CN106153746B - IgG2型单抗二硫键配对分析方法 - Google Patents
IgG2型单抗二硫键配对分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种IgG2型单抗二硫键配对分析方法，该方法包括步骤：1)、对蛋白质进行变性处理；2)、在非还原条件下使用特异性酶酶解变性处理后的蛋白质；3)、将酶解后的蛋白质分成两份样品，其中一份样品加入DTT进行还原，另一份样品不还原，两份样品均终止酶解；4)、对终止酶解后的样品的二硫键肽段进行质量肽谱图分析。本发明的方法可克服较为繁琐多种酶切处理方式，采用单一酶胰蛋白酶在非还原条件下酶解抗体蛋白，可以排除抗体蛋白特殊氨基酸序列对酶解蛋白时的空间位阻作用，能准确确认和定位二硫键肽段，并能检测到错配二硫键肽段。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种单抗二硫键配对分析方法。
背景技术
二硫键即S-S键，是2个巯基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的共价键，是一种常见的蛋白质翻译后修饰，交联多肽链内或链间的两个半胱氨酸，在形成稳定的蛋白质空间结构、保持正确的空间构象、调节生物学活性方面起着非常重要的作用。二硫键正确配对利于肽链迅速折叠并形成紧密的、稳定的空间结构，形成局部疏水中心，能阻止水分子进入肽的内部破坏氢键，形成稳定的高级结构区域。
二硫键只具有相对的稳定性，其共价键容易被还原而断裂，当二硫键被断开还原为巯基基团时，蛋白质结构及构象必然发生改变，可能完全或部分丧失原有的生物学功能，巯基含量较高的抗体具有较低的生物活性和较低的热稳定性(Chader jian WB，Chin ET，Harris RJ，et al.Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHOcell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibodyexpressed.Biotechnology Progress 2005；21(2):550-553；Lacy ER,Baker M,Brigham-Burke M.Free sulfhydryl measurement as an indicator of antibodystability.Analytical Biochemistry 2008；382:66-8)。正确的二硫键配对方对抗体蛋白药物生物学活性至关重要，错配或不能完全形成二硫键往往意味活性的降低(OuelletteD,Alessandri L,Chin A,Grinnell C,Tarcsa E,Radziejewski C,et al.Studies inserum support rapid formation of disulfide bond between unpaired cysteineresidues in the VH domain of an immuno
globulin G1molecule.AnalyticalBiochemistry 2010；397:37-47)。抗体蛋白狄迪诺塞麦(Denosumab)是一种典型的IgG2类型抗体，其铰链区有4对二硫键(Liu H，May K.Disulfide bond structures of IgGmolecules.mAbs 2012；4:117-23)，其本身结构容易形成二硫键。在细胞株克隆筛选、纯化工艺确认、制剂配方筛选、产品稳定性确认等研发周期过程中，监控二硫键配对可以判断抗体蛋白工艺开发的成熟度。现有的技术方法多是采用几种特异性酶进行联合酶解来确认Denosumab的二硫键配对形式，非常不方便。
因此，一种简单、有效的单抗二硫键配对分析方法仍是目前急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种IgG2型单抗(如Denosumab)二硫键配对分析方法，该方法克服了现有技术中使用酶切方式较多的缺点，减少了酶切方式，能准确确认和定位二硫键肽段，并能检测到错配二硫键肽段。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种蛋白质二硫键配对分析方法，包括如下步骤：1、对蛋白质进行变性处理；2、在非还原条件下使用特异性酶酶解变性处理后的蛋白质；3、将酶解后的蛋白质分成两份样品，其中一份样品加入DTT进行还原，另一份样品不还原，两份样品均终止酶解；4、对终止酶解后的样品的二硫键肽段进行质量肽谱图分析。
较佳的，所述蛋白质是抗体蛋白；进一步的所述蛋白质是IgG2型单抗如狄迪诺塞麦(Denosumab)。
较佳的，步骤1中，所述变性处理使用的缓冲液为盐酸胍；优选的变性样品体系中盐酸胍浓度为5M～7.6M。
在一具体实例中，所述变性处理使用的缓冲液为8M盐酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3。
较佳的，步骤2中，所述特异性酶为胰蛋白酶；优选胰蛋白酶的用量为1﹕5～12(wt/wt，酶/蛋白)；更优选胰蛋白酶的用量为1﹕10(wt/wt，酶/蛋白)。
在其它具体实例中，所述特异性酶为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、Lys-C酶；优选胰蛋白酶的用量为1﹕25(wt/wt，酶/蛋白)；优选胰凝乳蛋白酶的用量为1:50(wt/wt，酶/蛋白)；优选弹性蛋白酶的用量为1:50(wt/wt，酶/蛋白)；优选Lys-C酶的用量为1:200(wt/wt，酶/蛋白)。
较佳的，步骤3中使用DTT对所述其中一份样品进行还原；优选DTT的浓度为60mM。
较佳的，步骤3中加入甲酸(FA)终止酶解；优选加入所述甲酸至体积终浓度0.1％。
较佳的，步骤4中使用ESI-Q-TOF MS方法进行分析，所得数据采用BiopharmaLynx软件进行处理分析。
在另一具体实例中，所述ESI-Q-TOF MS分析采用以下方法实现：将抗体蛋白肽段样品用50mM NH4HCO3(pH8.0)溶液稀释至1.5-2mg/mL(以酶解前蛋白浓度计)；然后WatersAcquity UPLC BEH300C181.7μm 2.1×150mm色谱柱分离；进行Q-TOF质谱分析。
本发明所述抗体蛋白狄迪诺塞麦(Denosumab)轻链含有5个半胱氨酸Cys，分别为Cys23、Cys89、Cys135、Cys195、Cys215，重链含13个半胱氨酸Cys，分别为Cys22、Cys96、Cys136、Cys 149、Cys205、Cys224、Cys225、Cys228、Cys231、Cys262、Cys322、Cys368、Cys426，从轻链N-末端开始到C-末端分别标示为1C～5C，从重链N-末端开始到C-末端分别标示为6C～18C，理论配对链内二硫键为1C/2C、3C/4C、6C/7C、9C/10C、15C/16C、17C/18C，链间二硫键为5C/8C，铰链区二硫键为11C+12C+13C+14C/11C+12C+13C+14C。
实验结果表明，胰蛋白酶加入量为1：15及以上时，二硫键肽段6C/7C的丰度相对较低，其b、y离子个数较少，优选地胰蛋白酶加入量为1：10碎片离子信息较为丰富，这比通过几种特异性酶进行组合酶切确认所有二硫键配对的方式更简单更方便。
总之，与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明通过单一酶胰蛋白酶酶切能确认抗体蛋白狄迪诺塞麦全部二硫键配对，不需要多种酶组合酶切，并且碎片离子较为丰富，同时能检测到部分错配二硫键肽段。
附图说明
图1为本发明实施例1抗体蛋白二硫键肽段(1C/2C)碎片离子图；
图2为本发明实施例1抗体蛋白二硫键肽段(3C/4C)碎片离子图；
图3为本发明实施例1抗体蛋白二硫键肽段(5C/8C)碎片离子图；
图4为本发明实施例1抗体蛋白二硫键肽段(6C/7C)碎片离子图；
图5为本发明实施例1抗体蛋白二硫键肽段(9C/10C)碎片离子图；
图6为本发明实施例1抗体蛋白二硫键肽段(11C+12C+13C+14C/11C+12C+13C+14C)碎片离子图；
图7为本发明实施例1抗体蛋白二硫键肽段(15C/16C)碎片离子图；
图8为本发明实施例1抗体蛋白二硫键肽段(17C/18C)碎片离子图；
图9为本发明实施例1自由巯基肽段(1C)碎片离子图；
图10为本发明实施例1自由巯基肽段(2C)碎片离子图；
图11为本发明实施例1自由巯基肽段(3C)碎片离子图；
图12为本发明实施例1自由巯基肽段(4C)碎片离子图；
图13为本发明实施例1自由巯基肽段(6C)碎片离子图；
图14为本发明实施例1自由巯基肽段(7C)碎片离子图；
图15为本发明实施例1自由巯基肽段(8C)碎片离子图；
图16为本发明实施例1自由巯基肽段(9C)碎片离子图；
图17为本发明实施例1自由巯基肽段(10C)碎片离子图；
图18为本发明实施例1自由巯基肽段(11C+12C+13C+14C)碎片离子图；
图19为本发明实施例1自由巯基肽段(15C)碎片离子图；
图20为本发明实施例1自由巯基肽段(17C)碎片离子图；
图21为本发明实施例1自由巯基肽段(18C)碎片离子图；
图22为本发明实施例1抗体蛋白错配二硫键肽段(5C/10C)碎片离子图；
图23为本发明实施例1抗体蛋白错配二硫键肽段(6C/9C)碎片离子图；
图24为本发明实施例1抗体蛋白错配二硫键肽段(7C/8C)碎片离子图；
图25为本发明实施例1抗体蛋白错配二硫键肽段(8C/9C)碎片离子图。
附图中肽段中氨基酸之间的每一条虚线表示检测到的该肽段的一个碎片离子(b离子或y离子)，y离子是从肽段羧基端开始，b离子是从肽段氨基端开始。一般碎片离子越多越丰富，即表明该肽段是理论肽段，碎片离子较少，则不一定是理论肽段，可能是具有相同分子量的其他肽段，碎片离子的多少与肽段的长度及碎裂模式有关，太短或太长的肽段在诱导碰撞电离碎裂模式下一般碎片离子都较少。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进一步阐述，不应理解为是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均是按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行实验。
以下实施例中，所用抗体蛋白为Denosumab(上海抗体药物国家工程研究中心有限公司提供)。
以下实施例中，变性的定义是指在高浓度盐等作用下，蛋白质分子间氢键等次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构，但其一级结构并未改变。
以下实施例中，还原的定义是指蛋白质二硫键在还原试剂作用下断开。
实施例1：抗体蛋白二硫键配对分析(胰蛋白酶酶切)
抗体蛋白二硫键配对分析步骤：
(1)蛋白变性处理
取蛋白样品0.5mg加入到380μl变性缓冲液中(8M盐酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混匀，37℃孵育60分钟。超滤离心或经脱盐柱脱盐至50mM的NH4HCO3(pH8.0)缓冲液中。
(2)酶解
取(1)中蛋白100μg，以1:10(wt/wt，酶/蛋白)加入胰蛋白酶酶解抗体蛋白，37℃孵育4小时。
(3)还原和终止酶解
待(2)中样品酶解完成后，取出一半体积样品加入甲酸FA至体积终浓度0.1％；另一半体积样品加入1μL0.1M DTT(二硫苏糖醇)，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至体积终浓度0.1％，终止酶解反应，同时酸化肽段。
(4)ESI-Q-TOF质量肽谱图分析
混匀后离心10min(转速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色谱柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分离后，ESI-Q-TOF质谱分析，BiopharmaLynx软件分析。
所述ESI-Q-TOF MS分析典型参数包括质谱参数和液相条件优选如下：
表1：ESI-Q-TOF MS分析质谱参数和液相条件
流动相A：0.1％FA-H2O，流动相B：0.1％FA-ACN，质谱清洗液：50％CAN，质谱IntelliStart阀清洗液：50％MeOH，柱温：45℃，检测波长：214nm，进样体积：5μL或10μL，样品室温度：10℃，液相梯度洗脱条件：流动相B在80分钟内从1％到36％。
实验结果：实验结果见下表2-4，其中：表2为本发明实施例1非还原条件抗体蛋白二硫键肽段分子量与理论分子量对比表；表3为本发明实施例1非还原条件抗体蛋白自由巯基肽段分子量与理论分子量对比表；表4为本发明实施例1非还原条件抗体蛋白错配二硫键肽段分子量与理论分子量对比表：
表2：实施例1非还原条件抗体蛋白二硫键肽段分子量与理论分子量对比表
表3：实施例1非还原条件抗体蛋白自由巯基肽段分子量与理论分子量对比表
表4：实施例1非还原条件抗体蛋白错配二硫键肽段分子量与理论分子量对比表
经ESI-Q-TOF质量肽谱图分析，二硫键肽段(1C/2C)碎片离子图见附图1，二硫键肽段(3C/4C)碎片离子图见附图2，二硫键肽段(5C/8C)碎片离子图见附图3，二硫键肽段(6C/7C)碎片离子图见附图4，二硫键肽段(9C/10C)碎片离子图见附图5，二硫键肽段(11C+12C+13C+14C/11C+12C+13C+14C)碎片离子图见附图6，二硫键肽段(15C/16C)碎片离子图见附图7，二硫键肽段(17C/18C)碎片离子图见附图8，自由巯基肽段(1C)碎片离子图见附图9，自由巯基肽段(2C)碎片离子图见附图10，自由巯基肽段(3C)碎片离子图见附图11，自由巯基肽段(4C)碎片离子图见附图12，自由巯基肽段(6C)碎片离子图见附图13，自由巯基肽段(7C)碎片离子图见附图14，自由巯基肽段(8C)碎片离子图见附图15，自由巯基肽段(9C)碎片离子图见附图16，自由巯基肽段(10C)碎片离子图见附图17，自由巯基肽段(11C+12C+13C+14C)碎片离子图见附图18，自由巯基肽段(15C)碎片离子图见附图19，自由巯基肽段(17C)碎片离子图见附图20，自由巯基肽段(18C)碎片离子图见附图21，错配二硫键肽段(5C/10C)碎片离子图见附图22，错配二硫键肽段(6C/9C)碎片离子图见附图23，错配二硫键肽段(7C/8C)碎片离子图见附图24，错配二硫键肽段(8C/9C)碎片离子图见附图25。
实施例2：抗体蛋白二硫键配对分析(胰蛋白酶1：25酶切)
抗体蛋白二硫键配对分析步骤：
(1)蛋白变性处理
取蛋白样品0.5mg加入到380μl变性缓冲液中(8M盐酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混匀，37℃孵育60分钟。超滤离心或经脱盐柱脱盐至50mM的NH4HCO3(pH8.0)缓冲液中。
(2)酶解
取(1)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶酶解抗体蛋白，37℃孵育4小时。
(3)还原和终止酶解
待(2)中样品酶解完成后，取出一半体积样品加入甲酸FA至终浓度0.1％；另一半体积样品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至终浓度0.1％，终止酶解反应，同时酸化肽段。
(4)ESI-Q-TOF质量肽谱图分析
混匀后离心10min(转速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色谱柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分离后，ESI-Q-TOF质谱分析，BiopharmaLynx软件分析。
所述ESI-Q-TOF MS分析典型参数包括质谱参数和液相条件优选与实施例1中相同。
实验结果：能确认1C/2C、3C/4C、5C/8C、9C/10C、15C/16C和17C/18C共6对二硫键，含6C/7C二硫键可以找到，但丰度较低，碎片离子信息不丰富未能确认，同时铰链区11C+12C+13C+14C/11C+12C+13C+14C二硫键也未能确认。
实施例3：抗体蛋白二硫键配对分析(胰蛋白酶联合胰凝乳蛋白酶酶切)
抗体蛋白二硫键配对分析步骤：
(1)蛋白变性处理
取蛋白样品0.5mg加入到380μl变性缓冲液中(8M盐酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混匀，37℃孵育60分钟。超滤离心或经脱盐柱脱盐至50mM的NH4HCO3(pH8.0)缓冲液中。
(2)酶解
取(2)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶，以1：50(wt/wt)加入胰凝乳蛋白酶联合酶解抗体蛋白，37℃孵育4小时。
(3)还原和终止酶解
待(2)中样品酶解完成后，取出一半体积样品加入甲酸FA至终浓度0.1％；另一半体积样品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至终浓度0.1％，终止酶解反应，同时酸化肽段。
(4)ESI-Q-TOF质量肽谱图分析
混匀后离心10min(转速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色谱柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分离后，ESI-Q-TOF质谱分析，BiopharmaLynx软件分析。
所述ESI-Q-TOF MS分析典型参数包括质谱参数和液相条件优选与实施例1中相同。
实验结果：能确认3C/4C、5C/8C、9C/10C、11C+12C+13C+14C/11C+12C+13C+14C和15C/16C等二硫键配对，无法确认6C/7C二硫键肽段。
实施例4：抗体蛋白二硫键配对分析(胰蛋白酶联合胰凝乳蛋白酶酶切)
抗体蛋白二硫键配对分析步骤：
(1)蛋白变性处理
取蛋白样品0.5mg加入到380μl变性缓冲液中(8M盐酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混匀，37℃孵育60分钟。超滤离心或经脱盐柱脱盐至50mM的NH4HCO3(pH8.0)缓冲液中。
(2)酶解
取(1)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶，37℃孵育3小时后，再以1:50(wt/wt)加入胰凝乳蛋白酶，继续37℃孵育1小时。
平行取(1)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶，37℃孵育3小时40分钟后，再以1:50(wt/wt)加入胰凝乳蛋白酶，继续37℃孵育20分钟。
(3)还原和终止酶解
待(2)中样品酶解完成后，取出一半体积样品加入甲酸FA至终浓度0.1％；另一半体积样品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至终浓度0.1％，终止酶解反应，同时酸化肽段。
(4)ESI-Q-TOF质量肽谱图分析
混匀后离心10min(转速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色谱柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分离后，ESI-Q-TOF质谱分析，BiopharmaLynx软件分析。
所述ESI-Q-TOF MS分析典型参数包括质谱参数和液相条件优选与实施例1中相同。
实验结果：未能确认6C/7C二硫键肽段。
实施例5：抗体蛋白二硫键配对分析(胰蛋白酶联合弹性蛋白酶酶切)
抗体蛋白二硫键配对分析步骤：
(1)蛋白变性处理
取蛋白样品0.5mg加入到380μl变性缓冲液中(8M盐酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混匀，37℃孵育60分钟。超滤离心或经脱盐柱脱盐至50mM的NH4HCO3(pH8.0)缓冲液中。
(2)酶解
取(1)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶，以1:50(wt/wt)加入弹性蛋白酶，37℃孵育4小时。
(3)还原和终止酶解
待(2)中样品酶解完成后，取出一半体积样品加入甲酸FA至终浓度0.1％；另一半体积样品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至终浓度0.1％，终止酶解反应，同时酸化肽段。
(4)ESI-Q-TOF质量肽谱图分析
混匀后离心10min(转速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色谱柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分离后，ESI-Q-TOF质谱分析，BiopharmaLynx软件分析。
所述ESI-Q-TOF MS分析典型参数包括质谱参数和液相条件优选与实施例1中相同。
实验结果：由于弹性蛋白酶酶切位点较大，肽段较短，碎片离子信息也不丰富，未能确认6C/7C二硫键肽段。
实施例6：抗体蛋白二硫键配对分析(胰蛋白酶联合Lys-C酶切)
抗体蛋白二硫键配对分析步骤：
(1)蛋白变性处理
取蛋白样品0.5mg加入到380μl变性缓冲液中(8M盐酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混匀，37℃孵育60分钟。超滤离心或经脱盐柱脱盐至50mM的NH4HCO3(pH8.0)缓冲液中。
(2)酶解
取(2)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶，以1：200(wt/wt)加入Lys-C联合酶解抗体蛋白，37℃孵育4小时。
(3)还原和终止酶解
待(2)中样品酶解完成后，取出一半体积样品加入甲酸FA至终浓度0.1％；另一半体积样品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至终浓度0.1％，终止酶解反应，同时酸化肽段。
(4)ESI-Q-TOF质量肽谱图分析
混匀后离心10min(转速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色谱柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分离后，ESI-Q-TOF质谱分析，BiopharmaLynx软件分析。
所述ESI-Q-TOF MS分析典型参数包括质谱参数和液相条件优选与实施例1中相同。
实验结果：能确认1C/2C、3C/4C、15C/16C和17C/18C等二硫键肽段，但无法确认6C/7C二硫键肽段。
综上，与现有技术相比，本发明通过单一酶胰蛋白酶在非还原条件下，能直接确认抗体蛋白Denosumab所有二硫键配对方式，可以排除抗体蛋白特殊氨基酸序列对酶解蛋白时的空间位阻作用，全部二硫键配对只通过单一酶酶切方式即能确认，方法简单方便、有效可靠。同时，该方法可以检测到部分错配的二硫键肽段。
Claims (2)
1.Denosumab单抗的二硫键配对分析方法，依次包括如下步骤：1)、取蛋白加入变性缓冲液,37℃孵育1小时，超滤离心或经脱盐柱脱盐至pH8.0的NH4HCO3中，变性缓冲液为8M盐酸胍、5mM EDTA和0.5M Tris的混合物，其pH为8.3；2)、取上步变性处理后的蛋白加入与蛋白重量比为1:10的胰蛋白酶在37℃孵育4小时，酶解变性处理后的蛋白质；3)、将酶解后的蛋白质分成两份样品，其中一份样品加入DTT进行还原并37℃水浴30分钟，另一份样品不还原，两份样品均加入甲酸FA至终体积浓度0.1％终止酶解；4)、对终止酶解后的样品的二硫键肽段使用ESI-Q-TOF MS分析。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述ESI-Q-TOF MS分析采用以下方法实现：将蛋白肽段样品用50mM NH4HCO3，pH8.0溶液稀释至1.5-2mg/mL，然后用色谱柱分离，进行ESI-Q-TOF质谱分析。
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Also Published As
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| CN106153746A (zh) | 2016-11-23 |
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