KR100649043B1 - 플라스미노겐 활성화제에 대한 역상 고성능 액체크로마토그래피 분석법 - Google Patents
플라스미노겐 활성화제에 대한 역상 고성능 액체크로마토그래피 분석법 Download PDFInfo
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Abstract
인간 tPA 또는 그의 변이체를 함유하는 시료를 인간 야생형 tPA의 Arg275-Ile276 결합을 특이적으로 절단할 수 있는 프로테아제, 및 이어서 인간 야생형 tPA의 디술피드 결합을 환원시키기에 효과적인 양의 변성제 및 환원제와 함께 인큐베이션하고, 시료에 역상 고성능 액체 크로마토그래피 단계를 수행하고, 크로마토그래피 단계로부터의 용출 프로파일을 그에 존재하는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포에 내생성인 플라스미노겐 활성화제 (PA)의 양에 대해 분석하는 것을 포함하는, 상기 시료로부터 CHO 세포에 내생성인 PA의 제거에 있어서 정제 방법의 효과를 모니터하는 방법이 개시된다.
역상 HPLC, 플라스미노겐 활성화제
Description
본 발명은 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산된 천연 서열 또는 그의 변이체를 갖는 재조합 인간 tPA의 시료에 존재하는 차이니스 햄스터 난소-생산된 tPA의 양을 측정하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
조직-형 플라스미노겐 활성화제 (tPA)는 응고혈액의 분해를 초래하는 일련의 사건에 관여하는 내생성 세린 프로테아제이다 (Astrup and Permin, Nature, 159, 681-682 (1947); Camiolo et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 138,277-280 (1971); Collen, J. Biol. Chem., 33, 77-86 (1987); Hoylaerts et al., J. Biol. Chem., 257, 2912-2919 (1982)). 악티바세 (ACTIVASE; 등록상표)는 급성 심근 경색 및 폐 색전증의 관리에 사용되는 인간 tPA의 재조합체 형태 (r-tPA)이다 (Grossbard, Pharm. Res., 4, 375-378 (1987)). 악티바세는 또한 최근 허혈성 발작의 치료에 승인되었다 (Smith et al., Acad. Emergency Medicine, 6(6), 618-25 (1999); Kwiatkowski et al., New Eng. J. Med., 340(23), 1781-1787 (1999)). 이것은 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 천연의 인간 tPA의 상보성 DNA (cDNA)를 발현함으로써 생산되는 당단백질이다. TNK-tPA는 CHO 세포에서 클로닝되고 발 현된 인간 tPA의 유전공학적으로 가공된 변이체이다 (Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA., 91, 3670-3674 (1994)). 부위-지시적 돌연변이가 인간 tPA의 세 특이 부위에 도입되어 TNK-tPA 변이체를 생성하였다. 이들은 Thr103이 Asn (T103N), Asn117이 Gln (N117Q), Lys-His-Arg-Arg 296-299가 Ala-Ala-Ala-Ala (KHRR296-299AAAA)로 된 것이다. tPA와 비교할 때, TNK-tPA는 시험관 조건에서 유사한 생물학적 활성, 플라스미노겐 활성화제 억제제에 대한 증가된 내성 및 강화된 피브린 특이성을 나타내며, 혈장으로부터 더욱 서서히 사라진다 (Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA., 91, 3670-3674 (1994); Thomas et al., Stroke, 25:10, 2072-2079 (1994); Benedict et al., Circulation, 92: 10, 3032-3040 (1995); Modi et al., Thromb Haemost, 79, 134-139 (1998)). 이것은 현재 r-tPA의 단일의 환약 투여 형태로 규제 승인을 기다리고 있다. CHO 세포는 CHO-PA로 불리우는 내생성 햄스터 tPA를 생합성한다. CHO-tPA는 응고 분해 분석법으로 측정하였을 때 인간 tPA와 유사한 섬유소용해 활성을 갖는다. CHO-PA의 아미노산 서열은 인간 tPA의 것과 80% 동일하다. 많은 치환은 Arg↔Lys, Glu↔Asp, Phe↔Thr, Val↔Ala, Ile↔Leu 또는 Thr↔Ser과 같이 반보존적이다. 소태아 키모트립신 구조를 기준으로 한 인간 tPA 프로테아제 영역의 모델을 사용하여 CHO-PA에서의 치환 모두가 사실상 단백질 표면 또는 그 근처에 편재한다는 것이 관찰되었다.
r-tPA, TNK-tPA 및 CHO-PA는 모두 17개의 디술피드 결합을 갖는 527 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩티드 사슬이다 (Nguyen and Carole, "Stability Characterization and Formulation Development of Altepase, a Recombinant Tissue Plasminogen Activator," in Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case Histories, Y. J. Wang, R. Pearlman, eds., (Plenum Press: New York, 1993), pp. 91-135). 세 단백질 모두 Arg275 및 Ile276 사이의 펩티드 결합이 프로테아제 절단에 특히 민감하다. 절단은 두 프래그먼트를 생성하며, 하나는 N-말단 275 아미노산으로 이루어지고, 다른 하나는 C-말단 252 아미노산으로 이루어진다. N-말단 사슬은 플라스미노겐 및 프로트롬빈에서 발견되는 크링클 부위와 상동인 부위를 함유하며, 따라서 종종 "크링클 프래그먼트"로 간주된다 (Nguyen and Carole, 상기 문헌; de Vos et al., Biochem., 31, 270-279 (1992)).
C-말단 사슬은 촉매 활성 부위를 함유하여, 따라서 일반적으로 "프로테아제 프래그먼트"로 간주된다 (Pennica et al., Nature, 301, 214-221 (1983). 절단된 두 사슬은 Cys264 및 Cys395 사이에 형성된 단일의 디술피드 결합에 의해 연결된다. 절단된 분자는 일반적으로 "단일 사슬 tPA"와 반대되게 "이중-사슬 tPA" 또는 온전한 형태로 간주된다.
r-tPA는 서열 Asn-X-Ser/Thr로 식별되는 N-연결 글라이코실화에 대한 4개의 잠재적인 부위를 함유한다 (Nguyen and Carole, 상기 문헌). 이들은 Asn117, Asn184, Asn218 및 Asn448이다. r-tPA는 타입 I 및 타입 II로 표시되는 두 글라이코실화 이소자임으로 존재한다. 타입 I r-tPA는 Asn117, Asn184 및 Asn448에서 글라이코실화되며, 반면 타입II r-tPA는 단지 Asn117 및 Asn448에서만 글라이코실화된다. Asn218
은 두 이소폼에서 글라이코실화되지 않는다. TNK-tPA는 글라이코실화 부위가 위치 117에서 103으로 효과적으로 이동된 Thr103이 Asn으로 및 Asn117이 Gln으로의 돌연변이인 것을 제외하고는 r-tPA와 동일한 글라이코실화 경향을 갖는다 (Keyt et al., 상기 문헌). CHO-PA의 글라이코실화 경향은 완전히 특성화되지 않았다 (Rijken and Collen, J. Biol. Chem., 256: 7035-7041 (1981)).
악티바세 (등록상표)는 급성 심근경색 및 폐 색전증의 관리에 사용되는 재조합체 형태의 인간 조직-형의 플라스미노겐 활성화제 (r-tPA)의 상품명이다. 악티바세 상품명의 tPA는 또한 허혈성 발작을 치료하는 데 승인되었다. 이것은 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 천연 인간 tPA에 대한 상보성 DNA (cDNA)를 발현함으로써 제조된다 (미국특허 제5,753,486호). TNK-tPA는 악티바세 (등록상표) r-tPA와 비교할 때 효능이 강화되고, 출혈 발생이 감소되는 r-tPA의 유전공학적으로 가공된 변이체이다. 이것은 세 부위-지시적 돌연변이 (T103N, N117Q 및 KHRR296-299AAAA)에 의해 생성되며, 또한 CHO 세포에서 클로닝되고 발현된다 (미국특허 제5,612,029호). CHO 세포는 CHO-PA로 불리우는 내생성 햄스터 tPA를 생합성한다. CHO-PA의 아미노산 서열은 r-tPA의 것과 고도의 상동성 (80% 동일성)을 갖는다. 모두 3개의 혈전용해 단백질이 주로 단백질 분해/가수분해 및 상이한 글라이코실화에 기인하여 이질적인 이소폼으로 존재한다.
CHO-PA로부터 인간 tPA를 정제하는 방법은 미국특허 제5,411,864호에서 설명 된다. 이 방법은 인간 tPA를 함유하는 유체를 해당 내생성 CHO-PA에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고, 인간 tPA를 회수하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 접촉 단계는 항체가 고정된 크로마토그래피 베드에 유체를 통과시키는 것을 포함한다.
재조합 DNA-유도된 단백질 약물의 개발은 단백질을 특성화하고(거나) 단백질 제조의 일관성을 입증하는데 사용될 수 있는 새로운 분석 방법의 도입에 의하여 촉진되었다. 펩티드 맵핑은 아미노산 서열을 모니터하는 중요한 방법이며, 작은 크기 내지 중간 크기의 단백질, 예를 들면 인슐린 및 인간 성장 호르몬에서의 작은 변화를 검출할 수 있다. 더욱 큰 단백질, 예를 들면 피브리노겐 (분자량 350,000) 또는 항체 (분자량 150,000)와 같은 이질적인 당단백질의 분석은 효소 분해에 의해 생성되는 펩티드 범위의 복잡함에 의하여 방해받는다. 이러한 복잡성으로 온-라인 자외선 검출이 조합된 단일의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 분리법이 제한된 용도로 사용되도록 한다.
종래의 HPLC와 상용성이 있는 상업적으로 시판되는 HPLC 및 전자분무 이온화 매스 스펙트로메트리 (LC-ES-MS) 시스템 조합의 출현으로 펩티드 맵핑의 능력이 크게 증가하였다 (Ling et al., Anal. Chem., 63: 2909-2915 (1991); Guzetta et al., Anal. Chem., 65: 2953-2962 (1993)). 인-소스 충돌-유도된 붕괴 (CID)와 조합된 LC-ES-MS가 N- 및 O-연결된 글라이코실화의 부위를 식별하기 위하여 효과적으로 사용되었다 (Carr et al., Protein Sci., 2: 183-196 (1993); Huddleston et al., Anal. Chem., 65: 877-884 (1993); Conboy and Henion, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 3: 804-814 (1992)). 그러나, 이러한 기술조차 가변적인 단백질 글라이코실화 및 중간 크기의 당단백질의 효소 분해에 의해 야기되는 많은 수의 매우 유사한 펩티드로부터 초래되는 불충분한 해상에 의해 제한된다. 따라서, 이러한 시료를 특성화하기 위한 직접적인 특이성을 갖는 범위의 기술을 사용하는 것이 필요하다.
흡혈 박쥐의 침샘으로부터 유래된 단일 사슬의 플라스미노겐 활성화제인 DSPAα1에 의해 예시된 것처럼 고성능 모세관 전기영동, HPLC, LC-ES-MS, 및 급속 매스 스펙트로메트리의 메트릭스 지지된 레이저 탈착 이온화 시간의 조합의 사용이 미분화 당단백질 시료의 효소분해의 특성화를 허용하는 지에 대해 조사되었다 (Apffel et al., J. Chromatography A, 717: 41-60 (1995)). 이들 네 기술은 당단백질을 조사하는데 매우 우수한 기술인 것으로 결론지워졌다. 그러나, 저자들은 이러한 방법의 능력을 개선하기 위하여 연구가 더 수행될 필요가 있으며, 방대한 탄수화물의 이질성 때문에 고-수율의 농축 단계가 필요할 것이라는 것을 인정한다.
상기 미국특허 제5,411,864호에서 보고된 것처럼, tPA에 대한 정제 절차가 수행된 후에 존재하는 CHO-PA의 상대적인 및 절대적인 양을 모니터할 기술에 대한 필요가 있다.
<발명의 요약>
따라서, 본원에서 3개의 혈전용해 분자, 즉 CHO-tPA, 천연 서열을 갖는 재조합 인간 tPA, 및 TNK-tPA의 분석을 위한 역상 HPLC 방법이 개발되었다. 본 방법은 CHO-PA로부터 인간 tPA 및(또는) TNK-tPA를 해상할 수 있는 능력을 가질 뿐 아니 라, 각 분자의 상이한 이소폼을 식별하고, 정량화할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 인간 tPA 또는 그의 변이체를 함유하는 시료를 인간 야생형 tPA의 Arg275-Ile276 결합을 특이적으로 절단할 수 있는 프로테아제, 및 이어서 인간 야생형 tPA의 디술피드 결합을 환원시키기에 효과적인 양의 변성제 및 환원제와 함께 인큐베이션하고, 시료에 역상 고성능 액체 크로마토그래피 단계를 수행하고, 크로마토그래피 단계로부터의 용출 프로파일을 그에 존재하는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포에 내생성인 플라스미노겐 활성화제 (PA)의 양에 대해 분석하는 것을 포함하는, 상기 시료로부터 CHO 세포에 내생성인 PA의 제거에 있어서 정제 방법의 효과를 모니터하는 방법을 제공한다.
도 1은 천연 r-tPA, TNK-tPA 및 CHO-PA의 역상 HPLC 분석을 나타내는 도.
도 2는 DTT/우레아 처리된 r-tPA, TNK-tPA 및 CHO-PA의 역상 HPLC 분석을 나타내는 도. 크로마토그래피에 앞서 플라스미노겐 활성화제에 DTT/우레아를 처리하였다.
도 3은 플라스민 및 DTT/우레아 처리된 r-tPA, TNK-tPA 및 CHO-PA의 역상 HPLC 분석을 나타내는 도. 크로마토그래피에 앞서 플라스미노겐 활성화제에 플라스민 처리에 이어 DTT/우레아 처리를 수행하였다.
정의
용어 "조직 플라스미노겐 활성화제" 및 "tPA"는 통상적으로 5개의 영역 (핑거, 성장 인자, 크링클-1, 크링클-2 및 프로테아제 영역)을 갖는 구조를 가지나, 혈전용해제로서의 기능을 갖는 한 더 작은 영역을 가지거나 그 영역중 일부가 반복될 수 있으며, 위치 117, 184 및 448에서 N-연결된 글라이코실화 부위를 보유하는 섬유소용해 활성을 갖는 인간의 외인성 (조직-형) 플라스미노겐 활성화제를 의미한다. 최소한 tPA는 플라스미노겐을 플라스민으로 전환할 수 있는 프로테아제 영역, 및 적어도 부분적으로 피브린 결합을 담당하는 것으로 생각되는 N-말단 부위로 이루어지며, 야생형 인간 tPA의 아미노산 위치 117, 184 및 448에 해당하는 위치에서 N-연결된 글라이코실화 부위를 보유한다. 이들 글라이코실화 부위의 보유는 재조합체 및 흑색종-유도된 야생형 tPA의 가변 부위 점유가 각각 "타입 I tPA" 및 "타입 II tPA"로 표시되는 두 개의 변이체의 생성을 초래한다는 사실에 기초한다. 타입 I tPA는 위치 117, 184 및 448에서 N-연결된 올리고사카라이드를 함유한다. 타입 II tPA는 위치 117 및 448에서 N-연결된 올리고사카라이드를 함유한다. 각 개인의 tPA의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 차이에 의해 입증된 것처럼 개인 사이에 천연의 대립적인 변이가 존재하며, 출현할 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "야생형 인간 조직 플라스미노겐 활성화제", "야생형 인간 tPA", "천연 인간 조직 플라스미노겐 활성화제" 및 "천연 인간 tPA" (여기서, "인간 tPA"는 약어로 "htPA"일 수 있음)은 천연-서열의 인간 tPA, 즉 1988년 8월 23일 허여된 미국특허 제4,766,075호에서 보고된 cDNA 서열에 의하여 코딩된 것을 의미한다. tPA 분자에서 아미노산 부위 수 및 위치는 미국특허 제4,766,075호에 따라 표지된다.
본원에서 사용된 tPA의 다양한 영역에 대한 참조는 상기 정의된 것으로 야생형 인간 tPA의 영역, 및 천연 인간 tPA 서열과 비교할 때 아미노산 변경을 갖는 인간 tPA, 또는 박쥐 조직 플라스미노겐 활성화제 (bat-PA)와 같은 다른 공급원으로부터의 (천연 또는 변이) tPA의 기능적으로 동일한 부분을 의미한다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "프로테아제 영역"은 야생형 인간 tPA의 성숙 형태의 아미노산 위치 264로부터 아미노산 위치 527로 연장하는 부위, 및 천연 인간 tPA 서열과 비교할 때 아미노산 변경을 갖는 인간 tPA, 또는 bat-PA와 같은 다른 공급원으로부터의 tPA의 기능적으로 동일한 부분을 의미한다.
본원에서 사용된 "tPA 변이체"는 기존 아미노산에 대하여 하나 이상의 아미노산 변화 또는 변형에 의해 천연 tPA와는 상이한 분자를 의미한다. TNK-tPA는 본원에서 바람직한 변이체이다. 목적하는 서열 변이를 수행하기 위한 천연 분자에서의 변화 또는 적절한 아미노산의 삽입에 의한 변경은 예를 들면 부위-지시적 돌연변이 또는 적절한 서열의 관련 단백질을 코딩하는 DNA와의 라이게이션과 같은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의하여 달성된다.
본원에서 사용된 "TNK-tPA"는 야생형 tPA의 Thr103이 Asn (T103N)으로, 야생형 tPA의 Asn117이 Gln (N117Q)로, 및 야생형 tPA의 Lys-His-Arg-Arg296-299가 Ala-Ala-Ala-Ala (KHRR296-299AAAA)로 변화된 tPA 분자를 의미한다. 이러한 TNK는 미국특허 제5,612,029호에서 더 설명된다.
용어 "차이니스 햄스터 난소 세포" 또는 "CHO 세포"는 예를 들면 1989년 8월 29일 간행된 EP117,159; 미국특허 제4,766,075호; 제4,853,330호; 제5,185,259호; 문헌 [Lubiniecki et al., in Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, Spier et al., eds. (1989), pp. 442-451]에서 설명된 차이니스 햄스터 난소 유래의 세포 또는 세포주뿐만 아니라 CHO/-DHFR (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), CHO-K1 DUX B11 (Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2495-2499 (1983); Urlaub and Chasin, 상기문헌) 및 dp12.CHO 세포 (1989년 3월 15일 간행된 EP307,247)와 같은 CHO 유도체를 의미한다. 바람직한 숙주 세포에는 CHO-K1 DUX B11 및 dp12.CHO 세포가 포함된다.
tPA의 대규모 생산을 위해 개발된 CHO 세포는 문헌 (Wiebe et al., in Large Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, ed., (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 147-160)에서 설명된 것처럼 MCB/작업 세포 은행 (WCB) 시스템에서 냉동으로 유지된다. 인간 tPA를 코딩하는 DNA로 형질감염된 DHFR- CHO-K1 세포를 버지니아주 매나사스의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁하였으며, 기탁번호 CCL 61로 입수가능하다. 또 다른 tPA-생산 CHO 세포주의 시료 (CHO 세포주 1-1515)는 ATCC 기탁번호 CRL 9606으로 기탁하였다. 후자의 세포주는 50 pg/세포/일에 달하는 인간 tPA 수준을 생성하는 것으로 보고되었다.
본원에서 사용된 "CHO 플라스미노겐 활성화제" 또는 "CHO-PA"는 CHO 세포에 의해 내생성으로 생산되는 플라스미노겐 활성화제를 의미한다. CHO 세포에 의해 발현되는 이러한 내생성 PA는 인간 야생형 tPA와는 다소 상이한 서열을 갖는다 (약 80% 상동성). CHO-PA는 조직-형 PA가 아니다.
본원에서 사용된 "프로테아제"는 인간 야생형 tPA의 Arg275-Ile276 결합을 특이적으로 절단할 수 있는 효소를 의미한다. 예에는 플라스민 (또는 플라스민으로 전환되는 플라스미노겐), 조직 칼리크레인 또는 인자 Xa뿐만 아니라 이러한 특이적인 제한된 단백질분해를 수행할 수 있는 임의의 트립신-유사 프로테아제가 포함된다. 적합한 프로테아제는 문헌 (Ichinosi et al., FEBS Letters, 175: 412-418 (1984))에서 설명된다. 본원에서 플라스민/플라스미노겐이 바람직하다.
본원에서 사용된 "변성/환원제" 또는 "변성제 및 환원제"는 인간 야생형 tPA의 디술피드 결합을 환원시키는 변성제 및 환원제의 배합물을 의미한다. 바람직하게는, 변성제는 구아니딘 또는 우레아이며, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT) 또는 2-메르캅토에탄올이다.
<발명을 수행하는 방식>
재조합체 생산 후, tPA 또는 tPA 변이체를 CHO 배양 배지로부터 분비된 단백질로서 또는 분비 신호없이 직접 발현되는 경우 숙주 세포 용해물로서 회수한다. 단백질로서 실질적으로 균질한 제조물을 수득하기 위하여 숙주세포 단백질로부터 tPA 또는 그의 변이체를 정제하는 것이 필요하다. 첫 번째 단계로서, 배양 배지 또는 용해물을 원심분리 또는 여과하여 입상의 세포 잔사를 제거한다.
그 후, 인간 tPA 또는 그의 변이체를 예를 들면 미국특허 제5,411,864호에서 설명된 것과 같은 면역친화 또는 이온 교환 컬럼상에서의 분획화; 에탄올 침전법; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전법; 또는 예를 들면 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 전기영동과 같은 기술에 의해 CHO-PA와 같은 해당 오염원인 내생성 단백질로부터 정제한다. 또한, 정제동안 단백질 분해를 억제하는 데 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF)와 같은 tPA 활성에 간섭하지 않는 프로테아제 억제제가 유용할 수 있으며, 출현하는 오염물질의 증가를 방지하기 위하여 항생물질이 포함될 수 있다. 당 분야의 숙련자는 천연 tPA에 적합한 정제 방법이 재조합 세포 배양에서 발현되는 tPA 또는 그의 변이체의 속성 변화에 대응하도록 변형을 필요로 할 수 있다는 것을 인정할 것이다.
바람직한 구현예에서, tPA 변이체가 생산되면, 그것은 분비되고, 상층액을 항-tPA 염소 다클론성 A6 항체에 연결된 유리 비드의 PBS-예비콘디셔닝된 컬럼 상에 통과시키고, 컬럼을 완충액으로 평형시킨 후, tPA 변이체를 용출한다.
본 발명은 이러한 정제 시스템에서 취한, CHO 세포에서 생산된 하나 이상의 형태의 인간 tPA를 함유하는 시료에서 천연 CHO-PA의 수준을 모니터 (정성 및 정량분석 포함)하는 것에 관한 것이다. 본 방법은 시료를, Arg275-Ile276 결합을 특이적으로 절단할 수 있는 프로테아제와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이 후, 프로테아제-처리된 시료를 인간 야생형 tPA의 디술피드 결합의 환원을 수행하기에 적절한 상대적 및 절대적 양의 변성제 및 환원제의 배합물과 인큐베이션한다. 변성제 및 환원제의 처리가 효소 활성의 손실을 초래하기 때문에 프로테아제와의 인 큐베이션이 먼저 일어난다.
인큐베이션 후, 시료에 역상 고성능 액체 크로마토그래피 단계를 수행하고, 존재하는 CHO 세포에 대해 내생성인 PA의 양에 대하여 크로마토그래피 단계로부터의 용출 프로파일을 분석한다. 바람직하게는 프로테아제는 플라스미노겐으로, 활성형인 플라스민으로 전환되며 인간 tPA는 천연-서열 tPA이고, tPA 변이체는 TNK-tPA이다.
프로테아제에 이어 변성/환원제의 연속적인 인큐베이션 단계는 통상적으로 약 30 내지 40 ℃, 더욱 바람직하게는 약 36 내지 38 ℃, 가장 바람직하게는 약 37 ℃의 온도에서 최소 약 15분, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 40분 동안 일어난다.
또한, 바람직하게는 인큐베이션 전에 시료를 분해 완충액으로 희석하며, 이것은 바람직하게는 약 7 내지 8의 pH를 가지며, 더욱 바람직하게는 pH 7.4 내지 7.6의 인산염 완충액이고, 더욱 바람직하게는 또한 아르기닌을 함유한다.
시료가 로딩되는 임의의 적합한 HPLC 컬럼이 예비 또는 분석 규모를 포함하여 본 발명의 목적에 이용될 수 있다. 상기 컬럼은 통상적으로 시료 주입에 앞서 약 15분 이상동안 평형된다. 컬럼 크기, 컬럼 물질, 유속, 용출 완충액, 구배 유형, 주입 부피, 및 컬럼의 입자 크기는 조사할 시료의 크기, 이동상 조성물 및 구배의 유형, 및 구별할 tPA의 형태에 따라 달라진다.
로딩 용매는 임의의 용매일 수 있으나, 바람직하게는 물, 아세토니트릴, 및 트리플루오로아세트산 (TFA)와 같은 아세토니트릴 기재 용매이다. 바람직하게는 컬럼은 약 4 내지 40 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 15 ㎛의 입자 직경, 및 약 100 내지 4000 Å, 더욱 바람직하게는 약 150 내지 350 Å의 공극 크기를 갖는 매질로 충진된 Zorbax C8, Vydac, 또는 Baker C-18 컬럼이다. 또한, 매질은 바람직하게는 C4, C8 또는 C18 알킬기를 가지며, 가장 바람직하게는 C8 실리카 매질이다. 바람직하게는 용출은 물, 아세토니트릴 및 TFA와 같은 아세토니트릴을 포함하는 용매를 사용하여 60 내지 100분의 구배 포맷, 바람직하게는 아세토니트릴의 상대적인 양이 용매에서 증가하는 선형 구배로 수행된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 약 0.25%의 아세토니트릴/분의 얕은 구배 경사 (shallow gradient ramp)가 사용된다.
본원의 순도에 대한 분석이 사용된 기술이 성공적으로 PA를 제거한다는 것을 가리키면, 임의의 다른 오염물질을 제거하는 것이 필요할 때 추가의 정제 단계가 사용될 수 있다. 본 기술이 허용되는 수준으로 CHO-PA를 성공적으로 제거하지 못한다면, 다른 정제 기구가 이용될 수 있으며, 그 기구가 얼마나 효과적인지를 측정하기 위하여 본 방법이 반복된다.
최종 정제 후, tPA 또는 그의 변이체는 제약상 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있으며, tPA 산물은 제약상 허용되는 담체와의 혼합물로 배합된다. 그러한 제형은 투여량 및 용도와 함께 문헌에 잘 설명되어 있다. 예를 들면, tPA 또는 그의 변이체는 심혈관 질환 또는 증상 및 발작을 앓고 있는 대상에게 비경구로 적합하게 투여된다.
하기 실시예는 본 발명을 수행하기 위하여 이제 공지된 한 구현예를 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들 실시예에 제한되는 것을 고려하는 것은 아니다. 모든 공개된 및 특허된 문헌 인용은 본원에 참고로서 설명적으로 도입된다.
<실시예 1>
재료
악티바세 (등록상표) 및 TNK-tPA는 CHO 세포로부터 정제된 형태로 제넨테크, 인크 (캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코)로부터 구입하였다. 또한, 예를 들면 악티바세 (등록상표) r-tPA의 경우 미국특허 제4,766,075호 및 제5,753,486호가, TNK-tPA의 경우 미국특허 제5,612,029호가 참조된다.
CHO-PA에 대한 단클론성 항체 #354는 미국특허 제5,411,864호에서 설명된 것처럼 제조하였다. 요약하면, 암컷 Balb/c 생쥐를 인간 tPA가 없는 숙주 세포로부터 정제된 CHO 플라스미노겐 활성화제가 실질적으로 풍부한 단백질 용액으로 12주 동안 면역화하였다. 각각 대략 30 ㎍으로 이루어진 5개의 주사액이 있다. 첫 번째 주사액은 완전 프로인트 보조제로 현탁하고, 경피 부위에 투여하였다. 두 번째 주사액은 1.5주 후에 불완전 프로인트 보조제로 현탁하고, 절반은 경피, 절반은 복강내로 투여하였다. 나머지 세 번의 주사액은 3, 6, 12 주에 인산염 완충된 식염수 (PBS)로 복강내 부위에 투여하였다.
면역화된 생쥐로부터 13주에 비장을 분리하고, 비장 세포를 문헌 (Fazekas et al., J. Immunol. Methods, 35: 1 (1980) and Lane, J. Immunol. Methods 81: 223 (1985))의 일반적인 절차를 사용하여 생쥐 골수종 세포주 NP3X63-Ag8.653과 융합하였다. 융합된 세포를 각각 96웰을 포함하는 10개의 미량역가 플레이트에 분배하였다. 각 웰을 두 개의 ELISA (효소-연결 면역흡착 분석법)의 상이한 반응성을 사용하여 특이 항체 생산에 대하여 스크리닝하였다. 한 ELISA는 특이적으로 CHO-PA에 대한 항체를 검출하고, 다른 하나는 재조합 인간 tPA와 교차 반응하는 항체를 검출하였다.
총 웰의 대략 5%가 단지 CHO-PA와만 반응성이 있고, 3%가 CHO-PA 및 인간 tPA와 반응하였다.
CHO-PA 특이 항체를 함유하는 웰로부터의 하이브리도마 세포를 제한 희석법으로 확장하여 클로닝하였다 (Oi and Herzenberg, "Immunoglobin-Producing Hybrid Cell Lines", p. 351-372, in Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell and Shiigi, eds. (W. H. Freeman and Co., 1980)). 하이브리도마 세포를 세포 배양하거나 생쥐에 하이브리도마 세포를 주입하여 복수 종양을 생산함으로써 다량의 특이 단클론성 항체를 생산하였다. MAb 354는 하나의 생성된 항체로, 고정될 때 단일 컬럼 통과에서 CHO-PA 수준을 약 100배 이상 저하시키며, 여러 상이한 고정 화학법 및 엄격한 세척 조건에 대해 안정하다.
MAb 354는 하기 기재된 절차를 사용하여 정제되며, 모든 단계는 실온에서 수행되었다. 농축은 다음과 같이 수행하였다. MAb 하이브리도마 현탁 배양 수확 유체 (HF)를 0.2 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. 배양 유체를 한외여과법 또는 이온-교환 수지 상의 크로마토그래피에 의해 농축하였다.
친화도 크로마토그래피는 다음과 같이 수행하였다. 티메로살을 농축된 MAb HF 용액에 대략 0.02%로 첨가하였다. 3.0 M의 글리신을 첨가하고, 이어서 결정성 NaCl을 첨가하여 용액을 대략 1.5 M 글리신, 3.0 M NaCl, pH 9.0으로 조정하였다. 단백질 A는 Ab에 약한 결합력을 가지며, 따라서 NaCl과 글리신의 첨가가 소수성 상호작용을 증가시켜 Ab 결합을 촉진한다. 용액을 여과법에 의해 정화하였다. 정화된 농축 MAb HF를 단백질 A가 아가로스에 고정된 컬럼에 적용하였다. 결합된 MAb를 컬럼을 평형시키기 위하여 사용된 대략 1.5 M 글리신, 3.0 M NaCl, 0.02 M EDTA, pH 9.0의 조성을 갖는 완충액으로 세척하였다. MAb는 0.1 M 시트르산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 3.0 완충액으로 용출시켰다. 단백질 A 컬럼을 3.0 M NaSCN, 0.03 M TRIS, pH 8.5로 세척하여 재생하고, 재평형시켰다. 280 nm에서 흡광도 프로파일을 기준으로 용출된 MAb 피크를 모았다. 시트르산염-용출된 MAb 피크를 대략 1.5 M TRIS-HCl, pH 9.0의 조성을 갖는 완충액에 모아 즉시 중화하였다. 사용 후, 단백질 A 컬럼을 풀어 2 내지 8 ℃의 밀봉된 용기에서 보관 완충액으로서 대략 0.02%의 티메로살에 보관하였다.
그 후, 354 MAb를 투석여과로 완충 교환하였다. 투석여과는 전도도 및 pH가 0.03 M TRIS, 0.05 M NaCl, pH 8.5 완충액의 경우의 값과 유사해질 때까지 진행하였다.
이어서, MAb를 DEAE-FAST FLOW (등록상표) 아가로스 지지체를 함유하는 음이온-교환 크로마토그래피 컬럼에 적용하고, 0.03 M TRIS, 0.05 M NaCl, pH 8.5 완충액으로 세척하였다. MAb를 대략 0.03 M TRIS, 0.15 M NaCl, pH 8.5의 조성을 갖는 완충액으로 단계 용출시켰다. 용출된 MAb 피크를 280 nm에서의 흡광도 프로파일을 기준으로 모았다.
MAb를 위생 밀봉성 용기로 여과 (0.2 ㎛)하고, -40 ℃ 미만에서 보관하였다.
플라스미노겐은 플루카 (스위스)에서 구입하였다. HPLC-등급의 아세토니트릴은 부르딕 앤드 잭슨 (미시간주 머스크곤)에서 구입하고, 트리플루오로아세트산 (TFA)는 피어스 (일리노이주 록포드)에서 구입하였다. HPLC 이동상 및 시료 용액용의 물은 밀리포아 (매사추세츠주 밀포드)의 MILLI-Q (등록상표) 시스템으로 정제하였다. 다른 모든 화학약품은 시그마 (미조리주 세인트루이스)의 시약 등급의 것이었다.
방법
CHO-PA의 정제
CHO-PA는 CHO 세포 배양액으로부터 친화도 크로마토그래피에 이어 면역흡착에 의해 단리하였다. 친화도 크로마토그래피의 경우 플라스미노겐 활성화제의 크링클 2 부위에 리신이 결합하는 바이오세페라 (프랑스 파리)의 리신 하이퍼 D 수지를 사용하였다 (Cleary et al., Biochem. 28, 1884-1890 (1989)). 면역흡착은 CHO-PA 특이 단클론성 항체 #354 (MAb#354)를 사용하여 수행하였다. MAb #354를 판매자의 절차 (뉴저지주 피스카터웨이의 파마시아 바이오텍)에 따라 CNBr-활성화된 세파로스 4B (등록상표) 겔에 커플링시켰다. CNBr-활성화된 세파로스 4B 겔의 1 ml당 약 10 mg의 MAb #354를 커플링시켰다. 커플링후, MAb #354-세파로스 4B (등록상표) 컬럼을 충진하였다.
분비된 CHO-PA를 함유하는 CHO 세포 배양 유체를 pH 7.5의 50 mM 인산나트륨 및 0.01% 폴리솔베이트 80 (등록상표) 디터전트를 함유하는 평형 완충액으로 예비평형된 리신-친화도 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 리신-친화도 컬럼을 먼저 평형 완충액에 이어 40 mM TRIS, 800 mM NaCl 및 0.008% 폴리솔베이트 80 (등록상표)를 함유하는 pH 8.0의 완충액, 마지막으로 평형 완충액으로 3회 세척하였다. 그 후, 50 mM 인산나트륨, 200 mM L-아르기닌 및 0.01% 폴리솔베이트 (등록상표)를 함유하는 pH 7.5의 완충액으로 리신-친화도 컬럼으로부터 CHO-PA를 용출시켰다. 인산염 완충된 식염수 (PBS, 8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4 및 0.24 g/L KH2PO4, pH 7.4)로 평형시킨 후, MAb #354-세파로스 (등록상표) 4B 컬럼에 리신-친화도 컬럼 용출액을 로딩하였다. 로딩 후, 9.5 mM Na2HP04, 1 M NaCl, 및 5% 프로필렌 글리콜 (v/v)을 함유하는 pH 7.4의 완충액으로 컬럼을 세척하였다. 결합된 CHO-PA는 pH 2.5의 0.2 M 글리신-HCl로 컬럼으로부터 용출시켰다. 용출은 280 nm에서 분광계로 모니터하고, CHO-PA 함유 분획을 모은 즉시 1.5M 아르기닌-인산염 (pH 8.0) 0.14 부피로 중화하였다. 용출된 CHO-PA의 특성과 순도를 SDS-PAGE 및 아미노산 서열 분석으로 확인하였다.
DTT/우레아 처리
플라스미노겐 활성화제를 함유하는 용액을 분해 완충액 (8 M 우레아, 0.5 M TRIS, 및 3.2 mM EDTA, pH 8.4)으로 1:1 (v/v) 희석하였다. 디티오트레이톨 (DTT)를 1 M 스톡용액으로부터 20 mM의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
플라스민 처리
플라스미노겐 활성화제를 함유하는 용액을 변성 완충액 (125 mM Na2HPO4, 200 mM 아르기닌, 및 0.01% NaN3, pH 7.5)으로 1:3 (v/v) 희석하였다. 플라스미노겐 1/100 (w/w)을 첨가하고, 혼합물을 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
플라스미노겐 활성화제에 대한 역상 HPLC 분석
분석은 4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛ 입자 크기, 300 Å의 공극 수지, Zorbax SB-C8 컬럼 (펜실베니아주 챠즈포드의 맥-모드)을 갖는 휴렛-패커드 1090M (등록상표) HPLC 시스템 (펜실베니아주 아본데일의 휴렛-패커드) 상에서 수행하였다. 시료 주입에 앞서 15 분 이상 동안 컬럼을 평형시켰다. 초기 이동상 조성물은 70/30/0.1 (v/v/v)의 물/아세토니트릴/TFA였다. 5 분간의 초기 유지 후에, 선형 구배를 80분 (도 1 및 도 2의 경우) 및 60분 (도 3의 경우)으로 50/50/0.1 (v/v/v)의 물/아세토니트릴/TFA로 수행하였다. 구배 직후에, 100/0.1 (v/v)의 아세토니트릴/TFA를 사용하여 10분 동안 컬럼을 재생하였다. 그 후, 5 분내에 조성을 원래의 조건으로 되돌리고 다음 주입물을 위하여 시스템을 재평형시켰다. 주입 부피는 250 ml이고, 유속은 1 ml/분이었다. 크로마토그래피는 40 ℃에서 수행하였다. 휴렛-패커드 1046A (등록상표) 프로그램된 형광 검출기 (Ex = 275 nm 및 Em = 340 nm)로 형광을 측정하였다. 휴렛-패커드 켐스테이션 (등록상표) 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램을 기록하고, 분석하였다.
결과 및 고찰
악티바세 (r-tPA), TNK-tPA 및 CHO-PA는 높은 서열 상동성 때문에, 매우 유사한 생화학적/생물리학적 특성을 갖는다. 회수 방법의 개발과 임상연구 및 상업 적인 생산의 경우 각 분자의 순도를 평가하기 위하여 이들 세 플라스미노겐 활성화제를 서로 해상할 수 있는, 또는 CHO-PA로부터 tPA 또는 CHO-PA로부터 TNK-tPA를 해상할 수 있는 분석 및 제조 방법이 필요하다. 이러한 목표를 달성하는 단순한 역상 HPLC 방법이 본원에서 설명된다.
분당 0.25% 아세토니트릴의 얕은 구배 경사를 사용하고, 프로테아제 또는 변성/환원제 없이, 역상 HPLC는 천연 CHO-PA로부터 r-tPA의 천연 형태를 분리할 수 없었다 (도 1). 그러나, 천연 형태의 TNK-tPA는 이들 조건하에서 천연 r-tPA 및 CHO-PA 모두로부터 매우 잘 해상되었다. 다음으로, 디술피드 결합을 환원시키고, 단백질을 변성시키기 위하여 DTT/우레아 처리가 수행되었다. 세 단백질 모두의 경우 Arg275 및 Ile276 사이의 펩티드 결합은 프로테아제 절단에 매우 민감하다. 시간이 지나면서 이러한 민감성은 용액중의 r-tPA, TNK-tPA 및 CHO-PA의 경우 이질성을 초래한다. 프로테아제 절단에 의해 소량의 단일-사슬 형태가 이중-사슬 형태로 전환된다. DTT/우레아 처리는 분자를 함께 이중-사슬 형태로 유지하는 Cys264-Cys395 사이의 디술피드 결합을 환원시켜, 분자를 두 프래그먼트 (크링클 프래그먼트 및 프로테아제 프래그먼트)로 분해시킨다.
도 2는 동일한 구배 경사하에서 역상 HPLC가 DTT/우레아 처리후, 세 혈전용해 분자의 단일-사슬 형태를 서로 해상할 수 있다는 것을 보여준다. 이들 세 단백질 모두 첫 번째 용출되는 이중-사슬 형태의 크링클 프래그먼트, 두 번째 용출되는 단일-사슬 형태 및 마지막으로 용출되는 이중-사슬 형태의 프로테아제 프래그먼트 를 갖는 유사한 용출 프로파일을 나타내었다. 세 플라스미노겐 활성화제 각각의 프로테아제 프래그먼트도 또한 서로 잘 해상되지만, 세 분자의 크링클 프래그먼트는 잘 분리되지 않았다. 결과적으로, 이 방법은 플라스미노겐 활성화제의 이중-사슬 형태로의 단일-사슬 형태의 프래그먼트화를 검출하고, 정량하는데 사용될 수 있다.
r-tPA, TNK-tPA 및 CHO-PA 프로파일에서 관찰된 이질성 (도 2)는 이들 분자의 정량화를, 특히 r-tPA, TNK-tPA 및 CHO-PA의 혼합물에서 각 개별적인 분자를 정량화하려고 할 때 이를 매우 어렵게 만든다. 단백질분해와 관련된 이질성을 제거하기 위하여, 플라스미노겐과 인큐베이션하여 단일-사슬 형태 모두를 이중-사슬 형태로 전환시켰다. 플라스미노겐은 천연의 섬유소용해 시스템에서 플라스미노겐 활성화제의 기질이다. r-tPA, TNK-tPA 및 CHO-PA의 혼합물에서 모두 플라스미노겐의 Arg560-Val561의 펩티드 결합을 절단하는 효소 활성을 갖는다. 이러한 절단은 플라스미노겐을 그 활성 형태인 플라스민으로 전환시킨다. 플라스민은 낮은 특이성을 갖는 세린 프로테아제로 r-tPA, TNK-tPA 및 CHO-PA에서 Arg275-Ile276 펩티드 결합을 절단할 수 있다. 그 결과, 플라스미노겐과의 인큐베이션은 세 플라스미노겐 활성화제의 단일-사슬 형태를 이중-사슬 형태로 전환시킨다.
플라스민 처리에 이어, 시료에 DTT/우레아를 처리하여 디술피드 결합을 환원하여 분자의 이중-사슬 형태를 두 개의 분리된 프래그먼트로 분해시켰다. 도 3은 플라스민- 및 DTT/우레아-처리된 플라스미노겐 활성화제의 역상 HPLC 프로파일을 나타낸다. 세 단백질 각각의 프로테아제 프래그먼트 서로 잘 분리되지만, 세 분자의 크링클 프래그먼트는 해상되지 않았다. 따라서, 각 플라스미노겐 활성화제의 통합과 정량화에 프로테아제 프래그먼트를 사용하였다. r-tPA 및 TNK-tPA 모두의 경우, 타입 I 및 타입 II 이소자임으로부터의 크링클 프래그먼트는 잘 분리되었다. 그 결과, 본 방법은 또한 r-tPA 및 TNK-tPA 모두에 대해 타입 I 대 타입 II 비율의 정량화에 유용하다.
본 역상 HPLC 방법의 가용성은 제조 방법 개발을 크게 촉진한다. 제품의 통합성 (즉, 단일-사슬 비율) 및 타입 I 및 타입 II 이소자임의 비율과 관련된 제품 품질에 대한 상이한 발효 조건의 영향을 평가하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 방법은 정제 공정 개발을 돕고, 생산 배치 사이의 일관성을 보장하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 용도 모두는 새로운 약물의 개발에서 분석 및 상업적인 방법의 대략적인 역할을 예시한 것이다.
<110> Xu, Yuan
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1
Claims (11)
- 인간 조직형 플라스미노겐 활성화제(tPA), 또는 프로테아제 절단 부위 Arg275-Ile276을 갖는 그의 변이체를 함유하는 시료를 인간 야생형 tPA의 Arg275-Ile276 결합을 특이적으로 절단할 수 있는 프로테아제, 및 이어서 인간 야생형 tPA의 디술피드 결합을 환원시키기에 효과적인 양의 변성제 및 환원제와 함께 인큐베이션하는 단계;상기 시료에 역상 고성능 액체 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계; 및상기 크로마토그래피 단계로부터의 용출 프로파일을 그에 존재하는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포에 내생성인 플라스미노겐 활성화제 (PA)의 양에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 상기 시료로부터 CHO 세포에 내생성인 PA의 제거에 있어서 정제 방법의 효과를 모니터하는 방법.
- 제1항에 있어서, 프로테아제가 플라스미노겐인 방법.
- 제1항에 있어서, 인간 tPA가 천연-서열의 tPA인 방법.
- 제1항에 있어서, tPA 변이체가 TNK-tPA인 방법.
- 제1항에 있어서, 인큐베이션 전에 시료를 분해 완충액으로 희석하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 완충액이 7 내지 8의 pH를 갖는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 완충액이 인산염 완충액인 방법.
- 제7항에 있어서, 완충액이 아르기닌을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 변성제가 우레아 또는 구아니딘을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨 또는 2-메르캅토에탄올을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 크로마토그래피 단계를 아세토니트릴을 포함하는 용매를 사용하여 구배 포맷(format)으로 용출함으로써 수행하는 것인 방법.
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