CN108333281A - 一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法,属于蛋白质组学的技术领域。是利用LC‑Q‑Q‑TOF联用技术与“柱后在线还原法”相结合测定rhG‑CSF二硫键以及二硫键错配比例的方法。测试步骤有采用胃蛋白酶在缓冲液pH5.0的条件下对rhG‑CSF进行酶切、还原样品和未还原样品的LC‑MS检测、未还原样品的在线柱后还原液相色谱质谱联用检测。本发明直接在酸性条件下对rhG‑CSF进行酶解,省略变性和烷基化步骤使操作简洁,反应条件温和,重复性好,灵敏度高;搭配在线柱后还原法可显著降低数据分析难度;鉴定rhG‑CSF的二硫键和计算二硫键错配比例结果更可靠,实验过程更简洁,数据分析更高效。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学的技术领域,涉及一种基于高效液相色谱质谱联用技术和在线柱后还原技术测定重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)中二硫键及二硫键错配比例的方法。
背景技术
二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰,对稳定蛋白质的空间结构,维持构象及调节其生物活性有着非常重要的作用。因此,探索二硫键在蛋白质中的连接方式对于全面了解蛋白质化学结构具有重大意义。
目前常用的定位二硫键的主要方法分为非片段法和片段法:非片段法即在保持蛋白质原有构象的基础上进行测定,包括X射线衍射晶体结构解析法、多维核磁共振波谱法等;片段法则将蛋白质用各种手段裂解开来,通过鉴定其产生的片段来进行二硫键分析,包括对角线电泳法、酶解法、氰化半胱氨酸裂解法及部分还原测序法等。
X射线晶体衍射法是确定蛋白质构象最准确的方法,但其依赖于高纯度蛋白在复杂条件下形成结晶方可准确测定,对前期样品处理是要求非常高,亦非常耗资、耗时。多维核磁共振波谱法在分析分子量较大、二硫键构型复杂的蛋白质的时候,谱图复杂程度较高;而在蛋白纯度不够或样品量较少时,准确性也随之下降,目前上述两种方法尚未被广泛采用。氰化半胱氨酸裂解法前处理过程较为剧烈,可能会加剧二硫键的重排作用,造成假阳性结果,因此一般不被优先选择。
酶解法是将含有二硫键的蛋白质借助蛋白酶进行酶切,将酶切产物经过一些手段(例如电泳、色谱等)进行分离,通过对比还原前和还原后的检测结果来获取二硫键相关信息的方法。对角线电泳与酶解法搭配使用是一种曾被广泛使用的二硫键定位分析方法。其大致思路是将蛋白质进行酶切,继而在弱酸性条件下进行一维电泳,当酶解产物在胶片上充分分离后,再将凝胶暴露于过甲酸蒸汽中(该步骤目的是将二硫键氧化),再将凝胶旋转90度,采用相同条件(电压、电流、时间)进行第二维电泳。经过上述步骤,不含二硫键的肽段在电泳胶片上横纵迁移率一致,因此会整齐地排列在胶片的对角线上;而含二硫键的肽段被氧化之后,其产物的电泳行为会发生变化,横纵迁移率不再一致,导致其偏离对角线之外。二硫键氧化产物可通过茚三酮显色等手段来检测。该方法的弊端在于:由于过甲酸除了氧化二硫键之外,还可能氧化肽段中的色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸等,会增加分析的复杂程度;此外,该实验重现性差、耗时长、自动化程度低,无法实现高通量,近年来已逐渐被兼具分离和检测功能的液相色谱质谱联用法取代。该方法与对角线电泳法的不同之处在于:酶解后的样品经液相色谱分离之后流入质谱进行在线检测。研究者可以通过对比还原前和还原后的肽图差异,找到含有二硫键的肽段,再通过回收、富集这些二硫肽并进行还原处理,得到单个二硫肽还原后的产物,借助质谱手段鉴定出肽段序列从而得到二硫键构型信息。相比于前几种二硫键分析方法,酶解法结合液相色谱质谱联用仪用于分析蛋白质二硫键,体现出自动化程度高、省时、高通量、高准确度和重现性等优点。
大量文献证明,酸性环境有利于保持二硫键原有构象,碱性条件则会加剧蛋白分子中二硫键交换作用,尤其在分子内存在未配对半胱氨酸时错配现象更为严重。而常见的用于二硫键分析的酶例如胰蛋白酶(Trypsin)、胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)、赖氨酸C端内切酶(Lys-C)、谷氨酸C端内切酶(Glu-C)等,最适pH多偏碱性。这些蛋白酶在酸性条件下酶活会降低数倍,很难发挥效力,而在碱性条件下酶切,又容易产生大量的错配,使分析结果不准确。胃蛋白酶由于位点专一性较差,酶切肽段较为复杂,给数据分析造成很大干扰。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种重要的细胞因子,它选择性作用于粒系造血祖细胞,促进其增殖、分化。基因重组人粒细胞集落刺激因子是由基因工程方法表达的人粒细胞集落刺激因子,主要作用于中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化和分化。其最重要的作用是刺激粒细胞、单核巨噬细胞成熟以及促进成熟细胞向外周血释放,主要用于大面积烧伤或癌症化疗所致的中性粒细胞减少等相关症状。rhG-CSF由174个氨基酸组成,其中包含两对二硫键和一个未配对半胱氨酸,氨基酸序列如下:
当采用酶解法分析rhG-CSF的二硫键时,常用的蛋白酶例如胰蛋白酶、赖氨酸C酶等均不能将其酶解为适合检测的肽段;且在碱性条件下,分子内的未配对半胱氨酸极易攻击已配对的二硫键,使之发生错配。
本发明参考已发表文献(Jingjie Mo,Adrienne A.Tymiak and GuodongChen.Rapid Commun.Mass Spectrom.2013,27,940–946)作为背景技术,该研究借助变性剂RapiGest SF在pH7.0条件下,用N-乙酰马来酰亚胺(NEM)对rhG-CSF进行烷基化以封闭游离半胱氨酸;再将体系置换为pH7.5缓冲液,用Glu-C酶切过夜。酶解液通过液相色谱质谱联用仪进行检测。该研究虽正确测定了rhG-CSF的二硫键,并计算出半胱氨酸的错配比例依次为:37%(Cys17),25%(Cys36-Cys42)和3%(Cys64-Cys74)。然而,由于此研究采用的烷基化和酶切体系均为中性或偏碱性体系,那么其结果中较高的二硫键错配比例,很有可能来源于烷基化和酶切过程。此外,背景技术在对二硫肽进行解析须借助赛默飞公司的静电场轨道阱(Orbitrap)质谱仪,且必须配备电子转移裂解模块(electron transferdissociation,ETD)方可实现。该方法前处理过程复杂,重复性差,且对实验仪器要求较高,不适合作为常规方法使用。
综上所述,使用酶解法搭配液相色谱质谱联用仪进行rhG-CSF的蛋白质二硫键分析和二硫键错配分析,选用合适的蛋白酶和酶切条件、减少样品处理过程中二硫键错配、降低数据复杂度、降低对实验仪器的依赖度,是目前亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题,是在使用酶解法和液相色谱质谱联用仪进行重组人粒细胞集落刺激因子的二硫键分析和二硫键错配分析实验中,如何减少样品在前处理中发生的二硫键错配问题、高效采集质谱数据并进行解析、以及降低对实验仪器的依赖程度的问题。
本发明一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法,“二硫键组成”包括二硫键正确配对方式和错配比例测定。本发明采用胃蛋白酶酶切结合在线柱后还原法对二硫键组成进行测定。即,选用胃蛋白酶(sigma)在pH2-6的柠檬酸钠缓冲液中酶切16小时,将酶解液分为两份:一份直接使用LC-MS分析;另一份经三羧基乙基膦(TCEP)还原后再进行LC-MS分析。对比还原前后的色谱和质谱图差异,找到还原后消失的组分记录为含二硫键的肽段。还原前的肽图样品还需经液相色谱分离后使用“柱后在线还原法”进行在线还原,并注入质谱仪进行检测,在含有二硫键的肽段对应的保留时间处可以检测到对应肽段的还原的产物,再通过分析这些还原产物来确定二硫键的连接方式。分别提取每个二硫键和半胱氨酸相关肽段的离子流峰面积,计算出rhG-CSF的二硫键组成。
本发明的测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法可如下所述。
A、rhG-CSF样品的胃蛋白酶酶解
将胃蛋白酶(购买自Sigma公司,来源:猪胃粘膜)以超纯水配制成1mg/ml溶液,每支100μl分装冻存备用。配制50mM~100mM的柠檬酸溶液,用氢氧化钠溶液调节pH至2.0~6.0,微孔滤膜过滤备用。用上述过滤后的柠檬酸钠溶液将rhG-CSF原液稀释至1mg/ml,向rhG-CSF溶液中加入胃蛋白酶溶液(按照质量比rhG-CSF溶液:胃蛋白酶溶液=40:1比例),漩涡混匀后在37℃水浴孵育16小时。此为还原前样品。
将酶解产物取出100μL置于EP管中,加入1μL TCEP溶液,室温下孵育0.5小时,此为还原后样品。
B、在线柱后还原装置的构建
在线柱后还原装置的原理是将液相色谱的紫外检测器出口端、针泵、质谱离子源的入口端通过一个三通连接在一起,使流过紫外检测器出口的液体与进样针内的还原剂按照一定比例混合后进入质谱进行检测,从而实现对含有二硫键的肽段进行在线还原,并同步检测其还原产物的目的。
C、样品检测
还原前和还原后酶解样品分别用液相色谱质谱联用仪进行检测。对比还原前后肽图的差异,可以找到还原后消失(或显著降低)的色谱峰,确定并记录含有二硫键肽段的一级质谱分子量和保留时间。查找在柱后还原质谱数据中,对应保留时间处产生的新肽段,通过对这些新肽段的二级质谱数据分析,确定二硫键连接方式。
D、数据处理:
液相色谱质谱联用检测时,利用Analyst 1.7.1工作站进行数据采集;利用PeakView2.2软件进行图谱对比和含二硫键的肽段离子流提取工作;使用PEAKS Studio软件进行肽段匹配和二级质谱解析。通过提取二硫键和半胱氨酸相关肽段的离子流峰面积,计算出rhG-CSF的二硫键组成。
结合上述和实施例确定本发明的技术方案如下。
一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法,分为样品前处理、还原前和还原后酶解液的液相色谱质谱联用仪检测、还原前酶解液的在线柱后还原结合液相色谱质谱联用仪检测、确定二硫键连接方式、计算半胱氨酸错配比例五个步骤;
所述的样品前处理,是将重组人粒细胞集落刺激因子原液使用胃蛋白酶进行水解,水解条件为pH值2.0~6.0的酸性环境,37℃水浴孵育16小时,得到酶解液;
所述的还原前和还原后酶解液的液相色谱质谱联用仪检测,将酶解液取出一部分,使用三羧基乙基膦还原,将还原前和还原后的酶解液分别进行液相色谱质谱联用检测得到对应肽图;对比还原前后肽图的差异,找到还原后消失或显著降低的色谱峰,确定含有二硫键的肽段,记录含有二硫键肽段的一级质谱分子量和保留时间;
所述的还原前酶解液用柱后还原法结合液相色谱质谱联用检测,是使流过液相色谱紫外检测器出口的还原前的酶解液与针泵的在线还原试剂混合后进入质谱进行检测,找到在柱后还原质谱数据中对应含二硫键肽段的保留时间处产生的新肽段,分析还原后新肽段的二级质谱数据;所述的在线还原试剂为二硫苏糖醇的氨水溶液;
所述的确定二硫键连接方式,是采用质谱分析软件对二级质谱数据进行解析,分析差异、鉴定酶解肽段,最后确定二硫键连接方式;
所述的计算半胱氨酸错配比例,是提取含有半胱氨酸的肽段并对峰面积进行积分,计算出每个半胱氨酸错配比例。
在样品前处理步骤中,所述的水解条件,优选用50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠配置pH值为5.0;所述的胃蛋白酶,是提取自猪胃粘膜的胃蛋白酶,蛋白浓度最好为1mg/mL,蛋白与酶的质量比为40:1。
在还原前酶解液用柱后还原法结合液相色谱质谱联用检测步骤中,在线还原剂二硫苏糖醇的浓度可以选用0.2mol/L,载体溶液氨水的浓度可以选用9%。
所述的确定二硫键连接方式,更具体的是使用PEAKS质谱数据分析软件对还原前酶解液用柱后还原法结合液相色谱质谱联用检测所得数据进行解析,通过高分辨一级质谱数据进行肽段匹配,通过二级质谱数据对肽段进行精准鉴定;在含二硫键肽段对应的保留时间处,通过柱后还原产生的新肽段中所包含的两个半胱氨酸,被确定为形成了二硫键。
所述的计算半胱氨酸错配比例,更具体的是使用PeakView2.2质谱分析软件的提取离子流功能,将含半胱氨酸肽段所有价态的单同位素离子提取出来并求和,作为该肽段的峰面积;半胱氨酸错配比例计算公式如下:对于一个半胱氨酸来说,将含有该半胱氨酸的所有错误形式存在的肽段峰面积之和除以全部包括正确形式和错误形式的包含该半胱氨酸的肽段的面积总和,再乘以100%,即得到该半胱氨酸的错配比例。
本发明的有益效果是应用于二硫键研究具有更强的优势,具体的是:
1,与背景技术相比,本发明省去了变性、烷基化等步骤,前处理过程操作简洁,反应条件温和,更有利于维持蛋白原有结构;
2,与背景技术相比,使用胃蛋白酶可以直接在酸性条件下对待测物进行酶解,大大降低二硫键错比例,尤其适合分子内存在未配对半胱氨酸的蛋白质分子的二硫键定位的检测;而且胃蛋白酶的活力更高。
3,与背景技术相比,本发明对实验仪器的要求大大降低。背景技术须采用赛默飞公司的静电场轨道阱质谱仪(Orbitrap)且必须搭配电子转移裂解(Electron TransferDissociation,ETD)模块,方可实现对rhG-CSF二硫键和错配组分的鉴定,而本发明仅需一台任意型号的液相色谱高分辨质谱联用仪(包括被广泛应用的四级杆-飞行时间质谱仪和静电场轨道阱质谱仪等),搭配一台带有进样针的针泵(绝大部分质谱仪标配此组件)或能够流动注射的蠕动泵即可完成;
4,本发明将胃蛋白酶酶解和在线柱后还原法联合使用鉴定rhG-CSF的二硫键,大大降低数据分析难度。通过此方法,二硫肽及其还原产物很容易被锁定,辅以PEAKS质谱分析软件进行二级质谱解析,能够更快速、更准确地对酶解肽段进行鉴定;
5,本发明在检测rhG-CSF的二硫键错配比例实验中,表现出较高的灵敏度,对含量很低的二硫键错配形成的肽段也能够有效检测;
6,本发明在构建的柱后在线还原装置(参见实施例和图19),选择将还原剂在紫外检测器之后通过三通接入,这样做的好处在于避免了还原剂以及载体溶液(氨水溶液)造成较高的紫外吸收从而干扰紫外信号。
附图说明
图1是还原前和还原后样品总离子流对比图,其中框选部分为8个显著变化的色谱峰。
图2~图9分别是还原前样品中8个显著变化的色谱峰对应的一级质谱图和在线还原产物的一级质谱图的对比图。
图10~图18分别是图2~图9的在线还原产物的二级质谱及碎片离子匹配图。
图19是柱后在线还原装置示意图。
具体实施方式
实施例1
1、rhG-CSF样品的胃蛋白酶酶解
将胃蛋白酶(购买自Sigma公司,来源:猪胃粘膜)以超纯水配制成1mg/ml溶液,每支100μl分装冻存备用。配制50mM的柠檬酸溶液,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调至pH 5.0,用0.45μm微孔滤膜过滤。用此溶液将rhG-CSF原液稀释至1mg/ml,按照体积比40:1比例加入1mg/ml胃蛋白酶,旋涡混匀三次,每次5秒,混匀后置于37℃水浴孵育16小时。将上述酶解产物取出100μL置于液相色谱进样瓶中,此为还原前样品。将酶解产物取出100μL置于EP管中,加入1μL TCEP溶液(浓度为1mol/L,以超纯水配制),旋涡混匀三次,每次5秒,混匀后置于室温下孵育0.5小时,转移至液相色谱进样瓶中,此为还原后样品。
上述的使用胃蛋白酶可以直接在酸性条件下对待测物进行酶解,大大降低二硫键错比例,尤其适合分子内存在未配对半胱氨酸的蛋白质分子的二硫键定位的检测;而且胃蛋白酶的活力更高。
2、还原前样品和还原后样品的LC-MS检测与差异肽段查找
将还原前和还原后酶解样品分别用LC-MS系统进行检测,其色谱条件和质谱条件见下表。记录色谱和质谱信号,对比还原前后肽图的差异,可以找到还原后消失(或显著降低)的色谱峰,确定并记录其一级质谱分子量和保留时间,这些色谱峰就是被关注的二硫键的肽段。找到还原后消失或显著降低的质谱信号,确定为含有二硫键的肽段,可以缩小关注范围,有助于降低数据分析复杂度。
色谱条件:
流速:0.2mL/min;
波长:210nm-220nm;
流动相A:0.1%FA-水;
流动相B:0.1%FA-乙腈。(水、乙腈、甲酸均为质谱纯)
色谱柱:Waters Peptide BEH C18 1.7μm 2.1×150mm
柱温:50℃;
进样量:30μL;
洗脱方式:梯度洗脱,梯度表见表1。
表1:液相色谱梯度表
质谱条件:
本发明所用的质谱参数设置见表2。
表2:质谱参数表
色谱条件和质谱条件不局限于上述参数,可在合理范围内适度调整。
3、构建在线柱后还原装置
将液相色谱紫外检测器出口端、针泵、质谱离子源的入口端通过一个三通连接在一起,使流过紫外检测器出口的液体与针泵的液体按照要求的比例混合后进入质谱进行检测。具体示意图见图19。流动相需要经过金属两通到达质谱离子源,金属两通紧密贴合在离子源金属表面,起到辅助加热的作用。从金属三通混合后进入离子源这部分流路的液体体积需大于15μL,小于50μL,该部分的死体积如果过小,会导致还原不彻底;体积过大则会导致质谱峰变宽、分离度变差和响应值降低。
4、对还原前样品进行柱后还原质谱检测
rhG-CSF的还原前肽图样品需要按照如下条件进行在线还原检测:在线还原试剂为200mM二硫苏糖醇(DTT)溶于9%氨水溶液。将在线还原试剂吸入针泵,通过三通与柱后管路相连,以5μL/min流速,与流动相在柱后充分混合之后注入质谱仪进行在线还原检测。还原前肽图样品进样20μL,色谱条件和质谱条件同上。
在已经缩小关注范围的基础上在线对含二硫键的肽段还原,直接检测其还原产物,省去富集的步骤并提高灵敏度,对检测低浓度组分优势更加明显。
5、数据分析
5.1二硫键分析
通过对比rhG-CSF的还原前和还原后肽图数据的差异,找到经TCEP处理后消失(或显著降低)的色谱峰,确定并记录其一级质谱分子量和保留时间,这些色谱峰就是本发明关注的含二硫键的肽段。
在还原前样品的柱后在线还原质谱数据中,找到二硫肽经在线柱后还原之后新产生的质谱信号。通过对这些还原后新生成的肽段进行二级质谱数据分析,确定二硫键连接方式。
通过上述方法,在rhG-CSF的还原前肽图中找到8个还原后消失或显著降低的色谱峰,分别命名峰1~峰8,其对应的保留时间和质荷比、相对分子质量见表3。
表3:含二硫键色谱峰汇总表
经过在线柱后还原和质谱检测,上述8个含二硫键肽段被还原,峰1还原后生成2个含有半胱氨酸的肽段;峰2~峰8还原后均生成1个肽段,通过二级质谱分析,证明了这种情况是由于一个肽段中的两个半胱氨酸巯基相连形成二硫桥,还原后二硫键打开而肽键并未断裂,故分子量比原来增加2Da。8个色谱峰还原后生成的9个含半胱氨酸肽段及对应的匹配结果见表4。
表4:二硫肽还原产物汇总表
注:带有*的肽段为N末端的谷氨酰胺发生焦谷氨酸化的产物。
根据以上数据,能够得出结论如下:在rhG-CSF的分子内,存在两对二硫键,分别是第36位半胱氨酸与第42位半胱氨酸相连;第64位半胱氨酸与第74位半胱氨酸相连。
上述的还原前酶解液的在线柱后还原结合液相色谱质谱联用分析,是在已经缩小关注范围的基础上在线对含二硫键的肽段还原,直接检测其还原产物,省去富集的步骤并提高灵敏度,对检测低浓度组分优势更加明显。
5.2错配分析
通过对比还原前肽图样品的肽图检测结果和在线柱后还原肽图结果,找到30.8min、35.3min和40.1min三个色谱峰为正确的含二硫键肽段;31.9min、32.2min为二硫键错配形成的肽段,上述正确和错误二硫键配对形成的肽段整理在表5中。
表5:含半胱氨酸肽段还原前后峰面积及错配比例汇总表
注:由于第64位半胱氨酸和第74位半胱氨酸未发现有错配情况,因此未整理在表格中。表格中括号内数字为所带电荷数。
通过PeakView2.2软件分别提取各肽段的单同位素峰(包含所有可能带上的电荷数)求和,作为该肽段的峰面积。对于每一个半胱氨酸,采用如下公式计算其错配比例:
包含该半胱氨酸肽段的正确形式总峰面积/(正确形式半胱氨酸肽段峰面积+错误形式半胱氨酸肽段峰面积)*100%
通过计算,得出Cys17的错配比例为8.1%;Cys36的错配比例为2.5%;Cys42的错配比例为10%;Cys64-Cys74这对二硫键未发现有错配情况,故认为错配比例近似为零。上述结果远低于背景技术采用pH7.0条件N-乙酰马来酰亚胺(NEM)烷基化、pH7.5条件下Glu-C酶切所得结果:37%(Cys17),25%(Cys36-Cys42)和3%(Cys64-Cys74)。
综上所述,使用胃蛋白酶在pH5.0下对rhG-CSF酶解,通过LC-MS/MS和柱后在线还原法搭配使用,可准确鉴定rhG-CSF的分子内二硫键,且省时省力、数据易于分析。通过对rhG-CSF的二硫键错配情况的分析,以及与背景技术的对比,证实了该方法鉴定rhG-CSF二硫键能够得到更低的错配比例,准确性更好,更适用于rhG-CSF药品的批间一致性控制。
Claims (5)
1.一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法,分为样品前处理、还原前和还原后酶解液的液相色谱质谱联用仪检测、还原前酶解液的在线柱后还原结合液相色谱质谱联用仪检测、确定二硫键连接方式、计算半胱氨酸错配比例五个步骤;
所述的样品前处理,是将重组人粒细胞集落刺激因子原液使用胃蛋白酶进行水解,水解条件为pH值2.0~6.0的酸性环境,37℃水浴孵育16小时,得到酶解液;
所述的还原前和还原后酶解液的液相色谱质谱联用仪检测,将酶解液取出一部分,使用三羧基乙基膦还原,将还原前和还原后的酶解液分别进行液相色谱质谱联用检测得到对应肽图;对比还原前后肽图的差异,找到还原后消失或显著降低的色谱峰,确定含有二硫键的肽段,记录含有二硫键肽段的一级质谱分子量和保留时间;
所述的还原前酶解液用柱后还原法结合液相色谱质谱联用检测,是使流过液相色谱紫外检测器出口的还原前的酶解液与针泵的在线还原试剂混合后进入质谱进行检测,找到在柱后还原质谱数据中对应含二硫键肽段的保留时间处产生的新肽段,分析还原后新肽段的二级质谱数据;所述的在线还原试剂为二硫苏糖醇的氨水溶液;
所述的确定二硫键连接方式,是采用质谱分析软件对二级质谱数据进行解析,分析差异、鉴定酶解肽段,最后确定二硫键连接方式;
所述的计算半胱氨酸错配比例,是提取含有半胱氨酸的肽段并对峰面积进行积分,计算出每个半胱氨酸错配比例。
2.根据权利要求1所述的一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法,其特征在于,在样品前处理步骤中,所述的水解条件,是用50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠配置pH值为5.0;所述的胃蛋白酶,是提取自猪胃粘膜的胃蛋白酶,蛋白浓度为1mg/mL,蛋白与酶的质量比为40:1。
3.根据权利要求1所述的一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法,其特征在于,在还原前酶解液用柱后还原法结合液相色谱质谱联用检测步骤中,在线还原剂二硫苏糖醇的浓度是0.2mol/L,载体溶液氨水的浓度是9%。
4.根据权利要求1所述的一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法,其特征在于,所述的确定二硫键连接方式,是使用PEAKS质谱数据分析软件对还原前酶解液用柱后还原法结合液相色谱质谱联用检测所得数据进行解析,通过高分辨一级质谱数据进行肽段匹配,通过二级质谱数据对肽段进行精准鉴定;在含二硫键肽段对应的保留时间处,通过柱后还原产生的新肽段中所包含的两个半胱氨酸,被确定为形成了二硫键。
5.根据权利要求1所述的一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法,其特征在于,所述的计算半胱氨酸错配比例,是使用PeakView2.2质谱分析软件的提取离子流功能,将含半胱氨酸肽段所有价态的单同位素离子提取出来并求和,作为该肽段的峰面积;半胱氨酸错配比例计算公式如下:对于一个半胱氨酸来说,将含有该半胱氨酸的所有错误形式存在的肽段峰面积之和除以全部包括正确形式和错误形式的包含该半胱氨酸的肽段的面积总和,再乘以100%,即得到该半胱氨酸的错配比例。
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