CN104645949B - 一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法。二甲基亚砜溶液中加入抽干基质和烯丙基溴进行活化；活化基质与N‑溴代丁二酰亚胺反应；将溴代醇化的基质与己二胺反应，得到氨基活化基质；依次用去离子水、无水乙醇和无水N,N‑二甲基甲酰胺洗涤，加入含有四肽、2‑(7‑偶氮苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯、N,N‑二异丙基乙胺的N,N‑二甲基甲酰胺溶液，偶联四肽配基；将偶联四肽的介质置于乙酸钠和乙酸酐的混合液中，得到以四肽作为功能配基的亲和层析介质。本发明所研制的新型层析介质，功能基团为酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸组成的四肽，基于抗体Fc片段的蛋白A结合位点而设计，抗体结合的选择性大幅度提高，可以用于抗体的高效分离。

Description

一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。

背景技术

抗体是指机体的免疫系统在外界抗原的刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗体具有多种生物活性，包括特异性结合抗原、激活补体和结合细胞Fc受体等，主要用途包括疾病治疗、体外诊断和检测、肿瘤定位显像等。

常见的抗体分离方法有盐析、离子交换层析、疏水相互作用层析和亲和层析等。抗体产品的质量要求通常较高，纯度大于90％，同时要求保持生物活性。盐析往往需要料液中抗体浓度较高，而且沉淀得到的抗体纯度和收率都较低。常规的离子交换层析和疏水相互作用层析能够分离抗体，但是特异性和选择性较低，需要多步分离。基于蛋白A或蛋白G的亲和层析，是目前抗体分离的通用技术，选择性高，但介质价格昂贵，蛋白配基易被料液中蛋白酶降解而脱落，增加后续分离的负担，且重复使用次数有限，操作成本较高。因此，开发具有抗体选择性的新型层析介质成为研究热点。

从上世纪80年代Porath等(Porath et al.,FEBS letters,1985,185:306)提出亲硫层析，到1998年Burton和Harding(Burton and Harding,J.Chromatogr.A,1998,814:71)报道的疏水性电荷诱导层析，再到混合模式层析(Pezziniet al.,J.Chromatogr.A,2011,1218:216；Toueille et al.,J.Chromatogr.B,2011,879:836)，以及基于小分子配基的仿生亲和层析(Li et al.,Nat Biotech,1998,16:190；Roque et al.,J.Chromatogr.A,2005,1064:157；Qian et al.,J.Chromatogr.B,2012,898:15)，抗体分离技术不断得到改进。专利(CN101279243；CN101279244；CN101284224)报道了疏水电荷诱导层析介质用于抗体选择性分离。专利(US Patent 8,802,448；US Patent 7,691,980)报道了混合模式层析介质分离抗体。然而，上述层析介质的功能基团都是结构相对简单的小分子配基，因此抗体的亲和力和选择性有限，从复杂料液中分离抗体难以得到理想的效果。相对于小分子配基，多肽配基则具有足够的亲和力和选择性，且比蛋白配基具有更好的稳定性。已报道的多肽配基有六肽HWRGWV(US Patent 7,408,030)、八肽FYWHCLDE(CN103014880)、环状五肽cyclo[Link-M-WFRHY-K](Menegatti et al.,Biotechnol.Bioeng.,2013,110:857)、环九缩酚酸肽cyclo[A-Dap(Nα-Ac)-RWHYFK-A-E](Menegatti et al.,Anal.Chem.,2013,85:9229)以及树状多肽TG19318(Fassina et al.,J.Mol.Recognit.,1998,11:128)等。上述多肽配基在实际应用时，有些与抗体相互作用较强，需要酸性或碱性较强的条件才能洗脱，影响抗体活性；有些配基的耐盐结合能力较弱，料液需要稀释。因此，开发性能更优良的多肽配基亲和介质，缩短肽链长度，提高抗体吸附容量，且具有耐盐吸附特性，洗脱条件温和，对于抗体的规模化制备具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法。

以四肽为功能配基的亲和层析介质包括层析基质、空间臂和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，空间臂为己二胺，配基为酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸组成的四肽。

所述的层析介质的结构组成为：

所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。

所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。

所述的层析介质的配基密度为20-100μmol/g介质。

所述的以四肽为功能配基的亲和层析介质的制备方法包括如下步骤：

1)将层析基质抽干后，加入0.5-1倍层析基质质量的20％(v/v)二甲基亚砜、0.1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠，30℃下180rpm摇床中活化8-48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；

2)将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下180rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的层析基质；

3)将溴代醇化的层析基质和0.1-0.3倍层析基质质量的己二胺以及1M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10-12，30℃下180rpm摇床中反应8-24小时，得到氨基活化基质；

4)取氨基活化基质，分别用去离子水、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺清洗，加入到含有0.2-1倍活化氨基密度的四肽、0.4-2倍活化氨基密度的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、0.8-4倍活化氨基密度的N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，25℃下水浴摇床中反应8小时，得到多肽偶联后的介质；

5)将多肽偶联后的介质依次用无水N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，去离子水洗涤，得到以四肽为功能基团的亲和层析介质。

本发明研制的以四肽为功能配基的亲和层析介质，配基结构基于分子模拟辅助设计，与蛋白A等天然配基结合抗体的模式类似，对抗体具有很好的亲和力和选择性，主要特点体现在：(1)抗体吸附容量大，静态吸附的饱和容量可达80mg/g湿介质以上；(2)具有耐盐吸附的特性，在较宽的盐浓度范围(0-1M NaCl)内，都能保持高吸附容量；(3)吸附速率快；(4)洗脱条件温和，仅需调节溶液pH至4～5，借助配基-蛋白间的静电排斥力，就可实现蛋白的有效洗脱；(5)氨基活化反应条件温和，成本低廉；(6)多肽配基偶联效率高，密度可控；(7)以己二胺为空间臂，多肽配基可以充分伸展到孔道空间，有利于抗体结合；(8)介质性质稳定，清洗再生方便。本发明的关键在于多肽配基的肽链较短，成本较低，偶联方便，效率高；四肽配基组成由分子模拟辅助设计，抗体选择性高，同时具有耐盐吸附特性，无需对料液进行稀释或加盐处理；洗脱条件温和，可避免过酸或过碱等洗脱条件对蛋白结构产生不良影响或活性损失，因此具有良好的抗体分离应用前景。

附图说明

图1是NaCl浓度对四肽亲和层析介质吸附人IgG的影响。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10mL 20％(v/v)二甲基亚砜溶液、10mL烯丙基溴和5g氢氧化钠，30℃下180rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下180rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和3mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 12)混合，30℃下180rpm摇床中反应24小时，得到氨基活化基质；取1g氨基活化基质，依次用去离子水、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，加入到2mL含100mg四肽、100mg 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和62.5μL N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时，得到多肽偶联介质；最后将多肽偶联介质依次用无水N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，去离子水洗涤，得到以四肽为功能基团的多肽亲和层析介质，配基密度为100μmol/mL。

实施例2

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入7.5mL 20％(v/v)二甲基亚砜溶液、8mL烯丙基溴和4g氢氧化钠，30℃下180rpm摇床中活化36小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化基质、4g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下180rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和3mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 11)混合，30℃下180rpm摇床中反应16小时，得到氨基活化基质；取1g氨基活化基质，依次用去离子水、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，加入到2mL含80mg四肽、80mg 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和50μL N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时，得到多肽偶联介质；最后将多肽偶联介质依次用无水N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，去离子水洗涤，得到以四肽为功能基团的多肽亲和层析介质，配基密度为80μmol/mL。

实施例3

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入5mL 20％(v/v)二甲基亚砜溶液、6mL烯丙基溴和3g氢氧化钠，30℃下180rpm摇床中活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化基质、3g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下180rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1.8mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 11)混合，30℃下180rpm摇床中反应12小时，得到氨基活化基质；取1g氨基活化基质，依次用去离子水、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，加入到2mL含60mg四肽、60mg 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和37.5μL N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时，得到多肽偶联介质；最后将多肽偶联介质依次用无水N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，去离子水洗涤，得到以四肽为功能基团的多肽亲和层析介质，配基密度为60μmol/mL。

实施例4

取抽干纤维素微球10g，加入10mL 20％(v/v)二甲基亚砜溶液、4mL烯丙基溴和2g氢氧化钠，30℃下180rpm摇床中活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化基质、2g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下180rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1.2mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 10)混合，30℃下180rpm摇床中反应8小时，得到氨基活化基质；取1g氨基活化基质，依次用去离子水、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，加入到2mL含40mg四肽、40mg 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和25μL N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时，得到多肽偶联介质；最后将多肽偶联介质依次用无水N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，去离子水洗涤，得到以四肽为功能基团的多肽亲和层析介质，配基密度为40μmol/mL。

实施例5

取抽干纤维素微球10g，加入5mL 20％(v/v)二甲基亚砜溶液、1mL烯丙基溴和1g氢氧化钠，30℃下180rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化基质、1g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下180rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1mL己二胺以及1M碳酸钠缓冲液(pH 10)混合，30℃下180rpm摇床中反应8小时，得到氨基活化基质；取1g氨基活化基质，依次用去离子水、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，加入到2mL含20mg四肽、20mg 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和12.5μL N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，25℃下水浴摇床中反应8小时，得到多肽偶联介质；最后将多肽偶联介质依次用无水N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，去离子水洗涤，得到以四肽为功能基团的多肽亲和层析介质，配基密度为20μmol/mL。

实施例6

取实施例1所得到的层析介质对人IgG的静态吸附性能进行测试，考察不同NaCl浓度的影响。首先用去离子水充分清洗介质,并用缓冲液平衡。分别准确称取0.03g介质于2mL离心管中，加入0.8mL不同人IgG浓度的缓冲溶液；将离心管置于恒温混匀仪中，25℃下1200rpm吸附3h，达到吸附平衡后，离心分离，取出上清液测定人IgG的浓度；根据物料平衡计算介质的吸附容量，绘制吸附等温线，并根据Langmuir方程拟合得到饱和吸附容量和解离常数。本发明实施例1制备的亲和层析介质在0M NaCl条件时，对人IgG的饱和吸附容量为88.8mg/g介质，解离常数为0.7mg/mL；在1M NaCl条件时，饱和吸附容量为64.6mg/g介质，解离常数为0.7mg/mL。结果表明，四肽亲和层析介质对人IgG吸附量较大，具有良好的耐盐吸附特性。

实施例7

取实施例1所得到的层析介质对单克隆抗体料液进行分离纯化。介质经平衡缓冲液(20mM磷酸钠盐缓冲液，pH 7.0，含1M NaCl)充分平衡，细胞培养液上样10mL；10个柱体积平衡缓冲液冲洗至基线；pH 4或者pH 5的20mM醋酸钠缓冲液洗脱；最后用0.1M NaOH进行原位清洗。洗脱得到的样品用非还原SDS-PAGE和HPLC分析，单克隆抗体纯度达到99.4％(洗脱pH为4)和99.5％(洗脱pH为5)。

Claims (5)

1.一种以四肽为功能配基的亲和层析介质，其特征在于包括层析基质、空间臂和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，空间臂为己二胺，配基为酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸组成的四肽；

层析介质的结构组成为：

。

2.根据权利要求1所述的一种以四肽为功能配基的亲和层析介质，其特征在于所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。

3.根据权利要求1或2所述的一种以四肽为功能配基的亲和层析介质，其特征在于层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。

4.一种如权利要求1所述的以四肽为功能配基的亲和层析介质的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将层析基质抽干后，加入0.2-1倍层析基质质量的体积百分比为20％的二甲基亚砜、0.1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠，30℃下180rpm摇床中活化8-48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；

2)将活化层析基质和0.1-0.5倍活化层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下180rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的层析基质；

3)将溴代醇化的层析基质和0.1-0.3倍溴代醇化的层析基质质量的己二胺以及1M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10-12，30℃下180rpm摇床中反应8-24小时，得到氨基活化基质；

4)取氨基活化基质，分别用去离子水、无水乙醇和无水N,N-二甲基甲酰胺清洗，清洗后的氨基活化基质加入到含有0.2-1倍活化氨基密度的四肽、0.4-2 倍活化氨基密度的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、0.8-4倍活化氨基密度的N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，25℃下水浴摇床中反应8小时，得到多肽偶联后的介质；

5)将多肽偶联后的介质依次用无水N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中，25℃下水浴摇床中反应1小时，去离子水洗涤，得到以四肽为功能基团的亲和层析介质。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的乙酸钠和乙酸酐的体积比为1:1。