CN1387579A - 纤维蛋白溶酶原激活剂的反相hplc分析 - Google Patents

纤维蛋白溶酶原激活剂的反相hplc分析 Download PDF

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Abstract

本发明描述了一种监控纯化工艺从含有人tPA或其变体的样品中除去中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内源性纤维蛋白溶酶原激活剂(PA)的有效性的方法。该方法包括使所述样品与能特异性裂解人类野生型tPA中Arg275－Ile276键的蛋白酶一起保温,然后与含有各自有效量的能使人类野生型tPA中二硫键还原的变性/还原剂一起保温;对该样品实施反相高效液相层析步骤,分析层析步骤的洗脱图谱,以便得出其中出现的CHO细胞内源性PA的量。

Description

纤维蛋白溶酶原激活剂的反相HPLC分析
                         发明背景
本发明涉及能定量中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的tPA的测定法，所述tPA出现在CHO细胞中产生的具有天然序列的重组人tPA或其变体的样品中。
                        相关领域描述
组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)是参与导致血凝块解散的一系列事件的内源性丝氨酸蛋白酶(Astrup和Permin，Nature，159，681-682(1947)；Camiolo et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，138，277-280(1971)；Collen，J.Biol.Chem.，33，77-86(1987)；Hoylaerts et al.，J.Biol.Chem.，257，2912-2919(1982))。ACTIVASE是人类tPA的重组形式(r-tPA)，其用于处理急性心肌梗塞和肺栓塞(Grossbard，Pharm.Res.，4，375-378(1987))。最近ACTIVASE还获准用于治疗局部缺血性休克(Smith et al.，Acad.Emergency Medicine，6(6)，618-25(1999)；Kwiatkowski et al.，New Enq.J.Med.，340(23)，1781-1787(1999))。这是一种糖蛋白，是通过在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达天然人类tPA的互补DNA(cDNA)而产生的。TNK-tPA是人tPA克隆并表达在CHO细胞中的一种遗传工程变体(Keyt et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA.，91，3670-3674(1994))。所述TNK-tPA变体通过在人类tPA的三个特殊位点进行定点突变而产生。这三个定点突变是Thr103变为Asn(T103N)，Asn 117变为Gln(N117Q)，以及Lys-His-Arg-Arg 296-299变为Ala-Ala-Ala-Ala(KHRR296-299AAAA)。与tPA相比，TNK-tPA具有相似的体外生物学活性，对纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂的抗性增强，对纤维蛋白的特异性增强，且更容易从血浆中清除(Keyt et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA.，91，3670-3674(1994)；Thomas et al.，Stroke，25：10，2072-2079(1994)；Benedict et al.，Circulation，92：10，30323040(1995)；Modi et al.，Thromb Haemost，79，134-139(1998))。r-tPA的单一大药丸给药形式目前正等待批准。CHO细胞合成内源性仓鼠tPA，其称为CHO-PA。经凝血块裂解试验测定，CHO-PA具有类似于人类tPA的纤维蛋白溶解活性。CHO-PA与人类tPA有80％的氨基酸序列同一性。很多取代都是半保守的取代，如：ArgLys，GluAsp，PheTyr，ValAla，IleLeu或ThrSer。利用基于牛胰凝乳蛋白酶结构的人类tPA蛋白酶结构域模型显示，实质上CHO-PA中所有取代均位于或靠近蛋白的表面。
r-tPA，TNK-tPA，CHO-PA都是由527个氨基酸组成的单链多肽，具有17个二硫键(Nguyen和Carole，″Stability Characterization and FormulationDevelopment of Altepase，a Recombinant Tissue Plasminogen Activator，″inStability and Characterization of Protein and Peptide Drugs：Case Histories，Y.J.Wang，R.Pearlman，eds.，(Plenum Press：New York，1993)，pp.91-135。在所有这三种蛋白中，位于Arg275和Ile276之间的肽键对蛋白酶的裂解尤其敏感。这种裂解可产生两种片段：一种由N-末端275个氨基酸组成，另一种由C-末端252个氨基酸组成。所述N-末端链包含与纤维蛋白溶酶原和凝血酶原中发现的可里格尔(kringle)区同源的区域，并因此常常被称为“可里格尔片段”(Nguyen和Carole，出处同上；de Vos et al.，Biochem.，31，270-279(1992))。
C-末端链包含催化裂解活性部位，并因此通常被称为“蛋白酶片段”(Pennica et al.，Nature，301，214-221(1983))。裂解后的两条链通过在Cys264和Cys395之间形成一个二硫键而相连。裂解后的分子通常被称为“双链tPA”，其对应于“单链tPA”或完整形式。
r-tPA含有4个由Asn-X-Ser/Thr序列识别而进行N-连接糖基化的潜在位点(Nguyen和Carole，出处同上)。它们是Asn117，Asn184，Asn218和Asn448。r-tPA有两种糖基化同工酶，分别称为I型和II型。I型r-tPA在Asn117，Asn184，和Asn448发生糖基化；而II型r-tPA仅在Asn117和Asn448发生糖基化。Asn218在这两种同工酶中均未发生糖基化。TNK-tPA具有与r-tPA相同的糖基化模式，仅区别在于因Thr103突变为Asn和Asn117突变为Gln而有效地将糖基化位点从第117位转移到第103位(Keyt et al.，出处同上)。CHO-PA的糖基化模式尚未完全弄清楚(Rijken和Collen，J.Biol.Chem.，256：7035-7041(1981)。
ACTIVASE是重组人类组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(r-tPA)的商标，该激活剂用于处理急性心肌梗塞和肺栓塞。以ACTIVASE为商标的tPA目前已获准用于治疗局部缺血性休克。它通过天然人类rPA的互补DNA(cDNA)在中国仓鼠卵巢(CHO)中的表达而产生(美国专利5,753，486)。TNK-tPA是r-tPA的一种遗传工程化变体，它与ACTIVASEr-tPA相比，效力增强且出血的可能性降低。它通过三处定点突变(T103N，N117Q和KHRR296-299AAAA)而产生，并已经克隆和表达在CHO中(美国专利5,612,029)。CHO细胞生物合成内源性仓鼠tPA，其称为CHO-PA。CHO-PA与r-tPA具有很高的氨基酸序列同源性(80％相同)。所有三种溶血栓蛋白由于蛋白裂解/水解作用和不同的糖基化作用而以异源同工酶的形式存在。
美国专利5,411,864公开了一种从CHO-PA中纯化人类tPA的方法。该方法包括使含有人类tPA的液体与特异性结合相应内源性CHO-PA的抗体接触，并回收人类tPA。优选所述接触步骤包括使所述液体流经挂有固相化抗体的层析柱。
重组DNA衍生的蛋白药物的开发由于引入了能用于鉴定蛋白和/或证实蛋白生产的一致性的新型分析方法而得到促进。肽作图是监控氨基酸序列的关键方法，它能检测小分子至中等大小分子的蛋白如胰岛素和人类生长激素的小的改变。对较大分子的蛋白，如纤维蛋白原(分子量350,000)或异源糖蛋白，如抗体(分子量150,000)的分析由于酶消化产生的肽的复杂性而受阻。这种复杂性使得简单的反相高效液相层析(RP-HPLC)分离术与在线紫外检测的联合应用范围受限。
目前市面上出现了与传统HPLC相容的HPLC加电喷射离子化质谱分析(electrospray ionization mass spectrometry)联合系统(LC-ES-MS)，这种商品化系统使得肽作图能力大大增强(Ling et al.，Anal.Chem.，63：2909-2915(1991)；Guzetta et al.，Anal.Chem.，65：2953-2962(1993))。LC-EM-MS与in-source碰撞诱导型解离(CID)联合可有效用于鉴别N-连接和O-连接的糖基化位点(Carr et al.，Protein Sci.，2：183-196(1993)；Huddleston et al.，Anal.Chem.，65：877-884(1993)；Conboy和Henion，J.Am.Soc.Mass Spectrom.，3：804-814(1992))。但即使该技术也因不能使中等大小的糖蛋白经不同蛋白糖基化作用和酶消化后产生的大量非常相似的肽段很好地区分开来而使用受限。因此需要利用具有交叉(orthogonal)选择性的一系列技术来鉴定这类样品。
高效毛细电泳、HPLC、LC-ES-MS和矩阵-辅助型激光解吸附作用解离-时间的光谱分析(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flightmass spectrometry)，已有人尝试将它们联合应用以便鉴定非衍生化糖蛋白样品的酶解产物，如DSPAαl，这是一种衍生自吸血蝙蝠唾液腺的单链纤维蛋白溶酶原激活剂(Apffel et al.，J.Chromatography A，717：41-60(1995))。结果发现，这四种技术是检查糖蛋白的优选技术。但是，作者认识到，还需要作大量的工作来提高该方法的效力，此外，由于碳水化合物的广泛异质性，该方法中还需要高处理量的浓缩步骤。
因此，需要一种技术，它能在tPA纯化(如美国专利5,411,864，出处同上报道的类似技术)后对CHO-PA的相对量和绝对量进行监控。
                           发明概述
相应地，本文公开了一种反HPLC法，其用于分析三种溶血栓分子：CHO-tPA、具有天然序列的重组人tPA、和TNK-tPA。该方法不仅能将人tPA和/或TNK-tPA与CHO-PA区分开来，还能鉴定并定量每种分子的不同同工型。
具体地，本发明提供一种能监控纯化工艺从含有人tPA或其变体的样品中除去中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内源性纤维蛋白溶酶原激活剂(PA)的有效性的方法，该方法包括使所述样品与能特异性裂解人类野生型tPA中Arg275-Ile276键的蛋白酶一起保温，然后与含有有效量的能使人类野生型tPA中二硫键还原的变性和还原剂一起保温；对该样品实施反相高效液相层析步骤，分析层析步骤的洗脱图谱，以便得出其中出现的CHO细胞内源性PA的量。
                        附图简述
图1显示天然r-tPA、TNK-tPA和CHO-PA的反相HPLC分析。
图2显示经DTT/尿素处理的r-tPA、TNK-tPA和CHO-PA的反相HPLC分析。纤维蛋白溶酶原激活剂在层析前先用DTT/尿素处理。
图3显示纤维蛋白溶酶以及经DTT/尿素处理的r-tPA、TNK-tPA和CHO-PA的反相HPLC分析。在层析前，将纤维蛋白溶酶原激活剂用纤维蛋白溶酶处理，然后用DTT/尿素处理。
                    优选实施方案描述
定义
术语“组织纤维蛋白溶酶原激活剂”和“tPA”指具有溶纤维蛋白活性的人类外源(extrinsic)(组织型)纤维蛋白溶酶原激活剂，其结构中通常具有5个功能区(指(finger)区、生长因子区、可里格尔-1区、可里格尔-2区和蛋白酶区)，但也可能含有较少的功能区或可能有部分功能区有重复，只要它仍然具有溶血栓的活性，此外它还保留了在117、184和448位的N-连接糖基化位点。tPA至少由一个能使纤维蛋白溶酶原转化为纤维蛋白溶酶的蛋白酶区和一个据信至少部分负责与纤维蛋白结合的N-末端区组成，并至少保留了对应于野生型人tPA中117、184和448位的位置处的N-连接糖基化位点。这些糖基化位点的保留基于以下事实：重组型和黑素瘤衍生的野生型tPA中不同的位点占有性导致产生两种变体，分别命名为“I型tPA”和“II型tPA”。I型tPA包含第117、184和448位的N-连接糖基化位点。II型tPA包含第117和448位的N-连接糖基化位点。可以理解天然等位基因变体的存在，而且它们可能出现在不同个体中，正如每个个体中tPA氨基酸序列的一或多个氨基酸差异所证实的那样。
术语“野生型人类组织纤维蛋白溶酶原激活剂”、“野生型人类tPA”、“天然人类组织纤维蛋白溶酶原激活剂”、和“天然人类tPA”(其中“人类tPA”可能缩写为“htPA”)指天然序列的人类tPA，即由1988年8月23日公布的美国专利4,766,075中报道的cDNA序列来编码。TPA分子中氨基酸位点编号或位置按照美国专利4,766,075所述进行标记。
本文中，针对tPA各种功能区的参照指如上述定义的野生型人类tPA的功能区，以及人类tPA的相对于天然人类tPA序列或其它来源的(天然型或变异型)tPA(如蝙蝠组织纤维蛋白溶酶原激活剂，蝙蝠-PA)序列具有氨基酸改变的功能等价部分。因此，本文中“蛋白酶区”是指野生型人类tPA成熟形式中从第264位氨基酸延伸至第527位氨基酸(包含两个端点)的区，以及人类tPA的相对于天然人类tPA序列或其它来源的tPA(如蝙蝠-PA)序列具有氨基酸改变的功能等价部分。
本文中“tPA变体”是指相对于天然tPA有一或多个氨基酸改变或对现有氨基酸进行了修饰的分子。本文中优选的变体是TNK-tPA。在天然分子中改变或插入适当氨基酸(一或多个)，使得发生所需序列变异的那些修饰可通过本领域已知的任何方法实现，如定点诱变或将适当序列连接至编码相关蛋白的DNA中。
本文中“TNK-tPA”是指一种tPA分子，其中野生型tPA的Thr103已变为Asn(T103N)、野生型tPA的Asn117已变为Gln(N117Q)、野生型tPA的Lys-His-Arg-Arg 296-299已变为Ala-Ala-Ala Ala(KHRR296-299AAAA)。这类TNK可另见美国专利5,612,029。
术语“中国仓鼠卵巢细胞”或“CHO细胞”是指衍生自中国仓鼠卵巢的细胞或细胞系，例如见EP 117,159，1989年8月29日公开；美国专利4,766,075；4,853,330；5,185,259；Lubiniecki et al.，Advances in Animal CellBiology and Technology for Bioprocesses，Spier et al.，eds.(1989)，pp.442-451)，以及CHO衍生物如CHO/-DHFR(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))、CHO-K1 DUX B11(Simonsen和Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：2495-2499(1983)；Urlaub和Chasin，出处同上)、dp12.CHO细胞(EP 307,247，1989年3月15日公开)。优选的宿主细胞包括CHO-K1 DUX B11和dp12.CHO细胞。
用于大规模生产tPA的CHO细胞冻存于MCB/working cell bank(WCB)系统，如Wiebe et al.，在Large Scale Mammalian Cell CultureTechnology，Lubiniecki，ed.，(Marcel Dekker：New York，1990)，pp.147-160中所述。用编码人类tPA的DNA转染的DHFR+CHO-K1细胞已保藏在美国典型培养物保藏中心，Manassas，Virginia(ATCC)，保藏号CCL 61。另一种能产生tPA的CHO细胞系(CHO细胞系1-1515)已经保藏在ATCC，保藏号为CRL 9606。后一种细胞系据报道能使人类tPA水平接近50pg/细胞/天。
本文中“CHO纤维蛋白溶酶原激活剂”或“CHO-PA”是指由CHO细胞内源产生的纤维蛋白溶酶原激活剂。由CHO细胞表达的这种内源PA与人类野生型tPA的序列略有不同(约80％相同)。CHO-PA并非组织型PA。
本文中“蛋白酶”是指能特异性裂解人类野生型tPA的Arg275-Ile276键的酶。实例有纤维蛋白溶酶(或能转化为纤维蛋白溶酶的纤维蛋白溶酶原)、组织激肽释放酶、或Xa因子、以及能影响这种特异性有限蛋白水解作用的任何胰蛋白酶样蛋白酶。符合条件的蛋白酶另见Ichinosi et al.，FEBSLetters，175：412-418(1984)。本文中优选纤维蛋白溶酶/纤维蛋白溶酶原。
本文中“变性/还原剂”或“变性剂和还原剂”是指变性剂和还原剂的一种组合，它能使人类野生型tPA的二硫键还原。优选地，变性剂为胍或尿素，还原剂为二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇。
                    实施本发明的模式
重组生产后，从CHO培养物中收获tPA或tPA变体，其可以是分泌蛋白，或当直接表达而不含分泌信号时，可以从宿主细胞裂解物中回收。为了获得基本均一的蛋白制剂，必需从宿主蛋白中纯化tPA或其变体。首先，将培养物或裂解物离心或过滤以除去微粒状细胞残渣。
然后将人tPA或其变体从相应的杂质性内源蛋白如CHO-PA中纯化，纯化技术有，免疫亲和层析柱或离子交换层析柱上的分级分离，美国专利5,411,864；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅或阳离子交换树脂如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；或利用如Sephadex G-75进行的凝胶电泳。不干扰tPA活性的蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟(PMSF)可用于纯化期间抑制蛋白裂解性降解，也可包含抗生素以阻止外来污染物的生长。本领域技术人员将理解，适用于天然tPA的纯化方法可能需要进行改良，以便适应tPA或其变体在重组细胞培养中表达后性质的改变。
在一优选实施方案中，如果产生了分泌型tPA变体，则使上清流过用偶联了抗tPA山羊多克隆A6抗体的玻璃珠装填、并用PBS-预处理的层析柱，用缓冲液平衡该柱，然后洗脱所述tPA变体。
本发明还涉及对取自这类纯化系统的样品中天然CHO-PA水平的监控(包括定性和定量监控)，所述样品中含有产生于CHO细胞中的至少一种形式的人类tPA。该方法包括使样品与能特异性裂解Arg275-Ile276键的蛋白酶一起保温。然后将这种经蛋白酶处理的样品与变性和还原剂的混合物一起保温，所述变性和还原剂的相对量和绝对量可使得人类野生型tPA中的二硫键有效还原。由于变性和还原剂的处理导致酶活性的损失，因此先与蛋白酶一起保温。
保温后，对所述样品进行反相高效液相层析，分析层析的洗脱图谱，以便定量其中出现的CHO细胞内源性PA的量。优选地，所述蛋白酶为纤维蛋白溶酶原，它可转化为活性形式，即纤维蛋白溶酶；所述人类tPA是天然序列tPA，所述tPA变体是TNK-tPA。
与蛋白酶，然后与变性/还原剂连续保温的步骤通常在约30-40℃，更优选约36-38℃，最优选约37℃，进行约15分钟，更优选约20-40分钟。
此外，优选在保温前，将样品用消化缓冲液(优选pH约7-8)稀释，更优选pH 7.4-7.6的磷酸盐缓冲液，更优选还包含精氨酸。
所述样品能上样的任何适当的HPLC层析柱都可为本发明所用，包括制备型层析柱或分析型层析柱。层析柱通常在样品注射前平衡至少约15分钟。层析柱床体积、层析介质、流速、洗脱缓冲液、梯度类型、注射体积以及层析介质的颗粒大小取决于各种因素，包括需要检测的样品的大小，流动相组成和梯度的类别，需要区分的tPA的形式。
上样用的溶剂可以是任何溶剂，但优选基于乙腈的溶剂如水、乙腈和三氟乙酸(TFA)。优选地，层析柱为Zorbax C8，Vydac，或Baker C-18层析柱，其中装填的基质的颗粒直径约4-40μm，更优选约5-15μm，孔径大小约100-4000，更优选约150-350。此外，所述基质优选含有C4，C8，或C18烷基，最优选为C8硅基质。优选地，洗脱用含有乙腈的溶剂，如水、乙腈和TFA以在60-100分钟内的一定梯度，优选线性梯度进行，其中乙腈在溶剂中的相对量递增。在另一优选实施方案中，使用每分钟以约0.25％缓速递增的乙腈梯度。
如果这里所述纯度分析表明，所用技术成功除去了CHO-PA，可进行进一步的纯化步骤以便除去任何其它杂质。如果所述技术并未成功除去CHO-PA至可接受的水平，则可利用另一种纯化方案，并重复这里所述过程以便确定该方案的有效程度。
最终纯化后，可按照已知方法将tPA或其变体配制成可药用组合物，其中将tPA产物与可药用载体混合。这类制剂，以及剂量和应用在文献中有详细介绍。例如，可将tPA或其变体经胃肠道外给药至心血管病患者和突然发作的患者。
以下实施例旨在举例说明目前已知可实施本发明的一个实施方案，并非本发明仅限于这些实施例。本文引用的所有公开文献和专利文献均引入本文作为参考。
                   实施例1
材料
ACTIVASE(r-tPA)和TNK-tPA来自Genentech，Inc.(South San Francisco，CA)，为CHO细胞来源的纯化形式。ACTIVASEr-tPA也参见美国专利4,766,075和5,753,486；TNK-tPA见美国专利5,612,029。
针对CHO-PA的单克隆抗体#354按照美国专利5,411,864所述来制备。简言之，用富含大量从缺乏人类t-PA的宿主细胞中纯化的CHO纤维蛋白溶酶原激活剂的蛋白溶液对雌性Balb/c进行为期12周的免疫。共5次注射，每次约30μg。第一剂注射用完全弗氏佐剂乳化，皮下一或多处给药。1.5周后进行第二剂注射，该剂配以不完全弗氏佐剂，且一半为皮下给药，一半为腹膜内给药。剩余的三剂注射是在第3，6和12周用磷酸盐缓冲液(PBS)在同一个腹膜内位点给药。
第13周取免疫小鼠的脾脏，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系NP3X63-Ag8.653融合，方法见Fazekas et al.，J.Immunol.Methods，35：1(1980)and Lane，J.Immunol.Methods 81：223(1985)。将融合的细胞分配至10个96孔板中。利用在两项ELISA试验(酶联免疫吸附试验)中反应性的差异来筛选特异性抗体的产生。其中一项ELISA特异性检测针对CHO-PA的抗体，第二项试验检测与重组人类tPA交叉反应的抗体。
约5％的孔仅与CHO-PA反应，约3％的孔与CHO-PA和人类t-PA都有反应。
通过有限稀释对含CHO-PA-特异性抗体的孔中的杂交瘤细胞进行扩增和克隆(Oi和Herzenberg，″Immunoglobin-Producing Hybrid Cell Lines″，p.351-372，in Selected Methods in Cellular Immunology，Mishell和Shiigi，eds.(W.H.Freeman and Co.，1980))。通过杂交瘤细胞培养或通过将杂交瘤细胞注射至小鼠使之形成腹水瘤都可产生大量特异性单克隆抗体。MAb 354是其中一种抗体产物，将它固定在层析柱中，通过一次层析便可将CHO-PA水平减少约100倍以上，它还能稳定经受多种不同的固定化化学处理以及较强的洗涤条件。
MAb 354可用如下步骤纯化，所有这些步骤均在室温进行。通过使Mab杂交瘤悬浮培养的收获液(HF)滤过0.2μm滤膜而进行浓缩。培养液经超滤浓缩或在离子交换树脂上通过层析浓缩。
亲和纯化如下进行：在浓缩的MAb HF溶液中添加硫柳汞至约0.02％。向该溶液中添加3.0M甘氨酸，再添加NaCl结晶，从而将溶液调整为约1.5M甘氨酸，3.0M NaCl，pH 9.0。蛋白A结合抗体的能力很弱，因此添加NaCl和甘氨酸可以增加疏水相互作用，以便促进抗体结合。通过过滤使该溶液澄清。将澄清后的浓缩MAb HF上样至已固定了蛋白A的琼脂糖层析柱中。被结合的Mab用柱平衡液洗涤，该平衡液的近似组成是1.5M甘氨酸，3.0MNaCl，0.02M EDTA，pH 9.0。Mab用0.1M柠檬酸钠，0.15M NaCl，pH 3.0缓冲液洗脱。蛋白A层析柱通过用3.0M NaSCN，0.03M TRIS，pH 8.5洗涤而再生，然后再平衡。根据280nm处的吸光度值收获Mab洗脱峰。被柠檬酸盐洗脱的Mab峰通过收集在近似组成为：1.5M TRIS-HCl，pH 9.0的缓冲液中而迅速中和。使用完毕后，卸载蛋白A层析柱，于2-8℃密闭容器中保存，保存缓冲液为约0.02％的硫柳汞。
将354Mab通过渗滤而更换缓冲液。渗滤过程持续至导电性和pH类似于0.03M TRIS，0.05M NaCl，pH 8.5缓冲液。
然后将该Mab上样至含有DEAE-FAST FLOWTM琼脂糖的阴离子交换层析柱，用0.03M TRIS，0.05 M NaCl，pH 8.5缓冲液洗涤。用近似组成为0.03M TRIS，0.15M NaCl，pH 8.5的缓冲液逐步洗脱所述Mab。根据在280nm的吸光度值收获Mab洗脱峰。
将所述Mab过滤(0.2μm)至干净的密闭容器内，-40℃以下保存。
纤维蛋白溶酶原来自Fluka(Switzerland)。HPLC-级乙腈来自Burdick&Jackson(Muskgon，MI)，三氟乙酸(TFA)来自Pierce(Rockford，IL)。用于HPLC流动相和样品溶液的水用Millipore的MILLI-QTM系统(Milford，MA)纯化。所有其它化学试剂都是来自Sigma(St.Louis，MO)的试剂级产品。
方法
CHO-PA的纯化
CHO-PA从CHO细胞培养液经亲和层析分离，然后进行免疫吸附。用BioSepra(Paris，France)的Lysine hyper D树脂进行亲和层析，因为赖氨酸与纤维蛋白溶酶原激活剂的可里格尔2区结合(Cleary et al.，Biochem.28，1884-1890(1989))。免疫吸附用CHO-PA特异性单克隆抗体#354(MAb#354)进行。将MAb#354与CNBr-活化的SEPHAROSE 4BTM凝胶按照厂商建议而偶联(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。约10mg MAb#354与1ml CNBr-活化的Sepharose 4B凝胶偶联。偶联后，装填MAb#354-SEPHAROSE 4BTM层析柱。
将含有分泌型CHO-PA的CHO细胞培养液上样至已用含有50mM磷酸钠和0.01％POLYSORBATE 80TM去污剂pH 7.5的缓冲液预平衡的赖氨酸亲和层析柱。上样后，将该赖氨酸亲和柱洗三次：第一次用平衡缓冲液洗，然后用含有40mM TRIS，800mM NaCl和0.008％POLYSORBATE 80TM的缓冲液pH 8.0洗，最后用平衡缓冲液洗柱。接着用含有50mM磷酸钠，200mM L-精氨酸和0.01％POLYSORBATE 80TM的缓冲液pH 7.5将CHO-PA从赖氨酸亲和柱上洗脱。MAb#354-SEPHAROSE 4B层析柱用磷酸盐缓冲液(PBS，8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4和0.24g/L KH2PO4，pH7.4)平衡后，将上述赖氨酸亲和柱洗脱液集中并上样。用含有9.5mMNa2HPO4，1M NaCl和5％丙二醇(v/v)的缓冲液pH 7.4洗柱。所结合的CHO-PA用0.2M甘氨酸-HCl pH 2.5从柱上洗脱。洗脱过程利用分光光度计在280 nm处监控，含有CHO-PA的级分用0.14倍体积的1.5M精氨酸-磷酸(pH 8.0)在收获后迅速中和。所洗脱的CHO-PA的同一性和纯度通过SDS-PAGE和氨基酸序列分析证实。
DTT/尿素处理
将含有纤维蛋白溶酶原激活剂的溶液用变性缓冲液(8M尿素，0.5MTRIS，和3.2mM EDTA，pH 8.4)进行1∶1(v/v)稀释。添加二硫苏糖醇(DTT)，使之从1M原液变为终浓度20mM，将该混合物37℃保温30分钟。
纤维蛋白溶酶处理
将含有纤维蛋白溶酶原激活剂的溶液用消化缓冲液(125mM Na2HPO4，200 mM精氨酸和0.01％NaN3，pH 7.5)进行1∶3(v/v)稀释。添加1％(w/w)的纤维蛋白溶酶原，将该混合物37℃保温30分钟。
纤维蛋白溶酶原激活剂的反相HPLC分析
该项试验在树脂颗粒大小为5μm，孔径为300的4.6mm×250mmZorbax SB-C8层析柱(Mac-Mod，Chadds Ford，PA)上，用Hewlett-Packard1090MTMHPLC系统(Hewlett Packard，Avondale，PA)进行。层析柱在注射样品之前预平衡至少15分钟。起始流动相组成为70/30/0.1(v/v/v)的水/乙腈/TFA。最初的5分钟洗柱后，在80分钟内(图1和2)和60分钟内(图3)经线性梯度变化为50/50/0.1(v/v/v)的水/乙腈/TFA。紧接该梯度之后，将层析柱用100/0.1(v/v)的乙腈/TFA处理10分钟，使之再生。然后将组成调整到起始条件下保持5分钟，将该系统再次平衡后，准备下一次注射。注射体积为250mL，流速为1mL/min。层析在40℃进行。用Hewlett-Packard 1046ATM可编程型荧光检测仪(Ex＝275nm和Em＝340nm)检测荧光。记录层析图谱，用Hewlett-Packard CHEMSTATIONTM软件进行分析。
结果和讨论
由于较高的序列同源性，ACTIVAS(r-tPA)、TNK-tPA和CHO-PA具有非常相似的生物化学/生物物理学特性。能区分这三种纤维蛋白溶酶原激活剂，或能将tPA与CHO-PA区分开来，或将TNK-tPA与CHO-PA区分开来的分析方法和制备方法是开发回收工艺和评估用于临床研究和商品化生产的每种分子的纯度所必需的。本文描述了能实现这些目的的一种简单的反相HPLC方法。
当乙腈以每分钟0.25％的微弱趋势变化且没有蛋白酶或变性/还原剂存在时，反相HPLC不能将r-tPA的天然形式与天然CHO-PA区分开来(图1)。但是，天然形式的TNK-tPA在这些条件下可以很好地与天然r-tPA和CHO-PA区分。此外，DTT/尿素处理被用于还原二硫键并使蛋白变性。对所有三种蛋白而言，位于Arg275和Ile276之间的键对蛋白酶裂解很敏感。随时间的延长，这种易感性导致溶液中r-tPA、TNK-tPA和CHO-PA的异质性。由于蛋白酶裂解，少量单链形式转变为双链。DTT/尿素处理使Cys264和Cys395之间能维持分子的双链形式的二硫键被还原，导致该分子解离为两个片段(可里格尔片段和蛋白酶片段)。
图2显示，在相同的梯度变化条件下，DTT/处理后的反相HPLC能将这三种溶血栓分子的单链形式相互区分开来。所有三种蛋白表现出相似的洗脱图谱，其中双链形式中的可里格尔片段首先被洗脱，接着是单链形式，最后被洗脱的是双链中的蛋白酶片段。三种纤维蛋白溶酶原激活剂各自的蛋白酶片段相互间也能很好地区分，但这三种分子的可里格尔片段不能很好地分离。结果是，当单链形式的纤维蛋白溶酶原激活剂经片段化而成为双链形式时，该方法可用于对其进行检测和定量。
r-tPA、TNK-tPA和CHO-PA图谱(图2)的异质性使得对这些分子的定量非常困难，尤其当试图定量rtPA、TNK-tPA和CHO-PA混合物中的每种分子时。为了使与蛋白水解作用有关的异质性减至最小，可通过与纤维蛋白溶酶原保温而将所有单链形式转变为双链形式。纤维蛋白溶酶原是天然纤维蛋白溶解系统中纤维蛋白溶酶原激活剂的底物。r-tPA、TNK-tPA和CHO-PA都具有裂解纤维蛋白溶酶原中Arg560-Val561肽键的酶活性。这种裂解将纤维蛋白溶酶原转化为其活性形式，即纤维蛋白溶酶。纤维蛋白溶酶是一种低特异性丝氨酸蛋白酶，能裂解r-tPA、TNK-tPA和CHO-PA中的Arg275-Ile276肽键。结果是，与纤维蛋白溶酶原一起保温可使三种纤维蛋白溶酶原激活剂由单链形式转变为双链形式。
经过纤维蛋白溶酶的处理后，将样品用DTT/尿素处理以便还原二硫键，并因此使所述分子的双链形式解离为两个单独的片段。图3显示了经纤维蛋白溶酶处理和DTT/尿素处理的纤维蛋白溶酶原激活剂的反相HPLC图谱。这三种蛋白各自的蛋白酶片段被很好地分离，而这三种分子的可里格尔片段没能很好地区分。因此，可用蛋白酶片段整合并鉴定每种纤维蛋白溶酶原激活剂。对r-tPA和TNK-tPA而言，来自I型和II型同工酶的可里格尔片段能很好地分离。因此，该方法还可以用于鉴定r-tPA和TNK-tPA中I型与II型的比例。
本发明提供的这种反相HPLC方法极大地促进了生产工艺的发展。它可用于评估不同发酵条件对产物质量在产物完整性(即单链百分率)以及I型与II型同工酶之比例方面的影响。它还有助于纯化工艺的开发以及用于确保不同批次的生产之间的一致性。所有这些应用举例说明了分析方法和商业方法在新药开发中的关键作用。

Claims (11)

1.一种监控纯化工艺从含有人tPA或其变体的样品中除去中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内源性纤维蛋白溶酶原激活剂(PA)的有效性的方法，该方法包括使所述样品与能特异性裂解人类野生型tPA中Arg275-Ile276键的蛋白酶一起保温，然后与含有有效量的能使人类野生型tPA中二硫键还原的变性剂和还原剂一起保温；对该样品实施反相高效液相层析步骤，分析层析步骤的洗脱图谱，以便得出其中出现的CHO细胞内源性PA的量。
2.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶是纤维蛋白溶酶原。
3.权利要求1的方法，其中所述人类tPA是天然序列tPA。
4.权利要求1的方法，其中所述tPA变体是TNK-tPA。
5.权利要求1的方法，其中在所述保温前，将样品用消化缓冲液稀释。
6.权利要求5的方法，其中所述缓冲液的pH为约7-8。
7.权利要求6的方法，其中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
8.权利要求7的方法，其中所述缓冲液还包含精氨酸。
9.权利要求1的方法，其中所述变性剂包括尿素或胍。
10.权利要求1的方法，其中所述还原剂包括二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。
11.权利要求1的方法，其中所述层析步骤通过用含有乙腈的溶剂以一定的乙腈梯度进行洗脱来实施。
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