CN107652352B - 一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质 - Google Patents

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Abstract

本案涉及一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质，以吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球为内核，在醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子，其中壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与水杨醛或者水杨醛衍生物缩合连接，该亲和层析介质表面通过配位固载Ni2+；通过空间位阻和螯合价位两方面的共同调控，实现对含有4×His‑Tag、5×His‑Tag、6×His‑Tag的重组蛋白的特异性分离纯化；本发明改进方法简单，生产成本低，有利于大规模的推广应用。

Description

一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质
技术领域
本发明涉及一种层析介质，具体涉及一种用于组氨酸标签蛋白纯化的金属螯合亲和层析介质。
背景技术
应用基因重组技术，通过体内或者体外方法能够获得具有特定功能和活性的重组蛋白，经过除杂达到一定纯度标准的重组蛋白可以作为相应医药产品的功能性组分。重组蛋白纯化要求将目标蛋白与其他蛋白、核酸、多糖等成分分离，同时要使目标蛋白的结构保持完整、生物活性保留。随着重组蛋白纯化工艺的发展，亲和标签已经成为重组蛋白纯化的一个重要且有效的工具，其中，由6个连续组氨酸组成的组氨酸标签(6×His-Tag)在蛋白亲和纯化以及免疫检测等领域应用最为广泛。由多个组氨酸组成的肽链(常用6～10个组氨酸)可以与二价金属离子(镍、铜、锌和钴等)之间产生较强的金属螯合作用，从而便于用金属螯合亲和层析纯化重组蛋白质。
目前已经商业化的用于组氨酸标签蛋白纯化的金属螯合亲和层析介质主要包括Ni-NTA Agarose和Ni-IDA Agarose两种配位结合镍离子的琼脂糖凝胶，在纯化过程中，带有组氨酸标签的重组蛋白通过与镍离子(Ni2+)螯合配位而吸附停留在凝胶上，杂质成分首先被缓冲溶液洗脱，然后调整缓冲溶液组分及pH值将目标重组蛋白特异性洗脱以达到分离纯化的目的。上述两种配位结合镍离子的琼脂糖凝胶不仅价格昂贵，而且适用范围窄，仅对末端含有6×His-Tag的重组蛋白有较好的纯化效果，在实际应用中，当重组蛋白末端融合6个组氨酸成串的肽段出现困难时，将无法实现有效的纯化。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于组氨酸标签蛋白纯化的金属螯合亲和层析介质。相比于现有技术，通过简单的调控，本发明能纯化含有特定组氨酸标签(4×His-Tag，即4个连续组氨酸组成的组氨酸标签；5×His-Tag，即5个连续组氨酸组成的组氨酸标签)的重组蛋白。
本发明的技术方案概述如下：
以吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球为内核，在所述醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子；所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与水杨醛或者水杨醛衍生物缩合连接；所述亲和层析介质表面通过配位固载Ni2+；
其中，所述水杨醛衍生物由水杨醛苯环上的氢被供电子基团取代所得。
优选的是，所述水杨醛衍生物为3-羟基水杨醛、3-甲基水杨醛、3-甲氧基水杨醛、4-羟基水杨醛、5-甲基水杨醛、5-甲氧基水杨醛中的一种。
优选的是，当所述氨基三乙酸与水杨醛或者水杨醛衍生物的摩尔比为1∶0.1-0.2时，能有效分离含有6×His-Tag的重组蛋白。
优选的是，当所述氨基三乙酸与水杨醛或者水杨醛衍生物的摩尔比为1∶0.8-1时，能有效分离含有5×His-Tag的重组蛋白。
优选的是，当所述氨基三乙酸与水杨醛或者水杨醛衍生物的摩尔比为1∶1.8-2时，能有效分离含有4×His-Tag的重组蛋白。
水杨醛及其衍生物中苯环上的醛基容易与氨基发生缩合反应生成席夫碱配基，席夫碱对金属具有较强的螯合配位作用，同时苯环会产生一定的空间位阻。席夫碱配基与氨基三乙酸配基的比例通过上述调控，可以对不同组氨酸数目的肽段实现有效筛选。
优选的是，所述Fe3+吸附量与Ni2+固载量的摩尔比为1∶1-1.2，醋酸纤维素微球内核对Fe3+的吸附量在0.4-0.6mol/m2，所吸附的Fe3+能够通过配位增强壳聚糖分子在醋酸纤维素微球表面的结合强度，使壳聚糖分子在使用过程中不易脱落。与此同时，在对席夫碱配基与氨基三乙酸配基进行调控时，内核吸附Fe3+的螯合配位与介质表面所固载Ni2+的螯合配位协调互补，使金属离子剩余特定的价位与组氨酸标签配位，结合配基在空间位阻上的筛选，实现对含有特定组氨酸标签的重组蛋白进行纯化。
优选的是，所述醋酸纤维素微球的粒径为40-50μm。
本发明的有益效果是：本案通过对金属螯合亲和层析介质进行设计改进，由席夫碱配基与氨基三乙酸配基相互配合以及吸附在内核的Fe3+与固载在介质表面的Ni2+共同作用，通过空间位阻和螯合价位两方面的共同调控，实现对含有4×His-Tag、5×His-Tag、6×His-Tag的重组蛋白的特异性分离纯化。本发明改进方法简单，生成成本低，有利于大规模的推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案提供一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质，以吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球为内核，在所述醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子；所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与水杨醛或者水杨醛衍生物缩合连接；所述层析介质表面通过配位固载Ni2+。改变介质表面两种配基的比例能够对具有组氨酸标签的重组蛋白分离提纯。
实施例1
制备过程如下：
1)将20g粒径为40～50μm的醋酸纤维素微球浸泡于1mol/L的醋酸铁缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、干燥；
2)在55℃，pH为5的条件下，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖键合于吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球表面，反应物的质量比为吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球∶壳聚糖∶戊二醛＝10∶4∶5，搅拌3～4小时；反应结束后，过滤并洗涤干燥；
3)反应体系中加入20g步骤2)所得微球、25mL环氧丙氯丙烷、20g(约0.1mol)氨基三乙酸、50mL的乙醇和5g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应5～6h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥；
4)反应体系中加入20g步骤3)所得微球、28g(约0.2mol)3-羟基水杨醛、50mL的乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应3～4h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥；
5)将上述步骤4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、洗涤三次、干燥即得能够特异性分离含有4×His-Tag重组蛋白的亲和层析介质。
实施例2
制备过程如下：
1)将20g粒径为40～50μm的醋酸纤维素微球浸泡于1mol/L的醋酸铁缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、干燥；
2)在55℃，pH为5的条件下，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖键合于吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球表面，反应物的质量比为吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球∶壳聚糖∶戊二醛＝10∶4∶5，搅拌3～4小时；反应结束后，过滤并洗涤干燥；
3)反应体系中加入20g步骤2)所得微球、30mL环氧丙氯丙烷、29mL(约0.15mol)氨基三乙酸、50mL的乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应6～8h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥；
4)反应体系中加入20g步骤3)所得微球、20g(约0.15mol)3-羟基水杨醛、50mL乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应2～3h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥；
5)将上述步骤4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、洗涤三次、干燥即得能够特异性分离含有5×His-Tag重组蛋白的亲和层析介质。
实施例3
制备过程如下：
1)将20g粒径为40～50μm的醋酸纤维素微球浸泡于1mol/L的醋酸铁缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、干燥；
2)在55℃，pH为5的条件下，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖键合于吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球表面，反应物的质量比为吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球∶壳聚糖∶戊二醛＝10∶4∶5，搅拌3～4小时；反应结束后，过滤并洗涤干燥；
3)反应体系中加入20g步骤2)所得微球、65mL环氧丙氯丙烷、60g(约0.3mol)的氨基三乙酸、50mL乙醇和6g LiOH，在55～60℃下搅拌反应6～8h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥；
4)反应体系中加入20g步骤3)所得微球、8.5g(约0.06mol)的3-羟基水杨醛、50mL的乙醇和3g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应1～1.5h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥；
5)将上述步骤4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、洗涤三次、干燥即得能够特异性分离含有6×His-Tag重组蛋白的亲和层析介质。
用SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计(NANODROP 2000c，Thermo,U.S.A)检测重组蛋白纯化前后的浓度，考察所制备的亲和层析介质对含有特定组氨酸标签的重组蛋白的提纯效果。首先以融合有4×His-Tag的重组蛋白A作为目标蛋白质，取1g含有该重组蛋白的混合物，用SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计检测其纯度，然后将其溶解于100mL结合缓冲液中(20mM PBS，pH＝7.8，500mM KCl，5mM咪唑)中，制得浓度为10mg/mL的4×His-Tag的重组蛋白A溶液；将该蛋白质溶液用实施例1所制备的亲和层析介质提纯，其中用洗脱缓冲液(20mMPBS，pH＝7.8，500mM KCl，250mM咪唑)洗脱2～3次，收集上清液包括原液和分离液，分别用SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计检测提纯后的重组蛋白A浓度。
采用相同的步骤，用实施例2所制备的亲和层析介质提纯分离含有5×His-Tag的重组蛋白A，实施例3所制备的亲和层析介质提纯分离含有6×His-Tag的重组蛋白A。采用相同的步骤对分别融合有4×His-Tag、5×His-Tag、6×His-Tag的目标重组蛋白G混合物进行提纯分离，测试并记录提纯前后的目标蛋白质浓度。测试结果如表1～3所示，可以看出实施例1～3分别对含有4×His-Tag、5×His-Tag、6×His-Tag的目标重组蛋白具有特异性的选择提纯作用。
表1
Figure BDA0001451543740000061
表2
Figure BDA0001451543740000062
表3
Figure BDA0001451543740000063
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (3)

1.一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质，其特征在于，以吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球为内核，在所述醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子；所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；所述亲和层析介质表面通过配位固载Ni2+；所述亲和层析介质用于特异性分离含有4×His-Tag重组蛋白；根据如下步骤获得所述亲和层析介质：
1)将20g粒径为40～50μm的醋酸纤维素微球浸泡于1mol/L的醋酸铁缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、干燥，以形成吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球；
2)在55℃，pH为5的条件下，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖键合于步骤1)的吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球表面，反应物的质量比为吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球∶壳聚糖∶戊二醛＝10∶4∶5，搅拌3～4小时；反应结束后，过滤并洗涤干燥，从而在所述醋酸纤维素微球的表面键合了壳聚糖分子；
3)取20g步骤2)所得微球、25mL环氧丙氯丙烷、20g氨基三乙酸、50mL的乙醇和5g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应5～6h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联；
4)取20g步骤3)所得微球、28g的3-羟基水杨醛、50mL的乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应3～4h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的的氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；
5)将步骤4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、洗涤三次、干燥；得到用于特异性分离含有4×His-Tag重组蛋白的亲和层析介质。
2.一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质，其特征在于，以吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球为内核，在所述醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子；所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；所述亲和层析介质表面通过配位固载Ni2+；所述亲和层析介质用于特异性分离含有5×His-Tag重组蛋白；根据如下步骤获得所述亲和层析介质：
1)将20g粒径为40～50μm的醋酸纤维素微球浸泡于1mol/L的醋酸铁缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、干燥，以形成吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球；
2)在55℃，pH为5的条件下，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖键合于步骤1)的吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球表面，反应物的质量比为吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球∶壳聚糖∶戊二醛＝10∶4∶5，搅拌3～4小时；反应结束后，过滤并洗涤干燥，从而在所述醋酸纤维素微球的表面键合了壳聚糖分子；
3)取20g步骤2)所得微球、30mL环氧丙氯丙烷、29mL氨基三乙酸、50mL的乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应6～8h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联；
4)取20g步骤3)所得微球、20g的3-羟基水杨醛、50mL的乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应2～3h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的的氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；
5)将步骤4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、洗涤三次、干燥；得到用于特异性分离含有5×His-Tag重组蛋白的亲和层析介质。
3.一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质，其特征在于，以吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球为内核，在所述醋酸纤维素微球的表面键合有壳聚糖分子；所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联，氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；所述亲和层析介质表面通过配位固载Ni2+；所述亲和层析介质用于特异性分离含有6×His-Tag重组蛋白；根据如下步骤获得所述亲和层析介质：
1)将20g粒径为40～50μm的醋酸纤维素微球浸泡于1mol/L的醋酸铁缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、干燥，以形成吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球；
2)在55℃，pH为5的条件下，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖键合于步骤1)的吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球表面，反应物的质量比为吸附有Fe3+的醋酸纤维素微球∶壳聚糖∶戊二醛＝10∶4∶5，搅拌3～4小时；反应结束后，过滤并洗涤干燥，从而在所述醋酸纤维素微球的表面键合了壳聚糖分子；
3)取20g步骤2)所得微球、65mL环氧丙氯丙烷、60g的氨基三乙酸、50mL乙醇和6g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应6～8h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的羟基端与氨基三乙酸交联；
4)取20g步骤3)所得微球、8.5g的3-羟基水杨醛、50mL的乙醇和3g的LiOH，在55～60℃下搅拌反应1～1.5h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤干燥，使得所述壳聚糖分子中的的氨基端与3-羟基水杨醛缩合连接；
5)将步骤4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时；过滤、洗涤三次、干燥；得到用于特异性分离含有6×His-Tag重组蛋白的亲和层析介质。
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