CN115931514A - 一种微量蛋白样品的前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种微量蛋白样品的前处理方法。本发明提供的微量蛋白样品的前处理方法，包括如下步骤：S1、向样品中加入裂解液，进行一步法裂解变性及还原烷基化处理；S2、向步骤S1处理后的样品中加入碳酸氢铵溶液，再加入单胰蛋白酶，进行酶切处理；S3、向步骤S2处理后的样品中加入酸性试剂，进行离心处理，取上清液；S4、对所述上清液进行热干处理，得到肽段冻干粉末。本发明提供的前处理方法无需超声处理即可保证较高的蛋白质数量鉴定，因而具有操作步骤少，省时省力、效率高等优点；同时该前处理方法选用的试剂为常规试剂，不仅种类少，而且成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物质谱检测技术领域，具体涉及一种微量蛋白样品的前处理方法。
背景技术
随着质谱技术的飞速发展，质谱公司也在推出越来越高分辨率的质谱仪，并且同时具有多个检测器，因而极大地提高了基于质谱的蛋白质组学检测效率。
在进行基于质谱的蛋白质组学中，最关键的是蛋白样品的前处理。样品前处理指：在蛋白样品上质谱仪之前，对蛋白样品进行裂解，酶切，纯化等处理的过程。前处理的目的是最终得到干净无杂质的蛋白样品，增加上机前蛋白样品的浓度，提高检测的灵敏度，因而在实际蛋白样品前处理过程中，往往需要大量的起始材料来让最终待测样品足够，从而得到最深的覆盖程度。
但对于稀有细胞（如细针抽吸活检），早期发育中的胚胎，以及流式分选的细胞等样本，因其数量过少而无法进行高通量、高灵敏度的蛋白质组分析。因此，开发高度敏感的技术以提供对生物医学领域极少数细胞和微量样品的深入和信息丰富的蛋白质组知识，就显得至关重要。
现有文献已提出多种适用于微量蛋白样品的前处理方法，例如iST方法，该方法采用商业化iST试剂盒，适用于1-20μg的起始样品量，可一步完成样品的裂解，变性，烷基化和还原，处理效率高，省事省力，但试剂盒价格昂贵，单次检测需要约$30。
同时现有专利申请文献也提出对微量蛋白样品前处理的方法改进，例如：CN110161155A公开一种从微量组织中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用。所述方法包括：向组织样品中加入裂解液，进行裂解；将裂解后的组织样品进行超声处理；向超声处理后的样品中加入还原剂进行温育，然后加入烷基化试剂进行烷基化处理；向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到肽段溶液。该方法试剂种类较多，成本高；且裂解、探针超声、还原、烷基化分步进行，操作步骤较多，操作时间较长。
CN115184110A公开了一种全类型生物蛋白质组学样本保存及自动化前处理方法，包括：向10μL蛋白样本中加入大量脱氧胆酸钠裂解5min，然后加入氯乙酰胺和三（2-羧乙基）膦盐酸盐的混合物，氯乙酰胺终浓度为10mM，三（2-羧乙基）膦盐酸盐的终浓度为40mM，反应30min，然后加入胰蛋白酶和赖氨酸酶。该方法同样需要将蛋白样本先裂解，再还原烷基化的分步处理方式，且还原烷基化反应时间及脱盐处理时间较长，虽为自动化处理，但并未对流程进行优化。
此外，现有专利文献还提出可通过优化裂解液配方，实现常量蛋白样品的一次性裂解、还原及烷基化反应，例如，CN110208448A提出的蛋白质组样本处理试剂盒及处理方法，以及CN112710755A公开的利用消化缓冲液处理血清/血浆蛋白质组样品的方法；但CN110208448A和CN112710755A的处理样品均为常量蛋白样品，CN110208448A中需要将裂解处理后样品先离心再酶切，并通过sRP液相分离，后续处理复杂；而CN112710755A则在加入消化缓冲液进行裂解还原烷基化之前需要先将样本离心除杂，纳米修饰，再次离心，重悬，离心等复杂操作。但由于微量蛋白样本数量过少，过多操作会导致样品损失，降低鉴定水平。
可见，现有微量蛋白样品处理的操作步骤多，受蒸发量和移液枪的微升容积的限制，样品量及反应体积将减少，蛋白质和多肽在反应容器表面的非特异性吸附性能受到的影响随之增大，鉴定结果的准确性随之降低；同时现有酶消化的效率较低，也影响前处理的处理效率。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的微量蛋白样品的前处理方法。本发明提供的前处理方法无需超声处理即可保证较高的蛋白质数量鉴定，因而具有操作步骤少，省时省力、效率高等优点；同时该前处理方法选用的试剂为常规试剂，不仅种类少，而且成本低廉。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种微量蛋白样品的前处理方法，包括如下步骤：
S1、向样品中加入裂解液，进行一步法裂解变性及还原烷基化处理；
S2、向步骤S1处理后的样品中加入碳酸氢铵溶液，再加入单胰蛋白酶，进行酶切处理；
S3、向步骤S2处理后的样品中加入酸性试剂，进行离心处理，取上清液；
S4、对所述上清液进行热干处理，得到肽段冻干粉末。
步骤S1中，所述裂解液的组成如下：质量浓度5-15%的脱氧胆酸钠，5-15mM的三(羧乙基)膦，30-50mM的2,2-二氯乙酰胺，50-100mM的碳酸氢铵，pH为8.0-8.8。优选地，所述裂解液的组成如下：质量浓度10-15%的脱氧胆酸钠，10-15mM的三(羧乙基)膦，40-50mM的2,2-二氯乙酰胺，50-100mM的碳酸氢铵，pH为8.0-8.8。
步骤S1中，所述脱氧胆酸钠的工作浓度为质量浓度10%；所述三(羧乙基)膦的工作浓度为10mM；所述2,2-二氯乙酰胺的工作浓度为40mM。
步骤S1中，所述一步法裂解变性及还原烷基化处理的反应条件为：温度为90-100℃，时间为5-15min。
步骤S2中，所述碳酸氢铵的工作浓度为50-150mM，优选为100-110mM；所述碳酸氢铵溶液加入后使体系中所述脱氧胆酸钠的质量浓度将至1%。
步骤S2中，所述胰蛋白酶的工作浓度为2-20ng/μL，优选为10-15ng/μL。研究表明，胰蛋白酶的工作浓度过高，会抑制信号显示，降低鉴定的灵敏度及准确性；若工作浓度过低，则酶切效果不好，肽段较少，也会影响鉴定结果的准确性。
步骤S2中，所述酶切的反应条件为：温度为35-40℃，时间为0.5-1h。
步骤S3中，所述酸性试剂为三氟乙酸或甲酸。
步骤S3中，所述离心处理的条件为：离心力为15000-20000g，时间为4-6min。研究表明，在前期裂解还原烷基化及酶切程度基础上，通过在此范围内的离心力可将其中部分杂质彻底分离出来，有利于简化后续除杂洗脱步骤。
步骤S4中，所述热干处理的条件为：温度为60-65℃，时间为50-70min。通过热干处理除盐，具体操作如下：将所述上清液（注意要吸取的干净，尽量不带任何白色沉淀物）移管（转移至新的EP管）后，进行热干处理。
在上述前处理方法中，所述样品为细胞样品。
在上述前处理方法中，所述样品的处理量为1k-10k个细胞。
在上述前处理方法中，还包括如下步骤：将所得肽段冻干粉末置于-80℃- -78℃保存；并在上质谱前用质量浓度0.1%的甲酸复溶。
本发明的有益效果如下：
1、本发明利用含有高浓度的脱氧胆酸钠、缓冲液碳酸氢铵的裂解液，在无需超声的情况下对样品实现一步法裂解变性及还原烷基化处理，避免了现有方法中多步骤添加液体、移/换管、超声及避光等处理步骤，同时也避免了现有同步裂解变性及还原烷基化方法中存在的样品复杂的预处理或后处理步骤，从而大大减少了实验过程中因操作和液体转移而带来的样品损失，提高了微量蛋白样品的鉴定水平，同时也提高了前处理效率。
2、本发明提出在酶切处理前先补充碳酸氢铵溶液，以使体系中脱氧胆酸钠的质量浓度降至1%以下，从而避免在后续酶切过程中脱氧胆酸钠对胰蛋白酶的影响。
3、本发明优化胰蛋白酶的工作浓度，从而在不转移样品的前提下仅利用单胰蛋白酶以较短的时间完成酶切，避免了现有方法中酶切前离心等操作带来的样品损失，进一步提高鉴定水平。
4、本发明提供的前处理方法简化了后续除盐流程，即仅通过热干处理实现除盐，且不影响蛋白质数量鉴定的准确性，进一步保留了肽段的数量，节约了步骤和时间，提高了处理效率。
5、本发明提供的前处理方法，整个处理过程用时不超过2小时，其中手动操作时间只需半小时，大大提高了微量蛋白样本的前处理效率。
6、本发明提供的前处理方法所使用的裂解液均为常规试剂，种类较少，酶切仅需单胰蛋白酶，大大降低了前处理的试剂成本，每个样品处理仅需20元人民币。
附图说明
图1为本发明所述前处理方法的流程示意图。
图2为实施例1中采取不同裂解液作用下的蛋白鉴定对比图。
图3为实施例1中采取不同蛋白酶作用下的蛋白鉴定对比图。
图4为实施例1中采取不同酶工作浓度作用下的蛋白鉴定对比图。
图5为实施例1中采取不同酶工作时间作用下的蛋白鉴定对比图。
图6为实施例1中采取不同除盐方式作用下的蛋白鉴定对比图。
图7为实施例1中采取/不采取超声处理作用下的蛋白鉴定对比图。
图8为实施例1中采取/不采取补充碳酸氢铵溶液作用下的蛋白鉴定对比图。
图9为实施例1所提供的前处理方法与现有iST方法的蛋白鉴定对比图。
图10为实施例2中不同数量脾细胞经本发明提供的前处理方法处理后的蛋白鉴定数量。
图11为实施例2中不同数量肝细胞经本发明提供的前处理方法处理后的蛋白鉴定数量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
实施例中所用到的材料及厂家、规格如下：
三(羧乙基)膦：ALDRICH C4706-10G。
2,2-二氯乙酰胺：ALDRICH C0267-100G。
脱氧胆酸钠（SDC）：Life Science 0613-100G。
碳酸氢铵：Solarbio A0240 500G。
胰蛋白酶：Promega V5117 100G。
质谱仪：ThermoFisher公司Fusion-Lumos；检测条件为离子扫描模式，电喷雾电压2kV，一级质谱分辨率120000，AGC为5e5，最大离子注入时间50ms，全扫描质核比300~1400;二级质谱母离子采用数据依赖模式，HCD碰撞能量设定为30%，AGC为5e3，最大离子注入时间35ms，动态排除18s，质谱采集时间75min。优选的，如果想要获得更深度的覆盖，质谱采集时间可以延长至150min，二级母离子扫描模式选择非数据依赖模式。如果想进一步提高蛋白和肽段的鉴定水平，可以选择灵敏度更高的Thermo Scientific Orbitrap Exploris™480。
实施例1、针对293T细胞样品的前处理方法
293T细胞样品的前处理方法，如图1所示，操作如下：
（1）取10000个293T细胞，用PBS缓冲液清洗后，加入EP管中；再向其中加入10μL裂解液，吹打混匀后于95℃加热10min，一次性完成裂解变性和还原烷基化，放置室温；
上述裂解液的组成如下：质量浓度10%的脱氧胆酸钠，10mM的三(羧乙基)膦，40mM的烷基化试剂2,2-二氯乙酰胺，100mM的碳酸氢铵（pH=8.0）；
（2）向所得液体中加入90μL 100mM的碳酸氢铵溶液，使体系中脱氧胆酸钠的质量浓度将至1%，处于适合胰蛋白酶工作的状态下；
继续加入1μg/μL的trypsin胰蛋白酶1μL，37℃加热0.5h，完成酶切，得到肽段；所述胰蛋白酶的工作浓度为10ng/μL；
（3）继续加入2μL的三氟乙酸，震荡10s，将脱氧胆酸钠沉淀出来，再以20000g离心力离心5min，出现白色沉淀，吸取上清液；
（4）将所得上清液（注意要吸取的干净，尽量不带任何白色沉淀物）转移至一新EP管中，热干60min，完成除盐，得到肽段冻干粉末；
将处理后的样品放置-80℃冰箱内保存，备用；
在上质谱前，用10μL的质量浓度0.1%的甲酸复溶。
效果验证1：
1、含有不同浓度的脱氧胆酸钠的裂解液作用下的蛋白鉴定对比效果，如图2所示，10%脱氧胆酸钠对于微量细胞有更好的裂解效果，能够鉴定到更深度的蛋白水平。
2、不同蛋白酶作用下的蛋白鉴定对比效果，如图3所示，单独的胰蛋白酶与赖氨酸蛋白酶/胰蛋白酶组合相比，二者的酶切效果相似，说明采取本发明所述的方法时，采用单胰蛋白酶同样能够鉴定到相同水平的肽段。
3、不同酶工作浓度作用下的蛋白鉴定对比效果，如图4所示，对于微量样品，酶的工作浓度更加重要，通过测试2ng/μL和20ng/μL两个浓度，发现效果相同，故酶的工作浓度在2-20ng/μL内都可以实现较好的酶切效果。
4、不同酶工作时间的蛋白鉴定对比效果，如图5所示，对于微量样品，酶工作时间控制在0.5h时即可取得较好的鉴定效果，而酶工作时间16h的过夜酶切效果反而较差，由此说明采用本发明所述的前处理方法，不仅大大缩短酶切时间，且提高酶切效果。
5、不同除盐方式作用下的蛋白鉴定对比效果，如图6所示，利用C18除盐柱进行除盐能够得到更加干净的肽段，但操作步骤复杂，增加了操作的时间；而采用直接热干除盐方式不仅简化操作，还不会影响蛋白的鉴定水平。
上述C18除盐柱除盐方式的操作如下：
（1）C18脱盐柱的制备：
利用15号钝针头在厚度0.5mm的C18膜中心打一个孔，然后将其推入10μL移液器吸头中并紧贴移液器吸头的侧壁，即得到脱盐柱；
（2）适配器：
取一个1.5ml的EP管的盖子，用刀将盖子表面划一个十字，十字的尺寸与10μL移液管吸头的孔径相匹配，即得到适配器；
将填充C18膜的脱盐柱通过十字开口卡在适配器上，并在脱盐柱的下边接一个1.5ml的EP管。
（3）脱盐柱的活化、平衡、除杂：
活化：向脱盐柱中加入50μL乙腈进行活化，以1000g离心力离心1min；
平衡：向离心后的脱盐柱中加入50μL的含有质量浓度70%乙腈/质量浓度0.1%三氟乙酸的溶液进行平衡，以1000g离心力离心1min；
除杂：向平衡后的脱盐柱中加入50μL的质量浓度0.1%三氟乙酸溶液除杂，以1000g离心力离心1min；
弃掉移液器吸头下边的原有EP管，更换一个新的1.5ml的EP管，备用。
由此可见，C18除盐柱除盐方式操作过于繁琐，操作中样品易损失，影响鉴定水平。
6、采取/不采取超声处理作用下的蛋白鉴定对比效果，如图7所示，对于组织样品，超声能够辅助裂解，得到更好的裂解效果；但对于微量样品，通过测试发现，是否超声对于鉴定水平没有本质提升，故采用本发明提供的处理流程可省去超声这一步骤，提高处理效率；该测试中超声采用非接触式超声 AMP: 80% Pulse: 30s on 30s off Time: 5min。
7、采取/不采取补充缓冲液碳酸氢铵溶液作用下的蛋白鉴定对比效果，如图8所示，虽然经过裂解处理后，体系中脱氧胆酸钠的浓度有所降低，但仍然会影响胰蛋白酶的酶切效果，而通过添加碳酸氢钠溶液稀释脱氧胆酸钠的浓度至1%以下后，酶切效果较好。
8、实施例1所提供的前处理方法与现有iST方法的对比效果，如图9所示，与iST相比，实施例1的前处理方法具有更高的蛋白和肽段鉴定水平，且具有更高的稳定性。
实施例2、针对小鼠原代细胞（脾细胞和肝细胞）的前处理
小鼠原代细胞（脾细胞和肝细胞）的前处理，操作如下：
（1）分别取100，1000和10000个小鼠原代脾细胞和肝细胞，经过消化清洗后，分别加入EP管中；向各管中加入10μL裂解液，吹打混匀后于95℃加热10min，一次性完成裂解变性和还原烷基化，放置室温；
上述裂解液的组成如下：质量浓度10%的脱氧胆酸钠，10mM的三(羧乙基)膦，40mM的烷基化试剂2,2-二氯乙酰胺，100mM的碳酸氢铵缓冲液（pH=8.0）；
（2）向各自所得液体中加入90μL 100mM的碳酸氢铵溶液，使体系中脱氧胆酸钠的质量浓度将至1%，处于适合胰蛋白酶工作的状态下；
继续加入1μg/μL的trypsin胰蛋白酶1μL，37℃加热0.5h，完成酶切，得到肽段；所述胰蛋白酶的工作浓度为10ng/μL；
（3）继续向各管中加入2μL的三氟乙酸，震荡10s，将脱氧胆酸钠沉淀出来，再以20000g离心力离心5min，出现白色沉淀，吸取上清液；
（4）将各自所得上清分别转移至一新管，热干60min，完成除盐，得到肽段冻干粉末；
将处理后的样品放置-80℃冰箱内保存，备用；
在上质谱前，用10μL的质量浓度0.1%的甲酸复溶。
效果验证2：
上述不同数量的脾细胞和肝细胞经前处理方法处理后，其鉴定结果分别如图10和图11所示；由此可见，对于小鼠原代细胞，上述前处理方法适用于不同数量级别的原代细胞的鉴定，且同样具有较高的蛋白鉴定数。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种微量蛋白样品的前处理方法，包括如下步骤：
S1、向样品中加入裂解液，进行一步法裂解变性及还原烷基化处理；
S2、向步骤S1处理后的样品中加入碳酸氢铵溶液，再加入单胰蛋白酶，进行酶切处理；
S3、向步骤S2处理后的样品中加入酸性试剂，进行离心处理，取上清液；
S4、对所述上清液进行热干处理，得到肽段冻干粉末。
2.根据权利要求1所述的微量蛋白样品的前处理方法，其特征在于：步骤S1中，所述裂解液的组成如下：质量浓度5-15%的脱氧胆酸钠，5-15mM的三(羧乙基)膦，30-50mM的2,2-二氯乙酰胺，50-100mM的碳酸氢铵，pH为8.0-8.8。
3.根据权利要求1或2所述的微量蛋白样品的前处理方法，其特征在于：步骤S1中，所述一步法裂解变性及还原烷基化处理的反应条件为：温度为90-100℃，时间为5-15min。
4.根据权利要求1或2所述的微量蛋白样品的前处理方法，其特征在于：步骤S2中，所述碳酸氢铵的工作浓度为50-150mM；
所述碳酸氢铵溶液加入后使体系中所述脱氧胆酸钠的质量浓度将至1%。
5.根据权利要求1或2所述的微量蛋白样品的前处理方法，其特征在于：步骤S2中，所述胰蛋白酶的工作浓度为2-20ng/μL。
6.根据权利要求1或2所述的微量蛋白样品的前处理方法，其特征在于：步骤S2中，所述酶切的反应条件为：温度为35-40℃，时间为0.5-1h。
7.根据权利要求1或2所述的微量蛋白样品的前处理方法，其特征在于：步骤S3中，所述酸性试剂为三氟乙酸或甲酸。
8.根据权利要求1或2所述的微量蛋白样品的前处理方法，其特征在于：步骤S3中，所述离心处理的条件为：离心力为15000-20000g，时间为4-6min。
9.根据权利要求1或2所述的微量蛋白样品的前处理方法，其特征在于：步骤S4中，所述热干处理的条件为：温度为60-65℃，时间为50-70min。
10.根据权利要求1或2所述的微量蛋白样品的前处理方法，其特征在于：所述样品为细胞样品；
所述样品的处理量为1k-10k个细胞。
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