130245224A1; US8859726B2; EP2646126A1; JP2014502272A; WO2012074463A1

Abstract

本发明涉及从液体中分离一种或更多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法。本方法包括首先将液体与含有固定在支持物上的配体的分离基质接触；使含有免疫球蛋白的蛋白质通过与配体相互作用吸附到基质上；然后进行洗涤被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白质的任选步骤；和通过使基质与释放蛋白质的洗脱液接触而回收所述的含有免疫球蛋白的蛋白质。本方法改进了以前的分离方法，其中每个配体包含一个或多个蛋白A结构域(E，D，A，B，C)或蛋白Z或其功能性变体，其中至少一个单体具有第三个α-螺旋后最接近C末端的脯氨酸残基的取代。

Description

亲和色谱基质

发明领域

本发明涉及亲和色谱法领域，且更具体涉及含有配体的分离基质，所述配体含有一个或多个蛋白A结构域（E、D、A、B、C）或蛋白Z，具有在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸残基（C-terminal most proline residue）的氨基酸取代。本发明还涉及用具有增加能力(capacity)的优势的前述基质分离目标蛋白质的方法。

发明背景

免疫球蛋白为全球范围内生产或研发中最普遍的生物制药产品。其特定治疗市场的高度商业化需求和由此带来的价值已导致制药公司将重点放在将其各自的mAb生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。

大多数情况下使用亲和色谱法作为这些免疫球蛋白分子（例如单克隆或多克隆抗体）纯化中的关键步骤之一。特别有意义的一类亲和试剂是能特异性结合免疫球蛋白分子的恒定部分的蛋白质，这样的相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。这样的试剂可广泛用于从不同样本中用亲和色谱法回收免疫球蛋白，所述样本例如但不限于血清或血浆制备物或得自细胞培养物的原料。这样的蛋白质的一个实例为葡萄球菌蛋白A，其含有能与不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分相结合的结构域。

基于葡萄球菌蛋白A（SpA）的试剂因为其高度亲和力和选择性在生物技术领域已经发现了广泛的用途，例如用于捕获和纯化抗体以及检测的亲和色谱法。目前，基于SpA的亲和介质可能是最广泛使用的从不同样本中分离单克隆抗体及其片段的亲和介质，所述样本包括来自细胞培养物的工业原料。因此，各种包含蛋白A配体的基质可市购获得，例如以天然蛋白A的形式（例如Protein A SEPHAROSE™, GE Healthcare, Uppsala, Sweden），还可由重组蛋白A组成（例如rProtein A SEPHAROSE™, GE Healthcare）。更具体地说，在市售的重组蛋白A产品中进行的基因操作的目的在于促进其附着至支持物。

这些应用，与其他亲和色谱法应用类似，需要充分注意一定要去除杂质。这样的杂质可例如为色谱程序中吸附在固定相或基质上的非洗脱分子，例如不期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。通常在所期望产品的第一次洗脱之后从基质上去除这样的杂质，以便于在后续使用之前使基质再生。这样的去除通常涉及称为原位清洗（cleaning-in-place, CIP）的程序，其中使用能从固定相上洗脱杂质的试剂。经常使用的一类这样的试剂为流过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洗和清洁试剂为NaOH，其浓度范围可为0.1M直到例如1 M，这依赖于杂质的程度和种类。这个策略涉及将基质暴露于超过13的pH值中。对许多含有蛋白性质的亲和配体的亲和色谱基质来说，这样的碱性环境为非常苛刻的条件，因此由于配体对有关高pH的不稳定性而导致能力下降。

因此，广泛的研究已集中在工程改造蛋白质配体的研制上，所述蛋白质配体显示出耐受碱性pH值的能力提高。例如，Gülich等(Susanne Gülich, Martin Linhult, Per-Åke Nygren, Mathias Uhlén, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178) 提出了蛋白质工程改造，以在碱性环境中提高葡萄球菌白蛋白结合结构域（ABD）的稳定性。Gülich等创建了ABD的突变体，其中所有的4个天冬酰胺残基被亮氨酸（1个残基）、天冬氨酸（2个残基）和赖氨酸（1个残基）置换。此外，Gülich等报道了其突变体显示类似于天然蛋白的靶蛋白结合特性，并且在重复暴露于碱性环境后，含有工程改造的配体的亲和柱比用亲本未改造的配体制备的亲和柱显示出更高的结合能力。因此，从中推断出可置换所有的4个天冬酰胺残基而对结构和功能没有任何明显的影响。

近期研究表明也可改变蛋白A（SpA）来影响类似的性质。美国专利申请公布US 2005/0143566公开了当至少1个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺或天冬氨酸时，与亲本SpA（例如SpA的B结构域）或蛋白Z（源自SpA的B结构域的合成构建体（US 5,143,844））相比，该突变赋予了在高达约13-14的pH值下增加的化学稳定性。作者证明当这些突变的蛋白质用作亲和配体时，预想的分离介质可更好地耐受使用碱性试剂的清洗程序。US 2006/0194955显示突变的配体可更好地耐受蛋白酶从而减少配体在分离过程中的漏失。另外一个公布US 2006/0194950显示可进一步修饰碱稳定的SpA结构域以使配体缺失对Fab的亲和力但保留对Fc的亲和力，例如通过G29A突变。

在过去，含有5个IgG结合结构域的天然蛋白A用于生产所有的蛋白A亲和介质。使用重组技术，已经产生出许多蛋白A的构建体，它们都含有4个或5个IgG结合结构域。近期研究表明，与四聚体配体相比较，二聚体配体有类似或增加的结合能力（WO 2010/080065）。

在该领域仍有需要获得包含具有增加的结合能力的蛋白质配体的分离基质。

发明概述

本发明的一个目标是提供能结合免疫球蛋白的蛋白质配体，所述免疫球蛋白例如IgG、IgA和/或IgM，优选通过其Fc片段结合。这些配体具有在至少1个蛋白A的单体结构域（E、D、A、B、C）或蛋白Z中第三个α螺旋后最接近C末端的脯氨酸残基的取代，因此与没有取代的配体相比较有更高的结合能力。配体优选为多聚体，即含有超过一个选自蛋白A的单体结构域（E、D、A、B、C）和蛋白Z。

本发明的另一目标是提供亲和分离基质，其包含能结合免疫球蛋白的配体，所述免疫球蛋白例如IgG、IgA和/或IgM，优选通过其Fc片段结合，如上所述。

本发明的又一目标是提供用本发明亲和基质分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法。通过使用具有取代的亲和配体，出乎意料的是，本方法实现对靶分子的结合能力增加。

因此，本发明提供了一种方法用以产生纯化的产物，例如纯化的免疫球蛋白分离物或除掉免疫球蛋白后剩余的液体，或者用以检测样本中免疫球蛋白的存在。本发明的配体显示增加的能力，这使配体成为节省成本且大规模实施的有吸引力的候选。

按所附权利要求所述可实现一个或多个上述目标。

附图简述

图1显示蛋白Z的氨基酸序列，第57位的脯氨酸用粗体显示(SEQ ID NO: 2)。

图2a显示假设的四聚体配体结构，每个单体是蛋白A的结构域（E、D、A、B、C）或蛋白Z，由于每个单体中最接近C末端的脯氨酸的存在，因此在每个结构域之间含有60°的转角。

图2b显示配体和IgG之间的假设的结合，其中一个IgG结合两个单体结构域（两个Fc链由圆环表示，分别结合一个单体结构域）。

图2c显示在单体结构域之间假设的更线性和柔性的多聚体配体结构，其归因于在每个结构域中最接近C末端的脯氨酸取代为其他氨基酸残基。

图2d显示蛋白A的5个结构域的氨基酸序列的比对。

图3显示动力学结合能力试验的代表性色谱结果。

发明详述

定义

术语“蛋白质”在本文用以描述蛋白质及其片段。因此，术语“蛋白质”包括显示三维结构的任何氨基酸链，并且相应地包括蛋白质片段。

术语蛋白质的“功能性变体”在本文意指变体蛋白质，其中与本发明所定义的亲和力和稳定性有关的功能被基本保留。因此与所述功能不相关的一个或多个氨基酸可能被替换。

术语“亲本分子”在本文指在本发明的突变引入前形式的相应蛋白质。

术语“结构稳定性”指分子的三维形状的完整性，而“化学稳定性”指耐受化学降解的能力。

术语“Fc片段结合”蛋白意指蛋白质能够结合免疫球蛋白的Fc片段。然而，并不排除Fc片段结合蛋白还能结合其他区域，例如免疫球蛋白的Fab区。

在本说明书中，如果没有通过其全称提及氨基酸，那么用惯例的单字母符号表示氨基酸。

突变在本文中用被替换的位置的编号来定义，野生型或非突变的氨基酸在前，突变的氨基酸在后。因此，例如在第23位上天冬酰胺突变成苏氨酸表示为N23T。

一方面，本发明涉及从液体中分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法，所述方法包括(a)使液体与含有固定在支持物上的配体的分离基质接触；(b)通过与配体相互作用使含有免疫球蛋白的蛋白质吸附到基质上；(c)清洗被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白质的任选步骤；和(d)通过使基质与释放蛋白质的洗脱液接触以回收含有免疫球蛋白的蛋白质。本方法通过使用配体提供配体对免疫球蛋白分子增加的结合能力，每个配体包含一个或多个葡萄球菌蛋白A (SpA) (E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性变体的结构域（即，单体），其中在所述一个或多个结构域中的至少一个中最接近C末端的脯氨酸被取代为其他氨基酸。

免疫球蛋白结合蛋白（即，配体）可以是具有天然的免疫球蛋白结合能力的任何蛋白质，例如葡萄球菌蛋白A (SpA)或葡萄球菌蛋白G (SpG)，或含有这些蛋白质的IgG结合结构域的重组蛋白质。其他这样的蛋白质的综述可参见例如Kronvall, G., Jonsson, K. Receptins: a novel term for an expanding spectrum of natural and engineered microbial proteins with binding properties for mammalian proteins, J. Mol. Recognit. 1999 Jan-Feb; 12(1):38-44。配体可包含一个或多个SpA的E、D、A、B和C结构域。配体更优选包含蛋白A的结构域B或工程改造的蛋白Z。

每一个蛋白Z或蛋白A结构域包含靠近C末端的脯氨酸(P57)（参见例如图1、图2d和SEQ ID NO. 1-8）。已知脯氨酸由于其结构(即侧链连接在α氮上)可在蛋白质中提供转角。这种连接限制为φ=约60°的成键角度，因此在蛋白质中产生转角。经典实例可参见IgG的铰链，其中可存在脯氨酸。因此，当脯氨酸存在于C末端时，蛋白A的每个结构域或蛋白Z以60°键角结束，在结构域之间产生转角（图2a-2c）。最接近C末端的脯氨酸既不涉及Fc结合(Graille等, PNAS 2000, 97 (10): 5399-5404; Deisenhofer, Biochemistry 1981, 20 (9): 2361-2370)，也不是α螺旋的一部分（脯氨酸不可能形成α螺旋）。

因此，因为结构限制，由每个结构域中C末端脯氨酸的存在可导致蛋白A/蛋白Z配体的单体结构域的利用率很低（在总过载下二中之一被使用），即位阻现象。有可能在配体中两个结构域结合一个IgG分子，因此阻碍了IgG接近所有其他的结构域（图2b）。这样的结合还可暗示了IgG与配体的结合更强。本发明的某些实施方案取代了在每个结构域中最接近C末端的脯氨酸（SEQ ID NO: 1或2的P57），以实现每个结构域的利用率更高从而增加的配体能力，这可能归因于单体结构域之间更线性和/或柔性的多聚配体结构（图2c）。

如图2d所示，蛋白A的5个结构域之间的序列高度相关。没有缺失或插入，且许多取代是对蛋白质的结构或功能引起最小可能变化的保守改变。例如，在整个58个氨基酸的多肽内在B结构域和C结构域之间只有4个改变。因此，在每个这些结构域中C末端脯氨酸对蛋白A或含有所述结构域的配体具有类似的结构/功能贡献。同样地，脯氨酸的改变对含有这种改变的配体的结构/功能产生类似的影响。

在某些实施方案中，脯氨酸被取代为优选形成β折叠的氨基酸。脯氨酸优选被取代为大体积氨基酸或产生“刚性”的氨基酸，例如Y、W、F、M、I、V、T。取代更优选为P57I。

在另外的实施方案中，脯氨酸被取代为易于形成α螺旋的氨基酸，例如E、A、L、H、M、Q、K。

在某些优选实施方案中，亲本分子包含由SEQ ID NO: 1-8所定义的序列或其任何功能性变体。

在某些实施方案中，在多聚体配体的至少一个单体结构域中最接近C末端的脯氨酸残基被取代。在另外的实施方案中，在多聚体配体的所有单体结构域中最接近C末端的脯氨酸残基被取代。

在一个实施方案中，配体还呈现碱稳定性，例如通过将SpA结构域B或蛋白Z的至少一个单体结构域的至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸来实现。如早期所讨论，US专利申请公布US 2005/0143566公开了当至少一个天冬酰胺残基被突变为非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，该突变赋予配体在高pH下增加的化学稳定性（例如，N23T）。此外，包含这些配体的亲和介质能更好地耐受使用碱性试剂的清洗程序。US 2006/0194955显示突变的配体还能更好地耐受蛋白酶，从而减少在分离过程中的配体漏失。因此，这些申请的公开内容通过引用其整体而结合到本文中。

在另一实施方案中，这样制备的配体对抗体的Fab部分缺少任何显著的亲和力，而对Fc部分有亲和力。因此，在某些实施方案中，配体的至少一个甘氨酸被丙氨酸取代。US 2006/0194950显示碱稳定的结构域可被进一步修饰从而使配体缺少对Fab的亲和力而保持Fc亲和力，例如通过G29A突变来实现。因此，该申请的公开内容通过引用其整体而结合到本文中。本文所用的氨基酸编号方式为本领域常规使用的方式，以蛋白A的结构域B上的位置为例，且本领域的技术人员可容易地识别每个E、D、A、B、C结构域或蛋白Z的突变位置。

在一个有利的实施方案中，配体被制成结构域B的多聚体拷贝，并且通过将至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸（例如N23T）以获得结构域B的碱稳定性；并且含有在碱稳定的结构域B的第29位上的氨基酸残基的突变，例如G29A突变。

在另一个实施方案中，将配体制成蛋白Z的多聚体拷贝，其中通过将至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸以获得碱稳定性。在一个有利的实施方案中，通过将至少第23位天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸以获得碱稳定性。

如本领域技术人员易于理解，可用常规的分子生物学技术以任何的次序进行P57的取代、提供碱稳定性的突变以及G到A的突变。此外，可用含有编码突变的蛋白配体的核酸序列的载体表达配体。或者，可通过蛋白质合成技术制备配体。合成预先确定序列的肽和蛋白质的方法为本领域所熟知且普遍可被使用。

因此，在本发明中，术语“葡萄球菌蛋白A的碱稳定结构域B”意指基于SpA的结构域B的碱稳定蛋白质，例如在US专利申请公布US 2005/0143566和US 2006/0194950中描述的突变蛋白质；还指其他来源但具有功能上等效的氨基酸序列的其他碱稳定蛋白质。

如技术人员所理解，表达的蛋白质在固定到支持物上之前应被纯化到适当的程度。这样的纯化方法为本领域所熟知，且使用标准方法可容易地将基于蛋白质的配体固定到支持物上。适当的方法和支持物将在下面更详细地讨论。

因此，在一个实施方案中，本发明的突变蛋白质包含至少约75%，例如至少约80%或优选至少约95%的SEQ ID NO: 1或2所定义的序列，前提是在第21位没有天冬酰胺突变。

在本说明书中，SEQ ID NO: 1定义了SpA的B结构域的氨基酸序列：

。

SEQ ID NO: 2定义了称为蛋白Z的蛋白质：

。

蛋白Z为源自SpA的B结构域的合成构建体，其中在第29位的甘氨酸被置换为丙氨酸，参见例如生物过程技术百科全书：发酵、生物催化和生物分离(The Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation)，M.C. Fleckinger和S.W. Drew编辑，John Wiley and Sons Inc., New York, 8-22中的Ståhl等, 1999: 生物技术中的亲和融合：聚焦蛋白A和蛋白G (Affinity fusions in biotechnology: focus on protein A and protein G)。

在一个实施方案中，上述突变蛋白质包含SEQ ID NOs: 1或2定义的氨基酸序列，或为其具有P57取代的功能性变体。在另一实施方案中，上述突变蛋白质包含SEQ ID NOs: 4-8定义的氨基酸序列，或为其具有P57取代的功能性变体。本文中所用的术语“功能性变体”包括任何类似的序列，其包含一个或多个氨基酸位置上的进一步变异，所述变异不影响突变蛋白质对免疫球蛋白的亲和力，或不影响其在增加的pH值环境中所改进的化学稳定性。

在一个有利的实施方案中，本发明的P57取代选自大体积氨基酸或产生“刚性”的氨基酸，例如Y、W、F、M、I、V、T；且其中亲本分子包含由SEQ ID NO: 1-8定义的序列，或其任何功能性变体。在另一实施方案中，P57被易于形成α螺旋的氨基酸取代，例如E、A、L、H、M、Q、K，且其中亲本分子包含由SEQ ID NO: 1-8定义的序列，或其任何功能性变体。取代更优选为P57I。如上所述，为获得用作在碱性条件下具有长时间的高度结合能力配体的突变蛋白质，应避免在第21位上的天冬酰胺残基的突变。在一个实施方案中，在第3位上的天冬酰胺残基没有突变。

在某些实施方案中，在多聚体配体的至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸残基被取代。在另外的实施方案中，在多聚体配体的所有单体中最接近C末端的脯氨酸残基被取代。

在一个有利的实施方案中，位于亮氨酸残基和谷氨酰胺残基之间的天冬酰胺残基还被突变为例如苏氨酸残基。因此，在一个实施方案中，由SEQ ID NO: 2定义的序列的第23位上的天冬酰胺残基被突变为例如苏氨酸残基。在一个具体的实施方案中，由SEQ ID NO: 2定义的序列的第43位上的天冬酰胺残基还被突变为例如谷氨酸。在第43位氨基酸被突变的实施方案中，最有利的是与至少一个其他的突变联合，例如N23T。

因此，本发明包括以上论述的单体突变蛋白质。然而，这样的蛋白质单体可组合成多聚体配体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体等。因此，本发明的另一方面为包含至少一个本发明的突变蛋白质及一个或多个其他单元的多聚体，其他单元优选同样为本发明的突变蛋白质。因此，本发明为例如由两个重复单元组成的二聚体，或由四个重复单元组成的四聚体。

在某些实施方案中，多聚配体包含两个或更多个（例如2-4个）拷贝的相同单体结构域，所述结构域来自蛋白A的结构域E、D、A、B、C或蛋白Z或任何功能性变体。

在另外的实施方案中，多聚体配体包含两个或更多个（例如2-4个）不同的单体结构域，其选自蛋白A的结构域E、D、A、B、C或蛋白Z或任何功能性变体

在一个实施方案中，本发明的多聚体包含连接有一段氨基酸(优选长度为0-15个氨基酸，例如0-10或5-10个氨基酸)的单体单元。这类连接物的性质应优选不会蛋白质单元的空间构像不稳定。此外，所述连接物还应优选为在碱性环境中足够稳定，不削弱突变的蛋白质单元的性质。

在另一实施方案中，本发明的二聚体配体包括SEQ ID NO: 3的序列：

。

在又一实施方案中，二聚体配体包括SEQ ID NO: 9的序列：

。

在另一实施方案中，四聚体配体包括SEQ ID NO: 10的序列：

。

意想不到的是，本发明发现当比较配体的能力时，与未取代的配体相比较，在配体的至少一个单体结构域中C末端脯氨酸(P57)的取代提供了更高的能力。

本发明一方面涉及用于分离含有免疫球蛋白的蛋白质的配体。配体包含一个或多个葡萄球菌蛋白A (SpA)的结构域(E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性变体，其中在至少一个结构域中最接近C末端的脯氨酸被取代为其他氨基酸。与没有该取代的配体相比较，这样的配体当固定在固体支持材料上时可提供增加的对免疫球蛋白的能力。配体可按上述任何实施方案构建。

一方面，本发明涉及用于亲和分离的基质，该基质包含含有偶联到固体支持物上的免疫球蛋白结合蛋白的配体。优选在至少一个蛋白A的单体结构域(E、D、A、B、C)或蛋白Z中第三个α螺旋后最接近C末端的脯氨酸残基（P57残基）被取代为其他氨基酸。配体优选为多聚体，即含有超过一个选自蛋白A (E、D、A、B、C)和蛋白Z的单体结构域。与没有取代的基质相比，本发明的基质显示出增加的结合能力。突变的蛋白配体优选为Fc片段结合蛋白，并且可用于选择性结合IgG、IgA和/或IgM，优选IgG。

本发明的基质可包含在其以上任何实施方案中所述的突变蛋白作为配体。在最优选的实施方案中，存在于固体支持物上的配体包含如上所述的取代。

本发明的基质固体支持物可以为任何合适的已知种类。常规的亲和分离基质通常为有机性质，且基于使亲水表面暴露于所用水性介质的聚合物，即，使羟基(-OH)、羧基(-COOH)、酰胺(-CONH₂，可能以N-取代形式)、氨基(-NH₂，可能以取代形式)、寡或聚乙烯氧基暴露于其外表面，并且如果存在，还暴露于内表面。在一个实施方案中，聚合物可例如基于多聚糖，例如葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰、琼脂、琼脂糖等，其可有利地与例如双环氧化物(bisepoxides)、环氧卤丙烷(epihalohydrins)、1,2,3-三卤代低级烃，或依照US6602990所述的方法交联，以产生适当的多孔性和刚性。在最优选的实施方案中，固体支持物为多孔琼脂或琼脂糖珠粒。本发明所用支持物按标准方法很容易制备，所述方法例如反相悬浮凝胶法（S Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)）。或者，基础基质为市售产品，例如Sepharose™ FF或Sepharose HP (GE Healthcare)。在一个特别有利于大规模分离的实施方案中，对支持物调整以增加其刚性，从而致使基质更适应于高流速。

或者，固体支持物基于合成的聚合物，例如聚乙烯醇、聚丙烯酸羟烷基酯、聚甲基丙烯酸羟烷基酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水聚合物，例如基于二乙烯基和单乙烯基取代苯的基质的情况中，基质表面经常被亲水化使如上所述的亲水基团暴露于周围的水性液体中。按照标准方法易于制备这样的聚合物，所述方法可参见例如“通过悬浮聚合开发的基于苯乙烯的聚合支持物(Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization)”(R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988))。或者，使用市售产品，例如 SOURCE™ (GE Healthcare)。

在另一实施方案中，本发明的固体支持物包括无机性质的支持物，例如二氧化硅、氧化锆等。

在另一实施方案中，固体支持物为其他形式，例如表面、芯片、毛细管或滤器。

关于本发明的基质的形状，在一个实施方案中基质为多孔整料的形式。在一个备选的实施方案中，基质为珠粒或颗粒形式，其可以是多孔或无孔的。珠粒或颗粒形式的基质可用作填充床或以悬浮的形式。悬浮形式包括已知为膨胀床和纯悬浮液的那些形式，其中颗粒或珠粒可自由移动。如果为整料、填充床或膨胀床，则分离程序通常按照常规的浓度梯度色谱法进行。在纯悬浮液的情况中，使用分批模式。

可通过常规偶联技术利用例如存在于配体中的氨基和/或羧基使配体连接到支持物上。双环氧化物(bisepoxides)、环氧卤丙烷(epihalohydrins)、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等为熟知的偶联试剂。在支持物和配体之间，可引入称为间隔物的分子，其将提高配体的有效性并促进配体化学偶联到支持物上。或者，配体可通过非共价键合连接到支持物上，例如通过物理吸附或生物特异性吸附。基质的配体含量可以为5-15 mg/ml基质，且有利地是5-10 mg/ml。

在一个有利的实施方案中，本发明的配体通过硫醚键偶联到支持物上。用于进行这样的偶联的方法为本领域所熟知，且本领域技术人员使用标准的技术和设备容易实施所述方法。在一个有利的实施方案中，首先要向配体提供末端半胱氨酸残基，以在后续的偶联中使用。本领域技术人员还可容易地进行适当的纯化步骤。

在本发明的某些实施方案中，吸附步骤的条件可为任何常规使用的条件，其根据靶抗体的性质例如其pI被适当调整。用通常使用的缓冲液（例如PBS缓冲液）进行任选的洗涤步骤。

可用任何常规使用的缓冲液进行洗脱。

本发明的方法用于捕获靶抗体，例如抗体的纯化方案中的起始步骤，所述抗体用于例如治疗或诊断用途。在一个实施方案中，回收至少75%的抗体。在一个有利的实施方案中，用针对具体的配体系统的适当pH的洗脱液回收至少80%，例如至少90%，且优选至少95%的抗体。本发明的方法之后可进行一个或多个附加的步骤，例如其他色谱步骤。因此，在一个具体的实施方案中，回收超过约98%的抗体。

如早期所讨论，对于SpA (结构域E、D、A、B、C)或蛋白Z配体，当至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，包含这些突变配体的亲和介质可更好地耐受使用碱性试剂的清洗程序(US 2005/0143566)。增加的稳定性意思是突变蛋白对免疫球蛋白的起始亲和力基本上在长时间内保留。因此其在碱性环境中的结合能力比亲本分子降低的更慢。环境可被定义为碱性，意思是增加的pH值，例如在通常表示的碱性条件下超过约10，例如可达到约13或14，即10-14或10-14。或者，条件可由NaOH的浓度来定义，其可达到约1.0 M，例如0.7 M或特别是约0.5 M，相应地在0.7-1.0 M的范围内。

因此，在所讨论的天冬酰胺突变的存在下对免疫球蛋白的亲和力即本发明配体的结合性质，和由此基质的能力在用碱性试剂处理时基本上没有改变。通常，对于亲和分离基质的原位清洗处理，所用的碱性试剂为NaOH，且其浓度可达到0.75 M，例如0.5 M。因此，在用0.5 M NaOH处理7.5小时后其结合能力将下降至低于约70%，优选低于约50%，且更优选低于约30%，例如约28%。

在另一方面，本发明涉及分离免疫球蛋白的方法，所述免疫球蛋白例如IgG、IgA和/或IgM，其中使用本发明的配体或基质。因此，本发明包括色谱法过程，其中通过吸附到上述的配体或基质上可从液体中分离出至少一种靶化合物。预期的产物可以是分离的化合物或液体。因此，本发明的该方面涉及亲和色谱法，其为广泛使用且熟知的分离技术。简单地说，在起始步骤中，含有靶化合物（优选为上面提到的抗体）的溶液在允许靶化合物吸附到存在于所述基质上的配体的条件下流过分离基质。这样的条件受例如pH和/或盐浓度（即溶液中的离子强度）控制。注意不应超出基质的能力，即流速应足够地慢以充分吸附。在该步骤中，溶液的其他组分将基本上无阻通过。任选的是，然后例如用水溶液洗涤基质，以除掉保留的和/或松散结合的物质。最有利的是，经过中间的洗涤步骤后使用本发明的基质，所述洗涤步骤利用了添加剂例如溶剂、盐或清洁剂或其混合物。在下一步中，将代表洗脱液的第二溶液在提供解吸附作用（即释放靶化合物）的条件下流过基质。通常通过改变pH、盐浓度即离子强度、疏水性等来产生这样的条件。已知多种洗脱流程，例如梯度洗脱和分步洗脱。还可通过包含竞争物的第二溶液来提供洗脱，所述竞争物将取代在基质上所期望的抗体。对于亲和色谱法原理的全面综述，可参见例如Wilchek, M.和Chaiken, I. 2000. 亲和色谱法概述(An overview of affinity chromatography). Methods Mol. Biol. 147: 1-6。

实施例

下面通过实施例的方式描述本发明，其仅仅用于阐明目的，因此不应理解成限制由所附权利要求定义的本发明的范围。下面和本申请别处给出的所有参考文献通过引用而包括于本文中。

实施例1

样品

突变体Z(P57I)2：含有两个各自包含P57I取代的蛋白Z拷贝的配体二聚体(Z(P57I)2) (SEQ ID No. 3)，配体浓度为5.8 mg/ml。

突变体Z(P57I)4：含有四个各自包含P57I取代的蛋白Z拷贝的配体四聚体(Z(P57I)4) (SEQ ID No. 10)，配体浓度为9.7 mg/ml。

突变体C(P57I)2：含有两个各自包含P57I取代的蛋白A的C结构域拷贝的配体二聚体(C(P57I)2) (SEQ ID No. 9)，配体浓度为7.2 mg/ml。

常规的Z2：含有两个蛋白Z (Z2 reg)拷贝的配体二聚体(SEQ ID No. 3但没有P57I取代)，配体浓度为6.1 mg/ml。

将2 ml每种树脂填充到Tricorn 5 100柱中。

蛋白质

165 mg/ml的Gammanorm (Octapharma)，用平衡缓冲液稀释成1 mg/ml。

平衡缓冲液

20 mM的APB磷酸盐缓冲液+0.15 M NaCl，pH 7.4 (Elsichrom AB)。

吸附缓冲液

20 mM的APB磷酸盐缓冲液+0.15 M NaCl，pH 7.4 (Elsichrom AB)。

洗脱缓冲液

0.1 M的APB柠檬酸盐缓冲液，pH 3 (Elsichrom AB)。

CIP

0.1 M的NaOH。

实验详述和结果：

蛋白的诱变

使用编码脯氨酸取代物的寡核苷酸通过PCR进行定点诱变。使用含有Z或C单结构域的质粒作为模板。将PCR片段连接到大肠杆菌(E. coli)表达载体(pGO)中。使用DNA测序来验证插入片段的正确序列。

为形成Z(P57I)和C(P57I)多聚体，使用位于C或Z结构域的起始密码子(GTA GAC)中的Acc I酶切位点，对应于氨基酸VD。将pGO Z(P57I)1和pGO C(P57I)1用Acc I酶消化并用CIP处理。设计特异针对每种变体的Acc I粘末端引物，且从每个模板上产生两个重叠的PCR产物。纯化PCR产物，通过在2%的琼脂糖凝胶上比较PCR产物来估计其浓度。相等量的成对PCR产物在连接缓冲液中杂交(45分钟内90℃

25℃)。得到的产物含有大约1/4的可能连接到Acc I位点的片段（正确的PCR片段和/或经消化的载体）。连接和转化后，克隆经PCR筛选以确定含有Z(P57I)2、Z(P57I)4、C(P57I)2和C(P57I)4的构建体。通过DNA测序验证阳性克隆。

构建体表达与纯化

通过大肠杆菌K12在标准培养基中发酵，构建体在细菌外周胞质中表达。发酵后，热处理细胞以使外周胞质内含物释放到培养基中。通过用0.2 µm孔径的滤膜进行微过滤以回收释放到培养基中的构建体。

将存在于过滤步骤中得到的滤液中的每种构建体进行亲和纯化。将滤液上样到含有固定的IgG的色谱介质上。用磷酸盐缓冲液洗涤负载的产物，并通过降低pH进行洗脱。

调整洗脱集合液至中性，并加入二硫苏糖醇还原。然后将样品上样到阴离子交换柱上。在洗涤步骤之后，用NaCl梯度洗脱构建体以使其从所有的杂质中分离。通过超滤将洗脱集合液浓缩至40-50 mg/ml。

用LC-MS分析纯化的配体以确定纯度和确定分子量与预期（基于氨基酸序列）相一致。

活化

所用的基础基质为刚性交联的85微米平均直径的琼脂糖珠粒（按US6602990的方法制备），具有针对Mw 110 kDa的葡聚糖的孔大小，相当于反相凝胶过滤色谱法Kav值0.7（依据在Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, pp 6-13中所述的方法）。

将25 mL (g)导出的基础基质、10.0 mL蒸馏水和2.02 g NaOH在100 mL烧瓶中混合，于25℃机械搅拌10分钟。加入4.0 mL环氧氯丙烷，反应进行2小时。活化的凝胶用10倍凝胶沉淀物体积(GV)的水洗涤。

偶联

在50 ml 的Falcon管中，向20 mL配体溶液(50 mg/mL)中加入169 mg NaHCO₃、21 mg Na₂CO₃、175 mg NaCl和7 mg EDTA。Falcon管置于摇床中5-10分钟，然后加入77 mg的DTE。还原进行超过45分钟。然后将配体溶液在填充有Sephadex G-25的PD10柱中脱盐。通过测定276 nm的UV吸收来确定脱盐的溶液中的配体含量。

用3-5倍GV的0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA pH 8.6洗涤活化的凝胶，然后根据US6399750中所述的方法偶联配体。实验中使用的所有缓冲液用氮气脱气至少5-10分钟。

固定化之后，用3倍GV的蒸馏水洗涤凝胶。将凝胶与1倍GV的0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA/10%硫代甘油pH 8.6混合，将管置于室温下摇床中过夜。然后用3倍GV的0.1 M TRIS/0.15 M NaCl pH 8.6和0.5 M的HAc交替洗涤凝胶，然后用8-10倍GV的蒸馏水洗涤。将凝胶样品送至外部实验室对氨基酸进行分析，且从总氨基酸含量中计算配体含量(mg/ml凝胶)。

能力确定

用ÄKTAExplorer 10系统以按标准的2.4和6分钟的保留时间确定临界点能力(breakthrough capacity)。吸附缓冲液流过旁通柱直到获得稳定的基线。在自动零位调整之前进行上述操作。施加样品到柱上直到获得100%的UV信号。然后再次施加吸附缓冲液直到获得稳定的基线。

在上样前用吸附缓冲液平衡柱，直到达到85%最大吸光度的UV信号。然后用吸附缓冲液以0.5 ml/min的流速洗涤柱，直到达到20%最大吸光度的UV信号。用10倍CV的洗脱缓冲液以0.5 ml/min的流速洗脱蛋白质。然后用0.1 M的NaOH以0.5 ml/min的流速清洗柱，且在用20%的乙醇清洗之前用吸附缓冲液再次平衡。最后一步是通过上样流过旁通柱直到获得100%的UV信号来核查样本浓度。

为计算在10%的临界点能力，使用下面的公式。其为上样到柱中直到柱流出液中IgG的浓度为进料的IgG浓度的10%时IgG的量。

A_100% = 100% UV信号；

A_sub = 非结合IgG亚类的吸光度贡献；

A(V) = 给定的施用体积的吸光度；

V_c = 柱体积；

V_app = 直到10%临界点的施用体积；

V_sys = 系统的死体积；

C₀ = 进料浓度。

典型的动力学结合能力趋势如图3所示。计算10%临界点的动力学结合能力(DBC)并且研究了曲线的表观。还研究曲线关于结合、洗脱和CIP峰。

计算5、10和80%临界点的动力学结合能力(DBC)。结果如表1所示。与亲本P57配体相比较，具有P57I取代的配体观察到更高能力。

表1：结果汇总。

以上实施例阐明本发明的具体方面，且不意味着限制其在任何方面的范围也不应这样解释。受益于上述本发明教导的本领域技术人员可对其进行众多修改。这些修改被认为包括在所附的权利要求中所述的本发明的范围内。还理解可以组合不同实施方案的特征。

Claims

1.从液体中分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法，所述方法包括：

(a) 使所述液体与含有固定在支持物上的配体的分离基质接触；

(b) 通过与配体相互作用，使所述含有免疫球蛋白的蛋白质吸附到基质上；

(c) 洗涤被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白质的任选步骤；

(d) 通过使基质与释放蛋白质的洗脱液接触回收所述含有免疫球蛋白的蛋白质；

改进之处在于每种所述的配体含有一个或多个葡萄球菌蛋白A (SpA)的结构域(单体) (E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性变体，其中在至少一个结构域中最接近C末端的脯氨酸被取代为任何其他的氨基酸。

2.权利要求1的方法，其中所述的一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z为两个或更多个来自相同结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的拷贝。

3.权利要求1的方法，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z为两个或更多个选自结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的结构域。

4.权利要求1的方法，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z选自结构域B、结构域C或蛋白Z。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中在多聚体配体的至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为其他的氨基酸。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中在多聚体配体的所有单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为其他的氨基酸。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为选自Y、W、F、M、I、V、T的氨基酸。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为异亮氨酸。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为选自E、A、L、H、M、Q、K的氨基酸。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体通过将至少一个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而具有碱稳定性。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体具有对免疫球蛋白的Fc部分的亲和力，但缺乏对免疫球蛋白的Fab部分的亲和力。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体的至少一个甘氨酸被取代为丙氨酸。

13.权利要求11或12的方法，其中对应于蛋白A的B结构域的第29位的甘氨酸残基被替换为丙氨酸。

14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体为蛋白Z，其中通过将至少一个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而获得碱稳定性。

15.权利要求14的方法，其中通过将至少第23位的天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而获得蛋白Z的碱稳定性。

16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多聚体为二聚体。

17.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多聚体为四聚体。

18.前述权利要求中任一项的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白质为单克隆抗体。

19.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白质为多克隆抗体。

20.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白质为含有与其他蛋白质融合的免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白。

21.用于分离含有免疫球蛋白的蛋白质的配体，所述配体包含一个或多个葡萄球菌蛋白A (SpA)的结构域(单体) (E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性变体，其中在至少一个结构域中最接近C末端的脯氨酸被取代为任何其他氨基酸。

22.权利要求21的配体，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z为两个或更多个来自同样的结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的拷贝。

23.权利要求1的配体，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z为两个或更多个选自结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的结构域。

24.权利要求1的配体，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z选自结构域B、结构域C或蛋白Z。

25.权利要求21-24中任一项的配体，其中在多聚体配体的至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代成其他氨基酸。

26.权利要求21-25中任一项的配体，其中在多聚体配体的所有单体中最接近C末端的脯氨酸被取代成其他氨基酸。

27.权利要求21-26中任一项的配体，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为选自Y、W、F、M、I、V、T的氨基酸。

28.权利要求21-27中任一项的配体，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代成异亮氨酸。

29.权利要求21-28中任一项的配体，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为选自E、A、L、H、M、Q、K的氨基酸。

30.权利要求21-29中任一项的配体，其中所述配体通过将至少一个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而具有碱稳定性。

31.权利要求21-30中任一项的配体，其中所述配体具有对免疫球蛋白的Fc部分的亲和力，而缺乏对免疫球蛋白的Fab部分的亲和力。

32.权利要求21-31中任一项的配体，其中所述配体的至少一个甘氨酸被取代成丙氨酸。

33.权利要求31或32的配体，其中对应于蛋白A的B结构域的第29位的甘氨酸残基被替换成丙氨酸。

34.权利要求21-33中任一项的配体，其中所述配体为蛋白Z，其中通过将至少一个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而获得碱稳定性。

35.权利要求34的配体，其中通过将至少第23位的天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而获得蛋白Z的碱稳定性。

36.权利要求21-35中任一项的配体，其中所述多聚体为二聚体或四聚体。

37.包含至少一个权利要求21-36中任一项的配体的分离基质，所述配体被偶联在固体支持物上。

38.权利要求37的分离基质，其中所述固体支持物包括多糖，例如琼脂或琼脂糖。

39.权利要求37-38中任一项的分离基质，其中所述固体支持物是交联的。

40.权利要求37-39中任一项的分离基质，其中所述配体通过硫醚键偶联。

41.权利要求37-40中任一项的分离基质，其中所述基质的配体含量为5-15 mg/ml，例如5-10 mg/ml。