CN110161155A - 从微量样品中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用 - Google Patents

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CN110161155A CN201810146491.9A CN201810146491A CN110161155A CN 110161155 A CN110161155 A CN 110161155A CN 201810146491 A CN201810146491 A CN 201810146491A CN 110161155 A CN110161155 A CN 110161155A
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Abstract

本发明涉及一种从微量组织中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用。所述方法包括：向组织样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述蛋白变性剂为可适用于质谱上机鉴定的质谱兼容性变性剂；将裂解后的组织样品进行超声处理；向超声处理后的样品中加入还原剂进行温育，然后加入烷基化试剂进行烷基化处理；向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到肽段溶液。该方法操作简单，可提升样本中蛋白质的提取量，增加蛋白质的鉴定和定量。

Description

从微量样品中提取和消化蛋白质的方法、定量检测及应用
技术领域
本发明涉及蛋白质组学领域，具体涉及一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法、对提取的肽段溶液进行定量检测的方法以及用于从微量组织中提取和消化蛋白质的试剂盒。
背景技术
激光捕获显微切割技术(LCM)是一种可以在显微镜直视下快速准确的获取所需的单一细胞亚群甚至单个细胞的技术。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分，且研究的目标细胞(如癌前病变细胞或侵袭性的癌细胞)往往被其它组织成分所环绕，原始组织的异质性极大影响了实验结果的准确性和可靠性。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。激光捕获显微切割技术(LCM)正好可以解决组织中细胞异质性的问题。
发明内容
在从微量样品中提取蛋白的过程中，蛋白提取过程需要不断的进行转管操作，这样就会对本来不多的样品造成巨大的损失，从而影响相应的实验结果。此外，在提取蛋白后不进行进一步分离的条件下，鉴定和定量的蛋白质种类比较少，而如果进行进一步分离则对精确定量有影响。本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法和试剂盒，一方面使得样品提取操作简单，无需转管，从而减少样本损失，另一方面可以提升微量样本中蛋白质的提取量，增强蛋白质的鉴定效率和定量，该方法可以适用于低至0.1μg的蛋白样本的提取和消化，例如可以适用于从少量的细胞样本中提取多肽，也适用于从切片组织中提取多肽，用于蛋白质组学的研究。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法，包括：
向样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述蛋白变性剂为可适用于质谱上机鉴定的质谱兼容性变性剂；
将裂解后的组织样品进行超声处理；
向超声处理后的样品中加入还原剂进行温育，然后加入烷基化试剂进行烷基化处理；
向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；
向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到肽段溶液。
根据本发明的实施例，利用含有可挥发的碱性试剂的裂解液，在对得到的肽段溶液进行质谱测定时，不需要对裂解液中的碱性试剂进行专门的去除操作即可用于质谱上机的鉴定，然后采用超声处理，可以有效的将组织破碎，将蛋白提取出来，然后加入胰蛋白酶进行酶解，由此可以提高组织样品中蛋白质和多肽的提取量，而且采用本发明的方法，所有的操作可以只在一个管子中进行，避免了转管带来的样品损失。通过该方法得到的肽段溶液可以直接适用于质谱上机检测，不需要对得到的肽段溶液再进行其他处理，从而可以节约样品，尤其适用于样本量很少的蛋白质和多肽的提取。其中，裂解液中含有的可发挥的碱性试剂可以为可挥发的盐或者可挥发的弱碱溶液，例如可以为乙酸铵、氨水或者碳酸氢铵等。
根据本发明的实施例，本发明所述从微量样品中提取和消化蛋白质的方法，可以进一步包括如下附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述超声处理为接触式超声处理。本发明中接触式超声处理指的是在超声处理的过程中，超声用到的探头同样品溶液接触，从而可以提高超声的效率，缩短超声处理的时间，而且本身样品量少，接触式超声也可以粉碎碎片，在超声处理之后，不需要进行过滤或者离心去除碎片，从而不会产生由于转管操作带来的样品损失。
根据本发明的实施例，所述超声处理为探针超声处理。通过探针超声处理，可以极大的提高超声的效率，提高肽段溶液中多肽和蛋白的数量。
根据本发明的实施例，所述超声处理的时间为1～2分钟，功率为40～100W。通过超声处理，可以有效破碎组织。
根据本发明的实施例，所述超声处理按照超声2～3秒，停止2～3秒重复。按照此工作2～3秒，停止2～3秒进行超声处理，可以使组织蛋白充分溶解，提高组织蛋白的提取效率。
根据本发明的实施例，所述蛋白变性剂为RapiGest或脱氧胆酸钠。采用这两种蛋白变性剂无需除盐操作，从而可以提高组织样品中蛋白质和/或多肽的提取量，而且无需转管，从而可以避免转管带来的样品损失。
根据本发明的实施例，所述RapiGest的质量浓度为1～5％，所述脱氧胆酸钠的质量浓度为1～5％，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂。采用此种浓度可以有效对组织样品进行裂解。
根据本发明的实施例，所述可挥发的碱性试剂为第一弱碱试剂，所述第一弱碱试剂包括选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种。该弱碱溶液的使用首先是为随后胰蛋白酶的酶解提供最适的酶解环境，其次该弱碱溶液是易挥发性的，从而方便在抽干过程中，弱碱溶液会因挥发而被除去，从而不会影响质谱上机检测。
根据本发明的实施例，所述第一弱碱溶液为碳酸氢铵。
根据本发明的实施例，加入所述还原剂后在45～65℃条件下，温育30分钟～2小时。由此可以使得蛋白进行有效还原，即将蛋白中的二硫键打开。
根据本发明的实施例，所述还原剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液。
根据本发明的实施例，所述二硫苏糖醇溶液的作用浓度为5mM～10mM，所述三(2-羧乙基)膦溶液的作用浓度为5mM～10mM。本发明中作用浓度指的是发生反应时的浓度，在这里指的是发生还原反应时，二硫苏糖醇或者三(2-羧乙基)膦在混合溶液中的浓度。
根据本发明的实施例，加入烷基化试剂后在室温避光放置30分钟～45分钟。可以使得蛋白还原后有效烷基化，即将打开的二硫键利用巯基进行封闭，从而大大提高后续步骤中蛋白的酶切效率。
根据本发明的实施例，所述烷基化试剂为碘乙酰胺或甲基甲硫甲基亚砜(MMTS)溶液。
根据本发明的实施例，所述碘乙酰胺溶液的作用浓度为20mM～40mM，所述甲基甲硫甲基亚砜溶液的作用浓度为20mM～40mM。本发明中作用浓度指的是发生反应时的浓度，在这里指的是发生烷基化反应时，碘乙酰胺或者甲基甲硫甲基亚砜在混合溶液中的浓度。
根据本发明的实施例，在加入胰蛋白酶酶解之前加入第二弱碱试剂，所述第二弱碱试剂包括选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种。由此，可以用来稀释之前加入的裂解液，从而降低RapiGest或者脱氧胆酸钠的浓度，减少对于酶切反应的抑制效应。而且该弱碱溶液是易挥发性的，从而方便在抽干过程中，弱碱溶液会因挥发而被除去，从而不会影响质谱上机检测。
根据本发明的实施例，所述第二弱碱试剂为碳酸氢铵。
根据本发明的实施例，所述酶解的条件为37℃下水浴4～8小时。由此，可以有效发挥蛋白酶解作用。
根据本发明的实施例，所述胰蛋白酶的浓度为0.1μg/μL～0.3μg/μL。
根据本发明的实施例，所述胰蛋白酶为测序级的胰蛋白酶。
根据本发明的实施例，所述酸性试剂选自甲酸(FA)、三氟乙酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种。加入酸性试剂可以起到中和裂解液中蛋白变性剂的作用。例如可以使得RapiGest分解为两种物质，分解为2-十二酮和3-羟(2,3-二羟基丙基)丙磺酸钠，其中2-十二酮是水不溶的，可以通过离心去除，3-羟(2,3-二羟基丙基)丙磺酸钠在LC-MS检测时，不会对肽段的质谱检测造成干扰。同样的，酸性试剂也可以使得脱氧胆酸钠降解，降解后的产物也不影响后续肽段溶液的检测。
根据本发明的实施例，所述方法可适用于低至0.1μg的蛋白样品的提取和消化。
根据本发明的实施例，所述微量样品为组织样品或者细胞样品。
根据本发明的实施例，所述微量样品为切片组织样品或穿刺组织样品。例如可以为激光捕获显微切割(LCM)切片组织，从而可以应用在医学诊断技术领域或者用于蛋白质组学的研究。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种对微量样品中提取的肽段进行定量检测的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将以上任一项所述的肽段溶液利用液相色谱-质谱联用进行数据非依赖性分析(DIA)检测。采用非依赖性数据检测可以指定质荷比(m/z)窗口内的所有肽段都经过碎裂，经过重复分析，直至质谱仪覆盖整个m/z范围。从而可以实现准确的肽段定量，而不限于分析预先定义的肽段，该方法对于低丰度的肽段可以有效实现定量检测。在本发明中，采用新型数据非依赖性分析(DIA)定量方法，在不进行进一步分离肽段的情况下，可以实现一针质谱分析鉴定和定量5000多种蛋白质的效果，既可达到精确定量又能实现深度鉴定和定量，从而可以应用于蛋白质组学的研究中。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于从微量组织中提取蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括试剂套装，所述试剂套装包括：
试剂A，所述试剂A为裂解液，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述蛋白变性剂为RapiGest或脱氧胆酸钠，所述蛋白酶抑制剂为PMSF蛋白酶抑制剂，，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述可挥发的碱性试剂选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；
试剂B，所述试剂B为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦溶液；
试剂C，所述试剂C为碘乙酰胺或甲基甲硫甲基亚砜溶液；
试剂D，所述试剂D为胰蛋白酶溶液；
当试剂B为二硫苏糖醇溶液时，试剂C为碘乙酰胺溶液，当试剂B为三(2-羧乙基)膦溶液时，试剂C为甲基甲硫甲基亚砜溶液。
根据本发明的实施例，所述试剂盒可以进一步包括如下附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述试剂套装进一步包括试剂E，所述试剂E为酸性试剂，所述酸性试剂选自甲酸(FA)、三氟乙酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述试剂套装进一步包括试剂F，所述试剂F选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述RapiGest的质量浓度为1～5％，所述脱氧胆酸钠的质量浓度为1～5％。
根据本发明的实施例，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为5mM～10mM，所述三(2-羧乙基)膦溶液的作用浓度为5mM～10mM。
根据本发明的实施例，所述碘乙酰胺溶液的作用浓度为20mM～40mM，所述甲基甲硫甲基亚砜溶液的作用浓度为20mM～40mM。
根据本发明的实施例，所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.1μg/μL～0.3μg/μL。
根据本发明的实施例，以上试剂盒中各试剂可以配制成以上浓度的倍数，在使用时，按照试剂的作用浓度进行稀释就可以。
本发明所取得的有益效果为：本发明中，所有操作只在一个管子中进行，避免了转管带来的样本损失，而且操作方便，可用于临床微量的，大规模的样品的处理，具有临床意义；而且样本提取过程操作简单，用时较短，在得到消化好的肽段后无需进行除盐，可直接进行质谱鉴定和定量，减少了样本的损失。该方法可以成功实现5mm2×8μm LCM样本的蛋白质提取和蛋白质组学分析。即使在样本体积较少的情况下，仍然可以采用超声的方法，提升样本中蛋白质的提取量，增加蛋白质的鉴定和定量。而且在不分组分的情况下，使用DIA方法进行鉴定和定量，不仅能实现单针5000多蛋白质的鉴定，而且在节省上机时长的情况下完成准确定量。
附图说明
图1为根据本发明的实施例不同裂解液处理得到的MS2谱图数、肽段数和蛋白质数。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在对微量样本进行蛋白质组学分析时，蛋白质或者多肽的鉴定数量对于蛋白质组学的研究至关重要。而微量样品中蛋白质或者多肽的提取和鉴定，最重要的问题在于，微量样品中蛋白质的含量很少，而且在提取的过程中，会对蛋白质或者多肽的数量造成损失，从而影响蛋白质或者多肽的鉴定。在对微量样本处理时，如何能够尽量减少操作步骤、减少转管至关重要。本发明发明人在研究过程中通过对关键步骤的考虑和筛选，通过组合关键特定步骤的方法可以实现对微量样本的提取和鉴定的提升，最终可以实现低到0.1μg蛋白的提取、消化和鉴定。
本发明通过选择一种变性能力不是最强，但是不需要进行除盐处理的变性剂进行蛋白的提取，这样就会减少样本除盐的损失。同时为了增加提取效率，采用超声助溶的方式在同一管中进行，优选通过接触式超声处理，可以在短时间内将样本中的组织或者细胞的碎片进行破碎。
因此，在本发明的一种具体实施方式中，本发明提供了一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法，包括：向样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂、蛋白酶抑制剂以及可挥发的盐或者碱，所述蛋白变性剂为RapiGest；将裂解后的组织样品进行超声处理；向超声处理后的样品中加入二硫苏糖醇溶液进行温育，然后加入碘乙酰胺溶液进行烷基化处理；向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到可以直接适用于质谱上机检测的肽段溶液。
在本发明的又一种具体实施方式中，本发明提供了一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法，包括：向样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂、蛋白酶抑制剂以及可挥发的盐或者碱，所述蛋白变性剂为脱氧胆酸钠；将裂解后的组织样品进行超声处理；向超声处理后的样品中加入三(2-羧乙基)膦溶液进行温育，然后加入甲基甲硫甲基亚砜溶液进行烷基化处理；向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到可以直接适用于质谱上机检测的肽段溶液。
采用本发明的方法不仅适用于LCM和微量细胞样本的蛋白的提取，还可以应用到其他微量样本的制备中，例如少量肾小球组织等。
同时在对肽段进行鉴定和定量方面，本发明采用了DIA的方式，通过该技术不仅节省分析的时间，同时还能提升定量的准确性。将DIA方法应用到LCM等微量样本的鉴定和定量中，是发明人的创造性劳动成果。
因此，在本发明的一种具体实施方式中，本发明提供了一种对微量样品中提取的肽段进行定量检测的方法，将以上实施例方式所得到的肽段溶液利用液相色谱-质谱联进行非依赖性数据(DIA)检测。
在本发明的一种具体实施方式中，本发明提供了一种对微量样品中的蛋白质和/或多肽进行定量检测的方法，包括：
向样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述蛋白变性剂为RapiGest；将裂解后的组织样品进行超声处理；向超声处理后的样品中加入二硫苏糖醇溶液进行温育，然后加入碘乙酰胺溶液进行烷基化处理；向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到可以直接适用于质谱上机检测的肽段溶液；将所得到的肽段溶液利用液相色谱-质谱偶联进行数据非依赖性(DIA)检测。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
其中，实施例中所用到的原料及厂家如下：
RapiGest SF Surfactant(RapiGest SF表面活性剂)，Waters Corporation,Cat.No.186001861
甲酸，Fisher Chemical,Cat.No.A117-50
脱氧胆酸钠(SDC)，Sigma Life Science,Cat.No.30970-100G
PMSF蛋白酶抑制剂，BBI life science,Cat.No.16A6063
胰蛋白酶，测序级，厂家：Promega,Cat.No.V5280
实施例一
本实施例提供了对人胃组织LCM样本中蛋白质或者多肽进行提取的案例。
实验样本：所检测的对象为人体胃组织LCM样本，所述人体胃组织LCM样本来自于正常人胃粘膜上皮组织。
取0.1cm2的LCM组织切片，然后按照如下技术方案提取LCM样本中的蛋白质。注意，在切割0.1cm2的LCM组织样品后，不需要利用切割帽(cap)对切割的组织样本进行粘取，直接用镊子将其加入到离心管中进行蛋白质或者多肽的提取即可。
其中，试剂A配制：将1mg RapiGest用100mM的碳酸氢铵溶液溶解为50μL，浓度为2％，加入终浓度为2mM的蛋白酶抑制剂PMSF，(该抑制剂中含有2mM乙二胺四乙酸溶液(EDTA))，制成RapiGest裂解液。
(1)将组织样品加入得到Eppendorf管中，离心数秒，从而保证样品不会丢失。因为组织样品为非常小的透明组织切片，通过离心处理可以将样品离心至离心管底部，防止样品的丢失。
(2)向组织样品中加入8-10μL的试剂A，然后在冰上静置5分钟。向组织样品中加入试剂A，可以对组织样品进行裂解，在冰上静置的过程中能够保证乙二胺四乙酸溶液以及蛋白酶抑制剂混合物与组织样品充分反应。
(3)将经过裂解处理后的将组织样品使用超声破碎仪进行超声1分钟(超声2秒钟，停止3秒钟)，功率为60W。超声主要是为了增加变性剂的溶解能力，增加蛋白的提取率尤其是那些比较难溶一些的蛋白。而且由于样本量少，所以碎片很少。通过接触式的超声，也可以尽量对样品进行粉碎，而且可以缩短超声的时间，由此即便有碎片存在，也不会影响胰蛋白酶的作用。通过超声破碎，可以使组织蛋白充分溶解，从而提高组织蛋白的提取效率。
(4)加入的二硫苏糖醇溶液(Dithiothreitol，DTT)，使得二硫苏糖醇溶液在混合溶液中的浓度为5mM，混匀后在56℃条件下水浴1小时。然后恢复室温，再加入碘乙酰胺溶液，使得碘乙酰胺溶液在混合溶液中的浓度为20mM，混匀后于室温在暗室放置45分钟。
该步骤的作用在于使蛋白还原烷基化，即二硫键的打开与巯基的封闭，大大提高后续步骤中蛋白的酶切效率。
(5)加入100mM的碳酸氢铵溶液8-10μL，混匀后，再加入胰蛋白酶溶液，使得胰蛋白酶在混合溶液中的浓度为0.1μg/μL，混匀，然后在37℃温度下水浴6小时。
通过加入碳酸氢铵溶液可以用来稀释RapiGest，从而可以减少RapiGest对于胰蛋白酶的酶切反应的抑制效应。而且碳酸氢铵属于弱碱性溶液，后续可以挥发去除，从而不会影响蛋白或者多肽的检测。
(6)加入1％(w/v)的甲酸(1％FA，Formic acid)溶液，使之在混合溶液中的终浓度为0.8％，混匀，然后在37℃水浴30分钟。
RapiGest在酸性条件下是不稳定的，所以通过加入甲酸，可以使RapiGest分解为两种物质，即分解为2-十二酮和3-羟(2,3-二羟基丙基)丙磺酸钠，其中2-十二酮是水不溶的，可以通过离心去除，3-羟(2,3-二羟基丙基)丙磺酸钠在LC-MS检测时，不会对肽段的质谱检测造成干扰。
(7)13000g转速下离心10分钟，取上清液得到可直接质谱检测的肽段溶液。
将得到的肽段溶液抽干，复溶后按照实施例二的方法进行液相联用串联质谱进行DIA检测(LC-MS/MS)，即可得到鉴定和定量结果。
实施例二
实施例二进一步提供了一种对于微量样品中提取的肽段进行定量检测的方法。以实施例一制备得到的肽段溶液为例，按照如下方法进行检测：
所得到的肽段使用液相联用串联质谱进行检测，其中液相色谱仪采用的是ThermoUltimate 3000系列型号，质谱仪是Thermo Scientific公司Q Exactive HF型号。
每个样本注射3针，每针跑3个小时，总检测时长为9小时。
质谱主要参数为：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集。离子碎裂模式为高能碰撞解离模式(HCD)，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。
质谱数据分析所用软件为Spectronaut，搜索鉴定主要参数：数据库为swissprot的homo蛋白数据库；一级质谱质量误差范围10ppm；二级质谱质量误差范围0.02Da；固定修饰为“Carbamidomethyl(C)”；可变修饰为“Oxidation(M),N->D(N),Gln->pyro-glu(N-termQ)”，酶切方式Trypsin，最大允许漏切数为2。
对实施例一的样本进行检测的结果如表1所示：
表1采用不同方法处理LCM组织切片得到的结果
表1中，蛋白质数量指的是处理LCM组织切片，鉴定出来的分子量不同的蛋白质的数量。多肽数量指的是处理LCM组织切片，鉴定出来的分子量不同的多肽的数量。表1中“人胃组织LCM切片”为采用本发明技术方案所检测到的结果。同表1的结果可以看出，通过本发明实施例的方法鉴定的蛋白质数量为5150，多肽的数量为35826，用时9小时。
在表1中，还有一栏为：“人肺肉芽肿组织LCM切片”，该LCM切片为根据文献中提取方法所得到的对照结果(Inflammatory signaling in human tuberculosis granulomasis spatially organized.Nat Med.2016May；22(5):531-8.doi:10.1038/nm.4073.)。考虑到人胃组织与人肺肉芽肿组织中在蛋白种类上没有显著差异。因此，发明人利用人体肺结核肉芽肿组织LCM样本，按照该文献中发明的技术方案进行操作，所得到的组织蛋白及肽段使用液相联用串联质谱进行检测，其中液相色谱仪采用的是Thermo Fisher Scientific公司的Easy nLC系列型号，质谱仪是Thermo Fisher Scientific公司的Q-Exactive massspectrometer型号。总检测时长为20小时，质谱主要参数为：一级质谱采用Orbitrap，分辨率70000；二级质谱采用HCD碎裂并由Orbitrap检测，分辨率17000；循环模式为一个一级质谱后接二十个二级质谱；动态排除时间为15秒；选择母离子最低强度为1000000。质谱数据分析所用软件为maxQuant 1.3.0.5，搜索鉴定主要参数：数据库为Uniprot的homo蛋白数据库；固定修饰为“Carbamidomethyl(C)”；可变修饰为“N-acetylation of protein andoxidation of methionine”。从表1中的结果可以看出，利用文献中的方法不仅用时较长，而且蛋白质的数量仅为4406，多肽的数量也仅为30000。
通过两种方法进行比较，从表1中的结果可以看出，本发明在LCM样本提取后的检测效果有明显的大幅提升，且经过分组分所用时间减少，所得蛋白鉴定效果超出文献水平。而且操作简易，在该微量样本的蛋白鉴定量和多肽鉴定量来看，至少提升了15％。
实施例三
在蛋白质组学的研究过程中，蛋白质或者肽段的鉴定和定量的提升是蛋白质组学检测的基础，例如通过提升蛋白质或者多肽的鉴定量，可以作为一些重要的分子机制的研究的基础或者某些新的蛋白质或者多肽的鉴定，可以作为某些组织或者某些分子信号通路的生物标志物。因此，在蛋白质组学的研究过程中，任何能够提升蛋白质或者多肽的鉴定量的方法，尤其是针对某些微量样品中蛋白质或者多肽的鉴定量的鉴定，对于蛋白质组学的研究具有重要的意义。
因此，发明人在实验过程中，研究了不同的裂解液对于多肽肽段鉴定数的影响。具体实验过程按照与实施例一相同的方法进行操作，区别仅在于，通过调整裂解液中不同的变性剂，同时统计肽段鉴定数。
实验组1
实验组1-1：与实施例1相比，区别在于，所用到的裂解液为：利用100mM的碳酸氢铵溶液，配制成含有0.2％(w/v)的SDS、7M尿素、2M的硫脲以及2mMPMSF蛋白酶抑制剂的混合物；所用到的胰蛋白酶的浓度为0.05μg/μL。然后按照实施例二相同的方法，对提取的肽段进行鉴定。
实验组1-2：调整裂解液中变性剂浓度(即将以上裂解液中的0.2％(w/v)SDS和7M尿素分别调整为0.1％(w/v)SDS和2M尿素)，同时将胰蛋白酶的浓度调整为0.2μg/μL。然后按照实施例二相同的方法，对提取的肽段进行鉴定。
实验结果发现，将裂解液中的变性剂的浓度从0.2％(w/v)SDS和7M尿素的混合物调整为0.1％(w/v)SDS和2M尿素后，肽段鉴定数改善从300改善为800。实验结果表明，将变性剂的浓度降低后，对于胰蛋白酶的干扰变小，所得到的肽段数仍得到提高。
实验组2
与实验组1-1相比，去掉裂解液中的硫脲(thiourea)，同时胰蛋白酶的浓度调整为0.2μg/μL。按照与实施例二相同的方法，对提取的肽段进行鉴定。
实验结果发现，肽段鉴定数从800提高到2800。
实验组3
与实验组2相比，使用脱氧胆酸钠(SDC)替代原裂解液中的SDS，省略除盐步骤，增长高效液相色谱LC梯度(1h→1.5h)。同时验证了不同浓度的SDC，对于肽段鉴定数的影响，实验结果如图1所示。
实验结果发现，肽段鉴定数从2800提高到5000。
实验组4
与实验组3相比，使用RapiGest代替SDC后，鉴定结果更好，且随着变性剂浓度增加，鉴定数更高。见附图1所示。
附图1为不同的裂解液对样品质谱鉴定的影响图，其中RG为RapiGest，低代表浓度为0.5％(w/v)，中代表浓度为1.0％(w/v)，高代表浓度为2.0％(w/v)，误差线表示标准差，从图1可以看出，相同浓度的变性剂，RapiGest比SDC的鉴定结果更好。2％RapiGest提取LCM样本可鉴定6831个肽段，2％SDC提取相同的样本可鉴定6692个肽段。当RapiGest的浓度为2％时，所鉴定出来的肽段和蛋白质的量最多。
同时，为了研究裂解方式对于蛋白或者多肽的鉴定的影响，发明人进行了如下实验：
在蛋白质在还原烷基化处理之前，分别利用56℃水浴处理、水浴超声处理、探针超声处理以及PCT处理对蛋白质进行处理，其他步骤同实施例一相同。其中56℃水浴是在56℃水浴锅中放置1h处理；水浴超声是在水浴超声锅中进行常温水浴超声1h；探针超声是利用探针超声仪处理1min(2s on/3s off)，即同实施例一的方法；PCT是使用PCT(压力循环技术)处理45min，使用35kpsi压强作用与样品溶液，50s加压，10s常压，每一分钟循环一次。按照与实施例一相同的方法得到用于质谱检测的上样溶液，然后按照实施例二的质谱条件对于肽段定量、谱图数，谱图鉴定率，肽段鉴定数进行测定。
其中，肽段定量是通过实施例一的方法得到的用于质谱检测的上样溶液抽干后的定量结果。
谱图数指的是通过质谱检测所采集到的所有的谱图数。
谱图鉴定率指的是能鉴定出氨基酸序列的MS/MS谱图占所有采集谱图的比率。
肽段鉴定数指的是能够鉴定出肽段序列的质谱图。
相应的CV值均代表的是变异系数。
其中，实验1和实验2代表两次重复实验，所用到的LCM样本均为小鼠肝组织LCM样本。
表2不同裂解方式的评估详表
从表2的结果可以看出，相比较于56℃水浴处理、水浴超声处理以及PCT处理，采用探针超声处理，无论是所获得的谱图数、谱图鉴定率以及肽段鉴定数等，均更高，这些提高对于蛋白质组学的研究具有重要的意义。
实施例四
采用与实施例一相同的方法，区别仅在于样本为流式细胞仪分选出的1000HELA细胞。经质谱上机后，共鉴定5000多种蛋白。在文献Ultrasensitive proteome analysisusing paramagnetic bead technology.Molecular Systems Biology中对于1000Hela细胞进行检测，共鉴定出大约2000种蛋白，在文献Microproteomics with microfluidic-based cell sorting：Application to 1000and 100immune cells.Protemics中对1000THP-1细胞进行检测，共鉴定出911种蛋白。因此，采用本发明的方法对微量蛋白的提取，同样适用于从细胞中获得微量蛋白，而且本发明的方法所提取鉴定出的蛋白水平，在国际上也是领先水平。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种从微量样品中提取和消化蛋白质的方法，其特征在于，包括：
向样品中加入裂解液，进行裂解，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述蛋白变性剂为可适用于质谱上机鉴定的质谱兼容性变性剂；
将裂解后的组织样品进行超声处理；
向超声处理后的样品中加入还原剂进行温育，然后加入烷基化试剂进行烷基化处理；
向经过烷基化处理后的溶液中加入胰蛋白酶进行酶解；
向酶解后的样品中加入酸性试剂，然后离心取上清，得到肽段溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声处理为接触式超声处理，优选为探针超声处理；
所述超声处理的时间为1～2分钟，功率为40～100W；
任选地，所述超声处理按照超声2～3秒，停止2～3秒重复。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白变性剂为RapiGest或脱氧胆酸钠；
任选地，所述RapiGest的质量浓度为1～5％，所述脱氧胆酸钠的质量浓度为1～5％，
所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(PMSF)。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述可挥发的碱性试剂为第一弱碱试剂，所述第一弱碱试剂包括选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；
任选地，所述第一弱碱溶液为碳酸氢铵。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，加入所述还原剂后在45～65℃条件下，温育30分钟～2小时；
任选地，所述还原剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦溶液；
任选地，所述二硫苏糖醇溶液的作用浓度为5mM～10mM，所述三(2-羧乙基)膦溶液的作用浓度为5mM～10mM。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，加入烷基化试剂后在室温避光放置30分钟～45分钟；
任选地，所述烷基化试剂为碘乙酰胺或甲基甲硫甲基亚砜溶液；
任选地，所述碘乙酰胺溶液的作用浓度为20mM～40mM，所述甲基甲硫甲基亚砜溶液的作用浓度为20mM～40mM。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，在加入胰蛋白酶酶解之前加入第二弱碱试剂，所述第二弱碱试剂包括选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；
任选地，所述第二弱碱试剂为碳酸氢铵。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述酶解的条件为37℃下水浴4～8小时；
任选地，所述胰蛋白酶的浓度为0.1μg/μL～0.3μg/μL；
任选地，所述胰蛋白酶为测序级的胰蛋白酶；
任选地，所述酸性试剂选自甲酸(FA)、三氟乙酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种；
任选地，所述方法可适用于低至0.1μg蛋白样品的提取和消化；
任选地，所述微量样品为组织样品或者细胞样品，优选为切片组织样品或穿刺组织样品。
9.一种对微量样品中提取的肽段进行定量检测的方法，其特征在于，
将权利要求1～8任一项所述的肽段溶液利用液相色谱-质谱联用进行非依赖性数据(DIA)检测。
10.一种用于从微量组织中提取和消化蛋白质的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂套装，所述试剂套装包括：
试剂A，所述试剂A为裂解液，所述裂解液包括蛋白变性剂和蛋白酶抑制剂，所述蛋白变性剂为RapiGest或脱氧胆酸钠，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(PMSF)，所述裂解液中含有可挥发的碱性试剂，所述可挥发的碱性试剂选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种，
试剂B，所述试剂B为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦溶液，
试剂C，所述试剂C为碘乙酰胺或甲基甲硫甲基亚砜MMTS溶液，
试剂D，所述试剂D为胰蛋白酶溶液，
当试剂B为二硫苏糖醇溶液时，试剂C为碘乙酰胺溶液，当试剂B为三(2-羧乙基)膦溶液时，试剂C为甲基甲硫甲基亚砜溶液；
任选地，所述试剂套装进一步包括试剂E，所述试剂E为酸性试剂，所述酸性试剂选自甲酸(FA)、三氟乙酸、乙酸、柠檬酸中的至少一种；
任选地，所述试剂套装进一步包括试剂F，所述试剂F选自碳酸氢铵、氨水、乙酸铵中的至少一种；
任选地，所述RapiGest的质量浓度为1～5％，所述脱氧胆酸钠的质量浓度为1～5％；
任选地，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为5mM～10mM，所述三(2-羧乙基)膦溶液的作用浓度为5mM～10mM；
任选地，所述碘乙酰胺溶液的作用浓度为20mM～40mM，所述甲基甲硫甲基亚砜溶液的作用浓度为20mM～40mM；
任选地，所述胰蛋白酶溶液的作用浓度为0.1μg/μL～0.3μg/μL。
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