PL204011B1 - Sposób monitorowania sposobu oczyszczania przez usuwanie aktywatora plazminogenu z próbki - Google Patents
Sposób monitorowania sposobu oczyszczania przez usuwanie aktywatora plazminogenu z próbkiInfo
- Publication number
- PL204011B1 PL204011B1 PL355389A PL35538900A PL204011B1 PL 204011 B1 PL204011 B1 PL 204011B1 PL 355389 A PL355389 A PL 355389A PL 35538900 A PL35538900 A PL 35538900A PL 204011 B1 PL204011 B1 PL 204011B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- tpa
- cho
- human
- ala
- tnk
- Prior art date
Links
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 title claims abstract description 40
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 31
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 12
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 108010051181 TNK-tissue plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 34
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 15
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 14
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- 108010084094 alanyl-alanyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 abstract description 7
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 17
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 14
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940099983 activase Drugs 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 3
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- HBHMVBGGHDMPBF-GARJFASQSA-N Cys-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N HBHMVBGGHDMPBF-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOKCBYNCZVSILJ-KKUMJFAQSA-N His-Asn-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O VOKCBYNCZVSILJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 2
- 108010031891 KHRR 296-299 AAAA T103N Proteins 0.000 description 2
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- JRBWMRUPXWPEID-JYJNAYRXSA-N Pro-Trp-Cys Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 JRBWMRUPXWPEID-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N Thr-Cys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- -1 flow rate Substances 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N Ala-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXSFUECZFORGOG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IXTPACPAXIOCRG-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N IXTPACPAXIOCRG-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RGQCNKIDEQJEBT-CQDKDKBSSA-N Ala-Leu-Tyr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RGQCNKIDEQJEBT-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N Ala-Tyr-Arg Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)CN=C(N)N PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DQNLFLGFZAUIOW-FXQIFTODSA-N Arg-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DQNLFLGFZAUIOW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DGFGDPVSDQPANQ-XGEHTFHBSA-N Arg-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O DGFGDPVSDQPANQ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- UGZUVYDKAYNCII-ULQDDVLXSA-N Arg-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UGZUVYDKAYNCII-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- LXMKTIZAGIBQRX-HRCADAONSA-N Arg-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O LXMKTIZAGIBQRX-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UGJLILSJKSBVIR-ZFWWWQNUSA-N Arg-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UGJLILSJKSBVIR-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- GOVUDFOGXOONFT-VEVYYDQMSA-N Asn-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GOVUDFOGXOONFT-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- YRTOMUMWSTUQAX-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YRTOMUMWSTUQAX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- GPPIDDWYKJPRES-YDHLFZDLSA-N Asp-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GPPIDDWYKJPRES-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- MJJIHRWNWSQTOI-VEVYYDQMSA-N Asp-Thr-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O MJJIHRWNWSQTOI-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N Asp-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N Asp-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- PRVVCRZLTJNPCS-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)CN=C(N)N PRVVCRZLTJNPCS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMXSSZUVDNPRMA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N Cys-Asp Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O TULNGKSILXCZQT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- KABHAOSDMIYXTR-GUBZILKMSA-N Cys-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N KABHAOSDMIYXTR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N Cys-Gly-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O DZLQXIFVQFTFJY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LVNMAAGSAUGNIC-BQBZGAKWSA-N Cys-His Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 LVNMAAGSAUGNIC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SSNJZBGOMNLSLA-CIUDSAMLSA-N Cys-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SSNJZBGOMNLSLA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WTEACWBAULENKE-SRVKXCTJSA-N Cys-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N WTEACWBAULENKE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QNNYDGBKNFDYOD-UBHSHLNASA-N Cys-Trp-Cys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N QNNYDGBKNFDYOD-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 241000288900 Desmodus rotundus Species 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N Glu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- WVWZIPOJECFDAG-AVGNSLFASA-N Glu-Phe-Cys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N WVWZIPOJECFDAG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N Glu-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWYFJOHWGCCRIR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JXYMPBCYRKWJEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N Gly-Asp-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N Gly-Cys-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC([O-])=O CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HAXARWKYFIIHKD-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ile-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAXARWKYFIIHKD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CVFOYJJOZYYEPE-KBPBESRZSA-N Gly-Lys-Tyr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CVFOYJJOZYYEPE-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N Gly-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(O)=O OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N Gly-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N His-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- VOEGKUNRHYKYSU-XVYDVKMFSA-N His-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VOEGKUNRHYKYSU-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- YAALVYQFVJNXIV-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 YAALVYQFVJNXIV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- LVWIJITYHRZHBO-IXOXFDKPSA-N His-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LVWIJITYHRZHBO-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- WYKXJGWSJUULSL-AVGNSLFASA-N His-Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(=O)O WYKXJGWSJUULSL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 102100038297 Kallikrein-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710176219 Kallikrein-1 Proteins 0.000 description 1
- IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N L-Leucyl-L-Arginyl-L-Proline Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- IIKJNQWOQIWWMR-CIUDSAMLSA-N Leu-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N IIKJNQWOQIWWMR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- APFJUBGRZGMQFF-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN APFJUBGRZGMQFF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N Leu-Phe-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZDBMWELMUCLUPL-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- RNYLNYTYMXACRI-VFAJRCTISA-N Leu-Thr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O RNYLNYTYMXACRI-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- GKFNXYMAMKJSKD-NHCYSSNCSA-N Lys-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GKFNXYMAMKJSKD-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CFVQPNSCQMKDPB-CIUDSAMLSA-N Lys-Cys-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CFVQPNSCQMKDPB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GJJQCBVRWDGLMQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N Lys-Gly-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- KNKJPYAZQUFLQK-IHRRRGAJSA-N Lys-His-Arg Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KNKJPYAZQUFLQK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KKFVKBWCXXLKIK-AVGNSLFASA-N Lys-His-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N KKFVKBWCXXLKIK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ZJSZPXISKMDJKQ-JYJNAYRXSA-N Lys-Phe-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZJSZPXISKMDJKQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N Lys-Pro-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N Phe-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FPTXMUIBLMGTQH-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- ULECEJGNDHWSKD-QEJZJMRPSA-N Phe-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ULECEJGNDHWSKD-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- DNAXXTQSTKOHFO-QEJZJMRPSA-N Phe-Lys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DNAXXTQSTKOHFO-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 1
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 1
- ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- UTAUEDINXUMHLG-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 UTAUEDINXUMHLG-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N Pro-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N Pro-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VYWNORHENYEQDW-YUMQZZPRSA-N Pro-Gly-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 VYWNORHENYEQDW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SUENWIFTSTWUKD-AVGNSLFASA-N Pro-Leu-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SUENWIFTSTWUKD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HOTVCUAVDQHUDB-UFYCRDLUSA-N Pro-Phe-Tyr Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=C(O)C=C1 HOTVCUAVDQHUDB-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N Pro-Trp Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)[O-])C(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- FQPQPTHMHZKGFM-XQXXSGGOSA-N Thr-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FQPQPTHMHZKGFM-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- VEWZSFGRQDUAJM-YJRXYDGGSA-N Thr-Cys-Tyr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N)O VEWZSFGRQDUAJM-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N Thr-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O BEZTUFWTPVOROW-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- RPVDDQYNBOVWLR-HOCLYGCPSA-N Trp-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPVDDQYNBOVWLR-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N Trp-Leu-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- DTPWXZXGFAHEKL-NWLDYVSISA-N Trp-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DTPWXZXGFAHEKL-NWLDYVSISA-N 0.000 description 1
- BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N Tyr-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- XUIOBCQESNDTDE-FQPOAREZSA-N Tyr-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O XUIOBCQESNDTDE-FQPOAREZSA-N 0.000 description 1
- CLEGSEJVGBYZBJ-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CLEGSEJVGBYZBJ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N Val-Arg-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- ZXAGTABZUOMUDO-GVXVVHGQSA-N Val-Glu-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N ZXAGTABZUOMUDO-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- PMXBARDFIAPBGK-DZKIICNBSA-N Val-Glu-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PMXBARDFIAPBGK-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N Val-His Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 BNQVUHQWZGTIBX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N Val-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PQSNETRGCRUOGP-KKHAAJSZSA-N Val-Thr-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O PQSNETRGCRUOGP-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- DLRZGNXCXUGIDG-KKHAAJSZSA-N Val-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O DLRZGNXCXUGIDG-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N alpha-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940124645 emergency medicine Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010045126 glycyl-tyrosyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 102000047823 human PLAT Human genes 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010074082 phenylalanyl-alanyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- CCTIOCVIZPCTGO-BYPYZUCNSA-N phosphoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(=N)NP(O)(O)=O CCTIOCVIZPCTGO-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/972—Plasminogen activators
- G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Devices For Conveying Motion By Means Of Endless Flexible Members (AREA)
- Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Signal Processing For Digital Recording And Reproducing (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu monitorowania sposobu oczyszczania polegającego na usuwaniu aktywatora plazminogenu endogennego dla komórek jajnika chińskiego (CHO) z próbki zawierającej ludzki tkankowy aktywator plazminogenu.
Dziedzina wynalazku
Opisany zgodnie z wynalazkiem sposób pozwala na określenie ilości wyprodukowanego w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) tPA w próbkach rekombinowanego ludzkiego tPA o natywnej sekwencji, lub jego odmian, wytworzonych w komórkach CHO.
Opis stanu techniki
Aktywatory plazminogenu typu tkankowego (tPA) są endogennymi proteazami serynowymi zaangażowanymi w kaskadę procesów prowadzących do rozpuszczenia skrzepu krwi (Astrup i Permin, Nature, 159, 681-682 (1947), Camiolo i i wsp. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 138, 277-280 (1971); Collen, J. Biol. Chem., 33, 77-86 (1987), Hoylaerts i wsp., J. Biol. Chem., 257, 2912-2919 (1982)). ACTIVASE® jest rekombinowaną formą ludzkiego tPA (r-tPA), stosowaną w przypadku ostrego zawału mięśnia sercowego i zatorze tętnicy płucnej (Grossbard, Pharm. Res., 4, 375-378 (1987). ACTIVASE® stosowana jest także do leczenia udaru niedokrwiennego (Smith i wsp., Acad. Emergency Medicine, 6 (6), 618-25 (1999); Kwiatkowski i wsp., New Enq. J. Med., 340 (23), 1781-1787 (1999)). Jest to glikoproteina produkowana poprzez ekspresję komplementarnego DNA (cDNA) dla naturalnego ludzkiego tPA w komórkach jajnika chomika chińskiego. TNK-tPA to genetycznie zmodyfikowana odmiana ludzkiego tPA sklonowana i eksprymowana w komórkach CHO (Keyt i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91, 3670-3674 (1994)). Mutacje ukierunkowane wprowadzono w trzech specyficznych miejscach ludzkiego tPA tak, aby wytworzyć odmianę TNK-tPA. Są nimi Thr 103 do Asn (T103N), Asn 117 do Gln (N117Q) oraz Lys-His-Arg-Arg 296-299 do Ala-Ala-Ala-Ala (KHRR2 96-2 99AAAA). W porównaniu do tPA, TNK-tPA wykazuje podobną aktywność biologiczną in vitro, zwiększoną oporność wobec inhibitora aktywatora plazminogenu oraz poprawioną specyficzność fibrynową oraz jest wolniej usuwany z osocza (Keyt i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91, 3670-3674 (1994); Thomas i wsp., Stroke, 25: 10,2072-2079 (1994); Benedict i wsp., Circulation, 92: 10, 30323040 (1995); Modi i wsp., Thromb Haemost, 79, 134-139 (1998)). Oczekuje się właśnie na wydanie zezwolenia na podawanie r-tPA w postaci jednej dużej dawki. Komórki CHO biosyntetyzują endogennie chomiczy tPA, zwany CHO-PA. CHO-PA wykazuje podobną aktywność fibrynolityczną do ludzkiego tPA jak to określono przez test lizy skrzepu. Sekwencja aminokwasowa CHO-PA jest w 80% identyczna z sekwencją ludzkiego tPA. Wiele z substytucji jest semikonserwatywnych, takich jak: Arg θ Lys, Glu θ Asp, Phe< >Tyr, Val θ Ala, Ile θ Leu lub Thr θ Ser. Stosując model domeny ludzkiej proteazy tPA w oparciu o strukturę chymotrypsyny wołowej zaobserwowano, że wszystkie substytucje w CHO-PA zlokalizowane są na powierzchni białka lub w jej pobliżu.
r-tPA, TNK-tPA oraz CHO-PA są pojedynczymi łańcuchami polipeptydowymi złożonymi z 527 aminokwasów z 17 wiązaniami disiarczkowymi (Nguyen i Carole, Stability Characterization and Formulation Development of Altepase, a Recombinant Tissue Plasminogen Activator, w Stabilitv and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case Histories, Y. J. Wang, R. Pearlman, wyd., (Plenum Press: New York, 1993), str. 91-135. W przypadku wszystkich tych trzech rodzajów białek wiązania peptydowe pomiędzy Arg275 a Ile276 są szczególnie podatne na trawienie proteazą. Trawienie powoduje powstanie dwóch fragmentów: jednego składającego się z 275 aminokwasów z N-końca oraz i drugiego składającego się z 252 aminokwasowów z C-końca. Łańcuch N- końcowy zawiera regiony homologiczne do regionów kringle występujących w plazminogenie i protrombinie, i dlatego też często jest nazywany „fragmentem kringle (Nguyen i Carole, supra; de Vos i wsp., Biochem., 31,270-279 (1992).
Łańcuch C-końcowy zawiera miejsce katalitycznie aktywne i dlatego też jest przeważnie nazywany „fragmentem proteazowym (Pennica i wpół., Nature, 301, 214-221 (1983). Strawione dwa łańcuchy są połączone pojedynczym wiązaniem disiarczkowym utworzonym pomiędzy Cys264 i Cys395. Strawiona cząsteczka jest często nazywana „dwułańcuchowym tPA w przeciwieństwie do „jednołańcuchowego tPA lub formy nienaruszonej.
r-tPA zawiera cztery potencjalne miejsca N-glikozylacji identyfikowane przez sekwencje Asn- X- Ser/ Thr (Nguyen i Carole, jak wyżej). Są nimi Asn117, Asn184, Asn218 oraz Asn448. r-tPA występuje jako dwa glikozylowane izozymy oznaczono jako typ I oraz II. Typ I r-tPA jest glikozylowany w Asn117, Asn184 oraz Asn448, podczas gdy typ II r-tPA jest glikozylowany tylko w Asn117 i Asn448.
PL 204 011 B1
Asn218 nie jest glikozylowany w żadnej z izoform. TNK-tPA ma taki sam wzór glikozylacji jak r-tPA, z wyją tkiem tego, ż e mutacje Thr103 na Asn oraz Asn117 na Gln skutecznie przenoszą miejsce glikozylacji z pozycji 117 do 103 (Keyt i wsp., jak wyżej). Wzór glikozylacji dla CHO-PA nie jest w pełni scharakteryzowany (Rijken i Collen, J. Biol. Chem., 256: 7035-7041 (1981).
ACTIVASE® to znak towarowy dla rekombinowanej formy ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (r-tPA), stosowanego w przypadku ostrego zawału serca oraz zatoru tętnicy płucnej. tPA pod marką ACTIVASE® jest także obecnie dozwolony w leczeniu udaru niedokrwiennego. Jest on produkowany poprzez ekspresję komplementarnego DNA (cDNA) dla naturalnego ludzkiego tPA w komórkach jajnika chomika chińskiego (Patent U.S. nr 5, 753, 486). TNK- tPA to genetycznie zmodyfikowana odmiana r-tPA o podwyższonej skuteczności i obniżonej częstości krwawienia w porównaniu do ACTIVASE® r-tPA. Została ona utworzona przez mutacje ukierunkowane w trzech pozycjach (T103N, N117Q i KHRR296-299AAAA) oraz klonowanie i ekspresję w komórkach CHO (Patent U.S. nr 5,612,029). Komórki CHO biosyntetyzują endogenny chomiczy tPA, zwany CHO-PA. Sekwencja aminokwasowa CHO-PA jest wysoce homologiczna (w 80% identyczna) do sekwencji r-tPA. Wszystkie te trzy białka trombolityczne funkcjonują jako heterogenne izoformy, głównie z powodu proteolizy/ hydrolizy i zróżnicowanej glikozylacji.
Sposób oczyszczania ludzkiego tPA z CHO-PA opisano w Patencie U.S. nr 5,411,864. Sposób ten obejmuje kontaktowanie cieczy zawierającej ludzki tPA z przeciwciałami specyficznie wiążącymi się z odpowiednim endogennym CHO-PA i odzyskiwanie ludzkiego tPA. Korzystnie etap kontaktowania obejmuje przepuszczenie cieczy przez kolumnę chromatograficzną, na której immobilizowano przeciwciała.
Opracowywanie białkowych środków farmaceutycznych opartych na rekombinowanym DNA zostało ułatwione przez wprowadzenie nowych metod analitycznych, które można użyć do charakteryzowania białka i/ lub wykazania regularności wytwarzania białka. Mapowanie białka jest kluczową metodą do monitorowania sekwencji aminokwasowej i jest zdolne do wykrycia małych zmian w małych do średnich białkach, np. insulinie i ludzkim hormonie wzrostu. Analiza o wiele większego białka, np. fibrynogenu (masa cząsteczkowa 350 000) lub heterogennych glikoprotein, takich jak przeciwciała (masa cząsteczkowa 150 000) jest utrudniona przez złożoność budowy białek tworzonych przez trawienie enzymatyczne. Taka złożoność ogranicza zastosowanie rozdzielania z użyciem samej wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą (RP-HPLC) w połączeniu z wykrywaniem on-line w ultrafiolecie.
Opracowanie komercyjnie dostępnych systemów złożonych z HPLC połączonej ze spektroskopią masową z jonizacją w elektrospreju (ang. electrospray ionization mass spectromety (LC-ES-MS)) kompatybilnych z konwencjonalną HPLC zwiększyło znacznie moc mapowania białka (Ling i współ, Anal. Chem., 63: 2909-2915 (1991); Guzetta i wsp., Anal. Chem., 65: 2953-2962 (1993)). LC- EM- MS w połączeniu ze ź ródł ową indukowaną kolizyjnie dysocjacją (ang. insource collisionally induced disscociation) (CID) skutecznie zastosowano do identyfikacji miejsc N- i O-glikozylacji (Carr i wsp., Protein Sci., 2: 183-196 (1993); Huddleston i wsp., Anal. Chem., 65: 877-884 (1993); Conboy i Henion, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 3: 804-814 (1992)). Jednakże nawet ta technika jest ograniczona przez niewystarczającą rozdzielczość wynikającą z dużej liczby bardzo podobnych białek, spowodowaną przez zmienną glikozylację białka i enzymatyczne trawienie glikoprotein o średnich rozmiarach.
Zatem istnieje potrzeba wykorzystania wielu technik z ortogonalną selektywnością do charakteryzacji takich próbek.
Zbadano zastosowanie kombinacji wysokosprawnej elektroforezy kapilarnej, HPLC, LC- ES- MS oraz spektrometrii masowej czasu przelotu z laserową desorpcją i jonizacją próbki wspomaganą matrycą, celem scharakteryzowania enzymatycznego trawienia niederywatyzowanych próbek glikoprotein, jak to przedstawiono na przykładzie DSPAal, jednołańcuchowego aktywatora plazminogenu otrzymanego z gruczołów ślinowych nietoperza wampirzego (Apffel i wsp., J. Chromatography A, 717: 41-60 (1995)). Wyciągnięto wniosek, że wspomniane cztery techniki są wysoce odpowiednie do badania glikoprotein. Pomimo to twórcy przyznają, iż należy dołożyć jeszcze więcej starań, aby poprawić skuteczność tych metod oraz że będą wymagane etapy z wysokimi stężeniami ze względu na dużą heterogenność węglowodanów.
Istnieje zatem zapotrzebowanie na technikę monitorowania względnej i bezwzględnej ilości CHO-PA obecnego po procedurze oczyszczania tPA, takiej jak wspomniana w Patencie U.S. nr 5,411,864, jak wyżej.
PL 204 011 B1
Podsumowanie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób monitorowania sposobu oczyszczania polegającego na usuwaniu aktywatora plazminogenu (PA) endogennego dla komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) z próbki zawierającej ludzki tPA dzikiego typu (SEQ ID NO: 3) lub cząsteczkę tPA, w której Thr103 z ludzkiego tPA dzikiego typu (SEQ ID NO: 3) jest zmieniona na Asn, Asn 117 z ludzkiego tPA (SEQ ID NO: 3) jest zmieniona na Gln, a Lys-His-Arg-Arg (SEQ ID NO: 1 296-299) z ludzkiego tPA dzikiego typu (SEQ ID NO: 3) jest zmieniona na Ala-Ala-Ala-Ala (SEQ ID NO: 2) (TNK-tPA), w którym
a) inkubuje się próbkę z proteazą, która specyficznie tnie wiązanie Arg275 -He276 ludzkiego tPA typu dzikiego lub TNK-tPA;
b) inkubuje się próbkę z etapu a) z czynnikiem denaturującym wybranym spośród mocznika lub guanidyny i czynnikiem redukującym wybranym spośród ditiotreitolu lub 2-merkaptoetanolu w celu redukcji wiązań disiarczkowych ludzkiego tPA dzikiego typu lub TNK-tPA; i
c) poddaje się próbkę etapowi wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą, przy czym przecięty proteazą fragment PA endogennego dla komórek CHO eluuje się przed przeciętym proteazą fragmentem tPA dzikiego typu lub TNK-PA.
Korzystnie jako proteazę stosuje się plazminogen.
Korzystnie jako ludzki tPA stosuje się tPA o natywnej sekwencji.
Korzystnie jako odmianę tPA stosuje się TNK-tPA.
Korzystnie przed inkubacją próbkę rozcieńcza się w buforze do trawienia.
Korzystniej stosuje się bufor o pH od około 7 do 8.
Jeszcze korzystniej jako bufor stosuje się bufor fosforanowy.
Najkorzystniej stosuje się bufor zawierający ponadto argininę.
Korzystnie etap chromatografii przeprowadza się przez elucję rozpuszczalnikiem zawierającym acetonitryl w gradiencie.
Zgodnie z powyższym opracowano tutaj wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconą fazą do analizy trzech cząsteczek trombolitycznych, CHO-tPA, rekombinowanego ludzkiego tPA z natywną sekwencją oraz TNK-tPA. Sposób ten nie tylko ma zdolność do rozdzielania ludzkiego tPA i/ lub TNK-tPA od CHO-PA, ale także zdolny jest do identyfikowania i oceny ilościowej różnych izoform każdej z tych cząsteczek.
Dokładniej, zgodnie z wynalazkiem dostarczono sposób monitorowania skuteczności procesu oczyszczania polegającego na usuwaniu aktywatora plazminogenu (PA) endogennego dla komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) z próbki zawierającej ludzki tPA lub jego odmiany, który to sposób obejmuje inkubację próbki z proteazą zdolną do specyficznego trawienia wiązania Arg275-Ile276 ludzkiego tPA dzikiego typu, a następnie z czynnikami denaturującymi i redukującymi w ilości skutecznej do zredukowania wiązań disiarczkowych ludzkiego tPA dzikiego typu, a następnie poddawanie próbki etapowi wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą oraz analizie profilu elucji z etapu chromatografii pod kątem ilości PA endogennego dla komórek CHO.
Krótki opis figur
Figura 1 pokazuje analizę HPLC z odwróconą fazą natywnego r-tPA, TNK-tPA oraz CHO-PA.
Figura 2 pokazuje analizę HPLC z odwróconą fazą r-tPA, TNK-tPA oraz CHO-PA traktowanych DTT/ mocznikiem. Aktywatory plazminogenu traktowano DDT/ mocznikiem przed chromatografią.
Figura 3 pokazuje analizę HPLC z odwróconą fazą plazminy i traktowanych DTT/ mocznikiem r-tPA, TNK-tPA oraz CHO-PA. Aktywatory plazminogenu traktowano plazminą a następnie DDT/ mocznikiem przed chromatografią.
Opis preferowanych wykonań
Definicje
Określenia „tkankowy aktywator plazminogenu oraz „tPA odnoszą się do ludzkich zewnętrznych tkankowych aktywatorów plazminogenu mających aktywność fibrynolityczną, których struktura przeważnie zawiera pięć domen (palca, czynnika wzrostu, kringle-1, kringle-2, oraz domen proteazowych), ale pomimo to może zawierać mniej domen lub niektóre z nich mogą być powtórzone, pod warunkiem że wciąż funkcjonuje jako czynnik trombolityczny i zachowuje miejsca N-glikozylacji w pozycji 117, 184 i 448.
tPA składa się co najmniej z domeny proteazowej, która jest zdolna do przekształcania plazminogenu w plazminę oraz regionu N-końcowego, który uważa się, że jest co najmniej częściowo odpowiedzialny za wiązanie fibryny i zachowywanie miejsca N-glikozylacji w pozycjach odpowiadających pozycjom aminokwasów 117, 184 i 448 ludzkiego tPA dzikiego typu. Zachowywanie tych miejsc glikoPL 204 011 B1 zylacji wynika z faktu, że zajęcie zmiennego miejsca w rekombinowanych i dzikiego typu tPA pochodzącego od czerniaka prowadzi do wytwarzania dwóch odmian, oznaczonych odpowiednio jako „Typ I tPA oraz „ Typ II tPA. Typ I tPA zawiera oligosacharydy połączone przez N w miejscach 117, 184 i 448. Typ II tPA zawiera oligosacharydy łączone przez N w miejscach 117 i 448. Zrozumiałym będzie, że występują naturalne odmiany alleliczne i mogą pojawiać one się wśród osobników, jak to przedstawiono przez jedną lub większą ilość różnic aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej tPA każdego osobnika.
Określenia „ludzki tkankowy aktywator plazminogenu dzikiego typu, „ludzki tPA dzikiego typu, „natywny ludzki tkankowy aktywator plazminogenu oraz „natywny ludzki tPA, przy czym „ludzki tPA może być skracany do „htPA, odnoszą się do natywnej sekwencji ludzkiego tPA, tj. sekwencji kodowanej przez sekwencję cDNA opisaną w Patencie U.S. nr 4,766,075, wydanym 23 sierpnia 1988. Numery lub pozycje aminokwasowe w cząsteczce tPA oznaczono zgodnie z Patentem U.S. nr 4,766,075.
W stosowany tutaj sposób odniesienia do róż nych domen tPA oznaczaj ą domeny dzikiego typu ludzkiego tPA jak wcześniej zdefiniowano oraz funkcjonalne równoważne części ludzkiego tPA posiadające zmiany aminokwasów w porównaniu do natywnej sekwencji ludzkiego tPA, albo tPA (natywnego lub odmiany) z innych źródeł, takich jak tkankowy aktywator plazminogenu z nietoperza (bat-PA). Tak więc, w stosowanym tu znaczeniu określenie „domena proteazy odnosi się do regionu rozpoczynającego się od aminokwasu w pozycji 264 do 527 włącznie, dojrzałej formy ludzkiego tPA dzikiego typu, oraz do funkcjonalnie równoważnych części ludzkiego tPA posiadających zmiany sekwencji aminokwasowej w stosunku do natywnej sekwencji ludzkiego tPA lub tPA z innych źródeł, takich jak bat-PA.
W stosowanym tu znaczeniu „odmiany tPA odnosi się do cząsteczek, które różnią się od natywnego tPA jedną lub większą ilością zmian lub modyfikacji aminokwasów względem istniejących aminokwasów. TNK-tPA jest tutaj preferowaną odmianą. Modyfikację mającą na celu zmianę lub wprowadzenie odpowiedniego aminokwasu lub aminokwasów do natywnej cząsteczki celem uzyskania pożądanej odmiany sekwencji przeprowadza się za pomocą metod znanych w danej dziedzinie nauki, takich jak mutageneza ukierunkowana lub ligacja odpowiedniej sekwencji do DNA kodującego istotne białko.
Stosowane tutaj określenie „TNK-tPA odnosi się do cząsteczki tPA, w której Thr103 dzikiego typu tPA jest zamieniony na Asn (T103N), Asn117 dzikiego typu tPA jest zmieniony na Gln (N117Q) oraz Lys-His-Arg-Arg 296-299 dzikiego typu tPA jest zamieniony na Ala-Ala-Ala-Ala (KHRR296299AAAA). Taki TNK jest ponadto opisany w Patencie U.S. nr 5,612,029.
Określenie „komórka jajnika chomika chińskiego lub „komórka CHO odnosi się do komórek lub linii komórkowych uzyskanych z jajników chomików chińskich, jak opisano np. w EP 117,159, opublikowanym w 29 sierpnia 1989; Patentach U.S. nr 4,766,075; 4,853,330; 5,185,259; Lubiniecki i wsp., in Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, Spier i wsp., wyd. (1989), str. 442-451), jak również pochodnych CHO takich jak CHO/-DHFR (Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)), CHO-Kl DUX B11 (Simonsen i Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2495-2499 (1983); Urlaub i Chasin, jak wyżej), i komórek dpl2. CHO (EP 307,247 opublikowane 15 marca 1989). Preferowane komórki gospodarza obejmują komórki CHO-K1 DUX B11 oraz dp 12 CHO.
Komórki CHO opracowane do wytwarzania tPA na dużą skalę są utrzymywane kriogenicznie w układzie MCB/ pracują cym banku komórek (ang. working cell bank, WCB) jak to opisano przez Wiebe i wsp. Large Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, wyd., (Marcel Dekker: New York, 1990), str. 147-160. Komórki DHFR + CHO-K1 transfekowane DNA kodującym ludzki tPA zostały zdeponowane w Amerykańskiej Kolekcji Hodowli Typowych (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia (ATCC) i są dostępne pod numerem dostępu CCL 61. Próbka innej linii komórkowej CHO produkującej tPA (linia komórkowa CHO 1-1515) została zdepononowana pod numerem dostępu ATCC CRL 9606. Odnośnie tej ostatniej linii komórkowej opisano, że skutkuje powstawanie ludzkiego tPA na poziomie dochodzącym do 50 pg/ komórkę/dzień.
W stosowanym tu znaczeniu „aktywator plazminogenu CHO lub „CHO-PA odnosi się do aktywatora plazminogenu, który jest produkowany endogennie przez komórki CHO. Ten endogenny PA eksprymowany przez komórki CHO ma sekwencję nieco inną (około 80% identyczności) od ludzkiego dzikiego typu tPA. CHO-PA nie jest typem tkankowym PA.
W stosowanym tu znaczeniu określenie „proteazy odnosi się do enzymu, który jest zdolny do specyficznego trawienia wiązania Arg275-Ile276 ludzkiego tPA dzikiego typu. Przykłady obejmują pla6
PL 204 011 B1 zminę (lub plazminogen, który przekształca się w plazminę), tkankową kalikreinę lub czynnik Xa, jak również proteazy typu trypsynowego, które mogą przeprowadzać tę specyficzną ograniczoną proteolizę. Przydatne proteazy są ponadto opisane w Ichinosi i wsp. FEBS Letters, 175: 412-418 (1984). Preferowana jest tutaj plazmina/ plazminogen.
W stosowanym tu znaczeniu okreś lenia „czynniki denaturujące/ redukujące lub „czynnik denaturujący i czynnik redukujący odnoszą się do kombinacji środka denaturującego i redukującego, która redukuje wiązania disiarczkowe ludzkiego tPA dzikiego typu. Czynnikiem denaturującym jest w szczególności guanidyna lub mocznik a czynnikiem redukującym ditiotreitol (DTT) lub 2-merkaptoetanol.
Sposoby realizacji
Po produkcji rekombinacyjnej, odmiana tPA lub tPA jest odzyskiwana z podłoża hodowlanego CHO, albo jako wydzielane białko albo z lizatu komórek gospodarza, gdy jest bezpośrednio eksprymowane bez białka sygnałowego. Niezbędne jest oczyszczenie tPA lub jego odmiany z białek komórek gospodarza, aby uzyskać preparaty, które są zasadniczo homogenne jako białko. W pierwszym etapie podłoże hodowlane albo lizat są wirowane lub filtrowane, aby usunąć rozdrobnione szczątki komórkowe.
Ludzki tPA, lub jego odmiana, jest następnie oczyszczany z odpowiednich endogennych białek, takich jak CHO-PA za pomocą takich technik jak frakcjonowanie na kolumnach do chromatografii immunopowinowactwa lub jonowymiennej jak to opisano np. w Patencie U. S. nr 5,411,864; precypitacja etanolem; HPLC z odwróconą fazą; chromatografia na krzemionce lub chromatografia jonowymienna na żywicy takiej jak DEAE; ogniskowanie chromatograficzne; SDS-PAGE; precypitacja siarczanem amonu lub elektroforeza żelowa z użyciem, np. Sephadex G-75. Użyteczny może być także inhibitor proteazy, który nie oddziałuje z aktywnością tPA, taki jak fluorek fenylometylosulfonylu, aby hamować degradację proteolityczną podczas oczyszczania oraz antybiotyki, które mogą być użyte do zapobiegania wzrostowi pojawiających się zanieczyszczeń. Specjaliści w dziedzinie dostrzegą fakt, że metody oczyszczania odpowiednie do natywnego tAP mogą wymagać modyfikacji ze względu na zmiany w charakterze tPA lub jego odmian po ekspresji w rekombinacyjnej hodowli komórkowej.
W preferowanym wykonaniu jeś li produkowana jest odmiana tPA to jest ona wydzielana a supernatant jest przepuszczany przez kolumnę prekondycjonowaną PBS ze szklanymi kulkami, na których znajdują się kozie poliklonalne przeciwciała A6 przeciw tPA, kolumna jest równoważona buforem, a nastę pnie eluowana jest odmiana tPA.
Wynalazek jest skierowany na monitorowanie (jakościowe i ilościowe) poziomów natywnego CHO-PA w próbce pobranej z systemów oczyszczania, która zawiera co najmniej jedną formę ludzkiego tPA, który jest produkowany w komórkach CHO. Sposób ten obejmuje inkubację próbki z proteazą, która jest zdolna do specyficznego trawienia wiązania Arg275 -Ile276. Później następuje inkubacja próbki traktowanej proteazą z kombinacją czynnika denaturującego i redukującego w odpowiednich bezwzględnych i względnych ilościach aby uzyskać redukcję wiązań disiarczkowych w ludzkim tPA dzikiego typu. Ponieważ traktowanie czynnikami denaturującymi i redukującymi powoduje utratę aktywności enzymatycznej to inkubację z proteazą przeprowadza się jako pierwszą.
Po inkubacji próbka poddawana jest wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą a profil elucji z etapu chromatografii analizowany jest pod kątem ilości obecnego PA endogennego dla komórek CHO. Proteazą jest dogodnie plazminogen, który przekształca się w aktywną formę, plazminę, ludzki tPA jest natywną sekwencją tPA a odmianą tPA jest TNK-tPA.
Następujące po sobie w etapie inkubacji inkubacja z proteazą, a następnie czynnikiem denaturującym/ redukującym przeważnie zachodzą w temperaturze około 30-40°C, zwłaszcza około 36-38°C, a w szczególności około 37 °C, przez co najmniej około 15 minut, zwłaszcza około 20-40 minut.
Poza tym dogodnie przed inkubacją próbka jest rozcieńczana buforem rozcieńczającym, który korzystnie ma pH około 7 do 8, korzystniej buforem fosforanowym w pH 7,4-7,6 i najkorzystniej zawierającym także argininę.
Zgodnie z wynalazkiem zastosowana może być jakakolwiek kolumna HPLC, na którą nakładana jest próbka, zarówno na skalę preparatywną, jak i analityczną. Kolumna jest przeważnie równoważona przez co najmniej około 15 minut przed wstrzyknięciem próbek. Rozmiar kolumny, materiał kolumny, szybkość przepływu, bufor do elucji, typ gradientu, objętość wstrzyknięcia oraz rozmiar cząstek kolumny zależą od wielu czynników, w tym rozmiaru badanej próbki, składu fazy ruchomej oraz gradientu, jak i form rozdzielanego tPA.
Rozpuszczalnikiem do nakładania może być jakikolwiek rozpuszczalnik, ale korzystny jest rozpuszczalnik bazujący na acetonitrylu, taki jak woda, acetonitryl, kwas trifluorooctowy (TFA).
PL 204 011 B1
Zalecaną kolumną jest kolumna Zorbax C8, Vydac lub Baker C-18 wypełniona podłożem o średnicy cząstek około 4-40 μm, zwłaszcza około 5-15 μm i rozmiarem porów około 100-4000 A, zwłaszcza około 150-350 A. Ponadto podłoże dogodnie zawiera grupy alkilowe C4, C8 lub C18, a zwłaszcza stanowi podłoże krzemionkowe C8. Korzystnie elucja przeprowadzana jest rozpuszczalnikiem zawierającym acetonitryl, takim jak woda, acetonitryl i TFA w gradiencie przez około 60-100 minut, zwłaszcza w gradiencie liniowym, gdzie względna ilość acetonitrylu wzrasta w rozpuszczalniku. W innym preferowanym wykonaniu stosowany jest płytki gradient wynoszący około 0,25% acetonitrylu na minutę .
Jeśli analiza czystości ujawnia, że użyta technika pomyślnie usuwa CHO-PA, późniejsze etapy oczyszczania mogą być użyte do usunięcia innych zanieczyszczeń. Jeśli technika nie usuwa pomyślnie CHO-PA do akceptowanego poziomu można użyć innego schematu oczyszczania a opisany tu sposób można powtórzyć, celem określenia skuteczności tego schematu.
Po końcowym oczyszczaniu, tPA lub jego odmiana, może być preparowany zgodnie ze znanymi metodami tak, aby przygotować farmaceutycznie przydatne kompozycje, przy czym produkt tPA łączony jest w mieszance z farmaceutycznie akceptowanym nośnikiem. Takie preparaty, jak również dawki i zastosowania, są dobrze opisane w literaturze. Przykładowo, tPA, lub jego odmiana, są odpowiednio podawane pozajelitowo pacjentom cierpiącym na stany lub choroby sercowo-naczyniowe lub udary.
Następujące przykłady mają na celu przedstawienie jednego wykonania wynalazku, ale nie mają na celu jego ograniczenia. Cała otwarta i opatentowana literatura cytowana tutaj jest tu włączana przez odesłanie.
P r z y k ł a d 1
Materiały
ACTIVASE® (r-tPA) oraz TNK-tPA uzyskano z Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) w oczyszczonej formie z komórek CHO. Zobacz np. Patent U.S. nr 4,766,075 i 5,753,486 dla ACTIVASE® r-tPA oraz dla TNK-tPA Patent U.S. nr 5,612,029. Przeciwciało monoklonalne #354 dla CHO-PA wyprodukowano jak to opisano w patencie U.S. nr 5,411,864. W skrócie, samicę myszy Balb/c immunizowano przez okres 12 tygodni roztworami białka zasadniczo wzbogaconymi w aktywator plazminogenu CHO oczyszczony z komórek gospodarza bez ludzkiego tPA. Przeprowadzono pięć wstrzyknięć, przy czym każde zawierało około 30 μg. Początkowe wstrzyknięcie emulgowano z kompletnym adiuwantem Freunda i podano podskórnie. Drugie wstrzyknięcie podano po 1,5 tygodnia w formie emulgowanej z niekompletnym adiuwantem Freunda, przy czym połowę podano podskórnie a połowę dootrzewnowo. Pozostałe trzy wstrzyknięcia podano w tygodniu 3, 6 i 12 w fizjologicznym roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) dootrzewnowo.
Śledzionę immunizowanej myszy usunięto w 13 tygodniu a jej komórki poddano fuzji z mysią linią komórkową czerniaka NP3X63-Ag8.653 przy użyciu ogólnych procedur Fazekas i wsp., J. Immunol. Methods, 35: 1 (198 0) i Lane, J. Immunol. Methods 81: 223 (1985). Komórki poddane fuzji rozmieszczono do 10 płytek do mikromiaraczkowania, z których każda zawierała 96 dołków. Każdy dołek był badany pod kątem produkcji specyficznych przeciwciał przy użyciu zróżnicowanej reaktywności w dwóch testach ELISA. Jeden test ELISA specyficznie wykrył przeciwciała przeciwko CHO-PA a drugi przeciwciała, które reagowały krzyżowo z rekombinowanym ludzkim tPA.
Około 5% wszystkich dołków reagowało jedynie z CHO-PA, a 3% reagowało z CHO-PA i ludzkim t-PA.
Komórki hybrydomy z dołków zawierających specyficzne przeciwciała przeciwko CHO-PA namnożono i sklonowano poprzez ograniczone rozcieńczenia (Oi i Herzenberg, „ImmunoglobinProducing Hybrid Cell Lines, str. 351-372, in Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell i Shiigi, wyd. (W. H. Freeman and Co., 1980)). Wyprodukowano duże ilości specyficznych przeciwciał monoklonalnych poprzez hodowlę tkankową komórek hybrydoma lub poprzez wstrzyknięcie komórek hybrydoma do myszy, prowadząc przez to do powstania guzków puchliny brzusznej. MAb 354 to jedno z powstałych przeciwciał, które obniżyło poziomy CHO-PA po immobilizacji ponad około 100-krotnie w jednym pasażu kolumny, i które jest stabilne wobec kilku różnych związków chemicznych do immobilizacji i ciężkich warunków przemywania.
MAb 354 oczyszczono zgodnie z etapami opisanymi poniżej, przy czym wszystkie poniższe etapy przeprowadzono w temperaturze pokojowej (RT). Stężenie było następujące: ciecz pohodowlaną zawiesiny hodowli hybrydomy MAb (HF) filtrowano przez filtr 0,2 μm. Ciecz hodowlaną zatężono przez ultrafiltrację lub za pomocą chromatografii na żywicy jonowymiennej.
Oczyszczanie z użyciem chromatografii powinowactwa przeprowadzono w następujący sposób. Thimerosal dodano do stężonego roztworu HF MAb do stężenia 0,02%. Roztwór dostosowano do 1,5 M
PL 204 011 B1 glicyny, 3,0 M NaCl o pH 9,0, poprzez dodanie 3,0 M glicyny a następnie krystalicznego NaCl. Białko A wykazuje słabe wiązanie Ab, zaś dodatek NaCl i glicyny zwiększa oddziaływanie hydrofobowe, aby ułatwić wiązanie Ab. Roztwór klarowano przez filtrację. Sklarowaną stężoną HF MAb nakładano na kolumnę z białkiem A immobilizowanym na agarozie. Związane MAb przemyto buforem używanym do równoważenia kolumny, którego przybliżony skład był następujący: 1,5 M glicyny, 3,0 M NaCl, 0,02 M EDTA i pH 9,0. MAb eluowano buforem o składzie 0,1 M cytrynianu sodu, 0,15 M NaCl o pH 3. Kolumnę z białkiem A regenerowano poprzez przemycie 3,0 M NaSCN, 0,03 M TRIS o pH 8,5 i powtórnie poddano równoważeniu. Eluowany pik MAb zebrano w oparciu o profil absorbancji przy 280 nm. Pik MAb eluowany cytrynianem natychmiast zobojętniono przez zebranie do buforu o przybliżonym składzie: 1,5 M TRIS-HCl o pH 9,0. Po użyciu białko A na kolumnie zostało rozpakowane i przechowane w zamkniętych pojemnikach w temperaturze 2-8°C w około 0,02% timerosalu jako buforze do przechowywania.
MAb 354 poddano następnie diafiltracji wobec buforu. Diafiltrację kontynuowano do momentu, gdy przewodność oraz pH były podobne do wartości dla buforu o składzie: 0,03 M TRIS, 0,05 M NaCl i pH 8,5.
MAb nakładano następnie na kolumnę do chromatografii jonowymiennej zawierającej podłoże agarozowe DEAE-FAST FLOW™ i przemywano buforem o przybliżonym składzie: 0,03 M TRIS, 0,0 5 M
NaCl o pH 8,5. Wyeluowany pik MAb zebrano w oparciu o profil absorbancji przy 280 nm.
MAb filtrowano (0,2 μm) do odkażonych zamykanych pojemników i przechowywano poniżej -40°C.
Plazminogen uzyskano z Fluka (Szwajcaria). Acetonitryl o jakości do HPLC uzyskano z Burdick & Jackson (Muskogon, MI) a kwas trifluorooctowy (TFA) z Pierce (Rockford, IL). Wodę do fazy ruchomej w HPLC i roztworów próbek oczyszczono systemem MILLI-Q z Millipore (Milford, MA). Wszystkie inne związki chemiczne były jakości reagentów z Sigma (St. Louis, MO).
Metody
Oczyszczanie CHO-PA
CHO-PA izolowano z cieczy hodowlanej komórek CHO poprzez chromatografię powinowactwa a następnie immunoabsorbcję. Żywicę Lysine hyper D z BioSepra (Paryż, Francja) stosowano do chromatografii powinowactwa, ponieważ lizyna łączy się z regionem kringle 2 aktywatorów plazminogenu (Cleary i wsp., Biochem. 28,1884-1890 (1989). Immunoabsorpcję przeprowadzono przy użyciu specyficznego przeciwciała monoklonalnego #354 (MAb#354). MAb#354 sprzęgano z aktywowanym CNBr żelem SEPHAROSE 4B™ zgodnie z instrukcją sprzedawcy (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Około 10 mg MAb#354 sprzęgano na ml aktywowanego CNBr żelu SEPHAROSE 4B. Po sprzęganiu upakowano kolumnę MAb#354-SEPHAROSE 4B.
Ciecz z hodowli komórek CHO zawierającą wydzielane CHO-PA nałożono na kolumnę powinowactwa do lizyny równoważoną wstępnie buforem równoważącym zawierającym 50 mM fosforanu sodu i 0,01% detergent POLYSORBATE 80™ o pH 7,5. Po nałożeniu, kolumnę powinowactwa do lizyny trzykrotnie przemyto: pierwszy raz buforem równoważącym, następnie buforem zawierającym 40 mM TRIS, 800 mM NaCl i 0,008% POLISORBATE 80™ o pH 8,0 i na końcu buforem równoważącym. CHO-PA następnie eluowano z kolumny powinowactwa do lizyny buforem zawierającym 50 mM fosforanu sodu, 200 mM L-argininy i 0,01% POLISORBATE 80™ o pH 7,5. Po równoważeniu fizjologicznym roztworem soli buforowanym fosforanem (PBS, 8 g/l NaCl 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l Na2HPO4 i 0,24 g/l KH2PO4 o pH 7,4) na kolumnę MAb#354-SEPHAROSE™ nałożono pulę elucyjną z kolumny powinowactwa do lizyny. Po nałożeniu kolumnę przemyto buforem zawierającym 9,5 mM Na2HPO4, 1 M NaCl i 5% glikolu propylenowego (objętościowo) o pH 7,4. Związany CHO-PA eluowano z kolumny 0,2 M glicyną - HCl o pH 2,5. Elucję monitorowano spektrofotometrycznie przy 280 nm i frakcje zawierające CHO-PA zobojętniano 0,14 objętościami 1,5 M fosforanu argininy (pH 8,0) bezpośrednio po zebraniu. Tożsamość oraz czystość eluowanego CHO-PA potwierdzono z użyciem SDS-PAGE i analizy sekwencji aminokwasowych.
Traktowanie DTT/ mocznikiem
Roztwór zawierający aktywator lub aktywatory plazminogenu rozcieńczono 1:1 (objętościowo) buforem denaturującym (8 M mocznik, 0,5 M TRIS i 3,2 mM EDTA o pH 8,4).
Ditiotreiotol (DTT) dodano z 1 M roztworu wyjściowego do końcowego stężenia 20 mM, a mieszaninę inkubowano w 37°C przez 30 min.
Traktowanie plazminą
Roztwór zawierający aktywator lub aktywatory plazminogenu rozcieńczono buforem rozcieńczającym (125 mM Na2HPO4, 200 mM argininy, i 0,01% NaN3 o pH 7,5). Dodano jedną setną (wagowo) plazminogenu i mieszaninę inkubowano w 37°C przez 30 minut.
Test HPLC z odwróconą fazą na aktywatory plazminogenu
PL 204 011 B1
Test przeprowadzono przy użyciu systemu Hewlett-Packard 1090 M. HPLC (Hewlett Packard,
Avondale, PA), 4,6 mm x 250 mm, o wielkości cząstek 5 μm, porach żywicy 300 A, na kolumnie Zorbax SB-C8 (Mac-Mod, Chadds Ford, PA). Kolumnę równoważono przez co najmniej 15 minut przed wstrzyknięciem próbki. Początkowy skład fazy ruchomej wynosił 70/ 30/ 0,1 (objętościowo) woda/ acetonitryl/ TFA. Po 5 minutach początkowego wstrzymania zastosowano liniowy gradient przez 80 minut (dla figury 1 i 2) i przez 60 minut (dla figury 3) do 50/ 50 / 0,1 (objętościowo) woda/ acetonitryl/ TFA. Bezpośrednio po gradiencie kolumnę regenerowano przez 10 minut przy użyciu 100/ 0,1 (objętościowo) acetonitryl/ TFA. Kompozycję następnie przenoszono z powrotem do początkowych warunków w czasie 5 minut, a układ równoważono ponownie do następnego wstrzyknięcia. Objętość wstrzyknięcia wynosiła 250 ml, a szybkość przepływu 1 ml/ min. Chromatografię prowadzono w 40°C. Fluoroscencję mierzono przy użyciu programowalnego fluoroscencyjnego detektora Hewlett-Packard 1046A (Ex = 275 i Em = 340 nm). Chromatogramy nagrano i analizowano za pomocą programu CHEMSTATIONTM Hewlett- Packard.
Wyniki i dyskusja
Z powodu wysokiej homologii sekwencyjnej, ACTIVASE®(r-tPA), TNK-tPA oraz CHO-PA mają wysoce podobne właściwości biochemiczno/biofizyczne. Analityczne oraz preparatywne metody zdolne do rozdzielenia tych trzech aktywatorów plazminogenu lub zdolne do rozdzielenia tPA od CHO-PA lub TNK-tPA od CHO-PA są konieczne do opracowania sposobu odzyskiwania oraz do określenia czystości każdej z tych cząsteczek do badań klinicznych i produkcji komercyjnej. Opisano tutaj prostą metodę HPLC z odwróconą fazą, która osiąga te cele.
Z płytkim gradientem wynoszącym około 0,25% acetonitrylu na minutę i bez obecności proteazy lub czynników denaturujących/ redukujących HPLC z odwróconą fazą nie była zdolna do oddzielenia natywnej formy r-tPA od natywnego CHO-PA (figura 1). Jednakże natywną formę TNK-tPA oddzielono w tych warunkach bardzo dobrze zarówno od natywnego r-tPA, jak i od CHO-PA. Następnie traktowanie DTT/ mocznikiem przeprowadzono w celu zredukowania wiązań disiarczkowych i denaturcji białek. W przypadku wszystkich tych trzech białek, wiązanie peptydowe pomiędzy Arg275 a Ile276 jest bardzo wrażliwe na trawienie proteazą. Wraz z upływem czasu wrażliwość ta prowadzi do heterogenności r-tPA, TNK-tPA i CHO-PA w roztworze. Niewielka ilość formy jednołańcuchowej jest przekształcana w formę dwułańcuchową poprzez trawienie proteazą. Traktowanie DTT/mocznikiem redukuje wiązanie disiarczkowe pomiędzy Cys264 a Cys395, które utrzymuje formę dwułańcuchową cząsteczki, powodując dysocjację cząsteczki na dwa fragmenty (fragment kringle oraz fragment proteazowy).
Figura 2 pokazuje, że w tym samym gradiencie, HPLC z odwróconą fazą jest zdolna do rozdzielenia formy jednołańcuchowej każdej z tych trzech cząsteczek trombolitycznych od siebie po traktowaniu DTT/ mocznikiem. Wszystkie te trzy białka wykazywały podobne profile elucji, przy czym fragment kringle z formy dwułańcuchowej eluuje jako pierwszy, jako drugi eluuje z formy jednołańcuchowej a fragment proteazowy z formy dwułańcuchowej eluuje jako ostatni. Odpowiednie fragmenty proteazowe z tych trzech aktywatorów plazminogenu oddzielono także dobrze od siebie, podczas gdy fragmenty kringle dla tych trzech cząsteczek nie były dobrze oddzielone. W konsekwencji sposób ten może być stosowany do wykrywania i oceny ilościowej fragmentacji formy jednołańcuchowej w formę dwułańcuchową aktywatorów plazminogenu.
Heterogenność zaobserwowana w profilach r-tPA, TNK-tPA oraz CHO-PA (figura 2) czyni ocenę ilościową tych cząsteczek bardzo trudną, zwłaszcza gdy próbuje się ocenić ilościowo każdą z tych cząsteczek w mieszaninie r-tPA, TNK-tPA i CHO-PA. Aby wyeliminować heterogenność związaną z proteolizą, wszystkie formy jednołańcuchowe przekształcano w formy dwułańcuchowe przez inkubację z plazminogenem. W naturalnym systemie fibrynolitycznym plazminogen jest substratem aktywatora plazminogenu. r-tPA, TNK-tPA i CHO-PA wykazują aktywność enzymatyczną trawienia wiązania peptydowego Arg560-Val561 plazminogenu. Takie trawienie przekształca plazminogen w jego aktywną formę, plazminę. Plazmina to proteaza serynowa o niskiej specyficzności i zdolności do trawienia wiązania peptydowego Arg275-Ile276 w r-tPA, TNK-tPA i CHO-PA. W wyniku tego inkubacja z plazminogenem przekształca formy jednołańcuchowe tych trzech aktywatorów plazminogenu w formy dwułańcuchowe.
Po traktowaniu plazminą, próbki traktowano DTT/ mocznikiem aby zredukować wiązania disiarczkowe i przez to zdysocjować dwułańcuchową formę cząsteczki w dwa oddzielne fragmenty. Figura 3 pokazuje profile HPLC z odwróconą fazą dla traktowanych plazminą i DTT/ mocznikiem aktywatorów plazminogenu. Odpowiednie fragmenty proteazowe tych trzech białek oddzielono od siebie, podczas gdy fragmentów kringle tych trzech cząsteczek nie oddzielono. Tak więc fragment proteazowy użyto do integracji i oceny ilościowej każdego aktywatora plazminogenu. Zarówno w przypadku r-tPA, jak i TNK-tPA, fragmenty kringle z typu I i typu II izozymów były dobrze oddzielone. W wyniku
PL 204 011 B1 tego sposób ten także użyteczny do oceny ilościowej stosunku typu I do typu II zarówno r-tPA, jak i TNK-tPA.
Dostępność tego sposobu HPLC z odwróconą fazą wysoce ułatwia rozwój procesu wytwarzania. Stosowano go do oceny wpływu różnych warunków fermentacji na jakość produktu w odniesieniu do integralności produktu (tj. procentu formy jednołańcuchowej) i stosunku izozymów typu I i typu II. Był on także stosowany do ułatwiania procesu oczyszczania i zapewniania zgodności pomiędzy poszczególnymi partiami produkcyjnymi. Wszystkie te zastosowania przedstawiają kluczową rolę metod analitycznych i komercyjnych w opracowywaniu nowych środków farmaceutycznych.
<110> Χυ, Yuan <l20> Sposób monitorowania sposobu oczyszczania przez usuwanie aktywatorów plazminogenu z próbki <130> P1788R1IL <140> US 09/703,695 <141> 2001-11-03 <1SO> US 60/163,607 <151> 1999-11-04 <160> 3 <210> 1 <211> 4 <212> prt ’ <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> Sekwencja częściowa <400> 1
Lys His Arg Arg <210> 2 <211> 4 <212> prt <213> Artificial sequence <220>
<223> Partia! Sequence. <400> 2
Ala Ala Ala Ala <210> 3 <21L> 527 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
| Ser | Tyr | Gin | Val | ile | cys | Arg | Asp | Glu | Lys | Thr | Gin | Met | Ile | Tyr |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Gin | Gin | His | Gin | ser 20 | Trp | Leu | Arg | Pro | val 25 | Leu | Arg | ser | ASfl | %r§ |
| val | Glu | Tyr | cys | Trp | cys | Asn | ser | Gly | Arg | Ala | Gin | Cys | His | Ser |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| val | pro | Val | Lys | ser 50 | Cys | ser | Glu | Pro | Arg 55 | cys | Phe | Asn | Gly | Gly 60 |
| Thr | cys | Gin | Gin | Ala | Leu | Tyr | Phe | Ser | ASp | Phe | val | Cys | Gl π | cys |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Pro | Glu | Gly | Phe | Ala | Gly | Lys | cys | Cys | Gl U | ile | Asp | Thr | Arg | Ala |
| 80 | 85 | 90 |
PL 204 011 B1
| Thr cys Tyr Glu Asp Gin Gly Ile Ser 95 | Tyr 100 Asn 115 | Arg Trp | Gly Asn | Thr Ser | Trp Ser | Ser 105 'Ala 120 | ||||||||
| Thr | Ala | Glu | Ser | Gly 110 | Ala | Glu Cys Thr | ||||||||
| Leu | Ala | Gin | Lys | Pro | Tyr | ser | Gly | Arg | Arg | Pro | ASp | Ala | Ile | Arg |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Leu | Gly | Leu | Gly | Asn 140 | His | Asn | Tyr | cys | Arg 145 | Asn | Pro | Asp | Arg | ASP 150 |
| Ser | tys | Pro | Trp | Cys | Tyr | va1 | Phe | Lys | Ala | Gly | Lys | Tyr | Ser | Ser |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| Glu | Phe | cys | ser | Thr 170 | Pro | Ala | cys | ser | Glu 175 | Gly | Asn | ser | ASP | |
| Tyr | Phe | Gly | Asn | Gly | Ser | Ala | Tyr | Arg | Gly | Thr | J-lis | ser | Leu | Thr |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Gl lt | Ser | Gly | Ala | Ser | Cys | Leu | pro | Trp | Α5Π | ser | Met | ile | Leu | rle |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Gly | Lys | val | Tyr | Thr | Ala | Gin | Asn | ΡΓΟ | Ser | Ala | Gin | Ala | Leu | Gly |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| Leu | Gly | Lys | His | Asn | Tyr | cys | Arg | Asn | Pro | ASP | Gly | ASp | Al a | Lys |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Pro | Trp | cys | His | va1 245 | Leu | Lys | Α5Π | Arg | Arg 250 | Leu | Thr | Trp | Gl u | Tyr 255 |
| Cys | ASp | val | Pro | ser | Cys | ser | Thr | cys | Gly | Leu | Arg | Gin | Tyr | ser |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| Gin | Pro | Gin | Phe | Arg | lic | Lys | Gly | Gly | Leu | Phe | Ala | ASp | Π e | Ala |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Ser | Hi 5 | pro | Trp | Gin | Ala | Ala | ile | Phe | Ala | Lys | His | Arg | Arg | Ser |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| Pro | Gly | Glu | Arg | phe | Leu | cys | Gly | Gly | Ile | Leu | ile | Ser | Ser | Cys |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Trp | Ile | Leu | Ser | Ala | Ala | His | cys | Phe | Gl n | Gl u | Arg | Phe | Pro | Pro |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| Hi s | His | Leu | Thr | val | Ile | Leu | Gly | Arg | Thr | Tyr | Arg | va! | val | pro |
| 33S | 340 | 345 | ||||||||||||
| Gly | Glu | GlU | Gl u | Gin | Lys | Phe | Glu | val | GlU | Lys | Tyr | ile | val | His |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Lys | Glu | phe | Asp | ASO | ASP | Thr | Tyr | Asp | Asn | ASO | ile | Ala | Leu | l«u |
| 365 | 370 | • | 375 | |||||||||||
| Gin | Leu | Lys | ser | ASp | Ser | ser | Arg | cys | Ala | Gin | Glu | ser | ser | Val |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| val | Arg | Thr | va1 | cys | Leu | pro | Pro | Al a | Asp | Leu | Gin | Leu | Pro | A3p |
| 395 | 400 | 405 |
PL 204 011 B1
| Trp | Thr | Glu | Cys | Glu | Leu | ser | Gly | Tyr | Gly | Lys | His | Glu | Ala | Leu |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||||
| ser | Pro | Phe | Tyr | ser | Glu | Arg | Leu | Lys | Glu | Ala | His | val | Arg | Leu |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| Tyr | Pro | ser | Ser | Arg | Cys | Thr | Ser | Gin | His | Leu | Leu | Asn | Arg | Thr |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||
| val | Thr | ASp | Asn | Met | Leu | cys | Ala | Gly | ASp | Thr | Arg | ser | Gly | Gly |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||
| pro | Gin | Ala | Asn | Leu | His | Asp | Ala | Cys | Gin | Gly | Asp | Ser | Gly | Gly |
| 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| pro | Leu | val | Cys | Leu | Asn | ASp | Gly | Arg | Met | Thr | Leu | val | Gly | Ile |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||
| ile | ser | Trp | Gly | Leu | Gly | Cys | Gly | Gin | Lys | Asp | val | Pro | Gly | Val |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||
| Tyr | Thr | Lys | val | Thr | Asn | Tyr | Leu | Asp | Trp | Ile | Arg | Asp | Asn | Met |
| 515 | 520 | 525 |
Arg pro
Claims (9)
1. Sposób monitorowania sposobu oczyszczania polegającego na usuwaniu aktywatora plazminogenu (PA) endogennego dla komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) z próbki zawierającej ludzki tPA dzikiego typu (SEQ ID NO: 3) lub cząsteczkę tPA, w której Thr103 z ludzkiego tPA dzikiego typu (SEQ ID NO: 3) jest zmieniona na Asn, Asn 117 z ludzkiego tPA (SEQ ID NO: 3) jest zmieniona na Gln, a Lys-His-Arg-Arg (SEQ ID NO: 1 296-299) z ludzkiego tPA dzikiego typu (SEQ ID NO: 3) jest zmieniona na Ala-Ala-Ala-Ala (SEQ ID NO: 2) (TNK-tPA), w którym
a) inkubuje się próbkę z proteazą, która specyficznie tnie wiązanie Arg275 -Ile276 ludzkiego tPA typu dzikiego lub TNK-tPA;
b) inkubuje się próbkę z etapu a) z czynnikiem denaturującym wybranym spośród mocznika lub guanidyny i czynnikiem redukującym wybranym spośród ditiotreitolu lub 2-merkaptoetanolu w celu redukcji wiązań disiarczkowych ludzkiego tPA dzikiego typu lub TNK-tPA; i
c) poddaje się próbkę etapowi wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą, przy czym przecięty proteazą fragment PA endogennego dla komórek CHO eluuje się przed przeciętym proteazą fragmentem tPA dzikiego typu lub TNK-PA.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako proteazę stosuje się plazminogen.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako ludzki tPA stosuje się tPA o natywnej sekwencji.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako tPA stosuje się TNK-tPA.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed inkubacją próbkę rozcieńcza się w buforze do trawienia.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się bufor o pH od około 7 do 8.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako bufor stosuje się bufor fosforanowy.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się bufor zawierający ponadto argininę.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap chromatografii przeprowadza się przez elucję rozpuszczalnikiem zawierającym acetonitryl w gradiencie.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16360799P | 1999-11-04 | 1999-11-04 | |
| PCT/US2000/030252 WO2001032915A2 (en) | 1999-11-04 | 2000-11-01 | Reversed-phase hplc assay for plasminogen activators |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL355389A1 PL355389A1 (pl) | 2004-04-19 |
| PL204011B1 true PL204011B1 (pl) | 2009-12-31 |
Family
ID=22590762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL355389A PL204011B1 (pl) | 1999-11-04 | 2000-11-01 | Sposób monitorowania sposobu oczyszczania przez usuwanie aktywatora plazminogenu z próbki |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6593097B1 (pl) |
| EP (1) | EP1226269B1 (pl) |
| JP (1) | JP4659320B2 (pl) |
| KR (1) | KR100649043B1 (pl) |
| CN (1) | CN1167808C (pl) |
| AT (1) | ATE243263T1 (pl) |
| AU (1) | AU781023B2 (pl) |
| BR (1) | BRPI0015283B8 (pl) |
| CA (1) | CA2384756C (pl) |
| CZ (1) | CZ302023B6 (pl) |
| DE (1) | DE60003449T2 (pl) |
| DK (1) | DK1226269T3 (pl) |
| ES (1) | ES2200973T3 (pl) |
| HK (1) | HK1046158B (pl) |
| HU (1) | HU226202B1 (pl) |
| IL (1) | IL149006A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA02004401A (pl) |
| NO (1) | NO329876B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ518187A (pl) |
| PL (1) | PL204011B1 (pl) |
| PT (1) | PT1226269E (pl) |
| SI (1) | SI1226269T1 (pl) |
| WO (1) | WO2001032915A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA200202687B (pl) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2210948A3 (en) | 1999-12-10 | 2010-10-06 | Life Technologies Corporation | Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning |
| AU2002227153B2 (en) | 2000-12-08 | 2008-01-24 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US6972327B1 (en) * | 2001-05-08 | 2005-12-06 | Immunex Corporation | Regeneration of chromatography material |
| EP1885488B1 (en) * | 2005-05-24 | 2015-07-08 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | Regeneration of a chromatography matrix |
| KR100701265B1 (ko) * | 2006-01-16 | 2007-04-02 | 대한민국 | 재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 발현벡터 및 플라스미노겐 활성인자를 소변으로 분비하는 형질전환돼지 생산방법 |
| JP5386354B2 (ja) * | 2006-09-08 | 2014-01-15 | ワイス・エルエルシー | アフィニティークロマトグラフィーを使用するタンパク質精製におけるアルギニン洗浄 |
| EP2089710B1 (en) * | 2006-10-27 | 2014-10-01 | Janssen Pharmaceutica NV | A method for pharmacologically profiling compounds |
| CN101539550B (zh) * | 2009-04-28 | 2012-05-23 | 李绍平 | 用于多糖的定性与定量分析方法 |
| EP3592858B1 (en) | 2017-03-09 | 2024-06-12 | Universität des Saarlandes | Means and methods for lignin pyrolysis |
| CN108333281A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-07-27 | 吉林大学 | 一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法 |
| CN108918749B (zh) * | 2018-07-17 | 2020-05-05 | 北京赛升药业股份有限公司 | 一种蛇毒纤溶酶的反相hplc检测方法 |
| CN114426962B (zh) * | 2021-12-21 | 2024-06-18 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | t-PA纯化方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI831484L (fi) | 1982-05-05 | 1983-11-06 | Genentech Inc | Plasminogen aktivator foer maenskovaevnad |
| US4766075A (en) | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| US4777043A (en) * | 1985-12-17 | 1988-10-11 | Genentech, Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
| US5120535A (en) * | 1986-11-26 | 1992-06-09 | Oncogen | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity |
| US5411864A (en) * | 1987-11-05 | 1995-05-02 | Genentech, Inc. | Method of purifying recombinant proteins from corresponding host cell proteins |
| GB8919803D0 (en) * | 1989-09-01 | 1989-10-18 | Ciba Geigy | Pharmaceutical compositions |
| JP3559559B2 (ja) | 1992-06-03 | 2004-09-02 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 向上した治療特性を有する組織プラスミノーゲン活性化因子グリコシル化変異体 |
| US5753702A (en) * | 1996-05-22 | 1998-05-19 | University Of Vermont | Arachidonic acid metabolite, 16-hete |
-
2000
- 2000-11-01 NZ NZ518187A patent/NZ518187A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-11-01 AU AU15816/01A patent/AU781023B2/en not_active Expired
- 2000-11-01 DE DE60003449T patent/DE60003449T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 PL PL355389A patent/PL204011B1/pl unknown
- 2000-11-01 IL IL14900600A patent/IL149006A0/xx active IP Right Grant
- 2000-11-01 EP EP00978343A patent/EP1226269B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 US US09/703,695 patent/US6593097B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 HU HU0202973A patent/HU226202B1/hu unknown
- 2000-11-01 CA CA2384756A patent/CA2384756C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 PT PT00978343T patent/PT1226269E/pt unknown
- 2000-11-01 CN CNB008153434A patent/CN1167808C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 MX MXPA02004401A patent/MXPA02004401A/es active IP Right Grant
- 2000-11-01 SI SI200030178T patent/SI1226269T1/xx unknown
- 2000-11-01 CZ CZ20021196A patent/CZ302023B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-11-01 AT AT00978343T patent/ATE243263T1/de active
- 2000-11-01 BR BRPI0015283 patent/BRPI0015283B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-11-01 WO PCT/US2000/030252 patent/WO2001032915A2/en active IP Right Grant
- 2000-11-01 ES ES00978343T patent/ES2200973T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 JP JP2001535595A patent/JP4659320B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 DK DK00978343T patent/DK1226269T3/da active
- 2000-11-01 KR KR1020027005727A patent/KR100649043B1/ko active IP Right Grant
-
2002
- 2002-04-05 ZA ZA200202687A patent/ZA200202687B/en unknown
- 2002-05-03 NO NO20022122A patent/NO329876B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-10-28 HK HK02107782.5A patent/HK1046158B/zh unknown
-
2003
- 2003-05-21 US US10/443,701 patent/US6828118B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Parekh et al. | Cell-type-specific and site-specific N-glycosylation of type I and type II human tissue plasminogen activator | |
| McMullen et al. | Amino acid sequence of the heavy chain of human alpha-factor XIIa (activated Hageman factor). | |
| Wiman et al. | Structural Relationship between “Glutamic Acid” and “Lysine” Forms of Human Plasminogen and Their Interaction with the NH2‐Terminal Activation Peptide as Studied by Affinity Chromatography | |
| EP1226269B1 (en) | Assay | |
| Winkler et al. | Purification and characterization of recombinant single-chain urokinase produced in Escherichia coli | |
| Vivas-Ruiz et al. | Coagulant thrombin-like enzyme (barnettobin) from Bothrops barnetti venom: molecular sequence analysis of its cDNA and biochemical properties | |
| Kohno et al. | Kidney plasminogen activator: a precursor form of human urokinase with high fibrin affinity | |
| Vehar et al. | Characterization studies on human melanoma cell tissue plasminogen activator | |
| Little et al. | Functional properties of carbohydrate-depleted tissue plasminogen activator | |
| Xiuxia et al. | Purification and biochemical characterization of F IIa, a fibrinolytic enzyme from Agkistrodon acutus venom | |
| Nguyen et al. | Stability characterization and formulation development of alteplase, a recombinant tissue plasminogen activator | |
| Wiman et al. | Amino‐Acid Sequence of the Cyanogen‐Bromide Fragment from Human Plasminogen that Forms the Linkage between the Plasmin Chains | |
| Samel et al. | Metalloproteinase with factor X activating and fibrinogenolytic activities from Vipera berus berus venom | |
| Marcotte et al. | Characterization of a metalloprotease which cleaves with high site-specificity the Glu (143)-Leu (144) bond of urokinase | |
| RU2112528C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДЕСТАБИЛАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕГО ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ, ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЙ, ЭНДО- И ЭКЗО- ε(γ GLY)-LYS-ИЗОПЕПТИДАЗНОЙ И АМИДОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ | |
| Lindberg et al. | Cleavage of proenkephalin by a chromaffin granule processing enzyme | |
| Dawson et al. | Substitution of arginine 719 for glutamic acid in human plasminogen substantially reduces its affinity for streptokinase | |
| Pohl et al. | Tissue plasminogen activator mutants lacking the growth factor domain and the first kringle domain: I: DNA Constructions, Expression in Mammalian Cells, Protein Structure, Fibrin Affinity and Enzymatic Properties | |
| Dewerchin et al. | Characterisation of conjugates of thrombin-treated single chain urokinase-type plasminogen activator with a monoclonal antibody specific for crosslinked fibrin | |
| Li et al. | Biochemical properties of recombinant mutants of nonglycosylated single chain urokinase-type plasminogen activator | |
| WO1989009820A1 (en) | PURIFIED TYPE I AND TYPE II tPA | |
| Bezeaud et al. | Limited proteolysis of human α-thrombin by urokinase yields a non-clotting enzyme | |
| Shikata et al. | Intelligent peptide-mapping method for recombinant human tissue-type plasminogen activator by lysyl-endopeptidase digestion | |
| Pohl et al. | Porcine tissue plasminogen activator: Immunoaffinity purification, structural properties and glycosylation pattern | |
| Wilczyńska et al. | The Conformation Changes of the Finger Domain of Tissue Type Plasminogen Activator during the Activator-lnhibitor Reaction |