PT96854A

PT96854A - Processo para a prparacao de vectores compostos para a expressao de formas zinogenias da proteina c humana

Info

Publication number: PT96854A
Application number: PT96854A
Authority: PT
Inventors: Bruce Edward Gerlitz; Brian William Grinnell
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1990-02-23
Filing date: 1991-02-22
Publication date: 1991-10-31
Also published as: IE910610A1; ZA911330B; HUT61592A; HU910605D0; NZ237198A; CA2036915A1; JPH05103678A; KR910021476A; EP0443875A3; NO910720D0; AU7130891A; CN1054798A; NO910720L; EP0443875A2; YU31791A; MX24652A; US5270178A; FI910853A0; FI910853A; IL97310A0

Description

>

0 presente invento proporciona novos compostos de DNA e vectores de clonagem de DNA recombinante que codificam novas formas zimogénicas da proteína C humana. Estes zimogénios podem ser activados in. vivo pela trombina sózinha a uma velocidade importante clinicamente e são muito mais susceptíveis à activação pela trombina/trombomodulina do que o zimogénio da proteína C nativa. Os vectores de expressão proporcionam um meio simples e eficaz para a expressão destes zimogénios da proteína C humana em células hospedeiras recombinantes. Os zimogénios da proteína C humana nativa requerem tratamento com níveis elevados de trombina outrombina e trombomodulina ou outras enzimas caras para activação. 0 presente invento proporiona um método para a produção de formas de zimogénio da proteína C humana que servem como melhores substratos da trombina e consequentemente podem ser activados na presença de níveis mais baixos de trombina ou trombina/trombomo-dulina ou outras enzimas, é ainda mais importante que as formas de zimogénio da proteína C humana do invento podem ser activadas pela trombina mesmo na presença de Ca”" fisiológico o qual é inibidor da activação do zimogénio da proteína C nativa pela trombina. As novas formas do zimogénio da proteína C humana diferem das conhecidas de outros trabalhos nas sequências de resíduos de aminoâcidos na região do peptídeo de activação, o qual é removido das formas de zimogénio para produzir proteína C activada. Estas novas formas de zimogénio da proteína C oferecem vantagens especiais no tratamento de anomalias no sangue envolvendo coagulação. A proteína C, uma proteína do plasma dependente da vitamina K, é de grande importância fisiológica no controle da bemostasia. A proteína C á sintetizada como uma molécula ínactiva aqui designada proteína C nascente. A proteína C nascente sofre um processamento complexo, dando origem a uma série de diferentes moléculas inactivas como é aqui descrito mais detalhadamente. As formas secret-adas de proteína C inactiva sê?o aqui referidas como zimogénio da proteína C. A activação de proteína C ocorre no sangue através de uma reacçSo envolvendo um complexo trombomodu— 1ina—trombina. A proteína C activada, juntamente com o seu cofactor proteína S, é um antácoagulante com bastante importância fisiológica. A proteína C activada pode evitar a trombose intravascular e controlar a extensão de coágulos existentes. 0 mecanismo de acção da forma activada da proteína C e o mecanismo de activacão do zimogénio inactivo para protease activa foram ec lar i ficados nos últimos anos (para uma revisão, ver -J.E. 6'ard.iner e J.H. Qriffin.· Progress in Hematology. Vol. XIII, pp. 265-278, ed. Elmer .6. Brown, õrune e Strstton, Inc., 1383)e Esmon, N.L. 19:39, Proa Hemos t. fhromb. 9; 29-55). A activacão da proteína C envolve trombina, a protease serina final da cascada de coagulação e uma glicoproteina associada a membranas de células endoteliais designada trombomodu— l.ina. A trombomodu 1 ina forma um compl&xo estequiométrico forte com a trombina. A trombomodu3.ina quando complexada com trombina, altera dramaticamente as propriedades funcionais da trombina. A trombina normalmente coagula o fibrinogénio, activa as plaquetas e converte os cofactores de coagulação V e VIII nas suas formas activadas, Va e VlIXa. Finalmente, a trombina activa a proteína C, mas apenas muito lentamente e ineficazmente e a activacão é «K*?* ainda inibida por Ca fisiológico. Pelo contrário, a trombina complexada com trombomodu!.1 na não coagula o fibrinogénio, activa as plaquetas ou converte os factores de coagulação V e VII nas suas contrapartes activadas Va e VIIIa, mas torna-se um activador

muito eficaz do zimogénio da proteína C na presença de Ca fisiológico. A constante de velocidade da activação do zimogénio da proteína C pela irombomodulina-trombina é cerca de de 1000 vezes superior á constante de velocidade da trombina sôzinha.

Para compreender como a proteína C regula de forma negativa a coagulação do sangue, é proporcionada a descrição breve que se segue sobre o sistema de enzimas de coagulação. 0 sistema de coagulação é melhor observado como uma reacção em cadeia envolvendo a activação sequenciada de zimogénios para proteases serina activas.Esta reacção em cadeia eventualmente produz a enzima trombina, a qual através de proteôlise limitada converte o fibrinogénio do plasma em fibrina insolúvel no gel. Dois acontecimentos chave na cascada de coagulação são a conversão do fact-or ds coagulação X para Xa através do factor de coagulação IXa e a conversão de protrombina em trombina pelo factor de coagulação Xa. Ambas as rsaccSes ocorrem nas superfícies celulares, principalmente na superfície de plaquetas e ambas as reacçbes necessitam de cofactores. Os principais cofactores, factores V e VIII, no sistema circulam como percursores reiativa mente inactivos, mas quando se formam as primeiras poucas moléculas de trombina, a trombina responde e act-iva os cofactores através de proteôlise limitada. Os cofactores activados, Va e VII.Ia, aceleram ambos a conversão de protrombina em trombina e também a conversão do factor X em factor Xa em aproximadamente cinco ordens de grandeza. A proteína C activada actua preferen-ciaimente para degradar proteoliticamente, hidrolizar e irreversivelmente destruir os factores de coagulação Va e VIIIa, as formas dos factores de coagulação inactivos V e VIII. Os factores de coagulação V e VIII, pelo contrário, são substratos muito fracos da proteína C activada in vivo.

Um cofactor importante para a proteína C aetivada é a proteína S, uma outra proteína do plasma dependente da vitamina K. A proteína S aumenta substancialmente a hidrólise mediada por proteína C aetivada dos factores Va e VIIIa 25 vezes. A proteína C é reconhecida como um importante agente terapêutico (ver, por exemplo, Bang et JÚ

Patente U.S.Nfi 4,775,624, publicada em 4 de Outubro de 1988, os ensinamentos da qual é aqui incorporado como referência). A proteína C aetivada é um novo agente anil -1 r ombó f, .1 c o com um índice terapêutico mais largo do que os anticoagulantes disponíveis, tais como heparina e os anticoagulantes orais do tipo hidroxicoumarina. Nem o zimogé-nio da proteína C nem a proteína C aetivada são eficazes at+e ser gerada trorobina, uma vez que a trombina é necessária para converter os factores de coagulação V para Va e VIII para VIIIa; as formas activadas destes dois cofactores são o substrato preferido para a proteína C aetivada. A trombina é também necessária para act-ivar o zimogénio da proteína C, pois sem o complexo trombomo-dulina-trombina, o zimogénio da proteína C não é eficazmente convertido na sua contraparte activa.

A proteína C aetivada é um anticoagulante desejável pois a proteína C aetivada funciona inactivando os cofactores Va e VIIIa. Devido á trombina ser necessária para converter os factores V e VIII nas suas contrapartes activadas Va e VIIIa, a proteína C actua apenas como anticoagulante após ser gerada a trombina. Os anticoagulantes convencionais ao contrário da proteína C aetivada, mantém um estado anticoagulante constante na circulação durante o tempo em que são administrados ao doente, aumentando assim substancialmente o risco de hemorregias relativamente è proteína C ou â proteína C aetivada. A proteína C >

activada é portanto um anticoagulante desejável de larga utilidade clinica para usar como alternativa à heparina e às hdroxicou-marinas.

Nalgumas doenças tais como deficiência hereditária em proteína C, o zimogénio da proteína C é de grande interesse terapêutico. Na deficiência congénita homozigóti ca da proteína C os indivíduos afectados morrem no inicio da infância de purpura íulminans, uma forma muitas vezes letal de coagulação intravascular disseminada.. Na deficiência heterozigótica relativamente á proteína C, os indivíduos afectados sofrem de surtos tromboembô-licos regulares. Está c .1 inicamente bem estabelecido que os concentrados de proteína do plasma destinados a tratar a hemofi-lia B ou a deficiência no factor IX, o qual contem proteína C como impureza, são defectivos na prevenção s tratamento de coagulação intravascular na deficiência, heterozigótica de proteína C. Também se observou níveis anormalmente baixos de proteína C em estados trombóticos tais como coagulação intravascular disseminada e em doenças com predisposição para a trombose, tais como trauma grave, cirúrgia e cancro.

Para facilitar uma compreensão da proteína C activada e do invento, descreve-se abaixo a sequência codificadora e a correspondente sequência de resíduos de a.m.inoácidos da proteína C humana, nascente. Esta sequência de resíduos de aminoácidos e suas partes importantes também caracterizam a "proteína C humana nativa" para fins do presente invento.

10 20 30 40 5'-ATG TGG CAG CTC ACA AGC CTC CTG CTG TTC GTG GCC ACC TGG GGA ATT h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE 5 10 15 50 60 70 80 90 TCC GGC ACA CCA GCT CCT CTT GAC TCA GTG TTC TCC AGC AGC GAG CGT SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG 20 25 30 100 110 120 130 140 GCC CAC CAG GTG CTG CGG ATC CGC AAA CGT GCC AAC TCC TTC CTG GAG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU 35 40 45 150 160 170 180 190 GAG CTC CGT CAC AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG GAG ATC TGT GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS 50 55 60 200 210 220 230 240 GAC TTC GAG GAG GCC AAG GAA ATT TTC CAA AAT GTG GAT GAC ACA CTG ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU 65 70 75 80 250 260 270 280 GCC TTC TGG TCC AAG CAC GTC GAC GGT GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO 85 90 95 290 300 310 320 330 TTG GAG CAC CCG TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG TGC ATC LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE 100 105 110 3 -

340 350 360 370 380 GAC GGC ATC GGC AGC TTC AGC TGC GAC TGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY 115 120 125 390 400 410 420 430 CGC TTC TGC CAG CGC GAG GTG AGC TTC CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN 130 135 140 440 450 460 470 480 GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGC CTA GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS 145 150 155 160 490 500 510 520 AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG CAG TGT CAC SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS 165 170 175 530 540 550 560 570 CCC GCA GTG AAG TTC CCT TGT GGG AGG CCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS 180 185 190 580 590 600 610 620 AAG CGC AGT CAC CTG AAA CGA GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL 195 200 205 630 640 650 660 670 GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC CCC ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO 210 215 220 680 690 700 710 720 TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA 225 230 235 240 730 740 750 760 GTG CTC ATC CAC CCC TCC TGG GTG CTG ACA GCG GCC CAC TGC ATG GAT VAI LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP 245 250 255

ÍO - 770 780 790 800 810 GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG 260 265 270 820 830 840 850 860 TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS 275 280 285 870 880 890 900 910 CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS 290 295 300 920 930 940 950 960 CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC TGC CTC LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU 305 310 315 320 970 980 990 1000 CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC AAT CAG GCC GGC CAG GAG PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU 325 330 335 1010 1020 1030 1040 1050 ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAC CAC AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA 340 345 350 1060 1070 1080 1090 1100 AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC AAC TTC ATC AAG ATT CCC GTG GTC LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL 355 360 365 1110 1120 1130 1140 1150 CCG CAC AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN 370 375 380 1160 1170 1180 1190 1200 ATG CTG TGT GCG GGC ATC CTC GGG GAC CGG CAG GAT GCC TGC GAG GGC MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY 385 390 395 400 1210 1220 1230 1240

GAC AGT GGG GGG CCC ATG GTC GCC TCC TTC CAC GGC ACC TGG TTC CTG

ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU 405 410 415 1250 1260 1270 1280 1290

GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC CTT CAC AAC TAC

VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR 420 425 430 1300 1310 1320 1330 1340

GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC GAC TGG ATC CAT GGG CAC

GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS 435 440 445 1350 1360 1370 1380 ATC AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG-3' ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH 450 455 460 em que A á desoxiadenilo, Θ ê desoxiguaniIo, C é desocitidilo, T é timidi lo, ALA é Alanina, A.R6 é Arginina, ASM é Asparδgina. ASP é Ácido aspártico, -CUUm è o extremo carfoonilo, CYS é Cisteína, 6LN é Slutamina, 6LU é ácido gluiâmico, SLY é 61icina, HIS é h.i stidlna, H?iM- é o extremo aotina, ILE é isoleucina, LEU é Leucina, LYS ê Ls.1 via, MET e Met-ionina, PHE è Fenilalanina, PRO é Prolina, SER é Serina, THR é Treonina, TRP é Tripiofano, TYR é Ti r* os i na e VAL é Vali na. • ....... · >— " ' ” ™ "· * ·“« Γμ "JWI am V» 'η M n» » d· M W\ U proteína C humana. Os familiarizados com o ramo reconhecem que <· natureza degenerada do código genético permite construir mu-A_' 'quências diferentes de DNA que codificam a mesma sequência de A sequência de DMA descrita atrás derivou de clones de cDNA preparados a partir de mRNA de fígado humano que codifica a iã mu i tas

resíduo» d® aminoácidos. A sequência do cDNA para a proteína C humana nascente descri ta atrás é portanto apenas uma das muitas sequências possíveis codificadoras de proteína C humana nascente Na construção de cienes de cDNA, construiu-se uma sequência poli & 5‘, uma sequência poli C 3' e sequência de reconhecimento da enzima de restrição PstI 5' e 3' nos extremos do c-DNA codificador da proteína C. Dois destes clones de cDNA foram manipulados para construir uma molécula de DNA compreendendo a sequência codificadora da proteína C.humana nascente e também fracçbes do da DNA codificador do mRNA não traduzido nos extremos 5' região codificadora. Esta molécula de DNA foi inserida no sítio PstI do plasmídeo pBR322 para construir o plasmideo pHC7. q Ρ.1.asmídeo pHC7 compreende assim a sequência codificadora atrás © novamente descrevendo apenas uma cadeia da molécula, também contem estas sequências adicionais: 51 -C TGC AGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG CTG TCA TGG CGG CAG GAC GGC GAA CTT GCA GTA TCT CCA CGA CCC GCC CCT ACA GGT GCC AGT GCC TCC AGA-3’ e 5'-CGA CCC TCC CTG CAG GGC TGG GCT TTT GCA TGG CAA TGG ATG GGA CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCT GCA G-3'

da à B e nos extremos 5' e 3', respectivamenie, da cadeia codificadora sequência codificadora da proteína C humana nascente. Devido natureza complementar do emparelhamento de bases do DNA, sequência de uma cadeia de uma molécula de DNA de cadeia dupla

suficiente para determinar a sequência da cadeia oposta. 0 plasmideo pHC7 pode ser convencionalmente isolado a partir de E. col i K' 1.2 RRí/pHC7, uma estirpe depositada e englobada na cal seção permanente de culturas do Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria Illinois. Uma cultura de E. coll K.1.2 RR 1 /pHC7pode ser obtida da NRRL com o número de acesso NRRL 8-1-5926. Na Figura. .2 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e de funções do plasmideo pHC7. A prote5.na C nascente também P‘ode ser descrita esquema* ticamente como se mostra abaixo.

H 42|43 Ipre-pro | LC

197)198 199|200 211(212 I KR 1 AP I

461 AHC <--HC-> pre-pro - resíduos de aminoácidos .1.-42 da proteína C humana nascente codificam o peptídeo sinal e o propaptídeo da proteína G humana, importante para dirigir a secreção e gama-carboxilação da proteína C.

LC

KR resíduos de aminoacidos 43—197 da proteína C nascente, uma vez modificados após tradução, constituem a cadeia 1 ave \L. G) do zimogênio de ouas caoeias 1 formado a partir do zimogénio de uma cadeia pela remoção do dipeptídeo KR, conforme discutido abaixo) e formas a.c t i vadas da p pote,, na C. resíduos de aminoácidos 198-199 da proteína C humana

nascente} pensa—se que estes resíduos sejam removidos (com base na hcmologia com proteína C bovina), provavelmente por um processo de dois passos compreendendo uma primeira clivagem (entre os resíduos 197-198 ou 199-200) seguido da acção de carbo.x'ipeptidase ou de aminopeptidase, para formar a proteína C de duas cadeias. AP - resíduos de aminoâcidos 200-211 da proteína C nascente constituem o peptideo de aciivação, o qual é removido das formas de zimogénio da proteína C para se obter a proteína C activada. AHC - resíduos de aminoâcidos 212-461 da proteína C nascente, uma vez modificada apôs a tradução, constituem a cadeia pesada activada (AHC) da proteína C activa. HG - a cadeia pesada da forma de duas cadeias do zimogénio da proteína C, uma vez modificada após tradução, é composta pelos resíduos de aminoâcidos 200-461, a AP e AHC. O zimogénio da proteína C humana é um precursor de protease serina sintetizado no fígado e presente no sangue. Para a expressão de actividade biológica completa, a proteína C necessita de modificações pás-tradução para as quais a proteína K é necessária. 0 zimogénio da proteína C com duas cadeias ligadas por ligações dissulfureto surge do zimogénio de uma só cadeia por proteólise limitada. Pensa-se que esta proteólise limitada inclua a clivagem e remoção dos resíduos de aminoâcidos 198 e 199. A activação do zimogénio de duas cadeias para protease serina activa envolve a clivagem proteoliiica de uma ligação pept-ídica ARS-LEU (resíduos 211 e 212). Esta última clivagem liberta, um dodecapeptídeo (resíduos 200-211), o peptídeo de activação, o qual constitui o extremo amine. da cadeia maior (pesada.) da molécula zimogénio de duas cadeias. A proteína C é significativa-mente glicosilada; a. enzima madura do plasma contem 15 a 23¾ de açúcar. A proteína C também contem uma série de aminoàcidos invulgares, incluindo ácido gama-carboxigluiãmico e ácido S-hi-droxiaspártico Ceritro-L-B-hidroxi-aspartato). 0 ácido gama-car-boxiglutâmico (gla) é produzido por carboxilação de gama-gluta-milo dos resíduos de ácido glutâmicocom a ajuda de uma carboxi-lase microsomal hepática que precisa da vitamina K como cofactov. A activação da proteína C humana pode também ser representada esquematicamente e está apresentada abaixo. 0? dos passos ordem dos familiarizados com a matéria reconhecem que a ordem mostrados no esquema não refletem necessáriamente a passoa na via in vivo. pre-pro-LC-KR-AP-AHC proteína C nascente modi f icação pôs-tradução, i . e. , ί gama-carboxilação de resíduos í de ácido glutâmico específicos, ! β-hidroxilação de um resíduo de í ácido aspártico e glicosilação í secreção, a remoção dos resíduos, 1-42, que pode envolver mais de i uma clivagem proteolática ! LC-KR-AP-AHC zimogénáo de uma cadeia !

I remoção dos resíduos 198-199, 1

cerca de 30% da proteína I zimogénio C encontrada no sangue,’ humano é a forma de duas cadeias, CS-S== ligação dissulfureio) ! LC I i-S j AHC-

zimogénio de duas cadeias AP activação por ! t r omb i na -1 r ombomodu 1 :i. na í

LC Ι·'-8 proteína C activada

ÃHCP 17

0 presente invento proporciona formantes e métodos para a novos compostos, vectores, trarté"' expressão recombinante de novos zimogénios de proteína C.

os

Para fins do presente invento tal como aqui é seguintes termos são definidos abaixo. Ad2LP- o principal promotor tardio do adenoví divulga- rus tipo

Os resíduos de aminoácidos nas proteínas ou peptídeos aqui descritos são abreviados como se segue na Tabela I.

Tabela 1

Abreviatura de uma só letra

Abreviatura de três letras Resíduo de anunoác ido FEN Fenilalanina F LEU Leuc i na L .TLE Isoleucina I MET Metionina H VAL Va1i na V SER Se rir)a o ·«.' PRO Prolina P TRE Treonina T ALA Alanina A TIR Ti rosina y HIS Histidina H SLN S1 u tarí; x na Q hSN Asparagina N LIS L i s i na K ASP Ácido aspárti co D SLU Â c i do g .1 u tâm i c o F CIS Císteina C TRP Triptofano y ARQ Arginina R GLI 61i c ina 6' ApR · ” o fenótipo de resistência á ampicilina que o confere. BK - DNA do vírus BK. 13

Enh ou potenciador — o potenciador do vírus BK ep ou SV40ep ~ um segmento de DMA compreendendo p promotor precoce do gene do antigénio T, os sítios de ligado ao antigénio T, o potenciador do SV40 e a origem de replicado do SV4C. gar/a-carfoox3.1 acSo — uma rsscçâo que adiciona um grupo carboxilo a ácidos glutâmicos no carbono gama.

Proteína Sama-carfcoxilada - uma proteína em que alguns resíduos de ácido glutâmico sofreram gama-carboxilaçSo.

Unidade de transcrição SBMT - uma unidade de controle da transcrição modificada compreendendo o potenciador P2 do vírus BK situado perto do elemento regulador a montante do principal promotor tardio do adenovírus íMLTF> f o principal promotor tardio do adenovírus tipo 2, um elemento poli ST colocado para estimular o referido promotor & uma sequência de DMA contendo a sequência lider tripartida e "spliced" do adenovírus. A unidade de transcrição QBMT encontra-se num fragmento de restrição HindlII do P1asm ídeo pST-h. IVS — DMA codificador de um intrêio, também designado sequência interviniente. MMTpro o promotor do gene da metalotioneína I de murganho.

Proteína nascente - o polipeptídeo produzido quando da tradução de um transcrito m.RNA; antes de quaisquer modificações pós-tradução. No entanto, as modificações pós-tradução tais como gama-carboxilação de resíduos de ácido glutámico e bidroxilação de resíduos de ácido aspártico podem começar antes de uma proteína ser totalmente traduzida a partir de um transcrito mRNA.

NeoR — qual pode também um gene que confere resistência â neomicina, o ser usado para conferir resistência ao antibió tico 6418. pA - uma sequência de DNA que dirige a transcrição de DNA em RNA.

Actividade de proteína C - qualquer propriedade de uma proteína C humana responsável por actividades proteolíticas, amidolíticas, esterolíticas e biológicas (anticoagulantes ou profibrinolíticas). Os métodos para testar a actividade anticoa-gulante de proteínas são bem conhecidos na área, i.e., ver Grinnel .1 et a,1. ., 1387, Biotechnology -5,* 1189.

Vector de clonagem de DNA recombinante - qualquer agente, incluindo, mas não estando limitados a agentes de integração cromossômicos, plasm.ídeos de replicação autónoma e fagos, compreendendo uma molécula de DNA â qual podem ser ou foram adicionados um ou mais segmentos de DNA adicionais.

Vector de expressão de DNA recombinante - qualquer vector de clonagem de DNA recombinante no qual foi incorporado um promotor e colocado de forma a dirigir1 a expressão de um produto genético.

Vector de DMA rscombinanie — qualquer vector de clona-" sem ou de expressão de DMA recombinante.

Rep .1 i c ão - uma sequência de DMA que controla e per mi t-n; v*epi cação autónoma de um plasmídeo ou de outro vector.

Fragmento de restrição - qualquer sequência de linear gerada pela acção de uma ou mais enzimas endonuclesses ^ restrição. Célula hospedeira sensível - uma célula hospedeira a-'je não pode crescer na presença de um dado antibiótico ou outro composto tóxico sem um segmento de DMA que lhe confere resistên·” c ia.

TcR — fenôtipo que confere resistência á tetracid1ϊ1β1 ou gene que confere a mesma.

Transformação — a introdução de DMA numa célula hosP*-deira recipiente que altera o genótipo da célula recipiente.

Transformante “ uma célula hospedeira recipiente C'M'~ sofreu transformação.

Sequência activadora da transcrição - qualquer seqw5-n"" cia de DMA, incluindo a codificadora de um sítio de ligação dU ribossoma e o codão de iniciação da tradução, como seja 5' -ATu"-'·' que proporciona a tradução de um transcrito de mRNA num peptíd^tf ou po 1 i pep t, í deo. enzimaticamente inactivo

Zimogênio — um precursor enzimaticamente inactivo de uma enzima proteo.1 í ti ca. 0 zimogênio da proteína C,- tal como aqui é usado., refere-se a formas inactivas secreiadas, quer de uma quer de duas cadeias, de proteína C. A Figura í é um mapa QS s í t i os de restrição e funções do Pi asmídeo pLPC—M. f *!a r c 5 f i ns do presente invento, as Figuras não estão desenhadas e: :<actamente à es cala, A F i. g u r a ,2 é um mapa d© sítios de restrição e funções do ρ1asm í deo pLPC—FN A Figura 3 é um mapa de s í t i os d© restrição e funções do plasmídeo pLPC-SN A Fx gu r a é um m a p a de S l Í<I os d© restrição e funções do Ρ1 asm í deo pLPC-L I.i N. A Figura 5 é um mapa de s í t i os de restrição e funções do P1 asm i deo pL.PC-FL. IN A Figura S ê um de sítios de restrição e funções do p1asm í deo pQTC. A Figura 7 é um mapa de sítios d© restrição e funções do P1asm í deo pGT-d. A Figura 8 já UFfj mapa de si ti os de restrição e funções do plasmídeo pGT-h. 0 presente invento proporciona compostos de DNA que codificam a expressão de novas formas de zimogénio da proteína C humana. Foram descritos vários métodos para a produção de zímogé-mo da proteína C humana nativa e de proteína C humana nativa Cver Bang et al. Patente U.S. 4775,62:4, publicada em 4 de

Outubro de 1988 e Publicação de Patente Europeia .215548, ambos sendo aqui incluídos como referência). Os métodos de trabalhos anteriores proporcionam expressão de formas de zimogénio de proteína 0 humana que não diferem na sequência de aminoâcidos das formas de zimogénio presentes em sangue humano. Quando expressas em certas linhas de células eucerióiicas, corso seja a linha celular 293 de rim humano, o zimogénio da proteína C humana nativa é secretado com um novo padrão de glicosilação que é diferente do encontrado na forma zimogénio do sangue humano. 0 presente invento proporciona formas zimogénio de proteína C humana que têm padrões de glicosilação alterados devido a alterações dirigidas na sequência de resíduos de amincá-cidos. Quando activadas estas formas de zimogénio têm uma actividade amidolítica e anticoagulante superior ã da proteína C humana nativa. 0 presente invento também proporciona compostos de DNA, vectores de expressão de DNA recombinante, linhas celulares transformadas e métodos para a expressão recombinante destas novas formas de zimogénio da proteína C humana. 0 método para a produção destas formas de zimogénio da proteína C humana caracteriza-se por! íA) transformação de uma célula hospedeira eucariôtica com um vector de DNA recombinante, o referido vector compreendendo, (1) uma sequência de DNA que codifica uma sequência de resíduos de aminoâcidos, a referida sequência de

resíduos de aminoâcidos compreendendo, do extremo amina para o extremo carboníloí (a > um peptídeo sinal e um pro-peptídeo de uma proteína secretada gama-carboxilada; < b) (c) e a cadeia leve da proteína C humana,' um dipept-ídeo seleccionado do grupo constituído por LIS-ARO, ARG-LIS, LIS-LI ARfí-ARfí; e a sequência de resíduos de aminoácidoí;

ASP THR GLU Rx R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 Rio Ru R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAI VAI LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

em que é seleccionado do grupo constituído por Ab‘P e LEU, R.-, é seleccionado do grupo constituído P‘~!r GLW e HIS, R.-, ê selecciona— do do grupo constituído por GLU e

TC

e R 4 ê seleccionado do

grupo constituído por ASP e LEU, -·ς grupo constituído por VAL. e TRE, R R_ é GLN, R,_ ê seleccionado do é seleccionado do grupo constituído por ASP, FEN e TIR, Rf, é PRi"L Rg é ASP, R1Q é seleccionado do grupo constituído por LEU e TRE, Rj^ é seleccionado do grupo constituído por ILE ou uma de 1 ecçSo, R^ê Atír-í e —CUUH ê o ex t remo c arbon i1o e

Cii > um promotor colocado de forma a conduzir a expressão da referida sequência de ONA; e (B> cultura da referida célula hospedeira transformada no passo CA) em condiçQes adequadas â expressão da referida sequência de DNA. Este método e compostos úteis no método são descritos mais de ta1hadamente aba i xo. 0 invento também proporciona compostos de DNA para usar no método de produção destas novas formas de zimogénio de proteína C humana. Estes novos compostos todos codificam um pre-propep-tídeo compreendendo um peptídeo sinal para dirigir a secreção e um propeptídeo de uma proteína gama—carboxiiada (através da acção de uma carhoxilase dependente de vitamina k>. Tais sequências de propeptídeo são bem conhecidas. Ver por exemplo, Suttie et al., .1.387, Proc. Natl. Sei. 84 ,‘634-637. De preferência e para facilidade de construção, tanto a sequência codificadora do peptídeo sinal como a sequência codificadora do propeptídeo derivarão da sequência de resíduos de aminoâcidos do pre-propeptídeo de uma proteína gama-carboxilada. Exemplos de tais proteínas gama-carbo-xilada incluem mas não estão limitados a factor VII, factor IX, factor X, proirombina, proteína S, proteína 2 e proteína €. Uma sequência de DNA codificadora do pre-propeptídeo da proteína C humana é usada de preferência nos vectores do invento.

Os compostos de DNA do invento compreendem ainda a sequência codificadora da cadeia leve da proteína C humana colocada imediatamente adjeacente e a jusante da grelha de leitura e na mesma fase de leitura da sequência codificadora do pre-propeptídeo. A cadeia leve da proteína C humana contem os resíduos de aminoácidos 43 a 197, inclusive, de proteína C nascente, como descrito na seccão de fundamento atrás. As frac-çSes amino-terminais das proteínas do plasma dependentes da vitamina K, tais como a fraccão amino-terminal da cadeia leve de proteína C, têm sítios de ligação ao cálcio. Os domínios de ligação ao cálcio destas proteínas do plasma, tais como factor VII, factor IX, factor X, protrombina e proteína S, podem ser usados de forma equivalente (ver Publicação de Patente Europeia N2 0215548A1, nas páginas 12 e Í3) ao domínio de ligação ao cálcio da cadeia leve da proteína C humana.

Os compostos de DNA do invento compreendem ainda a sequência codificadora do dipeptídeo LIS-ARO (KR) colocado imediatamente adjacente, a jusante e na mesma grlha de leitura de tradução da sequência codificadora da cadeia leve. Um dipeptídeo dibásico tal como LIS-ARO é colocado na proteína nascente no lado carboxi-terminal da cadeia leve. A orientação do dipeptídeo LIS-ARQ na proteína expressa é irrelevante para fins do presente invento. Dipeptideos dibásicos tais como LIS—LIS ou ARQ-ARQ são equivalentes ao dipeptídeo LIS-ARQ para fins do presente invento. No entanto para fins do presente invento é preferido o dipeptídeo LIS-ARQ, que é o dipeptídeo na proteína C humana nativa.

Imediatamenie a jusante dos codões para o dipeptídeo LIS-ARG está a sequência codificadora do peptídeo de aciivação. Nos compostos do invento, as alteaçfíes na sequência codificadora do peptídeo de activação e os 3 primeiros aminoâcidos da cadeia pesada (e correspondente sequência de aminoâcidos) são principalmente responsáveis pela propriedade cie aumento da sensibilidade â trombina destes novos zímogénios.

Os fami1iarizados com a matéria reconhecerão que as formas de zimogénio do presente invento diferem -essencialmente das formas de zimogénio nativas da proteína C humana como descrito abaixo. Na proteína C humana nativa o pepiídeo de activação & os 3 primeiros aa da cadeia pesada são; 200 201 202 203 204 20S 206 207 208 203 210 211 212 213 214 ASP-TRE-SLU-ASP-SLN-eLU-ASP-SLN-VAL-ASP-PRO-ARe-LEU-ILE-ASP, em que os números se referem à posição dos resíduos de aminoâcidos na proteína C humana nascente. 0 presente invento descreve que alterando vários resíduos resultai na correspondente forma de zimogénio tendo uma maior sensibilidade para a clivagem pelo c omp1exo tromb i na-1 rombomodu1i na.

As várias delecções e substituiçfíes cie aminoâcidos do presente invento conduzem â formação de formas mutanies que têm valores mais elevados de sensibilidade â trombina para o zimogénio resultante. 0 termo "zimogénio resultante" é usado para indicar que apesar das substituições serem descritas com referência a posições de aminoâcidos na proteína C humana nascente, a proteína C humana nascente deve ser secretada (resultando na remoção dos resíduos de aminoâcidos 1 a 42) para se obter uma

forma de zimogénio. A substituição do resíduo de ácido aspártico < no peptideo de aciivaçâo) na posição 214 na proteína C humana nascente por um resíduo de asparagina resulta, assim num novo zimogénio do presente invento. A deleção Cem vez da substituição) de um resíduo de aminoácicio também resulta em novas rormas de zimogénio da proteína €. Para. facilidade de compreensão e numera™ ç cr o f uma deleção é representada por um o 0 Quando um aminoácido é e .1 i m i ria do, os aminoácidos d [gi ambos os 1ados do resíduo el iminado são ligados para formar s c ade i a de zimogénio contígua. A Tabela I a p r e s e n t a. v ái r i a s f o r m a de novos zimogénios da proteína C deste invento.

04 PU a a a a a γΗ P CP CP CP CP CP CP ί« CS < < < < < < tw eo w li P Há 0.1 3 3 Pá CS M HT P α CS P P P P P w rH W ω w w w Pá CS 3 P P H P P i—t α o o o o ca 05 rH pí Pá Pá a a pá CS <3 o o o o o o o «0 p Pá Pá a Pá a a oá CS P4 Pr Pr Pr Pr Pr cn P-i Pr w Pá Pr <a (d N o CP CP S Es CP s eá CS < < Pr H <3 a Ό írt Η vu x: «3 Há Há Há Q>J P p £ (ΰ <0 O < < <C S < < 1 Η Pá cs > > > H > > Hl p xi X) r~ Sá a a a a a β cd U3 o 3 Há P P P p w Η Pá CS α O o α ca ca O S3 Pr Pr Pr P Pr a «O s< o CP CP CP w CP CP 4-3 Pá CS < < <5 P < < m Φ m P P P CP a p 03 o Há Há P >r p p ro Pá es O ca O P ca ca φ i0 <f a a a co a a o> 04 o Há Há P HH p P O Pá cs O O o a o α Φ P * co Pr Pr a P Pr a Φ H o CP CP CP ω CP CP Ό ο Pá cs <C < < P < < •Η Φ β 'Φ <0 0) bO > Φ Ο !Õ S +3 o> Η Φ •H ΝΙ B 3 P Φ O a α a a P XS Pr CP P P p’ a) P P m <0 β a P a •W 2 β Φ w ο P o * ί,Ο-, 31 31

Assim, as novas formas de zimogénio preferidas da proteína C do presente invento resultam do processamento * secreção de moléculas da proteína C humana nascente com a sequência de resíduos de aminoâcidos descrita abai.-.o.

h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU Ri r2 r3 R4 Rs Re R7 r8 r9 RiO Ril Rj.2 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS

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LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH em que R^ é seleccionado do grupo constituído por ASP e LEU, R.„, é seleccionado do grupo constituído por GLN © HIS, R é sslsccionado do grupo constituído por GLU © LIS e R é seleccionado do grupo constituído por ASP e LEU, Rc é GLN, R... é seleccionado do

V Q grupo constituído por VAL e TRE, R? é seleccionado do grupo constituído por ASP, FEN e TIR, R,., é PRO, R,_ é ARG, R * selec- o y 10 cionado do grupo constituído por LEU e TRE, R é seleccionado do A * grupo constituído por ILE ou uma delecção, R é ASN e -CQGH é o ex t r emo c a r boni1o.

Os familiarizados com a area reconhecerão que devido à degeneração do código genético uma variedade daqueles compostos de DNA podem codificar o polipeptídeo descrito atrás. Consequentemente, as construções descritas abaixo e nos Exemplos juntos para os compostos de DNA, vectores e transformante preferidos do

do invento são apenas ilustrativos e não 1imitantes do âmbito i nvento.

Todos os compostos de DMA do presente invento foram preparados por mutagénese dirigida do gene da proteína C humana. As moléculas codificadoras de zimogénio mutagenizadas foram então inseridas em vectores de expressão eucariót-icos de tal forma que a expressão dos genes do zimogénio foi dirigida pelo principal promotor tardio do acionoví.rus tipo 2. Os vectores podem também compreender o elemento potenciador P2 do vírus BK colocado de forma a aumentar a expressão a partir do promotor. Os vectores foram usados para transformar células de Escherichia coli K12 ΑΘ1 e depositadas e inseridas na colecção de culturas permanentes do Northern Regional Research Laboratories em Peoria, Illinois 61604 em 9 de -Janeiro, 1990. As culturas específicas, datas de depósitos e números de acesso estão apresentados na Tabela II.

Tabela II

Cultura Número de acesso Data de depósito E. coli K12 AGl/pLPC-N NRRL B-18612 01/09/90 E. coli K12 AGl/pLPC-FN NRRL B-18613 01/09/90 E. coli K12 ΑΘ1/pLPC-SC NRRL B-18614 01/13/90 E. coli KJ.2 A61/pLPC-LIN NRRL B”18615 01/13/90 Eh. coli K12 ΑΘ1/pLPC-FLIN NRRL B-18616 01/13/90

As culturas foram feitas e os piasmídeos isolados usando técnicas convencionais e depois foram usados para trans— fectar di rec tamente células hospedei ras eucarióticas para a produção de formas de zimogénio da proteína C humana. De células transformar preferência os piasmideos são usados para hospedeiras que expressam o produto do gene precoce imediato do adenovirus EIA, por o potenciador BK encontrado nos vectores funcionar mais eficazmente no aumento da expressão na presença de EIA. Os familiarizados com a matéria compreenderão que existe uma série de células hospedeiras que expressam ou podem ser forçadas a expressar um produto dos genes precoces imediatos de um vírus grande de DMA. As linhas celulares preferidas são a linha celular 293 de rim humano Cque pode ser adquirida à American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC CRL 1573) ou a linha celular de hamster sírio AVI2—664 CATCC 9595). A linha celular de rim humano embrionário 233 é a preferida.

Para se obter níveis mais altos de expressão, os genes codificadores cie várias formas zimogénio da proteína C podem ser cortados dos vectores depositados e ligados a um vector que contem a unidade de controle da transcrição 8BMT. Especificaroen-te, o plasmideo pGΓ—h, que contem um gene que confere resistência á higromicina, pode ser obtido (em E. coli K12 AGI) â NRRL com o número de acesso NRRL B—18592. 0 plasmideo foi aberto por digestão com a enzima de restrição Bell apôs isolamento de DNA do plasmideo a. partir de uma estirpe dam metilase de E. coli, como seja GM48 (NRRL 8-15725). Os novos, genes de zimogénio podem ser removidos dos respeetivos piasmideos por digestão com Bell. 0 vector foi purificado e desfosforálado, em seguida os novos genes de zimogénio do presente invento foram ligados ao sitio Bell. Os Piasmideos compreendendo os novos genes de zimogénio colocados a seguir â unidade de transcrição fíBMT para haver expressão foram então usados para transformar células k!93, cultivadas e os novos zimogénios podem ser purificados a partir da cultura por técnicas que são bem conhecidas. Um método para a purificação de proteína C humana foi descrito por Yan, Publicação de Patente Europeia N2 0363126, publicado em 11 de Abril de 1930, todos os ensinamentos da qual são aqui incluídos como referência.

Os compostos do invento também incluem as formas de zimogénio geradas quando da secreção das proteínas nascentes do invento. Os derivados de proteína C activados produzidos quando da activação das formas de zimogénio da proteína C são também compostos do invento. Assim, os compostos do invento incluem sequências codificadoras de DMA, vectores de expressão que dirigem a expressão daquelas sequências, proteínas nascentes produzidas quando da tradução de transcritos de mRNA gerados a partir daquelas sequências codificadoras, zimogénios produzidos quando da secreção daquelas proteínas nascentes e derivados activados de certos zimogénios.

Os compostos de DMA do invento podem também ser sintetizados quimicamente ou por combinação de fragmentos de restrição conhecidos. Os aparelhos de síntese de DMA podem também ser adquiridos e usados para construir os compostos do invento.

Os vectores ilustrativos do invento compreendem o potenciador BK colocado de forma a estimular a transcrição pelo principal promotor tardio do adenovírus da sequência codificadora do invento. Os familiarizados com a matéria reconhecem que um grande número de promotores eucarióticos, potenciadores e vectores de expressão são conhecidos e podem ser usados no método do presente invente*. Os familiarizados com a matéria também reconhecerão que um vector de expressão eucariòtico pode funcionar sem um elemento potenciador. 0 aspecto chave do presente invento não reside no potenciador particular, caso exista ou no

promotorj usado para dirigir a expressão do zimogénio da proteína C mas antes reside na nova sequência codificadora e correspondentes proteínas produzidas a partir daquela sequência.

No entanto, a escolha de elementos vectores, tais como promotores, potenciadores e marcas seleccionâveis pode ter grande impacto nos níveis finais de proteína produzida por uma célula hospedeira eucariót-ica. A Publicação de Patente Europeia N2 0245949, publicada em ÍS de Novembro de 1987, aqui incluído como referência, descreve uma série de vectores de expressão para a proteína C zimogénio nativa que utilizam o potenciador BK para estimular um promotor eucariótico colocado de forma a dirigir a expressão da proteína C humana nascente. Estes vectores dirigem níveis de expressão especía1mente altos em células eucarióticas que também expressam um produto de gene precoce imediato de um vírus grande de DNA, como seja o produto do gene EIA de adenoví-rus. Como é evidente a partir dos vectores exemplaficativos pGT-N, pST-FN, pGT—SC, pGT-LIN e pGT-FLIN aqui descritos, o método de expressão do produto do gene SBMT-E1A é especia1mente preferido para usar com os vectores do presente invento. 0 presente invento não está .1.imitado è utilização numa célula hospedeira eucariôtica particular. Uma variedade de células hospedeiras eucarióticas existem em depositários tais como a American Type Culture Collection CATCC) Rockvi 1le, MO 2085.2, e são adequadas para usar com os vectores do invento. A escolha de uma célula hospedeira particular depende até certo ponto do vector de expressão particular usado para dirigir a expressão dos compostos de DNA codificadores da proteína C do invento. No entanto devido â proteína C humana nascente e Os

derivados da proteína C humana nascente do invento sofrerem substancial modificação pôs-·tradução, algumas células hospedeiras são mais preferidas do que outras para usar com os vectores do invento. A Publicação de Patente Europeia M£ 0245943 e fârinnell et al,, 1387, Bio/Technology 5:1183 descreve que células de rim embrionário humano são especialmente preferidas para usar na produção de recomfoinantes de proteínas gama-carbcxiladas tais como proteína C humana. Tal linha de células de rim embrionário humano é a linha celular 233 disponível na ATCC com o número de acesso ATCC CRL 1573. A linha de células 233 é também preferida para usar com os vectores do presente invento.

No entanto, as vantagens de produzir uma proteína gama-carboxilada, como seja um zimogénio de proteína C humana, numa linha celular transformada por adenovírus não estão limitadas a a células de rim embrionário humano transformadas com adenovírus. De facto, as células transformadas com adenovírus em geral são hospedeiros excepcionais para a produção de proteína C humana gama-carboxilada. Uma linha celular deste tipo especialmente preferida é a linha celular AVI2—664 (daqui em diante "AVI2">, disponível na ATCC com o número de acesso ATCC NRRL CRL 9535. A linha celular AV.12 foi construída por injecção de um hamster sírio no pescoço com adenovírus humano 12 e isolamento das células do tumor resultante. 0 Exemplo 3, abaixo, descreve a transformação das linhas celulares 293 e AV12 com o vector j. 1 us t r a t i vo pGT~N. ident i f i car transformant.es

Os vectores do invento podem ser transformados e expressos numa variedade de células hospedeiras eucarióticas, espec ialmente de mamífero. Os vectores do invento que não possuem marca selectiva com a qual isolar e

eucarióticos estáveis são úteis não só para fins de de ensaio transitório como também para fins de cotransformação, um processo divulgado na Patente U.8. MS 4,399,216, publicado em 26 de Agosto de 1983 e incorporado aqui como referência. Os vectores do invento podem também compreender sequências que permitem a replicação em E. coli.· uma vez que é mais geralmente mais eficaz preparar DMA de p 1 asmí deo em E. coli do que em outros organismos hospedeiros. A expressão das sequências codificadoras da proteína C humana contida nos vectores do invento ocorre nas células hospedeiras em que o promotor particular está associado às funçêSes de genes estruturais. São exemplos de células hospedeiras adequadas para usar no invento as apresentadas na. Tabela. III, juntamente com os comentários adequados.

a u B ·» bO •H 0 O r— H 0 TJ Sm Sm TJ o •H 0 1 0 0 0 Pu 0 > Sm o ca o TJ Qj tj 0 td X Sm 0 0 Sm H CJ ε •H 0 O 0 cu O a 0 0 0 TJ X c 0 ta rH D 0 tj TJ X) •H o 0 0 cr TJ o 0 ε 0 C x Ό O Cu Dj 0 0 0 o 0 ca rH rH ε 0 on (d Ό o o 3 bO P ro x: TJ x O rH 0 0 c 0 0 cu '0 N 0 •H P > GD 0 •rH a 0 TJ m H c •H X p P 03 ON 0 Sm Ω 0 0 00 Sm m 0 ε 0 0 0 ε •H O p aj Ω O TJ > o /0 43 •r| ^3* ta Ό TJ 0 o Sm , 0 » 0 Sm rH 0 0 O Ό a 0 > •rH 0 0 CU W 2 0 c •H P 0 •H •P 0^ • o Sm t- Ή Sm Sm •H 0 c 0 C 00 10 ca -3 rH 0 0 0 P 0 0 o O TJ cu TJ P 0 ε D <d •H O Sm 0 * 0 O Λ N 0 a . a O 0 O 0 •rH TJ 0 Η ε ε O 0 0 CJ P rH Mj 0 o 0 0 TJ 0 Sm c •H 0 ^5 Sm o o P 0 Sm 0 0 p 0 0 TJ 0 > bO P D CQ O 3 w 0 Sm •H Ctí 0 H cr Ή Sm O Sm M Sm Dm 0 Sm E™* 0 0 0 0 0 C 0 CJ < 05 P bO co Ω &M 0 • tm o a . Csl _ ' wH wo O O r**· P"* C*v o pg ·— Ω H H H 0 43 £2 u u a M u u G CJ •-3 CJ CJ u u CJ o kM r** (3 MSM CJ CJ M “M·* 0 rH 0 ΧΪ c *= =¾ =¾ =¾ =¾ ss =¾ sa aa CJ o &M < w < CJ CJ < CJ ÇJ r· < < CJ CJ ζ o a t- < CJ ÇJ <: CJ w < CJ ÇJ < P < u CJ < 0 ** o H x c O 0 c b() 0 ÍH E o 3 o 3 c ε o TJ x 0 0 c o 0 0 o •H TJ 0 ε 0 TJ Sm o <0 3 o H 0 10 c •E x: 3 bO 0 0 •H •H rH rH •H 0 3 S- x: X 0 0 '0 Cm 0 D 0 X) O •H bO O *d 0 0 ε > Sm X E, 0 Sm 0 x 0 Sm Sm 3 0 '0 <U Ό 0 .c 05 0 0 o ε Ό X - fac > 05 0 P O P 0 o TJ 0 o 0 (U 0 Sm ε O O o E 0 c Sm TJ E o 0 Sm o 0 o 0 m (β Ό 0 O c jj O 43 0 0 O O X E 0 o P 0 0 0 O a 0 43 <D 3 Ό P •H E E 0 0 0 ε 0 0 x> x: 0 O 3 0 rH E ε 0 TJ •H 0 0 •H x: x: 43 0 rH O 0 E rH P o 0 0 Ό XI o H ε O XI o 0 a> 43 Ό Ό O •H 0 O P o E E TJ 0 ε Sm c. P H 0 s- 0 0 D« ε ε X> '0 •rH 0 Ou X» 0 0 E 0 •H •Η 05 •rH > a •H 0 •H H H •H s: 05 05 0 Oh o ω s n: &M Dm a 05 > 0 Sm pmM • MM C H •H 0 TJ 0 a .3 > to u U j; 0 ** •m n rví X O _ X 0 rH ♦ . 3 rH '0 O r*vj CN X _ CM rv PH «3 1 > CJ 1 CJ 1 CJ ΓΗ c_ rn X 1 O ϋ r; 0 Ξ ΗΓ Cl27 I óõ 1 miK-2 *Aiiinri<:«ιιι Tyjx; Ctrl Lure CoIlecLion, 12J01 Parklawu Drivu, Hoekvillir, Narylautl 20ίΙΓ)2-1776 - 40 -

Conforme .indicado pela Tabela III muitas células hospedeiras de mamífero possuem a maquinaria celular necessária para o reconhecimento e processamento correcto do peptídeo sinal nas proteínas nascentes do invento e proporcionam as modificações pós-tradução, tais como glicosiulação, gama-carfooxilação e β—hidroxilação, tal como são observadas na proteína C humana presente no plasma sanguíneo. No entanto, como indicado atrás, o processamento pós-tradução óptimo para HPG ocorre em células transformadas com adenovírus. Existe uma grande variedade de para a transformacão de os vectores espec í ficos e forma alguma limitar tais células exemplif ίο âmbito do vectores, discutidos abaixo, hospedeiras eucariôticas, mas cados abaixo não pretendem d presente; invento.

Os vectores do tipo pSV2 compreendem segmentos do genoma de SV40 que constituem uma unidade de transcrição eucariô-t.ica definida—promotor <ep>, sequência interviniente CIV8> e sítio de pol jadem 1 ação (.pA') . Na ausência do antigénio T do SV40, os vectores plasmídeo tipo p8Y2 transformam células hospedeiras eucariôticas de mamífero e outras através da integração no DNA cromossómico da célula hospedeira

Gonstruiu-se uma vsriBQsde de vectores plasmídeo tipo pSV2 (ver Eukaryotic Virai Vectors, editado por Gluzman, publicado por Gold Spring Harbor Laboratories, P .1 asm í deos pSV2-S-giode um gene

Cold Spring Harbor, New York, 1982), como sejam os pSV2-gpt, pSV2—neo, pSV2—dhfr, pSV2—hyg e pSV2—hyg e bina, em que o promotor do 8V40 dirige a transcrição inserido. Estes vectores são adequados para usar com as sequên estão disponíveis na American em Rockviile, Maryland ou no to r y (NRRL > em Peoria, 111i noi s. cias codificadoras do invento e Type Culture Collection <ATCC) Northern Regional Research Labora 41 0 plasmideo pSV2-dhfr íAICC 37146) compreende um gene da di-hidrofolato-redutase (dhfr) murina sob o controle do promotor precoce do 8V40. Nas condições adequadas, sabe-se que o gene dhfr é amplificado ou copiado no cromossoma do hospedeiro. Esta amplificação, descrita num artigo de revisão por Schimfce, 1984, Ce.11 37:705-7.1.3, pode envolver sequências de DNA quase contíguas ao gene dhfr, tais como uma sequência codificadora de proteína C humana nascente do invento e pode assim ser usada para aumentar a produção dos zimogénios da proteína C do invento.

Os p .1 asm £ deos que foram construídos para a expressão da proteína C nascente e zimogénios de proteína C do invento em células de mamífero e de outros hospedeiros eucarióticos podem utilizar uma larga variedade de promotores. 0 presente invento não está de forma alguma limitado á utilização dos promotores eucarióticos particulares aqui exemplifiçados. Promotores tais como o promotor tardio do SV40 ou os promotores eucarióticos divulgados em Bucher et al., 1986, Nuc. Acids Res. 14 ¢24):1009 ou promotores de genes eucarióticos tais como, por exemplo, o gene da ovalbumina de galinha induzido por estrogénios, os genes do interferão, o gene da tirosina-aminotransferase induzido por glucocorticôides, o gene da timidina-cinase e os principais promotores precoces e tardios doa adenovírus, podem ser fácilmente isolados e modificados para usar em vectores de expressão de DNA recombinante projectados para produzir zimogénio de proteína C humana em células hospedeiras eucarióticas. Os promotores eucarióticos podem também ser usados em tandem para dirigir a expressão de uma sequência codificadora do invento. Ainda, sabe-se que um grande número de retrovírus infectam uma larga gama de células hospedeiras eucariôticas. As repetições terminais longas no DNA dos retrovírus muitas vezes codificam act-ividade de promotores e podem assim ser usadas para dirigirem a expressão das sequências codificadorss do invento. 0 plasmídeo pRSVcat (ATCC 37152) compreende fracções da repetição terminal longa do vírus do Sarcoma de Rous (RSV), um vírus que se sabe infectar galinhas e outras células hospedeiras. As sequências das repetições terminais longas do RSV podem ser isoladas num fragmento de restrição Ndel-HindiII ~ 0,76 Kb do plasmídeo pRSVcat. 0 promotor na repetição terminal longa tio RSV ífiorman et al., 1992, P.N.A.S. 79;6777) é adeequada para usar em vectores do invento. 0 plasmídeo pilSVi CNRRL B-15929> compreende as repetições terminais longas do vírus do Sarcoma Murino ÍMSV), um vírus que se sabe infectar células hospedeiras de murganho e outras. Estas sequências repetitivas são adequadas para usar como um promotor nos vectores do invento. 0 promotor da metalotioneina de murganho (ΜΜΪ > também foi bem caracterizado para usar em células hospedeiras eucariôticas e é adequado para usar em vectores do invento. 0 promotor MilT está presente no plasmídeo pd8PV~MMTnso de 15 Kb (ATCC 37224), o qual pode servir como material de partida para a construção de outros plasmídeos do presente invento. São possíveis muitas modificações e variações das presentes sequências de DNA e plasmídeos ilustrativos. Por exemplo, a degeneração do código genéticopermite a substituição de nucleôtidos ao longo da sequência codificadora do polipeptí-deo. Tais sequências substituíveis podem ser deduzidas a partir de sequências de aminoácidos ou de DNA conhecidas da proteína C humana e podem ser construídas seguindo processos convencionais de síntese ou de mutagénese dirigida. Os métodos de síntese podem ser realizados substancialmente de acordo com os processos de 43

Itakura et· al. , 1977 Science 198!1056 e Crea ei al . , 1378., Proc . Nat. Acad. Sei. USA 75!5765. Portanto, o presente invento não está de forma alguma limitado a sequências de DMA e plasmídeos espe c i f i c amen te exemp1i f i c ados.

Após transformação de um vector do invento numa célula hospedeira eucariótica, pode-se seleccionar transformantes com base num fenóiipo seleccionável. Este fenótipo ssleccionável pode ser conferido por uma marca seleccionável presente no vector de expressão ou presente num outro vector cotransformado com o vector de expressão na célula hospedeira. Uma vez seleccionados os transformantes, é desejável identificar quais os transforman-tes que expressam os níveis mais elevados da proteína pretendida codificada pelo vector de expressão. Tal identificação é especialmente importante apôs um processo de cotransformação,, o qual gera umasérie de transformantes que contêm apenas o plasmídeo tendo a marca selectiva e portanto não contêm o vector de expressão. No Exemplo 4, abaixo, descreve-se um protocolo não só para a identificação de células que expressam e secretam a proteína pretendida como também para a quantificação, relativa a outras células examinadas usando o método, da quantidade de proteína secretada. 0 protocolo também permite o isolamento de células viáveis que secretem os níveis mais altos de uma proteína pretendida .

Os métodos para a activação de formas zimogénio de proteína C humana são velhos e bem conhecidos. A proteína C pode ser activada apenas pela trombina, por um complexo trombina/trom-bomodulina, por veneno de víbora de Russell ou por uma variedade de outros meios. Para comparar as várias velocidades de activação dos zimogénios do presente invento, usou-se a trornina sózinha, na 44

presença ou na ausência de 3 mM CaC 1ou na presença de S mM EDTA. Õs ensaios de activaçSo de trombina e de proteína C famido-lítico e anticoagulante) foram realizados segundo os ensinamentos de Srinnell et al. , 1387,, Biotechno 1 ogy Si 1187-1192» todos eles sendo aqui incluídos como referência. Outros métodos para activaçSo da proteína C usando trombina imobilizada foram divulgados por Yan, Pedido de Patente U.S. N2 de Série 07/403,SIS, Attorney Docket N2 X-7307, entregue em 5 de Setembro de 1989, os ensinamentos da qual é aqui incluído como referência. As velocidades relativas de activaçSo estão descritas na Tabela IV.

Tabela IV

Trombina Trombina Forma de zimogénio <3 mM CaCl_> CS mM EDTA> Tipo selvagem - 1 1 Fí 67 20 2 LIN .“t 1,3 FLIN 30 O FN ~ 450 5-6 SC £ 260 5-6 O zimogénio FÍ67 contem o peptídeo de activação tipo selvagem excepio no que respeita ao aminoácido na posição 209 que foi. alterado de ácido aspártieo para. feni lalanina. 0 zimogénio FÍS7 está descri to na Publicação de Patents

Europeia N£ 03: 149, publicado em 5 de -Julho, 1989, os ensinamentos da qual estão aqui incluídos como referência. As actividades anticoagulantes funcionais dos zimogênios mutantes F.1.S7, LIN e FLIN foram 100 a 109% do controle tipo selvagem. As actividades dos mutantes FW e SC foram inferiores a 10% muito baixas. do controle devido a actividades amidolíticas A proteína C activada tem propriedades anti-trombóticas substanciais na prevenção da extensão dos coágulos intravenosos, na prevenção da formação de trorobos arteriais e na prevenção da morte e falha de orgãos por sépsia causada por 6ram-negativos, endotoxemia e coagulação intravascular disseminada. Em experiências com animais, a infusão do zimogénio da proteína C nativa não teve qualquer efeito no tratamento de septicémia por fíram-negat.i-vos com choque e coagulação intravascular disseminada <DIC>. Estes resultados negativos indicaram que nesta forma de trombose microvascular espalhada envolvendo geração massiva de trombina, estava presente insuficiente tromfoomodulina para complexar com trombina e activar o zimogénio administrado por infusão. A principal desvantagem da proteína C activada, tal como para outras proteases serina, é a sua curta semi-vida (TI/2) comparado com o precursor zimogénio. A Tl/2 em cães foi estabelecida como sendo de 11 minutos e a Tí/2 em macacos como sendo 22 a 26 minutos

Em comparação a Tí/2 do zimogénio da proteín

C nativa no homem foi calculado como sendo de 6 horas. As causas das semi-vi das miais curtas das proteases serina activadas, incluindo proteína C activada, comparado com os seus zimogénios, são complexas e envolvem mecanismos celulares e humorais. As proteases serina activadas também formam complexos com inibidores de proteases serina normalmente presentes no plasma. Os complexos de proteína C activada C A PC') com um novo inibidor APC descrito assim como cm alfa-2-macroglobulina. Os zimogénios inactivos, incluindo os zimogénios da proteína C do invento, não reagem com os inibidores de protease serina. A vantagem dos zimogénios da proteína C deste invento é que eles são melhor activados pela trombina do que o zimogénio da proteína. C nativa, pois a trombina tem uma necessidade dramaticamente reduzida de complexacão com trombomodulina oara activar “!? estes zimogénios na presença de Ca Segue-se que estes zimogénios de proteínas C, quando administrados, podem ser activados nos sítios intravasculares de produção de trombina, i.e., em qualquer sítio onde haja desenvolvimento de um coágulo intravascular. Assim, estes zimogénios de proteína C recombinantes podem ser usados como pro-drogas e serão activados nos locais de geração de trombina. Devido a estes zimogénios sensíveis â trombina poderem ser administrados na forma de zimogénio, eles não se compiexarão com inibidorss da proteína C e poderão apresentar uma semi-vida. igual à do zimogénio da proteína C nativa.

Os zimogénios de proteína C recombinante do invento são úteis na prevenção e tratamento de uma larga variedade de doenças adquiridas envolvendo coagulação intravascular, incluindo trombose de veias profundas, embolia pulmonar, trombose das artérias periféricas, embolia derivada de artérias cardíacas ou periféricas, enfarte agudo do miocárdio, choques trombóiicos e coagulação intravascular disseminada. Estes derivados de proteína C podem também ser usados eficazmente no tratamento de um número significativo de doentes com deficiências heterozigôticas em proteína C apresentando frequente trombose das veias profundas e no caso de doentes com deficiência homozigôtica em proteína C tendo purpura f u1mi nans.

Os resultados experimentais e clínicos sugerem que os anticoagulantes convencionais, particularmente a "warfarin" são úteis no tratamento de cancros invasores e actuam para prevenir k i -

ou reduzir as lesões metâsticas distantes destas doenças. Ainda, está bem estabelecido que os estímulos inflamatórios,- tais como endotoxinas, factor de necrose tumoral e interleuquina 1, fazem endoteliais mac rovascular representam c onven c i ona i s depleçêío de trombomodulina da superfície de células que se pensa desencadear a trombose microvascular e Os zimogénios recomfoinaní-es da proteína C do invento uma alternativa atractiva aos anticoagulantes nestas situações clínicas.

Uma indicação terapêutica atractiva para a proteína C activada é na prevenção de trombose de veias profundas e embolia pulmonar, normalmente tratada com doses baixas de heparina. Outra vantagem destes zimogénios é que podem ser dados como injecçSes de um foolus em vez de infusão IV continua devido á pequena TI/2 daquela proteína.

Estas infusões dos zimogénios de proteína C do invento implicam uma probabilidade mais baixa de hemorregia. Assim, estes zimogénios podem substituir a heparina antes e após cirúrgia con juntamento com trombeciomias ou embolec tornias, processos tem subs ian ciai cirúrgicos que são muitas vezes necessários para membros isquémi-cos de amputação quando da obstrução arterial aguda. Devido à sua longa TÍ/2, comparado com a proteína C activada e á sua administração relativamente fâci, estes zimogénios são mais adequados do que a proteína C activada para o tratamento de coágulos arteriais derivados do coração. A administração a longo termo destes zimogénios em doses comparáveis às usadas para o tratamento de trombose de veias profundas—embolia pulmonar utilidade na prevenção de coágulos cardiogénicos.

De forma semelhante., os zimogénios da proteína C do invento podem ser usados para o tratamento de coágulos derivados de trombes nas artérias periféricas, principalmente artérias carótidasi as quais não são tratáveis ou sujeitas a um prevenção satisfatória com os regimes normalmente usados, os quais incluem drogas capazes de suprimir a função de plaquetas,· anticoagulantes orais ou suas combinações. Tal como no caso de coágulos cardiogé-nicos* estes zimogénios podem ser administrados a longo termo do mesmo modo que descrito para coágulos cardiogénicos e têm um potencial importante na prevenção de coágulos derivados de trombos das artérias carótidas e que resultam em choques embóli— cos. em

Os zimogénios choques trombôticQS. da proteína C do invento são também úteis Ac tua.1 mente, os choques não são geralmen 0 tratamento de te tratados com anticoagulantes convencionais. choques com heparina ou anti-coagulantes orais, se bem que ocasionalmente benéficos, traz um elevado risco de hemcrregias na área do cérebro com enfarte, agravando assim o défice neurológico que acompanha o choque. Devido aos seu baixo potencial indutor de hemorregias e à sua selett-ividade, os zimogénios do invento podem ser administrados a vítimas de choque e podem ser benéficos na prevenção o alastramento local do trombus arterial oclusivo, reduzindo assim o défice neurológico resultante do choque.

Os zimogénios do invento serão úteis também no tratamento de enfarte do miocárdio agudo, devido ás suas propriedades pro-fibrinolíticas uma vez activados. Estes zimogénios podem ser dados com activador do plasminogénio tipo tecido durante as fases agudas do enfarte do miocárdio. Após a dissolução do trombo

coronário oclusivo os zimogénios podem ser dados durante ma is dias para evitar novo enfarte agudo cio miocárciio. A proteína C activada é útil no tratamento de coagulação intravascular disseminada. A heparina e os com coagulação intravascular disseminada (DIC> em vários ensaios clínicos mas os resultados foram desapontantes. Na coagulação intravascular disseminada a proteína C activada assim como os derivados activados do presente invento, têm uma vantagem distinta relativamente a outros anticoagulant.es convenc ionais.

Conforme referido atrás, foi estabelecido em experiências com animais o zimogénio da proteína C não é eficaz na prevenção da morte e danificação de orgãos provocada por septicémia devido a Gram-negativos e coagulação intravascular disseminada. Pelo contrário, os zimogénios da proteína C do invento, ao serem altamente susceptíveis â activação pela trombina, serão eficazes no tratamento de coagulação intravascular disseminada.

As drogas anticoagulantes convencionais, particularmen-te a "warfarin" são úteis no tratamento de tumores malignos invasivos. Muitas células tumorais produzem substâncias que desencadeiam a activação do sistema de coagulação resultando em depósitos de fibrina localizados. Estes depósitos de fibrina funcionam como "ninhos" em que as células cancerosas se podem dividir para formar lesões metásticas. No entanto, não é possível administrar "warfarin" ou outros anticoagulantes convencionais em combinação com as formas mais intensivas e eficazes de quimioterapia, pois tal terapia produz uma queda rápida na contagem de plaquetas e trombocitopema combinada com terapia usando "warfarin" coloca o doente num estado de risco alto e inaceitável relativamente a complicações envolvendo hemorregias graves. Os derivados

de proteína C do invento, ia! como a proteína C activada são mais seleciivos do que os anticoagulantes convencionais e têm um Índice terapêutico muito superior ao da heparina ou anticoagulan— tes orais, podem ser administrados com relativa segurança a doentes com irombociiopenia tornando assim possível o tratamento de doentes com cancros invasivos usando uma quimioterapia eficaz e intensiva em combinação com um derivado de proteína C activada do invento.

Os zimogénios e contrapartes activadas do presente invento podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, pelo que um zimogénio de proteína C humana ou proteína C activada do invento é combinado com um veículo farmacêutico aceitável. Veículos adequados e sua formulação, incluindo outras proteínas, e.g., a1bum i na sérica humana, estão descritos, por exemplo, em Remington?s Pharmaceutical Sciences 16isd i ç ão.1.980, Mack Publishing Co., editado por Osol et al., o qual é aqui incluido como referência. Tais composições conterão uma quantidade eficaz de um zimogénio de proteína C ou a sua contraparte activada, juntamente com uma quantidade adequada de veículo para preparar composições farmacêuticas aceitáveis adequadas para a administração eficaz a um hospedeiro. A composição com proteína C pode ser administrada parenteralmenie ou por outros métodos que assegurem a sua libertação para a corrente sanguínea numa forma eficaz.

Deve-se notar que os zimogénios do presente invento podem ser usados para preparar proteína C activada in vitro. Se bem que sejam conhecidos os métodos recombinantes para a produção de proteína C activada directamente em células eucarióticas, estes métodos requerem que a proteína C permaneça no meio de cultura durante períodos de tempo longos. Devido â proteína C activada ser relativamente instável, estes métodos de expressão directa podem dar quantidade baixas de proteína C activada. Pelo contrário, os zimogénios do invento podem ser activados pela trombina sôzinha mesmo na presença de Ca*" e assim oferecem vantagens significativas relativamente a outros métodos conhecidos para a produção de proteína C activada.

Os exemplos que se seguem ilustram os métodos e descrevem os protocolos de construção para compostos, vectores e transformantes representativos do invento sem limitar o mesmo.

Exemp1o 1

Isolamento do plasmídeo pLFC-FLÍN

Adquiriram-se liofilizados de E. coli Kl2 AQl/pLPC-FLIN ao Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, com o número de acesso NRRL 8—18608. Os liofilizadcs foram decantados para tubos contendo 10 ml de meio L8 (10 g de Bacto— g de NaCl por auas horas a de ampicilina -triptona, 5 g de extracto de levedura Bacio e 10 litro; o pH foi ajustado a 7,5) e incubado durante 32°C, sendo então ajustadas as culturas a 50 jug/ml e depois incubadas a 37°C durante a noite.

Uma pequena fracção da cultura crescida durante a noite foi colocada em placas de agar LB (meio LB com 15 g/1 de agar Ba cio) contendo 50 ,ug/ml de ampicilina de forma a obter-se uma colónia isolada de E. co1i K12 A61/pLPC—Q037. A colónia isolada obtida foi inoculada em 10 ml de meio LB contendo 50 ,ug/ml de ampicilina e incubada durante a noite a 37°C com agitação

vigorosa. . A cultura de 10 ml 1ada em 500 m 1 de meio L.8 incubada a 37°C com agi tação estacionária. rrescxda ouranfce a noite toi mocu-contendo SO.ug/ml de ampiciiina e 0 processo que se segue foi adaptado de Maniatis et àL.) 1982, Mo 1 ecu 1 ar Cioning CCold Spring Harbor Laboratory).

As células forma colhidas por cent-rifugação a 4 000 g durante 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi rejeitado. 0 sedimento de células foi lavado em 100 ml de tampão 8TE arrefecido em gelo <0,1 M NaCl,' 10 mM Tris-HCl, pH 7,S; e 1 mM EDTA). Após lavagem, o sedimento de células foi ressuspenso em 10 ml de Solução 1 <50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0] e 10 mM EDTA> contendo 5 mg/ml de lisos:ima e deixado â temperatura ambiente durante 10 minutos. Vinte ml de Solução 2 <0,2 N NaOH e 1¾ SOS> foram então adicionados âs células tratadas com lisos:ima e a solução foi misturada suavemente por inversão. A mistura foi incubada em gelo durante 10 minutos.

Adicionou-se quinze ml de acetato de potássio 5 M arrefecido em gelo, pH 4,8, ã mistura de células lisadas e a solução foi misturada por inversão. A solução foi incubada em gelo durante 10 minutos. A solução de acetato de potássio 5M foi preparada pela adição de 11,5 ml de ácido acético glacial a 28,5 ml de água e 60 ml de acetato de potássio 5 M; a solução resultante é 3M relativamente ao potássio e SM relativamente a acetato. A mistura de células lisadas foi csntrifugada num Beckman 3W27 Cou seu equivalente) a 20 000 rpm durante 20 minutos a 4°C. 0 DMA celular e detritos formam um sedimento no fundo do tubo. Cerca de 36 ml de sobrenadante foram recuperados e adicionado 0,6 volumes de isopropanol, misturados e a solução resultante foi deixada à temperatura ambiente· durante IS minutos. 0 DNA de plasmídeo por centrifugação a 12 000 g durante 30 minutos à temperatura ambiente. 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento de dNA foi lavado com etanol a 70% á temperatura ambiente. 0 etanol foi então decantado e o sedimento seco sob vácuo. 0 sedimento foi então ressuspenso em 8 ml de tampão TE CIO mH Tris-HCl, pH 8/0 e 1 mli EDTA1.

Adicionou-se oito gramas de CsCl á solução de DNA. Cerca de 0,8 ml de uma solução de 10 mg/ml de brometo de etídio em água foram então adicionados para cada 10 ml de solução de CsCl-DNA. A densidade final da solução foi de aproximadamente 1,55 g/ml e a concentração final de brometo de etídio foi de cerca de 600 jug/ml . A solução foi transferida para um tubo de centrífuga Beckwan Type &0, chei até cima com óleo de parafina; selado e centrifugado a 45 000 rpm 24 horas a 20 °C. Após centrifugação são visíveis duas bandas de â !.u.z normal. Após remoção da tampa do tubo a banda inferior de DNA foi removida usando uma seringa com uma agulha hipodérmica inserida lateralmente no tubo de c entr ífuga. ct 0 brometo de etídio foi removido por várias extracçSes com l-butanoi saturado com água. 0 CsCl foi removido por diálise contra tampão TE. Após extracçSes com fenol tamponado e depois clorofórmio o DNA foi precipitado, lavado com etanol a 70¾ e seco. Cerca de 1 mg de plasmídeo pLPC-Q097 foi obtido e guardado 4°C em tampão TE a uma concentração de aproximadamente 1 .ug/ml.

Na Figura 1 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pLPC—FN. Do mesmo modo, os plasmídeos pLPC-FN, pLPC-SC, pLPC-LIN e pLPC-N foram 54 isolados a partir das correspondentes células hospedeiras, também adquiridas à NRRL. Nos desenhos juntos estão apresentados .mapas de si.tios de restrição e íunçães de cada um destes plasmídeos.

Exemplo 2

Construção do plasmídeo pQT-FLIN

Os plasmídeos pLPC-N, pLPC-FN, pLPC-SC e pLPC-FLIN podem ser usados para transformar directamente células hospedeiras eucarióticas (de preferência células 293) relativamente è produção de· níveis elevados de zimogénios de proteína C humana. Podem ser obtidos níveis de expressão e secreção do produto ainda superiores se o gene codificador do ziniogénio mutante for ligado a um vector de forma a que a expressão do gene seja conduzida pela unidade de transcrição 68MT. 0 plasmídeo p6TC é um desses vectores em que o gene do zimogénio da proteína C humana tipo selvagem é dirigido pela unidade de transcrição β£!ΜΤ. 0 gene da proteína C tipo selvagem pode ser facilmente removido do vector num fragmento de restrição BçjLI e qualquer um dos genes do presente invento pode ser inserido no vector num fragmento de restrição Bc 1J.. A digestão do DNA de plasmídeo com Bell é inibida pela metilação da adenina na sequência 5;—6ATC—3'. Portanto, o plasmídeo pSTC foi preparado a partir de células hospedeiras £. coli que não possuem uma ademna--metilase, como seja a codificada pelo gene dam, o produto da qual meti la o resíduo de adenina na sequência S’-SATC-S*. £. coli Kl2 ΘΜ48 (NRRL. B-1572S) não possui uma dam metilase e portanto é adequada para usar na preparação do DNA de plasmíoso pGTC para usar como material de partida na construção de plasmideos deriva dos.

As células E. coli Kí2 GN48 foram cultivadas e tornadas competentes para a transformação e o plasmídeo pQTCfoi usado para transformar as células de E. coli K12 6M48 substancialmente de acordo com o processo do Exemplo 1. As células transformadas foram semeadas em asar L contendo ampicilina e uma vez formadas colónias resistentes â ampicilina pelos transformantes K12 6Μ4Θ/pSTC, uma dessas colónias foi usada para preparar DMA do plasmídeo pSTC substancialmente de acordo com o processo do Exemplo í . Obteve—se cerca de 1 mg de D.MA do plasmídeo pQTCqu© se ressuspendeu em cerca de 1 ml de tampão TE. Do mesmo modo os plasmideos pST-h e de pST-dpoclem ser preparados para permitir a digestão com Bc 1. 0 plasmídeo pGT—d compreende a unidade de transcrição sem gene no sítio Bell, de tal forma que qualquer gene pode ser facilmente inserido. 0 plasmídeo ρβΤ-d também comp7'ísends o gene dbfr murino de tal forma que qualquer transfor-mante pode ser seiecciornado ou amplificado usando o fenótipo de resistência ao metotrexato. 0 plasmídeo pST-b compreende a unidade de transcrição SBMT, um sítio BclI. para facilidade de inserção de um gene com interesse e o gene que confere resistência à higromicina. As estirpes de E. coli Kl 2 AS1 compreendendo cada um destes plasmideos foram depositadas na NRRL em 18 de Janeiro de 1990. As estirpes estão disponíveis com os números de acesso NRRL. B-.1.8591 (para E._col i Kl2 .ΑΘ1/p-ST-dl, N.RRL 8-18592 (para E.__coli Kl2 ASl/pST-d?, NRRL B~ 18592 (para E. coli Kl2 ASl/pGT—h? e NRRL· B—18598 (para £. coli K1 k) AQl/pQTCl. Os mapas de sítios de restrição e funções destes plasmideos estão apresentados nos desenhos juntos.

Cerca de .10 gl de DNA do plasmídeo pLPC~FL..IN preparado a partir de células GM48 foram misturados com 20 jul de tampão de restrição 10X Bc1I í100 mH Tris-HCl <pH 7,4), 1,5 M KC1, 100 mH MgCl? e 10 mM DTT), 20 jj.I de img/ml B8A, 5 .u 1 da enzima de rerstrição Bell (x 50 Unidades, como definido por Bethesda Research Laboratories <8RL), onde foram adquiridas todas as enzimas de restrição aqui usadas) e 145 jli! de água e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 2 horas. As reacções com enzimas de restrição aqui descritas são normalmente paradas por ©xtracçffes com fenol seguido de clorofórmio, as quais são seguidas de precipitação do DNA, uma lavagem com eianol e ressuspensão do DNA em tampão TE. 0 DNA digerido foi então sujeito a elsctro-forese através de um gel preparativo de 1% de agarose e o fragmento de restrição com cerca de 1400 pares de bases compreendendo o gene mutante foi purificado usando um kit BioRad Prep-A-Gene, de acordo com as instruções do fabricante. 0 plasmídeo pGTC foi então isolado a partir de EL_colj. K12 AGl/pGTC íNRRL B-.18593) essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo í e propagado em ΘΜ48 e isolado essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 2. 0 DNA plasmídeo pGTC foi então digerido com a enzima de restrição Bell como ensinado atrás, em seguida o fragmento grande do vector foi isolado e purificado. Este fragmento vector foi levado até um volume de 90 ,ul com TE (ρΗ 8,0), em seguida adicionou—se lo .'-'l <0,05 Unidade) de fosfatase alcalina de intestino de vitela para desfosforilar os extremos do vector. A .mistura foi incubada st 37°C durante 30 minutos, em seguida adicionou-se 10 jul de SOO mH ΕΘΤΑ e a reacção foi incubada a 65°C durante 45 minutos para inactivar a enzima. A reacção foi então extraída com •57 fenol/clorofôrmio, precipitada com et ano .1, lavada e rsssuspensa em 20 ,u.l de água. •57 Cerca de 7 ,ul 0.0 ng> então misturado com cerca de restrição Bc1I de 1400 pares de de tampão iigase 10X C0,S M t) lOOmM DTT e 500 jug/ml de BSA) reacção de ligação foi então ir do v © C tor d igsrid* o com Bcl I foi 1 ,Ul ( 100 mg) do fragmento de bases do ρ 1 asm í deo pLPC-FLIM, ijul 1 C pH ! 7 j 6 ) ; 100 mH MgC e 1 ,!j 1 de DímA- 1 i1 9SS8 d© 14. A ícubad a GWV ante 1.2 a 16 .Ho ‘rãs * a 16°C. A reacção de ligação pode conduzir a plasmídeos que contêm o gene do zimogémo mutante orientado para transcrição a partir da unidade de transcrição SBMT ou plasmídeos em que o gene é ligado na direcção oposta. Aqueles plasmídeos que contêm o gene na orientação correcta para transcrição são designados ρΘΤ-FLIN. Células competentes congeladas de E. coli K.1.2 AS1 foram adquiridas à Stratagene, 3770 Tansey Road, San Diego, Califórnia 3212,1.. Cerca oe 5 ,u 1 oa reacção de ligação foi misturaoo com uma. amostra de 100 ,ul de células competentes, em seguida a mistura de células DMA foi incubada em gelo durante uma hora? sujeitas a choque térmico a 420C durante 45 segundos, depois arrefecidas em gelo durante cerca de 2 minutos. A mistura de células-DNA foi incubada em gelo durante cerca de 2 minutos. A mistura de célu-las-DNA foi diluída em 1 mi de meio S0C em tubos Faicon 2053 e .incubados a 37°C durante uma hora. Amostras de cem microlit-ros foram colocadas am placas de agar L.B contendo ampicilina e incubadas a 37°C atá aparecerem colónias.

As colónias plasmídeo das colónias ensi mas de res tri ç ão. foram cultivadas individualmente e o DNA de individuais foi examinado por análise com 0 isolamento de DMA de plasmídeo foi realizado numa escala menor de acordo com o processo do Exemplo 1i mas o passo do CsCl foi omitido até serem identificados os transf ormantes correctos E , ço 1 i KÍ2 AG 1 /pâT-Q037~h. Naquela altura, realizou-se uma preparação em larga escala de plasmideo altamente purificado. Seguindo os ensinamentos dos Exemplos 1 © 2, qualquer um dos genes mutantes do zimogénio pode ser facilmente clonado em qualquer um dos vectores GBMT.

Exemp1o 3

Construção de transformantes da linha de células 233 de rim embr ionár o transformadas com adenovirus e da linha de células AVI2 de hamster sirio transformada com adenovirus usando o

Plasmideo pGT-FLIN A linha celular 293 de rim embrionário pode ser adquirida à American Type Culí-ure Collection com o número de acesso ATCC CRL .1573. A linha celular* AV.12 de hamster sírio transformada com adenovi rus pode ser também adquirida à American T*/pe Culture Collection com o número de acesso ATCC CRL 3595. 0 processo de transformação descrito abaixo refere—se a células 233 como linha celular hospedeira, no entanto* o processo é geralmente aplicável á maior parte da linhas celulares eucaritóticas, incluindo a linha celular AV.1.2 e aos vectores de expressão do invento. semana.

As células 293 foram adquiridas à ATCC com o número de acesso CRL 157:3 num frasco de 25 mnf' contendo uma monocamada confluente de aproximadamente 5,5 x Í0& células em Meio Mínimo Essencial de Eagle CGifoccO com .1.0% de soro inactivado de cavalo. O frasco foi incubado a 370C; o meio foi mudado duas vezes por 0 meio é composto por DMEM (6ibco) suplementado com 1.0%

de soro fetal de vitela, 50 ,ug/ml de gentamicina e lOjug/ml de R

AquaMEPHVTON fitonadiona vitamina (Merck Sharp and Dohme,

Merckand Co., Xnc ., West Point, PA 194.86). As células foram subcultivadas por remoção do meio, lavagem com solução equilibrada de sais de Hank CSibco), adição de 0,25¾ tripsina (contendo 0,2 g/1 de EDTA) durante 1-2 minutos, lavagem com meio fresco, aspiração e distribuição por novos frascos numa razão de subcul— tura de .1 ! 5 ou li 10.

Um dia antes da transformação, as células foram semea- das a 0,7 x 10 por placa de 100 mm. DMA de plasmádeo estéril precipitado com etanol dissolvido em tampão TE foi usado para preparar uma solução de 2X DMA-CaC 1contendo 25 ,ug/ml do DMA de plasmídeo transformant© e 250 mH CaCL.rj. Preparou-se 2X H8SS contendo 280 mM NaCl, 50 mM Hepes e 1,5 mM fosfato de sódio, com o pH ajustado a 7,05-7,15. A solução de 2X DNA-CaC 1foi adi cio- A» nada gota a gota a um volume igual de 2X HBS8. Uma pipeta de plástico estéril de 1 ml com uma rolha de algodão na ponta foi inserida no tubo de mistura que contem ο 2X HBSS, e introduzidas bolhas soprando enquanto o DMA é introduzido. O precipitado de DNA-fosfato de cálcio é formado sem agitação durante :30-45 minutos â temperatura ambiente. ura do por pipeiagem su ave placa ) de precipit ado foi me i o de crescimen to que >ras de incubação a 37 °C , o e as células deix fá *mJ d "dj ã Ί" elS :e r p r essão se 1 e c ti f LJfftcã ff;ο. P C £í SÊ? 1 £?C t· X v<s que i ransf ormaç ão adicionado directamente aos .1.0 ml do cobre as células recipientes. Após 4 h>: meio foi subst.itu.ido por meio fresco incubar durante mais 72 horas antes de va. Para os plasmideos que não contêí funcione em células eucariôticas o processo de

utiliza uma mistura de plasmídeosí © vector de expressão do presente invento que não possui uma marca selectiva,’ e um vector de expressão que compreende uma marca selectiva que funciona em células eucarjôticas. Existe uma variedade de vectores para usar em tais sistemas de cotransformacão e incluem p8V2-dhfr í!ATGC 37.146), pSV2-neo (ATCC 37149), pSV2-gpt CATCC 37145) e p8V2-hyg (NRRL B-18039). 0 plasmídeo pSV2-hyg confere resistência â higromicina B nas células hospedeiras eucariõticas. Esta técnica de cotransformacão permite a selecçSo de células que contêm o plasmídeo com a marca selectiva. Estas células foram ainda examinadas para identificar células que compreendem ambos os p1asmídeos de transformação. Certamente o presente invento também compreende vectores de expressão que contêm uma marca selectiva para células eucariôticas e assim não necessitam da técnica de cotransformacão.

Para as células transfectadas com piasmídeos contendo o gene que confere resistência â higromicina como seja o plasmídeo pST-Q097~h, a higromicina B foi adicionada ao meio de crescimento para uma concentracão final de aproximadamenie 200 .ug/ml. As células foram então incubadas a 37°C durante 2-4 semanas com mudança de meio com intervalos de 3 a 4 dias. As colónias resultantes resistentes â higromicina foram transferidas para frascos de cultura individuais para caracterização. O plasmídeo pSV2-neo confere resistência à neomicina ¢6418 é também usado em vez de neomicina) e a selecção de colónias resistentes a 6418 foi realizada essencialmente de acordo com o processo de seieccão de células resistentes à higromicina, excepto S4Í8 ser adicionado para uma concentração final de 400 ,ug/ml. 61 A utilização do gene da di-hidrofolato-redutase (dhf r > ou o derivado do gene dhfr que confere resistência ao metotrexato Cdhfr-mtx) como marca selectiva para introdução de um gene ou plasmídeo numa linha celular deficiente para dhfr e a utilização subsequente do metotrexato para amplificar o número de cópias do plasmídeos está bem estabelecida na literatura. As células 296! são dhfr positivas assim os transformantes de 293 que contêm os plasmídeos compreendendo o gene dhfr não são seleccionadas apenas na base do fenóiipo dhfr-positivo, que é a capacidade para crescer em meios que não possui hipo.xanti.na e timina. As linhas celulares que não possuem um gene dhfr funcional e são transformadas com plasmídeos contendo dhfr podem ser seleccionadas com *4“ base no fenóiipo dhfr . Se bem que a utilização do dhfr como marca selectiva e marca amplificâvel em células produtoras de dhfr não tenha sido bem estudada, os dados da literatura sugerem que dhfr pode ser usada como marca selectiva e na amplificação de gene sem células produtoras de dhfr. 0 presente invento não está limitado pela marca seleccionável usada nos vectores de expressão. Ainda, podem ser usadas as marcas amplifiçáveis tais como genes de metalotioneína, genes da adenosina-deaminase ou membros da família de mutigenes de resistência, exemplificado pelo gene da F'~g 1 i coproteina. A transformação das linhas celulares 293 e ftVi.2 com uma mistura de plasmídeo pST-FLIM e um vector que confere resistência à higromicina e subsequente selecção das células resistentes à higromicina dá uma série de transformantes. (Outros transformantes foram obtidos usando o plasmídeo pSV2-neo como vector cotrans-formante e selecção de células resistentes a 6418.) 0 processo neste exemplo pode ser usado para cada um cios plasmítíeos do zimogénio HPC do presente invento.

Exemplo 4 imogénio da proteí

Seleccão de células que secretam mutar.ies do na C humana no 100 de

Os transformantes resistentes á higromicina obtidos Exemplo 3 foram cultivados em placas de cultura de tecidos de mui*" numa densidade de várias centenas de elones por placa cultura de tecidos. 0 meio foi decantado.. © as células foram lavadas duas vezes com 5 ml de uma solução de sais equilibrada de Hank (6ibco>. Uma solução de asar estéril a 0,45% (Agarose Tipo 4 da Sgma, catálogo #A3S43; Sigma Chemical Co. , P.O. Box 14508, St. Louis, MO 53178) foi preparada misturando 1 ml de agar a 1,8% <’47°C) com 3 ml de Meio de Eagle modificado por Dulbecco <DME) (Ciibco) (37°C) e 2 ml desta solução de agar a 0,45% foi foi usada para cobrir as células.

Filtros de nitrocelulose OSchleicher and Schuell, Inc., Keene, NH 03431) foram fervidos e depois autoclavados 2 horas para remover o agente molhante, o qual é tóxico para as células. Os filtros foram então colocados sobre a camada de agar e após remoção das bolhas de ar as placas foram incubadas a 37°C durante 1 a 3 horas. Os filtros, préviamente marcados para indicar a orientação original do filtro na placa de modo a facilitar posterior identificação das colónias, foram então removidos © colocados em P88 (50 mM Tris-HCl, pH = 7,2 e ISO mH NaCl).

Para manter as células na placa viáveis durante a análise dos filtros, as células foram cobertas com uma mistura

V V ais DME (37°C 3 e 4 í37 0 C). As c é1u1as contendo 2 ml de agar a 1,8% (47°C>, 2 mi de ml de sais DME com 20% de soro fetal bovino foram então colocadas numa estufa a 37°C.

Todas as lavagens e reacçdes realizadas nos filtros foram conseguidas com os filtros numa plataforma rolante. Os filtros foram primeiro bloqueados por incubação â temperatura ambiente em 5% de leite em PB8. Os filtros foram então lavados (S minutos/1 a vagem 3 quatro vezes em PBS. Uma solução de lOjug/ml de anticorpo policlonal de cabra biot-inilado anti—proteína C humana em albumina sérica bovina a 2,5% foi adicionada ao filtro (em quantidades suficientes para cobrir o filtro), o qual foi então incubado a 37°C durante 1 hora. A purificação da proteína C, para subsequente utilização na preparação de anticorpos contra a proteína C, pode ser conseguida como descrito por Kisiel, 1379, J. Clin. Invest. 641761. 0 anticorpo policlonal pode ser preparado pelo processo descrito em Structura1 Concepts in Immunology and Immunochemistry por E.A. Kabat, publicado em 3.368 por Holt, Rhinehart e Winston. 0 anticorpo monoclonal, que também é adequado para usar no ensaio, pode ser preparado conforme divulgado em Kohler e

Milstein, .1375, Nature, 256:435, ou como divulgado na Patente U.8. NÊ 205046; Laurel 1 et al. , 1385, FEBS 131 (13:75; Suzuki et. al., 1386, J. Biochem. 97;127-138; e EPO Pub. N2 138222. A avidina D e a peroxidase de rábano silvestre biotinilada (HRP3 ΤΙΊ usadas no ensaio foram obtidas num kit Veciastain (Vector

Laboratories, Inc., 30 Insold Road, Burlingame, CA 34010). A biotina foi também adquirida à Vector Laboratories, Inc.

Os filtros foram lavados quatro vezes com P8S a 4°C. Em seguida, a avidina D e a peroxidase de rábano silvestre biotini- lada foram preparadas e adicionadas de acordo com as instruções

TM do fabricante no Kit Vectastain (Vector Laboratories). Os filtros foram incubados com a avidina D conjueada com HRP durante 1 hora a 40C (tempos de incubação mais longos, i.e., durante a noite, podem ser usados quando são secretadas quantidades mais pequenas de proteína); em seguida os filtros foram lavados quatro vezes com PBS a 4ÔC.

Para desenvolver a cor indicadora nos filtros, cerca de 30 mg de reagente revelador de côr da HRP (4-c loro-l-naf to3., Sigma) dissolvido em metanol a 100% arrefecido em gelo foram adicionados a 50 ml de PBS e 30 .ul de H ...,0.-, a 30%. Esta mistura foi adicionada aos filtros de nitrocelulose, os quais foram incubados á temperatura ambiente até a côr aparecer. As colónias que secretam o zimogénio da proteína C humana do invento em maior quantidade serão indicados nos filtros não só pelo aparecimento mais rápido da côr mas também pelas manchas mais escuras no filtro.

Após os filtros terem sido revelados os filtros foram novamente realinhados com as placas originais para determinar quais as colónias que estão associadas ãs manchas no filtro. As colónias que secretam maior quantidade do zimogénio da proteína C humana foram então seleccionadas e usadas para a produção do zimogénio. 0s familiarizados com a matéria reconhecerão que o ensaio acima é meramente ilustrativo do método de identificação de linhas celulares altamente secretoras. Mo método pode ser

empregue com êxito uma variedade de processos de ensaios. Por anticorpos em que C é substituído mais um anticorpo exemplo, pode ser empregue uma reacção com dois o anticorpo de cabra biotini.lado anti-proteína com um anticorpo <Ig<3) de cabra anti-proteína C biotinilado anti-Igõ de cabra.

Os mutantes do zimogénio podem ser purificados a partir das culturas celulares. 0 sobrenadante foi removido das células expressando o produto recombinante e purificado numa coluna Pharmacia Fastflow-Q. Cerca de 1 ml da resina foi equilibrada com 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,.1.5 M Na Cl , 5 mM EDTA, 4 mH bertzamidi-na. 0 sobrenadante da cultura foi levado a pH 7,4 pela adição de Tris-HCl <pH 8,0) e 5 mM EDTA, 4 mM benzamidina. 0 sobrenadante foi aplicado na resina numa coluna, e lavado com três volumes de coluna de Tris-HCl <pH 7,4), 0,15 M NaCl. 0 produto recombinante foi eluido da coluna usando um tampão de eluição contendo 10 mM Ca Cl.-, em 20 mM Tris-HCl <pH 7,4), 0,15 M NaCl, 5 m.M benzam idi na.

Il I I A actividade específica do produto foi determinada de acordo com o processo de Grinnell et al., ¢1887), Biotechno1ogy 5;1189-1192 como se segue; o produto concentrado e dialisado do eluato da coluna foi primeiro activado com um complexo trombina--trombomodulina imobilizado. A actividade amidolíti ca do produto foi medido pela. hidrólise de um substrato tripeptídeo S-2366 «.'adquirido da Helena Labs). A actividade anticoagulante do produto foi determinada pelo prolongamento de um tempo parcial de trombop.lastina activado usando reagentes da Helena.

Claims

REIV Ϊ NDICAÇÕES ia. recombinante, - Processo para a preparação de caracterizado por compreender a um vector de DNA ligação conjunta de: i.I) um vector de clonagem de DMA recombinante; e CII') um composto de DNA compreendendo uma sequência codificadora de uma proteína, compreendendo a referida proteína, a partir do extremo amina para o extremo carbonilo; a ) um peptídeo sinal e propeptídeo de uma proteína secretada gama—carboxi le.de., b) a cadeia leve da proteína C humana; c) um dipeptídeo seleccionado a partir do grupo c onst i tu í do po r 1i s i na-arg i n i na, a r g i n ina-1i s i na, 1isina-1isina e arginina-arginina; e d> a sequência de resíduos de aminoàcidos 67 ASP THR GLU R1 r2 r3 r4 RS Re r7 Rs r9 Rio Ru r12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA· VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHÉ ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

em que R1 é seleccionado do grupo constituído por ASP e LEU, R..., é seleccionado a partir do grupo a!m constituído por <3LN e HIS, R._, é seleccionado a partir do grupo constituído por õL-U e LIS, R^ è seleccionado a partir do grupo constituído por ASP e LEU, R_ é 8LN, R_ é seleccionado a partir do «h o grupo constituído por VAL e TRE, Ry é seleccionado a partir do grupo constituído por ASP, FEN e TIR, R. é PRO, R,~ ê ARG, Ri, é seleccionado a partir do grupo constituído por LEU e TRE, R^j é seleccionado a partir do grupo constituído por ILE ou uma deleção, R é ASW e -CODH é o extremo carbonilo. .1. já 2â. - procp<-so ,-je acordo com a Reivindicação 1/ cb.pb.c~ terizado por o referido poíipsptideo codificado pelo referido DNA ser; 69 H2N-HET TRP GLN LEU THE SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU Rx R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 Ru R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU AU LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS AU GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP AU CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL AU SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU AU PRO GLN LYS SER TRP AU PRO-COOH

em que R VAL, R? ASN . ter irado do grupo ρΘΤ-Ν. 1 é ASP' R._. ώ SLN. R._. é GLU, R Λ é ASP, R,_ ê 4 5 SLN, R^. é b é A8P* R0 é ARS, R in” é LEU ? 1 Ri1 é uma deleçlo e R12 é 3§. — Processo de acordo com a Re i v i nd i c a ç â'o •i» ; carac- pOV* l»© produzir um P .1 asm i deo que é selectionado a pa r t i r consti tuído pelo p1asm £deo pLPC-N e pelo Pira ism í. deo 4sS, — Processo de acordo com a Rei vindi cacio 1; csrsc ter i zado por o po 1 i pep t i deo c od i f i c ado pe 1 o referi do DNA ser

h2n-het TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU Ri r2 R3 R4 R5 Re r7 Rs r9 Rio Rn R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

em que R^ é ASP, R,, é SLN j R..., é 6LU, R^ L é ASP, Rc é 6LN, Rp é VAL, R., é r FEN, Rft é PRO; R^ é ARfí , R 10 á! LEU, Rt1 é> uma. dele cão e R· é ASN. J· >tm 5ã. — Processo de acordo i com a. Reivindi cação 4, carac- teriza.do por se produzir o plasmídeo pLPC-FN. SI. - Processo de acordo com a Reivindicação 1,- carácter izado por o polipeptídeo codificado pelo referido DNA ser:

h2n-met trp gln leu thr ser leu leu SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ASP PHE GLU GLU AU LYS GLU ILE ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU SER CYS AU PRO GLY TYR LYS LEU PRO AU VAL LYS PHE PRO CYS GLY LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP R7 Rg Rg Rio Rn R12 GLY LYS TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR LEU AU GLN PRO AU THR LEU SER PRO ASP SER GLY LEU AU GLU ARG THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET LEU CYS AU GLY ILE LEU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL AU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG LEU PHE VAL AU THR TRP GLY ILE SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG LYS ARG AU ASN SER PHE LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS THR GLU Ri R2 R3 R4 R5 Re MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO LYS LYS LYS LEU AU CYS GLY AU LEU THR AU AU HIS CYS MET ASP LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS ASP ASN ASP ILE AU LEU LEU HIS GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU GLU LEU ASN GLN AU GLY GLN GLU HIS SER SER ARG GLU LYS GLU AU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN ASP ARG GLN ASP AU CYS GLU GLY SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU AU PRO GLN LYS SER TRP AU PRO-COOH 74 em que é ASP, R._, «lú· QLN, R..,, é O GLU, R, é ASPi 4 Rc é GLN, R<. é ò fo VAL R? é FEN, R0 é PRQ, R9 é ARG, Rj(.} é LEU, R^ é uma deieção e Ri é ASN. 7ã. — Processo terizado por se produzir de acordo com a Reivindicação 6,-o plasmídeo pLFC-SC. carac fiei Processo de acordo com a Reivindicací carac terizado por o po.l.ipeptideo codificado peio eferido DNA ser; ► »

h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU R1 r2 r3 r4 RS R6 r7 Rs Rs Rio Rn R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO -COOH 7β em que é ASP, VAL, R_ ê ASP, Ra ASN. R0 é SLN, R_ é PRO, Ra é é QLU, R, é ASP, R_ 4 5 ARS, R ê LEU, R é é SLN, R_ é ILE e H, * Sã. - Processo de acordo com a Reivindicação 8, carac terizado por se produzir o plasmídeo pLPC-LIN. ÍOã. - c a r a c te r i zado po r Processo de acordo com a .Reivindicação í, o polipeptídeo codificado pelo referido DNA ser: 77 n'ΐ h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU *1 r2 r3 r4 r5 r6 r7 Ra r9 Rio Rn Rl2 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH 78 78 em que é ASP, R.-, é SLM, R,^ é QLU. R^ é A8P., Rc é GLN, Rg é UAL, R7 é ASP, Rg £ PRO, Rg è ARS, ... ê LEU, Rj1 é ILE e Rj2 é A8N. jj.a. - Processo de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por se produzir o plasmídeo pLPC-FLIN. Í2â. - Método para a produção recombinante de uma forma zimogênia da proteína C humana quando da secreção a partir de uma célula hospedeira eucariótica, caracterizado por compreender; CA> a transformação de uma célula hospedeira eucariótica com um vector de DMA recombinante, o referido vector compreendendo; (i) uma sequência de DMA que codifica uma sequência de resíduos de aminoâcidos, a referida sequência de resíduos de aminoâcidos compreendendo, a partir do extremo amina para o extremo carbonilo: ( a ) í b ) C c ) <d) um peptídeo s i ria 1 e propeptídeo de uma proteína secretada gama—carboxiladaj a cadeia leve da proteína C humanaj um dipeptídeo seleccionado a partir do grupo constituído por LIS—ARS, ARQ—LIb, LIS—LIS e ARG-AR6 J e a sequência de resíduos de aminoâcidos; 79 ASP THR GLU Ri r2 Ra R* Rs Re r7 Ra *9 Rio Ru R12 GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAI LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHÉ ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH em que R., é seleccionado do grupo constituído por A SP e LEU, ,R._, é selecc ionado do grupo constituído por GLN e HIS, R._, é selecc ionado do grupo constituído por 8LU e LIS, R^ é seleccionado do grupo constituído por ASP e LEU, R_ é GLN; R._ é selecc ionado do grupo constituído por VAL e TRE, R_, é selecc ionado / do grupo constituído por ASP, FEN e TIR, RCt é PRO, Rq é ARG, R^ê selecc ionado do grupo constituído por LEU e TRE, ^ é seleccionado do grupo constituído por ILE ou uma. de 1 ergo, R^é ASM e -COOH é o extremo carbonilo; (ii) um promotor colocado para conduzir a expresslo da referida sequência de DNA; t r a ns f o r ma da no a expressão da a cultura da referida célula hospedeira passo (A) nas condiçdes que permitem referida sequência de DNA e a recuperação da referida forma zimogénia da proteína C a p a r t i r da r e f e r i da c u 11 u r a . > > a Reivindicação 12, carac-eira cultivada no passo (B) hospedeiras consc-xtuido por 293/pL.PC-SC ,· 293/pLPC-LIN e 13i. - Método de acordo com t-erizado por a referida célula hosped ser seleccionada do grupo de células 233/pLPC—N, 293/p6T-N, 2S3/pLPC-FN; 293/pLPC-FLIN. Lisboa, 22 de Fevereiro de 1391

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oíicial da Propriedade Induitrtal RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3.® 1200 USBOA