MXPA02004401A - Ensayo de cromatografia liquida de alta resolucion de fase inversa para activadores de plasminogeno. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe un proceso para verificar la efectividad de un proceso de purificacion en la remocion del activador de plasminogeno (PA) endogeno con respecto a las celulas del ovario del hamster Chino (CHO) de una muestra que contiene tPA humano o variantes del mismo. Este proceso comprende incubar la muestra con una proteasa capaz de segmentar especificamente el enlace de Arg275 ° Ile276 del tPA del tipo silvestre humano y luego con agentes desnaturalizantes/reductores en cantidades respectivas efectivas para reducir los enlaces de disulfuro del tPA del tipo silvestre humano; someter la muestra a un paso de cromatografia liquida de alta resolucion de fase inversa; y analizar el perfil de elucion del paso de cromatografia para verificar la cantidad del PA endogeno con respecto a las celulas de CHO presentes alli.

Description

ENSAYO DE CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN DE FASE INVERSA PARA ACTIVADORES DE PLASMINOGENO Antecedentes de la Invención Esta invención está dirigida a un ensayo para determinar la cantidad de tPA producido por el Ovario del Hámster Chino (CHO) que está presente en las muestras del tPA humano recombinante con la secuencia natural o sus variantes producidas en células de CHO.

Descripción de la Técnica Previa Los activadores del plasminógeno del tipo de tejido (tPA) son serina proteasas endógenas involucradas en una cascada de eventos que conducen a la disolución de un coágulo de sangre (Astrup y Permin, Nature, 159, 681-682 (1947); Camiolo et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 138, 277-280 (1971); Collen, J. Biol. Chem., 33, 77-86 (1987),.; Hoylaerts et al., J. Biol. Chem., 257, 2912-2919 (1982)). ACTIVASE® es la forma recombinante del tPA humano (r-tPA) , utilizada en el manejo del infarto al miocardio agudo y el embolismo pulmonar (Grossbard, Pharm. Res., 4 , 375-378 (1987)). La ACTIVASE® también fue aprobada ahora para tratar los ataques isquémicos (Smith et al., Acad. Emergency Medicine, j5(6), 618-25 (1999); Kwiatkowski et al., New Eng. J. Med., 340 (23) , 1781-1787 REF 137832 (1999) . La misma es una glicoproteina producida expresando el ADN complementario (ADNc) para el tPA humano natural en las células del ovario del hámster Chino. El TNK-tPA es una variante diseñada genéticamente del tPA humano clonado y expresado en las células de CHO (Keyt et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA., 91, 3670-3674 (1994) ) . Las mutaciones dirigidas al sitio fueron introducidas en tres sitios específicos del tPA humano para crear la variante de TNK-tPA. Las mismas son Thrl03 hasta Asn (T103N) , Asn 117 hasta Gln (N117Q) , y Lys-His-Arg-Arg 296-299 hasta Ala-Ala-Ala-Ala (KHRR296-299AAAA) . Cuando se compara con el tPA, el TNK-tPA exhibe una actividad biológica in vitro similar, una resistencia incrementada al inhibidor del activador del plasminógeno y una especificidad de la fibrina mejorada, y es despejada o eliminada más lentamente del plasma (Keyt et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA., 91, 3670-3674 (1994); Thomas et al., Stroke, 25:10, 2072-2079 (1994); Benedict et al., Circulation, 92_:10, 3032-3040 (1995); Modi et al., Thromb Haemost, 79, 134-139 (1998) ) . Actualmente se está esperando la aprobación reguladora como una forma de r-tPA administrada en un bolo único. Las células de CHO biosintetizan el tPA del hámster endógeno llamado CHO-PA. El CHO-PA tiene una actividad fibrinolitica similar al tPA humano como se determinó por el ensayo de la lisis del coágulo. La secuencia de aminoácidos de CHO-PA es 80% idéntica con aquella del tPA humano. Muchas de las substituciones son semiconservadoras tales como: Arg<—>Lys, Glu<—>Asp, Phe<—>Tyr, Val<—>Ala, Ile<—>Leu o Thr<—>Ser. Utilizando un modelo del dominio de proteasa de tPA humano basado en la estructura de quimiotripsina de bovino, se observó que virtualmente la totalidad de las substituciones en CHO-PA están localizadas en o cerca de la superficie de la proteina. El r-tPA, TNK-tPA, y CHO-PA son todos cadenas de polipéptido único compuestas de 527 aminoácidos con 17 enlaces de disulfuro (Nguyen y Carole, "Stability Characterization and Formulation Development of Altepase, a Recombinant Tissue Plasminogen Activator", en Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case Histories, Y. J. ang, R. Pearlman, eds., (Plenum Press: New York, 1993), pp. 91-135. Para todas las tres proteínas, el enlace del péptido entre Arg275 e Ile276 es particularmente susceptible a la segmentación de la proteasa. La segmentación conduce a dos fragmentos: uno que consiste de los 275 aminoácidos N-terminales y los otros que consisten de los 252 aminoácidos C-terminales. La cadena N-terminal contiene regiones las cuales son homologas con respecto a las regiones "kringle" encontradas en el plasminógeno y protrombina y, por lo tanto, frecuentemente es referida como el "fragmento de "kringle"" (Nguyen y Carole, supra; de Vos et al., Biochem. , 31, 270-279 (1992) ) . La cadena C-terminal contiene el sitio catalíticamente activo y, por lo tanto, es referido comúnmente como el "fragmento de proteasa" (Pennica et al., Nature, 301, 214-221 (1983)). Las dos cadenas segmentadas están enlazadas por un enlace de disulfuro único formado entre Cys264 y Cys395. La molécula segmentada es referida comúnmente como "tPA de dos cadenas" como lo opuesto a "tPA de una sola cadena" o la forma intacta. El r-tPA contiene cuatro sitios potenciales para la glicosilación N-enlazada identificada por la secuencia Asn-X-Ser/Thr (Nguyen y Carole, supra) . Estos son Asn?17, Asn184, Asn2?s, y Asn4 8. El r-tPA existe como dos isozimas de glicosilación designadas como el tipo I y el tipo II. El r-tPA del tipo I está glicosilado en Asnn?, Asn18, y Asn448; mientras que el r-tPA del tipo II está glicosilado solamente en Asn?i7 y Asn448. El Asn2?8 no está glicosilado en ninguna de las isoformas. El TNK-tPA tiene la misma configuración de glicosilación que el r-tPA, excepto que las mutaciones Thrl03 para Asn y Asnll7 para Gln movieron efectivamente el sitio de glicosilación desde la posición 117 hasta 103 (Keyt et al., supra) . La configuración de glicosilación para CHO-PA no está caracterizada completamente (Rijken y Collen, J. Biol. Chem., 256: 7035-7041 (1981) . ACTIVASE® es una marca registrada para la forma recombinante del activador del plasminógeno del tipo de tejido humano (r-tPA) , utilizada en el manejo del infarto al miocardio agudo y embolismo pulmonar. El tPA marca ACTIVASE® también está aprobado ahora para el tratamiento de ataques isquémicos. El mismo es producido expresando el ADN complementario (ADNc) para el tPA humano natural en las células del ovario del hámster Chino (Pat. U.S. No. 5,753,486). El TNK-tPA es una variante diseñada genéticamente del r-tPA con eficacia mejorada e incidencia inferior de hemorragia comparado con el r-tPA ACTIVASE®. El mismo fue creado por tres mutaciones dirigidas al sitio (T103N, N117Q y KHRR296-299AAAA) , y también es clonado y expresado en las células CHO (Pat. U.S. No. 5,612,029). Las células CHO biosintetizan el tPA de hámster endógeno llamado CHO-PA. La secuencia de aminoácidos de CHO-PA es altamente homologa (80% idéntica) a aquella del r-tPA. Todas las tres proteínas tromboliticas existen como isoformas heterogéneas, principalmente debido a la proteólisis/hidrólisis y glicosilación diferencial. Un método para purificar el tPA humano del CHO-PA es descrito en la Pat. U.S. No. 5,411,864. Este método comprende poner en contacto un fluido que contiene el tPA humano con anticuerpos que se unen específicamente al CHO-PA endógeno correspondiente y recuperan el tPA humano . Preferentemente, el paso de contacto involucra hacer pasar el fluido a través de un lecho cromatográfico que tiene los anticuerpos inmovilizados sobre el mismo. El desarrollo de substancias farmacéuticas de proteina derivadas del ADN recombinante ha sido facilitado por la introducción de nuevos métodos analíticos que pueden ser utilizados para caracterizar la proteina y/o para demostrar la consistencia de fabricación de una proteina. El mapeo o asignación de coordenadas de un péptido es un método clave para verificar la secuencia de aminoácidos y es capaz de detectar cambios pequeños en proteínas de tamaño pequeño a moderado, por ejemplo, la insulina y la hormona del crecimiento humana. El análisis de una proteina mucho más grande, por ejemplo, el fibrinógeno (masa molecular de 350, 000) , o las glicoproteinas heterogéneas, tales como los anticuerpos (masa molecular de 150,000), es impedido por la complejidad de la gama de péptidos generados por una solubilización enzimática. Tal complejidad hace a la separación única por cromatografía liquida de alta resolución de fase inversa (CLAR-FI) combinada con la detección ultravioleta en la linea, de utilidad limitada.

La llegada de sistemas de espectrometría de masa de ionización por electrorrociado (EM-ES-CL) y CLAR combinados, disponibles comercialmente, compatibles con CLAR convencional, ha incrementado la potencia del mapeo o asignación de coordenadas del péptido (Ling et al., Anal. Chem., 63: 2909-2915 (1991); Guzetta et al., Anal., 65: 2953-2962 (1993) ) . La EM-ES-CL en combinación con la disociación inducida por colisiones en la fuente (DIC) ha sido utilizada efectivamente para identificar sitios de glicosilación N- y O-enlazados (Carr et al., Protein Sci., 2: 183-196 (1993); Huddleston et al., Anal. Chem., 65: 877-884 (1993); Conboy y Henion, J. Am. Soc. Mass Spectro ., _3: 804-814 (1992)). Sin embargo, aún esta técnica está limitada por una resolución insuficiente que resulta del gran número de péptidos muy similares provocada por la glicosilación de proteínas variables y las solubilizaciones enzimáticas de las glicoproteinas de tamaño moderado. Por lo tanto es necesario emplear una gama de técnicas con selectividad ortogonal para caracterizar tales muestras. El uso de las combinaciones de electrofóresis capilar de alto rendimiento, CLAR, EM-ES-CL, y el tiempo de ionización por desorción con rayo láser auxiliada por una matriz de la espectrometría de masa en serie, ha sido investigado para permitir la caracterización de las solubilizaciones enzimáticas de las muestras de glicoproteina no derivadas, como se ejemplificó por DSPAal, un activador • del plasminógeno de una sola cadena derivado de las glándulas salivales del murciélago vampiro (Appfel et al., J^ Chromatography A, 717 : 41-60 (1995) ) . Se concluyó que estas cuatro técnicas son técnicas altamente complementarias para examinar glicoproteinas. No obstante, los autores reconocen que se debe realizar más trabajo para mejorar el poder o capacidad de este método, y que los pasos de concentración de alto rendimiento serán requeridos debido a la heterogeneidad extensa de los carbohidratos. Existe una necesidad de una técnica para verificar las cantidades relativas y absolutas del CHO-PA presente después de que un procedimiento de purificación para tPA es llevado a cabo, tal como uno reportado en la Patente U.S. no. 5,411,864, supra.

Breve Descripción de la Invención En consecuencia, un método de CLAR de fase inversa fue desarrollado aqui para el análisis de las tres moléculas tro boliticas, CHO-tPA, tPA humano recombinante con la secuencia natural, y TNK-tPA. Este método no solamente tiene la capacidad para resolver el tPA humano y/o el TNK-tPA del CHO-PA, sino también es capaz de identificar y cuantificar diferentes isoformas de cada molécula. Específicamente, la presente invención proporciona un proceso para verificar la efectividad de un proceso de purificación en la remoción del activador de plasminógeno (PA) endógeno con respecto a las células del ovario del hámster Chino (CHO) de una muestra que contiene tPA humano o variantes del mismo, tal proceso comprende incubar la muestra con una proteasa capaz de segmentar específicamente el enlace de Arg275 - Ile276 del tPA del tipo silvestre humano y luego con agentes desnaturalizantes y reductores en cantidades efectivas para reducir los enlaces de disulfuro del tPA del tipo silvestre humano; someter la muestra a un paso de cromatografía liquida de alta resolución de fase inversa, y analizar el perfil de elución desde el paso de cromatografía para verificar la cantidad del PA endógeno con respecto a las células de CHO presentes en el mismo.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra un análisis de CLAR de fase inversa del r-tPA natural, TNK-tPA y CHO-PA. La Figura 2 muestra un análisis de CLAR de fase inversa del r-tPA tratado con DTT/urea, TNK-tPA y CHO-PA. Los activadores de plasminógeno fueron tratados con DTT/urea previo a la cromatografía. La Figura 3 muestra un análisis de CLAR de fase inversa de la plasmina y del r-tPA tratado con DTT/urea, TNK-tPA y CHO-PA. Los activadores de plasminógeno fueron sometidos a tratamiento con plasmina seguido por tratamiento con DTT/urea previo a la cromatografía.

Descripción de las Modalidades Preferidas Definiciones Los términos "activador de plasminógeno del tejido", y "tPA" se refieren al activador del plasminógeno extrínseco (del tipo de tejido) humano que tiene actividad fibrinolitica que típicamente tiene una estructura con cinco dominios (dominios del dedo, del factor de crecimiento, "kringle"-l, "kringle"-2, y proteasa) , pero que puede tener sin embargo un número más pequeño de dominios o puede tener algunos de sus dominios repetidos si todavía funciona como un agente trombolitico y retiene los sitios de glicosilación N-enlazados en las posiciones 117, 184, y 448. Como minimo, el tPA consiste de un dominio de proteasa que es capaz de convertir el plasminógeno a plasmina, y una región N-terminal que se cree que va a ser al menos parcialmente responsable de la aglutinación de la fibrina, y retiene los sitios de glicosilación N-enlazados en las posiciones que corresponden a las posiciones de aminoácidos 117, 184, y 448 del tPA humano del tipo silvestre. La retención de estos sitios de glicosilación se debe al hecho de que la ocupación del sitio variable del tPA del tipo silvestre recombinante y derivado del melanoma conduce a la producción de dos variantes, designadas como "tPA del Tipo I" y "tPA del Tipo II", respectivamente. El tPA del Tipo I contiene oligosacáridos N-enlazados en las posiciones 117, 184, y 448. El tPA del Tipo II contuvo oligosacáridos N-enlazados en las posiciones 117 y 448. Se entenderá que las variaciones alélicas naturales existen y pueden estar presentes entre los individuos, como se demostró por una o más diferencias de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de tPA de cada individuo. Los términos "activador del plasminógeno del tejido humano del tipo silvestre", "tPA humano del tipo silvestre", "activador del plasminógeno del tejido humano natural", y "tPA humano natural", en donde "tPA humano" puede ser abreviado como "htPA", se refieren al tPA humano de la secuencia natural, es decir, que está codificado por la secuencia de ADNc reportada en la Pat. U.S. No. 4,766,075, expedida el 23 de Agosto de 1988. Los números o posiciones del sitio de aminoácido en la molécula de tPA están etiquetados de acuerdo con la Pat. U.S. No. 4,766,075.

Cuando se utilicen aqui, las referencias a varios dominios del tPA significan los dominios del tPA humano del tipo silvestre como se definieron aqui anteriormente, y las porciones equivalentes funcionalmente del tPA humano que tienen alteraciones de aminoácidos cuando se compara con la secuencia de TPA humana natural, o del tPA (natural o variante) de otras fuentes, tales como el activador del plasminógeno del tejido del murciélago (bat-PA) . Por consiguiente, cuando se utilice aqui, el término dominio de la proteasa" se refiere a la región que se extiende desde la posición 264 del aminoácido hasta la posición 527 del aminoácido, inclusive, de la forma madura del tPA humano del tipo silvestre, y a las porciones equivalentes funcionalmente del tPA humano que tienen alteraciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia de tPA humano natural, o del tPA de otras fuentes, tal como bat-PA. Cuando se utilice aqui, ^variantes de tPA" se refieren a las moléculas que difieren del tPA natural en uno o más cambios o modificaciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos existentes. El TNK-tPA es la variante preferida aqui. La modificación para cambiar o insertar el (los) aminoácido (s) apropiado (s) en la molécula natural para efectuar las variaciones deseadas de la secuencia, es efectuada por cualquier medio conocido en el arte, tal como por ejemplo la mutagénesis dirigida al sitio o ligamiento de la secuencia apropiada en el ADN que codifica la proteina relevante. Cuando se utilice aqui, "TNK-tPA" se refiere a una molécula de tPA en donde Thrl03 del tPA del tipo silvestre es cambiado a Asn (T103N) , Asnll7 del tPA del tipo silvestre es cambiado a Gln (N117Q) , y Lys-His-Arg-Arg 296-299 del tPA del tipo silvestre es cambiado a Ala-Ala-Ala-Ala (KHRR296-299AAAA) . Tal TNK es descrito adicionalmente en la Pat. U.S. No. 5,612,029. El término "célula del ovario del hámster Chino" o "célula de CHO" se refiere a las células o lineas celulares derivadas de los ovarios del hámster Chino, como se describe, por ejemplo, en EP 117,159, publicada el 29 de agosto de 1989; Pat. U.S. Nos. 4,766,075; 4,853,330; 5,185,259; Lubiniecki et al., en Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, Spier et al, eds. (1989), pp. 442-451), asi como los derivados de CHO tales como CHO/-DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)), CHO-K1 DUX Bll (Simonsen y Levinson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 2495-2499 (1983); Urlaub y Chasin, supra), y las células dpl2.CHO (EP 307,247 publicada el 15 de marzo de 1989) . Las células huésped preferidas incluyen las células CHO-K1 DUX Bll y dpl2.CHO.

Las células de CHO desarrolladas para la producción a gran escala de tPA son mantenidas criogénicamente en un sistema de banco de células de trabajo/MCB (WCB) como se describió por iebe et al., en Large Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, ed., (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 147-160. Las células de DHFR+ CHO-K1 transfectadas con el tPA humano que codifica el ADN han sido depositadas en el American Type Culture Collection, Manassas, Virginia (ATCC) , y están disponibles bajo el número de acceso CCL 61. Una muestra de otra linea celular de CHO que produce tPA (linea celular l-15?5 de CHO) ha sido depositada bajo el número de acceso CRL 9606 del ATCC. Esta última linea celular se reportó que conduce a niveles de tPA humanos que se aproximan a 50 pg/célula/dia. Cuando se utilice aqui, "activador de plasminógeno de CHO" o "CHO-PA" se refiere al activador de plasminógeno que es producido endógenamente por las células de CHO. Este PA endógeno expresado por las células de CHO tiene una secuencia ligeramente diferente (aproximadamente 80% idéntica) del tPA del tipo silvestre humano. El CHO-PA no es un PA del tipo del tejido. Cuando se utilice aqui, "proteasa" se refiere a una enzima que es capaz de segmentar el enlace de Arg75 - Ile276 del tPA del tipo silvestre humano específicamente. Los ejemplos incluyen la plasmina (o el plasminógeno, el cual se convierte a plasmina), la calicreina del tejido, o el Factor Xa, asi como cualesquiera proteasas semejantes a la tripsina que pueden efectuar esta proteólisis limitada, especifica. Las proteasas eligibles son descritas adicionalmente en Ichinosi et al., FEBS Letters, 175: 412-418 (1984). Se prefiere aqui una plasmina/plasminógeno. Cuando se utilice aqui, "agentes desnaturalizantes/reductores" o "agente desnaturalizante y agente reductor" se refiere a una combinación de desnaturalizante y reductor que reduce los enlaces de disulfuro del tPA del tipo silvestre humano. Preferentemente, el agente desnaturalizante es la guanidina o la urea y el agente reductor es ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol .

Modalidades para Llevar a Cabo la Invención Después de la producción recombinante, el tPA o la variante de tPA es recuperada del medio de cultivo de CHO, ya sea como una proteina secretada o de los Usados de la célula huésped cuando es expresada directamente sin una señal secretoria. Es necesario purificar el tPA y la variante de la misma a partir de las proteínas de la célula huésped para obtener preparaciones que son substancialmente homogéneas con respecto a la proteina. Como un primer paso, el medio de cultivo o lisado es centrifugado o filtrado para remover los desechos celulares particulados. El tPA humano o la variante del mismo es purificada entonces de las proteínas endógenas contaminantes correspondientes tales como CHO-PA por técnicas tales como fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico como se describe, por ejemplo, en la Pat. U.S. No. 5,411,864; precipitación con etanol; CLAR de fase inversa; cromatografía sobre gel de silice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; o electrofóresis en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75. Un inhibidor de la proteasa que no interfiere con la actividad de tPA tal como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolitica durante la purificación, y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes extraños . Una persona experta en el arte apreciará que los métodos de purificación adecuados para el tPA natural pueden requerir una modificación para tomar en cuenta los cambios en el carácter del tPA o sus variantes durante la expresión en el cultivo celular recombinante . En una modalidad preferida, si una variante de tPA está siendo producida, la misma es secretada y el sobrenadante se hace pasar sobre una columna preacondicionada con PBS de perlas de vidrio unidas a un anticuerpo policlonal A6 de cabra anti-tPA, la columna es equilibrada con un amortiguador, y la variante de tPA es eluida entonces. La invención está dirigida aqui a verificar (incluyendo la calificación y cuantificación) los niveles del CHO-PA natural en una muestra tomada de tales sistemas de purificación que contienen al menos una forma del tPA humano que es producido en las células de CHO. El proceso comprende incubar la muestra con una proteasa que es capaz de segmentar el enlace Arg27S - Ile276 específicamente. Esto es seguido por la incubación de la muestra tratada con proteasa con una combinación de un agente desnaturalizante y reductor en cantidades relativas y absolutas apropiadas para efectuar la reducción de los enlaces de disulfuro en el tPA del tipo silvestre humano. Puesto que el tratamiento con agentes desnaturalizantes y reductores provoca la pérdida de la actividad de la enzima, la incubación con la proteasa ocurre primero. Después de la incubación, la muestra es sometida a un paso de cromatografía liquida de alta resolución de fase inversa, y el perfil de elución del paso de cromatografía analizado para verificar la cantidad del PA endógeno con respecto a las células de CHO presentes alli.

Preferentemente, la proteasa es el plasminógeno, el cual se convierte la forma activa, la plasmina, el tPA humano es el tPA de la secuencia natural, y la variante de tPA es TNK-tPA. El paso de incubación consecutivo con la proteasa seguido por los agentes desnaturalizantes/reductores se lleva a cabo típicamente a una temperatura de aproximadamente 30-40 °C, más preferentemente de aproximadamente 36-38 °C, y aún m s preferentemente de aproximadamente 37 °C, durante un minimo de aproximadamente 15 minutos, más preferentemente de aproximadamente 20-40 minutos. También, preferentemente antes de la incubación, la muestra es diluida con un amortiguador -de solubilización, el cual tiene preferentemente un pH de aproximadamente 7 a 8, más preferentemente un amortiguador de fosfato a un pH de 7.4-7.6, y más preferentemente también contiene arginina. Cualquier columna de CLAR adecuada sobre la cual la muestra es cargada puede ser utilizada para los propósitos de esta invención, incluyendo la escala preparativa o analítica. La columna es equilibrada típicamente durante al menos aproximadamente 15 minutos previo a la inyección de la muestra. El tamaño de la columna, el material de la columna, la velocidad de flujo, los amortiguadores de elución, el tipo de gradiente, el volumen de inyección, y el tamaño de particula de la columna depende de varios factores, incluyendo el tamaño de la muestra que es examinada, el tipo de la composición de la fase móvil y el gradiente, y las formas del tPA que son distinguidas. El solvente de carga puede ser cualquier solvente pero preferentemente es un solvente a base de acetonitrilo tal como el agua, acetonitrilo, y ácido trifluoroacético (TFA) . Preferentemente, la columna es una columna Zorbax C8, Vydac, o Baker C-18 empacada con un medio que tiene un diámetro de particula de aproximadamente 4-40 µm, más preferentemente de aproximadamente 5-15 µm, y un tamaño de poro de aproximadamente 100-4000 Á, más preferentemente de aproximadamente 150-350 Á. También, el medio preferentemente tiene un grupo alquilo C4, C8, o C18, y aún más preferentemente es un medio de silice C8. Preferentemente, la elución se lleva a cabo con un solvente que comprende acetonitrilo, tal como agua, acetonitrilo, y TFA, en un formato de gradiente durante 60-100 minutos, preferentemente un gradiente lineal, en donde la cantidad relativa de acetonitrilo es incrementada en el solvente. En otra modalidad preferida, un gradiente de variación ligera de aproximadamente 0.25% de acetonitrilo por minuto es empleada. Si el análisis para pureza de á~qui indica que la técnica empleada remueve exitosamente el CHO-PA, se pueden llevar a cabo pasos de purificación adicionales cuando sea necesario para remover cualesquiera otros contaminantes. Si la técnica no remueve el CHO-PA exitosamente a niveles aceptables, se puede utilizar un esquema de purificación diferente y el proceso de aqui es repetido para determinar que tan efectivo es este esquema. Después de la purificación final, el tPA o una variante del mismo puede ser formulada de acuerdo con los métodos conocidos para preparar composiciones útiles farmacéuticamente, por lo cual el producto de tPA es combinado mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales formulaciones son bien descritas en la literatura asi como sus dosificaciones y usos. Por ejemplo, el tPA o su variante es administrada adecuadamente de manera parenteral a sujetos que padecen de enfermedades o condiciones cardiovasculares y accesos. Los siguientes ejemplos están propuestos para ilustrar una modalidad ahora conocida para practicar la invención, pero la invención no se va a considerar que va a estar limitada a estos ejemplos. Todas las citas de literatura patentada y abierta al público son expresamente incorporadas aqui para referencia.

Ej emplo 1 Materiales La ACTIVASE® (t-tPA) y TNK-tPA fueron obtenidos de Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) en una forma purificada a partir de las células de CHO. Véanse también, por ejemplo, las Pat. U.S. Nos. 4,766,075 y 5,753,486 para el r-tPA ACTIVASE® y la Pat. US No. 5,612,029 para TNK-tPA. El anticuerpo monoclonal #354 para CHO-PA fue producido como se describió en la Pat. No. 5,411,864. Brevemente, un ratón de Balb/c hembra fue inmunizado durante un periodo de 12 semanas con soluciones de proteina enriquecidas substancialmente en el activador de plasminógeno de CHO purificado a partir de la célula huésped que carece del t-PA humano. Existieron cinco inyecciones que consisten cada una de aproximadamente 30 µg. La inyección inicial fue emulsificada con el auxiliar de Freund completo y administrado en el (los) sitio (s) subcutáneo (s) . La segunda inyección dada 1.5 semanas más tarde fue emulsificada con el auxiliar de Freund incompleto y la mitad fue administrada subcutáneamente y la otra mitad intraperitonealmente. Las restantes tres inyecciones fueron provistas en las semanas 3, 6 y 12 en la solución salada amortiguada con fosfato (PBS) administrada en un sitio intraperitoneal.

El bazo del ratón inmunizado fue removido en la semana 13 y las células del bazo fueron fusionadas con la linea celular NP3X63-Ag8.653 del mieloma del ratón utilizando los procedimientos generales de Fazekas et al., J. Immunol. Methods, 35: 1 (1980) y Lañe, J. Immunol. Methods 81: 223 (1985) . Las células fusionadas fueron distribuidas en diez placas de microtitulación que contienen _ cada una 96 cavidades . Cada cavidad fue seleccionada para la producción de un anticuerpo especifico utilizando la reactividad diferencial en los dos ELISAs (ensayos inmunoadsorbentes enlazados a la enzima) . Un ELISA detectó específicamente los anticuerpos contra CHO-PA y el segundo detectó los anticuerpos que reaccionaron de manera cruzada con el tPA humano recombinante . Aproximadamente 5% de las cavidades totales fueron reactivas únicamente con el CHO-PA, y 3% reaccionaron con CHO-PA y t-PA humano. Las células del hibridoma de las cavidades que contienen los anticuerpos específicos para CHO-PA fueron expandidas y clonadas por dilución limitativa (Oi y Herzenberg, "Immunoglobin-Producing Hybrid Cell Lines", p. 351-372, en Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell y Shiigi, eds. (W. H. Freeman and Co . , 1980)). Grandes cantidades de anticuerpos monoclonales específicos fueron producidas por el cultivo celular de las células del hibridoma o por inyección de las células del hibridoma en ratones por lo cual se producen tumores de ascitos. Mab 354 fue un anticuerpo resultante, el cual redujo los niveles de CHO-PA en más de aproximadamente 100 veces en una pasada en una sola columna cuando se inmovilizó y es estable a varias condiciones de lavado difíciles y a condiciones quimicas de inmovilización diferentes. El Mab 354 fue purificado utilizando los pasos descritos posteriormente, en donde todos los pasos fueron llevados a cabo a temperatura ambiente. La concentración se llevó a cabo como sigue: El fluido de colección del cultivo de suspensión del hibridoma de Mab (HF) se filtró a través de un filtro de 0.2 µm. El fluido del cultivo fue concentrado por ultrafiltración o por cromatografía sobre una resina de intercambio iónico. La purificación por afinidad se llevó a cabo como sigue: el Thimerosal fue agregado a la solución de MAb HF concentrada a aproximadamente 0.02%. La solución fue ajustada a aproximadamente glicina 1.5 M, NaCl 3.0 M, pH 9.0 por la adición de glicina 3.0 M, seguido por la adición de NaCl cristalino. La proteina A tiene una unión pobre a Ab, de modo que la adición de NaCl y glicina incrementa la interacción hidrofóbica, para facilitar la unión de Ab. La solución se aclaró por filtración. El MAb HF concentrado aclarado se aplicó a una columna de proteina A inmovilizada con respecto a la agarosa. El MAb unido fue lavado con el amortiguador utilizado para equilibrar la columna, teniendo la composición aproximada de glicina 1.5 M, NaCl 3.0 M, EDTA 0.02 M, pH 9.0. El MAb se eluyó con el amortiguador de citrato de sodio 0.1 M, NaCl 0.15 M, pH 3.0. La columna de proteina A fue regenerada por el lavado con NaSCN 3.0 M, TRIS 0.03M, pH 8.5 y se reequilibró. El pico de MAb eluido fue colectado con base en el perfil de absorbencia a 280 nm. El pico de MAb eluido con citrato fue neutralizado inmediatamente por colección en el amortiguador con la composición aproximada: TRIS-HC1 1.5 M, pH 9.0. Después de su uso, la columna de la proteina A fue desempacada y almacenada en recipientes sellados a 2-8 °C en - thimerosal aproximadamente 0.02% como el amortiguador de almacenamiento. El 354 MAb fue intercambiado entonces con el amortiguador por diafiltración. La diafiltración procedió hasta que la conductividad y el pH fueron similares a los valores para el amortiguador TRIS 0.03 M, NaCl 0.05 M, pH 8.5. El MAb fue aplicado subsiguientemente a una columna de cromatografía de intercambio aniónico que contiene el soporte de agarosa DEAE-FAST FLOW™ y se lavó con el amortiguador de TRIS 0.03 M, NaCl 0.05 M, pH 8.5. El MAb fue eluido por pasos con un amortiguador que tiene la composición aproximada: TRIS 0.03 M, NaCl 0.15 M, pH 8.5. El pico de MAb eluido se colectó con base en el perfil de absorbencia a 280 nm. El MAb fue filtrado (0.2 µm) en recipientes que se pueden sellar, sanitarios y se almacena abajo de -40 °C. El plasminógeno fue obtenido de Fluka (Suiza) . Se obtuvo acetonitrilo de grado CLAR de Burdick & Jackson (Muskgon, MI) y el ácido trifluoroacético (TFA) de Pierce (Rockford, IL) . El agua para la fase móvil de CLAR y las soluciones de muestra fueron purificadas con un sistema MILLI-Q™ de Millipore (Milford, MA) . Todas las otras substancias quimicas fueron del grado reactivo de Sigma (St. Louis, MO) .

Métodos Purificación de CHO-PA El CHO-PA fue aislado del fluido del cultivo celular de CHO por cromatografía de afinidad seguido por inmunoabsorción. La resina Lysine hyper D de BioSepra (Paris, Francia) se utilizó para la cromatografía por afinidad cuando la lisina se une a la región "kringle" 2 de los activadores del plasminógeno (Cleary et al., Biochem. 28, 1884-1890 (1989) ) . La inmunoabsorción fue llevada a cabo utilizando el anticuerpo monoclonal #354 especifico para CHO-PA (MAb#354) . Mab#354 se acopló al gel de SEPHAROSE 4B™ activado con CNBr de acuerdo con el protocolo del vendedor (Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ) . Aproximadamente 10 mg del MAb #354 fueron unidos por ml del gel de Sepharose 4B activado por CNBr. Después de la unión, se empacó una columna de MAb#354-SEPHAROSE 4B™. El fluido del cultivo celular de CHO que contiene el CHO-PA secretado se cargó sobre una columna de afinidad de lisina pre-equilibrada con un amortiguador de equilibrio que contiene fosfato de sodio 50 mM y detergente POLYSORBATE 80™ al 0.01% a pH 7.5. Después de la carga, la columna de afinidad de lisina se lavó tres veces: primero con el amortiguador de equilibrio, seguido por un amortiguador que contiene TRIS 40 mM, NaCl 800 mM, y POLYSORBATE 80™ al 0.008% a pH 8.0, y finalmente con el amortiguador de equilibrio. El CHO-PA fue eluido entonces a partir de la columna de afinidad de lisina con un amortiguador que contiene fosfato de sodio 50 mM, L-arginina 200 mM, y POLYSORBATE 80™ al 0.01% a pH 7.5. Después del equilibrio con la solución salada amortiguada con fosfato (PBS, 8 g/l de NaCl, 0.2 g/l de KC1, 1.44 g/l de Na2HP04 y 0.24 g/l de KH2P04 a pH 7.4), la columna de MAb#354-SEPHAR0SE™ 4B se cargó con el liquido para elución de la columna de afinidad de lisina. Después de la carga, la columna se lavó con un amortiguador que contiene Na2HP04 9.5 mM, NaCl 1 M, y 5% de propilenglicol (v/v) a pH 7.4. El CHOPA unido fue eluido a partir de la columna con glicina-HCl 0.2 M a pH 2.5. La elución fue verificada espectrofotométricamente a 280 nm y las fracciones que contienen el CHO-PA- fueron neutralizadas con 0.14 volúmenes del fosfato-arginina 1.5 M (pH 8.0) inmediatamente durante la colección. La identidad y pureza del CHO-PA eluido fue confirmada por SDS-PAGE y el análisis de la secuencia de aminoácidos .

Tratamiento con DTT/urea La solución que contiene el (los) activador (es) de plasminógeno se diluye (n) 1:1 (v/v) con un amortiguador de desnaturalización (urea 8 M, TRIS 0.5 M, y EDTA 3.2 mM a pH 8.4). El ditiotreitol (DTT) fue agregado desde una solución de materias primas 1 M a una concentración final de 20 mM, y la mezcla se incuba a 37 °C durante 30 minutos.

Tratamiento con Plasmina La solución que contiene el (los) activador (es) de plasminógeno fue diluida 1:3 (v/v) con el amortiguador de solubilización (Na2HP04 125 mM, arginina 200 mM, y NaN3 al 0.01% a pH 7.5). Una centésima (p/p) de plasminógeno fue agregada, y la mezcla se incuba a 37 °C durante 30 minutos.

Ensayo de CLAR de fase inversa para activadores de plasminógeno El ensayo fue efectuado sobre un sistema de CLAR Hewlett-Packard 1090M™ (Hewlett Packard, Avondale, PA) con una columna Zorbax SB-C8, de resina de poros de 300 Á, de tamaño de particula de 5 µm, de 4.6 mm x 250 mm (Mac-Mod, Chadds Ford, PA) . La columna se equilibró durante al menos 15 minutos previo a la inyección de la muestra. La composición de la fase móvil inicial fue 70/30/0.1 (v/v/v) de agua/acetonitrilo/TFA. Después de una retención inicial de cinco minutos, se llevó a cabo un gradiente lineal en 80 minutos (para las Figuras 1 y 2) y en 60 minutos (para la Figura 3) hasta 50/50/0.1 (v/v/v) del agua/acetonitrilo/TFA. Inmediatamente a continuación del gradiente, la columna se regeneró durante 10 minutos con 100/0.1 (v/v) de acetonitrilo/TFA. La composición fue llevada entonces de regreso a las condiciones iniciales en 5 minutos, y el sistema se reequilibró durante la siguiente inyección. El volumen de la inyección fue de 250 ml, y la velocidad de flujo fue de 1 ml/min. La cromatografía se llevó a cabo a 40 °C. La fluorescencia fue medida con un detector de fluorescencia programable Hewlett-Packard 1046A™ (Ex = 275 nm y Em = 340 nm) . Los cromatogramas fueron registrados y analizados con un programa CHEMSTATION™ de Hewlett-Packard.

Resultados y Exposición Debido a la homología de secuencia elevada, la ACTIVASE® (r-tPA) , TNK-tPA, y CHO-PA tienen propiedades bioquimicas/biofisicas muy similares. Los métodos analíticos y preparativos capaces de resolver estos tres activadores de plasminógeno de cada uno de los otros o capaces de resolver el tPA a partir de CHO-PA o TNK-tPA a partir de CHO-PA son necesarios para recuperar el desarrollo del proceso y para estimar la pureza de cada molécula para los estudios clínicos y la producción comercial. Aqui se describe un método simple de CLAR de fase inversa que es capaz de obtener estas metas. Con un gradiente de variación ligera de 0.25% de acetonitrilo por minuto y nada de proteasa o agentes reductores/desnaturalizantes, la CLAR de fase inversa no fue capaz de separar la forma natural del r-tPA del CHO-PA natural (Figura 1) . Sin embargo, la forma natural de TNK-tPA fue resuelta muy bien desde tanto el r-tPA como el CHO-PA naturales bajo estas condiciones. A continuación, el tratamiento con DTT/urea fue efectuado para reducir los enlaces de disulfuro y desnaturalizar las proteínas. Para todas las tres proteínas, el enlace del péptido entre Arg2-; e Ile276 es muy susceptible a la segmentación de la proteasa. Durante el transcurso del tiempo, esta susceptibilidad conduce a la heterogeneidad para el r-tPA, TNK-tPA, y CHO-PA en solución. Una cantidad pequeña de la forma de una sola cadena es convertida a la forma de dos cadenas debido a la segmentación de la proteasa. El tratamiento con DTT/urea reduce la unión de disulfuro entre Cys264 y Cys395 que mantiene la forma de dos cadenas de la moléculas juntas, conduciendo a la disociación de la molécula en dos fragmentos (el fragmento "kringle" y el fragmento de proteasa) . La Figura 2 muestra que, bajo la misma variación del gradiente, la CLAR de fase inversa fue capaz de resolver la forma de una sola cadena de las tres moléculas tromboliticas de cada una de las otras después del tratamiento con DTT/urea. La totalidad de las tres proteínas exhibieron perfiles de elución similares con el fragmento "kringle" de la forma de dos cadenas que eluye primero, la forma de una sola cadena que eluye en segundo lugar, y el fragmento de proteasa de la forma de dos cadenas que eluye al último. Los fragmentos de proteasa respectivos de los tres activadores de plasminógeno también fueron bien resueltos de cada uno de los otros. Mientras que los fragmentos de "kringle" para las tres moléculas no fueron bien separados.

En consecuencia, este método puede ser utilizado para detectar y cuantificar la fragmentación de la forma de una sola cadena en la forma de dos cadenas de los activadores del plasminógeno . La heterogeneidad observada en los perfiles de r-tPA, TNK-tPA, CHO-PA (Figura 2) hace la cuantificación de estas moléculas muy difícil, especialmente cuando se trata de cuantificar cada molécula individual en una mezcla de rtPA, TNK-tPA, y CHO-PA. Para eliminar la heterogeneidad asociada con la proteólisis, la totalidad de la forma de una sola cadena fue convertida a la forma de dos cadenas por incubación con el plasminógeno. El plasminógeno es el substrato del activador del plasminógeno en el sistema fibrinolitico natural. El r-tPA, TNK-tPA, y CHO-PA todos tienen la actividad enzimática de segmentar el enlace del péptido Arg56o - Valsßr del plasminógeno. Tal segmentación convierte al plasminógeno en su forma activa, la plasmina. La plasmina es una serina proteasa con especificidad baja y es capaz de segmentar el enlace del péptido de Arg275 - Ile276 en r-tPA, TNK-tPA, y CHO-PA. Como resultado, la incubación con el plasminógeno convierte a la forma de una sola cadena de los tres activadores de plasminógeno, a la forma de dos cadenas .

A continuación del tratamiento con plasmina, las muestras fueron tratadas con DTT/urea para reducir los enlaces de disulfuro y asi disociar la forma de dos cadenas de la molécula en dos fragmentos discretos. La Figura 3 muestra los perfiles de CLAR de fase inversa para los activadores de plasminógeno tratados con plasmina y DTT/urea. Los fragmentos de proteasa respectivos de las tres proteínas fueron bien separados unos de los otros mientras que los fragmentos "kringle" de las tres moléculas no fueron resueltos. Por lo tanto, el fragmento de proteasa fue utilizado para la integración y cuantificación de cada activador de plasminógeno. Tanto para r-tPA como TNK-tPA, los fragmentos "kringle" de las isozimas del tipo I y del tipo II fueron bien separados. Como resultado, este método también es útil para la cuantificación de la relación del tipo I con respecto al tipo II tanto para el r-tPA como el TNK-tPA. La disponibilidad de este método de CLAR de fase inversa facilita ampliamente el desarrollo del proceso de fabricación. El mismo se ha utilizado para evaluar el efecto de diferentes condiciones de fermentación sobre la calidad del producto considerando la integridad del producto (es decir, el porcentaje de una sola cadena) y la relación de las isozimas del tipo I y del tipo II. También ha sido utilizado para ayudar al desarrollo del proceso de purificación y para asegurar la consistencia entre los lotes de producción. Todas estas aplicaciones ejemplifican el papel crucial de los métodos analíticos y comerciales en el desarrollo de los nuevos fármacos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un proceso para verificar la efectividad de un proceso de purificación en la remoción del activador de plasminógeno (PA) endógeno con respecto a las células del ovario del hámster Chino (CHO) desde una muestra que contiene el tPA humano o las variantes del mismo, tal proceso comprende incubar la muestra con una proteasa capaz de segmentar específicamente el enlace de Arg275 - Ile276 del tPA del tipo silvestre humano y luego con un agente desnaturalizante y un agente reductor en cantidades efectivas para reducir los enlaces de disulfuro del tPA del tipo silvestre humano; someter la muestra a un paso de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa, y analizar el perfil de elución desde el paso de la cromatografía para verificar la cantidad de PA endógeno con respecto a las células de CHO presentes alli.
2. 2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteasa es el plasminógeno .
3. 3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tPA _humano es el tPA de la secuencia natural. 4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la variante de tPA es
4. TNK-tPA.
5. 5. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque antes de la incubación, la muestra es diluida con un amortiguador de la solubilización.
6. 6. El proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el amortiguador tiene un pH de aproximadamente 7 a 8.
7. 7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el amortiguador es un amortiguador de fosfato.
8. 8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porgue el amortiguador comprende además arginina.
9. 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente desnaturalizante comprende urea o guanidina.
10. 10. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente reductor comprende ditiotreitol o 2-mercaptoetanol .
11. 11. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de la cromatografía se lleva a cabo por elución con un solvente que comprende acetonitrilo en un formato de gradiente.