ES2710204T3 - Matrices de cromatografía que incluyen nuevos ligandos basados en la proteína A de Staphylococcus aureus - Google Patents

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Abstract

Una matriz de cromatografía de afinidad que comprende un soporte sólido con un ligando de cromatografía de afinidad que comprende bien uno o más dominios B de la Proteína A de Staphylococcus aureus (SpA) con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO.: 3 o codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO.: 9, o uno o más dominios Z de SpA con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO.: 6 o codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO.: 12, en donde al menos uno del uno o más dominios está mutado para delecionar tres, cuantro o cinco aminoácidos consecutivos del extremo N, empezando en la posición 1 o en la posición 2 de la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO.:6; en la que el ligando presenta una fragmentación reducida respecto a un equivalente de tipo salvaje, después de la exposición a NaOH 0,5M durante al menos 5 horas.

Description

DESCRIPCION
Matrices de cromatograffa que incluyen nuevos ligandos basados en la protema A de Staphylococcus aureus Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a matrices de cromatograffa que incluyen ligandos basados en uno o mas dominios de protemas de union a inmunoglobulinas tales como, la Protema A de Staphylococcus aureus (SpA) asf como a metodos para usar las mismas.
Antecedentes
El documento WO 2012/074463 A1 se refiere a una matriz de cromatograffa de afinidad. Los ligandos usados en cromatograffa de afinidad confieren ffpicamente una alta selectividad para la molecula diana, dando de esta manera como resultado un alto rendimiento, alta pureza y purificacion rapida y economica de las moleculas diana. Los reactivos y matrices de cromatograffa basados en la Protema A de Staphylococcus aureus han encontrado un uso amplio en el campo de la cromatograffa de afinidad para la captura y purificacion de anticuerpos y protemas que contienen Fc, asf como en metodos de deteccion de anticuerpos a escala anafftica debido a su capacidad de unirse a IgG, sin afectar significativamente la afinidad de la inmunoglobulina para el anffgeno.
De acuerdo con esto, se han desarrollado varios reactivos y medios que comprenden ligandos de Protema A y estan disponibles comercialmente, por ejemplo, ProSep®-vA High Capacity, ProSep® vA Ultra y ProSep® UltraPlus (MILLIPORE) y Protein A Sepharose™, MabSelect™, MabSelect Xtra™, MabSelect SuRe™ (GE HEALTHCARE), MabSelect SuRe™ LX y Poros MabCapture A™ (LIFE TECHNOLOGIES).
Con el fin de mantener la selectividad de los ligandos de cromatograffa incluyendo los ligandos unidos a soportes solidos tales como matrices de cromatograffa unidas a SpA, las matrices deben limpiarse y se limpian ffpicamente en condiciones acidas o alcalinas, p. ej., con hidroxido de sodio (NaOH). Por ejemplo, un proceso estandar que se usa para limpiar y restaurar la matriz es un protocolo alcalino de limpieza "in situ" ("cleaning-in-place") (CIP), que implica ffpicamente el tratamiento de la matriz con ligando unido con una concentracion de NaOH que vaffa de 0,05M a 1M, dando como resultado un intervalo de pH de 12,7 a 14,0. Tfpicamente, la exposicion de una matriz de cromatograffa de afinidad a ciclos repetidos de CIP da como resultado una perdida significativa de la capacidad de union de la matriz para una molecula diana con el tiempo, lo que requiere el uso de una mayor cantidad a lo largo del proceso de ligandos frecuentemente muy costosos que se unen a las matrices. Esto es tanto poco rentable como indeseable ya que da como resultado que el proceso de purificacion se vuelva mas costoso, asf como duradero. Compendio de la invencion
En la tecnica se han descrito previamente matrices de cromatograffa basadas en la Protema A que parece que muestran una perdida reducida de la capacidad de union para una molecula diana despues de tratamiento con condiciones alcalinas. Vease, p. ej., la Publicacion de Patente U.S. No. 20100221844, que describe matrices de cromatograffa de afinidad que incorporan los dominios B o Z de tipo salvaje (wt) de SpA con union de multiples puntos a la matriz, que muestran hasta el 95% de la capacidad de union inicial incluso despues de la exposicion a NaOH 0,5M durante 5 horas o mas. Tambien, la Publicacion de la Patente U.S. No. 20100048876 describe una matriz de cromatograffa que incorpora el dominio C de tipo salvaje de SpA asf como un dominio C que contiene una delecion de los residuos de aminoacidos 3 a 6, que parece mostrar hasta el 95% de la capacidad de union inicial despues de la exposicion a 0,5M durante aproximadamente 5 horas. Estos ligandos se inmovilizan a traves de un unico punto de union dirigido por cistema a la matriz. Ademas, se han descrito matrices de cromatograffa que incorporan dominios de la Protema A que contienen mutaciones en uno o mas residuos de asparagina de la protema, en el que las matrices parecen mostrar una perdida reducida en la capacidad de union respecto a SpA de tipo salvaje, despues de la exposicion a condiciones alcalinas y parece que estan inmovilizados a traves de la union de un unico punto a la matriz. Vease, p. ej., la Patente U.S. No. 6.831.161.
Aunque las matrices de cromatograffa de afinidad mencionadas anteriormente parecen mostrar una perdida reducida en la capacidad de union para una molecula diana despues de la exposicion a condiciones causticas, algunas de estas matrices parecen mostrar un alto grado de fragmentacion del ligando, p. ej., como se observa usando SDS-PAGE y/o cromatograffa de exclusion por tamano (SEC), despues de la exposicion a condiciones causticas. Dicha fragmentacion es indeseable, ya que un alto grado de fragmentacion del ligando da como resultado que esten presentes fragmentos mas pequenos de los ligandos que son mas diffciles de eliminar y separar de la molecula diana, incrementando de esta manera la probabilidad de que dichos fragmentos potencialmente inmunogenicos se co-purifiquen con la molecula diana terapeutica. Ademas, un alto grado de fragmentacion da como resultado una perdida incrementada en la capacidad de union de la matriz para una molecula diana.
La presente invencion proporciona matrices de cromatograffa de afinidad en las que los ligandos se basan en uno o mas dominios B o dominios Z de la Protema A de Staphylococcus aureus (SpA) como se define en las reivindicaciones. Estos ligandos y matrices muestran una fragmentacion reducida durante el uso de la purificacion, como se pone de manifiesto por tecnicas de SDS-PAGE y/o SEC, respecto a algunos de los ligandos descritos previamente, convirtiendolas de esta manera en candidatos mas atractivos y economicos para uso en cromatograffa de afinidad.
En un aspecto segun la presente invencion se proporcionan matrices de cromatograffa de afinidad que incluyen uno o mas dominios B de SpA que tienen una delecion o uno o mas dominios Z de SpA que tienen una delecion, en el que el uno o mas dominios estan unidos a un soporte solido.
En una realizacion una matriz de cromatograffa de afinidad segun la presente invencion incluye un ligando unido a un soporte solido, en el que el ligando comprende uno o mas dominios B de la Protema A de Staphylococcus aureus (SpA), en el que al menos un dominio B comprende una delecion de al menos 3 aminoacidos consecutivos del extremo N. Se describe una matriz de cromatograffa de afinidad que comprende un ligando unido a un soporte solido, en el que el ligando comprende uno o mas dominios C de protema A de Staphylococcus aureus (SpA), donde al menos un dominio C comprende una delecion de al menos 3 aminoacidos consecutivos del N-terminal.
Aun en otra realizacion una matriz de cromatograffa de afinidad segun la presente invencion comprende un ligando unido a un soporte solido, en donde el ligando comprende uno o mas dominios Z de la Protema A de Staphylococcus aureus (SpA), en el que al menos un dominio Z comprende una delecion de al menos 3 aminoacidos consecutivos del extremo N.
Se describe una matriz de cromatograffa de afinidad que comprende un ligando unido a un soporte solido, en el que el ligando comprende dos o mas dominios B, dos o mas dominios C o dos o mas dominios Z, o cualquier combinacion de dominios B, C y Z, en el que al menos uno del dominio B, C o Z comprende una delecion de al menos 3 aminoacidos consecutivos del extremo N.
En varias realizaciones segun la presente invencion, mas de un sitio en cada ligando esta unido a un soporte solido (es decir, union de multiples puntos).
En varias realizaciones segun la presente invencion, el ligando presenta una fragmentacion reducida, segun se determina por SDS-PAGE o por cromatograffa de exclusion por tamano (SEC), respecto a su equivalente wt, despues de la exposicion del ligando o la matriz que contiene el ligando a NaOH 0,5M durante al menos 5 horas. En algunas realizaciones segun la presente invencion, el ligando comprende una delecion de 3 aminoacidos del extremo N, una delecion de 4 aminoacidos del extremo o una delecion de 5 aminoacidos del extremo N, en el que mas de un sitio en el ligando esta unido a un soporte solido, para formar de esta manera una matriz de cromatograffa de afinidad.
Se describe en donde un ligando tiene una secuencia de aminoacidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO:13-42, SEQ ID NO:55-84 y SEQ ID NO: 93-94.
En otra realizacion un ligando segun la presente invencion tiene la siguiente estructura: [(X)n, (Y)m]n+m, en la que X representa un dominio B o un dominio Z de SpA, n representa el numero de dominios que vana de cero a (m-1), Y representa un dominio Bo un dominio Z de SpA que tiene al menos 3 aminoacidos consecutivos delecionados del extremo N y m representa el numero de dominios Y que vana de uno a ocho, en el que mas de un sitio en el ligando esta unido a un soporte solido (p. ej., una matriz de cromatograffa).
En algunas realizaciones segun la presente invencion, el ligando comprende dos dominios B o dos dominios Z de SpA, o un dominio B y uno C, o un dominio B y un dominio Z, o un dominio C y uno Z, en el que al menos un dominio B o al menos un dominio Z incluye una delecion de tres aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cuatro aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cinco aminoacidos consecutivos del extremo N. Se entiende que los distintos dominios pueden estar dispuestos en cualquier orden.
En otra realizacion, un ligando segun la presente invencion comprende tres dominios B o tres dominios Z, o cualquier combinacion de dominios B, C o Z en cualquier orden, en el que al menos un dominio B o al menos un dominio Z comprende una delecion de tres aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cuatro aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cinco aminoacidos consecutivos del extremo N.
En otra realizacion mas, un ligando segun la presente invencion comprende cuatro dominios B o cuatro dominios Z o cualquier combinacion de dominios B, Z o C en cualquier orden, en el que al menos un dominio B o al menos un dominio Z comprende una delecion de tres aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cuatro aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cinco aminoacidos consecutivos del extremo N.
Aun en otra realizacion, un ligando segun la presente invencion comprende 5 dominios B o cinco dominios Z o cualquier combinacion de dominios B, Z o C en cualquier orden, donde al menos un dominio B o al menos un dominio Z comprende una delecion de tres aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cuatro aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cinco aminoacidos consecutivos del extremo N.
En otra realizacion mas, un ligando segun la presente invencion comprende seis dominios B o seis dominios Z o cualquier combinacion de dominios B, Z o C en cualquier orden, en el que al menos un dominio B o al menos un dominio Z comprende una delecion de tres aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cuatro aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cinco aminoacidos consecutivos del extremo N.
Aun en otra realizacion, un ligando segun la presente invencion comprende siete dominios B o siete dominios Z o cualquier combinacion de dominios B, Z o C en cualquier orden, en el que al menos un dominio B o al menos un dominio Z comprende una delecion de tres aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cuatro aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cinco aminoacidos consecutivos del extremo N.
En otra realizacion mas, un ligando segun la presente invencion comprende ocho dominios B u ocho dominios Z o cualquier combinacion de dominios B, Z o C en cualquier orden, en el que al menos un dominio B o al menos un dominio Z comprende una delecion de tres aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cuatro aminoacidos consecutivos del extremo N o una delecion de cinco aminoacidos consecutivos del extremo N.
Adicionalmente, en la presente memoria se proporcionan metodos para usar matrices de cromatograffa de afinidad. De acuerdo con esto, se proporciona un metodo para purificar por afinidad una o mas moleculas diana (p. ej., inmunoglobulinas o protemas que contienen Fc) de una muestra, en el que el metodo comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra que comprende una o mas moleculas diana (p. ej., inmunoglobulinas o protemas que contienen Fc); (b) poner en contacto la muestra con una matriz segun la invencion en condiciones tales que la una o mas moleculas diana (p. ej., inmunoglobulinas o protemas que contienen Fc) se unan a la matriz; y (c) recuperar la una o mas moleculas diana (p. ej., inmunoglobulinas o protemas que contienen Fc) unidas mediante la elucion en condiciones adecuadas tales como, por ejemplo, un pH adecuado.
En algunas realizaciones, una matriz de cromatograffa de afinidad segun la presente invencion retiene al menos el 95% de su capacidad de union inicial para una molecula diana despues de 5 horas o despues de 10 horas o despues de 15 horas o despues de 20 horas o despues de 25 horas o despues de 30 horas de incubacion en NaOH 0,5 M.
En una realizacion particular, una matriz de cromatograffa de afinidad segun la presente invencion retiene al menos el 95% de su capacidad de union inicial despues de 5 horas de incubacion en NaOH 0,5M.
En otra realizacion mas, una matriz de cromatograffa de afinidad segun la presente invencion retiene al menos el 95% de su capacidad de union inicial para una molecula diana despues de 25 horas de incubacion en NaOH 0,1 M; al menos el 85% de su capacidad de union inicial para una molecula diana despues de 25 horas de incubacion en NaOH 0,3M; o al menos el 65% de su capacidad de union inicial para una molecula diana despues de 25 horas de incubacion en NaOH 0,5M.
Las inmunoglobulinas que con capaces de ser unidas por los distintos ligandos descritos en la presente memoria incluyen, p. ej., IgG, IgA e IgM, o cualquier protema de fusion que comprende un anticuerpo y cualquier fragmento de anticuerpo, que sea capaz de unirse a SpA.
En la presente memoria tambien se proporcionan moleculas de acido nucleico que codifican los distintos ligandos descritos en la presente memoria, asf como celulas huesped que incluyen dichas moleculas de acido nucleico. En algunas realizaciones, una celula huesped es una celula procariota. En otras realizaciones, una celula huesped es una celula eucariota.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona matrices de cromatograffa de afinidad basadas en SpA que presentan una union alterada (incrementada o disminuida) a una parte Fab de una inmunoglobulina comparado con los ligandos de SpA wt, mientras retienen la capacidad de union a la parte Fc de la inmunoglobulina. En una realizacion, una matriz basada en SpA segun la presente invencion presenta una union disminuida a una parte Fab de una inmunoglobulina comparado con SpA wt. En una realizacion particular, una matriz de cromatograffa incorpora un ligando de SpA, que incluye una lisina en la posicion 29, en lugar de una glicina (en el caso de los dominios B y C de SpA) o en lugar de una alanina (en el caso del dominio Z de SpA).
Las distintas realizaciones de la invencion pueden combinarse conjuntamente a no ser que sea tecnicamente incompatible.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 representa los alineamientos de las secuencias de aminoacidos para los dominios de union a IgG de tipo salvaje (wt) de SpA asf como el dominio Z, representado por las SEQ ID NO:1-6.
La FIG. 2 representa diagramas esquematicos del plasmido pET11a que contiene la secuencia de acido nucleico que codifica el ligando del dominio Z dimerico con una mutacion A29K, la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:85 (control) y el plasmido pET11a que contiene la secuencia de acido nucleico que codifica el ligando del dominio Z dimerico con una mutacion A29K, asf como el segundo dominio que incluye una delecion de 4 consecutivos del extremo N, la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:78. Las construcciones de ligando incluyen ademas una secuencia de etiqueta His en el extremo 3'.
La Figura 3 es un gel de SDS-PAGE tenido con Coomassie para analizar el patron de fragmentacion de ligandos Z y C dimericos libres e inmovilizados con o sin empape caustico en NaOH 0,5M durante 25 hrs. La descripcion de los distintos Carriles del gel de SDS-PAGE es como sigue. Carril 1: marcador molecular; Carril 2: ligando del dominio Z dimerico sin exposicion caustica (A29K sin deleciones, mostrado en la SEQ ID NO:85, que se usa como el control e incluye una etiqueta His); Carril 3: el control del ligando del dominio Z dimerico sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas; Carril 4: el control del ligando del dominio Z dimerico inmovilizado en una resina de cromatograffa de agarosa, que se somete a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas; Carril 5: el ligando del dominio Z dimerico que tiene una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N del segundo dominio (A29K con el segundo dominio que tiene una delecion, mostrado en la SEQ ID NO:78 y una etiqueta His) sin exposicion caustica; Carril 6: el ligando del dominio Z dimerico de la SEQ ID NO:78 con una etiqueta His sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas; Carril 7: el ligando del dominio Z dimerico de la SEQ ID NO:78 con una etiqueta His inmovilizado en una resina de cromatograffa de agarosa y sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas; Carril 8: ligando del dominio C dimerico sin deleciones usado como un control (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:92 que ademas tiene una etiqueta His) sin exposicion caustica; Carril 9: el control del ligando del dominio C dimerico sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas; Carril 10: el ligando del dominio C dimerico inmovilizado en una resina de cromatograffa de agarosa y sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas; Carril 11: el ligando del dominio C dimerico que tiene una delecion del extremo N del segundo dominio (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:35 que ademas tiene una etiqueta His); Carril 12: el ligando del dominio C dimerico de la SEQ ID NO:35 mas una etiqueta His sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas; y Carril 13: el ligando del dominio C dimerico de la SEQ ID NO:35 mas una etiqueta His inmovilizado en una resina de cromatograffa de agarosa y sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas.
La Figura 4 es un cromatograma de un analisis SEC de los ligandos de Z y C dimericos resumidos en la descripcion de la Figura 3 anterior. El eje de las x indica el tiempo de retencion en minutos teniendo las moleculas mas pequenas un mayor tiempo de retencion que el de una molecula mayor. El eje de las y representa la absorcion UV a 280 nm en mAU. La evidencia de una fragmentacion reducida para los ligandos de los dominios Z y C dimericos que tienen una delecion en el extremo N en el segundo dominio, despues de un empape caustico prolongado (es decir, empape en NaOH 0,5M durante 25 horas) se muestra mediante cajas en el cromatograma y la presencia de fragmentos mas pequenos para los controles de los dominios Z y C dimericos se muestra mediante flechas.
La Figura 5 es un gel de SDS-PAGE tenido con Coomassie para analizar el patron de fragmentacion tanto de los ligandos del dominio Z pentamerico libres como inmovilizados con o sin empape caustico en NaOH 0,5M durante 25 horas. La descripcion de los distintos carriles del gel de SDS-PAGE es como sigue: Carril 1: marcador de peso molecular; Carril 2: el ligando del dominio Z pentamerico tiene la mutacion A29K y una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N de todos excepto el primer dominio, cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:84, sin exposicion caustica; Carril 3: el ligando del dominio Z pentamerico de la SEQ ID NO:84 sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas; Carril 4: el ligando del dominio Z pentamerico de la SEQ ID NO:84 inmovilizado en una resina de cromatograffa de agarosa y sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas. Carril 5: el ligando del dominio Z pentamerico de la SEQ ID NO:91, usado como un control, que no se somete a empape caustico; Carril 6: el control del ligando del dominio Z pentamerico sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas; y Carril 7: el control del ligando del dominio Z pentamerico inmovilizado en una resina de cromatograffa de agarosa y sometido a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas. Ademas, los carriles 8, 9 y 10 se refieren a los resultados observados cuando se somete rSPA a un tratamiento similar, en el que el Carril 8 representa rSPA que no se somete a ningun empape caustico; el Carril 9 representa rSPA sometida a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas y rSPA inmovilizada sometida a empape en NaOH 0,5M durante 25 horas. Las bandas representan la fragmentacion, como se representa por flechas.
La Figura 6 es un cromatograma de un analisis SEC de los ligandos del dominio Z pentamericos resumidos en la descripcion de la Figura 5 anterior. El eje de las x indica el tiempo de retencion en minutos teniendo las moleculas mas pequenas un mayor tiempo de retencion que el de una molecula mayor. El eje de las y representa la absorcion UV a 280 nm en mAU. La evidencia de una fragmentacion reducida en el caso de los ligandos del dominio Z pentamericos que tiene una delecion N-terminal en todos excepto en el primer dominio, despues de un empape caustico prolongado, se muestra mediante cajas en el cromatograma y la presencia de fragmentos mas pequenos observada con el control del dominio Z pentamerico se muestra mediante una flecha que apunta a los fragmentos. Ademas, la cantidad extensa de fragmentacion observada para rSPA tambien puede observarse usando SEC.
La Figura 7 es un cromatograma de un analisis SEC de los ligandos del dominio Z pentamericos inmovilizados resumidos en la descripcion de la Figura 5 anterior. El eje de las x indica el tiempo de retencion en minutos teniendo las moleculas mas pequenas un mayor tiempo de retencion que el de una molecula mayor. El eje de las y representa la absorcion UV a 280 nm en mAU. La evidencia de una fragmentacion reducida en el caso del ligando del dominio Z pentamerico inmovilizado que tiene una delecion N-terminal en el segundo dominio, despues de un empape caustico prolongado, se muestra mediante una caja en el cromatograma y la presencia de fragmentos mas pequenos observada con el control del dominio Z pentamerico se muestra mediante una flecha que apunta a los fragmentos. Ademas, la cantidad extensa de fragmentacion observada para rSPA inmovilizada tambien puede observarse usando SEC.
La Figura 8 es un cromatograma de un analisis SEC de los ligandos del dominio Z dimericos libres despues de un empape caustico prolongado, en el que los ligandos incluyen una delecion en el extremo N del primero (SEQ ID NO:87), de los dos primeros (SEQ ID NO:88), de los tres primeros (SEQ ID NO:69) o de los cuatro primeros (SEQ ID NO:78) del segundo dominio de los ligandos dimericos. El eje de las x indica el tiempo de retencion en minutos teniendo las moleculas mas pequenas un mayor tiempo de retencion que el de una molecula mayor. El eje de las y representa la absorcion UV a 280 nm en mAU. La evidencia de una fragmentacion reducida en el caso de los ligandos dimericos que tienen los tres primeros o los cuatro primeros aminoacidos delecionados del extremo N del segundo dominio despues de un empape caustico prolongado se indica por cajas. La presencia de fragmentacion observada despues de un empape caustico prolongado de los ligandos dimericos que no tienen deleciones de aminoacidos (SEQ ID NO:85) o el primer aminoacido delecionado o los primeros dos aminoacidos delecionados del extremo N del segundo dominio, se muestra mediante flechas que apuntan a la presencia de fragmentos en el cromatograma.
La Figura 9 compara las capacidades de union retenidas de los ligandos pentamericos del dominio C inmovilizados despues de exposicion caustica repetida, en el que un ligando pentamerico incluye una delecion en el extremo N de 4 aminoacidos en cada dominio, la mutacion G29K en cada dominio asf como una alanina como el primer aminoacido en el pentamero (la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:93); y siendo el otro ligando pentamerico su equivalente wt con la mutacion G29 K (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:95). El eje de las x representa el tiempo de exposicion acumulativa de las matrices de cromatograffa a NaOH 0. 7M durante 16 ciclos de 30 mins cada uno. El eje de las y representa el porcentaje de capacidad de union retenida.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona matrices de cromatograffa de afinidad que incorporan ligandos basados en uno o mas dominios B o Z de SpA, en el que los ligandos, bien solos o cuando se inmovilizan en una matriz, muestran una fragmentacion reducida durante el uso en procesos de purificacion, respecto a los dominios wt correspondientes de SpA.
Los ligandos de cromatograffa basados en SpA ejemplares descritos previamente incluyen, por ejemplo, los descritos en la Publicacion de Patente U.S. No. 20100221844, que describe matrices de cromatograffa que incorporan dominios B y Z de tipo salvaje de SpA, en los que mas de un sitio en el ligando esta unido a una matriz de cromatograffa (es decir, union de multiples puntos); los descritos en la Publicacion de Patente U.S. No.
20100048876, que discute ligandos de cromatograffa basados en el domino C wt de SpA, que son capaces de unirse a las partes Fab de algunos anticuerpos y se acoplan a un vehmulo insoluble en un unico sitio usando un grupo de acoplamiento terminal; y los descritos en la Patente U.S. No. 6.831.161, que discute ligandos de cromatograffa alcalinos basados en SpA en los que se ha modificado uno o mas residuos del aminoacido asparagina.
Como se ha discutido anteriormente, aunque estos ligandos presentan una perdida reducida en la capacidad de union despues de la exposicion a condiciones alcalinas, algunos de estos ligandos muestran fragmentacion durante el uso en los procesos de purificacion, p. ej., los ligandos descritos en la Publicacion U.S. No. 20100221844, lo que es altamente indeseable. Los ligandos descritos en la presente memoria, por otra parte, son candidatos mucho mas atractivos para la purificacion de protemas comparados con los ligandos descritos previamente, ya que muestran una fragmentacion reducida despues de la exposicion a condiciones alcalinas durante los protocolos de regeneracion y limpieza "in situ" (CIP) que se usan rutinariamente en los procesos de purificacion de protemas. Con el fin de que la presente descripcion pueda entenderse mas facilmente, en primer lugar se definen determinados terminos. Las definiciones adicionales se muestran a lo largo de la descripcion detallada.
1. Definiciones
Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "SpA", "Protema A" o "Protema A de Staphylococcus aureus", se refiere a una protema con multiples dominios de 42Kda aislada de la bacteria Staphylococcus aureus. SpA esta unida a la pared celular bacteriana a traves de su region de union a la pared celular carboxi-terminal, referida como el dominio X. En la region amino-terminal, incluye cinco dominios de union a inmunoglobulina, referidos como E, D, A, B y C (Sjodhal, Eur J Biochem. Sep 78(2):471-90 (1977); Uhlen et al., J Biol Chem. Feb 259(3):1695-702 (1984). Cada uno de estos dominios contiene aproximadamente 58 residuos de aminoacidos y comparten el 65-90% de identidad en la secuencia de aminoacidos.
Cada uno de los dominios E, D, A, B y C de SpA posee distintos sitios de union a Ig. Un sitio es para Fcy (la region constante de la clase IgG de Ig) y el otro es para la parte Fab de determinadas moleculas de Ig (la parte de la Ig que es responsable del reconocimiento del anffgeno). Se ha reportado que cada uno de los dominios contiene un sitio de union a Fab. La parte que no se une a Ig de SpA esta localizada en el extremo C y se designa como la region X o dominio X.
El dominio Z de SpA es un analogo preparado por ingenieffa del dominio B de SpA e incluye una valina en lugar de una alanina en la posicion 1 y una alanina en lugar de un residuo de glicina en la posicion 29 (Nilsson, et al., Protein engineering, Vol. 1, No. 2, 107-113, 1987.).
La clonacion del gen que codifica SpA se describe en la Patente U.S. No. 5.151.350.
La presente invencion proporciona matrices de cromatograffa de afinidad que incorporan ligandos basados en SpA, en el que los ligandos (tanto ligandos libres, asf como inmovilizados) presentan una fragmentacion reducida, como se observa por SDS-PAGE y SEC, despues de los protocolos de regeneracion y CIP que se usan rutinariamente durante el proceso de purificacion de protemas.
Se describe en donde un ligando de afinidad comprende uno o mas dominios B o uno o mas dominios Z o uno o mas dominios C, o cualesquiera combinaciones de estos, en los que al menos un dominio B o al menos un dominio Z o al menos un dominio C comprende una delecion de 3 aminoacidos consecutivos del extremo N, o 4 aminoacidos consecutivos del extremo N o 5 aminoacidos consecutivos del extremo N, empezando en la posicion 1 o en la posicion 2.
En algunas realizaciones segun la presente invencion, mas de un sitio de un ligando de afinidad esta unido a una matriz de cromatograffa (es decir, union de multiples puntos). En una realizacion particular la presente invencion proporciona una matriz de cromatograffa de afinidad que comprende uno o mas dominios B de SpA unidos a una matriz de cromatograffa, en el que mas de un sitio del ligando esta unido a la matriz y en el que al menos un dominio B tiene una delecion de 3 aminoacidos consecutivos del extremo N o 4 aminoacidos consecutivos del extremo N o 5 aminoacidos consecutivos del extremo N, empezando en la posicion 1 o en la posicion 2 de la secuencia del dominio B wt.
En otroa realizacion, la presente invencion proporciona una cromatograffa de afinidad que comprende uno o mas dominios Z de SpA unidos a una matriz de cromatograffa, en el que mas de un sitio del ligando esta unido a la matriz y en el que al menos un dominio Z tiene una delecion de 3 aminoacidos consecutivos del extremo N o 4 aminoacidos consecutivos del extremo N o 5 aminoacidos consecutivos del extremo N, empezando en la posicion 1 o en la posicion 2 de la secuencia del dominio Z wt.
Tambien se describe en donde una matriz de cromatograffa de afinidad que comprende uno o mas dominios C de SpA unidos a una matriz de cromatograffa, en el que mas de un sitio del ligando esta unido a la matriz y en el que al menos un dominio C tiene una delecion de 3 aminoacidos consecutivos del extremo N o 4 aminoacidos consecutivos del extremo N o 5 aminoacidos consecutivos del extremo N, empezando en la posicion 1 o en la posicion 2 de la secuencia del dominio C wt.
Tambien se describe en donde un ligando de cromatograffa de afinidad estable en condiciones alcalinas que incluye cinco dominios C de SpA, incluyendo cada dominio una mutacion G29K, asf como 4 aminoacidos delecionados del extremo N, empezando en la posicion 1, e incluyendo la forma pentamerica una alanina extra como el primer aminoacido para facilitar el procesado homogeneo posterior a la traduccion de la protema.
En algunas realizaciones, los ligandos SpA descritos en la presente memoria incluyen ademas el residuo del aminoacido glicina en la posicion 29 reemplazado por un residuo del aminoacido lisina (en el caso de los dominios B y C) o el residuo del aminoacido alanina en la posicion 29 reemplazado por un residuo del aminoacido lisina (en el caso del dominio Z).
El termino "molecula parental" o "equivalente de tipo salvaje (wt)" o "protema wt" o "dominio wt", tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que se refiera a una protema (SpA) o un dominio de una protema (p. ej., dominios B, Z o C de SpA) correspondiente en su forma sustancialmente nativa, que se usa generalmente como un control en la presente memoria. Un control equivalente wt, tal y como se usa en la presente memoria, que corresponde a un dominio de SpA en su forma sustancialmente nativa puede incluir un cambio de aminoacido del dominio de SpA correspondiente para alterar la union a Fab; sin embargo, es de otra manera identico en secuencia al dominio wt correspondiente. Los ligandos segun la presente invencion presentan una fragmentacion reducida (en el caso tanto de las formas libres como inmovilizadas) respecto a sus equivalentes wt (es decir, completamente wt o que incluyen una mutacion para alterar la union a Fab), como se pone de manifiesto por los experimentos discutidos en los Ejemplos de la presente memoria. El equivalente wt de un ligando basado en un dominio B o un dominio C es el dominio B wt de SpA o el dominio C wt de SpA, cuyas secuencias de aminoacidos se muestran en la SEQ ID NO:3 y en la SEQ iD NO:4, respectivamente. En determinadas realizaciones, un equivalente wt de un ligando basado en un dominio Z es la secuencia de aminoacidos del dominio Z mostrada en la SEQ ID NO:6. Un equivalente wt de un dominio B, C o Z, es sustancialmente identico a la secuencia del dominio B, C o Z mencionado anteriormente, excepto una mutacion en la posicion 29 para alterar la union a Fab del dominio. De acuerdo con esto, un equivalente wt de un ligando basado en un dominio B incluye la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID nO:45 (G29K), un equivalente wt de un ligando basado en un dominio C incluye la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:46 (G29K) y el equivalente wt de un ligando basado en un dominio Z incluye la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:48 (A29K). Ademas, en el caso en el que un ligando de acuerdo con la presente invencion incluya mas de un dominio, el equivalente wt correspondiente incluira el mismo numero de dominios; sin embargo, puede incluir una mutacion para alterar la union a Fab. De acuerdo con esto, un equivalente wt de un ligando del dominio C pentamerico incluye la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO: 95 o en la SEQ ID NO:96.
El termino "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos, cuando se alinean de forma optima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos un 70% de identidad de secuencia o al menos un 80% de identidad de secuencia o al menos un 85% de identidad de secuencia o al menos un 90% de identidad de secuencia o al menos un 95% de identidad de secuencia o mas. Para la comparacion de secuencias, tfpicamente una secuencia actua como una secuencia de referencia (p. ej., secuencia parental), con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parametros del programa del algoritmo de la secuencia. Este algoritmo de comparacion de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la o las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, sobre la base de los parametros del programa designados.
El alineamiento optimo de secuencias para comparacion puede llevarse a cabo, p. ej., por el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homologfa de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la busqueda por el metodo de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o por inspeccion visual (vease generalmente Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). El software para realizar analisis BLAST esta publicamente disponible a traves del National Center for Biotechnology Information (accesible publicamente a traves del servidor de internet del National Institutes of Health NCBI). Tfpicamente, los parametros del programa por defecto pueden usarse para realizar la comparacion de secuencias, aunque tambien pueden usarse parametros personalizados. Para las secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP usa como defectos una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
Tal y como se usan indistintamente en la presente memoria, los terminos "dominio E", "dominio E de SpA" y "dominio E de la Protema A de Staphylococcus aureus", se refieren al polipeptido cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:1 o que esta codificado por, p. ej., la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO:7. El "dominio E" es un polipeptido de 51 aminoacidos que se pliega en una estructura de ovillo de tres helices. Es capaz de unirse a Fc a traves de residuos en la superficie de las helices 1 y 2 o a Fab a traves de residuos en la superficie de las helices 2 y 3.
Tal y como se usan indistintamente en la presente memoria, los terminos "dominio D", "dominio D de SpA" y "dominio D de la Protema A de Staphylococcus aureus", se refieren al polipeptido cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:5 o que esta codificado por, p. ej., la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO:11. El "dominio D" es un polipeptido de 61 aminoacidos que se pliega en una estructura de ovillo de tres helices. Es capaz de unirse a Fc a traves de residuos en la superficie de las helices 1 y 2 o a Fab a traves de residuos en la superficie de las helices 2 y 3.
Tal y como se usan indistintamente en la presente memoria, los terminos "dominio A", "dominio A de SpA" y "dominio A de la Protema A de Staphylococcus aureus", se refieren al polipeptido cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:2 o que esta codificado por, p. ej., la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO:8. El "dominio A" es un polipeptido de 58 aminoacidos que se pliega en una estructura de ovillo de tres helices. Es capaz de unirse a Fc a traves de residuos en la superficie de las helices 1 y 2 o a Fab a traves de residuos en la superficie de las helices 2 y 3.
Tal y como se usan indistintamente en la presente memoria, los terminos "dominio B", "dominio B de SpA" y "dominio B de la Protema A de Staphylococcus aureus", se refieren al polipeptido cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:3 o que esta codificado por, p. ej., la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO:9. El "dominio B" es un polipeptido de 58 aminoacidos que se pliega en una estructura de ovillo de tres helices. Es capaz de unirse a Fc a traves de residuos en la superficie de las helices 1 y 2 o a Fab a traves de residuos en la superficie de las helices 2 y 3.
En algunas realizaciones, un ligando basado en un dominio B de acuerdo con la presente invencion incluye una delecion de tres aminoacidos del extremo N, p. ej., que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:13. En otras realizaciones, un ligando basado en un dominio B de acuerdo con la presente invencion incluye una delecion de cuatro aminoacidos del extremo N, p. ej., que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:28. En otra realizacion, un ligando basado en un dominio B de acuerdo con la presente invencion incluye una delecion de cinco aminoacidos del extremo N (secuencia no mostrada).
Tal y como se usan indistintamente en la presente memoria, los terminos "dominio C", "dominio C de SpA" y "dominio C de la Protema A de Staphylococcus aureus", se refieren al polipeptido cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:4 o que esta codificado por, p. ej., la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO:10. El "dominio C" es un polipeptido de 58 aminoacidos que se pliega en una estructura de ovillo de tres helices. Es capaz de unirse a Fc a traves de residuos en la superficie de las helices 1 y 2 o a Fab a traves de residuos en la superficie de las helices 2 y 3.
Un ligando basado en un dominio C incluye una delecion de tres aminoacidos del extremo N, p. ej., que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:14. Un ligando basado en un dominio C incluye una delecion de cuatro aminoacidos del extremo N, p. ej., que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:29. Un ligando basado en un dominio C incluye una delecion de cinco aminoacidos del extremo N (secuencia no mostrada).
Tal y como se usan indistintamente en la presente memoria, los terminos "dominio Z", "dominio Z de SpA" y "dominio Z de la Protema A", se refieren al polipeptido de tres helices de 58 aminoacidos que es una variante del dominio B de la protema A. La secuencia de aminoacidos del dominio Z se muestra en la SEQ ID NO:6 y la secuencia de acido nucleico se muestra en la SEQ ID NO: 12. Un dominio Z ejemplar se describe en Nilsson et al., Protein Engr., 1:107­ 113 (1987).
En algunas realizaciones, un ligando basado en un dominio Z de acuerdo con la presente invencion incluye una delecion de tres aminoacidos del extremo N, p. ej., que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:15. En otras realizaciones, un ligando basado en un dominio Z de acuerdo con la presente invencion incluye una delecion de cuatro aminoacidos del extremo N, p. ej., que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:30. En otra realizacion, un ligando basado en un dominio Z de acuerdo con la presente invencion incluye una delecion de cinco aminoacidos del extremo N (secuencia no mostrada).
En algunas realizaciones, mas de un sitio de los ligandos descritos en la presente memoria se une a un soporte solido (es decir, union de multiples puntos) y en el que los ligandos muestran una fragmentacion reducida (en el caso tanto de ligandos libres como unidos) durante su uso en procesos de purificacion, como se pone de manifiesto por SDS-PAGE o SEC.
El termino "fragmentacion reducida", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una disminucion en el numero y/o intensidad de fragmentos de un ligando, como se observa en un gel de SDS-PAGE o por SEC, respecto a un equivalente wt del ligando, despues de la exposicion de la molecula de ligando libre o la molecula de ligando inmovilizada en un soporte solido, a condiciones alcalinas durante el proceso de purificacion. En algunas realizaciones, el ligando se inmoviliza en un soporte solido a traves de union de multiples puntos. La fragmentacion se detecta habitualmente por la presencia de bandas moleculares menores respecto a la molecula intacta en un gel de SDS-PAGE o como picos distintos que tienen diferentes tiempos de retencion en un cromatograma de SEC. Los ligandos de SpA segun la presente invencion presentan una fragmentacion reducida, que puede detectarse como sigue. Por ejemplo, el ligando libre puede exponerse directamente a NaOH 0,1M, NaOH 0,3m o NaOH 0,5M durante 25 hrs, seguido de un ajuste del pH a 7,0 y pueden analizarse posteriormente por SDS-PAGE o SEC usando protocolos estandar. Alternativamente, un ligando inmovilizado en una matriz de cromatograffa puede exponerse a NaOH 0,1M, NaOH 0,3M o NaOH 0,5M durante25 hrs. El sobrenadante caustico se separa posteriormente de la matriz (p. ej., una resina) y se neutraliza hasta pH 7. Este sobrenadante puede analizarse por SDS-PAGE o por SEC usando protocolos estandar. En el caso de SDS-PAGE, la intensidad optica relativa de los fragmentos puede observarse visualmente y compararse con un control adecuado (p. ej., un dominio wt de SpA o un dominio de SpA que contiene una mutacion en la posicion 29, como se describe en la presente memoria). En el caso de SEC, la intensidad de los picos relativa puede observarse y compararse con un control adecuado (p. ej., un dominio wt de SpA o un dominio de SpA que contiene una mutacion en la posicion 29, como se describe en la presente memoria).
Un proceso de purificacion ffpico usando una matriz de cromatograffa de afinidad implica la regeneracion de la matriz despues de cada ciclo de uso empleando una disolucion acida o alcalina, siendo preferible la ultima. Ademas, los procesos ffpicos tambien implican etapas de CIP, que emplean el uso de una disolucion acida o alcalina para limpiar la matriz, siendo preferibles las disoluciones alcalinas. De acuerdo con esto, se espera que una matriz de cromatograffa de afinidad este expuesta a varios ciclos de regeneracion y etapas de CIP en su vida util, dando como resultado de esta manera una perdida significativa de la capacidad de union para una molecula diana a lo largo del tiempo.
Las matrices de cromatograffa que incorporan los ligandos segun la presente invencion son estables en condiciones alcalinas ademas de presentar una fragmentacion reducida durante su uso en los procesos de purificacion, ya que muestran una perdida reducida de la capacidad de union para una molecula diana a lo largo del tiempo, despues de una exposicion prolongada a condiciones alcalinas durante las etapas de regeneracion y CIP.
El termino "estable en condiciones alcalinas", "estabilidad en condiciones alcalinas", “estable en condiciones causticas" o "estabilidad en condiciones causticas", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere generalmente a la capacidad de un ligando de afinidad segun la presente invencion, bien solo o cuando se inmoviliza en una matriz de cromatograffa, de soportar los ciclos repetidos de regeneracion y CIP usando lavados alcalinos sin perder su capacidad de union inicial. En general, se asume que una matriz por sf misma, en la que se inmoviliza un ligando segun la invencion, contribuye en menos de un 5% al cambio en la estabilidad despues de haberse empapado en NaOH 0,5M durante hasta 30 horas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ligandos de afinidad segun la invencion son capaces de soportar el lavado alcalino convencional durante un periodo de tiempo prolongado, lo que hace que los ligandos sean candidates atractivos, especialmente para la purificacion a gran escala rentable de inmunoglobulinas y protemas que contienen Fc, muchas de los cuales son moleculas terapeuticas.
En algunas realizaciones, la estabilidad en condiciones alcalinas se refiere a la capacidad de un ligando segun la presente invencion o una matriz que incorpora un ligando segun la presente invencion, de retener al menos el 65% o al menos el 70% o al menos el 75% o al menos el 80% o al menos el 85% o al menos el 90% o al menos el 95% de su capacidad de union inicial despues de 5 horas o despues de 10 horas o despues de 15 horas o despues de 20 horas o despues de 25 horas o despues de 30 horas de incubacion en NaOH 0,05M, NaOH 0,1M, NaOH 0,3M o NaOH 0,5M. En otra realizacion, la estabilidad en condiciones alcalinas se refiere a una disminucion de la capacidad de union inicial del ligando en menos de un 70% o menos de un 60% o menos de un 50% o menos de un 40% o menos de un 30% incluso despues de tratamiento con NaOH 0,05M, NaOH 0,1M, NaOH 0,3M o NaOH 0,5M durante 5 horas o 7,5 horas o 10 horas o 15 horas o 20 horas o 25 horas o 30 horas. En una realizacion particular, una matriz de cromatograffa que incorpora un ligando segun la presente invencion retiene hasta el 95% de su capacidad de union inicial despues de exposicion a NaOH 0,5M durante 5 horas. En otra realizacion, una matriz de cromatograffa que incorpora un ligando segun la presente invencion retiene hasta el 95% de su capacidad de union inicial despues de exposicion a NaOH 0,1M durante 25 horas. En otra realizacion mas, una matriz de cromatograffa que incorpora un ligando segun la presente invencion retiene hasta el 85% de su capacidad de union inicial despues de exposicion a NaOH 0,3M durante 25 horas. En una realizacion adicional, una matriz de cromatograffa que incorpora un ligando segun la presente invencion retiene hasta el 65% de su capacidad de union inicial despues de exposicion a NaOH 0,5M durante 25 horas.
En algunas realizaciones, las matrices de cromatograffa basadas en SpA segun la presente invencion presentan una estabilidad en condiciones alcalinas incrementada o mejorada comparado con matrices que incluyen dominios de SpA de tipo salvaje. Sin embargo, en otras realizaciones, las matrices de cromatograffa basadas en SpA segun la presente invencion no son mas estables en condiciones alcalinas que las matrices que incluyen equivalentes de tipo salvaje de los ligandos. Uno de dichos ejemplos es un ligando basado en el dominio C pentamerico de SpA que no es mas estable en condiciones alcalinas que su equivalente de dominio C pentamerico de tipo salvaje. Se entiende que, en determinados casos, tanto los dominios de SpA de tipo salvaje como las variantes pueden incluir una mutacion G29K para reducir la union a Fab; sin embargo, dicha mutacion no tiene un efecto en sf misma en la estabilidad en condiciones alcalinas (datos no mostrados).
La estabilidad en condiciones alcalinas puede medirse facilmente por un experto en la tecnica usando experimentacion rutinaria y/o como se describe en la presente memoria.
El termino "capacidad de union inicial", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad de una molecula diana (p. ej., una inmunoglobulina o una protema que contiene Fc) que puede capturarse por una unidad de volumen de una matriz de cromatograffa de afinidad (es decir, una matriz que incluye un ligando de afinidad) antes de la exposicion de la matriz a condiciones alcalinas.
Las matrices de cromatograffa de afinidad que incluyen los ligandos descritos en la presente memoria (es decir, que contienen uno o mas dominios B, Z o C de SpA que incluyen deleciones N-terminales descritas en la presente memoria) presentan menos de un 5% o menos de un 6% o menos de un 7% o menos de un 8% o menos de un 9% o menos de un 10% o menos de un 12% o menos de un 15% o menos de un 17% o menos de un 20% o menos de un 25% o menos de un 30% de perdida de la capacidad de union inicial de una molecula diana respecto a una matriz de cromatograffa de afinidad que contiene un equivalente wt del dominio de SpA como se describe en la presente memoria, despues de la exposicion prolongada a condiciones causticas. En algunas realizaciones, las matrices de cromatograffa de afinidad segun la presente invencion retienen al menos el 95% o al menos el 90% o al menos el 85% o al menos el 80% o al menos el 75% o al menos el 70% de la capacidad de union inicial de una molecula diana respecto a una matriz de cromatograffa de afinidad que contiene un dominio wt de SpA correspondiente, despues de la exposicion prolongada a condiciones causticas. Sin embargo, en algunas otras realizaciones, las matrices de cromatograffa segun la presente invencion presentan una capacidad de union similar a las matrices que contienen un equivalente wt del ligando despues de la exposicion prolongada a condiciones causticas. Una de dichas matrices de cromatograffa ejemplares incluye un ligando que incluye 5 o mas dominios C de SpA, en la que cada dominio incluye 4 aminoacidos delecionados del extremo N en la que el ligando no es mas estable en condiciones alcalinas que su dominio C equivalente de tipo salvaje. Tanto la forma de delecion como el equivalente de tipo salvaje puede contener una mutacion G29K. Ademas, en varias realizaciones descritas en la presente memoria, los ligandos SpA pueden incluir ademas un unico aminoacido tal como una alanina, una valina o una glicina, en el extremo N de solo el primer dominio en un mulffmero, en el que el aminoacido extra facilita el procesamiento homogeneo posterior a la traduccion.
La capacidad de union de un ligando de cromatograffa de afinidad para una molecula diana puede medirse facilmente usando metodos conocidos en la tecnica y aquellos descritos en la presente memoria, p. ej., como se describe en la Publicacion de Patente U.S. No. 20100221844.
El termino "cromatograffa", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una tecnica de separacion dinamica que separa una molecula diana de interes (p. ej., una inmunoglobulina o una protema que contiene Fc) de otras moleculas en la mezcla y permite aislarla. ^picamente, en un metodo de cromatograffa, una fase movil (ffquido o gas) transporta una muestra que contiene la molecula diana de interes a lo largo o a traves de un medio de fase estacionaria (normalmente solido). Las diferencias en el reparto o afinidad respecto a la fase estacionaria separan las diferentes moleculas mientras la fase movil porta las diferentes moleculas fuera a diferentes tiempos.
El termino "cromatograffa de afinidad", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un modo de cromatograffa en el que una molecula diana que se va a separar se afsla por su interaccion con una molecula (p. ej., un ligando de cromatograffa estable en condiciones alcalinas) que interacciona espedficamente con la molecula diana. En una realizacion, la cromatograffa de afinidad implica la adicion de una muestra que contiene una molecula diana (p. ej., una inmunoglobulina o una protema que contiene Fc) a un soporte solido que contiene en el un ligando basado en SpA, como se describe en la presente memoria.
El termino "cromatograffa de afinidad de Protema A", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a la separacion o aislamiento de sustancias usando Protema A o ligandos basados en SpA, tales como los descritos en la presente memoria, en la que el ligando SpA o Protema A se inmoviliza, p. ej., en un soporte solido. Los ejemplos de medios/resinas de cromatograffa de afinidad de Protema A conocidos en la tecnica incluyen aquellos que tienen a la Protema A inmovilizada en un nucleo de vidrio con poro controlado, p.ej., medios /resinas PROSEP A™ y PROSEP vA™ (MILLIPORE); aquellos que tienen a la Protema A inmovilizada en una fase solida de poliestireno, p. ej., los medios/resinas POROS 50A™ y Poros MabCapture A™ (APPLIED BIOSYSTEMS, INC.); y aquellos que tienen a la Protema A inmovilizada en un soporte solido de agarosa, p. ej., los medios o resinas rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOW™ o MABSELECT™ (GE HEALTHCARE).
Ademas de las matrices mencionadas anteriormente, la Protema A tambien puede inmovilizarse en un poffmero entrecruzado hidrofflico. Vease, p. ej., la Publicacion de Patente U.S. No. 20080210615, que describe poffmeros entrecruzados hidrofflicos ejemplares. Sin pretender la vinculacion a ninguna teoffa, se contempla que los ligandos englobados por la presente invencion pueden inmovilizarse en poffmeros entrecruzados hidrofflicos, tales como los descritos en la Publicacion de Patente U.S. No. 20080210615.
El termino "matriz de afinidad" o "matriz de cromatograffa de afinidad", tal y como se usa indistintamente en la presente memoria, se refiere a un soporte cromatografico al que se une un ligando de cromatograffa de afinidad (p. ej., SpA o un dominio de esta). El ligando es capaz de unirse a una molecula de interes a traves de una interaccion de afinidad (p. ej., una inmunoglobulina o una protema que contiene Fc) que se va a purificar o retirar de una mezcla. Las matrices de cromatograffa de afinidad basadas en la Protema A ejemplares para uso en cromatograffa de afinidad basada en la Protema A que son conocidas en la tecnica incluyen Protema A inmovilizada en un nucleo de vidrio con poro controlado, p. ej., las resinas PROSEP A™ y PROSEP vA™, Alta Capacidad, Ultra y PROSEP Ultra Plus (MILLIPORE); Protema A inmovilizada en una fase solida de poliestireno, p. ej., la resina POROs 50A™ y Poros MabCapture A™ (APPLIED BIOSYSTEMS, INC.); o Protema A inmovilizada en una fase solida de agarosa, por ejemplo, la resina rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOW™ o MABSELECT™ (GE HEALTHCARE).
El termino "inmunoglobulina", "Ig" o "anticuerpo" (usados indistintamente en la presente memoria) se refiere a una protema que tiene una estructura basica de cuatro cadenas polipepffdicas que consisten en dos cadenas pesadas y dos ligeras, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, por enlaces disulfuro intercadena, que tiene la capacidad de unirse espedficamente a anffgenos. El termino "inmunoglobulina de cadena unica" o "anticuerpo de cadena unica" (usados indistintamente en la presente memoria) se refiere a una protema que tiene una estructura de dos cadenas polipepffdicas que consisten en una cadena pesada y una ligera, estando estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, por conectores pepffdicos intercadena, que tiene la capacidad de unirse espedficamente a anffgenos. El termino "dominio" se refiere a una region globular de un polipeptido de cadena pesada o ligera que comprende bucles pepffdicos (p. ej., que comprende 3 a 4 bucles pepffdicos) estabilizados, por ejemplo, por una lamina p plegada y/o enlace disulfuro intercadena. Los dominios se refieren adicionalmente en la presente memoria como "constante" o "variable", sobre la base de la ausencia relativa de variacion en la secuencia en los dominios de los miembros de las distintas clases en el caso de un dominio "constante", o la variacion significativa en los dominios de los miembros de las distintas clases en el caso de un dominio "variable". Los "dominios" de anticuerpo o polipeptido se refieren frecuentemente de manera indistinta en la tecnica como "regiones" de anticuerpo o polipeptido. Los dominios "constantes" de las cadenas ligeras de anticuerpos se refieren de manera indistinta como "regiones constantes de cadena ligera", "dominios constantes de cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL". Los dominios "constantes" de las cadenas pesadas de anticuerpos se refieren de manera indistinta como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH". Los dominios "variables" de las cadenas ligeras de anticuerpos se refieren de manera indistinta como "regiones variables de cadena ligera", "dominios variables de cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL". Los dominios "variables" de las cadenas pesadas de anticuerpos se refieren de manera indistinta como "regiones variables de cadena pesada", "dominios variables de cadena pesada", regiones "VH" o dominios "VH".
Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomerica o polimerica, por ejemplo, los anticuerpos IgM que existen en forma pentamerica y/o los anticuerpos IgA que existen en forma monomerica, dimerica o multimerica. El termino "fragmento" se refiere a una parte o porcion de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoacidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacta o completa. Los fragmentos pueden obtenerse mediante tratamiento qmmico o enzimatico de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacta o completa. Los fragmentos tambien pueden obtenerse por medios recombinantes. Los fragmentos ejemplares incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc y/o Fv.
El termino "fragmento de union a antigeno" se refiere a una porcion de polipeptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une a un antigeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que se derivaron) para la union al antigeno (es decir, union espedfica). Los fragmentos de union pueden producirse por tecnicas de a Dn recombinante o por la escision enzimatica o qrnmica de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de union incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, cadenas unicas y anticuerpos de cadena unica.
Tambien estan englobadas las protemas de fusion que incluyen un anticuerpo o fragmento de este como una parte de la protema de fusion.
Los terminos "polinucleotido" y "molecula de acido nucleico", usados indistintamente en la presente memoria, se refieren a formas polimericas de nucleotidos de cualquier longitud, bien ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos. Estos terminos incluyen ADN mono, bi o tricatenaro, ADN genomico, ADNc, ARN, hterido ADN-ARN o un polfmero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleotidos naturales, modificadas qmmicamente o bioqmmicamente, no naturales o derivatizadas. El nucleo del polinucleotido puede comprender azucares y grupos fosfato (como se pueden encontrar tfpicamente en ARN o ADN) o azucares y grupos fosfato modificados o sustituidos. Ademas, un polinucleotido bicatenario puede obtenerse a partir del producto polinucleotido monocatenario de smtesis qrnmica bien sintetizando la cadena complementaria e hibridando las cadenas en condiciones apropiadas o sintetizando la cadena complementaria de novo usando una ADN polimerasa con un cebador apropiado. Una molecula de acido nucleico puede tener diferentes formas, p. ej., un gen o fragmento genico, uno o mas exones, uno o mas intrones, ARNm, ADNc, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de acido nucleico y cebadores. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y analogos de nucleotidos, uracilo, otros azucares y grupos conectores tales como fluororibosa y tioato y ramificaciones de nucleotidos. Tal y como se usa en la presente memoria, "ADN" o "secuencia de nucleotidos" incluye no solo las bases A, T, C y G, sino que tambien incluye cualquiera de sus analogos o formas modificadas de estas bases, tales como nucleotidos metilados, modificaciones internucleotido tales como uniones no cargadas y tioatos, el uso de analogos de azucares y estructuras de nucleo modificadas y/o alternativas, tales como poliamidas. En una realizacion particular, una molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una variante de SpA, como se describe en la presente memoria.
El termino "union a Fc", "se une a una porcion Fc" o "union a una porcion Fc" se refiere a la capacidad de un ligando de afinidad descrito en la presente memoria, de unirse a la parte constante (Fc) de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un ligando segun la presente invencion se une a una porcion Fc de un anticuerpo (p. ej., IgG1, IgG2 o IgG4 humana) con una afinidad de al menos 10-7 M o al menos 10-8 M o al menos10-9 M.
Tal y como se usa en la presente memoria, el termino "union a Fab" o "union a una porcion Fab" se refiere a la capacidad de un ligando de afinidad descrito en la presente memoria, de unirse a una region Fab de un anticuerpo o una molecula de inmunoglobulina. El termino "union reducida a una porcion Fab" se refiere a cualquier disminucion en la union a una porcion Fab (o F(ab)2) de una molecula de inmunoglobulina por un ligando basado en SpA segun la presente invencion respecto a un control (p. ej., un dominio wt de SpA), en el que el ligando incluye ademas una mutacion en uno o mas aminoacidos. En algunas realizaciones, un ligando segun la presente invencion y su equivalente wt (usado como un control) incluye el residuo de glicina en la posicion 29 reemplazado con un aminoacido distinto de alanina o triptofano. En una realizacion particular, un ligando segun la presente invencion incluye un residuo de lisina en la posicion 29. En una realizacion particular, la union a una porcion Fab de una molecula de inmunoglobulina por un ligando descrito en la presente memoria es indetectable usando tecnicas convencionales en la tecnica y aquellas descritas en la presente memoria. La union a una molecula de inmunoglobulina puede detectarse usando tecnicas muy conocidas incluyendo aquellas descritas en la presente memoria e incluyendo, pero no limitado a, por ejemplo, cromatograffa de afinidad y analisis por resonancia de plasmon superficial. En algunas realizaciones, una protema de union a inmunoglobulina englobada por la presente invencion se une a una molecula de inmunoglobulina con una afinidad de al menos 10-10M.
El termino "extremo N", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere al extremo amino de la secuencia de aminoacidos de un dominio de SpA, empezando en la posicion 1 o en la posicion 2 de la secuencia de aminoacidos de cada uno de los dominios, como se representa en la Figura 1. Sin embargo, se entiende que el primer aminoacido en una secuencia puede estar precedido por un residuo del aminoacido metionina u otro aminoacido para facilitar el procesamiento homogeneo posterior a la traduccion de la protema, tal como, por ejemplo, una alanina, una glicina o una valina. Los ligandos SpA descritos en la presente memoria incluyen una delecion de al menos 3 o al menos 4 o al menos 5 aminoacidos consecutivos del extremo N (empezando en la posicion 1 o en la posicion 2 de las secuencias de aminoacidos de los dominios B, C o Z mostradas en la Figura 1) de un dominio de SpA. En otras palabras, dichos ligandos incluyen una delecion de los aminoacidos consecutivos 1 a 3 o de los aminoacidos consecutivos 1 a 4 o de los aminoacidos consecutivos 1 a 5 etc., de los dominios de SpA B, Z o C o dichos ligandos incluyen una delecion de los aminoacidos consecutivos 2 a 4 o de los aminoacidos consecutivos 2 a 5 o de los aminoacidos consecutivos 2 a 6 etc., de los dominios de SpA B, Z o C (las secuencias de aminoacidos de los dominios B, C y Z wt se representan en la Figura 1, que estan modificadas para incluir deleciones del extremo N). Se describe en donde un ligando incluye 5 dominios C, incluyendo cada dominio una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N, empezando en la posicion 1.
La secuencia de aminoacidos del dominio B de SpA que contiene una delecion de 3 aminoacidos consecutivos del extremo N se representa en la SEQ ID NO: 13 y la que contiene una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N se representa en la SEQ ID NO: 28. Adicionalmente, la secuencia de aminoacidos del dominio C de SpA que contiene una delecion de 3 aminoacidos consecutivos del extremo N se representa en la SEQ ID NO: 14, y la que contiene una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N se representa en la SEQ ID NO: 29. Ademas, la secuencia de aminoacidos del dominio Z que contiene una delecion de 3 aminoacidos consecutivos del extremo N se representa en la SEQ ID NO: 15, y la que contiene una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N se representa en la SEQ ID NO: 30.
En general, en el caso de las formas multimericas de los ligandos basados en SpA descritas en la presente memoria, las secuencias de aminoacidos de las formas monomericas de los ligandos estan simplemente repetidas, segun sea deseable. Sin embargo, debe indicarse que, en el caso de algunas formas multimericas de los ligandos segun la presente invencion, no es necesario que todos los dominios tengan una delecion del extremo N. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ligandos no contienen une delecion en el extremo N del primer dominio en la forma multimerica del ligando; sin embargo, los dominios posteriores en el ligando contienen una delecion de al menos 3 aminoacidos consecutivos del extremo N o de al menos 4 aminoacidos consecutivos del extremo N o de al menos 5 aminoacidos consecutivos del extremo N.
Los ligandos basados en SpA segun la presente invencion presentan propiedades superiores e inesperadas, es decir, fragmentacion reducida durante su uso en los procesos de purificacion, como se pone de manifiesto en los Ejemplos de la presente memoria. Notablemente, las ensenanzas en la tecnica anterior parecen desaconsejar la motivacion de preparar y usar dichos ligandos. Por ejemplo, la Publicacion de Patente U.S. No. 20100048876, discute un ligando que incluye una delecion en los residuos de aminoacidos 3 a 6 del dominio C de SpA; sin embargo, sobre la base de las ensenanzas de esta publicacion (vease, p. ej., la Figura 2 de la Publicacion de Patente U.S. No. 20100048876), parece que el mutante de delecion descrito en ella se comporta pobremente respecto a la retencion de la capacidad de union respecto al dominio C wt de SpA, durante una exposicion caustica prolongada. De acuerdo con esto, sobre la base de las ensenanzas de esta referencia, sena menos deseable usar un mutante de delecion de un dominio C de SpA, cuando pierde mas capacidad de union con el tiempo, respecto a su equivalente de tipo salvaje.
Por motivos de conveniencia, las varias secuencias referenciadas a lo largo de la solicitud se resumen en la Tabla I siguiente.
Tabla I
Breve descripcion de la secuencia SEQ ID NO: AA - Aminoacido; NA - Acido Nucleico; A -que tiene una delecion
AA del dominio E wt 1
AA del dominio A wt 2
AA del dominio B wt 3
AA del dominio C wt 4
AA del dominio D wt 5
AA del dominio Z 6
NA del dominio E wt 7
NA del dominio A wt 8
NA del dominio B wt 9
NA del dominio C wt 10
NA del dominio D wt 11
Breve descripcion de la secuencia SEQ ID NO:
AA - Aminoacido; NA - Acido Nucleico; A -que tiene una delecion
NA del dominio Z 12 monomero del dominio B A3 AA 13 monomero del dominio C A3 AA 14 monomero del dominio Z A3 AA 15 dfmero del dominio B A 3 AA-teniendo ambos dominios la delecion 16 dfmero del dominio C A3 AA-teniendo ambos dominios la delecion 17 dfmero del dominio Z A3 AA-teniendo ambos dominios la delecion 18 dfmero del dominio B A3 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion 19 dfmero del dominio C A3 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion 20 dfmero del dominio Z A3 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion 21 pentamero del dominio B A3 AA-todos los dominios tienen la delecion 22 pentamero del dominio C A3 AA-todos los dominios tienen la delecion 23 pentamero del dominio Z A3 AA-todos los dominios tienen la delecion 24 pentamero del dominio B A3 AA-el primer dominio no tiene la delecion 25 pentamero del dominio C A3 AA-el primer dominio no tiene la delecion 26 pentamero del dominio Z A3 AA-el primer dominio no tiene la delecion 27 monomero del dominio B A 4 AA 28 monomero del dominio C A 4 AA 29 monomero del dominio Z A 4 AA 30 dfmero del dominio B A 4 AA-teniendo ambos dominios la delecion 31 dfmero del dominio C A 4 AA-teniendo ambos dominios la delecion 32 dfmero del dominio Z A 4 AA-teniendo ambos dominios la delecion 33 dfmero del dominio B A 4 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion 34 dfmero del dominio C A 4 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion 35 dfmero del dominio Z A 4 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion 36 pentamero del dominio B A 4 AA-todos los dominios tienen la delecion 37 pentamero del dominio C A 4 AA-todos los dominios tienen la delecion 38 pentamero del dominio Z A 4 AA-todos los dominios tienen la delecion 39 pentamero del dominio B A 4 AA-el primer dominio no tiene la delecion 40 pentamero del dominio C A 4 AA-el primer dominio no tiene la delecion 41 Breve descripcion de la secuencia SEQ ID NO:
AA - Aminoacido; NA - Acido Nucleico; A -que tiene una delecion
pentamero del dominio Z A 4 AA-el primer dominio no tiene la delecion 42 AA del dominio E wt no Fab (G29K) 43 AA del dominio A wt no Fab (G29K) 44 AA del dominio B wt no Fab (G29K) 45 AA del dominio C wt no Fab (G29K) 46 AA del dominio D wt no Fab (G29K) 47 AA del dominio Z no Fab (A29K) 48 NA del dominio E wt no Fab (G29K) 49 NA del dominio A wt no Fab (G29K) 50 NA del dominio B wt no Fab (G29K) 51 NA del dominio C wt no Fab (G29K) 52 NA del dominio D wt no Fab (G29K) 53 NA del dominio Z no Fab (A29K) 54 monomero del dominio B A3 AA no Fab (G29K) 55 monomero del dominio C A3 AA no Fab (G29K) 56 monomero del dominio Z A3 AA no Fab (A29K) 57 dfmero del dominio B A3 AA-teniendo ambos dominios la delecion no Fab (G29K) 58 dfmero del dominio C A3 AA-teniendo ambos dominios la delecion no Fab (G29K) 59 dfmero del dominio Z A3 AA-teniendo ambos dominios la delecion no Fab (A29K) 60 dfmero del dominio B A3 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion no Fab (G29K) 61 dfmero del dominio C A3 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion no Fab (G29K) 62 dfmero del dominio Z A3 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion no Fab (A29K) 63 pentamero del dominio B A3 AA-todos los dominios tienen la delecion no Fab (G29K) 64 pentamero del dominio C A3 AA-todos los dominios tienen la delecion no Fab (G29K) 65 pentamero del dominio Z A3 AA-todos los dominios tienen la delecion no Fab (A29K) 66 pentamero del dominio B A3 AA-el primer dominio no tiene la delecion no Fab (G29K) 67 pentamero del dominio C A3 AA-el primer dominio no tiene la delecion no Fab (G29K) 68 pentamero del dominio Z A3 AA-el primer dominio no tiene la delecion no Fab (A29K) 69 monomero del dominio B A 4 AA no Fab (G29K) 70 monomero del dominio C A 4 AA no Fab (G29K) 71 Breve descripcion de la secuencia SEQ ID NO: AA - Aminoacido; NA - Acido Nucleico; A -que tiene una delecion
monomero del dominio Z A 4 AA no Fab (A29K) 72
dfmero del dominio B A 4 AA-teniendo ambos dominios la delecion no Fab (G29K) 73
dfmero del dominio C A 4 AA-teniendo ambos dominios la delecion no Fab (G29K) 74
dfmero del dominio Z A 4 AA-teniendo ambos dominios la delecion no Fab (A29K) 75
dfmero del dominio B A 4 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion no Fab (G29K) 76
dfmero del dominio C A 4 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion no Fab (G29K) 77
dfmero del dominio Z A 4 AA-solo el segundo dominio tiene la delecion no Fab (A29K) 78 pentamero del dominio B A 4 AA-todos los dominios tienen la delecion no Fab (G29K) 79 pentamero del dominio C A 4 AA-todos los dominios tienen la delecion no Fab (G29K) 80 pentamero del dominio Z A 4 AA-todos los dominios tienen la delecion no Fab (A29K) 81 pentamero del dominio B A 4 AA-el primer dominio no tiene la delecion no Fab (G29K) 82 pentamero del dominio C A 4 AA-el primer dominio no tiene la delecion no Fab (G29K) 83 pentamero del dominio Z A 4 AA-el primer dominio no tiene la delecion no Fab (A29K) 84
dfmero del dominio Z no Fab (A29K) 85
NA etiqueta His 86
dfmero del dominio Z A 1 AA-el primer dominio no tiene la delecion no Fab (A29K) 87
dfmero del dominio Z A 2 AA-el primer dominio no tiene la delecion no Fab (A29K) 88
dfmero del dominio A A 4 AA-el primer dominio tiene una delecion N-terminal 89
dfmero del dominio D A 4 AA-el primer dominio tiene una delecion N-terminal 90 pentamero del dominio Z no Fab (A29K) 91
AA del dfmero del dominio C 92 pentamero del dominio C A 4 AA con el primer dominio teniendo alanina en el extremo N no Fab 93
(G29K)
pentamero del dominio C A 4 AA con el primer dominio con alanina en el extremo N 94 pentamero del dominio C no Fab (G29K) AA 95 pentamero del dominio C de tipo salvaje AA 96
II. Generacion de Moleculas basadas en SpA para Uso como Ligandos de Cromatografia
Los ligandos de cromatograffa de afinidad basados en SpA englobados por la presente invencion pueden prepararse usando cualesquiera metodos adecuados conocidos en la tecnica.
Por ejemplo, como una etapa inicial, pueden usarse tecnicas de ingeniena genetica estandar, p. ej., aquellas descritas en el manual de laboratorio titulado Molecular Cloning por Sambrook, Fritsch y Maniatis, para la generacion de acidos nucleicos que expresan las moleculas de ligando de SpA descritas en la presente memoria.
En algunas realizaciones, una molecula de acido nucleico que codifica uno o mas dominios de SpA que tienen una delecion en el extremo N puede clonarse en un vector adecuado para la expresion en una celula huesped apropiada. Los vectores de expresion adecuados son muy conocidos en la tecnica e incluyen tipicamente los elementos necesarios para la transcripcion y traduccion de la secuencia que codifica la SpA variante.
Las moleculas de SpA descritas en la presente memoria tambien pueden sintetizarse qmmicamente a partir de precursores de aminoacidos para fragmentos usando metodos muy conocidos en la tecnica, incluyendo metodos sinteticos de peptidos en fase solida tales como las estrategias que usan Boc (terc-butiloxicarbonilo) o Fmoc (9-fluorenilmetiloxi carbonilo) (veanse, p. ej., las Pat. U.S. Nos. 6.060.596; 4.879,378; 5.198.531; 5.240.680).
La expresion de las moleculas de SpA descritas en la presente memoria puede conseguirse en una variedad de tipos de celulas tales como, p. ej., celulas huesped eucariotas tales como celulas de levadura, celulas de insecto y celulas de mairnfero y celulas huesped procariotas, p. ej., bacterias tales como E. coli.
En algunas realizaciones, las moleculas de SpA pueden expresarse en la superficie de un bacteriofago de manera que cada fago contiene una secuencia de ADN que codifica una molecula de SpA individual presentada en la superficie del fago. La afinidad de la molecula de SpA para una inmunoglobulina puede evaluarse facilmente mediante el uso de tecnicas estandar en la tecnica y aquellas descritas en la presente memoria, p. ej., configuracion estandar de ELISA y Biacore™ 2000 (BIACORE a B, Uppsala Suecia). Es deseable que la afinidad de union de una molecula de SpA de la presente invencion para una inmunoglobulina sea al menos comparable con la de la molecula parental, en el que la molecula presenta una fragmentacion reducida durante su uso, como se describe en la presente memoria.
IN. Soportes Usados para la Preparacion de Matrices de Cromatografia
En algunas realizaciones, los ligandos de SpA englobados por la presente invencion se inmovilizan en un soporte, p. ej., un soporte solido o un soporte soluble, para generar una matriz de cromatografia de afinidad adecuada para la separacion de biomoleculas tales como, p. ej., inmunoglobulinas y protemas que contienen Fc.
En algunas realizaciones, un ligando segun la presente invencion se inmoviliza en un soporte solido. Sin pretender la vinculacion a ninguna teona, se contempla que cualquier soporte solido puede usarse para la union de un ligando segun la invencion. Por ejemplo, las matrices de soporte solido incluyen, pero no estan limitadas a, vidrio con poro controlado, sflice, oxido de circonio, oxido de titanio, agarosa, polimetacrilato, poliacrilato, poliacrilamida, polivinileter, polivinil alcohol y poliestireno y derivados de estos (p. ej., aleaciones de estos). Un soporte solido puede ser un material poroso o un material no poroso.
En algunas realizaciones, un soporte solido es un material poroso. Un material poroso usado como un soporte solido puede estar comprendido por un compuesto hidrofilico, un compuesto hidrofobico, un compuesto oleofobico, un compuesto oleofilico o cualquier combinacion de estos. El material poroso puede estar comprendido por un pofimero o un copolfmero. Los ejemplos de materiales porosos adecuados incluyen, pero no estan limitados a, polieter sulfona, poliamida, p. ej., nilon, polisacaridos tales como, por ejemplo, agarosa y celulosa, poliacrilato, polimetacrilato, poliacrilamida, polimetacrilamida, politetrafluoroetileno, polisulfona, poliester, fluoruro de polivinilideno, polipropileno, polietileno, polivinil alcohol, polivinileter, policarbonato, polfmero de un fluorocarbono, p. ej., poli (tetrafluoroetileno-co-perfluoro(alquil vinil eter)), vidrio, sflice, circonia, titania, ceramica, metal y aleaciones de estos.
El material poroso puede estar comprendido por una molecula organica o inorganica o una combinacion de moleculas organicas e inorganicas y puede estar comprendido por uno o mas grupos funcionales, p. ej., un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo carbonilo o un grupo acido carboxflico, adecuado para reaccionar, p. ej., formando enlaces covalentes para una modificacion qmmica adicional, con el fin de unirse covalentemente a una protema. En otra realizacion, el material poroso puede no poseer un grupo funcional, pero puede estar recubierto con una capa de material que porta grupos funcionales tales como, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo aminoacido, un grupo carbonilo o un grupo acido carboxflico.
En algunas realizaciones, se usa una matriz de separacion de afinidad convencional, p. ej., de naturaleza organica y basada en polfmero que exponen una superficie hidrofilica al medo acuoso usado, es decir, exponen grupos hidroxi (--OH), carboxi (--c Oo H), carbonilo (--CHO, o RCO-R'), carboxamido (--CONH2, posiblemente en formas N-sustituidas), amino (--NH2, posiblemente en forma sustituida), oligo o polietilenoxi en sus superficies externa y, si esta presente, tambien interna. En una realizacion, los pofimeros pueden estar basados, por ejemplo, en polisacaridos, tales como dextrano, almidon, celulosa, pululano, agarosa etc, que ventajosamente se han entrecruzado, por ejemplo, con bisepoxidos, epihalohidrinas, bromuro de alilo, aliglicidil eter, hidrocarburos inferiores sustituidos 1,2,3-trihalo, para proporcionar una porosidad y una rigidez adecuadas. En otra realizacion, el soporte solido comprende lechos de agarosa porosos. Los diferentes soportes usados en la presente invencion pueden prepararse facilmente segun metodos estandar conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, gelificacion en suspension inversa descrita, p. ej., en Hjerten, Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964). Alternativamente, las matrices base pueden ser productos disponibles comercialmente, tales como Sepharose™ FastFlow (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia). En algunas realizaciones, especialmente ventajosas para separaciones a gran escala, el soporte se adapta para incrementar su rigidez y, por lo tanto, hace que la matriz sea mas adecuada para velocidades de flujo altas.
Alternativamente, el soporte solido puede estar basado en poKmeros sinteticos, tales como polivinil alcohol, polivinileter, polihidroxialquil acrilatos, polihidroxialquil metacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilamidas etc. En el caso de polfmeros hidrofobicos, tales como matrices basadas en bencenos sustituidos con divinilo y monovinilo, la superficie de la matriz se hidrofiliza frecuentemente para exponer grupos hidrofflicos como se ha definido anteriormente a un lfquido acuoso circundante. Dichos polfmeros pueden producirse facilmente segun metodos estandar, vease p. ej., Arshady, Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988). Alternativamente, puede usarse un producto disponible comercialmente, tal como Source™ (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia) y Poros (APPLIED BIOSYSTEMS, Foster City, CA).
En otras realizaciones mas, el soporte solido comprende un soporte de naturaleza inorganica, p. ej., sflice, oxido de circonio, oxido de titanio y aleaciones de estos. La superficie de las matrices inorganicas se modifica frecuentemente para incluir grupos reactivos adecuados para una reaccion adicional con SpA y sus variantes. Los ejemplos incluyen CM Zirconia (Ciphergen-BioSepra (CERGYPONTOISE, Francia) y CPG® (MILLIPORE).
En algunas realizaciones, el soporte solido puede estar basado, por ejemplo, en circonia, titania o sflice en la forma de vidrio con poro controlado, que puede modificarse bien para contener grupos reactivos y/o para aguantar el empape caustico, para acoplarse a ligandos.
Los formatos de soporte solido ejemplares incluyen, pero no estan limitados a, un lecho (esferico o irregular), una fibra hueca, una fibra solida, una almohadilla, un gel, una membrana, un casete, una columna, un chip, un portaobjetos, una placa o un monolito.
Respecto al formato de una matriz, en una realizacion, esta en la forma de un monolito poroso, que puede prepararse usando un material inorganico tal como, p. ej., sflice, o un material organico tal como, p. ej., polimetacrilato, poliacrilato, poliacrilamida, polimetacrilamida, politetrafluoroetileno, polisulfona, poliester, fluoruro de polivinilideno, polipropileno, polietileno, polivinil alcohol, polivinileter y policarbonato. En el caso de un monolito, puede formarse mediante polimerizacion o por recubrimiento de un sustrato.
En una realizacion alternativa, la matriz esta en forma de lecho o de partmula que puede ser porosa o no porosa. Las partmulas pueden ser esfericas o no esfericas, asf como magneticas o no magneticas. Las matrices en forma de lecho o de partmula pueden usarse como un lecho empaquetado o en una forma suspendida. Las formas suspendidas incluyen aquellas conocidas como lechos expandidos y suspensiones puras, en las que las partmulas o lechos tienen un movimiento libre. En el caso de los monolitos, lechos empaquetados y lechos expandidos, el procedimiento de separacion sigue comunmente la cromatograffa convencional con un gradiente de concentracion. En el caso de una suspension pura, se usara el modo discontinuo. Tambien, puede usarse el soporte solido en formas tales como una superficie, un chip, un capilar o un filtro.
La matriz tambien podna estar en la forma de membrana en un cartucho. La membrana podna estar en un formato de lamina plana, espiral o fibra hueca.
En otra realizacion, un ligando segun la presente invencion se une a un soporte solido, p. ej., un polfmero soluble o un polfmero soluble en agua. Los soportes solubles ejemplares incluyen, pero no estan limitados a, un biopolfmero tal como, p. ej., una protema o un acido nucleico. En algunas realizaciones, puede usarse biotina como un polfmero soluble, p. ej., como se describe en la Publicacion de Patente US No. 20080108053. Por ejemplo, la biotina puede unirse a un ligando, p. ej., un ligando basado en SpA segun la presente invencion, que posteriormente a unirse al ligando, puede usarse para aislar una protema de interes, p. ej., un anticuerpo o fragmento de este, p. ej., presente en una mezcla cruda y la protema de interes puede aislarse o separarse mediante precipitacion del complejo de polfmero biotina-ligando-protema bien de forma reversible o irreversible. El polfmero tambien puede ser un polfmero soluble sintetico, tal como, por ejemplo, incluyendo, pero no limitado a, un polfmero que contiene grupos cargados negativamente (carboxflicos o sulfonicos), grupos cargados positivamente (amina cuaternaria, amina terciaria, grupos secundarios o primarios), grupos hidrofobicos (grupos fenilo o butilo), grupos hidrofflicos (grupos hidroxilo o amino) o una combinacion de los anteriores. Los polfmeros solubles sinteticos ejemplares pueden encontrarse en la Publicacion PCT Internacional No. WO2008091740 y en la Publicacion U.S. No. US20080255027. Estos polfmeros, despues de cambios ffsicos especfficos en una o mas condiciones tales como pH, conductividad o temperatura, pueden usarse para purificar la protema de interes mediante precipitacion bien de una forma reversible o irreversible. Los polfmeros solubles sinteticos pueden usarse solos o pueden acoplarse con un ligando segun la presente invencion y usarse para la captura/purificacion de una protema de interes tal como, p. ej., un anticuerpo o fragmento de este, mediante precipitacion bien de una forma reversible o irreversible.
En algunas realizaciones, los ligandos se unen a una membrana en un formato de placa con multiples pocillos. En otras realizaciones mas, los ligandos se incorporan en un dispositivo capilar o microflmdico.
IV. Metodos para Unir un Ligando a un Soporte
Puede usarse cualquier tecnica adecuada para unir un ligando descrito en la presente memoria a un soporte, p. ej., un soporte solido incluyendo aquellas muy conocidas en la tecnica y descritas en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ligando puede estar unido a un soporte mediante tecnicas de acoplamiento convencionales utilizando, p. ej., los grupos amino y/o carboxi presentes en el ligando. Por ejemplo, los bisepoxidos, epiclorohidrina, CNBr, N-hidroxisuccinimida (NHS) etc., son reactivos de acoplamiento muy conocidos. En algunas realizaciones, se introduce un espaciador entre el soporte y el ligando, que mejora la disponibilidad del ligando y facilita el acoplamiento qmmico del ligando al soporte.
En varias realizaciones englobadas por la presente invencion, se une mas de un sitio en un ligando a un soporte solido (es decir, union de multiples puntos), lo que da como resultado de esta manera una matriz de cromatograffa de afinidad que muestra una fragmentacion reducida del ligando despues de la exposicion caustica prolongada (tanto en el caso del ligando libre como en el del ligando unido).
La union de un ligando de cromatograffa basado en SpA a un soporte solido puede conseguirse mediante muchas maneras diferentes conocidas, la mayor parte de las cuales son muy conocidas en la tecnica, asf como las descritas en la presente memoria. Vease, p. ej., Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, p.
51-136 (1992).
Por ejemplo, los ligandos proteicos pueden acoplarse a un soporte solido mediante grupos activos bien en la superficie del soporte solido o el ligando proteico, tales como, por ejemplo, grupos hidroxilo, tiol, epoxido, amino, carbonilo, epoxido o acido carboxflico. La union puede conseguirse usando qmmicas conocidas incluyendo, pero no limitado a, el uso de bromuro de cianogeno (CNBr), N-hidroxil succinimida ester, activacion epoxi (bisoxirano) y aminacion reductora.
Por ejemplo, el acoplamiento de protemas dirigido por tiol se ha descrito en la bibliograffa. Vease, p. ej., Ljungquist, et al. Eur. J. Biochem. Vol 186, p. 558-561 (1989). Esta tecnica se ha aplicado previamente para el acoplamiento de SpA a un soporte solido. Como SpA de tipo salvaje no contiene grupos tiol, la union se consigue mediante la insercion de forma recombinante de una cistema que contiene tiol en el extremo C de SpA. Vease, p. ej., la Patente U.S. No. 6.399.750. Varios productos comerciales tales como MabSelect™, MabSelect™ Xtra y MabSelect™ SuRe, MabSelect™ SuRe LX se producen mediante este mecanismo. Se ha reportado que esta cistema terminal solo reacciona con el grupo epoxido en la superficie solida, dando como resultado de esta manera a un unico punto de union de la SpA al soporte solido. Vease, p. ej., Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry, CRC Press, 2006, pagina 473.
En algunas realizaciones segun la presente invencion, mas de un sitio en los ligandos de cromatograffa basados en SpA se une a un soporte solido mediante una union de multiples puntos no discriminada. En general, SpA contiene grupos amino libres abundantes de numerosas lisinas en cada dominio. La union de un dominio de SpA a un soporte solido mediante una union de multiples puntos, p. ej., una resina de cromatograffa con grupo epoxido o aldefffdo, puede conseguirse haciendo reaccionar el grupo amino de lisina en SpA, mediante la apertura del anillo epoxido o aminacion reductora, respectivamente. En determinadas realizaciones, la union de multiples puntos puede conseguirse por la reaccion de uno o mas aminoacidos naturales en SpA que tienen grupos hidroxilo libres, tales como, por ejemplo, serina y tirosina, con un soporte que contiene un grupo epoxido mediante una reaccion de apertura del anillo. Alternativamente, la union de multiples puntos puede conseguirse, por ejemplo, por la reaccion de aminoacidos naturales en SpA que tienen grupos acido carboxflico libres, tales como, por ejemplo, acido aspartico y acido glutamico, con un soporte que contiene grupos amino mediante, por ejemplo, N,N'-carbonildiimidazol. La union de multiples puntos del ligando al soporte tambien puede conseguirse por una combinacion de todos los mecanismos anteriores.
Los ligandos de cromatograffa basados en SpA tambien pueden unirse a un soporte solido mediante un mecanismo asociativo. Por ejemplo, un grupo asociativo puede interaccionar con un ligando de interes no covalentemente mediante interaccion ionica, hidrofobica o una combinacion de interacciones, para unir de esta manera el ligando de interes a la superficie solida. Esto facilita el acoplamiento de alta eficiencia del ligando a la matriz solida, por ejemplo, como se describe en las Patentes U.S Nos. 7.833.723 y 7.846.682 dando como resultado de esta manera a una densidad del ligando mayor que sin los grupos asociativos. Los grupos asociativos adecuados para uso en la invencion incluyen especies cargadas tales como especies ionicas y especies no cargadas tales como especies hidrofobicas. El grupo asociativo puede modificar el soporte solido, p. ej., uniendose covalentemente directamente con el soporte solido. Los ejemplos adecuados de especies ionicas pueden incluir aminas cuaternarias, aminas terciarias, aminas secundarias, aminas primarias, un grupo sulfonico, acido carboxflico, o cualquier combinacion de estos. Los ejemplos adecuados de especies hidrofobicas pueden incluir un grupo fenilo, un grupo butilo, un grupo propilo o cualquier combinacion de estos. Tambien se contempla que pueden usarse especies de modo mixto. El grupo asociativo tambien puede interaccionar con el ligando proteico. Asf, la interaccion entre el grupo asociativo y el ligando proteico puede estar comprendida por una mezcla de interacciones, p. ej., de especies ionicas e hidrofobicas.
El grupo asociativo puede acoplarse covalentemente al soporte solido haciendo reaccionar un grupo funcional en el soporte solido con un grupo funcional en el grupo asociativo. Los grupos funcionales adecuados incluyen, pero no estan limitados a aminas, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilo, imina, aldefffdo, cetona, alqueno, alquino, azo, nitrilo, epoxido, cianogenos y grupos activados acido carboxflico. Como un ejemplo, los lechos de agarosa contienen grupos hidroxilo que pueden hacerse reaccionar con la funcionalidad epoxido de un grupo asociativo cargado positivamente, tal como cloruro de glicidil trimetilamonio. Un experto en la tecnica apreciara que puede acoplarse una pluralidad de grupos asociativos al soporte solido siempre que se use al menos un grupo asociativo bifuncional. Asf, los grupos asociativos pueden acoplarse en tandem al soporte solido o pueden acoplarse individualmente directamente al soporte solido.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona grupos asociativos y/o ligandos proteicos que pueden acoplarse a un soporte solido mediante un conector interviniente. El conector puede comprender al menos un grupo funcional acoplado a un resto conector. El resto conector puede comprender cualquier molecula capaz de acoplarse a un grupo funcional. Por ejemplo, el resto conector puede incluir cualquiera de un grupo alquilo, un alquenilo o un alquinilo. El resto conector puede comprender una cadena de carbono que vana de 1 a 30 atomos de carbono. En algunas realizaciones, el conector puede estar comprendido por mas de 30 atomos de carbono. El resto conector puede comprender al menos un heteroatomo tal como nitrogeno, oxfgeno y azufre. El resto conector puede estar comprendido por una cadena ramificada, una cadena no ramificada o una cadena dclica. El resto conector puede estar sustituido con dos o mas grupos funcionales.
La eleccion de las condiciones de tamponamiento apropiadas para el acoplamiento de un ligando proteico a un soporte solido esta dentro de la capacidad del experto en la tecnica. Los tampones adecuados incluyen, p. ej., acetato de sodio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de potasio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, etc, o cualquier combinacion de los anteriores, con la concentracion variando de 10mM a 5M. En algunas realizaciones, la concentracion de sal vana de 0,1M a 1,5M.
Los tampones adecuados adicionales incluyen cualquier tampon que no contiene amina tal como tampones carbonato, bicarbonato, sulfato, fosfato y acetato o una combinacion de los anteriores. Cuando se usa qmmica asociativa, la concentracion de sal del tampon dependera del grupo asociativo usado. Por ejemplo, la concentracion de sal puede estar en el intervalo de 5nM-100mM. Cuando se usa una especie cargada, la concentracion de sal puede ser al menos 5nM pero menos de 0,1M, al menos 5nM pero menos de 0,01M, al menos 5nM pero menos de 0,001M. En determinadas realizaciones, la concentracion de sal puede ser 0,01M. Cuando se usa una especie hidrofobica, es deseable habitualmente una alta concentracion de sal. Asf, la concentracion de sal puede ser mayor de 0,001M, mayor de 0,01M o mayor de 0,1M.
En algunas realizaciones, cuando se usa qmmica asociativa, la reaccion se realiza a una temperatura que vana de 0°C a 99°C. En determinadas realizaciones, el metodo de reaccion se lleva a la practica a una temperatura menor de 60°C, menor de 40°C, menor de 20°C o menor de 10°C. En algunas realizaciones, el metodo de la invencion se lleva a la practica a una temperatura de aproximadamente 4°C. En otras realizaciones, el metodo de la invencion se lleva a la practica a una temperatura de 20°C.
V. Ensayo para Determinar la Fragmentacion Reducida de los Ligandos
La presente invencion proporciona matrices de cromatograffa de afinidad que incorporan ligandos SpA basados en uno o mas dominios b O z, en el que uno o mas dominios incluyen una delecion de 3 o 4 o 5 aminoacidos consecutivos del extremo N, empezando en la posicion 1 o en la posicion 2. En algunas realizaciones, se une mas de un sitio en un ligando basado en SpA a una matriz de cromatograffa.
La presente invencion se basa en un descubrimiento inesperado y sorprendente de que los ligandos descritos en la presente memoria, tanto en la forma libre como cuando se inmovilizan en un soporte solido (p. ej., una matriz de cromatograffa), presentan una fragmentacion reducida despues de la exposicion a condiciones causticas prolongadas durante su uso en procesos de purificacion. Como se ha discutido anteriormente, dicha fragmentacion es indeseable ya que da lugar a fragmentos potencialmente inmunogenicos de los dominios de SpA terminando con la protema diana potencialmente terapeutica. Ademas, la fragmentacion hace que el proceso de purificacion sea mas costoso debido a la necesidad de usar mas ligando durante el proceso.
La fragmentacion de ligandos de afinidad puede detectarse facilmente usando metodos conocidos en la tecnica y aquellos descritos en la presente memoria. Dichos metodos incluyen, pero no estan limitados a, SDS-PAGE y SEC. La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con dodecil sulfato de sodio (SDS) se usa comunmente para el analisis del peso molecular de protemas. El SDS es un detergente que disocia y despliega las protemas. El SDS se une a los polipeptidos para formar complejos con relaciones bastante constantes de carga a masa. La velocidad de migracion electroforetica a traves de un gel solo esta determinada, por lo tanto, por el tamano de los complejos. Los pesos moleculares se determinan corriendo simultaneamente protemas marcadoras con un peso molecular conocido. El gel se tine ffpicamente y puede visualizarse la presencia de biomoleculas con diferentes pesos moleculares.
La cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) es un metodo en el que las moleculas en disolucion se separan por su tamano. Habitualmente, se aplica a complejos grandes o macromoleculares tales como protemas y poffmeros industriales. La deteccion de diferentes especies moleculares se realiza ffpicamente por UV-Vis o por dispersion de la luz. En el caso de UV-Vis, se elige una longitud de onda espedfica para la deteccion de determinadas especies.
Los ordenes en los que eluyen determinadas especies moleculares, segun se observa en el cromatograma, asf como la intensidad de los picos correspondientes, proporciona informacion sobre el tipo de especie, asf como sobre la cantidad relativa.
Como se demuestra por los ejemplos incluidos en la presente memoria, los ligandos SpA segun la presente invencion presentan una fragmentacion reducida respecto a sus equivalentes wt, despues de la exposicion a condiciones causticas. En un experimento ejemplar para mostrar la fragmentacion reducida, un ligando SpA que tiene una delecion en el extremo N, como se describe en la presente memoria, y su equivalente wt, se exponen ambos a NaOH 0,5M durante 25 hrs. La disolucion se neutraliza entones con un acido hasta pH 7. Las disoluciones neutralizadas se inyectan en SEC o se cargan en un gel de SDS-PAGE para analisis y comparacion.
En otro experimento ejemplar para mostrar la fragmentacion reducida, una matriz de cromatograffa de afinidad que incluye un ligando que tiene una delecion en el extremo N unido a un soporte solido (inmovilizado por union de multiples puntos), como se describe en la presente memoria, asf como una matriz de cromatograffa de afinidad que incluye su equivalente wt unido a un soporte solido (inmovilizado por union de multiples puntos), se exponen ambas a NaOH 0,5M durante 25 hrs. La disolucion caustica y la matriz (p. ej., en la forma de una resina) se separan y se neutralizan inmediatamente con un acido hasta pH 7. Las disoluciones neutralizadas se inyectan en SEC o se cargan en un gel de SDS-PAGE para analisis y comparacion.
VI. Ensayo para Determinar la Estabilidad en Condiciones Alcalinas de los Ligandos
Ademas de presentar una fragmentacion reducida durante su uso en procesos de purificacion, los ligandos descritos en la presente memoria tambien son estables en condiciones alcalinas. Posteriormente a la generacion de las matrices de cromatograffa que incorporan los ligandos basados en SpA descritos en la presente memoria, puede ensayarse la estabilidad en condiciones alcalinas de las matrices que contienen los ligandos usando tecnicas estandar en la tecnica y aquellas descritas en la presente memoria.
Por ejemplo, la estabilidad en condiciones alcalinas de un ligando inmovilizado en una matriz puede ensayarse usando tratamiento rutinario con NaOH a una concentracion de aproximadamente 0,5M, p. ej., como se describe en la presente memoria, asf como en la Publicacion de Patente U.S. No. 20100221844.
En algunas realizaciones, las moleculas de SpA estables en condiciones alcalinas, asf como las matrices que incorporan las mismas, presentan una estabilidad en condiciones alcalinas "incrementada" o "mejorada", lo que significa que las moleculas y matrices que incorporan las mismas son estables en condiciones alcalinas durante un periodo de tiempo prolongado respecto a sus equivalentes wt. Previamente, se ha reportado que las matrices de cromatograffa que incorporan ligandos SpA basados en el dominio B, C o Z wt de SpA o que tienen una mutacion en uno o mas residuos de asparagina proporcionan una estabilidad en condiciones alcalinas mejorada en condiciones en las que el pH es mayor de aproximadamente 10, tal como hasta aproximadamente 13 o 14. Sin embargo, parece que algunos de estos ligandos muestran fragmentacion durante su uso, especialmente despues de ciclos repetidos de CIP, como se observa por la presencia de fragmentos en un gel de SDS-PAGE o por SEC.
En algunas realizaciones, los ligandos segun la presente invencion, asf como las matrices que incorporan los mismos, no son mas estables en condiciones alcalinas que sus equivalentes wt; no obstante, presentan fragmentacion reducida. Uno de dichos ligandos descrito en la presente memoria es una forma pentamerica del ligando del dominio C que incluye una delecion en el extremo N en cada uno de los dominios y que incluye una mutacion G29K en cada uno de los dominios. Dicho ligando puede incluir ademas una alanina con el primer aminoacido en el pentamero para facilitar el procesamiento homogeneo posterior a la traduccion.
La presente invencion se basa en el descubrimiento sorprendente e inesperado de nuevos ligandos SpA (tanto en forma libre, asf como cuando se inmovilizan en una matriz de cromatograffa) que presentan una fragmentacion reducida durante su uso en procesos de purificacion respecto a algunos de los ligandos descritos previamente, ademas de retener al menos un 95% de la capacidad de union inicial despues de la exposicion prolongada a condiciones causticas (p. ej., NaOH 0,1M durante 25 horas o mas). En algunas realizaciones, mas de un sitio en los ligandos se une a un soporte solido y estos ligandos se basan en dominios B O Z de SpA, en el que los ligandos tienen una delecion de 3, 4 o 5 aminoacidos consecutivos del extremo N, empezando en la posicion 1 o en la posicion 2.
En algunas realizaciones, despues de 100 ciclos, incluyendo cada ciclo un tratamiento de 15 min con NaOH 0,5M, el porcentaje de capacidad de union retenida de los ligandos SpA descritos en la presente memoria (p. ej., aquellos que comprenden uno o mas dominios B o Z, y cualquier combinacion de los mismos, en el que al menos uno de los dominios C incluye una delecion de al menos 3 aminoacidos consecutivos del extremo N), es al menos 1,25 veces mayor, 1,5 veces mayo, 2,0 veces mayor, 2,5 veces mayor o 3 veces mayor que el equivalente wt.
En una realizacion, la estabilidad en condiciones alcalinas del ligando inmovilizado, segun se ensaya por la retencion de la capacidad de union a IgG con el tiempo, se mide como sigue. La capacidad de union, referida como Qd 50%, se mide mediante la obtencion del volumen de IgG cargada a una concentracion basada en la absorbancia a UV280nm del 50% de la concentracion de IgG inicial. La Qd 50% inicial de la matriz de cromatograffa (p. ej., resina empaquetada en una columna) se mide en primer lugar. La matriz de cromatograffa (p. ej., una resina como se ha descrito anteriormente) se expone entonces a aproximadamente 10 ciclos de una exposicion de 15 de NaOH 0,5M a 0,8 mL/min. La Qd 50% se mide de nuevo. Este proceso se repite hasta que la matriz de cromatograffa se expone a un total de aproximadamente 100 ciclos de NaOH 0,5M. La Qd 50% se mide una ultima vez y los resultados de la matriz de cromatograffa de afinidad que incluye ligandos (p. ej., resina de cromatograffa inmovilizada con ligandos) como se describe en la presente memoria se comparan con el tipo respectivo de dominios wt de SpA.
En otro ensayo, la estabilidad en condiciones causticas o alcalinas de la matriz se mide por empape estatico de la matriz. Mediante el empape de una cantidad medida de una matriz de cromatograffa de afinidad (p. ej., en formato de resina) en NaOH 0,1M, NaOH 0,3M o NaOH 0,5M durante 25 hrs con rotacion suave y medicion de la capacidad de union a IgG antes y despues del empape con NaOH, se puede determinar la estabilidad en condiciones alcalinas mediante la retencion de la capacidad de union de la matriz para IgG.
VII. Metodos para Purificar una Molecula Diana Usando una Matriz de Cromatograffa de la Invencion Un metodo para purificar una molecula diana a partir de una mezcla usando las matrices de cromatograffa de afinidad se describe en la presente memoria. La molecula diana puede ser cualquier molecula que es reconocida por un ligando de afinidad proporcionado en la presente memoria, en el que el ligando se acopla a un soporte solido (es decir, una matriz de cromatograffa). Los ejemplos de moleculas diana incluyen inmunoglobulinas y protemas que contienen Fc. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos policlonales o un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional de estos. Los fragmentos funcionales incluyen cualquier fragmento de una inmunoglobulina que comprende una region variable que todavfa se une espedficamente a su anffgeno mientras al mismo tiempo retiene su capacidad de unirse espedficamente a un ligando proteico acoplado a un soporte solido.
Un metodo para aislar una molecula diana de interes usando una matriz de cromatograffa de afinidad descrita en la presente memoria incluye las etapas de: (a) poner en contacto un soporte solido que incluye un ligando de cromatograffa basado en SpA inmovilizado que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13-42, SEQ ID No : 55-84 y SEQ ID NO: 93-95, con una mezcla que comprende una molecula diana en condiciones tales que la molecula diana se una espedficamente al ligando; y (b) alterar las condiciones de manera que la molecula diana ya no este unida al ligando, aislando de esta manera la molecula diana.
En algunas realizaciones, la etapa de alteracion incluye alterar el pH, de manera que la molecula diana ya no este unida al ligando. En una realizacion particular, el pH se altera de una manera tal que es mas acido que las condiciones de pH de la etapa (a). Por ejemplo, en una realizacion, la etapa (a) puede realizarse a un pH neutro, o a un pH que vana de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 y la etapa (b) puede realizarse a un pH acido, p. ej., un pH que vana de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.
En otra realizacion, la etapa (b) comprende alterar la concentracion de sal del tampon que se usa, de manera que la molecula diana ya no este unida al ligando. Por ejemplo, en una realizacion, puede usarse una alta concentracion de sal, p. ej., > 0,1M, en la etapa (a) y puede usarse una menor concentracion de sal, p. ej., <0,1M en la etapa (b). A la inversa, en algunas realizaciones, puede usarse una baja concentracion de sal, p. ej., < 0,1M en la etapa (a) y puede usarse una alta concentracion de sal en la etapa (b). En otras realizaciones mas, tanto el pH como la concentracion de sal del tampon pueden alterarse entre la etapa (a) y la etapa (b).
Un experto en la tecnica puede determinar facilmente las condiciones adecuadas para la union de una molecula diana a un ligando y, de esta manera, alterar las condiciones para disrumpir la union de la molecula al ligando. En general, se contempla que los ligandos descritos en la presente memoria pueden usarse en cualquier proceso de purificacion o en un tren de proceso de purificacion en el que se usan ffpicamente SpA nativa y SpA recombinante. En otras palabras, es deseable generalmente reemplazar la SpA nativa (p. ej., aislada de S. aureus) y la SpA recombinante (p. ej., SpA wt expresada recombinantemente) en los procesos presentes en la tecnica con los ligandos descritos en la presente memoria, con el fin de reducir el coste global, asf como para mitigar el riesgo de fragmentos de SpA potencialmente inmunogenicos que se copurifican con una molecula terapeutica potencial. Se describe un metodo para la purificacion de anticuerpos por cromatograffa de afinidad, en el que el metodo incluye las etapas siguientes: poner en contacto una alimentacion del proceso con una matriz de cromatograffa de afinidad segun la invencion con el fin de unir uno o mas anticuerpos de la alimentacion; una etapa de lavado opcional; anadir un tampon de elucion adecuado para liberar los anticuerpos unidos de la matriz; y recuperar el uno o mas anticuerpos del eluato. Las matrices de cromatograffa de afinidad descritas en la presente memoria tambien pueden usarse para aislar anticuerpos de ffquidos de cultivos, sobrenadantes, asf como caldos de fermentacion. En el caso de los caldos de fermentacion, el uso de matrices de cromatograffa de afinidad permite la separacion de anticuerpos de protemas de la celula huesped (HCP), ADN, virus, endotoxinas, nutrientes, uno o mas componentes de un medio de cultivo celular, p. ej., agentes antiespumantes y antibioticos, e impurezas relacionadas con el producto, tales como especies plegadas erroneamente y agregados.
En una realizacion espedfica, la alimentacion se somete a filtracion mecanica antes de ponerla en contacto con la matriz de cromatograffa de afinidad descrita en la presente memoria y, consecuentemente, la fase movil es un caldo de cultivo celular aclarado. Las condiciones adecuadas para la adsorcion son muy conocidas para los expertos en la tecnica.
Se describe un proceso con multiples etapas para la purificacion de anticuerpos, proceso que comprende una etapa de captura usando una matriz de cromatograffa de afinidad descrita en la presente memoria seguida de una o mas etapas posteriores para la purificacion de intermedios y/o pulido de los anticuerpos. En una realizacion particular, la etapa de captura esta seguida de cromatograffa de interaccion hidrofobica y/o de intercambio ionico y/o cromatograffa de particion debil en modo unir y eluir o flujo de salida. En una etapa alternativa, la etapa de captura esta seguida de cromatograffa de anionico o cationico multimodal y/o cromatograffa de particion debil en modo unir y eluir o flujo de salida.
En otra realizacion, cualquier ligando basado en SpA lixiviado de la matriz de cromatograffa de afinidad puede retirarse por las etapas de purificacion posteriores hasta niveles aceptables, p. ej., hasta niveles que se consideran aceptables para un ligando de Protema A nativa.
En general, se contempla que los ligandos descritos en la presente memoria pueden usarse en cualquier proceso que emplea ffpicamente ligandos de Protema A.
Esta invencion se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generacion de Ligandos de SpA Con Uno o Mas Dominios que Tienen una Delecion en el Extremo N de 4 aminoacidos consecutivos
Los genes sinteticos que codifican las siguientes protemas se obtuvieron a partir de DNA 2.0 (Menlo Park, CA). Una protema dimerica SpA que contema dos dominios Z, conteniendo cada dominio la mutacion en la posicion 29 (A29K) para reducir o eliminar la union a Fab (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO: 85); y una protema dimerica SpA que contema dos dominios Z, conteniendo cada dominio la mutacion A29K y conteniendo el segundo dominio Z una delecion para delecionar 4 aminoacidos consecutivos del extremo N (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID nO:78).
El extremo 5' de cada gen sintetico incluye un codon para una metionina de inicio y el extremo 3' incluye seis codones de histidina (SEQ ID NO:86) para la purificacion posterior usando una columna NiNTA. Los extremos 5' y 3' de cada gen contienen los sitios de restriccion Ndel y BamHI, respectivamente. Estos genes sinteticos, asf como el vector de expresion que se usa, es decir, pET11a (e Md ), se digieren con NdeI y BamHI (NEW ENGLAND BIOLABS, Ipswich, MA), los fragmentos de ADN se separan en un gel agarosa TAE al 0,7% y los fragmentos de ADN apropiados se escinden y purifican usando el kit de extraccion de gel de QIAGEN (Valencia, CA). Los insertos purificados se ligan en el nucleo de un pET11a o cualquier otro vector de expresion adecuado usando ADN ligasa T4 (NEW ENGLAND BIOLABS, Ipswich, MA).
La reaccion de ligacion se transforma en E. coli DH5a competentes (INVITROGEN, Carlsbad, CA), segun las instrucciones del fabricante, y se siembran en placas Technova LB que contienen 100 pg/mL de ampicilina y se crecen toda la noche a 37°C. Con el fin de obtener ADN purificado, se toman colonias individuales para un cultivo de toda la noche en LB que contiene 100 pg/mL de ampicilina. El ADN se purifica usando kits spin mini-prep de QIAGEN (Valencia, CA). La identidad de los plasmidos recombinantes se confirma por analisis de digestion de restriccion usando NdeI y BamHI (NEW ENGLAND BIOLABS, Ipswich, MA). Los mapas plasirffdicos para los plasmidos que incluyen ambos genes insertados para las construcciones dimericas del dominio Z se muestran en la Figura 2.
Adicionalmente, se generan construcciones que expresan una forma pentamerica del ligando SpA que contiene 5 dominios Z, conteniendo cada dominio la mutacion A29K (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:91); asf como una forma pentamerica del ligando SpA que contiene 5 dominios Z, con cada dominio conteniendo la mutacion A29K asf como conteniendo todos excepto los primeros dominios una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:84).
Ademas, tambien se generan construcciones del ligando SpA dimerico que contiene dominios C. Se genera una construccion dimerica que expresa un ligando de dominio C, cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:92; asf como se genera una construccion dimerica que expresa un ligando de 2 dominios C, en el que solo el segundo dominio C incluye una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N, cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:35. Estos ligandos de dominio C dimericos no tienen una mutacion en la posicion 29.
Ejemplo 2: Expresion y Purificacion de Ligandos Basados en SpA
Como se ha discutido anteriormente, cualquier sistema de expresion bacteriano adecuado puede usarse para expresar los distintos ligandos SpA descritos en la presente memoria. Por ejemplo, la protema puede expresarse en una cepa de Escherchia coli tal como la cepa BL21(DE3) (PROMEGA, Madison WI) usando un vector pET tal como pET11a (EMD).
Se selecciona una unica colonia de una placa y se crece toda la noche a 37°C en medio LB que contiene 100 pg/mL de ampicilina. El cultivo de toda la noche se diluye 100 veces en medio LB fresco que contiene 100 pg/mL de ampicilina y se crece hasta una densidad celular tal que la densidad optica a 600 nm es ~0,8. Despues de la adicion de isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido 1mM, las celulas se crecen durante dos horas adicionales. La expresion se confirma por analisis de SDS-PAGE y transferencia Western.
Las celulas se recogen por centrifugacion (4.000 rpm, 4°C, 5 minutos) y se resuspenden en 3 mL de disolucion salina tamponada con fosfato que contiene imidazol 20mM. Las celulas se lisan por sonicacion y los restos celulares se sedimentan por centrifugacion (4.000 rpm, 4°C, 30 minutos). Los ligandos SpA se purifican usando la resina NiNTA (QIAGEN), aplicando 25-30 mL de lisado celular por 3 mL de columna. Las columnas se lavan con 30 mL de disolucion salina tamponada con fosfato que contiene imidazol 20mM dos veces y la SpA se eluye en fracciones de 3 mL de disolucion salina tamponada con fosfato que contiene imidazol 200mM. La SpA se dializa toda la noche en agua 18 mega-Ohm Milli-Q® (MILLIPORE, Billerica, MA) seguido de NaHCO310mM. La concentracion de protema se confirma usando el espectrometro UV basado en el coeficiente de extincion teorico (Pace et. al., Protein Science 4:2411 (1995)).
Ejemplo 3: Union de Ligandos basados en SpA a un Soporte Solido
Posteriormente a la generacion y expresion de varios ligandos, como se describe en los Ejemplos 1 y 2, se inmovilizaron mediante la union de multiples puntos a un soporte solido.
En un experimento ejemplar, se entrecruza resina de agarosa (Sepharose 4B) (GE HEALTHCARE) usando epiclorohidrina segun un metodo descrito previamente (Porath y Fornstedt, J. Chromatography, 51:479 (1979)). La resina de agarosa se hace reaccionar posteriormente con grupos asociativos cargados positivamente, p. ej., cationes, segun el siguiente metodo: a 10 mL de resina, se anaden 5 mL de 75% en peso de cloruro de glicidil trimetilamonio (GTMAC), 5 mL de agua Milli-Q® (MILLIPORE, Billerica, MA) y 0,258 g de 50% en peso de hidroxido de sodio. El vial de la reaccion se rota en un hidridizador Techne HB-1D (BIBBY SCIENTIFIC, Burlington, NJ) toda la noche a temperatura ambiente. La resina se filtra entonces y se lava con tres volumenes de 10 mL de agua Milli-Q® (MILLIPORE, Billerica, MA).
La resina (10 mL, torta filtrada) se anade a un frasco que contiene 3 mL de NaOH 4,6M. La mezcla se pone en suspension de solidos y despues se anaden 4 mL de butanodiol diglicidileter (BUDGE). Esta mezcla se rota a 35°C durante aproximadamente 2 horas. La resina se lava entonces con 5x 10 mL de agua Milli-Q® (MILLIPORE, Billerica, Ma ) y se equilibra con 2x 10 mL de NaHCO310mM.
Inmediatamente despues de la etapa de activacion con BUDGE, a 5 mL de la torta de lecho filtrada se anaden 10 mL de disolucion de NaHCO310mM que contiene una concentracion de 2,5 y 2,3 mg/mL de ligando de dominio Z dimerico que contiene una mutacion A29K (SEQ ID:85) o el ligando de dominio Z dimerico que contiene delecion en el extremo N en el segundo dominio Z (SEQ ID:78). La mezcla se tapa en un vial de vidrio y el vial se rota a 37°C durante aproximadamente 2 horas. Despues de dos horas, la resina se lava 3 veces con 10 mL de agua Milli-Q®. La torta de lecho filtrada (10 mL) se anade a un frasco que contiene una disolucion de 10 mL comprendida por 1 mL de tioglicerol y 9 mL de una disolucion tampon con NaHCO30,2M y NaCl 0,5M. La mezcla se pone en suspension de solidos y se rota toda la noche a temperatura ambiente. La resina se lava entonces 3 veces con 10 mL de los siguientes tampones: tampon Tris 0,1M con NaCl 0,15M (pH 8) y acido acetico 50mM (pH 4,5). Esto se sigue por el lavado de la resina con 10 mL de agua Milli-Q® y 10 mL de disolucion al 20% (v/v) de etanol agua. La resina final se almacena en una disolucion al 20% (v/v) de alcohol agua antes de su uso adicional. El metodo de acoplamiento de los ligandos de dominio C dimericos a un soporte solido es similar al descrito en la presente memoria para los ligandos de dominio Z dimericos.
El metodo de acoplamiento de ligandos de 5 dominios descritos anteriormente (SEQ ID NO: 91 y 84) a resina con base de agarosa es similar al proceso anterior, excepto que se usan 15 mg/mL de ligando durante la etapa de acoplamiento. Los ligandos de dominio Z pentamericos no contienen una etiqueta de 6 His.
Ejemplo 4: Analisis por SDS-PAGE de los Sobrenadantes Recogidos Despues del Empape Caustico de Ligandos Libres o Inmovilizados
El analisis por SDS-PAGE puede usarse para detectar la fragmentacion de los ligandos libres e inmovilizados descritos en la presente memoria, despues de una exposicion caustica prolongada. Un protocolo de SDS-PAGE se describe a continuacion.
Se diluyen SpA en agua Milli-Q®, disolucion de ligando empapada en caustica neutralizada y disoluciones de resina empapada y neutralizadas (cada una contiene ~0,5 mg/mL de protema) a una relacion 1:1 con tampon de Laemmli (BIORAD, Hercules, CA). Las muestras se incuban a 70°C durante 5 minutos para asegurar que las protemas estaban completamente desnaturalizadas. Se cargan 10 pL de cada muestra en un gel AnyKD (BIORAD, Hercules, CA) o gel Tris-HCl Ready al 15% (BIORAD, Hercules, CA). La electroforesis en gel se lleva a cabo en tampon de operacion 1X Tris-Glicina-SDS (THERMOFISHER, Waltham, MA) a 200 voltios durante 30 minutos. El gel con SDS se tine entonces en reactivo de tincion Gelcode Azul (THERMOFISHER, Waltham, MA) durante 1 hora y se destine en agua Milli-Q® toda la noche.
Ejemplo 5: Analisis por SEC de los Sobrenadantes Recogidos Despues del Empape Caustico de los Ligandos Libres e Inmovilizados
Ademas del analisis por SDS-PAGE descrito anteriormente, tambien puede usarse SEC (cromatograffa de exclusion por tamano) para el analisis de la fragmentacion de los ligandos libres e inmovilizados despues de un empape caustico prolongado. Un experimento de SEC se describe a continuacion.
La SEC se lleva a cabo en un sistema Agilent 1100 HPLC (AGILENT, Santa Clara, CA). Se centrifugan SpA control en agua Milli-Q®, disolucion de ligando empapado caustico neutralizado (~0,5 mg/mL), y disoluciones empapadas de resina neutralizadas a 13.500 RPM durante 10 minutos antes del analisis por SEC-HPLC. Las muestras se inyectan en 20 pL en la columna de SEC (SEPAX Zenix 7,8 mm X 300mm, SEPa X TECHNOLOGIES, INC. Newark, Delaware). Se usa tampon de fosfato de sodio (200mM, pH 7,0) como la fase movil con una velocidad de flujo de 1 mL/min. Se usa el software ChemStation de Agilent para la adquisicion de los datos de SEC y el analisis tanto a 230 nm como a 280 nm.
Ejemplo 6: Empape Caustico de los Ligandos
Despues de la expresion de los ligandos, como se describe en el Ejemplo 2, los ligandos se exponen a condiciones alcalinas.
A 1 mL de cada uno de los ligandos descritos anteriormente (a una concentracion de 1mg/mL), se anade 1 mL de NaOH 1M hasta una concentracion final de NaOH 0,5M y 0,5 mg/mL de ligando. La muestra se rota suavemente durante 25 hrs. Esta disolucion se neutraliza entonces hasta pH ~ 7 usando 32 pL de acido acetico glacial.
El analisis de fragmentacion de los ligandos dimericos del dominio Z y dominio C usando SDS-PAGE despues de con y sin empape caustico se muestra en la Figura 3. Como se observa en la Figura 3, el ligando del dominio Z dimerico (A29K sin deleciones, mostrado en la SEQ ID NO:85, que se usa como el control) muestra una fragmentacion significativa despues de empape caustico en NaOH 0,5M durante 25 horas, como se demuestra por la presencia de una mancha, asf como la presencia de fragmentos mas pequenos de alrededor de 7 KDa (vease el Carril 3). Por el contrario, el ligando de dominio Z dimerico que tiene la mutacion A29K, asf como una delecion de 4 aminoacidos consecutivos en el segundo dominio (secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:78) parece estar en gran medida intacto despues del empape caustico en NaOH 0,5M durante 25 horas (vease el Carril 6).
De forma similar, el ligando del dominio C dimerico que no tiene deleciones (la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:92, usado como un control) muestra la presencia de una mancha, asf como de fragmentos mas pequenos de alrededor de 7 KDa en una SDS-PAGE despues del empape caustico en NaOH 0,5M durante 25 horas (vease el Carril 9) respecto a la construccion del dominio C dimerico que incluye una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N del segundo dominio, cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:35 (vease el Carril 12).
Cada uno de los ligandos del dominio Z y C dimerico incluye adicionalmente una etiqueta de 6 His. Los ligandos que no se exponen a empape caustico se muestran en el Carril 2 (control del dominio Z dimerico), Carril 5 (ligando de dominio Z dimerico que tiene una delecion en el extremo N), Carril 8 (control del dominio C dimerico) y Carril 9 (ligando del dominio C dimerico que tiene una delecion en el extremo N).
La fragmentacion reducida de los ligandos del dominio Z y C dimerico que tienen una delecion en el extremo N, despues del empape caustico prolongado, se pone de manifiesto ademas por SEC. Los resultados de un experimento de SEC representativo se muestran en la Figura 4 en la forma de un cromatograma de SEC. Como se observa en la Figura 4, los controles para el ligando del dominio Z (que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:85) asf como el ligando del dominio C (que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:92) muestran una fragmentacion significativa, identificada por flechas en el cromatograma en la Figura 4. Por el contrario, los ligandos del dominio Z y C dimerico que tienen las deleciones en el extremo N en el segundo dominio (la secuencia de aminoacidos del ligando del dominio Z se muestra en la SEQ ID NO:78 y la secuencia de aminoacidos del ligando del dominio C se muestra en la SEQ ID NO:35), muestran una fragmentacion reducida, como se identifica por cajas en el cromatograma en la Figura 4.
Adicionalmente, las formas pentamericas de los ligandos del dominio Z descritas anteriormente (es decir, el ligando del dominio Z pentamerico que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:91 que representa el control y el ligando del dominio Z pentamerico que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:84, que representa el ligando pentamerico que tiene una delecion de 4 aminoacidos consecutivos en el extremo N en todos excepto en el primer dominio) tambien se analizaron para determinar su fragmentacion por SDS-PAGE, despues de empape caustico en NaOH 0,5M durante 25 horas.
Como se pone de manifiesto por los datos del gel de SDS-PAGE en la Figura 5, la forma pentamerica del ligando del dominio Z que tiene una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N en todos excepto el primer dominio (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:84), muestra muchas menos fragmentacion despues del empape del ligando en NaOH 0,5M durante 25 horas (vease el Carril 3), respecto al control del ligando del dominio Z pentamerico, cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO:91 (vease el Carril 6). Como se ha discutido anteriormente, ambas formas de ligandos pentamericos tienen la mutacion A29K. Los ligandos que no se empapan parecen estar intactos (Carriles 2 y 5).
Los Carriles 8-10 representan la fragmentacion observada con un ligando SpA recombinante (rSPA), que se usa rutinariamente en los procesos de purificacion. El ligando rSPA parece mostrar un grado incluso mucho mayor de fragmentacion despues de empape caustico en NaOH 0,5M durante 25 horas respecto al control del dominio Z, como se observa por una casi desaparicion de la protema en la SDS-PAGE (vease el Carril 9). El ligando rSPA no expuesto a condiciones causticas esta en el Carril 8.
Este resultado parece sugerir que los ligandos basados en el dominio Z que tienen la delecion en el extremo N, como se describe en la presente memoria, son candidatos muy superiores que los ligandos SpA usados rutinariamente tales como, p. ej., rSPA.
Una reduccion en la fragmentacion despues de empape caustico en NaOH 0,5M durante 25 horas observada con el ligando del dominio Z pentamerico que tiene la delecion N-terminal se confirma ademas usando SEC, los resultados de uno de dichos experimentos representativos se muestran en la Figura 6.
Como se demuestra por el cromatograma en la Figura 6, el control de la forma pentamerica del dominio Z (SEQ ID NO:91) sin delecion de aminoacidos muestra picos bien resueltos a un peso molecular menor, lo que indica la presencia de fragmentos mas pequenos. Por el contrario, la forma pentamerica del dominio Z que tiene la delecion en el extremo N (SEQ ID NO:84) muestra significativamente menos picos distintos a intensidad mas baja, lo que indica un grado mucho menor de fragmentacion, respecto al control.
El ligando SPA usado rutinariamente, rSPA, muestra la mayor fragmentacion o degradacion sin permanecer nada de molecula intacta. Notablemente, el cromatograma de SEC es consistente con los resultados del analisis por SDS-PAGE en la Figura 5, poniendo adicionalmente de manifiesto que el ligando rSPA se ha degradado de tal manera que no pueden observarse fragmentos significativos en un cromatograma de SEC despues de la exposicion prolongada a condiciones causticas (es decir, empape en NaOH 0,5M durante 25 horas).
Ejemplo 7: Empape Caustico de Ligandos Inmovilizados en Resina
Los distintos ligandos descritos en los ejemplos anteriores se evaluan para determinar la fragmentacion despues de exposicion caustica posterior a su union a un soporte solido (p. ej., una resina de cromatograffa de agarosa).
Para cada resina de interes, se miden 1 mL de resina en 5 mL de columna desechable de cromatograffa (EVERGREEN SCIENTIFIC, Los Angeles, CA) usando agua Milli-Q®. La resina se acondiciona en una columna con 2 CV (2 mL) de NaOH 0,5M rapidamente, se vuelve a poner en suspension de solidos y se pone en vado. Despues de repetir la condicion de NaOH una vez mas, la torta humeda puesta en vado de la resina se transfiere a tubos de ensayo de 4 mL (THERMOFISHER, Waltham, MA). Se anaden 2 mL de NaOH 0,5M a la columna (la parte inferior esta tapada) e inmediatamente se transfiere al tubo de ensayo con la resina correspondiente. Los tubos de ensayo tapados se ponen en un rotador y se rotan los tubos de ensayo durante 25 hrs. Al final del empape caustico, el contenido de los tubos de ensayo se vierte en una columna desechable y se recoge el filtrado. El filtrado en 1,5 mL se neutraliza con 50 pL de acido acetico glacial y esta listo para analisis adicional por SEC y SDS-PAGE.
El analisis por SDS-PAGE de los ligandos de los dominios Z y C dimericos inmovilizados despues del empape caustico prolongado (p. ej., empape con NaOH 0,5M durante 25 horas) se muestra en la Figura 3. En general, se espera que si un ligando es estable en condiciones causticas despues de su inmovilizacion en una matriz de cromatograffa (p. ej., una resina de agarosa), no mostrara ninguna fragmentacion significativa.
Como se observa por el gel de SDS-PAGE de la Figura 3, ambos controles de los ligandos de los dominios Z y C dimericos inmovilizados (secuencias de aminoacidos mostradas en la SEQ ID NO:85 y 92, respectivamente y representados por los Carriles 4 y 10 del gel de SDS-PAGE, respectivamente) asf como los ligandos de los dominios Z y C dimericos inmovilizados que contienen una delecion en el extremo N en el segundo dominio (secuencias de aminoacidos mostradas en la SEQ ID NO:78 y 35, respectivamente y representados por los Carriles 7 y 13, respectivamente), no parecen mostrar ninguna fragmentacion detectable despues del empape en NaOH 0,5M durante 25 horas, lo que implica que ambos son estables en condiciones causticas.
El analisis por SDS-PAGE de los ligandos del dominio Z pentamerico inmovilizado despues del empape caustico prolongado (p. ej., empape con NaOH 0,5M durante 25 horas) se muestra en la Figura 5. Como se observa por el gel de SDS-PAGE en la Figura 5, el ligando del dominio Z pentamerico que contiene una delecion en el extremo N en todos excepto en el primer dominio (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:84 y representado por el Carril 4 del gel de SDS-PAGE), muestra mucha menos fragmentacion comparado con su control del dominio Z pentamerico wt (SEQ ID NO:91 y Carril 7). Este resultado sugiere que el ligando del dominio Z pentamerico inmovilizado que tiene deleciones en el extremo N es mas estable en condiciones causticas comparado con el dominio Z pentamerico inmovilizado que no tiene dichas deleciones.
Ademas, la fragmentacion de un ligando usado rutinariamente (es decir, rSPA) tambien se investigo por SDS-PAGE despues de su inmovilizacion en una resina de cromatograffa de agarosa y sometiendo la resina con el ligando a un empape prolongado en NaOH 0,5M durante 25 horas. Como se observa en el Carril 10 del gel de SDS-PAGE de la Figura 5, la rSPA inmovilizada muestra una fragmentacion significativa despues de empape en NaOH 0,5M durante 25 horas, lo que implica que no es muy estable en condiciones causticas, respecto a los ligandos del dominio Z pentamerico (Carriles 4 y 7).
Sobre la base de los resultados del gel de SDS-PAGE en la Figura 5, puede concluirse que el ligando del dominio Z pentamerico inmovilizado con las deleciones en el extremo N tiene la menor fragmentacion despues de una exposicion caustica prolongada y, por lo tanto, es mas estable en condiciones causticas, comparado con el ligando control del dominio Z pentamerico inmovilizado y la rSPA inmovilizada.
Una confirmacion adicional de los resultados de SDS-PAGE con los ligandos del dominio Z pentamerico inmovilizado y el ligando rSPA se obtiene por analisis por SEC. Los resultados de un experimento representativo se representan en el cromatograma mostrado en la Figura 7. Como se observa en la Figura 7, el ligando del dominio Z inmovilizado de la SEQ ID NO:84 muestra una fragmentacion reducida despues de un empape caustico prolongado, como se muestra por una caja, respecto a su equivalente wt de la SEQ iD NO:91, que muestra picos resueltos de menor peso molecular en el cromatograma. Ademas, como se esperaba, la rSPA inmovilizada muestra una fragmentacion extensa despues de un empape caustico prolongado como se observa por picos anchos y no resueltos en el cromatograma.
Ejemplo 8: Medicion de la Capacidad de Union Estatica de Matrices de Cromatograffa a una Inmunoglobulina antes y despues de la exposicion a NaOH 0,5M durante 25 horas
Las matrices de cromatograffa de afinidad (es decir, resinas que tienen las resinas inmovilizadas en ellas a traves de union de multiples puntos) descritas anteriormente se ensayan adicionalmente para determinar su capacidad de union estatica antes y despues de la exposicion a NaOH 0,5M durante 25 horas.
En un experimento, cada una de las matrices de cromatograffa (en 1 mL de volumen) inmovilizadas con los ligandos del dominio Z o C dimerico o pentamerico descritos anteriormente, bien con exposicion a NaOH 0,1, 0,3 o 0,5M o sin exposicion a NaOH, se prepara en una suspension de solidos al 10% en agua Milli-Q® (MILLIPORE, Billerica, MA). Se anade 1 mL de cada suspension de solidos a 15 mL de IgG policlonal (SERACARE, 1 mg/mL)) en tampon de disolucion salina con fosfato 10mM y se rota durante 4 horas a temperatura ambiente. La reduccion de UV a 280 nm se usa para calcular la capacidad antes y despues de la capacidad de union en condiciones causticas. El porcentaje de capacidad de union a IgG retenida se calcula dividiendo la capacidad de union a IgG despues de la exposicion caustica por la de sin exposicion caustica. La Tabla II resume los resultados de uno de dichos experimentos. Como se resume en la Tabla II, el ligando del dominio Z dimerico de la SEQ ID NO:78 parece presentar una capacidad de union retenida mayor respecto a su equivalente wt (es decir, el ligando del dominio Z dimerico de la SEQ ID NO:85), despues del empape caustico prolongado en NaOH 0,5M durante 25 horas.
De forma similar, como tambien resume en la Tabla II siguiente, el ligando del dominio C dimerico de la SEQ ID NO:35 parece presentar una capacidad de union retenida mayor que su equivalente wt de la SEQ ID NO:92, despues del empape caustico prolongado en NaOH 0,5M durante 25 horas.
Tabla II
Secuencia del Ligando inmovilizado en la matriz Capacidad de union estatica a IgG retenida de la matriz (%) SEQ ID NO: 85 64
SEQ ID NO: 78 70
SEQ ID NO: 92 65
SEQ ID NO: 35 70
En un experimento adicional, la capacidad de union a IgG de un ligando del dominio Z pentamerico se evalua despues del empape caustico prolongado en NaOH 0,1M, NaOH 0,3M o NaOH 0,5M durante 25 horas. Los resultados de uno de dichos experimentos se resumen en la Tabla III siguiente.
La Tabla III muestra el porcentaje de la capacidad de union a IgG retenida de una matriz que tiene inmovilizado en ella una forma pentamerica del ligando del dominio Z que contiene una mutacion A29K y todos excepto el primer dominio incluyen una delecion de cuatro aminoacidos consecutivos del extremo N (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO: 84), despues de empapar la matriz en NaOH 0,1M, NaOH 0,3M o NaOH 0,5M. Como se resume a continuacion, la matriz con el ligando del dominio Z pentamerico con delecion en el extremo N muestra hasta un 95% de la capacidad de union inicial, despues de empape en NaOH 0,1M durante 25 horas; hasta un 85% de la capacidad de union inicial, despues de empape en NaOH 0,3M durante 25 horas y hasta un 65% de la capacidad de union inicial, despues de empape en NaOH 0,5M durante 25 horas.
Concentraci on de NaOH (M) Capaci dad de union estatica a IgG retenida de la matri z inmovi l i zada con la SEQ ID 84 (%)
0,1 95
0,3 85
0,5 65
Ejemplo 9 : Captura por SpA de IgG Antes y Despues de la Exposicion a NaOH 0,5M
En este experimento, la purificacion de una inmunoglobulina policlonal en alimentacion de CHO-S nula usando una matriz inmovilizada con un pentamero del ligando del dominio Z con todos excepto el primer dominio teniendo una delecion de 4 aminoacidos consecutivos se examina junto con la que tiene una SpA sintetizada recombinantemente (rSPA) con el fin de demostrar que los ligandos segun la presente invencion funcionan tal bien como la SpA recombinante en la eliminacion de impurezas.
Las muestras de resina inmovilizadas con rSPA (REPLIGEN, Waltham, MA) y el ligando pentamerico del dominio Z (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO:84), se empaquetan cada una en una columna de cromatograffa con un diametro de 1 cm y una altura de lecho empaquetado de 5 cm. Despues del equilibrado con tampon de disolucion salina con fosfato (fosfato de sodio 10mM), las resinas empaquetadas se someten a exposicion de alimentacion de CHO nula con hIgG policlonal (SERACARE, 5 mg/mL) a una velocidad de flujo de 50 cm/hr. Despues de cargar al 90% de 5% de ruptura, la resina se lava con tampon PBS y NaOAc 50mM, pH 5,5. La IgG unida se eluye posteriormente con NaOAc 50mM, pH 3. Se recogen fracciones y se analizan para analizar las impurezas. La resina empaquetada se expone entonces a NaOH 0,5M durante 15 minutos (velocidad de flujo 100 cm/hr) antes de ponerla en contacto de nuevo con hIgG policlonal en alimentacion de CHO nula. Las resinas se lavan entonces con tampon PBS y NaOAc 50mM, pH 5,5 y la IgG se eluye para ensayo adicional.
Este ciclo de exposicion caustica y operacion alimentacion se repite para recoger suficiente IgG para la etapa de intercambio cationico posterior. La protema A lixiviada se cuantifica usando ELISA de n-Protema A (REPLIGEN, Waltham, MA) segun las instrucciones del fabricante. La protema de la celula huesped se detecta usando el kit 3G CHO HCP ELISA (CYGNUS TECHNOLOGIES, Southport, NC), segun las instrucciones del fabricante. El ADN se detecta usando el Reactivo Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA (LIFE TECHNOLOGIES, Foster City, CA). Los resultados de uno de dichos experimentos representativos se muestran en la Tabla IV.
Ejemplo 10: Aclaramiento de los Ligandos SpA Lixiviados y Eliminacion Adicional de ADN y Protema de la Celula Huesped usando Cromatografia de Intercambio Cationico e Intercambio Anionico
Se examina como sigue el aclaramiento de los ligandos, asf como la eliminacion adicional de protemas de las celulas huesped (HCP) y ADN del combinado de la elucion de matrices de cromatograffa de afinidad que incorporan bien los ligandos SpA segun la presente invencion o aquellos que contienen SpA recombinante, rSPA (REPLIGEN, Waltham, MA).
La combinacion de los combinados de elucion de varias repeticiones del experimento descrito en el Ejemplo 8 proporciona la alimentacion para un aclaramiento adicional de los ligandos lixiviados y otras impurezas usando cromatograffa de intercambio cationico.
Se empaqueta Fractogel SO3" (MILLIPORE, Billerica, MA) en una columna con una dimension de lecho de 1,0 cm (d.i.) x 7 cm (altura del lecho). La columna se equilibra con NaOAc 50mM pH 4,5, 4 mS/cm y se carga con la IgG combinada de la elucion de la Protema A a 140 cm/hr. Despues de lavar la columna con tampon EQ, la IgG se eluye con NaCl 0,5N en NaOAc 50mM en 20 volumenes de columna (gradiente lineal). Los combinados de la elucion se recogen en fracciones de 10 mL y se analizan para determinar los ligandos lixiviados, ADN y protema de la celula huesped.
Las fracciones de la columna Fractolgel SO3" se combinan adicionalmente y se justan hasta pH 7,6 a 12 mS/cm. Esta alimentacion se carga en un dispositivo ChromaSorb (0,08 mL, MILLIPORE, Billerica, MA) pre-equilibrado (Tris, 25mM, pH 7,6, ~1 mS/cm) a una velocidad de flujo de 1 mL/min. Se recogen fracciones para cada 187 volumen de la columna y se analizan adicionalmente para ligando lixiviado y protema de la celula huesped, como se describe en el Ejemplo 8.
Como se resume en la Tabla IV siguiente, tanto el ligando rSPA lixiviado, asf como la forma pentamerica del dominio Z con todos excepto el primer dominio teniendo una delecion en el extremo N de cuatro aminoacidos consecutivos (secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID:84), pueden aclararse hasta menos de 1 PPM despues de cromatograffa de intercambio cationico e intercambio anionico. Ademas, la eliminacion de protemas y ADN de la celula huesped cumple con el estandar industrial y es mas o menos equivalente en ambos casos, como tambien se resume en la Tabla siguiente.
Tabla IV
Figure imgf000029_0001
Ejemplo 11: Efecto del Numero de Deleciones de Aminoacidos en el Extremo N sobre la Fragmentacion del Ligando Despues de Empape Caustico Prolongado
En otro experimento, 1, 2, 3 o 4 residuos de aminoacidos se delecionaron del extremo N del segundo dominio de un ligando del dominio Z dimerico, empezando en la posicion 1 y se determino el efecto de las deleciones de 1, 2, 3 o 4 aminoacidos sobre la fragmentacion del ligando del empape caustico prolongado, comparado con el ligando del dominio Z dimerico control (A29K)
Los resultados de uno de dichos experimentos se representan en el cromatograma mostrado en la Figura 8. Como se demuestra en la Figura 8, el efecto sobre la fragmentacion del numero de residuos de aminoacidos que se delecionaron del extremo N del segundo dominio del ligando del dominio Z dimerico puede observarse despues del empape caustico prolongado de cada uno de los ligandos en NaOH 0,5M durante 25 horas seguido de analisis por SEC, como se describe en el Ejemplo 5.
Despues de empapar los ligandos en NaOH 0,5M durante 25 horas, cada uno del ligando control (SEQ ID NO:85), el ligando con solo el primer aminoacido delecionado del extremo N del segundo dominio (SEQ ID NO:87) y el ligando con los dos primeros aminoacidos delecionados del extremo N del segundo dominio (SEQ ID NO:88) muestra fragmentos a un peso molecular menor, como se representa por las flechas, evidenciando fragmentacion. Mientras, el ligando con los tres primeros aminoacidos delecionados del extremo N del segundo dominio (SEQ ID NO:69) y el ligando con los cuatro primeros aminoacidos delecionados del extremo N del segundo dominio (SEQ ID NO:78) mostraron una fragmentacion reducida significativamente a un peso molecular menor como se representa por cajas en el cromatograma, evidenciando una fragmentacion reducida.
Estos resultados sugieren que los ligandos de afinidad basados en uno o mas dominios de la Protema A y que tienen al menos 3 aminoacidos delecionados del extremo N de uno o mas dominios presentan una fragmentacion reducida despues de la exposicion caustica prolongada, son candidatos superiores para uso como ligandos de cromatograffa de afinidad.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una matriz de cromatograffa de afinidad que comprende un soporte solido con un ligando de cromatograffa de afinidad que comprende bien uno o mas dominios B de la Protema A de Staphylococcus aureus (SpA) con la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO.: 3 o codificado por la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO.: 9, o uno o mas dominios Z de SpA con la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO.: 6 o codificada por la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ ID NO.: 12, en donde al menos uno del uno o mas dominios esta mutado para delecionar tres, cuantro o cinco aminoacidos consecutivos del extremo N, empezando en la posicion 1 o en la posicion 2 de la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO.:6;
en la que el ligando presenta una fragmentacion reducida respecto a un equivalente de tipo salvaje, despues de la exposicion a NaOH 0,5M durante al menos 5 horas.
2. La matriz de cromatograffa de afinidad segun cualquier reivindicacion anterior, en donde uno o mas dominios B o uno o mas dominios Z del ligando comprenden ademas una mutacion de aminoacido en la posicion 29 para reducir la union a Fab, en donde dicha posicion corresponde a la posicion del dominio Z de SpA o B de SpA de tipo salvaje.
3. La matriz de cromatograffa de afinidad segun la reivindicacion 2, en donde la mutacion de aminoacido del dominio B comprende reemplazar un residuo de aminoacido glicina con un residuo de aminoacido lisina.
4. La matriz de cromatograffa de afinidad segun la reivindicacion 2, en donde la mutacion de aminoacido del dominio Z comprende reemplazar un residuo de aminoacido alanina con un residuo de aminoacido lisina.
5. La matriz de cromatograffa de afinidad segun cualquier reivindicacion anterior, que comprende dos o mas dominios B de SpA o dos o mas dominios Z de SpA, o cualquier combinacion de dominios B o Z en cualquier orden.
6. Una matriz de cromatograffa de afinidad segun cualquier reivindicacion anterior, que comprende al menos cinco dominios B de SpA o al menos cinco dominios Z de SpA, en donde cada uno de los dominios comprende una mutacion para reducir la union a Fab, asf como una delecion de 4 aminoacidos consecutivos del extremo N, empezando en la posicion 1, en donde dicha posicion corresponde a la posicion del dominio Z de SpA o B de SpA de tipo salvaje.
7. La matriz de cromatograffa de afinidad segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ligando de la cromatograffa de afinidad se une al soporte solido a traves de una union de multiples puntos.
8. La matriz de cromatograffa de afinidad segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la matriz retiene al menos el 95% de su capacidad de union inicial despues de 5 horas de incubacion en NaOH 0,5 M.
9. La matriz de cromatograffa de afinidad segun las reivindicaciones dependientes 1 a 7, en la que la matriz retiene al menos el 95% de su capacidad de union inicial despues de 25 horas de incubacion en NaOH 0,1 M.
10. La matriz de cromatograffa de afinidad segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el soporte solido se selecciona del grupo que consiste en vidrio con poro controlado, sflice, oxido de circonio, oxido de titanio, agarosa, polimetacrilato, poliacrilato, poliacrilamida, polivinileter, polivinil alcohol y poliestireno y derivados de estos.
11. Un metodo para purificar por afinidad una o mas moleculas diana de una muestra, comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) proporcionar una muestra que comprende una o mas moleculas diana;
(b) poner en contacto la muestra con la matriz de cromatograffa de afinidad segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en condiciones tales que la una o mas moleculas diana se unan a la matriz; y
(c) recuperar la una o mas moleculas diana unidas por elucion.
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