CZ302023B6 - Zpusob sledování úcinnosti purifikacního postupu - Google Patents
Zpusob sledování úcinnosti purifikacního postupu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ302023B6 CZ302023B6 CZ20021196A CZ20021196A CZ302023B6 CZ 302023 B6 CZ302023 B6 CZ 302023B6 CZ 20021196 A CZ20021196 A CZ 20021196A CZ 20021196 A CZ20021196 A CZ 20021196A CZ 302023 B6 CZ302023 B6 CZ 302023B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- tpa
- cho
- sample
- buffer
- human
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/972—Plasminogen activators
- G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Abstract
Je popsán zpusob kontroly úcinnosti purifikacního postupu pri odstranování aktivátoru plazminogenu (PA), pocházejícího z bunek vajecníku cínského krecka (CHO), ze vzorku obsahujícího lidský tPA nebo jeho varianty. Tento postup zahrnuje inkubaci vzorku s proteázou schopnou specificky štepit vazbu Arg.sub.275.n.-Ile.sub.276 .n.v lidském standardním typu tPA, a dále inkubaci s denaturacními/redukcními cinidly v príslušných množstvích, která jsou úcinná pro redukování disulfidových vazeb v lidském standardním typu tPA; dále je se vzorkem proveden krok HPLC na reverzní fázi a je analyzován elucní profil z tohoto chromatografického kroku, a zjištováno prítomné množství PA, pocházejícího z bunek CHO.
Description
Oblast techniky
Tento vynález se týká testu pro určování jaké množství z tPA, produkovaného buněčnou linií z vaječníkú čínského křečka (CHO), je přítomno ve vzorcích rekombinantního lidského tPA s přirozenou sekvencí nebo jeho variantami, produkovanými v buňkách CHO.
Dosavadní stav techniky
Tkáňové typy aktivátorů piazminogenu (tPA) jsou endogenní serinové proteázy, které se účastní kaskády událostí, vedoucích k rozpuštění krevní sraženiny (Astrup a Permin, Nátuře, 159, 681682 (1947); Camiolo a kol., Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 138, 277-280 (1971); Collen, J. Biol. Chem., 33, 77-86 (1987); Hoylaerts a kol., J. Biol. Chem. 257, 2912-2919 (1982)). ACTIVASE5 je rekombinantní forma lidského tPA (r-tPA), používaná při léčbě akutního infarktu myokardu a plicní embolie (Grossbard, Pharm. Res., 4, 375-378 (1987)). ACTIVASE8 je nyní také povolena pro léčení ischemického záchvatu (Smith a kol., Acad. Emergency Medicine, 6(6), 618-25 (1999); Kwiatkowski a kol., New Eng. J. Med., 340(23), 1781-1787 (1999)). Je to glykoprotein produkovaný expresí komplementární DNA (cDNA) pro přirozený lidský tPA v buňkách z vaječníkú čínského křečka (CHO). TNK-tPA je geneticky upravená varianta lidského tPA, klonovaná a exprimovaná v buňkách CHO (Keyt a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA, 91, 36703674 (1994)). Aby byla vytvořena TNK-tPA varianta, byly do lidského tPA na třech specifických místech vneseny místně cílené mutace. Jedná se o záměny Thrl03 na Asn (TI 03N), Asn 117 na Gln(N117Q) a změnu Lys-His-Arg-Arg296 až 299 na Ala-Ala-Ala-Ala (KHRR296-299AAAA). Ve srovnání s tPA, TNK-tPA vykazuje podobnou biologickou aktivitu in vitro, zvýšenou odolnost k inhibitoru plazmidového aktivátoru a zvýšenou fibrinovou specificitu, a je pomaleji odstraňován z plazmy (Keyt a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91, 3670-3674 (1994); Thomas a kol., Stroke, 25: 10, 2072-2079 (1994); Benedict a kok, Circulation, 92: 10, 3032-3 040 (1995); Módi a kok, Thromb Haemost, 79, 134-139 (1998)). V současné době je očekáváno schválení směrnice o podávání r-tPA ve formě jednotlivých dávek. Buňky CHO syntetizují endogenní křečci tPA nazývaný CHO-tPA. Jak bylo zjištěno pomocí testů lyžování krevní sraženiny, CHO-tPA má podobnou fibrinolytickou aktivitu jako lidský tPA. Aminokyselinová sekvence CHO-tPA je z 80 % shodná se sekvencí lidského tPA. Mnoho substitucí je semikonzervativních, jako např: Arg <—> Lys, Glu <—> Asp, Phe <—> Tyr, Val <-> Ala, Ile<->Leu nebo Thr<->Ser. Za použití modelu domény lidské tPA proteázy, založeném na struktuře hovězího chymotrypsinu je vidět, že ve skutečnosti všechny substituce v CHO-tPA jsou lokalizovány na povrchu proteinu nebo v jeho blízkosti.
Všechny r-tPA, TNK—tPA a CHO-tPA se skládají z jednoho polypeptidového řetězce, který se skládá z 527 aminokyselin se 17 disulfidovými vazbami (Nguyen a Carole, „Stability Characterization and Formulation Development of Altepase, a Recombinant Tissue Plasminogen Activator“ v Stability and Charactcrization of Protein and Peptide Drugs: Čase Histories, Y. J. Wang, R. Peariman, vyd., (Plenům Press: New York, 1993), str. 91 až 135. U všech tří proteinů je peptidová vazba mezi Arg275 a lle276 zvláště citlivá ke štěpení proteázou. Výsledkem štěpení jsou dva fragmenty: jeden se skládá z 275 aminokyselin zN-konce a druhý jeden se skládá z 252 aminokyselin z C-konce. N-koncový řetězec obsahuje oblasti, které jsou homologní s kringle oblastmi, nacházejícími se v piazminogenu a protrombinu a proto je často označován jako „kringle fragment“ (Nguyen a Carole, víz výše; de Vos a kol., Biochem., 31, 270-279 (1992)).
C-koncový řetězec obsahuje katalyticky aktivní místo a proto je obecně označován jako „proteázový fragment“ (Pennica a kol., Nátuře, 301, 214—221 (1983)). Dva rozštěpené řetězce jsou spojeny jednou disulfidovou vazbou, vytvořenou mezi Cys264 a Cys395. Rozštěpená molekula je obecně nazývána „dvouřetězcový tPA“ na rozdíl od ,jednořetězcového tPA“ nebo intaktní formy.
-1 CZ 302023 B6 r-tPA obsahuje čtyři potenciální místa vhodná pro N-glykosylaci, která jsou určována sekvencí Asn-X-Ser/Thr (Nguyen a Carole, viz výše). Jsou to Asnn7, Asn]84, Asn2]8 a Asn448. r-tPA existuje jako dva glykosylované isoenzymy, označované jako typ í a typ II.
r-tPA je glykosylován pouze na Asn^ a Asn448. Asn2]8 není glykosylován v žádné z isoforem. TNK-tPA má stejné schéma glykosylace jako r-tPA s výjimkou toho, že mutace Thr103 na Asn a Asnll7 na Gin posouvají glykosylační místo z pozice 117 na 103 (Keyt a kol., viz výše). Schéma glykosylace pro CHO-tPA není úplně charakterizováno (Rijken a Collen, J. Biol. Chem., io 256: 7 035-7 041 (1981)),
ACTIVASE® je obchodní značka pro rekombinantní formu aktivátoru plazminogenu, pocházející z lidské tkáně (r-tPA), používaná při léčbě akutního infarktu myokardu a plicní embolie. Jako ACTIVASE8 označený tPA je nyní také povolen pro léčení ischemického záchvatu. Je produkován exprimováním komplementární DNA (cDNA) pro přirozený lidský tPA v buňkách z vaječníků čínského křečka (CHO) (patent US 5 753 486). TNK-tPA je geneticky upravená varianta r-tPA se zvýšenou účinností a nižším výskytem krvácení ve srovnání s ACTIVASE8 rtPA. Byla vytvořena třemi místně cílenými mutacemi (T103N, NI 17Q a KHRR296-299AAAA) a je také klonována a exprimována v buňkách CHO (patent US 5 612 029). Buňky CHO biosyntetizují endogenní křečci tPA nazývaný CHO—PA. Aminokyselinová sekvence CHO-PA je vysoce homologická (80% shoda) se sekvencí r-tPA. Všechny tři trombolytické proteiny existují jako heterogenní isoformy, hlavně kvůli proteolýze/hydrolýze a odlišné glykosylaci.
Způsob purifikace lidského tPA od CHO-PA je popsán v patentu US 5 411 854. Tento způsob obsahuje uvedení do kontaktu tekutiny obsahující lidský tPA s protilátkami, které specificky vážou odpovídající endogenní CHO-PA a opětné získání lidského tPA. S výhodou kontaktní krok obsahuje průchod tekutiny skrz chromatografickou vrstvu, na které jsou protilátky imobilizovány.
Vývoj proteinových léčivých přípravků, odvozených z rekombinantní DNA, byl usnadněn zavedením nových analytických metod, které mohou být použity pro charakterizování proteinu a/nebo pro demonstrování důslednosti pri přípravě proteinu. Mapování peptidů je klíčovou metodou pro kontrolování aminokyselinové sekvence a je schopno detekovat malé změny v proteinech malé až střední velikosti, jako jsou například inzulín a lidský růstový hormon. Analýza mnohem většího proteinu, např. fibrinogenu (molekulová hmotnost 350 000) nebo heterogenních glykoproteinů, jako jsou protilátky (molekulová hmotnost 150 000), je obtížná pro velký rozsah souboru různých peptidů, které jsou vytvářeny při enzymatickém štěpení. Taková složitost způsobuje, že jedno dělení metodou vysokovýkonné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RT-HPLC), spojené s průběžnou UV detekcí, má pouze omezenou použitelnost.
Nástup komerčně dostupných systémů kombinované HPLC a hmotové spektrometrie pomocí ionizace elektrickým sprejem (LC-ES-MS), které jsou slučitelné s běžnou HPLC, zvýšil podstatně účinnost mapování peptidů (Ling a kol., Anal. Chem., 63: 2 909-2 915 (1991); Guzetta a kol., Anal. Chem., 65: 2 953-2 962 (1993)). LC-ES-MS ve spojení s metodou kolizemi indukované disociace (CID) byla účinně použita pro určení míst N- a O-vázané glykosylace (Carr a kol., Protein Sci., 2: 183-196 (1993); Huddleston a kol., Anal. Chem., 65: 877-884 (1993); Conboy a Henion, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 3: 804-814 (1992)). Avšak dokonce i tato technikaje omezena nedostatečným nerozlišením, které vyplývá z velkého počtu velmi podobných peptidů, který je způsoben různou glykosylaci proteinů a enzymatickým štěpením středně velkých glyko50 proteinů. Pro charakterizování takových vzorků je nezbytné použít řadu technik s ortogonální selektivitou.
Bylo zkoumáno použití kombinací vysokovýkonné kapilární elektroforézy, HPLC, LC-ES—MS a hmotové spektroskopie typu MALDI-TOF pro umožnění charakterizace enzymatických štěpů vzorků přirozených glykoproteinů, jako jsou například DSPAal, jednořetězcového aktivátoru
-2CZ 302023 B6 plazminogenu, který je odvozen ze slinných žláz netopýra vampýra (Apffel a kok, J. Chromatography A, 717: 41-60 (1995)). Bylo uzavřeno, že tyto čtyři techniky jsou vysoce účinné pro zkoumání glykoproteinů. Nicméně autoři uznávají, že musí být vykonáno ještě mnoho práce pro zdokonalení účinnosti tohoto přístupu a že budou vyžadovány kroky, které jsou vysoce výkonné při provádění koncentrace, kvůli rozsáhlé heterogenitě glykoproteinů.
Existuje tedy potřeba postupu pro kontrolování relativních a absolutních množství přítomného CHO-PA, poté co byla s tPA provedena purifikační procedura, jako je např. taková, která je popsána v patentu US 5 411 864 (viz výše).
Podstata vynálezu
Byla zde tedy vyvinuta metoda HPLC na reverzní fázi, vhodná pro analýzu tří trom boly tických molekul, CHO-tPA, rekombinantního lidského tPA s přirozenou sekvencí a TNK-tPA. Tato metoda nemá pouze schopnost oddělit lidský tPA a/nebo TNK-tPA od CHO-PA, ale také je schopna zjišťování a kvantifikování různých isoforem každé z molekul.
Přesněji řečeno, předložený vynález poskytuje postup pro sledování účinnosti purifikační ho procesu při odstraňování aktivátoru plazminogenu (PA), který pochází z buněk vaječníku čínského křečka (CHO) ze vzorku, obsahujícího lidský tPA nebo jeho varianty, přičemž tento postup obsahuje inkubaci vzorku s proteázou, která je schopna specificky štěpit vazbu Arg275 -Ile276 ve standardním typu lidského tPA, a potom inkubaci s denaturačními a redukčními činidly v množství, které je účinné pro redukování disulfidových vazeb standardního typu lidského tPA; dále je se vzorkem proveden krok vysokovýkonné kapalinové chromatografie na reverzní fázi a analyzován eluční profil z chromatografiekého kroku, pro zjištění množství přítomného PA, kteiý pochází z buněk CHO.
Definice
Termíny „aktivátor tkáňového plazminogenu“ a „tPA“ označuje lidský vnější aktivátor plazminogenu (tkáňového typu) s fibrinolytickou aktivitou, který má typicky strukturu s pěti doménami (prst, růstový faktor, kringle-1, kringle-2 a proteázová doména), ale nicméně může mít domén méně nebo může mít některé své domény opakované, pokud stále funguje jako trombolytické činidlo a zachovává si N-vázaná glykosylaění místa na pozicích 117, 184 a 448. Minimálně se tPA skládá z proteázové domény, která je schopna přeměnit plazminogen na plazmin, a Nkoncové oblasti, o které se má za to, že je alespoň částečně odpovědná za vazbu fibrinu, a zachovává si N-vázaná glykosylaění místa na pozicích odpovídajících aminokyselinovým pozicím 117, 184 a 448 standardního lidského tPA Zachování těchto glykosylačních míst je způsobeno skutečností, že obsazení variabilního místa u rekombinantního a z melanomu odvozeného standardního typu tPA vede k produkci dvou variant označených „tPA typ 1“, respektive „tPA typ II“. tPA typu I obsahuje N-vázané oligosacharidy na pozicích 117, 184 a 448. tPA typu II obsahuje N-vázané oligosacharidy na pozicích 117 a 448. Je třeba mít na paměti, že existují přirozené alelové varianty a mohou se vyskytnout mezi jedinci, jak je demonstrováno jednou nebo více aminokyselinovými odchylkami v aminokyselinové sekvenci tPA u každého jedince.
Termíny „standardní typ aktivátoru lidského tkáňového plazminogenu“, „standardní typ lidského tPA“, „přirozený aktivátor lidského tkáňového plazminogenu“ a „přirozený lidský tPA“, kde „lidský tPA“ může být zkráceno jako „htPA“, označuje přirozenou sekvenci lidského tPA, tj. takovou, která je kódována cDNA sekvencí popsanou v patentu US4766 075, vydaném 23. srpna 1988. Čísla aminokyselinových míst neboli pozic v molekule tPA jsou značena v souhlase s patentem US 4 766 075.
Zde použité odkazy na různé domény tPA znamenají domény standardního typu lidského tPA jak byl definován výše, a funkčně odpovídající části lidského tPA, který má aminokyselinové změny
-3CZ 302023 B6 ve srovnání se sekvencí přirozeného lidského tPA nebo (přirozeného čí pozměněného) tPA z jiných zdrojů, jako aktivátor plazminogenu ze tkáně netopýra (bat-PA). Tedy zde používaný termín „proteázová doména“ označuje oblast sahající od aminokyselinové pozice 264 k aminokyselinové pozici 527 včetně, u zralé formy standardního lidského tPA, a funkčně odpovídajícím
Částem lidského tPA, ve kterém jsou ve srovnání se sekvencí přirozeného lidského tPA aminokyselinové změny, nebo tPA zjiných zdrojů, jako je např. bat-tPA.
Zde používaný termín „varianty tPA“ označuje molekuly, které se liší od přirozeného tPA jednou nebo více aminokyselinovými změnami nebo modifikacemi existujících aminokyselin. Vyhodit) nou variantou je zde TNK-tPA. Modifikace které pozměňují nebo vkládají vhodnou aminokyselinu (aminokyseliny) do přirozené molekuly, aby se tím uskutečnily požadované sekvenční variace, je možno provést jakýmkoli způsobem známým v oboru, jako jsou např. místně cílená mutageneze nebo ligování vhodné sekvence do DNA, která kóduje patřičný protein.
Zde používaný termín ..TNK -tPA“ označuje molekulu tPA, ve kteréje Thrl03 standardního typu tPA změněno na Asn (T103N), Asnl 17 standardního typu tPA je změněno na Gin (NI 17Q) a Lys-His-Arg-Arg 296-299 Asnl 17 standardního typu tPA jsou změněny na Ala-Ala-Ala-Ala (KHRR296-299AAAA). Tento TNK je dále popsán v patentu US 5 612 029.
Termín „buňky z vaječníku čínského křečka“ nebo „buňky CHO“ označuje buňky nebo buněčné linie odvozené z vaječníku čínského křečka, jak je popsáno například v EP 117 159, publikovaném 29. srpna 1989; patentech US 4 766 075; US 4 853 330; US 5 185 259; Lubiniecki a kol., Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, Spier a kol., vyd. (1989), str. 442 až 451), rovněž buňky odvozené od CHO, jako jsou CHO/-DHFR (Urlaub a Chasin,
Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)), CHO-K1 DUX Bl 1 (Simonsen a Levinson, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 2495-2499 (1983); Urlaub a Chasin, viz výše) a buňky dpl2.CHO (EP 307 247 publikovaný 15. března 1989). Mezi výhodné hostitelské buňky patří buňky CHOK1 DUX Bila buňky dpl2.CHO.
Buňky CHO vyvinuté pro produkci tPA ve velkém měřítku jsou udržovány v kryogenním stavu v systému MCB buněčné banky (WCB), jak je popsáno ve Wiebe a kol., Large Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, vyd. (Marcel Dekker: New York, 1990), str. 147 až 160. Buňky DHFR+ CHO-K1 transfekované DNA kódující lidský tPA byly uloženy v Americké sbírce typových kultur, Manassas, Virginia (ATCC) a jsou dostupné pod přístupovým číslem
CCL61. Vzorek jiné CHO buněčné linie produkující tPA (CHO buněčná linie 1-1515) byla uložena pod ATCC přístupovým číslem CRL 9606. U této posledně jmenované buněčné linie bylo uvedeno, že hladiny lidského tPA dosahují 50 pg/buňku/den.
Zde používaný termín „CHO aktivátor plazminogenu“ nebo „CHO-PA“ označuje aktivátor plaz40 minogenu, který je endogenně produkován buňkami CHO. Tento endogenní PA exprimovaný buňkami CHO má sekvenci slabě odlišnou (asi z 80 % shodnou) od standardního lidského tPA. CHO-PA není PA tkáňového typu.
Zde používaný termín „proteáza“ označuje enzym, který je schopen štěpit specificky vazbu
Arg275 - Ile?76 standardního lidského tPA. Mezi příklady patří plazmin (nebo plazminogen, který se přeměňuje na plazmin), tkáňový kallikrein nebo faktor Xa, rovněž jakékoli proteázy trypsinového typu, které jsou schopny provést tuto specifickou, omezenou proteolýzu. Vhodné proteázy jsou dále popsány v Ichínosi a kol., FEBS Letters, 175: 412—418 (1984). Výhodné jsou zde plazmin/plazminogen.
Zde používaný termín „denaturační/redukění činidla“ nebo „denaturační činidlo a redukční činidlo“ označuje kombinaci denaturačního a redukčního činidla, která redukuje disulfidové vazby standardního lidského tPA. S výhodou je denaturačním činidlem guanidin nebo močovina a redukčním činidlem je dithiothreitol (DTT) nebo 2-merkaptoethanol.
-4CZ 302023 B6
Způsoby provedení vynálezu
Poté, co je vytvořena rekombinanta, je tPA nebo varianta tPA získávána z média kultury CHO, buď jako sekretovaný protein 1 nebo z buněčných lyzátů, pokud je přímo exprimován bez sekreč5 ního signálu. Je nezbytné tPA nebo jeho variantu purifikovat od buněčných proteinů hostitele, aby byly získány přípravky, které jsou jakožto proteiny v podstatě homogenní. Jako první krok je médium z buněčné kultury nebo lyzát centrifugovány nebo filtrovány, aby byly odstraněny buněčné zbytky.
io Lidský tPA nebo jeho varianta jsou potom vyčištěny od doprovázejících kontaminujících endogenních proteinů, jako jsou CHO-PA, pomocí takových postupů, jako je frakcionace na imunnoafinitních nebo iontovýměnných sloupcích, jak je popsáno například v patentu US 5 411 864; ethanolovým srážením; HPLC na reverzní fázi; chromatografíi na kysličníku křemičitém nebo na pryskyřici vyměňující kationty, jako je DEAE; chromatografickým zaostřo15 váním; SDS-PAGE; srážením síranem amonným nebo gelovou elektroforézou za použití například Sephadex G-75. Inhibitor proteázy, který neinterferuje s aktivitou tPA, jako je fenylmethy lsulfonyl fluorid (PMSF), může být také výhodný pro zamezení proteolytické degradace v průběhu purifikace a antibiotika mohou být použita pro zabránění růstu náhodných kontaminujících mikroorganizmů. Osoba se zkušeností v oboru si bude plně vědoma, že purifikační metody vhodné pro přirozený tPA mohou vyžadovat modifikace, které by vyplývaly ze změn charakteru tPA nebo jeho variant po expresi v kultuře rekombinantních buněk.
Ve výhodném provedení, pokud je produkována varianta tPA, je vylučována a supematant prochází přes předem pomocí BSA upravený sloupec skleněných zrnek s navázanou kozí poly25 klonální protilátkou A6 proti tPA, sloupec je promyt pufrem do rovnovážného stavu a poté je varianta tPA eluována.
Zde popsaný vynález je zaměřen na sledování (včetně zjišťování kvality a kvantity) hladin přirozeného CHO-PA ve vzorku, který je odebírán z takových purifikačních systémů, které obsa30 hují alespoň jednu formu lidského tPA, produkovaného v buňkách CHO. V postupu je obsažena inkubace vzorku s proteázou, která je schopna specificky štěpit vazbu Arg375 - Ile27ó- Potom následuje inkubace proteázou štěpeného vzorku se směsí denaturačního a redukčního činidla v takovém vhodném relativním a absolutním množství, které má za následek redukci disulfidových vazeb v lidském standardním tPA Protože působení denaturačních a redukčních činidel způsobuje ztrátu enzymové aktivity, proto se inkubace s proteázou provádí jako první.
Po inkubaci je vzorek podroben kroku HPLC na reverzní fázi a eluční profil, který je výsledkem tohoto chromatografického kroku, je analyzován na množství tam přítomného PA, pocházejícího z buněk CHO. Je výhodné když proteázou je plazminogen, který se přeměňuje na aktivní formu, plazmin, a když lidský tPA má sekvenci přirozeného tPA, a variantou tPA je TNK-tPA.
Krok inkubace s proteázou, po kterém následují denaturační/redukční činidla se provádí typicky při teplotě 30 až 40 °C, výhodněji při 36 až 38 °C a nej výhodněji při 37 °C, minimálně po dobu 15 minut, výhodněj i po dobu 20 až 40 minut.
Také je výhodné, když je vzorek před inkubací zředěn pufrem, ve kterém je prováděno štěpení, který má s výhodou pH 7 až 8, ještě výhodněji fosforečnanovým pufrem s pH 7,4 až 7,6, a ještě výhodnější je, když tento pufr též obsahuje arginin.
Pro účely tohoto vynálezu může být použit jakýkoli vhodný sloupec HPLC, na který je vzorek nanesen, a to jak preparativní, tak i analytický. V typickém případě je sloupec před nastříknutím vzorku promýván do rovnovážného stavu po dobu alespoň 15 minut. Velkost sloupce, materiál ze kterého se skládá, průtoková rychlost, eluční pufry, typ gradientu injektováný objem a velikost částic materiálu ze kterého je sloupec připraven, závisejí na různých faktorech a také na velikosti
-5CZ 302023 B6 vzorku, který bude zkoumán, na typu složení mobilní fáze a gradientu, a na formách tPA, které budou rozlišovány.
Rozpouštědlo, ve kterém je látka nanášena, může být jakékoli rozpouštědlo, ale výhodným je 5 rozpouštědlo založené na acetonitrilu, jako jsou voda, aceton itril a kyselina trifluoroctová (TFA).
Je výhodné, když je použit sloupec Zorbax C8, Vydac, nebo sloupec Baker Cl 8, naplněný médiem o průměru částic 4 až 40 pm, výhodněji o průměru částic 5 až 15 pm a s velikostí pórů 10 až 400 nm, výhodněji 15 až 35 nm. Je výhodné, když médium obsahuje C4, C8 nebo Cl8 alkylovou ío skupinu, a nej výhodnějším médiem je C8 silika. Eluce je s výhodou prováděna rozpouštědlem obsahujícím acetonitril, jako jsou voda, acetonitril a TFA, ve formě gradientu po dobu 60 až
100 minut, s výhodou lineárním gradientem, přičemž se relativní množství acetonitrilu v rozpouštědle zvyšuje. V jiném výhodném provedení je používán pozvolný gradientový vzestup asi 0,25 % acetonitrilu za minutu.
Pokud zde analýza čistoty ukazuje, že použitý postup úspěšně odstraňuje CHO-PA, mohou být provedeny další purifikační kroky, pokud je nezbytné odstranit nějaké jiné kontaminanty. Pokud tento postup nesnižuje množství CHO-PA na přijatelnou úroveň, může být použito odlišné schéma purifikace a zde uvedený postup může být opakován, aby bylo zjištěno, jak účinný ten postup je.
Po konečné purifikaci může být z tPA nebo jeho varianty připraveny známými způsoby farmaceuticky užitečné prostředky, v nichž je tPA produkt kombinován s příměsí farmaceuticky přijatelného nosiče. Takové přípravky jsou v literatuře dobře popsány, stejně jako jejich dávkování a použití. Například tPA nebo jeho varianta jsou vhodné pro parenterální podávání subjektům, trpícím kardiovaskulárními chorobami nebo stavy a mrtvičnými záchvaty.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 ukazuje HPLC analýzu na reverzní fázi u přirozeného r-tPA, TNK-tPA a CHO-PA.
Obrázek 2 ukazuje HPLC analýzu na reverzní fázi u r-tPA, TNK-tPA a CHO-PA, na které bylo působeno směsí DTT/močovina, Na aktivátory plazminogenu bylo před chromatografií působeno směsí DTT/močovina.
Obrázek 3 ukazuje HPLC analýzu na reverzní fázi u r-tPA, TNK-tPA a CHO-PA, na které bylo působeno plazminem a směsí DTT/močovina. Na aktivátory plazminogenu bylo před chromatografií působeno směsí DTT/močovina a posléze plazminem.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady jsou uváděny pouze pro ilustraci určitého provedení, které je nyní známo při 45 praktické realizaci vynálezu, ale není tím míněno omezení vynálezu na tyto příklady. Všechny zde uvedené citace literatury a patentů jsou výslovně zahrnuty v odkazech.
Příklad 1:
Materiály:
ACTIVASE® (r-tPA) a TNK-tPA byly získány od Genetech, lne. (South San Francísco, CA) ve formě vyčištěné z buněk CHO. Viz též například patenty US 4 776 075 a US5753 486 na
ACTIVASE® r-tPA a patent US 5 612 029 na TNK-tPA.
-6CZ 302023 B6
Monoklonální protilátka #354 proti CHO-PA byla produkována tak, jak je popsáno v patentu US 5 411 864. Krátce řečeno, samice myši Balb/c byla imunizována v průběhu období 12 měsíců proteinovými roztoky, které byly podstatně obohaceny CHO aktivátorem plazminogenu, purifikovaným z hostitelské buňky, která neobsahuje lidský t-PA. Bylo provedeno 5 injekcí, z nichž každá obsahovala 30 pg. Úvodní injekce byla emulgována s kompletním Freudovým adjuvans a podána podkožně (jedno nebo více míst). Druhá injekce, podaná o 1,5 týdne později, byla emulgována s nekompletním Freudovým adjuvans a jedna její polovina byla podána podkožně, zatímco druhá polovina byla podána intraperitoneálně. Zbývající tři injekce byly podány 3. 6. a 12. týden ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (PBS) najedno intraperitoneální místo.
Slezina imunizované myši byla vyjmuta 13. týden a slezinné buňky byly fúzovány s buňkami myší myelomové linie NP3X63-Ag8.653, za použití obecných postupů podle Fazekas a kol., J. ImmunoL Methods, 35: 1 (1980) a Lané, J. ImmunoL Methods, 81: 223 (1985). Fúzované buňky byly rozmístěny do deseti mikrotitračních destiček, z nichž každá obsahuje 96 jamek. Každá jamka byla testována na produkci specifické protilátky tak, že byla využito rozdílné reaktivity ve dvou testech ELISA. Jeden test ELISA specificky detekoval protilátky proti CHO-PA a druhý detekoval protilátky, které zkříženě reagovaly s rekombinovaným lidským tPA.
Přibližně 5 % všech buněk reagovalo pouze s CHO-PA a 3 % jich reagovalo s CHO-PA a lidským tPA.
Hybridomové buňky zjamek obsahujících CHO-PA-specifické protilátky byly dále množeny a klonovány pomocí metody koncového ředění (Oi a Herzenberg, „Immunoglobin-Producing Hybrid Celí Lines“, str. 351 až 372, v Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell a Shiigi, vyd. (W. H. Freeman a spoL, 1980)). Velká množství specifických monoklonálních protilátek byla produkována buď v buněčných kulturách hybridomových buněk, nebo pomocí injekce hybridomových buněk do myši, čím byla vyvolána tvorba ascitových nádorů. Jednou z výsledných protilátek byla Mab354, která, když byla imobilizována na sloupci, snižovala hladiny CHO-PA po jednom průchodu tímto sloupcem více než lOOnásobně, aje odolná k několika různým chemický imobilizačním chemickým postupům a hrubým promývacím podmínkám.
Mab 354 byla purifikován a za použití kroků uvedených dále, přičemž všechny kroky byly provedeny při teplotě místnosti. Koncentrování bylo provedeno následovně: Odebraná tekutina (HF) ze suspenzní kultury MAb hybridomových buněk byla filtrována přes 0,2 pm filtr. Tekutina z kultury byla koncentrována pomocí ultrafiltrace nebo chromatografie na iontovýměnné pryskyřici.
Afínitní purifikace byla provedena následovně: Ke koncentrovanému roztoku MAb HF byl přidán thimerosal do 0,02% koncentrace. Roztok byl upraven aby obsahoval 1,5 M glycin, 3,0 M NaCI, pH 9,0 tak, že k němu byl přidán 3,0 M glycin a následovalo přidání krystalického NaCI. Protein A se špatně váže na Ab, tedy přidání NaCÍ a glycinu zvýšilo hydrofobní interakci a tím byla usnadněna vazba Ab. Roztok byl pročištěn filtrací. Pročištěná koncentrovaná MAb HF byla nanesena na sloupec proteinu A, imobilizovaného na agaroze. Vázaná MAb byla promyta pufrem, použitým pro uvedeni sloupce do rovnováhy, a jeho přibližné složení bylo 1,5 M glycin, 3,0 NaCI, 0,02 M EDTA, pH 9,0. MAb byla eluována pufrem obsahujícím 0,1 M citronan sodný a 0,15 M NaCI, pH 3,0. Sloupec proteinu A byl regenerován promytím 3,0 M NaSCN, 0,03 M Tris, pH 8,5 a znovu uveden do rovnováhy. Eluovaný pík MAb byl odebrán na základě profilu absorbance při 280 nm. Pík citronanem eluované MAb byl okamžitě neutralizován tím, že byl odebírán do pufru, jehož složení bylo: 1,5 M Tris-HCI, pH 9,0. Po použití byl sloupec s proteinem A vyjmut a uložen v utěsněných nádobách při teplotě 2 až 8 °C v 0,02 % thimerosalu jakožto skladovacím pufru.
Potom byl u 354 MAb vyměněn pufr pomocí diafiltrace. Diafiltrace probíhala dokud vodivost a pH nebylo podobné hodnotám pro pufr 0,03 M Tris, 0,05 M NaCI, pH 8,5.
-7CZ 302023 B6
MAb byla potom nanesena na chromatografický sloupec vyměňující an ionty, který obsahoval náplň DEAE-FAST FLOW™agarozy a byl promyt pufrem 0,03 M Tris, 0,05 M NaCl, pH 8,5. MAb byla po krocích vymývána pufrem, který měl složení 0,03 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 8,5. Eluovaný pík MAb byl odebrán na základě profilu absorbance při 280 nm.
MAb byla filtrována (0,2 pm) do dezinfikovaných těsnících nádob a uložena při teplotě pod -40 °C.
Plazminogen byl získán od firmy Fluka (Švýcarsko). Acetonítril čistý pro HPLC byl získán od Burdick & Jackson (Muskgon, MI) a kyselina trifluoroctová (TFA) byla od Pierce (Rockford, IL). Voda pro pohyblivou HPLC fázi a roztoky vzorků byla purifikován a pomocí systému MILLI-Q[M od Millipore (Milford, MA). Všechny ostatní chemikálie měly čistotu pro analýzu a pocházely od Sigma (St. Louis, MO).
Metody:
Purifíkace CHO-PA
CHO-PA byl izolován z kultivační tekutiny buněčných kultur CHO pomocí afinitní chromatografie, po které následovala imunoabsorbce. Pro afinitní chromatografíi byla použita pryskyřice Lysin Hyper D od BioSepra (Paříž, Francie), neboť lyzin se váže na oblast kringle 2 v aktivátorech plazminogenu (Cleary a kol., Biochem. 28, 1 884-1 890 (1989)). Imunoabsorbce byla provedena pomocí monoklonální protilátky #354 (MAb#354), specifické pro CHO-PA. MAb#354 byla navázána na gel SEPHAROSE 4B™, která byla aktivována pomocí CNBr podle protokolu prodejce (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Asi 10 mg MAb#354 bylo navázáno na mililitr gelu SEPHAROSE 4B, aktivované CNBr. Po navázání byl navrstven sloupec MAb#354SEPHAROSE 4B™.
Médium z kultur buněk CHO, které obsahuje vyloučený CHO-PA, bylo naneseno na sloupec s afinitním lyzinem, který byl předem uveden do rovnováhy pufrem obsahujícím 50 mM fosforečnan sodný a 0,01% detergent POLYSORBATE 80™ při pH 7,5. Po nanesení byl sloupec s afinitním lyzinem třikrát promyt: poprvé pufrem, kterým byl uveden do rovnováhy, potom následoval pufr obsahující 40 mM Tris, 800 mM NaCl a 0,008% POLYSORBATE 80™ pri pH 8,0 a nakonec následoval pufr, kterým byl sloupec uveden do rovnováhy. CHO-PA byl potom ze sloupce s afinitním lyzinem eluován pomocí pufru, který obsahuje 50 mM fosforečnan sodný, 200 mM L-arginin a 0,01 % POLYSORBATE 80™ pri pH 7,5. Po uvedení do rovnováhy fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS, 8 g/1 NaCl, 0,2 g/l K.C1, 1,44 g/1 Na2HPO4 a 0,24 g/l KH2PO4 při pH 7,4) byl na sloupec MAb#354-SEPHAROSE 4B navrstven eluát ze sloupce s afinitním lyzinem. Po nanesení byl sloupec promyt pufrem obsahujícím
9,5 mM Na2HPO4, 1 M NaCl a 5% propylenglykol (objem) pri pH 7,4. Vázaný CHO-PA byl ze sloupce eluován pomocí 0,2 M glycin-HCl při pH 2,5. Eluce byla sledována spektrofotometricky při 280 nm a frakce obsahující CHO-PA byly bezprostředně po odebrání neutralizovány pomocí 0,14 objemu 1,5 M argininfosforečnan (pH 8,0). Totožnost a čistota eluovaného CHO-PA byla potvrzena pomocí SDS-PAGE a analýzou aminokyselinové sekvence.
Působení směsi DTT/močovina
Roztok obsahující aktivátor (aktivátory) plazminogenu byl zředěn 1:1 (objem) v denaturačním pufru (8 M močovina, 0,5 M Tris a 3,2 mM EDTA při pH 8,4). Byl přidán 1 M zásobní roztok dithiothreitolu (DTT) do konečné koncentrace 20 mM a směs byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.
- 8 CZ 302023 B6
Zpracování plazminu
Roztok obsahující aktivátor (aktivátory) plazminogenu byl zředěn 1:3 (objem) v pufru pro štěpení (125 mM Na2HPO4, 200 mM arginin a 0,01% NaN3 pri pH 7,5). Byla přidána jedna setina objemu plazminogenu a směs byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.
Test aktivátorů plazminogenu pomocí HPLC na reverzní fázi
Test byl proveden na HPLC systému Hewlett-Packard 1090M™ (Hewlett Packard, Avondale, PA) s pryskyřicí o velikosti částic 5 pm a velikostí párů 30 nm, a se sloupcem Zorbac SBC8 4,6 x 250 mM (Mac-Mod, Chadds Ford, PA). Sloupec byl uveden do rovnováhy po dobu alespoň 15 minut před injektováním vzorku. Počáteční složení pohyblivé fáze bylo 70/30/0,1 (objem) voda/acetonitril/TFA Po počátečním pětiminutovém intervalu začal probíhat lineární gradient po dobu 80 minut (platí pro obrázky 1 a 2) nebo po dobu 60 minut (platí pro obrázek 3) na složení 50/50/0,1 (objem) voda/acetonitril/TFA. Bezprostředně po gradientu byl sloupec regenerován po dobu 10 minut roztokem 100/0,1 (objem) acetonitril/TFA. Potom se složení směsí během pěti minut vrátilo k počátečním podmínkám a systém byl opětně uveden do rovnováhy pro další injekci. Objem injekce byl 250 ml a rychlost průtoku byla 1 ml/minutu. Chromatografie byla prováděna při teplotě 40 °C. Měření fluorescence bylo prováděno pomocí programovatelného detektoru fluorescence Hewlett-Packard 1046A™ (Ex = 275 nm, Em = 340 nm). Chromatogramy byly zaznamenány a analyzovány pomocí software Hewlett-Packard CHEM STATION™. Výsledky a diskuse
Pro vysokou sekvenční homologíí měly ACT1VASE™ (r-tPA), TNK-tPA a CHOPA velmi podobné biochemické/biofyzikální vlastnosti. Analytické a preparativní metody, které jsou schopné vzájemně od sebe rozlišit tyto tři aktivátory plazminogenu, nebo které jsou schopné rozlišit tPA od CHO-PA nebo TNK-tPA od CHO-PA jsou potřebné pro vývoj izolačního postupu a pro hodnocení čistoty jednotlivých druhů molekul pro klinická studia a komerční výrobu. Zde je popsán jednoduchý postup HPLC na reverzní fázi, který tyto cíle splňuje.
Při pozvolném vzestupu gradientu o 0,25 % acetonitrilu za minutu a bez proteázy a denaturačních/redukčních činidel nebyla HPLC na reverzní fázi schopna oddělit nativní formu r-tPA od přirozeného CHO-PA (obrázek 1). Avšak přirozená forma TNK-tPA byla za těchto podmínek velmi dobře oddělena jak od přirozené formy r-tPA, tak od přirozené formy CHO-PA. Dále bylo provedeno působení směsí DTT/moěovina, aby došlo k redukování d i sulfidových vazeb a k denaturaci proteinů- U všech tří proteinů je peptidická vazba mezi Arg275 a Ile276 velmi citlivá k štěpení proteázou. Po čase tato citlivost vede k heterogenitě r-tPA, TNK-tPA a CHO-PA v roztoku. Malé množství jednořetězcové formy je účinkem proteázového štěpení převedeno na dvouřetězcovou formu. Působení směsi DTT/moěovina redukuje disulfidovou vazbu mezi Cys264 a Cys395, která drží dvouřetězcovou formu molekuly pohromadě, a má tedy za následek disociaci molekuly na dva fragmenty (fragment kringle a proteázový fragment).
Obrázek 2 ukazuje, že při tomtéž vzestupu gradientu byla HPLC na reverzní fázi schopna po působení směsi DTT/moěovina vzájemně od sebe rozdělit jednořetězcové formy tří trombolytických molekul. Všechny tři proteiny vykazovaly podobné eluční profily s tím, že kringle fragment dvouřetězcové formy je eluován jako první, jednořetězcové forma eluovánajako druhá a proteázový fragment dvouřetězcové formy je eluován jako poslední. Odpovídající proteázové fragmenty tří aktivátorů plazminogenu byly také vzájemně dobře odděleny, zatímco kringle fragmenty dobře odděleny nebyly. Z toho vyplývá, že tento postup může být u aktivátorů plazminogenu použít pro detekci a kvantifikací fragmentace jednořetězcové formy na dvouřetězcovou.
Heterogeníta pozorovaná v profilech r-tPA, TNK-tPA a CHO-PA (obrázek 2) činí kvantifikaci těchto molekul velmi obtížnou, zvláště pri snaze kvantifikovat každou jednotlivou molekulu ve směsi r-tPA, TNK-tPA a CHO-PA. Aby se zamezilo heterogenitě spojené s proteolýzou, všech-9CZ 302023 B6 ny jednořetězcové formy byly inkubací s plazminogenem převedeny na formy dvouřetězcové. Plazminogen je substrát aktivátoru plazminogenu v přirozeném fibrinolytickém systému. Všechny r-tPA, TNK-PA a CHO-PA mají enzymatickou aktivitu, která štěpí peptidickou vazbu Arg56()-Valg6| v plazminogenu. Toto štěpení převádí plazminogen na jeho aktivní formu, plazmin.
Plazmin je serinová proteáza s nízkou specifickou a je schopna štěpit peptidickou vazbu Arg275Ile276 v r-tPA, TNK-PA a CHO-PA. Výsledkem je, že inkubace s plazminogenem převádí jednořetězcovou formu tří aktivátorů plazminogenu na formu dvouřetězcovou.
Po působení na plazmin byly vzorky opracovány směsí DTT/močovina, aby došlo k redukci disulfidových vazeb a tak k rozdělení dvouřetězcové formy molekuly na dva oddělené fragmenty. Obrázek 3 ukazuje profily získané pomocí HPLC na reverzní fázi u aktivátoru plazminogenu, na které bylo působeno plazminem a směsí DTT/močovina. Odpovídající proteázové fragmenty tří proteinů byly dobře vzájemně odděleny, zatímco kringle fragmenty těchto tří molekul odděleny nebyly. Proto byl proteázový fragment použit pro integraci a kvantifikaci každého aktivátoru plazminogenu. Jak pro r-tPA, tak pro TNK-tPA byly kringle fragmenty od izoenzymů typu 1 a typu II dobře odděleny. Následkem toho je tato metoda také vhodná pro kvantifikaci poměru typu I a typu II jak pro r-tPA, tak pro TNK-tPA.
Dostupnost této metody HPLC na reverzní fázi velice usnadňuje vývoj procesu výroby. Byla použita pro hodnocení vlivu různých fermentačních podmínek na kvalitu produktu, pokud se týká integrity produktu (tj. procent zastoupení jednořetězcové formy) a poměru izoenzymů typu I a typu II. Byla také použita pro usnadnění vývoje postupu purifikace a pro zajištění konzistence mezi šaržemi produktu. Všechny tyto aplikace dokládají klíčovou roli analytických a komerčních metod při vývoji nových farmaceutických prostředků.
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob sledování účinnosti purifikačního postupu při odstraňování aktivátoru plazminogenu (PA), pocházejícího z buněk vaječníku čínského křečka (CHO), ze vzorku obsahujícího lidský tPA nebo jeho varianty, vyznačující se tím, že obsahuje inkubaci vzorku s proteázou35 schopnou specifického štěpení vazby Arg275 -1le276 ve standardním typu lidského tPA a dále inkubaci s denaturačním činidlem a redukčním činidlem v množstvích, která jsou účinná pro redukování disulfidových vazeb ve standardním typu lidského tPA; zpracování vzorku pomocí HPLC na reverzní fázi a analyzování elučního profilu z chromatografie kého kroku na přítomné množství PA, pocházejícího z buněk CHO.
- 2. Způsob podle nároku 1, vy z n a č uj íc í se t í m , že proteázou je plazminogen.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že lidský tPA je tPA s přirozenou sekvencí.
- 4. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se tím, že variantou tP A je TNK-tPA.
- 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vzorek je před inkubací zředěn štěpícím pufrem.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že pufr má pH 7 až 8.
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že pufrem je fosforečnanový pufr.55
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že pufr dále obsahuje arginin.- 10CZ 302023 B6
- 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že denaturační činidlo obsahuje močovinu nebo guanidin.5
- 10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že redukční činidlo obsahuje dith i othreitol nebo 2-merkaptoethanol.
- 11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že chromatografický krok je proveden gradientovou elucí pomocí rozpouštědla, obsahujícího acetonitril.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16360799P | 1999-11-04 | 1999-11-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021196A3 CZ20021196A3 (cs) | 2002-08-14 |
| CZ302023B6 true CZ302023B6 (cs) | 2010-09-08 |
Family
ID=22590762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021196A CZ302023B6 (cs) | 1999-11-04 | 2000-11-01 | Zpusob sledování úcinnosti purifikacního postupu |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6593097B1 (cs) |
| EP (1) | EP1226269B1 (cs) |
| JP (1) | JP4659320B2 (cs) |
| KR (1) | KR100649043B1 (cs) |
| CN (1) | CN1167808C (cs) |
| AT (1) | ATE243263T1 (cs) |
| AU (1) | AU781023B2 (cs) |
| BR (1) | BRPI0015283B8 (cs) |
| CA (1) | CA2384756C (cs) |
| CZ (1) | CZ302023B6 (cs) |
| DE (1) | DE60003449T2 (cs) |
| DK (1) | DK1226269T3 (cs) |
| ES (1) | ES2200973T3 (cs) |
| HK (1) | HK1046158B (cs) |
| HU (1) | HU226202B1 (cs) |
| IL (1) | IL149006A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02004401A (cs) |
| NO (1) | NO329876B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ518187A (cs) |
| PL (1) | PL204011B1 (cs) |
| PT (1) | PT1226269E (cs) |
| SI (1) | SI1226269T1 (cs) |
| WO (1) | WO2001032915A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200202687B (cs) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE391789T1 (de) | 1999-12-10 | 2008-04-15 | Invitrogen Corp | Verwendung einer vielzahl von rekombinationsstellen mit einzigartiger spezifität beim rekombinatorischen klonen |
| AU2715302A (en) | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Invitrogen Corp | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US6972327B1 (en) * | 2001-05-08 | 2005-12-06 | Immunex Corporation | Regeneration of chromatography material |
| EP1885488B1 (en) * | 2005-05-24 | 2015-07-08 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | Regeneration of a chromatography matrix |
| KR100701265B1 (ko) * | 2006-01-16 | 2007-04-02 | 대한민국 | 재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 발현벡터 및 플라스미노겐 활성인자를 소변으로 분비하는 형질전환돼지 생산방법 |
| CN101511387A (zh) * | 2006-09-08 | 2009-08-19 | 惠氏公司 | 使用亲和色谱法纯化蛋白质的精氨酸洗涤液 |
| JP2010507384A (ja) * | 2006-10-27 | 2010-03-11 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ | キナーゼ阻害剤のプロファイリング方法 |
| CN101539550B (zh) * | 2009-04-28 | 2012-05-23 | 李绍平 | 用于多糖的定性与定量分析方法 |
| EP3592858A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | Universität des Saarlandes | Means and methods for lignin pyrolysis |
| CN108333281A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-07-27 | 吉林大学 | 一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法 |
| CN108918749B (zh) * | 2018-07-17 | 2020-05-05 | 北京赛升药业股份有限公司 | 一种蛇毒纤溶酶的反相hplc检测方法 |
| CN114426962A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-05-03 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | t-PA纯化方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989004367A1 (en) * | 1987-11-05 | 1989-05-18 | Genentech, Inc. | Method of purifying recombinant proteins from corresponding host cell proteins |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI831484L (fi) | 1982-05-05 | 1983-11-06 | Genentech Inc | Plasminogen aktivator foer maenskovaevnad |
| US4766075A (en) | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| US4777043A (en) * | 1985-12-17 | 1988-10-11 | Genentech, Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
| US5120535A (en) * | 1986-11-26 | 1992-06-09 | Oncogen | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity |
| GB8919803D0 (en) * | 1989-09-01 | 1989-10-18 | Ciba Geigy | Pharmaceutical compositions |
| DE10199044I2 (de) | 1992-06-03 | 2006-02-09 | Genentech Inc | Varianten des Gewebeplasminogenaktivators mit verbesserter Therapeutischer wirkung |
| US5753702A (en) * | 1996-05-22 | 1998-05-19 | University Of Vermont | Arachidonic acid metabolite, 16-hete |
-
2000
- 2000-11-01 US US09/703,695 patent/US6593097B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 DK DK00978343T patent/DK1226269T3/da active
- 2000-11-01 WO PCT/US2000/030252 patent/WO2001032915A2/en active IP Right Grant
- 2000-11-01 PL PL355389A patent/PL204011B1/pl unknown
- 2000-11-01 IL IL14900600A patent/IL149006A0/xx active IP Right Grant
- 2000-11-01 KR KR1020027005727A patent/KR100649043B1/ko active IP Right Grant
- 2000-11-01 CN CNB008153434A patent/CN1167808C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 JP JP2001535595A patent/JP4659320B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 BR BRPI0015283 patent/BRPI0015283B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-11-01 MX MXPA02004401A patent/MXPA02004401A/es active IP Right Grant
- 2000-11-01 CA CA2384756A patent/CA2384756C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 HU HU0202973A patent/HU226202B1/hu unknown
- 2000-11-01 PT PT00978343T patent/PT1226269E/pt unknown
- 2000-11-01 AT AT00978343T patent/ATE243263T1/de active
- 2000-11-01 DE DE60003449T patent/DE60003449T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 ES ES00978343T patent/ES2200973T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 NZ NZ518187A patent/NZ518187A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-11-01 CZ CZ20021196A patent/CZ302023B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-11-01 EP EP00978343A patent/EP1226269B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 SI SI200030178T patent/SI1226269T1/xx unknown
- 2000-11-01 AU AU15816/01A patent/AU781023B2/en not_active Expired
-
2002
- 2002-04-05 ZA ZA200202687A patent/ZA200202687B/en unknown
- 2002-05-03 NO NO20022122A patent/NO329876B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-10-28 HK HK02107782.5A patent/HK1046158B/zh unknown
-
2003
- 2003-05-21 US US10/443,701 patent/US6828118B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989004367A1 (en) * | 1987-11-05 | 1989-05-18 | Genentech, Inc. | Method of purifying recombinant proteins from corresponding host cell proteins |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ancinetti V. and Hancock W.S.: "Analytical considerations in the development of protein purification processes", Bioprocess Technol., Vol. 18, 11-36, 1994 * |
| Apffel A. et al.: "Application of new analytical technology to the production of a "well-characterized biological", Dev. Biol. Stand., Vol. 96,11-25, 1998 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kohno et al. | Kidney plasminogen activator: a precursor form of human urokinase with high fibrin affinity | |
| Winkler et al. | Purification and characterization of recombinant single-chain urokinase produced in Escherichia coli | |
| CA2384756C (en) | Reversed-phase hplc assay for plasminogen activators | |
| Lim et al. | Affinity purification and enzymatic cleavage of inter-alpha inhibitor proteins using antibody and elastase immobilized on CIM monolithic disks | |
| Wiman et al. | Amino‐Acid Sequence of the Cyanogen‐Bromide Fragment from Human Plasminogen that Forms the Linkage between the Plasmin Chains | |
| Franklin et al. | Chromatographic evidence for the existence of multiple forms of cathepsin B1 | |
| Exner et al. | Characterisation and some properties of the protein C activator from Agkistrodon Contortrix Contortrix venom | |
| Mazar et al. | Domain analysis of urokinase plasminogen activator (u-PA): Preparation and characterization of intact A-chain molecules | |
| Powell et al. | Isolation of human Val354-plasminogen as an elastolytic fragment of human Glu1-plasminogen | |
| RU2112528C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДЕСТАБИЛАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕГО ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ, ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЙ, ЭНДО- И ЭКЗО- ε(γ GLY)-LYS-ИЗОПЕПТИДАЗНОЙ И АМИДОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ | |
| Dawson et al. | Substitution of arginine 719 for glutamic acid in human plasminogen substantially reduces its affinity for streptokinase | |
| Pohl et al. | Tissue plasminogen activator mutants lacking the growth factor domain and the first kringle domain: I: DNA Constructions, Expression in Mammalian Cells, Protein Structure, Fibrin Affinity and Enzymatic Properties | |
| KR100583537B1 (ko) | 활성화된 응고 인자 ｖｉｉ에 특이적인 모노클로날 항체 및 이의 용도 | |
| Dewerchin et al. | Characterisation of conjugates of thrombin-treated single chain urokinase-type plasminogen activator with a monoclonal antibody specific for crosslinked fibrin | |
| Mirshahi et al. | A monoclonal antibody directed against an epitope in the NH2-terminal region of native human plasminogen induces a modification of its functional properties | |
| Reddy et al. | Differential autolysis of human and canine plasmins | |
| Shikata et al. | Intelligent peptide-mapping method for recombinant human tissue-type plasminogen activator by lysyl-endopeptidase digestion | |
| AU740727B2 (en) | Activated vitamin K-dependent blood factor and method for the production thereof | |
| Pohl et al. | Porcine tissue plasminogen activator: immunoaffinity purification, structural properties and glycosylation pattern | |
| Bezeaud et al. | Limited proteolysis of human α-thrombin by urokinase yields a non-clotting enzyme | |
| Kentzer et al. | Characterization of plasmin digested peptide maps for recombinant high molecular weight urokinase and pro-Urokinase. Its use for the estimation of low molecular weight urokinase in pro-UK/HMW-UK | |
| WO1989009820A1 (en) | PURIFIED TYPE I AND TYPE II tPA | |
| JPH0759191B2 (ja) | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法 | |
| MXPA99008147A (en) | Activated vitamin k-dependent blood factor and method for the production thereof | |
| JPH0377900A (ja) | 血漿因子、その精製方法およびそれを有効成分として含有する血栓溶解剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20201101 |