CN114459848B - 一种通用的蛋白质组学样品制备方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用的蛋白质组学样品制备方法，包括以下步骤：蛋白质的提取和变性：向生物性样本中加入含有十二烷基磺酸钠的裂解液，裂解生物样本；残余SDS固定：加入环糊精或环糊精衍生物溶液，使得十二烷基磺酸钠与环糊精形成SDS‑环糊精复合物；脱除：在肽段纯化步骤中利用所述SDS‑环糊精复合物与肽段的亲和能力不同将其分离。本发明适用于几乎所有的蛋白质组学样品制备，包括普通的蛋白质组学样品、翻译后修饰的蛋白质组学样品，例如磷酸化肽段的样品制备，同时由于其强裂解能力，以及能配合各种裂解手段例如超声、加热，因此适用于绝大多数生物样本，包括动物、植物、真菌、细菌、组织切片等难以裂解的生物样本，故本发明通用性良好。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学领域，更具体地，涉及一种通用的蛋白质组学样品制备方法。
背景技术
蛋白质组学的样品制备，是蛋白质组学检测的关键步骤。样品制备是蛋白质组学分析极其重要的一环，其直接决定了蛋白质组学数据质量的好坏。如果破碎生物样本或变性蛋白不彻底，会导致酶解失败；样品中过多的干扰物会极大降低目标物质检测信号，并且污染质谱仪。蛋白质组学的样品制备，主要是通过各种手段，破坏细胞结构，释放蛋白质，同时降低干扰物影响。
十二烷基磺酸钠(SDS)是目前已知裂解效果最佳的裂解剂，能充分释放蛋白质。然而现有的方法，如果不将SDS从样品中去除，残留的SDS不仅会影响反相色谱柱对目标物质的分辨能力，而且会抑制质谱对目标物质的检测信号，导致最终结果不理想。目前，去除SDS的蛋白质组学样品制备方法有：(1)FASP方法，其利用蛋白超滤管离心的方式去掉SDS，但是由于滤膜对蛋白不可避免的具有一定的吸附能力，因此会导致蛋白损失，造成检测不准，尤其是很多关键蛋白其丰度是微量或痕量级别，FASP方法制备的样品几乎不可用；(2)丙酮沉淀法，在蛋白样品中加入一定比例的丙酮(80％)，放在低温-20℃下沉淀过夜，低温离心十分钟，去掉上清，再加入预冷的丙酮，低温离心十分钟，再去掉上清，重复丙酮清洗步骤三次，操作繁琐，耗时较长，重复性不佳，且存在样品损失风险；SP3方法，利用疏水亲和层析珠结合蛋白，洗掉SDS，其需要多次清洗和离心，然后还要根据样品中蛋白量的不同而调整层析珠用量和体系，步骤繁琐，并且由于层析珠对不同蛋白的亲和能力不同，所以重复性不佳。
长期以来，蛋白质组学样品由于制备过程的繁琐或者不可避免的蛋白损失，导致蛋白质组学检测结果重复性差的问题未能得到解决。自蛋白质组学建立以来，一直在探索能有效释放蛋白、步骤简单、且重复性好的蛋白质样品制备方法。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种通用的蛋白质组学样品制备方法，其目的在于，利用现有的蛋白质组学样品制备方法中一般具备的肽段纯化步骤，脱除一直以来困扰蛋白质组学样品制备的十二烷基磺酸钠残留，仅仅通过简单添加环糊精或环糊精衍生物，由此解决现有技术针对不同来源的样品、裂解手段不同或目标肽段不同，需要针对性的开发复杂的SDS脱除工艺，甚至需要牺牲蛋白质样品含量或者不得不放弃使用SDS的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种蛋白质组学样品制备方法，其包括以下步骤：
蛋白质的提取和变性：向生物性样本中加入含有十二烷基磺酸钠的裂解液，裂解生物样本；
残余SDS固定：加入环糊精或环糊精衍生物溶液，使得十二烷基磺酸钠与环糊精形成SDS-环糊精复合物；
脱除：在肽段纯化步骤中利用所述SDS-环糊精复合物与肽段的亲和能力不同将其分离。
优选地，所述蛋白质组学样品制备方法，其所述纯化步骤包括脱盐、洗涤、和/或富集。
优选地，所述蛋白质组学样品制备方法，其所述脱除步骤为样品脱盐，具体包括：使用SDB-RPS填料脱除所述SDS-环糊精复合物；
所述脱除步骤为磷酸化肽段富集，具体包括：使用IMAC、TiO2等磷酸化肽段吸附剂吸附磷酸化肽段。
优选地，所述蛋白质组学样品制备方法，其所述使用SDB-RPS填料脱除所述SDS-环糊精复合物，具体为采用酸性有机相清洗。
优选地，所述蛋白质组学样品制备方法，其所述有机相为乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯、异丙醇中的一种或多种的组合，优选为异丙醇。
优选地，所述蛋白质组学样品制备方法，其所述向生物性样本中加入含有十二烷基磺酸钠质量浓度(g/mL)在0.5％至10％的裂解液。
优选地，所述蛋白质组学样品制备方法，其所述裂解液含有5-20mM还原剂、以及20-80mM的烷基化试剂，所述还原剂为TCEP和/或DTT，所属烷基化试剂为CAA和/或IAA；所述裂解液优选含有10mM的TCEP、以及40mM的CAA，其pH值在7-9之间，优选8.5。
优选地，所述蛋白质组学样品制备方法，其包括步骤：
将所述加入有裂解液的生物性样本高温裂解和/或超声辅助溶解；
所述高温裂解优选具体为：将加入有裂解液的生物性样本，加热至90-100℃，优选加热至95℃，保温5-30分钟，优选10分钟。
所述超声辅助溶解优选具体为：将加入有裂解液的生物性样本，10-50Hz超声10-60s。
优选地，所述蛋白质组学样品制备方法，其环糊精或环糊精衍生物与SDS的摩尔比在1-6:1之间。
优选地，所述蛋白质组学样品制备方法，其所述环糊精或环糊精衍生物溶液为α-环糊精溶液、β-环糊精溶液、γ-环糊精溶液、羟丙基-α-环糊精溶液、羟丙基-β-环糊精溶液、以及羟丙基-γ-环糊精溶液中一种或多种的组合；所述环糊精或环糊精衍生物浓度在100mM-250mM之间。
按照本发明的另一个方面提供了一种蛋白质组学样品制备试剂盒，其特征在于，包括含有十二烷基磺酸钠的裂解液、以及环糊精或环糊精衍生物溶液。
优选地，所述蛋白质组学样品制备试剂盒，其所述裂解液含有质量浓度(g/mL)在0.5％至10％的十二烷基磺酸钠、5-20mM还原剂、以及20-80mM烷基化试剂，所述还原剂为TCEP和/或DTT，所属烷基化试剂为CAA和/或IAA；所述裂解液优选含有10mM的TCEP、以及40mM的CAA，其pH值在7-9之间，优选8.5；
所述环糊精或环糊精衍生物溶液为α-环糊精溶液、β-环糊精溶液、γ-环糊精溶液、羟丙基-α-环糊精溶液、羟丙基-β-环糊精溶液、以及羟丙基-γ-环糊精溶液中一种或多种的组合；所述环糊精或环糊精衍生物浓度在100mM-250mM之间。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
由于能够在不增加蛋白质样品损耗环节的前提下，较彻底地分离SDS，适用于几乎所有类型的蛋白质组学样品制备，包括普通的蛋白质组学样品、翻译后修饰的蛋白质组学样品，例如磷酸化肽段的样品制备，同时由于其强裂解能力，以及能配合各种裂解手段例如超声、加热，因此能适用于绝大多数的生物样本，包括动物、植物、真菌、细菌、组织切片等难以裂解的生物样本，故本发明通用性良好。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的蛋白质组学样品检测结果；
图2是本发明实施例2提供的蛋白质组学样品检测结果；
图3是本发明实施例3提供的蛋白质组学样品检测结果；
图4是本发明实施例4提供的蛋白质组学样品检测结果；
图5是本发明实施例5提供的蛋白质组学样品检测结果；
图6是本发明实施例6提供的蛋白质组学样品检测结果；
图7是本发明实施例7、8提供的蛋白质组学样品检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的蛋白质组学样品制备方法，包括以下步骤：
(1)蛋白质的提取和变性
向生物样本中加入含有SDS质量浓度(g/ml)在0.5％至10％的裂解液，破坏生物样本，使得蛋白质充分释放并且变性，获得蛋白质粗提液。
优选所述裂解液，含有10-20mM二硫键还原剂如TCEP、以及40-80mM的CAA，优选含有10mM的TCEP、以及40mM的烷基化试剂CAA，其pH值在7-9之间，优选8.5。
优选方案为了更充分地释放蛋白质，将所述加入有裂解液的生物性样本高温裂解和/或超声辅助溶解，由于本发明采用SDS进行裂解，可以配合高温和超声手段，帮助蛋白溶解，而不至于由于蛋白不稳定在后续的样品制备步骤中形成沉淀影响蛋白质组学检测结果。
所述高温裂解具体为：将加入有裂解液的生物性样本，加热至90-100℃，优选加热至95℃，保温5-30分钟，优选10分钟。
所述超声辅助溶解具体为：将加入有裂解液的生物性样本，10-50Hz超声10-60s；
(2)残余SDS固定：
向步骤(1)中制备的蛋白质粗提液中加入环糊精或环糊精衍生物溶液充分混匀，使得环糊精或环糊精衍生物与SDS的摩尔比在1-6:1之间。环糊精或环糊精衍生物的疏水内腔会结合SDS的疏水尾部，形成SDS-环糊精复合物，从而较好地包裹SDS。所述SDS-环糊精复合物无需额外增加步骤脱除，只需要在后续的脱盐步骤采用酸性有机相进行清洗，即可较完全地脱除，不影响后续的蛋白质组学检测。
所述环糊精或环糊精衍生物溶液，优选为α-环糊精溶液、β-环糊精溶液、γ-环糊精溶液、羟丙基-α-环糊精溶液、羟丙基-β-环糊精溶液、以及羟丙基-γ-环糊精溶液中一种或多种的组合；所述环糊精或环糊精衍生物浓度在100mM-250mM之间。
(3)酶解
加入样品中蛋白质总质量1/50至1/100的胰酶进行酶解，也可加入1/100lysine-C进行辅助酶解；37℃，酶解4～18小时。
(4)脱除
在肽段纯化步骤中将所述SDS-环糊精复合物与目标肽段分离；所述纯化步骤优选包括脱盐、洗涤、和/或富集。
脱盐步骤具体包括：使用SDB-RPS填料脱除Tris-HCl、TCEP、CAA等小分子盐类化合物、以及SDS-环糊精复合物，获得吸附有目标肽段的SDB-RPS填料。
所述脱除SDS-环糊精复合物，具体为采用酸性有机相清洗，所述酸性有机相pH值小于3，优选在0-3之间，常用体积百分比浓度为1-5％的三氟乙酸或甲酸的有机相；所述有机相为乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯、异丙醇中的一种或多种的组合，优选为异丙醇。
所述脱除盐类化合物，具体为采用pH值在0～1的水溶液清洗，例如0.2％的三氟乙酸水溶液。
实验显示SDB-RPS能较好地分离SDS-环糊精复合体和肽段，其分离能力明显优于其他填料，例如C18填料，尤其是配合酸性有机相清洗剂，其中有机相以异丙醇的效果为优。
富集步骤具体包括：使用目标肽段吸附剂吸附目标肽段，获得吸附有目标肽段的吸附剂，例如使用IMAC、TiO2等磷酸化肽段吸附剂吸附磷酸化肽段，获得吸附有磷酸化肽段的吸附剂。
(5)洗脱：将目标肽段与填料、或吸附剂分离，获得所述蛋白质组学样品，用于蛋白质组学检测。例如：
将吸附有目标肽段的SDB-RPS填料，清洗后采用洗脱液洗脱，收集洗脱液并抽干溶剂，即制得所述蛋白质组学样品。又如：
将吸附有磷酸化肽段的磷酸化肽段吸附剂，清洗后采用洗脱液洗脱、收集洗脱液并抽干溶剂，即获得磷酸化肽段的蛋白质组学样品。
目前已经有一些研究采用环糊精包裹SDS形成稳定的复合体，从而提高质谱信号的响应。一方面，SDS-环糊精复合体虽然能改善质谱信号，但是若不将其去除，会严重污染质谱仪，使其不能被用于蛋白质组学的液质联用检测过程；另一方面，这些方法仅适用于简单的肽段样本，在成分复杂的生物样本中，SDS、环糊精与样本中本身存在的小分子尤其是盐类化合物会形成复杂的相互作用，SDS-环糊精复合体的形成条件无法明确。
本发明首先发现环糊精能在温和条件下优先于样品中其他分子与SDS形成稳定的复合体，并且发现SDS-环糊精复合体与肽段的亲和性质差异较大，从而利用SDS-环糊精复合体与肽段的亲和性质差异，将SDS-环糊精复合体与肽段分离。更为巧妙的是，在蛋白质组学样品制备过程中，一般都会包括肽段的纯化步骤，从而将肽段与细胞或组织样品中的其他成分分离，例如多糖、小分子代谢产物、盐类等；故本发明利用了现有的蛋白质组学样品制备过程中的肽段纯化步骤，将SDS-环糊精复合体分离达到脱除SDS的目的，避免SDS影响后续反相色谱柱的分辨能力以及抑制质谱的信号，重要的是不会因为SDS的添加而增加针对SDS的脱除步骤，减少由于脱除环节的增加导致的肽段样品损耗。
本发明的难点还在于确定SDS-环糊精复合体的形成条件，我们发现SDS和环糊精的添加量比例是形成SDS-环糊精复合体的重要因素，以保证环糊精能充分地包接SDS形成SDS-环糊精复合体，甚至可能与其他小分子形成复合体，而不影响蛋白质酶解、肽段提取纯化。本发明通过大量实验摸索，在环糊精或环糊精衍生物与SDS的摩尔比在1-6:1之间，能更好地形成SDS-环糊精复合体，有效地摒除SDS对蛋白质组学检测的不良影响。
故本发明提供的蛋白质组学样品制备方法在两层意义上实现了通用性，第一层意义的通用性体现在对于生物样本适用范围上，由于SDS的添加，使得本发明提供的蛋白质组学样品制备方法适用于各种类型的生物性样本，包括动物、植物、真菌、细菌等等，皆可采用SDS充分裂解细胞，必要时还可配合更为强烈的裂解手段，例如超声、高温，充分溶解蛋白质，从而获得更全面、准确的蛋白质组学检测结果；第二层意义的通用性体现在目标肽段样品制备类型上，无论是普通的蛋白质组学样品制备还是磷酸化肽段样品制备，势必经过肽段纯化步骤，避免小分子代谢物、盐类、多糖类、核酸类物质的干扰，而本发明将SDS固定为SDS-环糊精复合体，容易与肽段分离，适合各种类型的肽段纯化步骤，而无需另外增加针对SDS的脱除步骤，对各种类型蛋白质组学目标肽段样品的通用性高。
以下为实施例：
以下实施例中，质谱检测条件均为质谱分析使用SCIEX公司的TripleTOF 5600液质联用系统进行。肽段样品通过自动进样器吸入后结合至C18捕获柱(5μm,5×0.3mm)，接着被洗脱至分析柱(75μm×150mm,3μm particle size,
pore size,Eksigent)进行分离。利用两个流动相(流动相A:3％DMSO,97％H2O,0.1％formic acid和流动相B:3％DMSO,97％ACN,0.1％formic acid)建立分析梯度。液相的流速设置为300nL/min。质谱IDA模式分析时，每个扫描循环中包含一个MS全扫描(m/z范围是350-1250，离子累积时间250ms)，以及随后跟着的40个MS/MS扫描(m/z范围是100-1500，离子累积时间50ms)。MS/MS采集的条件设置为母离子信号大于120cps，电荷数为+2～+5。离子重复采集排除时间设置为18s。
实施例1
一种蛋白质组学样品制备方法，包括以下步骤：
(1)蛋白质的提取和变性
向鼠源细胞L929细胞裂解液中加入含有SDS质量浓度在1％的裂解液100μL，破坏生物性样本，使得蛋白质充分释放并且变性，获得蛋白质粗提液。
所述裂解液，为含有10mM TCEP、以及40mM CAA、PH值为8.5的Tris-HCl缓冲液。
将加入有裂解液的生物性样本，加热至95℃，保温10分钟。
取少量样品进行吸光度测定蛋白质含量，测定粗提液中蛋白质的总浓度。
(2)残余SDS固定：
向步骤(1)中制备的蛋白质粗提液中加入25μl 250mM的羟丙基-β环糊精溶液充分混匀，使得环糊精或环糊精衍生物与SDS的摩尔比分别为0、0.36、0.72、1.08、1.44、2.16、2.88、3.6、5.76。
(3)酶解
加入样品中蛋白质总质量1/50的胰酶进行酶解，加入1/100的lysine-C进行辅助酶解；37℃，酶解8小时。
(4)脱除
加入1％TFA，如果有沉淀产生，离心取上清进行脱盐。
使用SDB-RPS填料脱除Tris-HCl、TCEP、CAA等小分子盐类化合物、以及SDS-环糊精复合物，获得吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料。
用SDB-RPS柱子进行脱除具体操作为：
将StageTips柱子插到2mLEP管中，加入100μL的乙腈(ACN)到StageTip中，离心，4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干，进行填料柱活化；将酶解的肽段样品完全加入到柱子中，一次200μL，如果超过200μL，分多次加入。4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干。
所述脱除SDS-环糊精复合物，具体为采用酸性有机相清洗，所述酸性有机相为含有质量分数1％的三氟乙酸的异丙醇。具体操作为：
加入酸性有机相到柱子中，4000g/min，高速离心5min，将液体完全离干。
所述脱除盐类化合物，具体为采用0.2％的三氟乙酸水溶液。
加入酸性水溶液到柱子中，4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干。
(5)洗脱
将吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料，采用洗脱液洗脱，收集洗脱液相并抽干溶剂，即制得所述蛋白质组检测样品。
具体操作为：
将吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料柱玻璃内插管放入到1.5mL的有孔EP管的管孔中。
加入60μL 80％ACN/5％氨水到柱子里，4000g，2min。将液体离心到玻璃内插管，获得含有肽段样品的内插管，真空抽干，获得蛋白质组学样品。
质谱分析结果如图1所示，如果不加环糊精，只能检测到极少量的肽段。但是当加入环糊精的量与SDS的摩尔比例在为1.44左右时，质谱鉴定到的肽段和蛋白与SDC的方法相似，证明环糊精是有效的去除SDS的样品制备方法；当环糊精过多的加入，会和蛋白上氨基酸相互作用，掩盖胰酶的酶切位点，导致酶切的效率降低，从而使鉴定的肽段数目降低。
实施例2
一种蛋白质组学样品制备方法，包括以下步骤：
(1)蛋白质的提取和变性
向鼠源细胞L929细胞裂解液中加入含有SDS质量浓度在1％的裂解液100μL，破坏生物性样本，使得蛋白质充分释放并且变性，获得蛋白质粗提液。
所述裂解液，为含有10mM TCEP、以及40mM CAA、PH值为8.5的Tris缓冲液。
将加入有裂解液的生物性样本，加热至95℃，保温10分钟。
取少量样品进行BCA试剂盒蛋白浓度测定，测定粗提液中蛋白质的总浓度。
(2)残余SDS固定：
向步骤(1)中制备的蛋白质粗提液中加入25μl 250mM的α-环糊精溶液充分混匀，使得环糊精或环糊精衍生物与SDS的摩尔比分别为0、0.36、0.72、1.08、1.44、2.16、2.88、3.6、5.76。
(3)酶解
加入样品中蛋白质总质量1/50的胰酶进行酶解，加入1/100的lysine-C进行辅助酶解；37℃，酶解12小时。
(4)脱除
加入1％TFA，如果有沉淀产生，离心取上清进行脱盐。
使用SDB-RPS填料脱除Tris-HCl、TCEP、CAA等小分子盐类化合物、以及SDS-环糊精复合物，获得吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料。
用SDB-RPS柱子进行脱除具体操作为：
将StageTips柱子插到2ml EP管中，加入100ul的乙腈(ACN)到StageTip中，离心，4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干，进行填料柱活化；将酶解的肽段样品完全加入到柱子中，一次200ul，如果超过200ul，分多次加入。4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干。
所述脱除SDS-环糊精复合物，具体为采用酸性有机相清洗，所述酸性有机相为含有质量分数1％的三氟乙酸的异丙醇。具体操作为：
加入酸性有机相到柱子中，4000g/min，高速离心5min，将液体完全离干。
所述脱除盐类化合物，具体为采用0.2％的三氟乙酸水溶液。
加入酸性水溶液到柱子中，4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干。
(5)洗脱
将吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料，采用洗脱液洗脱，收集洗脱液相并抽干溶剂，即制得所述蛋白质组检测样品。
具体操作为：
将吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料柱玻璃内插管放入到1.5ml的有孔EP管的管孔中。
加入60ul 80％ACN/5％氨水到柱子里，4000g，2min。将液体离心到玻璃内插管，获得含有肽段样品的内插管，真空抽干，获得蛋白质组学样品。
质谱分析结果如图2所示，如果不加环糊精，只能检测到极少量的肽段。但是当加入环糊精的量与SDS的摩尔比例在为2.16左右时，质谱鉴定到的肽段和蛋白与SDC的方法相似
实施例3
一种蛋白质组学样品制备方法，包括以下步骤：
(1)蛋白质的提取和变性
向鼠源细胞L929细胞裂解液中加入含有SDS质量浓度在1％的裂解液100μL，破坏生物性样本，使得蛋白质充分释放并且变性，获得蛋白质粗提液。
所述裂解液，为含有10mM TCEP、以及40mM CAA、PH值为8.5的Tris缓冲液。
将加入有裂解液的生物性样本，加热至95℃，保温10分钟。
取少量样品采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，测定粗提液中蛋白质的总浓度。
(2)残余SDS固定：
向步骤(1)中制备的蛋白质粗提液中加入25μL 250mM的γ-环糊精溶液充分混匀，使得环糊精或环糊精衍生物与SDS的摩尔比分别为0、0.36、0.72、1.08、1.44、2.16、2.88、3.6、5.76。
(3)酶解
加入样品中蛋白质总质量1/50的胰酶进行酶解，加入1/100的lysine-C进行辅助酶解；37℃，酶解12小时。
(4)脱除
加入1％TFA，如果有沉淀产生，离心取上清进行脱盐。
使用SDB-RPS填料脱除Tris-HCl、TCEP、CAA等小分子盐类化合物、以及SDS-环糊精复合物，获得吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料。
用SDB-RPS柱子进行脱除具体操作为：
将StageTips柱子插到2ml EP管中，加入100ul的乙腈(ACN)到StageTip中，离心，4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干，进行填料柱活化；将酶解的肽段样品完全加入到柱子中，一次200μL，如果超过200μL，分多次加入。4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干。
所述脱除SDS-环糊精复合物，具体为采用酸性有机相清洗，所述酸性有机相为含有质量分数1％的三氟乙酸的异丙醇。具体操作为：
加入酸性有机相到柱子中，4000g/min，高速离心5min，将液体完全离干。
所述脱除盐类化合物，具体为采用0.2％的三氟乙酸水溶液。
加入酸性水溶液到柱子中，4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干。
(5)洗脱
将吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料，采用洗脱液洗脱，收集洗脱液相并抽干溶剂，即制得所述蛋白质组检测样品。
具体操作为：
将吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料柱玻璃内插管放入到1.5mL的有孔EP管的管孔中。
加入60μL 80％ACN/5％氨水到柱子里，4000g，2min。将液体离心到玻璃内插管，获得含有肽段样品的内插管，真空抽干，获得蛋白质组学样品。
质谱分析结果如图3所示，如果不加环糊精，只能检测到极少量的肽段。但是当加入环糊精的量与SDS的摩尔比例在为1.44左右时，质谱鉴定到的肽段和蛋白与SDC的方法相似。
实施例1至3表明，环糊精和SDS的摩尔比例很大程度上决定了样品制备的效果，不同种类环糊精的最佳添加比例虽然有区别，但是在与SDS的摩尔比例在1至6的范围内时，体现出较为一致的良好效果。
实施例4
一种蛋白质组学样品制备方法，包括以下步骤：
(1)蛋白质的提取和变性
向鼠源细胞L929细胞裂解液中分别加入含有SDS质量浓度在1％、5％、10％的裂解液100μL，破坏生物性样本，使得蛋白质充分释放并且变性，获得蛋白质粗提液。
所述裂解液，为含有10mM TCEP、以及40mM CAA、PH值为8.5的Tris缓冲液。
将加入有裂解液的生物性样本，加热至95℃，保温10分钟。
取少量样品采用BCA蛋白浓度测定试剂盒，测定粗提液中蛋白质的总浓度。
(2)残余SDS固定：
向步骤(1)中制备的蛋白质粗提液中加入25微升250mM的羟丙基-β-环糊精溶液充分混匀，使得环糊精或环糊精衍生物与SDS的摩尔比分别为1.44。
(3)酶解
加入样品中蛋白质总质量1/50的胰酶进行酶解，加入1/100的lysine-C进行辅助酶解；37℃，酶解12小时。
(4)脱除
加入1％TFA，如果有沉淀产生，离心取上清进行脱盐。
使用SDB-RPS填料脱除Tris-HCl、TCEP、CAA等小分子盐类化合物、以及SDS-环糊精复合物，获得吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料。
用SDB-RPS柱子进行脱除具体操作为：
将StageTips柱子插到2ml EP管中，加入100ul的乙腈(ACN)到StageTip中，离心，4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干，进行填料柱活化；将是酶解的肽段样品完全加入到柱子中，一次200μL，如果超过200μL，分多次加入。4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干。
所述脱除SDS-环糊精复合物，具体为采用酸性有机相清洗，所述酸性有机相为含有质量分数1％的三氟乙酸的异丙醇。具体操作为：
加入酸性有机相到柱子中，4000g/min，高速离心5min，将液体完全离干。
所述脱除盐类化合物，具体为采用0.2％的三氟乙酸水溶液。
加入酸性水溶液到柱子中，4000g/min，高速离心2min，将液体完全离干。
(5)洗脱
将吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料，采用洗脱液洗脱，收集洗脱液相并抽干溶剂，即制得所述蛋白质组检测样品。
具体操作为：
将吸附有蛋白样品的SDB-RPS填料柱玻璃内插管放入到1.5ml的有孔EP管的管孔中。
加入60ul 80％ACN/5％氨水到柱子里，4000g，2min。将液体离心到玻璃内插管，获得含有肽段样品的内插管，真空抽干，获得蛋白质组学样品。
质谱分析结果如图4所示，显示低浓度的SDS溶液(1％)即可起到良好的样品制备效果。而本发明提供的方法对于高浓度的SDS溶液(10％)也能起到良好的脱除效果。
实施例5
采用如实施例1的方法制备蛋白质组学样品，区别仅在于(4)脱除步骤采用的酸性有机相，含有质量分数1％的三氟乙酸的以下溶剂：异丙醇、乙腈、乙醇、丙酮、甲醇。
质谱分析结果如图5所示，显示异丙醇的洗脱效果较好，相对于甲醇提高了近70％。
实施例6
采用实施例1的蛋白质组学样品制备方法和SDC样品制备方法(参考文献minimalencapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation ineukarytotic cells Nature methods)，分别制备酵母和水稻叶的蛋白质组学样品，进行质谱分析结果如图6所示。
质谱分析结果如图6所示显示，本发明制备的蛋白质组学样品，无论是对于酵母还是水稻，都能取得相较于SDC样品制备方法更好的检测结果，保留更多的肽段信号，蛋白质种类提高17％至18％，肽段的信号强度提高20％至41％。
实施例7磷酸化肽段的蛋白质组学样品制备方法
一种蛋白质组学样品制备方法，包括以下步骤：
(1)蛋白质的提取和变性、(2)残余SDS固定、(3)酶解步骤同实施例1。
(4)脱除：富集步骤具体包括：使用目标肽段吸附剂吸附目标肽段，获得吸附有目标肽段的吸附剂，具体为：
加入等体积的12％TFA/ACN。仔细观察溶液中是否有沉淀，如果有沉淀，12,000rpm，5min，转移到上清到新管。
称量所需要的磷酸化肽段吸附剂(200μg蛋白对应3mg TiO2)，加入到样品中。至少2,000rpm，震荡10min确保磷酸化肽段吸附剂保持悬浮状态。2000g，1min，离心去掉上清液。
本实施例所采用的磷酸化肽段吸附剂为TiO2。
(5)清洗：
加入6％TFA/50％ACN，500μL,室温振荡2,000rpm，30s，2000g，1min，离心去掉上清液。重复4次，加入0.1％TFA/50％ACN，500μL，2,000rpm室温振荡30s。
(6)洗脱：
转移溶液到C8的StageTip中，4000g，2min；加入50μL洗脱液，4000g，2min，收集流出液；重复步骤1次，合并流出液；加入50μLACN到C8柱，离心，收集流出液，获得磷酸化肽段。
将磷酸化肽段加入TFA，使溶液成酸性，进行脱盐操作获得磷酸化肽段的蛋白质组学样品。
实施例8磷酸化肽段的蛋白质组学样品制备方法
一种蛋白质组学样品制备方法，包括以下步骤：
(1)蛋白质的提取和变性、(2)残余SDS固定、(3)酶解步骤同实施例1。
(4)脱除：富集步骤具体包括：使用目标肽段吸附剂吸附目标肽段，获得吸附有目标肽段的吸附剂，具体为：
加入等体积的20％乙酸/乙腈。仔细观察溶液中是否有沉淀，如果有沉淀，12,000rpm，5min，转移到上清到新管。
称量所需要的磷酸化肽段吸附剂(200μg蛋白对应10μL IMAC)，加入到样品中。至少2,000rpm，震荡10min确保磷酸化肽段吸附剂保持悬浮状态。2000g，1min，离心去掉上清液。
本实施例所采用的磷酸化肽段吸附剂为IMAC。
(5)清洗：
加入1％乙酸/50％乙腈，500μL,室温振荡2,000rpm，30s，2000g，1min，离心去掉上清液。重复4次，加入H2O，500μL，2,000rpm室温振荡30s。
(6)洗脱：
转移溶液到C8的StageTips中，4000g，2min；加入50μL洗脱液，4000g，2min，收集流出液；重复步骤1次，合并流出液；加入50μLACN到C8柱，离心，收集流出液，获得磷酸化肽段。
将磷酸化肽段加入TFA，使溶液成酸性，进行脱盐操作获得磷酸化肽段的蛋白质组学样品。
质谱分析结果如图7所示，从磷酸化肽段鉴定的结果来看，其与文献中报道的磷酸化结果类似，本发明提供的基于SDS的蛋白质组学样品制备方法，同样适用于磷酸化肽段的蛋白质组学样品制备，损失少，对于IMAC和TiO2等不同磷酸化肽段吸附剂差异较小。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (16)
1.一种蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
蛋白质的提取和变性：向生物样本中加入含有SDS质量浓度（g/ml）在0.5%至10%的裂解液，破坏生物样本，使得蛋白质充分释放并且变性，获得蛋白质粗提液；所述裂解液含有5-20 mM还原剂、以及20-80 mM烷基化试剂；
残余SDS固定：向蛋白质粗提液中加入环糊精或环糊精衍生物溶液充分混匀，使得环糊精或环糊精衍生物与SDS的摩尔比在1-6:1之间，使得十二烷基磺酸钠与环糊精形成SDS-环糊精复合物；
酶解；加入样品中蛋白质总质量1/50至1/100的胰酶进行酶解；
脱除：在肽段纯化步骤中利用所述SDS-环糊精复合物与肽段的亲和能力不同将其分离；所述肽段纯化步骤包括脱盐、清洗和/或富集；
脱盐步骤具体包括：使用SDB-RPS填料脱除小分子盐类化合物、以及SDS-环糊精复合物，获得吸附有目标肽段的SDB-RPS填料；
所述脱除SDS-环糊精复合物，具体为采用酸性有机相清洗，所述酸性有机相pH值小于3；所述酸性有机相为1-5%的三氟乙酸或甲酸的有机相；所述有机相为乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯、异丙醇中的一种或多种的组合；
富集步骤具体包括：使用目标肽段吸附剂吸附目标肽段，获得吸附有目标肽段的吸附剂；
洗脱：将目标肽段与填料和/或吸附剂分离，获得所述蛋白质组学样品，用于蛋白质组学检测。
2.如权利要求1所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，所述脱除步骤为磷酸化肽段富集，具体包括：使用IMAC、TiO2磷酸化肽段吸附剂吸附磷酸化肽段。
3.如权利要求1所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，所述环糊精或环糊精衍生物溶液为α-环糊精溶液、β-环糊精溶液、γ-环糊精溶液、羟丙基-α-环糊精溶液、羟丙基-β-环糊精溶液、以及羟丙基-γ-环糊精溶液中一种或多种的组合。
4.如权利要求1所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，所述环糊精或环糊精衍生物浓度在100 mM-250 mM之间。
5.如权利要求1所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，所述有机相为异丙醇。
6.如权利要求1至5任意一项所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，所述裂解液含有5-20 mM还原剂、以及20-80 mM烷基化试剂。
7.如权利要求6所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，所述还原剂为TCEP和/或DTT，所属烷基化试剂为CAA和/或IAA。
8.如权利要求7所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，所述裂解液含有10 mM的TCEP、以及40 mM的CAA，其pH值在7-9之间。
9.如权利要求1至5任意一项所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，包括步骤：
将所述加入有裂解液的生物性样本高温裂解和/或超声辅助溶解。
10.如权利要求9所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，所述高温裂解具体为：将加入有裂解液的生物性样本，加热至90-100 ℃，保温5-30分钟。
11.如权利要求9所述的蛋白质组学样品制备方法，其特征在于，所述超声辅助溶解具体为：将加入有裂解液的生物性样本，10-50 Hz超声10-60 s。
12.一种蛋白质组学样品制备试剂盒，其特征在于，包括含有十二烷基磺酸钠的裂解液、以及环糊精或环糊精衍生物溶液；所述裂解液含有质量浓度（g/mL）在0.5%至10%的十二烷基磺酸钠，所述环糊精或环糊精衍生物浓度在100 mM-250 mM之间；所述裂解液含有5-20mM还原剂、以及20-80 mM烷基化试剂。
13.如权利要求12所述的蛋白质组学样品制备试剂盒，其特征在于，所述还原剂为TCEP和/或DTT。
14.如权利要求12所述的蛋白质组学样品制备试剂盒，其特征在于，所述烷基化试剂为CAA和/或IAA。
15.如权利要求12所述的蛋白质组学样品制备试剂盒，其特征在于，所述裂解液含有10mM的TCEP、以及40 mM的CAA，其pH值在7-9之间。
16.如权利要求12所述的蛋白质组学样品制备试剂盒，其特征在于，所述环糊精或环糊精衍生物溶液为α-环糊精溶液、β-环糊精溶液、γ-环糊精溶液、羟丙基-α-环糊精溶液、羟丙基-β-环糊精溶液、以及羟丙基-γ-环糊精溶液中一种或多种的组合。
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