CN101457247A - 一种快速酶解混合蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速酶解混合蛋白质的方法，所述方法包括：提供待酶解的蛋白质样品；将所述待酶解的蛋白质样品进行变性处理，获得经变性的蛋白质样品；对所述经变性的蛋白质样品进行蛋白酶酶解处理，并辅以超声波处理，获得蛋白质多肽片段。本发明还提供了一种快速鉴定蛋白质的方法。本发明的方法可快速高效地实现蛋白质的酶解和鉴定，且操作简单，准确性高。

Description

一种快速酶解混合蛋白质的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种快速酶解混合蛋白质的方法。

背景技术

目前用于蛋白质鉴定主要有二维电泳-质谱和多维色谱-质谱两大技术。前者，复杂的混合蛋白质用双向电泳分离，经胶内酶解，肽段主要用MALDI-TOF-MS检测，通过肽质量指纹法(PMF)进行鉴定，亦可进行串联质谱分析，通过肽段的序列信息来进行鉴定。后者是混合蛋白质经消化后，混合多肽用二维液相色谱在线分离，再进行MS/MS分析实现蛋白质鉴定。尽管二维凝胶电泳技术有所改进，其分离蛋白质的能力已经使胶内酶解适合分析非常复杂的蛋白质复合物，但是一些低丰度蛋白、极大极小分子量蛋白、极酸或极碱蛋白和疏水性蛋白质用这种凝胶的方法仍不易鉴定。另一方面，胶内消化操作需要花费更多的时间，消化后需要一系列化学处理和提取/纯化步骤以回收消化碎片，冗长的样品制备程序增加了污染蛋白质的可能性。而2D-LC的方法中，蛋白质消化是直接在溶液中完成的，溶液中消化只需相当少的时间和样品准备程序。但由于一些蛋白质不易被酶解，因而加入如化学变性剂、表面活性剂等促进蛋白质溶解和消化，这些对MALDI分析有影响的试剂必须在质谱分析前从消化碎片中去除，使纯化步骤变得比胶内消化方法更加麻烦。因此，样品的预处理和胰蛋白酶消化过程不仅慢而且已经成为用质谱进行高通量鉴定蛋白质的限制性步骤。到目前为止，已报道不同的方法能够减少蛋白质鉴定前样品预备的时间，这些方法主要专注于提高样品处理的通量，都基于在消化过程中提高温度，使用含有流动胰蛋白酶的柱，或加入有机溶剂，或用超声波和微波增强胰蛋白酶消化力等等。

Zee-Yong Park等人提出了在蛋白质溶液中消化和质谱分析肽质量谱图之前进行蛋白质的热变性。但热变性方法亦存在缺陷，在热变性过程中蛋白质易聚集，因此而未能被广泛采用。

因此，本领域目前使用的方法均存在技术上的缺陷，且无法满足蛋白质组学高通量的分析要求，因此本领域迫切需要找到一种高效快速酶解、鉴定蛋白的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速酶解混合蛋白质的方法。

在本发明的第一方面，提供一种快速酶解蛋白质(特别是混合蛋白质)的方法，所述的方法包括：

(1)提供待酶解的蛋白质样品；

(2)将步骤(1)获得的待酶解的蛋白质样品进行变性处理，获得经变性的蛋白质样品；和

(3)对步骤(2)获得的经变性的蛋白质样品进行蛋白酶酶解处理，并辅以超声波处理，获得蛋白质多肽片段。

在另一优选例中，所述的待酶解的蛋白质样品中含有一种或多种蛋白质(即混合蛋白质)。更佳地，所述的待酶解的蛋白质样品中含有的多种蛋白质具有某一范围的pI值(即接近的pI值)。

在另一优选例中，所述的超声波处理是间歇式或连续进行。

在另一优选例中，步骤(2)中，将待酶解的蛋白质样品先进行还原和烷基化处理，再进行热变性，从而获得变性的蛋白质样品。

在另一优选例中，在进行还原和烷基化处理时，分别采用二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)处理所述的蛋白质样品。

在另一优选例中，二硫苏糖醇在样品中的终浓度是5-20mmol/L；碘乙酰胺在样品中终浓度约是二硫代苏糖醇的5倍。

在另一优选例中，在进行还原和烷基化处理时，进行超声波(优选超声浴)辅助处理。

在另一优选例中，在还原和烷基化处理时，采用连续超声波处理方式。

在另一优选例中，二硫苏糖醇处理时，在37±2℃下超声波辅助处理5±2分钟。较佳地，超声功率是5-100瓦。较佳地，超声频率10-50MHz(较佳的为20-30MHz)。

在另一优选例中，碘乙酰胺处理时，在室温黑暗条件下超声波辅助处理5±2分钟。较佳地，超声功率是5-100瓦。较佳地，超声频率10-50MHz(较佳的为20-30MHz)。

在另一优选例中，步骤(2)中，在进行热变性时，调节蛋白样品的pH值远离样品蛋白质的等电点。

在另一优选例中，热变性的条件是：85-95℃处理(优选水浴处理)10-20分钟。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述的蛋白酶选自(但不仅限于)下组的一种或多种酶：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内肽酶Lys-C、V8蛋白酶、梭菌蛋白酶。

在另一优选例中，步骤(3)中，进行超声波辅助处理时，超声时间10-30秒(较佳地10-20秒)。

在另一优选例中，步骤(3)中，进行超声波辅助处理时，相对于100μl的样品，超声功率是5-100瓦；较佳地是15-30瓦。

在另一优选例中，步骤(3)中，进行超声波辅助处理时超声频率10-50MHz；较佳的为20-30MHz。

在另一优选例中，步骤(3)中，进行超声波辅助处理时，采用间隔超声的方式：超声波每处理3-8秒，间歇3-8秒。

在另一优选例中，步骤(3)中，进行超声辅助处理时，每超声波处理5秒，间歇5秒。

在本发明的第二方面，提供一种快速鉴定蛋白质的方法，所述方法包括：

(1)提供待酶解的蛋白质样品；

(2)将步骤(1)获得的待酶解蛋白质样品进行变性处理，获得经变性的蛋白质样品；

(3)对步骤(2)获得的经变性的蛋白质样品进行蛋白酶酶解处理，并辅以超声波处理，获得蛋白质多肽片段；和

(4)用(3)获得的蛋白质多肽片段进行质谱鉴定。

在另一优选例中，用MALDI-TOF-MS分析鉴定。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.超声波功率-超声时间安全区域图。

图2.热变性时溶剂相pH值和有机相比例对蛋白质溶解度的影响图。

图3.尿素和热变性结合部分试剂变性方法的MALDI-TOF-MS图谱比较。

(A)BSA尿素变性；

(B)BSA热变性结合部分试剂变性；

(C)Cytochrome c尿素变性；

(D)Cytochrome c热变性结合部分试剂变性，

热变性和酶解时溶剂体系均为水相，超声波辅助消化22W，15S。

图4.BSA的MALDI-TOF-MS图谱。

(A)碱性热变性，水相，覆盖率23％；

(B)碱性热变性，80％乙腈，覆盖率20％；

(C)酸性热变性，水相，覆盖率26％；

(D)酸性热变性，80％乙腈，覆盖率26％。

图5.细胞色素c的MALDI-TOF-MS图谱。

(A)碱性热变性，水相，覆盖率76％；

(B)碱性热变性，80％乙腈，覆盖率53％；

(C)酸性热变性，水相，覆盖率76％；

(D)酸性热变性，80％乙腈，覆盖率69％；

图6.Mygolobin的MALDI-TOF-MS图谱。

(A)传统预处理方法；

(B)快速预处理方法。

具体实施方式

针对现有技术中蛋白质酶解和鉴定方面存在的缺陷，本发明人经过深入的研究，将超声波处理技术应用于蛋白质的酶解和鉴定，并进一步优化了蛋白质变性和酶解的多方面条件。采用本发明提供的方法，可快速高效地实现蛋白质的酶解和鉴定，且操作简单，准确性高。在此基础上完成了本发明。

因此，本发明提供一种快速酶解蛋白质的方法，所述的方法包括：(1)提供待酶解的蛋白质样品；(2)将步骤(1)获得的待酶解的蛋白质样品进行变性处理，获得经变性的蛋白质样品；和(3)对步骤(2)获得的经变性的蛋白质样品进行蛋白酶酶解处理，并辅以超声波处理，获得蛋白质多肽片段。

本发明的方法中，蛋白质样品没有特别的限制，其可以是任何种类的蛋白质，只要它们能实现蛋白质的充分变性，二三级结构充分展开，并能够被蛋白酶所酶切。所述的蛋白质样品可以含有单一的一种蛋白质，或者可以是含有多种蛋白质的混合蛋白质，例如，所述的蛋白质样品可以是经细胞破碎或裂解后获得的蛋白质的总和，或是经过初步预分离的蛋白质的总和(如根据等电点进行一维等电聚焦凝胶电泳预分离后获得的等电点相近(如等电点在pI值±2范围内；更佳地pI值±1范围内；更佳地pI值±0.5范围内)的一类蛋白质)。

蛋白质变性

蛋白质的变性处理可以采用本领域的常规技术，只要所述技术能够使蛋白质充分变性，以便于后续的蛋白酶酶切。而单纯使用热变性后，蛋白质酶解程度不理想。作为本发明的优选方式，变性处理过程包括：将待酶解的蛋白质样品先进行还原和烷基化处理，再进行热变性，从而获得经充分变性的蛋白质样品。采用超声波辅助还原和烷基化处理结合热变性的技术，可缩小蛋白变性的时间，并且不需要使用尿素等具有一定副作用的变性试剂，从而避免了变性后的蛋白质样品中盐浓度过高的问题，无需后续的脱盐和纯化处理，大大简化了后续步骤。

作为本发明的优选方式，在进行还原和烷基化处理时，利用超声波辅助处理。优选地，还原和烷基化处理分别使用二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)作为还原试剂和烷基化试剂。优选地，二硫苏糖醇在样品中终浓度是5-20mmol/L，处理条件是在37±2℃下超声波(超声浴)辅助处理5±2分钟，超声功率是5-100瓦；较佳地15-30瓦。优选地，碘乙酰胺在样品中终浓度是二硫苏糖醇的4-6倍(优选5倍)，处理条件是在室温(如20-28℃)黑暗处采用超声波(超声浴)辅助处理5±2分钟，超声功率是5-100瓦；较佳地15-30瓦。

蛋白质的热变性可以采用本领域已知的热变性技术。优选地，热变性的条件是：85-95℃处理10-20分钟。优选地，使蛋白样品在水浴条件下进行热变性，从而有利于蛋白样品的均匀受热。

在蛋白质变性时，采用超声波辅助还原和烷基化处理结合热变性，可快速地实现蛋白质的变性，蛋白质的还原和烷基化反应在10分钟内完成，热变性也可在15分钟内完成，变性时间大大缩短。

作为本发明的优选方式，在进行热变性时，调节蛋白样品的pH值远离蛋白的等电点(如与样品蛋白质的等电点相差2以上，更佳的相差3以上，更佳的相差4以上)，从而阻止蛋白质在热变性过程中的聚集反应，减少蛋白质由于热变性后聚集沉淀导致的损失，可使得蛋白质在热变性后保持高的溶解度，并有利于蛋白酶水解消化，有效提高蛋白质鉴定的准确性。测定蛋白样品的pI值以及调节蛋白样品溶液pH值的方法是本领域人员所熟知的。当所述的蛋白样品是混合蛋白样品的时候，可以根据等电点对混合蛋白样品进行预分离，从而获得具有接近的等电点的一类混合蛋白样品用于后续的变性、酶解以及鉴定，当该样品进行热变性时，可以方便地选择远离等电点的pH值。

酶解方法

多种可用于蛋白质消化的蛋白酶均可用于本发明，只要其能够在蛋白上的特定位点发生酶切作用。所述的蛋白酶包括但不限于：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内肽酶Lys-C、V8蛋白酶、梭菌蛋白酶等。优选地，所述的蛋白酶是TPCK-胰蛋白酶。

在对蛋白质样品进行酶解时，以超声波辅助酶解可极大地提高蛋白质样品的酶解效率，有效地减少酶解反应的时间，使得酶解反应的时间由常规的约12小时大大地减少到低于1分钟。

为了准确地掌握对蛋白进行超声波处理的处理条件，不对蛋白质产生负面影响，本发明人根据蛋白质广泛的分子量范围，以建立一个超声功率和超声时间的安全范围。经过反复的研究，结果发现，进行超声波处理时，超声时间10-30秒下效果是较为理想的；优选地，超声功率5-100瓦；更优选地超声功率是15-30瓦，超声时间是10-20秒。在上述范围内进行超声波辅助酶解，可以在尽可能防止蛋白质非专一性剪切的情况下促进酶解。利用响应面法本发明人还确定了超声波辅助酶解超声功率-超声时间的最优条件，即22瓦处理15秒。进一步优选地，在进行超声波处理时，采用间隔超声的方式，即：每超声波处理3-8秒(如5秒)，间歇3-8秒(如5秒)。

此外，在对蛋白质进行酶解时，还可根据蛋白质本身的一些性质进行适当的处理和变通，这些都是本领域人员可以实现的。例如，可以根据蛋白质或其基团的亲水/疏水性质，适当地加入一定比例的有机溶剂，促进蛋白质溶解，有利于蛋白质消化。

酶解反应的终止是本领域人员熟知的技术，例如可通过煮沸样品的方法使得蛋白酶失活，从而终止酶解反应。

鉴定方法

在获得了经过酶解的蛋白质样品后，可以对该蛋白质样品进行鉴定，从而获得需要的蛋白信息。因此，本发明还提供了一种快速鉴定蛋白质的方法，所述方法包括：(1)提供待酶解的蛋白质样品；和(2)将步骤(1)获得的待酶解蛋白质样品进行变性处理，获得经变性的蛋白质样品；和(3)对步骤(2)获得的经变性的蛋白质样品进行蛋白酶酶解处理，并辅以超声波处理，获得蛋白质多肽片段；和(4)用(3)获得的蛋白质多肽片段进行质谱鉴定。

对酶解后的蛋白质样品进行质谱鉴定是本领域人员已知的技术。例如，质谱鉴定可采用MALDI-TOF-MS分析技术。

本发明提供的技术方案的主要优点如下：

(1)操作快速：本发明的方法通过超声波辅助消化替代传统整夜酶解，大大减少了蛋白质消化所需时间，酶解过程从约12小时缩短为约15秒。酶解之前采用超声浴辅助还原烷基化反应，使常规分别为1小时和45分钟的反应过程均在5分钟内实现，且可得到相同的变性效果。本发明的方法有效地减少了蛋白质鉴定前样品预处理的步骤并缩短时间，最终可实现蛋白质鉴定的高通量。

(2)步骤简化，易实现：本发明的方法中，优选采用热变性取代尿素变性，样品中盐浓度大大降低，质谱鉴定前不需进行脱盐处理，直接与基质溶液混合，最后用于质谱检测，可显著提高蛋白质质谱鉴定的信噪比和准确率。

(3)本发明的方法中，优选热变性时调节体系pH，选择远离蛋白质等电点的体系pH，蛋白质分子带足够的电荷，当蛋白质热变性后疏水作用成为分子间主导的作用力时，足够的静电斥力能阻止蛋白质发生聚集反应。极大的降低了蛋白质样品因聚集沉淀导致的损失。且有利于蛋白酶水解消化。

(4)热变性后结合超声波辅助蛋白酶的消化，一方面超声波能加速蛋白酶的消化，另一方面超声波有助于聚集沉淀的蛋白质溶解。将热变性后未加胰蛋白酶的样品进行超声，用高效液相色谱法检测超声前后样品中蛋白质浓度，结果显示超声波有助于提高蛋白质的溶解度，因此超声波也在一定程度上克服了热变性的缺陷。

(5)本发明的方法应用面广，适用于许多种类的蛋白质，适用于复杂的混合蛋白质体系，效果稳定。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

蛋白质变性

传统试剂变性方法

在蛋白质样品中分别加入5μL 16mol/L尿素溶液和5μL 20mmol/L的DTT(含25mmol/L碳酸氢铵)，37℃恒温1h，加入5μL 100mmol/L IAA，终浓度为DTT终浓度的5倍，于室温黑暗处反应45min，最后加25mmol/L碳酸氢铵溶液至总体积100μL。

热变性方法

热变性方式分为酸性热变性和碱性热变性，蛋白质样品在不同pH的缓冲液下，即25mmol/L的碳酸氢铵(pH约7.94-7.96)或2mmol/L HCL(pH约2.74-2.81)体系体积98μL，90℃水浴15min，pH酸性的样品最后加入1.25mol/L的碳酸氢铵2μL，终浓度为25mmol/L。

热变性结合部分试剂变性方法

将蛋白质样品先经终浓度10mmol/L DTT和终浓度为DTT浓度5倍的IAA还原烷基化反应后，再进行热变性。其中还原烷基化反应有常规方法(DTT 37℃恒温1h，IAA室温黑暗处反应45min)和快速方法(DTT 37℃恒温5min，IAA室温黑暗处反应5min，超声浴辅助下进行)两种方式，超声频率为20-30MHz。

溶液中蛋白质消化

传统的蛋白质消化方法

在变性后的蛋白质样品(体积100μL，蛋白浓度为0.1μg/μL)中加入胰蛋白酶，底物:酶＝40:1(W/W)，37℃下消化12h。均煮沸2-3min停止酶解反应。

超声波辅助消化方法

是将加入胰蛋白酶的蛋白质样品放置冰浴中，以工作5s间歇5s的方式超声，采用的探头直径为(2mm)，超声频率为20-30MHz。最后均煮沸2-3min停止酶解反应。

SDS-PAGE分析方法

采用凝胶浓度5％的浓缩胶和12％或14％的分离胶分析样品，凝胶图片用Totallab 2.0处理，进行数据分析。

溶液中蛋白质含量和溶解度较高时，凝胶图片上蛋白条带较粗且颜色较深，经软件分析得出的量值(volume)较大，反之则较小。酶解效率较高时，消化后凝胶中样品条带消失或量明显减少。为了减少不同凝胶间因染色和脱色程度不同而产成的误差，在每张凝胶上都以相同蛋白质浓度并未经过处理的标准蛋白质样品作为对照，以处理样对未处理样凝胶条带量的百分比即蛋白质溶解相对百分比(Relative Percentage of Protein Solubility /％)来表示蛋白质溶解程度，计算公式如下：

消化效率用蛋白质消化相对百分比(Relative Percentage of Protein Digestion/％)来衡量，计算公式如下：

MALDI-TOF-MS分析方法

酶解消化后的样品用0.8μL饱和基质溶液(α-氰基-4-羟基肉桂酸，0.1％TFA，50％乙腈配制)混合，点样后吹干，用4700型MALDI-TOF-TOF检测，所有的点均只作PMF。获得的实验数据的肽质量范围在700-3500Da，根据S/N大于等于20输出，利用Mascot的肽指纹谱(PMF，Peptide Mass Fingerprint)数据搜索功能进行检索，允许漏切位点(missed cleavages)的最大数为1，肽谱中质量偏差±100ppm，数据库选择Swiss Prot。

材料

肌球蛋白，β-半乳糖苷酶，磷酸酶b，牛血清白蛋白，卵清蛋白，碳酸苷酶，胰蛋白酶抑制剂，溶菌酶和抑肽酶混合标准蛋白质样品购自TaKaRa。单个标准蛋白质样品：牛血清白蛋白、细胞色素c和肌红蛋白购自Sigma。

I.实施例

实施例1.超声功率和超声时间安全区域的建立

9种蛋白质的混合样品(肌球蛋白200KD，β-半乳糖苷酶116KD，磷酸酶b 97.2KD，牛血清白蛋白66.4KD，卵清蛋白44.287KD，碳酸苷酶29KD，胰蛋白酶抑制剂20.1KD，溶菌酶14.3KD和抑肽酶6.5KD)取1μL(18μg/μL)经传统试剂变性后，在没有胰蛋白酶的作用的环境下超声，样品用SDS-PAGE检测，用Total lab 2.0分析，按公式(1)计算经超声波处理后剩余的蛋白质相对百分比。

结果，建立了超声功率和时间的安全区域见图1，在安全区域内，蛋白质分子经超声后基本不发生断裂，样品中蛋白质含量基本不变。当超声的总时间和间歇时间相同，改变连续超声时间对蛋白质的影响不明显，因此在实验中都采用工作5s间歇5s的超声方式。

实施例2.超声波辅助酶解最优条件确定

为了优化酶解效率，选取超声功率和超声时间这两个变量，在安全区域内进行两水平的响应面设计(Response Surface Design)，响应面设计见表1(根据超声波仪器功率设置的精度，将各变量的设计值取整后进行实验)。9种蛋白质的混合样品取1μL(18μg/μL)经传统试剂变性后，根据响应面设计表，进行超声波辅助消化，消化程度用SDS-PAGE检测，用Total lab 2.0分析，按公式(3)计算蛋白质消化相对百分比。

结果显示，各因子的推荐值为功率22.53W(100μL体系)，超声时间13.03秒。在进一步实验中均采用15s，经实验验证，符合最优条件下的预期结果。

表1 响应面设计表

实施例3.调节热变性时体系pH和有机相比例以提高蛋白质溶解度

分别取0.5μL(20μg/μL)牛血清白蛋白(BSA)和细胞色素c在不同pH和有机相比例的体系中热变性后，用SDS-PAGE检测蛋白质溶解度，用Total lab2.0分析，根据公式(2)计算蛋白质溶解相对百分比。

结果如图2：体系pH为酸性时热变性后蛋白质的溶解度较碱性时高，特别是细胞色素c的溶解度差异较显著，在水相中BSA碱性比酸性热变性后溶解度高。

实施例4.22W 15s超声波辅助酶解取代12h消化进行蛋白质鉴定

取0.5μL(20μg/μL)牛血清白蛋白经过传统试剂变性后，分别进行22W15s超声波辅助酶解和12小时整夜酶解，酶解后的样品进行质谱鉴定和数据库搜索，得到的结果见表2。采用超声波辅助消化方法，在15s内完成了消化过程，用MALDI-TOF分析得到肽质量指纹图谱经数据库搜索均能正确地鉴定蛋白质，蛋白质序列覆盖率和匹配的肽段数目与传统的12小时消化方法接近。

表2 BSA在传统与超声波辅助消化方法下蛋白质序列覆盖率、匹配肽段数目和得分比较

实施例5.热变性取代尿素结合部分试剂变性

取0.5μL(20μg/μL)牛血清白蛋白、细胞色素c分别经传统试剂变性和热变性结合部分试剂变性后，进行22W，15s超声波辅助消化方法，用MALDI-TOF-MS鉴定分析。用热变性取代尿素变性，样品的盐浓度降低，质谱分析图谱显示信噪比提高，如图3，牛血清白蛋白B图信噪比高于A图。

细胞色素c经过尿素变性后，消化程度较差，如图3C质谱分析前未经过脱盐处理，信噪比低，不能实现正确的鉴定，说明尿素对质谱分析和蛋白质鉴定存在显著的影响。

实施例6.超声波辅助DTT和IAA还原烷基化反应

取0.5μL(20μg/μL)牛血清白蛋白、细胞色素c，进行超声波辅助快速还原烷基化反应(DTT 37℃恒温5min，IAA室温黑暗处反应5min)，结合90℃15min热变性，后进行22W，15s超声波辅助酶解，用MALDI-TOF-MS鉴定及数据搜索。见表3，还原烷基化反应缩短为10分钟后，牛血清白蛋白的序列覆盖率达32％，匹配肽段数目达20，细胞色素c的序列覆盖率达76％，匹配肽段数目达10，与常规1小时45分钟处理方法下的结果相似，均实现了准确鉴定。说明蛋白质经超声浴辅助还原烷基化反应后达到了与常规处理相似的变性效果。

表3 热变性结合常规部分试剂变性和快速试剂变性后的蛋白质序列覆盖率和匹配肽段数目

实施例7.热变性时体系pH和有机相体系对鉴定结果的影响

取0.5μL(20μg/μL)牛血清白蛋白、细胞色素c分别经DTT，IAA还原烷基化后，在碱性和酸性的水相或80％乙腈中进行90℃ 15min热变性，酸性的体系最后用碳酸氢铵调至终浓度25mmol/l，22W超声波辅助酶解15s，进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定和数据库搜索。

分析结果如图4和图5显示，牛血清白蛋白和细胞色素c在各种条件下预处理后均能实现正确的鉴定。牛血清白蛋白在热变性溶剂相为酸性时样品的序列覆盖率高于碱性，细胞色素c在酸性体系中热变性处理后，最后鉴定结果覆盖率较高。由于酸性条件下体系pH远离细胞色素c的等电点(pI 10.1)热变性时蛋白质的溶解度较高，聚集损耗较少，易被酶解，故离子强度和序列覆盖率较高。

牛血清白蛋白在水相和80％乙腈相消化后得到的氨基酸序列覆盖率和匹配肽段数目没有显著差异。而细胞色素c则是水相明显高于80％乙腈。由于细胞色素c较易溶于水，而80％乙腈中细胞色素c的溶解度不如水相中高，不利于胰蛋白酶消化，因此序列覆盖率低于水相。

实施例8.快速预处理方法用于肌红蛋白的鉴定

取0.5μL(20μg/μL)肌红蛋白，经快速预处理，即超声波辅助快速DTT，IAA还原烷基化后，进行90℃ 15min热变性，22W超声波辅助酶解15s，最后进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定和数据库搜索。与传统处理方法下，即试剂变性(尿素+DTT+IAA)和12小时整夜酶解后的鉴定结果比较，见表4和图6，快速的预处理方法下肌红蛋白实现了正确的鉴定，匹配肽段数目为8，氨基酸序列覆盖率达到63％，高于传统预处理方法下得到的覆盖率58％。

表4 肌红蛋白在传统处理与快速预处理下蛋白质序列覆盖率、匹配肽段数目和得分比较

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种快速酶解蛋白质的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)提供待酶解的蛋白质样品；

(2)将步骤(1)获得的待酶解的蛋白质样品进行变性处理，获得经变性的蛋白质样品；和

(3)对步骤(2)获得的经变性的蛋白质样品进行蛋白酶酶解处理，并辅以超声波处理，获得蛋白质多肽片段。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的待酶解的蛋白质样品中含有多种蛋白质或单种蛋白质。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将待酶解的蛋白质样品先进行还原和烷基化处理，再进行热变性，从而获得变性的蛋白质样品。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在进行还原和烷基化处理时，分别采用二硫苏糖醇和碘乙酰胺处理所述的蛋白质样品。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在进行还原和烷基化处理时，进行超声波辅助处理。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，在进行热变性时，调节蛋白样品的pH值远离样品蛋白质的等电点。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的蛋白酶是选自下组的一种或多种酶：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内肽酶Lys-C、V8蛋白酶、梭菌蛋白酶。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，进行超声波辅助处理时，超声时间10-30秒。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，进行超声波辅助处理时，超声功率是5-100瓦；

更佳地，采用间隔超声的方式：超声波每处理3-8秒，间歇3-8秒。

10.一种快速鉴定蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供待酶解的蛋白质样品；

(2)将步骤(1)获得的待酶解蛋白质样品进行变性处理，获得经变性的蛋白质样品；

(3)对步骤(2)获得的经变性的蛋白质样品进行蛋白酶酶解处理，并辅以超声波处理，获得蛋白质多肽片段；和

(4)用步骤(3)获得的蛋白质多肽片段进行质谱鉴定。

Images