KR100701265B1 - 재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 발현벡터 및 플라스미노겐 활성인자를 소변으로 분비하는 형질전환돼지 생산방법 - Google Patents

재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 발현벡터 및 플라스미노겐 활성인자를 소변으로 분비하는 형질전환돼지 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 발현벡터 및 소변으로 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자를 분비하는 형질전환돼지 생산방법에 관한 것으로서, 사람의 혈관내에서 혈전을 형성하는 섬유소 단백질의 기능을 저하시키는데 중요한 역할을 하는 단백질 분해효소 플라스민의 형성 작용을 활성시키는 조직형 플라스미노겐 활성인자(tPA)를 돼지 소변으로 분비할 수 있도록 형질전환시키는 돼지를 생산할 수 있도록 하기 위한 것이다.
형질전환 돼재, htPA, 플라스미노겐 활성인자, 방광, 소변

Description

재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 발현벡터 및 플라스미노겐 활성인자를 소변으로 분비하는 형질전환돼지 생산방법{METHOD FOR GENERATING TRANSGENIC PIG SECRETING HUMAN TISSUE-PLASMINOGEN ACTIVATOR IN ITS URINE}
도 1은 본 발명 실시예 1에 사용된 생쥐 방광 특이 프로모터를 크로닝하는 과정 모식도.
도 2는 실시예 1에 사용된 사람 플라스미노겐 활성인자 유전자를 크로닝하는 과정 모식도.
도 3은 실시예 1에서 돼지 소변으로 사람 플라스미노겐 활성인자를 분비할 수 있는 재조합 발현벡터 구축과정 모식도.
도 4는 수정란 이식에 의해 분만된 자돈 꼬리 DNA로 부터 PCR 검정결과.
도 5는 일반돼지와 본 발명 형질전환 돼지 소변에서의 사람 플라스미노겐 활성인자. 단백질 함량 비교 그래프.
본 발명은 유전자 재조합기술을 이용하여 인간의 혈전용해제로 응용할 수 있 는 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA)를 돼지의 소변에서 분비할 수 있는 형질전환 돼지를 생산하기 위한 것이다.
일반적으로, 생체 혈류내 혈전용해 작용을 하는 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(human tissue Plasminogen Activator; htPA)는 플라스미노겐 아미노산 서열내의 알기닌(arginine)과 발린(valine) 단일결합의 가수분해에 의해 플라시미노겐을 플라스민으로 변환 시키는 전구효소(zymogen) 기능을 가지고 있으며, 플라스민 매개 단백질 분해효소로서 조직의 재구성(remodeling) 및 변성(degradation) 그리고 세포의 이동(migration) 및 다른 여러 가지 생리병리학적 기작(physiopathological events)에 있어서 중요한 역활을 하고 있다.
사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA)는 약 68~72kDa의 단백질로서 562개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 그 중 527개의 아미노산이 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA) 단백질을 구성하는 당단백질(glycoprotein) 형태를 나타내고 있다. 이러한 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA)는 매우 복잡한 분자 구조를 나타내는데 황화결합(disulfidebond)에 의해 A사슬(chain A)과 B사슬(chain B)의 이형 복합체(heterodimer)형태를 이루고 있다. 이는 높은 친화성에 의해 혈액내 섬유소(fibrin)와 결합하게 되며, 이 두 사슬의 상호 작용은 혈액내 플라스미노겐에 대한 친화성 증가에 의하여 100~1,000배에 달하는 효소 촉매 효율을 증가시킨다. 이는 헤파린(heparin) 결합이 혈액내에서 플라스미노겐의 활성을 증가시키는 것과 유사한 결과를 나타낸다. 그리고 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA)의 합성은 주로 혈관상피세포에서 만들어지는 것으로 알려져 있고 종양(tumor)을 포함한 다양한 조 직에서도 합성되며, 혈장(plasma), 자궁점액(uterine fluid), 타액(saliva), 치은구내점액(gingival crevicular fluid), 눈물(tears), 정장(seminal fluid) 그리고 유즙(milk)으로 분비되는 것으로 알려져 있다.
이러한 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA)는 혈류내에 존재하는 플라스미노겐(plasminogen) 단백질을 혈전(fibrin clots) 분해효소 플라스민(plasmin)으로 활성화하여, 혈전의 원인이 되는 섬유소(fibrin)를 분해하는 동시에 혈전을 용해시켜, 급성심근경색(myocardial infarction), 폐색전증(pulmonary embolism), 중풍(paralysis), 뇌졸중(cerebral apoplexy), 동맥경화(arteriosclerosis) 등의 각종 색전증(thromboembolism)의 치료제로 사용된다.
그러나, 지금까지 상기의 치료제는 미생물과 동물세포 배양에 의해 생산된 제조합 tPA를 정제하여 사용하고 있으나, 분비량이 너무 적고, 또한 생리활성도 천연형과는 동일하지 않으며, 세포에서 생산되는 htPA는 매회 생산 시 활성도가 달라지는 문제점을 나타내었다.
본 발명은 상기한 종래 기술에서의 문제점을 개선하기 위해 제안된 것으로서, 동물생체 자체에서 천연의 htPA 단백질 구조와 기능면에서 유사하며 인간의 혈전 용해제로 사용되는 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA)를 소변으로 대량 생산할 수 있는 형질 전환돼지를 유용하게 생산토록 하는데 목적이 있다.
상기 목적은, 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA) 유전자를 이용하여 재조합 발현벡터를 구축하고 돼지의 1세포기 수정란을 확보하여 미세주입하고 외과적 수정란 이식에 의한 자돈 생산과 생산된 자돈에 대한 유전자 검정에 의해 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA) 유전자가 형질전환된 돼지를 확인하고 유전자 검정된 형질전환돼지 소변에서 htPA 단백질 분비를 검정하는 형질전환돼지 생산 방법을 통해 이루어질 수 있게 된다.
< 실시예 1> 사람 조직형플라스미노겐 활성인자 ( htPA ) 재조합 발현벡터 구축
생쥐(mouse)의 게놈 DNA를 주형으로 하여 방광조직 특이 발현을 조절하는 3.6kb의 mouse UPII promoter를 PCR을 이용하여 증폭하고 크로닝 하였다. 생쥐(mouse) 꼬리 조직에서 genomic DNA 추출은 MagExtractor-Genome-(Toyobo NPK-101)키트를 이용하였으며, 생쥐 방광 특이 발현 프로모터(mouse uroplaskin II promoter)를 크로닝 하기 위해 프라이머를 설계하였는데, forward 5'-GTT CAA AGT GGC TCA CTC AAA GTT ACA AGC CA -3', reverse 5'- CTG CGC TGG GAC TCG ATC GTG GAA CAG GTG GTG-3'를 사용하여 PCR로 증폭하였고, 얻어진 유전자 단편 3.6kb를 pCR2.1 크로닝 벡터(Invitrogen)에 삽입하여 크로닝을 완료하였다(도 1).
이렇게 크로닝 벡터에 삽입된 생쥐 방광특이 발현 프로모터를 확인하기 위해 KpnI과 salI 제한효소를 이용하여 크로닝 유무를 확인하였다.
사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA)는 인간 태아 간 조직 유래 cDNA(BD Science)로부터 PCR을 이용하여 얻었는데, PCR을 위하여 설계한 프라이머는 forward 5'- ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG -3'이며, reverse 5'- TCA CGG TCG CAT GTT GTC ACG AAT CCA GTC TAG -3' 이며, 이를 이용하고 PCR로 증폭하여 1,689 bp의 유전자 단편을 얻어 pCR2.1 크로닝 벡터(Invitrogen)에 삽입하여 크로닝을 완료하였다(도 2).
이렇게 크로닝 벡터에 삽입된 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA)유전자를 확인하기 위해 KpnI과 SalI 제한효소를 이용하여 크로닝 유무를 확인하였다.
또한 유전자 발현 종료신호(SV poly A) 단편을 pCR2.1 크로닝 벡터를 이용하여 전체 발현 벡터를 재조합하기 위해 준비하였으며(모식도는 나타나지 않았음), 이러한 재조합 발현벡터를 구축하기 위하여 프로모터가 크로닝된 벡터와 유전자 발현 종료신호가 크로닝된 벡터를 이용하여 이후에 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA) 유전자를 삽입시키기 위한 카세트 크로닝 벡터를 구축한 다음, 최종적으로 소변으로 사람 플라스미노겐 활성인자(htPA)를 분비하는 형질전환돼지 생산용 재조합 발현벡터를 구축하였다(도 3, 서열목록 1).
이렇게 구축된 재조합유전자 mUPⅡ-htPA-SV poly A를 pCR2.1에 삽입한 후, 대장균(Ecoli : TOPO 10F: Invitrogen사)에 형질전환시켜, 이 벡터가 들어가 있는 콜로니로부터 대량의 플라스미드를 추출한 후, EcoRI과 EcoRV 제한효소로 절단하여 상기의 미세주입용 유전자를 돼지 1세포기 수정란의 전핵 내 미세주입에 사용하였다.
< 실시예 2> 돼지 수정란의 채란 및 이식
과배란 유도제 호르몬인 PMSG 및 hCG를 근육내주사하여 과배란을 유기 하였으며, hCG 주입 후 약 54시간에, 외과적 수술방법으로 돼지 난관에서 체내 1세포기 수정란(in vivo 1cell embryo)을 회수하고, 실시예 1에서 구축된 재조합 사람 플라 스미노겐 활성인자(htPA) 발현벡터를 현미경 미세조작기를 이용 웅성전핵에 주입한 후, 발정동기화 된 대리모에 외과적 수술 방법으로 돼지 난관에 수정란 이식을 수행하였다.
< 실시예 3> 분만자돈 돼지꼬리로부터 게놈 DNA 추출 및 PCR 검정
재조합 발현벡터가 도입된 돼지 1세포기 수정란이 이식된 대리모로부터 112~116일후 분만된 신생 자돈의 꼬리조직에서 게놈 DNA를 추출하고 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA) 유전자를 코드하는 DNA가 전이된 것을 PCR 방법을 통해 확인하였고, 도 4의 PCR 검정결과로 나타내었으며, htPA 유전자 증폭에 사용된 프라이머 염기서열은 하기의 [표 1] 및 서열목록 3 내지 6과 같다.
프라이머 염기서열 증폭크기
htPA-450 F 5'-AgC CAg ATC TTA CCA AgT gA-3' R 5'-TCT ggg TTT CTg CAg Tag TT-3' 450bp
htPA-831 F 5'-AAA CAg TgA CTg CTA CTT Tgg-3' R 5'-TCg gTg ACT gTT CTg TTA AgT-3' 831bp
이에 사용된 PCR 반응액 제조는 총량 25㎕로 하였으며, 주형 DNA는 25~100ng을 사용하였으며 프라이머는 각 10pmole 농도를 사용하였고 Taq 중합효소량은 1unit를 첨가하였다. 또한 PCR 수행 조건은 전처리를 95℃에서 5분간 수행한 후 본 처리를 하였다. 본 처리는 총 30회 반복하였으며 98℃에서 20초, 58℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분간 수행하였다. 이의 PCR 수행으로 얻어진 증폭산물은 2.5% 아가로즈젤(0.5X TBE 전기영동용 버퍼)을 이용하여 전기영동 후 유전자 삽입 유무를 검정하게 된다.
< 실시예 4> 형질전환돼지 소변내 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 ( htPA ) 단백질 함유검정
일반돼지와 형질전환돼지의 소변을 회수하여 htPA 농도를 확인하기 위하여 Elisa(BioPool)방법으로 분석한 결과를 도 5에 나타내었다. 일반돼지와 형질전환돼지의 소변은 자연상태에서 분비된 소변을 곧바로 회수하여 -80℃에 냉동 저장하였다가 Elisa 측정을 위하여 4℃에서 서서히 녹인 후 사용된 Elisa(BioPool) 키트의 설명서에 나타난 것과 동일한 과정을 거쳐 돼지 소변내 사람 플라스미노겐 활성인자(htPA) 농도를 측정하였다. 그 결과 일반돼지 소변내에는 2.5±0.28ng/ml으로 나타났으며 형질전환돼지의 소변에서는 htPA 농도가 7.44±0.98ng/ml로 나타났다. 이는 건강한 성인(25~34세)의 혈장내 htPA 농도가 남자가 5.5ng/ml 그리고 여자가 4.0ng/ml 이라는 보고와 비교하여 볼때 형질전환돼지 소변내 사람 플라스미노겐 활성인자(htPA)의 농도가 월등히 높다고 판단할 수 있었으며 이러한 결과를 토대로 돼지 소변으로 사람 플라스미노겐 활성인자(htPA)를 분비하는 형질전환돼지가 생산되었음을 최종 확인할 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같은 본 발명은, 형질전환돼지의 소변을 통하여 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA)를 대량으로 생산함으로서 동물생채내에서 안전하고 지속적인 물질을 지속적으로 공급받을 수 있게 되고, 이에 따른 인간의 뇌졸중과 혈전중의 치료제로서 생물 의약품을 생산할 수 있는 효과를 나타내게 된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. 서열목록1의 염기서열을 가지며, 제한효소 사이트 EcoRI과 KpnI를 갖고 있는 mouse UPⅡ 프로모터와 양쪽에 SalI 과 EcoRV 사이트를 가지고 있는 SV40 Poly A의 KpnⅠ와 SalI 사이 중간에 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자(htPA) 유전자를 결합시켜 구축된 재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 발현벡터.
  2. 삭제
  3. 청구항 1의 발현벡터를 이용한 소변으로 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자를 분비하는 형질전환돼지 생산방법.
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