PT96853A

PT96853A - Processo para a preparacao de vectores e compostos para a expressao de mutantes de glicosilacao da proteina c humana

Info

Publication number: PT96853A
Application number: PT96853A
Authority: PT
Inventors: Bruce Edward Gerlitz; Brian William Grinnell
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1990-02-23
Filing date: 1991-02-22
Publication date: 1991-10-31
Also published as: NO910719L; FI910854A0; DE69126049D1; YU31891A; ATE153069T1; IE910611A1; EP0443874A2; GR3023756T3; CA2036894C; EP0443874B1; DK0443874T3; IL97311A0; AU7130791A; CN1055560A; NO910719D0; JPH04211380A; FI910854A; NZ237199A; KR910021477A; AU645776B2

Description

0 presente invento proporciona novos compostos de DNA e vectores de clonagero de DNA recombinante que codificam novas formas zimogénicas da proteína C humana. Estes zimogénios foram projectados de forma a terem padrões de glicosilacão drâsticamente alterado em comparação com o zimogénio tipo selvagem da proteína C humana. A glicosilação, particularmente quando as fracções de açúcar contêm níveis elevados de ácido siâlico, pode desempenhar um papel importante na secreção e função de proteínas. Os novos zimogénios do presente invento foram construídos de forma a que cada um dos sítios de glicosilação tenha sido individualmente alterado. Os vectores de expressão proporcionam um meio simples e eficaz para a expressão destes zimogénios da proteína C humana em células hospedeiras recombinantes. O presente invento proporciona métodos para a produção de formas zimogénicas da proteína C que quando da activação têm actividade amidolítica e anticoagulante superior á da forma nativa. As novas formas de zimogénio da proteína C humana diferem das já conhecidas na sequência de resíduos de aminoácidos dos vários sítios de glico-silação. Estas novas formas de zimogénio da proteína C oferecem vantagens especiais no tratamento de anomalias no sangue envolvendo c oagu1a ç So. A proteína C, uma proteína do plasma dependente da vitamina K, έ de grande importância fisiológica no controle da hemostasia. A proteína C é sintetizada como uma molécula inactiva aqui designada proteína C nascente. A proteína C nascente sofre um processamento complexo, dando origem a uma série de diferentes moléculas inactivas como ê aqui descrito mais detalhadamente. As formas secretadas de proteína C inactiva são aqui referidas como zimogénio da proteína C. A activação de proteína. C ocorre no sangue através de uma reacção envolvendo um complexo trombomodu™ lina-trombina. A proteína C activada, juntamente com o seu cofactor proteína S, é um anticoagulante com bastante importância

fisiológica. A proteína C activada pode evitar a trombose intravascular e controlar a extensão de coágulos existentes. 0 mecanismo de acçSo da forma activada da proteína C e o mecanismo de activação do zimogánio inactivo para protea.se activa foram ©clarificados nos últimos anos (para uma revisão, ver J.E. Sardiner e J.H. Qriffin, Progress in Hematology, Vol. XIII, pp. 265-278, ed. Elmer &. Brown, Srun© s Stratton, Inc., 19831© Esmon, N.L... 3.989, Prog. Hemost. Thromb. 9: 29-55). A activação da proteína C envolve trombina, a protease serina final da cascada de coagulação e uma glicoproteina associada a membranas de células endoteliais designada trombomoduli— na. A trombomodulina forma um complexo estequiométrico forte com a trombina. A trombomodulina quando complexada com trombina, altera dramaticamente as propriedades f une i ona i s da trombi na.

A trombina normalmente coagula o fibrinogénio, activa as plaquetas e converte os cofactores de coagulação V e VIII nas suas formas activadas, Va e VIIIa. Finalmente, a trombina activa a proteína C, mas apenas muito lentamente e ineficazmente e a activação é ainda inibida por Ca fisiológico. Pelo contrário, a trombina complexada com trombomodulina não coagula o fibrinogénio, activa as plaquetas ou converte os fsetores de coagulação V e VII nas suas contrapartes activadas Va e VIIIa, mas torna-se um activador muito eficaz do zimogénio da proteína C na presença de Ca fisiológico. A constante de velocidade da activacão do zimogénio da proteína C pela trombomodulina-trombina á cerca de de 1000 vezes superior â constante de velocidade da trombina sózinha.

Para compreender como a proteína C regula de forma negativa a coagulação do sangue, é proporcionada a descrição breve que se segue sobre o sistema de enzimas de coagulação. 0 sistema de coagulação é melhor observado como uma reacção em cadeia envolvendo a activação sequenciada de zimogénios para 4

proteases serina activas.Esia reacção em cadeia eventual mente produz a enzima trombina, a qual através de proteôlise limitada converte o fibrinogénio do plasma em fibrina insolúvel no gel.

Dois acontecimentos chave na cascada de coagulado sâ'o a conversão do factor de coagulação X para Xa através do factor de coagulação IXa e a conversão de protrombina em trombina pelo factor de coagulação Xa. Ambas as reacçdes ocorrem nas superfícies celulares, principalmente na superfície de plaquetas e ambas as reacçôes necessitam de cofactores. Os principais cofactores, factores V e VIII, no sistema circulam coroo percursores· relativamente inactivos, mas quando se formam as primeiras poucas moléculas de trombina, a trombina responde e activa os cofactores através de proteôlise limitada. Os cofactores activados, Va & VIIIa, aceleram ambos a conversão de protrombina em trombina e também a conversão do factor X em factor Xa em aproximadamente cinco ordens de grandeza. A proteína C activada actua preferencialmente para degradar proteoliticamente, hidrolizar e irreversivelmente destruir os factores de coagulação Va e VII.la, as formas dos factores de coagulação inactivos V e VIII. Os factores de coagulação V e VIII, pelo contrário, são substratos muito fracos da proteína C activada in vivo.

Um cofactor importante para a proteína C activada ê a proteína 3, uma outra proteína do plasma dependente da vitamina K. A proteína S aumenta substancialroente a hidrólise mediada por proteína C activada dos factores Va e Vlíla 25 vezes. A proteína C é reconhecida como um importante agente terapêutico (ver, por exemplo, Bang et ai., Patente U.S.N2 4,775,624, publicada em 4 de Outubro de 1988, os ensinamentos da qual é aqui incorporado como referência). A proteína C activada é um novo agente anti-trombôtico com um índice terapêutico mais tais como heparina e largo do que os antieoagulantes disponíveis, 5 ~ s

V os anticoagulantes orais do tipo hidroxicoumarina. Nem o zimogé-nio da proteína C nem a proteína C activada são eficazes at+e ser gerada trombina, uma vez que a trombina é necessária para converter os factores de coagulação V para Va e VIII para VIIIa; as formas activadas destes dois cofactores são o substrato preferido para a proteína C activada. A trombina é também necessária para activar o zimogénio da proteína C, pois sem o complexo trombomo-dulina-trombina» o zimogénio da proteína C não é eficazmente convertido na sua contraparte activa. A proteína C activada é um anticoagulante desejável pois a proteína C activada funciona inactivando os cofactores Va e VII.Ia. Devido â trombina ser necessária para converter os factores V e VIII nas suas contrapartes activadas Va e VIII a , a proteína C actua apenas como anticoagulante após ser gerada a trombina. proteína C c irculação aumentando vamente á activada é de clínica marinas.

Os anticoagulante® convencionais ao contrário da activada, mantém um estado anticoagulante constante na durante o tempo em que são administrados ao doente, assim substancialmente o risco de hemorregias relati-proteína C ou à. proteína C activada. ft proteína C portanto um anticoagulante desejável de larga uiilida-para usar como alternativa â heparina e às hdroxicou-

Na1gumas doenças ta is c orno de f iciênc i a he red i tá r ia em proteína C, o zimogénio da proteína C é de grande interesse terapêutico. Na deficiência congénita homozigótica da proteína C os indivíduos afeciados morrem no inicio da infância de purpura fulminans, uma forma, muitas vezes letal de coagulação intravascular disseminada. Na deficiência heterozigótics. relativamente a proteína C, os indivíduos afectados sofrem de surtos tromboembó-licos regulares. Está cUnicamente bem estabelecido que os concentrados de proteína do plasma destinados a tratar a s hemofilia B ou a der iciência no facior 1X.> o qual contem proteína C como impureza, são defectivoe na prevenção e tratamento de coagulação intravascular na deficiência heterozigótica de proteína C. Também se observou níveis anormalmente baixos de proteína C em estados tromháticos tais como coagulação intravascular disseminada e em doenças com predisposição para a trombose, tais como trauma grave, cirúrgia e cancro.

Para facilitar uma compreensão da proteína C activada e do invento, descreve-se abaixo a sequência codificadora e a correspondente sequência de resíduos de aminoácidos da proteína C humana nascente. Esta sequência de resíduos de aminoácidos e suas partes importantes também caracterizam a "proteína C humana nativa" para fins do presente invento. *7 / 10 20 30 40 5'-ATG TGG CAG CTC ACA AGC CTC CTG CTG TTC GTG GCC ACC TGG GGA ATT h2n-met TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE 5 10 15 50 60 70 80 90 TCC GGC ACA CCA GCT CCT CTT GAC TCA GTG TTC TCC AGC AGC GAG CGT SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG 20 25 30 100 110 120 130 140 GCC CAC CAG GTG CTG CGG ATC CGC AAA CGT GCC AAC TCC TTC CTG GAG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU 35 40 45 150 160 170 180 190 GAG CTC CGT CAC AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG GAG ATC TGT GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS 50 55 60 200 210 220 230 2* GAC TTC GAG GAG GCC AAG GAA ATT TTC CAA AAT GTG GAT GAC ACA CTG ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU 65 70 75 80 250 260 270 280 GCC TTC TGG TCC AAG CAC GTC GAC GGT GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO 85 90 95 290 300 310 320 330 TTG GAG CAC CCG TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG TGC ATC LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE 100 105 110

340 350 360 370 380 GAC GGC ATC GGC AGC TTC AGC TGC GAC TGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY 115 120 125 390 400 410 420 430 CGC TTC TGC CAG CGC GAG GTG AGC TTC CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC AEG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN 130 135 140 440 450 460 470 480 GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGC CTA GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS 145 150 155 160 490 500 510 520 AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG CAG TGT CAC SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS 165 170 175 530 540 550 560 570 CCC GCA GTG AAG TTC CCT TGT GGG AGG CCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS 180 185 190 580 590 600 610 620 AAG CGC AGT CAC CTG AAA CGA GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL 195 200 205 630 640 650 660 670 GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC CCC ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO 210 215 220 680 690 700 710 720 TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA •225 230 235 240 730 740 750 760 GTG CTC ATC CAC CCC TCC TGG GTG CTG ACA GCG GCC CAC TGC ATG GAT VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP 245 250 255

770 780 790 800 810 GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG 260 265 270 820 830 840 850 860 TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC GTC CAC TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS 275 280 285 870 880 890 900 910 CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG CTG CAC PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS 290 295 300 920 930 940 950 960 CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC TGC CTC LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU 305 310 315 320 970 980 990 1000 CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC AAT CAG GCC GGC CAG GAG PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU 325 330 335 1010 1020 1030 1040 1050 ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAC CAC AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA 340 345 350 1060 1070 1080 1090 1100 AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC AAC TTC ATC AAG ATT CCC GTG GTC LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL 355 360 365 1110 1120 1130 1140 1150 CCG CAC AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN 370 375 380 1160 1170 1180 1190 1200 ATG CTG TGT GCG GGC ATC CTC GGG GAC CGG CAG GAT GCC TGC GAG GGC MET LEU CYS ALA GLY 1LE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY 385 390 395 400 10 -

1210 1220 1230 1240

GAC AGT GGG GGG CCC ATG GTC GCC TCC TTC CAC GGC ACC TGG TTC CTG

ASP SER GLY GLY PRO MET VAI AU SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU 405 410 415 1250 1260 1270 1280 1290

GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC CTT CAC AAC TAC

VAI GLY LEU VAI SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR 420 425 430 1300 1310 1320 1330 1340

GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC GAC TGG ATC CAT GGG CAC

GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS 435 440 445 1350 1360 1370 1380 ATC AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG-3 * ILE ARG ASP LYS GLU AU PRO GLN LYS SER TRP AU PRO-COOH 450 455 460

ίί em que A é desoxiadeni.1 o, 6 é desoxiguanilo, C' é desocitidilo, T é timidilo, ALA é Alanina, AR8 ê Arglnina, ASN é Asparagina, ASP é Ácido aspártico, -CGOH é o extremo carbonilo, CYS é Cisteina, 6L.N é 61utamina, 6LU é ácido glutâmico, 6LY é 61icina, HIS é histidina, H.-.N- é o extremo amina, J.LE é isoleucina, LEU é Leucina, LYS é Lisina, MET é Metionina, PHE é Fenilalanina, PRQ é Prolina, SER é Serina, THR é Treonina, TRP é Triptofano, TYR é Tirosina e VAL é Valina. A sequência de DMA descrita atrás derivou de clones de cDNA preparados a partir de mRNA de fígado humano que codifica a proteína C humana. Os familiarizados com o ramo reconhecem que a natureza degenerada do código genético permite construir muitas sequências diferentes de DMA que codificam a mesma sequência de resíduos de aminoácidos. A sequência do cDNA para a proteína C humana nascente descrita atrás é portanto apenas uma das muitas sequências possíveis codificadoras de proteína C humana nascente. Na construção de clones de cDNA, construiu-se uma sequência poli S , uma sequência poli C 3' e sequência de reconhecimento da enzima de restrição Ps11 5' e 3f nos extremos do c-DNA codificador da proteína C. Dois destes clones de cDNA foram manipulados para construir uma molécula de DNA compreendendo a sequência codificadora da proteína G humana nascente e também fracedes do DNA codificador do mRNA nâo traduzido nos extremos 5’ e 3’ da regiSó codif icadora. Esta molécula de DNA foi inserida no sítio PstI do plasmídeo pBR322 para construir o plasmídeo pHC7. 0 plasmídeo pHC7 compreende assim a sequência codificadora atrás e novamente descrevendo apenas uma cadsis da molécula, também contem estas sequências adicionais;

ν," 5'-C TGC AGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG CTG TCA TGG CGG CAG GAC GGC GAA CTT GCA GTA TCT CCA CGA CCC GCC CCT ACA GGT GCC AGT GCC TCC AGA-3' e 5’-CGA CCC TCC CTG CAG GGC TGG GCT TTT GCA TGG CAA TGG ATG GGA CAT TAA AGG GAC ATG TAA CAA GCA CAC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCT GCA G-3’

nos extremos S! e 31 , respectivamente, da cadeia codificadora da sequência codificadora da proteína C humana nascente. Devido á natureza complementar do emparelhamento de bases do DNA, a sequência de uma cadeia de uma molécula de DNA de cadeia dupla ê suficiente para determinar a sequência da cadeia oposta. O plasmídeo pHC7 pode ser co1i Kl2 RRi/pHG7, uma permanente de culturas (NRRL5, Peoria Illinois ser obtida da NRRL com convencionalmente isolado a partir de Eh. estirpe depositada e englobada na colecção do Northern Regional Research Laboratory . Uma cultura de E. coli KJ.2 RRl/pHC7pode o número de acesso NRRL B—15926. Na Figura 2 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e de funções do plasmídeo pHC7. A proteína C nascente também pode ser descrita esquematicamente como se mostra abaixo.

J. 42 43 .1.97 198 1 o o J. 200 21.1. 212 461. pre-pro LC Kl i AP .......................... AHC HG. pre~pro

KR - AP -

AHC

HC

— resíduos de aminoácidos 1-42 da proteína C humana nascente codificam o peptídeo sinal e o propeptídeo da proteína C humana, importante para dirigir a secreção e gama-carboxilação da proteína C. resíduos de aminoác idos 43-197 da proteína C nascem-e, uma vez modificados após tradução, constituem a cadeia leve (LC> do zimogénio de duas cadeias «.formado a partir do zimogénio de uma cadeia pela remoção do dipeptídeo KR, conforme discutido abaxxo> e formas activadas da proteína C. resíduos de aminoácidos 198-199 da proteína C humana nascente; pensa-se que estes resíduos sejam removidos (com base na homologia com proteína C bovina), provavelmente por um processo de dois passos compreendendo uma primeira clivagem (entre os resíduos 197-198 ou 199—2001 seguido da acção de carboxipeptidase ou de aminopeptidase, para formar a proteína C de duas cadeias. resíduos de aminoác idos 200—211 da proteína C nas c evite constituem o peptídeo de activação, o qual é removido das formas de zimogénio da proteína C para se ofcter a p ro te ína C ac t i vada. resíduos de aminoácidos 212—461 da proteína C nascente, uma vez modificada apôs a tradução, constituem a cadeia pesada activada (AHC) da proteína C activa. a cadeia pesada da forma de duas cadeias do zimogénio 14 da proteína C, unia vez modificada após tradução, é composta pelos resíduos de aminoácidos 200-451, a AP e AHC. 0 zimogénio da proteína C humana é um precursor de protease serina sintetizado no fígado e presente no sangue. Para a expressão de activida.de biológica completa, a proteína C necessita de modificações pós-tradução para as quais a proteína K é necessária. 0 zimogénio da proteína C com duas cadeias ligadas por ligações dissulfureto surge do zimogénio de uma só cadeia por proteólise limitada. Pensa-se que esta proteólise limitada inclua a clivagem e remoção dos resíduos de aminoácidos 138 e 139. A activação do zimogénio de duas cadeias para protease serina activa envolve a clivagem proteolítica de uma ligação peptídica AR6-L.EU (resíduos 21.1. e 212). Esta última clivagem liberta um dodecapeptídeo (resíduos 200-2111, o peptídeo de activação, o qual constitui o extremo amina da cadeia maior (pesada) da molécula zimogénio de duas cadeias. A proteína C é significativamente glicosilada; a enzima madura do plasma contem 15 a 23% de açúcar. A proteína C também contem uma série de aminoácidos invulgares, incluindo ácido gama-carboxiglutâmico e ácido ,8-hi- d rox i aspâ r t i co hox iglu târn i c o < e r i tro-L-8-h i d r ox i-aspa r ta to ?. 0 ácido (gla) é produzido por carboxilação de gama-car-gama-gluta- milo dos resíduos de ácido glutámicocom a ajuda de uma carboxi-lase microsomal hepática que precisa da vitamina K como cofactor. A activação da proteína C humana pode também ser representada esquematicamente e está apresentada abaixo. Os familiarizados com a matéria reconhecem que a ordem dos passos mostrados no esquema não refletem necessáriamente a ordem dos passoa na via in vivo. 15 pre-pro-LC-KR-^P-AHC proteína C nascente modifi caçáo pós-tradução, i . e. , í gama-carboxilacão de resíduos ! de ácido glutámico específicos, ' β-hidroxilação de um resíduo de í ácido aspártico e glicosilaçáo ! secreção, a remoção dos resíduos! 1-42, que pode envolver mais de ! uma clivagem proteolítica ! LC-KR-AP-AHC zimogánio de uma cadeia remoção dos resíduos 198-199, ! cerca de 90% da proteína ‘ zimogénio 0 encontrada no sangue! humano é a forma de duas cadeias! <8-8=1igação dissulfureto) '

LC |;-S zimogénio de duas cadeias

íLhC-AP activaçSo por ! trombi na-t rombomodul i. na !

LC :|;-8 proteína C activada

AHCP 0 presente invento proporc-iona novos compostos, vecto res, transformantes e métodos para a expressão recombinante de novos zimogénios de proteína C.

Para fins do presente invento tal como aqui é divulgado, os seguintes termos são definidos abaixo.

Ad2LP

- o principal promotor tardio adenov£ rus t i po

Os resídu de am i noâc i do vias proteínas ou p-eptideos aqui descritos sSo abreviados como se segue na Tabela I.

Tabela I

Abreviatura de uma só letra

Abreviatura de três letras Resíduo de aminoácido

FEN Fenilalanina F LEU Leuc ina L ILE Isoleucina I MET Metionina M VAL Va1i na V SER Serina ·" PRO Prolina P TRE Treonina T ALA Alanina A TIR T i r os i na V i HIS Histidina H GLN fílutamina Q ASN Asparagina N LIS Lisina L··* ASP Ácido aspáriico D QLU Ácido g1utâm i c o E CIS Cisteina C TRP T riptofano W AR <3 Arginina R GLI Θ1ic ina Q 17

ApR - o fenótipo de resistência à ampicilina ou gene que o confere. BK - DMA do vírus BK.

Enh ou potenciador - o potenciador do vírus BK. ep ou SV40ep - um segmento de DNA compreendendo p promotor precoce do gene do antigénio T, os sítios de ligação ao antigénio T, o potenciador do SV40 e a origem de replicação do SV40. gama-carboxilaçSo - uma reaccão que adiciona um grupo carboxilo a ácidos glutâmicos no carbono gama.

Proteína 6ama-carboxilada - uma proteína em que alguns resíduos de ácido glutâmico sofreram gama-carboxilação.

Unidade de transcrição SBMT - uma unidade de controle da transcrição modificada compreendendo o potenciador P2 do vírus BK situado perto do elemento regulador a montante do principal promotor tardio do adenovírus (MLTF), o principal promotor tardio do adenovírus tipo 2, um elemento poli GT colocado para estimular o referido promotor e uma sequência de DMA contendo a sequência lider tripartida e "spliced" do adenovírus. A unidade de transcrição 6BMT encontra-se num fragmento de restrição HindiIX do P1asm í deo pQT-h. IVS - DNA codificador de um intrão, também designado sequência interviniente. MMTpro - o promotor do gene da metalotioneína I de murganho.

Proteína nascente - o polipeptídeo produzido quando da tradução de um transcrito mRNA, antes de quaisquer modificações pós-tradução. No entanto, as modificações pás-tradução tais como gama-carboxilacão de resíduos de ácido glutámico e hidroxilação de resíduos de ácido aspártico podem começar antes de uma proteína ser totalmente traduzida a partir de um transcrito mRNA.

NeoR ~ um gene que confere resistência â neomicina, ' qual pode também ser usado para conferir resistência ao antibiô' tico 6418. pA - uma sequência de DMA que dirige a transcrição de DNA em RNA.

Actividade de proteína C - qualquer propriedade de uma proteína C humana responsável por actividades proteolíticas, amidolíticas, esterolíticas e biológicas Canticoagulantes ou profibrinolíticas). Os métodos para testar a actividade anticoa— gulant-e de proteínas são bem conhecidos na área, i.e., ver Qrinnell et aí . , 1987, Biotechnology 5,' 1189.

Vector de clonagem de DNA recombinante - qualquer agente, incluindo, mas não estando limitados a agentes de integração cromossómicos, plasmídeos de replicação autónoma e fagos, compreendendo uma molécula de DNA á qual podem ser ou foram adicionados um ou mais segmentos de DNA adicionais.

Vector de expressão de DNA recombinante - qualquer vector de clonagem de DNA recombinante no qual foi incorporado um promotor e colocado de forma a dirigir a expressão de um produto genético. 19

Vector de DMA recombinante - qualquer vecior de clona-gem ou de expressão de DMA recombinante.

Replicão ~ uma sequência de DMA que controla e permite repicação autónoma de um plasmídeo ou de outro vector.

Fragmento de restrição - qualquer sequência de DMA linear gerada pela ac cão de uma ou ma is enzimas endonucleases de restrição. Célula hospedeira sensível - uma célula hospedeira que não pode crescer na presença de um dado antibiótico ou outro composto tóxico sem um segmento de DMA que lhe confere resistên-c ia.

TcR - fenôtipo que confere resistência à tetraciclina ou gene que confere a mesma.

Transformação ~ a introdução de DMA numa célula hospedeira recipiente que altera o genôtipo da célula recipiente.

Transformante - uma célula hospedeira recipiente que sofreu transformação.

Sequência activadora da transcrição - qualquer sequência de DNA, incluindo a codificadora de um sitio de ligação ao ribossoma e o codão de iniciação da tradução, como seja S'-AT6--3', que proporciona a tradução de um transcrito de mRMA num peptídeo ou polipeptídeo.

Zimogénio - um precursor enzimaticamente inactivo de uma enzima proteolítica. 0 zimogénio da proteína C, tal como aqui :0 - é usado, refere-se a formas inactivas secreiadas, quer de uma quer de duas cadeias, de proteína C. A Figura 1 é um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pLPC~Q097. Para fins do presente invento, as Figuras não estão desenhadas exactamente à escala. A Figura 2 é um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pLPC~0248. A Figura 3 é um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pL..PC-Q313. A Figura 4 é um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pLPC-Q323. A Figura 5 é um mapa de sítios de restrição e funções do p1asm í deo pGTC. A Figura 6 ê um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pGT-d.

Figura 7 é um mapa de sítios de restrição e funções do Ρ1asm í deo pGT-h. 0 presente invento proporciona compostos de DNA que codificam a expressão de novas formas de zimogénio da proteína C humana. Foram descritos vários métodos para a produção de zimogé-nio da proteína C humana nativa e de proteína C humana nativa Cver Bang et al., Patente U.S. 4,775,624, publicada em 4 de Outubro de 1338 e Publicação de Patente Europeia 215548, ambos sendo aqui incluidos como referência). Os métodos de trabalhos anteriores proporcionam expressão de formas de zimogénio de 21 proteína C humana que não diferem na sequência de aminoácidos das formas de zimogénio presentes em sangue humano. Quando expressas em certas linhas de células eucerióticas, como seja a linha celular 293 de rim humano, o zimogénio da proteína C humana nativa é secretado com um novo padrão de glicosilação que é diferente do encontrado na forma zimogénio do sangue humano. 0 presente invento proporciona formas zimogénio de proteína C humana que têm padrfies de glicosilação alterados devido a alterações dirigidas na sequência de resíduos de aminoácidos. Quando activadas estas formas de zimogénio têm uma activida.de amidolítica e anticoagulante superior á da proteína C humana nativa. 0 presente invento também proporciona compostos de DNA, vectores de expressão de DMA recombinante, linhas celulares transformadas e métodos para a expressão recombinante destas novas formas de zimogénio da proteína C humana. 0 método para a produção destas formas de zimogénio da proteína C humana caracteriza-se porí CA) transformação de uma célula hospedeira eucariótica com um vector de DNA recombinante, o referido vector compreendendo, uma sequência de DNA que codifica uma sequência de resíduos de aminoâcidos, a referida sequência de resíduos de aminoácidos compreendendo, do extremo amina para o extremo carbonilo, a sequência de aminoácidos;

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Este método e compostos úteis no método são descritos mais detalhadamente abaixo. 0 invento também proporciona compostos de DNA para usar no método de produção destas novas formas de zimogénio de proteína C humana. Estes novos compostos todos codificam um pre-propep-tídeo compreendendo um peptideo sinal para dirigir a secreção e um propeptídeo de uma proteína gama-carboxilada (através da accão de uma carboxilase dependente de vitamina k>. Tais sequências de propeptídeo são bem conhecidas. Ver por exemplo, Suttie et al., 1987, Proc. Natl. Sei. 84 ,'634-637. De preferência e para facilidade de construção, tanto a sequência codificadora do peptideo sinal como a sequência codificadora do propeptídeo derivarão da sequência de resíduos de aminoáeidos do pre—propeptídeo de uma proteína gama-carboxilada. Exemplos de tais proteínas gama-carboxi lada incluem mas não estão limitados a factor VII, factor IX, factor X, protrombina, proteína 8, proteína Z e proteína C. Uma sequência de DNA codificadora, do pre-propeptídeo da proteína C humana é usada de preferência nos vectores do invento.

Os compostos de DNA do invento compreendem ainda a sequência codificadora da cadeia leve da proteína C humana colocada imediatamente adjeacente e a jusante da grelha de leitura e na mesma fase de leitura da sequência codificadora do pre-propeptídeo. A cadeia leve da proteína C humana contem os resíduos de aminoácidos 43 a 197, inclusive, de proteína C nascente, como descrito na secção de fundamento atrás. As frac-cffes amino-terminais das proteínas do plasma dependentes da vitamina K, tais como a fracção amino-terminal da cadeia leve de proteína C, têm sítios de ligação ao cálcio. Os domínios de ligação ao cálcio destas proteínas do plasma, tais como factor VII, factor IX, factor X, protrombina e proteína S, podem ser usados de forma equivalente (ver Publicação de Patente Europeia N.*2 02Í5548A1, nas páginas 12 e 131 ao domínio de ligação ao cálcio da cadeia leve da proteína C humana. Numa das novas formas de zimogénio (Q037) do presente invento, o resíduo asparagina na posição 139 dentro da cadeia leve foi alterado para um resíduo glutamina, removendo-se assim o sítio de glicosilação.

Os compostos de DNA do invento compreendem ainda a sequência codificadora do dipeptídeo LIS-ARG < KR > colocado imediatamente adjacente, a jusante e na mesma grlha de leitura de tradução da sequência codificadora da cadeia leve. Um dipeptídeo dibásico tal como LIS-ARG é colocado na proteína nascente no lado carboxi-terminal da cadeia leve. A orientação do dipeptídeo LIS-ARG na proteína expressa é irrelevante para fins do presente invento. Dipeptideos dibásicos tais como LIS-LIS ou AR6-ARG são equivalentes ao dipeptídeo LIS-ARG para fins do presente invento. No entanto para fins do presente invento ê preferido o dipeptídeo LIS-ARG, que é o dipeptídeo na proteína C humana nativa. 26

Imediatamente a jusante dos codões para o dipeptídeo LI8-ARG está a sequência codificadora do peptídeo de activação. Os familiarizados com a matéria reconhecerão que as formas de zimogénio do presente invento diferem essencialmente das formas de zimogénio nativas da proteína C humana como descrito abaixo.

Outras substituicSes de aminoácidos, além da substituição na posição 139 na cadeia leve, podem também aumentar a actividade amidolítica e anticoagulante do zimogénio resultante. O termo "zimogénio resultante" é usado para indicar que apesar das substituições serem descritas com referência a posições de aminoácidos na proteína C humana nascente, a proteína C humana nascente deve ser secretada (resultando na remoção dos resíduos de aminoácidos 1 a 42) para se obter a formai de; zimogénio. A substituição do resíduo asparagina na posição 139 < na proteína C humana nascente) por um resíduo de glutamina resulta assim num novo zimogénio do presente invento. A substituição do resíduo de asparagina (na cadeia pesada activada) em qualquer uma das posições 290, 355 ou 371, por um resíduo de glutamina também resulta numa nova forma de zimogénio do presente invento.

Assim, as novas formas de zimogénio preferidas da proteína C do presente invento resultam do processamento e secreção de moléculas da proteína C humana nascente com a sequência de resíduos de aminoácidos descrita abaixo.

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Os familiarizados com a área reconhecerão que devido á degeneração do código genético uma variedade daqueles compostos de DNA podem codificar o polipeptídeo descrito atrás. Consequsn-temente, as construções descritas abaixo e nos Exemplos juntos para os compostos de DNA, vectores e transformante preferidos do invento são apenas ilustrativos e não limitantes do âmbito do invento. Em adição, a substituição de 8LN em vez de ASN é ilustrativo e não limita o âmbito do invento tal como outras substituições, com excepção de CIS ou PRO, que podem ser usadas. Ainda, os familiarizados com a matéria reconhecerão que várias substituições de aminoáeidos isolados do presente invento podem ser combinadas para criar outros zimogénios novos.

Todos os compostos de DNA do presente invento foram preparados por mutagénese dirigida do gene da proteína C humana. As moléculas codificadoras de zimogénio mutagenizadas foram então inseridas em vectores de expressão eucariôticos de tal forma que a expressão dos genes do zimogénio foi dirigida pelo principal promotor tardio do adenovírus tipo 2. Os vectores podem também compreender o elemento potenciador P2 do vírus BK colocado de

forma a aumentar a expressão a partir do promotor. Os vectores foram usados para transformar células de Escherichia coii K12 AQi e depositadas e inseridas na colecção de culturas permanentes do Northern Regional Research Laboratories em Peoria, Illinois 61604 em 9 de Janeiro, 1990. As culturas específicas e números de acesso estão apresentados na Tabela II.

Tabela II

Cultura Número de acesso £· taJLL Kl 2 AQl/pLPC- -Q097 NRRL B-18608 E. col i Kl 2 ΑΘ1 / pLPC- NRRL B-18609 E. col i K.l 2 ASI/pLPC- -Q313 NRRL B-18610 E. col i K12 A61/PLPC- -Q329 NRRL B-18611

As culturas foram feitas e os plasmídeos isolados usando técnicas convencionais e depois foram usados para trans-fectar directamente células hospedeiras eucariôticas para a produção de formas de zimogénio da proteína C humana. De preferência os plasmídeos são usados para transformar células hospedeiras que expressam o produto do gene precoce imediato do adenovírus EIA, por o potenciador BK encontrado nos vectores funcionar mais eficazmente no aumento da expressão na presença de EIA. Os fami1iarizados com a matéria compreenderão que existe uma série de células hospedeiras que expressam ou podem ser forcadas a expressar um produto dos genes precoces imediatos de um vírus grande de DNA. As linhas celulares preferidas são a linha celular 293 de rim humano (que pode ser adquirida à Americsn Type Culture Collection com o número de acesso ATCC CRL 1573) ou a linha celular de hamster sírio AV12-664 (ATCC 9595). A linha celular de rim humano embrionário 293 é a preferida. 31

Para se obter níveis mais altos de expressão, os genes codificadores de várias formas zimogénio da proteína C podem ser cortados dos vectores depositados e ligados a um vector que contem a unidade de controle da transcrição GBMT. Especificamen-te, o plasmídeo pGT-h, que contem um gene que confere resistência á higromicina, pode ser obtido à NRRL com o número de acesso NRRL B-18532. 0 plasmídeo foi aberto por digestão com a enzima de restrição Bell após isolamento de DNA do plasmídeo a partir de uma estirpe dam metilase de E. coli, como seja GM48 CNRRL B-15725). Os novos genes de zimogénio podem ser removidos dos respectivos plasmídeos por digestão com Bc11. 0 vector foi purificado e desfosforilado, em seguida os novos genes de zimogénio do presente invento foram ligados ao sitio Bell. Os plasmídeos compreendendo os novos genes de zimogénio colocados a seguir à unidade de transcrição GBMT para haver expressão foram então usados para transformar células 233, cultivadas e os novos zimogénios podem ser purificados a partir da cultura por técnicas que são bem conhecidas. Um método para a purificação de proteína C humana foi descrito por Yan, Publicação de Patente Europeia N2 0363126, publicado em 11 de Abril de 1330, todos os ensinamentos da qual são aqui incluídos como referência.

Os compostos do invento também incluem as formas de zimogénio geradas quando da secreção das proteínas nascentes do invento. Assim, os compostos do invento incluem sequências codificadoras de DNA, vectores de expressão que dirigem a expressão daquelas sequências, proteínas nascentes produzidas quando da tradução de transcritos de mRNA gerados a partir daquelas sequências codificadoras, zimogénios produzidos quando da secreção daquelas proteínas nascentes e derivados activados de certos zimogénios.

Os compostos de DNA do invento podem também ser sintetizados quimicamente ou por combinação de fragmentos de restrição conhecidos. Os aparelhos de síntese de DNA podem tarnbém ser adquiridos e usados para construir os compostos do invento.

Os vectores ilustrativos do invento compreendem o Fotenciador BK colocado de forma a estimular a transcrição pelo principal promotor tardio do adenovírus da sequência codificadora do invento. Os fami1iarizados com a matéria reconhecem que um grande número de promotores eucarióticos, potenciadores e vectores de expressão são conhecidos e podem ser usados no método do presente invento. Os familiarizados com a matéria também reconhecerão que um veetor de expressão eucariõtico pode funcionar sem um elemento potenciador. 0 aspecto chave do presente invento não reside no potenciador particular, caso exista ou no promotor, usado para dirigir a expressão do zimogénio da proteína C mas antes reside na nova sequência codificadora e correspondentes proteínas produzidas a partir daquela sequência.

No entanto, a es promotores, potenc iadores impacto nos níveis finais colha de elementos vectores, tais como e marcas seleccionáveis pode ter grande de proteína produzida por uma célula hospede i ra euc a ri ôt i c a A Publicação de Patente

Europeia N£ 024-5949, publicada em referência, desc reve proteína C zimogénio estimular um promotor expressão da proteína níveis de expressão e que também expressam 19 de Novembro de 1987, aqui incluído como uma série de vectores de expressão para a nativa que utilizam o potenciador BK para eucariõtico colocado de forma a dirigir a C humana nascente. Estes vectores dirigem specialmente altos em células eucariôticas um produto de gene precoce imediato de um o vírus grande de DNft, como seja o produto do gene EIA de adenovírus. Como é evidente a. partir dos vectores exemplificativos p6T~0097~h, pQT-Q248~h, pGT~Q313~h e pGT-329-h aqui descritos, οο _ método de expressão do produto do gene GE-MT—blft è especialmente preferido para usar com os vectores do presente invento. 0 presente invento não está limitado á uti 1 ização numa célula hospedeira eucariôtica particular. Uma variedade de células hospedeiras eucarióticas existem em depositários tais como a American Type Culture Collect-ion (ATCCRockville, MD 20852, e são adequadas para usar com os vectores do invento. A escolha de uma célula hospedeira particular depende até certo ponto do vector de expressão particular usado para dirigir a expressão dos compostos de DMA codificadores da proteína C do invento. No entanto devido á proteína C humana nascente e Os derivados da proteína C humana nascente do invento sofrerem substancial modificado pós-tradução, algumas células hospedeiras são mais preferidas do que outras para usar com os vectores do invento. A Publicação de Patente Europeia N2 0245943 e Grinne.il et al., 1387, Bio/Technology 551183 descreve que células de rim embrionário humano são especialmenie preferidas para usar na produção de recombinantes de proteínas gama-carboxiladas tais como proteína C humana. Tal linha de células de rim embrionário humano é a linha celular 233 disponível na ATCC com o número de acesso ATCC CRL .1573. A linha de células 233 é também preferida para usar com os vectores do presente invento.

No entanto, as vantagens de produzir uma proteína gama-carfooxilada, como seja um zimogénio de proteína C humana, numa linha celular transformada por adenovírus não estão limitadas a a células de rim embrionário humano transformadas com adenovírus. De facto, as células transformadas com adenovírus em geral são hospedeiros excepcionais para a produção de proteína C humana gama-carboxilada. Uma linha celular deste tipo especialmente preferida é a linha celular AVI2-664 (daqui em diante

acesso ATCC NRRL CRL "AV12">, disponível na ATCC com o número 34 34 construí.da por 959S. A linha celular AVI2 foi construída por injecção de um hamster sírio no pescoço com adenovírus humano 12 e isolamento das células do tumor resultante. 0 Exemplo 3, abaixo, descreve a transformacão das linhas celulares 293 e AV12 com o vector j. 1 ustrati vo pQT-Q097-h.

Os vectores do invento podem ser transformados e expressos numa variedade de células hospedeiras eucariôticas, especialmente de mamífero. Os vectores do invento que não possuem marca selectiva com a qual isolar e identificar transformantes eucarióticos estáveis são úteis não só para fins de de ensaio transitório como também para fins de cotransfarmação, um processo divulgado na Patente U.8. 4,399,216, publicado em 26· de Agosto de 1983 e incorporado aqui como referência. Os vectores do invento podem também compreender sequências que permitem a replicação em E. coli, uma vez que é mais geralmente mais eficaz preparar DNA de plasmídeo em E. coli do que em outros organismos hospedeiros. A expressão das sequências codificadoras da proteína C humana contida nos vectores do invento ocorre nas células hospedeiras em que o promotor particular está associado ás funções de genes estruturais. São exemplos de células hospedeiras adequadas para usar no invento as apresentadas na Tabela III, juntamente com os comentários adequados. i cu XI cd a

Fonte Comentários i Iί ω> i. <u co S_ rH O 3 ca ih 0 ω X O CO CS cn £ T- C - -H m i—i σ\ oo 0 ~ jj 3· ca • 0 Ο Ό 2 • O co íca • o 3 cd ta O) *rH P rH C -H 0 P P 3 cd o. cd W ir 1 0 O ca 0 O bO H 0 X pedeiras podem deiro 0 33 ο ε Sm H 0 ra - 0 o 0 a 0 0 Ό uca 3 0 X X P •Η O cr X O 0 E ra c x: a a 0 0 0 O ca 0 rH H 3 0 X o - o 3 δΟΡ V r- x: 0 rH 0 03 0 « <- a '0 N 0 P > na 0 Ή O 0 x 1 c •H ÍX p P 0 ir Q w O CO u ε 0 0 0 ε *h cd Q 0 X > 0 /0 P •d X 0 O ir -H • 0 ir rH CO 0 a 0 > •H ca 0 a cd C Ή X> 0 •Η P s- r- •H i. ir •H 0 C 0 n j 1—í 0 0 0 P 0 0 X a X p m •H o i. 0 - Ώ o cd α a o 0 O ra ·η τι ε Ml ε 0 0 w 0 O W 0 X 0 Si 0 ^ ir o o -P 0 ir 0 o 0 Ό 0 t> ho 03 ÇJ> 3 ra 0 i. •H *3! 0 H cr *H ir O i, N! i, £* H 0 0 0 0 0 0 O < K p δΟ CO Q 6m n

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Conforme indicado pela Tabela ΙΪ!' muitas hospedeiras de mamífero possuem a maquinaria celular necessária para o reconhecimento e processamento correcto do peptídeo sinal nas proteínas nascentes do invento e proporcionam as modif.icaçfíes pós-tradução, tais como g 1 j. cosiu.1 ação, gama-carboxi lação e β-hidroxilação, tal como são observadas na proteína C humana presente no plasma sanguíneo. No entanto, como indicado atrás, o processamento pós-tradução óptimo para HPC ocorre em células transformadas com adenovírus. Existe uma grande variedade de vectores, discutidos abaixo, para a transformação de tais células hospedeiras ©ucarióticas, mas os vectores específicos exemplificados abaixo não pretendem de forma alguma limitar o âmbito do p r esen te i nven to.

Os vectores do tipo pSV2 compreendem segmentos do genoma de SV40 que constituem uma unidade de transcrição eucariô-tica definida—promotor ( ep >, sequência intervim ente (IVS ) e sitio de poliadenilação Cpft). Na ausência do antigénio T do SV40, os vectores plasmídeo tipo pSV2 transformam células hospedeiras eucarióticas de mamífero e outras através da integração no DNA cromossômico da célula hospedeira. Construiu-se uma variedade de vectores plasmídeo tipo p8V2 (ver Eukaryotic Virai Vectors, editado por Gluzman, publicado por Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1982), como sejam os plasmí-deos p8V2-gpt, p8V2~neo, p8V2-dhfr, p8V2-hyg e pSV2-hyg e pSV2-B--globina, em que o promotor do 8V40 dirige a transcrição de um gene inserido. Estes vectores são adequados para usar com as sequências codificadoras do invento e estão disponíveis na American Type Culture Collection CATGG) em Rockville, Haryland ou no Northern Regional Research Laboratory (NRRL) em Peoria, XI1inois. :«7

Cf plasmídso pSVk!—clhf r C ATCC 37146) compreende um gene da di-hidrofolato-redutase (dhfr) .«urina sob o controle do promotor precoce do SV40. Nas condições adequadas, sabe-se que o gene dhfr é amplificado ou copiado no cromossoma do hospedeiro. Esta amplificação, descrita num artigo de revisão por Schirnke, .1984, Cell 37.‘706-713, pode envolver sequências de DNA quase contíguas ao gene dhfr, tais como uma sequência codificadora de proteína C humana nascente do invento e pode assim ser usada para aumentar a produção dos zimogénios da proteína C do invento.

Os plasmídeos que foram construídos para a expressão da proteína C nascente e zimogénios de proteína C do invento em células de mamífero e de outros hospedeiros eucariôticos podem utilizar uma larga variedade de promotores. 0 presente invento não está de forma alguma limitado â utilização dos promotores eucariôticos particulares aqui exemplificados. Promotores tais como o promotor tardio do SV40 ou os promotores eucariôticos divulgados em Bucher et al. , 1986, Nuc . Acids Res. 14 (24)1009 ou promotores de genes eucariôticos tais como, por exemplo, o gene da oval.bu.mina de galinha induzido por estrogénios, os genes do interferão, o gene da tirosina—aminotransferase induzido por glucocorticóideso gene da timidina-cinase e os principais promotores precoces e tardios doa adenovírus, podem ser fácilmente isolados e modificados para usar em vectores de expressão de DNA recombinante projectados para produzir zimogénio de proteína C humana em células hospedeiras eucarióticas. Os promotores eucariôticos podem também ser usados em tandem para dirigir a expressão de uma sequência codificadora do .invento. Ainda, sabe—se que um grande número de retrovírus infectam uma larga gama de células hospedeiras eucarióticas. As repetições terminais longas no DNA dos retrovírus muitas vezes codificam activida.de de promotores e podem assim ser usadas para dirigirem a expressão das sequências codificadoras do invento.

0 plasmídeo pRSVcat <ATCC 371521 compreende fracções da repetição terminal longa do vírus do Sarcoma de Rous CRSV1, um vírus que se sabe infectar galinhas e outras células hospedeiras. As sequências das repetições terminais longas do RSV podem ser isoladas num fragmento de restrição Ndel-Hindi11 s* 0,76 Kb do plasmídeo pRSVcat.. 0 promotor na repetição terminal longa do RSV ("fiorman et al, , 1982, P.N.A.S. 79i67771 é adeequada para usar em vectores do invento. 0 plasmídeo pMSVi (NRRL B—15929) compreende as repetições terminais longas do vírus do Sarcoma Murino (MSV>, um vírus que se sabe infectar células hospedeiras de murganho e outras. Estas sequências repetitivas são adequadas para usar como um promotor nos vectores do invento. 0 promotor da metalotioneina de murganho (MMTl também foi bem caracterizado para usar em células hospedeiras eucarióticas e é adequado para usar em vectores do invento. 0 promotor MMT está presente no plasmídeo pdBPV-MJITneo de 15 Kh (A ICC 372241, o qual pode servir como material de partida para a construção de outros plasmídeos do Presente invento. São possíveis muitas presentes sequências de DMA e exemplo, a degeneração do código modificações e variações das P1asm £ deos i1ust rat i vos. Por genéticopermite a substituição de nuc3.eôtidos ao longo da sequência codificadora do polipeptí-deo. Tais sequências substituíveis podem ser deduzidas a partir de sequências de aminoâcidos ou de DMA conhecidas da proteína C humana e podem ser construídas seguindo processos convencionais de síntese ou de mutagénese dirigida. Os métodos de síntese podem ser realizados substancialmente de acordo com os processos de Itakura et al.. 1977 Science 19811055 e Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. 8ci. USA 7515765. Portanto, o presente invento não está de forma alguma limitado a sequências de DNA e plasmídeos espec i f i c amente exemp1i f i cados.

Apôs transformação de um vector do invento numa célula hospedeira eucariôtica, pode-se seleccionar transformantes com base num fenótipo selsccionâvel. Este fenòtipo seleccionêvel pode ser conferido por uma marca seleccionávei presente no vector de expressão ou presente num outro vector cotransformado com o vector de expressão na célula hospedeira. Uma vez seleccionados os transf ormantes, é desejáivel identificar quais os transf ormantes que expressam os níveis mais elevados da proteína pretendida codificada pelo vector de expressão. Tal identificação é especialmente importante apôs um processo de cotransformação, o qual gera umasêrie de transformantes que contêm apenas o plasmídeo tendo a marca selectiva e portanto não contêm o vector de expressão. No Exemplo 4, abaixo, descreve-se um protocolo não só para a identificação de células que expressam e sscretai» a proteína pretendida como também para a quantificação, relativa a outras células examinadas usando o método, da quantidade de proteína secretada. 0 protocolo também permite o isolamento de células viáveis que secretem os níveis mais altos de uma proteína preten-d i da.

Os métodos para a activação de formas zimogénio de proteína C humana para proteína C activada <APC> são velhos e bem conhecidos. A proteína C pode ser activada apenas pela trombina, por um complexo trombina/trombomodulina, por veneno de víbora de Russeli ou por uma variedade de outros meios. A actividade dos zimogénios de proteína C humana pode ser medida seguindo a activação de trombina por ensaios amidoláticos totais ou por ensaios anticoagulantes. Os ensaios de activação de trombina e de proteína C (amidolítico e anticoagulante) foram realizados segundo os ensinamentos de Srinnell et al., 1387, Biotechnology S: 1187-1132, todos eles sendo aqui incluídos como referência. As actividades amidoláticas dos mutantes de açúcar da proteína C humana estão divulgados na Tabela IV. 40 > Η CE .- <L X Π) E- V •σ ο > •Μ Ρ cd /Ή (D Ρ 0) > Ή S I *Η Ρ C cd 0) Ό cd Ό •r4 > •rí Ρ Ο Ο ι—1 Ctí C ο •Η Οα ρ Cm 0) Ό Ctí Ό •Η > •Η C rt m o\ • c 3 · • CS 5 5 P co α> Όca Ό ο ·Η ρ

cd +3 P P Q CS T—♦ cO CS c Π +1 +i £ 3 -H -W r- cs 00 “ CO co £ i—n pM os CS t ) r-i P™H cd ο •Η -Ρ Ή Γ“{ Ο τ3 •Η <ϋ Ό * cd Ό •rí > •Η Ρ Ο < -- a ε 3 ta β c 3 'rt 3 0) σ' •P O β β Ρ a 0) a 0) Ό Η Η d) a ο Ό **! ο β *Γ-ί d Ο Ρ •rt Ρ V-J -Ρ Π) Η β W Ο ca c ό 3 CU -Η σ* ε β ca ο ο ο cd Ο Ρ +1 1-Η X +1 ρ C0 4-1 ΡΜ +1 ο CU ο ρ )¾ Ό ο cd CN σ CS νΟ C Τ5 CQ co 03 ιη •Η cd c Ρ Τ3 C <D Ή Ή > Β U •Η Ρ Ο Ό <ΰ D. -Ρ ο α> ca Ό Ό Ό ca ca β ο β ε 0) -rt Ο) Ρ -Ρ -Ρ <ΰ ο ω Q β Ό β ο Ό ca Ν •rt rt ca ca s actividade amidolítica relativa, comparado com APC nativa vezes a actividade anticoagulantes relativa. ο ’ I 41 ’ I 41 da Tabela anf-i corpos ou deriva-qual foram pur i f i cação aos dados

As moléculas de zimogénio usadas nos ensaios IV foram quantificadas por um ensaio de ELISA usando monoclonais que podem não ter reagido com os mutantes dos no mesmo grau da molécula tipo selvagem com a induzidos os anticorpos. Consequentemente, posterior e quantificação baseado no teor em proteína levou registados na Tabela V.

Tabela V

Actividade funcional Cunidades/mgl HPC------

Amidolítica Anticoagulante (relativa a (relativa a wtHFO wtHPC do plasmai derivada d o plasma nd 250 (11 wt a.PC 3S±5 Π.) < n=7) 325±65 (1.31 (n=5 QO’37 32±4 (0,91 <n=101 303±33 fc· 1 / ( n=3 Q248 S3i .1.! 2 Cl,8) Cn=81 j 72 <2,7 1 < n=3 Q313 Π '~*·*·“7 (1,51 (n—91 627±99 (2,51 < n=3 Q329 47±6 (1,41 ( η=··91 516±29 <2, 11 < n=3 O primeiro número entre parêntesis é o número de vezes que aumentou a actividade a actividade relativamente à HPC derivada do plasma. Está indicado o número de amostras independentes (nl determinado em duplicado ou em triplicado.

Para além da actividade anticoagulante aumentada dos derivados estabelecidos na Tabela V, o mutante Q313 apresentou uma maior afinidade para a trombina, resultando num aumento de ap r ox i madamen t-e três vezes na velocidade de activação pela 42 trombina sózinha ou em complexo com o cofacior trombomodulina. Este aumento na velocidade é útil na criação de uma forma ziroogé-nio rnais susceptível da proteína C para utilização clínica e também no melhoramento do processo de produção para clivagem do zimogénio da proteína C para fazer proteína C activada. Os parâmetros cinéticos de activação do zimogénio Q313 estão apresentados na Tabela VI.

Tabela VI

Substrato K m fuH) K«t_. (min 15 K . /K cat.m (min mM wt HPC 6,1±0,45 n=3 480114 73 Q3Í3 1,310,50 n=4 380114 200

Os resultados são a média de três de te r m i na ç Se s independentes. Os valores foram determinados por análise de regressão não linear. an t i-1 r orobó ticas s i ntravenosos, na prevenção da (aram-nega i i vos, A proteína C activada tem propriedades substanciais na prevenção da extensão dos coágulo na prevenção da formação de trombos arteriais e morte e falha de orgãos por sépsia causada por endotoxemia e coagulação intravascular disseminada, é de particular importância o aumento da actividade funcional dos derivados de proteína € actibvada do invento que permitirão reduzir as dosagens nas indicações clínicas atrás referidas com potencial aumento da margem de segurança.

Os zimogênios de proteína C r e comfoi nan te a c t i vada do invento são úteis na prevenção e tratamento de uma larga 43 Λ--

variedade de doenças adquiridas envolvendo coagulação intravascu-lar, incluindo trombose de veias profundas, embolia pulmonar, trombose das artérias periféricas, embolia derivada de artérias cardíacas ou periféricas, enfarte agudo do miocárdio, choques trombôticos e coagulação intravascular disseminada. Estes derivados de proteína C podem também ser usados eficazmente no tratamento de um número significativo de doentes com deficiências heterozigóticas em proteína C apresentando frequente trombose das veias profundas e no caso de doentes com deficiência homozigôtica em proteína C tendo purpura fulminans. Uma indicação terapêutica atraente para a proteína C activada é a prevenção da trombose das veias profundas e embolia pulmonar normalmente tratadas com doses baixas de heparina.

De forma semelhante, os derivados de proteína C do invento podem ser usados para o tratamento de embolias derivadas de coágulos nas artérias periféricas, mais principalment© nas artérias carótides, as quais nSo são tratadas ou feita a sua prevenção com os regimes normalmente usados, os quais incluem drogas capazes de suprimir a função das plaquetas, anticoagulentes orais ou suas combinações.

Os derivados activados do invento serão também úteis no tratamento de enfarte agudo do miocárdio, devido á sua actividade pro—f .ifor inol í ti ca uma vez activados. Estes derivados activados podem ser dados com activador do plasminogénio de tecido durante as fases agudas do enfarte do miocárdio. Após o coágulo oclusivo ser dissolvido, os derivados activados podem ser administrados durante mais uns dias para evitar novo enfarte agudo do miocárdio . A proteína C activada é útil no tratamento de coagula— cão intravascular disseminada. A heparina e os anticoagulantes orais têm sido administrados a doentes com coagulação intravascular disseminada <0X0 em vários ensaios clínicos mas os resultados foram desapontantes. Na coagulação intravascular disseminada a proteína C activada assim como os derivados activados do presente invento, têm uma vantagem distinta relativamente a outros anticoagulantes convencionais.

As drogas anticoagulantes convencionais, particularmente a "warfarin" são úteis no tratamento de tumores malignos invasivos. Muitas células tumor a:i.s produzem substâncias que desencadeiam a activação do sistema de coagulação resultando em depósitos de fibrina localizados. Estes depósitos de fibrina funcionam como "ninhos'·' em que as células cancerosas se podem dividir para formar lesSes metásticas. No entanto, não é possível administrar "warfarin" ou outros anticoagulantes convencionais em combinação com as formas mais intensivas e eficazes de quimioterapia, pois tal terapia produz uma queda rápida na contagem de plaquetas e trombocitopenia combinada com terapia usando "war— farin" coloca o doente num estado de risco alto e inaceitável relativamente a complicaçSes envolvendo hemorregias graves. Os derivados de proteína C do invento, tal como a proteína C activada são mais selectivos do que os anticoagulantes convencionais e têm um indíce terapêutico muito superior ao da heparina ou anticoagulantes orais, podem ser administrados com relativa segurança a doentes com trombocitopenia tornando assim possível o tratamento de doentes com cancros invasivos usando uma quimioterapia eficaz e intensiva em combinação com um derivado de proteína C activada do invento.

Os zimogénios e contrapartes activada® do presente invento podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, pelo que um zimogénio de proteína C humana ou proteína C activada do invento

ê combinado com um veiculo farmacêutico aceitável. Veículos adequados e sua formulação,· incluindo outras proteínas, e.g., albumina sérica humana, estão descritos, por exemplo, em Remir.g-ton's Pharmaceutical Sciences iSâedição, 1380, siack Publishing Co., editado por Oso1 et al., o qual é aqui incluído como referência. Tais composições conterão uma quantidade eficaz de um zimogénio de proteína C ou a sua contraparte activada, juntamente com uma quantidade adequada de veiculo para preparar composições farmacêuticas aceitáveis adequadas para a administração eficaz a um hospedeiro. A composição com proteína C pode ser administrada parentera1mente ou por outros métodos que assegurem a sua libertação para a corrente sanguínea numa forma eficaz.

Os exemplos que se seguem ilustram os métodos e descrevem os protocolos de construção para compostos, vectores e transformantes representativos do invento sem limitar o mesmo. 46

Exemplo 1

Isolamento do piasuaídteo pLFC-£K)97

Adquiriram-se liofilizados de E. coli KÍ2(pLPC~Q037 ao Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, com o número de acesso NRRL B-18608. Os liofilizados foram decantados para tubos contendo 10 ml de meio LB (10 g de Bacto--triptona, S g de extracto de levedura Bacio e 10 g de NaCl por litro; o pH foi ajustado a 7,5) e incubado durante duas horas a 32°C, sendo então ajustadas as culturas a 50 jug/ml de ampicilina e depois incubadas a 37°C durante a noite.

Uma pequena foi colocada em placas Bacto)contendo 50 jug/m colónia isolada de E. obtida foi inoculada fraccSo da cultura crescida durante a noite de agar LB (meio L.B com 15 g/1 de agar 1 de ampicilina de forma a obtei—se uma coll Kl2 ΑΘ1 /pL..PC~Q037. A colónia isolada ©m 10 ml de meio LB contendo 50 ,ug/ml de ampicilina e incubada durante a noite a 37°C com agitação vigorosa. A cultura de 10 ml crescida durante a noite foi inoculada em 500 ml de meio LB contendo SOjug/ml de ampicilina e incubada a 37°C com agitação forte até a cultura atingir a fase estacionária. 0 processo que se segue foi adaptado de Maniatis et pring Harbor Laboratory). al. , .1332, Molecular Cloning (Coid

As células forma colhidas por centrifugação a 4 000 g durante 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi rejeitado. 0 sedimento de células foi lavado em 100 ml de tampão 8Τ.Ε arrefecido em gelo (0,1 M NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 7,8,’ e 1 mM EDTA). Após lavagem, o sedimento de células foi ressuspenso em 10 ml de Solução 1 (50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; e 10 mM EDTA) 47 47 ambiente 1% SDS) contendo 5 mg/ml de lisozima e deixado à temperatura durante 10 minutos. Vinte ml de Solução 2 (0,2 N NaOH e foram então adicionados ás células tratadas com lisozima e a solução foi misturada suavemente por inversão. A mistura foi incubada em gelo durante 10 minutos.

Adicionou-se quinze ml de acetato de potássio 5 M arrefecido em gelo, pH 4,8, ã mistura de células lisadas e a solução foi misturada por inversão. A solução foi incubada em gelo durante 10 minutos. A solução de acetato de potássio SM foi preparada pela adição de 11,5 ml de ácido acético glacial a 28,5 ml de água e 60 ml de acetato de potássio 5 Mj a solução resultante é 3M relativamente ao potássio e 5M relativamente a acetato. A mistura de células lisadas foi centrifugada num Seckman 8W27 (ou seu equivalente) a 20 000 rpm durante 20 minutos a 4°C. 0 DNA celular e detritos formam um sedimento no fundo do tubo. Cerca de 36 ml de sobrenadante foram recuperados e adicionado 0,6 volumes de isopropanol, misturados e a solução resultante foi deixada á temperatura ambiente durante 15 minutos. 0 DMA de plasmideo por centrifugação a 12 000 g durante 30 minutos à temperatura ambiente. 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento de dNA foi lavado com etanol a 70% á temperatura ambiente. 0 etanol foi então decantado e o sedimento seco sob vácuo. O sedimento foi então ressuspenso em 8 ml de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 e 1 mM EDTA).

Adicionou-se oito gramas de CsCl à solução de DNA. Cerca de 0,8 ml de uma solução de 10 mg/mi de brometo de etídio em água foram então adicionados para cada 10 ml de solução de CsGl-DNA. A densidade final da solução foi de aproximadamente 1,55 g/ml e a concentração final de brometo de etídio foi de cerca de 600 .ug/ml. A solução foi transferida para um tubo de centrífuga Beckman Type 50, chei até cima com óleo de parafina, 48 selado e centrifugado a 45 000 rpm 24 horas a 200C. Após centri~ f ugação são visáveis duas bandas de à luz normal. Apôs remoção da tampa do tubo a banda inferior de DNA foi removida usando uma seringa com uma agulha hipodérmica inserida lateralmente no tubo de c en t r í f uga. 0 brometo de etídio foi removido por várias extracções com i-butanol saturado com água. 0 CsCl foi removido por diálise contra tampão TE. Apôs extracções com fenol tamponado e depois clorofórmio o DNA foi precipitado, lavado com etanol a 70% e seco. Cerca de 1 mg de plasmídeo pLPC-Q037 foi obtido e guardado a 4°C em tampão TE a uma concentração de aproximadamente 1 jug/ml . Na Figura 1 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de sítios de restrição e funções do plasmídeo pLPC-Q097. Do mesmo modo, os plasmídeos pLPC-Q248, pLPC-Q313 e pLPC-Q329 foram isolados a partir das correspondentes células hospedeiras, também adquiridas à NRRL. Nos desenhos juntos estão apresentados mapas de sítios de restrição e funções de cada um destes plasmídeos.

Exemplo 2

Construção do Plasmídeo p-6T-Q037-h

Os -Q323 podem hospedei ras P1asm í deos pLPC-Q097, pLPC-Q24 ser usados para transformar eucarióticas (de 8, PLPC-Q313 direc tamente preferência células 233) e pLPC-células relativa- mente á produção de níveis elevados de zimogénios de proteína C humana. Podem ser obtidos níveis de expressão e secreção do produto ainda superiores se o gene codificador do zimogénio mutante for ligado a um vector de forma a que a expressão do gene seja conduzida pela unidade de transcrição 6BMT. 43 0 plasmídeo pQTC é um desses vectores em que o gene do zimogénio da proteína C humana tipo selvagem é dirigido pela unidade de transcrição GBMT. 0 gene da proteína € tipo selvagem pode ser facilmente removido do vector num fragmento de restrição Bc1I e qualquer um dos genes do presente invento pode ser inserido no vector num fragmento de restrição Bell. A digestão do QNA de plasmídeo com Bell é inibida pela metilação da adenina na sequência S^QATC-S'. Portanto, o plasmídeo pQTC foi preparado a partir de células hospedeiras E. coli que não possuem uma adeni— na-metilase, como seja a codificada pelo gene dam, o produto da qual meti la o resíduo de adenina na sequência 5'-QATC-3'. E. coli Kl2 GM48 (NRRL B-15725) não possui uma dam metilase e portanto é adequada para usar na preparação do DMA de plasmídeo pQTC para usar como material de partida na construção de plasmídeos derivados .

As células E. coli K12 GM48 foram cultivadas e tornadas competentes para a transformação e o plasmídeo pGTCfoi usado para transformar as células de E. co1i Kl2 ΘΜ48 substancialmente de acordo com o processo do Exemplo 1. As células transformadas foram semeadas em asar L contendo ampici1ina e uma vez formadas colónias resistentes â ampicilina pelos transformantes K12 6M48/pGTC, uma dessas colónias foi usada para preparar DMA do plasmídeo pQTC substancialmente de acordo com o processo do Exemplo 3.. Obteve-se cerca de 1 mg de DNA do plasmídeo pQTCque se ressuspendeu em cerca de 3. ml de tampão TE. Este processo foi usado para preparar DNA de plasmídeo a partir de pGT-h e de pQT~d. 0 plasmídeo pQT-d compreende a unidade de transcrição sem gene no sítio Bc1I, de tal forma que qualquer gene pode ser facilmente inserido. 0 plasmídeo pQT-d também compreende o gene dhfr murino de tal forma que qualquer transformante pode ser seleccionado ou amplificado usando o fenôtipo de resistência ao metotrsxato. 0 plasmídeo pGT-h compreende a unidade de 50 - transcrição QBMT, um aí tio Bell para facilidade de inserção de um gene com interesse e o gene que confere resistência à higromici— na. As estirpes de E. coii K12 ΑΘ1 compreendendo cada um destes plasmídeos foram depositadas na. NRRL em 18 de Janeiro de 1880. As estirpes estão disponíveis com os números de acesso NRRL B-18591 <para E. coli K12 ΑβΙ/ρβΤ-d), NRRL. B-18592 (para E. coli K12 ASl/pâT-d), NRRL B-18592 (para E. coli Kl2 AGl/pGT-h) e NRRL B-18593 (para E. coliK12 Aôl/pGTC). Os mapas de sítios de restrição e funções destes plasmídeos estão apresentados nos desenhos juntos.

Cerca de 10 gl de DNA do plasmídeo pLPOQ097 preparado a partir de células GM48 foram misturados com 20 .ul de tampão de restrição 10X Bell (100 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1,5 M KC1, 100 mM MgCl._, e 10 mM D TU, 20 ,ul de Img/ml BSA, 5 ,ul da enzima de rerstrição Bc.11 (ík 50 Unidades, como definido por Bethesda Research Laboratories (BRL), onde foram adquiridas todas as enzimas de restrição aqui usadas) e 145 λιΙ de água e a reacção resultante foi incubada a 37°C durante 2 horas. As reacções com enzimas de restrição aqui descritas são normalmente paradas por extraccões com fenol seguido de clorofórmio, as quais são seguidas de precipitação do DNA, uma lavagem com eianol e ressuspensão do DNA em tampão TE. 0 DNA digerido foi então sujeito a electro— forese através de um gel preparativo de 1% de agarose e o fragmento de restrição com cerca de 1400 pares de bases compreendendo o gene mutante foi purificado usando um kit BioRad Prep-A-Sene, de acordo com as instruções do fabricante.

0 plasmídeo pQT-h foi então isolado a partir de E. coli K12 Aâl/pBTC (NRRL B-18592) essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 1 e propagado em QM48 e isolado essen— ciaimente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 2. 0 DNA plasmídeo p6T-h foi então digerido com a enzima de restrição Bc1I 51 como ensinado atrás, em seguida o fragmento grande do vector foi isolado e purificado. Este fragmento vector foi levado até um volume de 90 .ui com TE (pH 3,0), em seguida adic s.onou~se 10 )-*l (0,05 Unidade) de fosfatase alcalina de intestino de vitela para desfosforilar os extremos do vector. A mistura foi incubada ® 37°C durante 30 minutos, em seguida adicionou-se 10 ul de 500 mH E6TA e a reacção foi incubada a 55°C durante 45 minutos par® inactivar a enzima. A reacção foi então extraída com fenol/cloro-fórmio, precipitada com etanol, lavada e ressuspensa em 20 .ul água.

Cerca de 7 ,ul (10 ng> do vector digerido com Sc 11 foi então misturado com cerca de 1 ul (100 mg) do fragmento de restrição Bc11 de 1400 pares de bases do p1asmídeo pLPC—Q037, lul de tampão ligase 10X (0,5 M tris-HCl CpH 7,6), 100 mM Mg01o, iOOmíi DTT e 500 jug/ml de BSA) e 1 ul de DNA—ligase de T4. A reacção de ligação foi então incubada durante 12 a 15 horas a 16°C. A reacção de ligação pode conduzir a plasmídeos que contêm o gene do zimogénio mutante orientado para transcrição a partir da unidade de transcrição GBMT ou plasmídeos em que o gene é ligado na direcção oposta. Aqueles plasmídeos que contêm o gene na orientação correcta para transcrição são designados pGT-Q097~ -h. Células competentes congeladas de E. co 1 i K.1.2 AGI foram adquiridas à Stratagene, 3770 Tanssy Road, San Diego, Califórnia '32121. Cerca de 5 ul da reacção de ligação foi misturado com uma amostra de 100 ul de células competentes, em seguida a mistura de células DMA foi incubada em gelo durante uma hora, sujeitas a choque térmico a 42°C durante 45 segundos, depois arrefecidas em gelo durante cerca de 2 minutos. A mistura de células-DNA foi incubada em gelo durante cerca de 2 minutos. A mistura de células-DNA foi diluída em 1 ml de meio S0C em tubos Falcon 2:059 e

O.IL incubados a 37°C durante uma hora. Amostras de cem microliiros foram colocadas em placas de agar LB contendo ampicilina e incubadas a 37°C até aparecerem colónias.

As colónias foram cultivadas individualment-e © o DMA d© pla.smi.deo das colónias individuais foi examinado por análise com enzimas d© restrição. 0 isolamento ds DNA ds plasmídeo foi realizado numa escala menor de acordo com o processo do Exemplo .1., mas o passo do CsCl foi omitido até serem identificados os transformantes correctos E. co 1 i K12 AGI/pGT-Q037-h. Naquela altura, realizou-se uma preparação em larga escala de plasmídeo altamente purificado. Seguindo os ensinamentos dos Exemplos 3. e 2, qualquer um dos genes mutantes do zimogénio pode ser facilmente clonado em qualquer um dos vectores SBMT para formar plasmí-deos pGT-Q097, pGT~Q248-h e pGT-Q323~h.

Exemplo 3

Construção de transformantes da linha de células 233 de rim embrionário transformadas com adenovírus e da linha de células AV12 de hamster sírio transformada com adenovírus usando o Plasmídeo pQT-SQ97-b A linha celular 293 de rim embrionário pode ser adquirida à American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC GRL .1573. A linha celular AV12 de hamster sírio transformada com adenovírus pode ser também adquirida á American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC CRL 9595. 0 processo de transformação descrito abaixo refere-se a células 293 como linha celular hospedeira; no entanto, o processo é geralmente aplicável â maior parte da linhas celulares eucaritóticas, incluindo a linha celular AVI2 e aos vectores de expressão do invento. 53

As células 293 foram adquiridas á ATCC com o número de

O acesso CRL 1573 num frasco de 25 mm"" contendo uma monocamada confluente de aproximadamenie 5,5 x 10fc' células em Heio Mínimo

Essencial de Eagle (8ibco) com 10% de soro inactivado de cavalo. O frasco foi incubado a 37°C,‘ o meio foi mudado duas vezes por semana. 0 meio é composto por DMEM (Qibco) suplementado com 10%

de soro fetal de vitela, 50 ,ug/ml de gentamicina e 10,ug/ml de R

AquaMEPHYTON fitonadiona vitamina (Merck Sharp and Dohme,

Merck and Co., Inc., West Point, PA 194.96). As células foram subcultivadas por remoção do meio, lavagem com solução equilibrada de sais de Hank (8ibco), adição de 0,25% tripsina (contendo 0,2 g/1 de EDTA) durante 1-2 minutos, lavagem com meio fresco, aspiração e distribuição por novos frascos numa razão de subcul-tura de 1;5 ou 1:10.

Um dia antes da transformação, as células foram semea- h das a 0,7 x 10" por placa de 100 mm. DMA de plasmídeo estéril precipitado com etanol dissolvido em tampão TE foi usado para preparar urna solução de 2X DNA-CaCl._, contendo 25 ,ug/ml do DMA de

HBSS plasmídeo transformante e 250 mM CaCL..,. Preparou-se contendo 280 mH NaCl, 50 mH Hepes e 1,5 mr1 fosfato de sódio, com o pH ajustado a 7,05-7,15. A solução de 2X DMA-CaCl.., foi adicionada gota a gota a um volume igual de 2X HBSS. Uma pipeta de plástico estéril de .1. ml com uma rolha de algodão na ponta foi inserida no tubo de mistura que contem ο 2X HBSS, e introduzidas bolhas soprando enquanto o DMA é introduzido. 0 precipitado de DNA-fosfato de cálcio é formado sem agitação durante 30-45 minutos á temperatura ambiente. 0 precipitado foi então misturado por pipetagem suave com uma pipeta de plástico e um ml (por placa) de precipitado foi adicionado directamente aos 10 ml do meio de crescimento que cobre as células recipientes. Após 4 horas de incubação a 37δ€, o 54 meio foi substituido por meio fresco e as células deixadas a incubar durante mais 72 horas antes de se fazer pressão selecti— va. Para os p 1 asmideos que não contêm uma marca selectiva que funcione em células eucarióticas o processo de transformação utiliza uma mistura de p1asmídeos! o vector de expressão do presente invento que não possui uma marca selectiva,' e um vector de expressão que compreende uma marca selectiva que funciona em células eucarióticas. Existe uma variedade de vectores para usar em tais sistemas de cotransformaçSo e incluem pSV2-dhfr CATCC 37146), pSV2~neo CATCC 37143), pSV2-gpt CATCC 37145) e pSV2-hyg CNRRL B-18033). 0 plasmídeo pSV2-hyg confere resistência à higromicina B nas células hospedeiras eucarióticas. Esta técnica de cotransformação permite a selecção de células que contêm o plasmídeo com a marca selectiva. Estas células foram ainda examinadas para identificar células que compreendem ambos os P1asmídeos de transformação. Certamente o presente invento também compreende vectores de expressão que contêm uma marca selectiva para células eucarióticas e assim não necessitam da técnica de cotransformação.

Para as células transfectadas com p1asmídeos contendo o gene que confere resistência à higromicina como seja o plasmídeo pST~-Q037-h, a higromicina B foi adicionada ao meio de crescimento para uma concentração final de aproximadamente 200 .ug/ml. As células foram então incubadas = 37°C durante 2-4 semanas com mudança de meio com intervalos de 3 a 4 dias. As colónias resultantes resistentes à higromicina foram transferidas para frascos de c u 1 tur a i nd :i. v i dua i. s par a carac te r ização. 0 p 1 asm £ deo pSV2-neo confere resistência â neomicina (Q418 é também usado em vez de neomicina) e a selecção de colónias resistentes a Θ418 foi realizada essencialmente de acordo com o processo de selecção de células resistentes à higromicina, escepto 8418 ser adicionado para uma concentração final de 300 jug/ml. 55 A utilização do gene da di-hidrofolato-redutase Cdhfr) ou o derivado do gene dhfr que confere resistência ao metotrexato Cdhfr-mtx) como marca selectiva para introdução de um gene ou plasmídeo numa linha celular deficiente para dhfr e a utilização subsequente do metotrexato para amplificar o número de cópias do plasmídeos está bem estabelecida na literatura. As células 293 são dhfr positivas assim os transformantes de 293 que contêm os plasmídeos compreendendo o gene dhfr não são seleccionadas apenas na base do fenòtipo dhfr-positivo, que é a capacidade para crescer em meios que não possui hipoxantina e timina. As linhas celulares que não possuem um gene dhfr funcional e são transformadas com plasmídeos contendo dhfr podem ser seleccionadas com base no fenòtipo dhfr"*". Se bem que a utilização do dhfr como marca selectiva e marca amplificável em células produtoras de dhfr não tenha sido bem estudada, os dados da literatura sugerem que dhfr pode ser usada como marca selectiva e na amplificação de gene sem células produtoras de dhfr. 0 presente invento não está limitado pela marca seleccionável usada nos vectores de expressão. Ainda, podem ser usadas as marcas amplificáveis tais como genes de metalotioneína, genes da adenosina-deaminase ou membros da família de mutigenes de resistência, exemplifiçado pelo gene da P-g 1 i c op r o t-e í na . A transformação da linha celular 233 com os plasmídeos pGT-Q097-h, p3T-Q248-h, p€iT—Q313~h e pGT-Q329~h deu uma série de transformantes. Estes transformantes foram analisados como desc ri to no Exemplo 4.

SeleccgQ de células gue secretais mutantes do ziasogénio da proteína C humana

Os transformantes resistentes â higromicina obtidos no Exemplo 3foram cultivados em placas de cultura de tecidos de 100 i»iba numa densidade de várias centenas de clones por placa de cultura de tecidos. 0 meio foi decantado, e as células foram lavadas duas vezes com 5 ml de uma solução de sais equilibrada de Hank CSibco). Uma solução de agar estéril a 0,45¾ (Agarose Tipo 4 da Sgma, catálogo #A3S43, Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178) foi preparada misturando 1 ml de agar a 1,8¾ <'47°C) com 3 ml de Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME> < Qibco> (37°C) e 2 ml desta solução de agar a 0,45¾ foi foi usada para cobrir as células.

Filtros de nitrocelulose (Schleicher and Scbuell, Inc., Keene, NH 0343.1.) foram fervidos e depois autoclavados 2 horas para remover o agente molhante, o qual é tóxico para as células. Os filtros foram então colocados sobre a camada de agar e após remoção das bolhas de ar as placas foram incubadas a 37°C durante 1 a 3 horas. Os filtros, préviamente marcados para indicar a orientação original do filtro na placa de modo a facilitar posterior identificação das colónias, foram então removidos e colocados em PB8 (50 mM Tris-HCl, pH =* 7,2 e 150 mM NaCl). viáveis durante a tas com uma mistura sais DME <37°C) e 4 (37°C). As células

Para manter as células na placa análise dos filtros, as células foram cofoer contendo 2 ml de agar a 1,8% (47°C), 2 ml de ml de sais DME com 20% de soro fetal bovino foram então colocadas numa estufa a 37°C. - 57

Todas as lavagens e reacções realizadas nos filtros foram conseguidas com os filtros numa plataforma rolante. Os filtros foram primeiro bloqueados por incubação â temperatura ambiente em 5% de leite em PB8. Os filtros foram então lavados (5 minutos/lavagem) quatro vezes em PB8. Uma solução de lOjug/ml de anticorpo policlonal de cabra biotini lado anti-proteína C humana em albumina sérica bovina a 2,5% foi adicionada ao filtro Cem quantidades suficientes para cobrir o filtro), o qual foi então incubado a 37°C durante 1 hora. A purificação da proteína C, para subsequente utilização na preparação de anticorpos contra a proteína C, pode ser conseguida como descrito por Kisiel, 3.979, J. Clin. Invest. 641763.. 0 anticorpo policlonal pode ser preparado pelo processo descrito em Structural Concepts in Immunology and Imatunochemistry por E.A. Kabat, publicado em 1968 por Holt, Rhinehart e Winston. 0 anticorpo monoclonal, que também é adequado para usar no ensaio, pode ser preparado conforme divulgado em Kohler e Mils-tein, 3.975, Nature, 256:495, ou como divulgado na Patente U.8. N£ 205046; Laurel1 et al.. 1985, FEBS 191 Cl),'75; Suzuki et ai., 1985, -J. Biochem. 97; 127-138; e EPO Pub. N2 188222. A avidina D e a peroxidase de rábano silvestre biotinilada CHRP) usadas no

TH ensaio foram obtidas num kit Vectastain ' CVector Laboratories, Inc., 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010). A biotina foi também adquirida á Vector Laboratories, Inc.

Os filtros foram lavados quatro vezes com PB8 a 4°C. Em seguida, a avidina D e a peroxidase de rábano silvestre biotinilada forarn preparadas e adicionadas de acordo com as instruções

TM do fabricante no Kit Vectastain ' CVector Laboratories). 0s filtros foram incubados com a avidina D conjugada com HRP durante 3. hora a 4°C Ctempos de incubação mais longos, i.e., durante a noite, podem ser usados quando são secretadas quantidades mais

pequenas de proteína); vezes com P8S a 4°C. em seguida os filtros foram lavados quatro

Para desenvolver a cor indicadora nos filtros, cerca de 30 mg de reagente revelador de côr da HRP (4-c 1 oro-1 -naf t,o 1,

Sigma) dissolvido em metanol a 100% arrefecido em gelo foram adicionados a 50 ml de PB8 e 30 .u3. de H.-0_ a 30%. Esta mistura 2 2 foi adicionada aos filtros de nitrocelulose, os quais foram incubados á temperatura ambiente até a côr aparecer. As colónias que secretam o zimogénio da proteína C humana do invento em maior quantidade serão indicados nos filtros não só pelo aparecimento mais rápido da côr mas também pelas manchas mais escuras no filtro.

Após os filtros terem

rr t •—T ίο revelados os filtros foram novamente realinhados com as placas originais para determinar no filtro. As da proteína C produção do quais as colónias que estão associadas âs manchas colónias que secretam maior quantidade do zimogénio humana foram então seleccionadas e usadas para a zimogénio.

Os familiarizados com a matéria reconhecerão que o ensaio acima é meramente ilustrativo do método de identificação de linhas celulares altamente secretoras. No método pode ser empregue com êxito uma variedade de processos de ensaios. Por exemplo, pode ser empregue uma reaccão com dois anticorpos em que o anticorpo de cabra biotinilado anti-proteína C é substituído com um anticorpo ClgQ) de cabra anti-proteína C mais um anticorpo biotinilado anti-IgG' de cabra.

Os mutantes do zimogénio podem ser purificado a partir das culturas celulares. 0 sobrenadsnte foi removido das expressando o produto recorobinante e purificado numa células coluna

Pharmacia Fastflow-Q. Cerca de 1 ml da resina foi equilibrada com 20 mM Tris-HCl <pH 7,4), 0,15 M NaC1, 5 mM EDTA, 4 mH benzamidi-na. 0 sobrenadante da cultura foi levado a pH 7,4 pela adição de Tris-HCl <pH 8,0) e 5 mM EDTA, 4 mM Benzamidina. 0 sobrenadante foi aplicado na resina numa coluna e lavado com três volumes de coluna de Tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA seguido de 3 volumes de coluna de 20 mMTris CHC1), 0,15 M NaCl, 4 mM benzami — dina. 0 produto recombinante foi eluido da coluna isando um tampão de eluição contendo 10 mM CaCl.., em 20 mM tRIS-hcL Ph tf* 7,4), 0,15 M NaCl, 5 mM benzamidina. A actividade especifica do produto foi determinada de acordo com o processo de Qrinnel 1 et al. , <1387), Bioteç.hnology, 511189-1192 como se segue! o produto concentrado e dialisado do eluato da coluna foi primeiro activado com um complexo trombina--trombomodulina imobilizado, em seguida a actividade amidolítica do produto foi medido pela hidrólise de um substrato tripeptídeo 8-2366 (adquirido da Helena Labs). A actividade anticoagulante do produto foi determinada pelo prolongamento de um tempo parcial oe tromboplastina activado usando reagentes da Helena.

Claims

REIVINPICAC8ES ~ Processo para a preparação cie um vecior de DMA recombinante, caracterizado por compreender a ligação conjunta de ·: (I) um composto de DMA recombinante compreendendo uma. sequência codificadora de uma proteína, em que a. referida proteína compreende a partir do extremo amina para o extremo carboni-lo, a sequência de aminoácidos: MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU R1 CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU PRO r2 TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ASP SER GLY LEU AU GLU ARG GLU LEU ASN GLN THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG LYS ARG R3 ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS PRO HIS R4 GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET MET LEU CYS AU GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ASP SER GLY GLY PRO MET VAL AU SER PHE HIS GLY VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU GLY VAI TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE ARG ASP LYS GLU AU PRO GLN LYS SER TRP AU

ΑΙΑ LEU LEU HIS PRO ILE CYS LEU ALA GLY GIN GLU GLU IYS GLU ALA ILE PRO VAL VAL VAI SER GLU ASN ALA CYS GLU GLY THR TRP ΡΗΕ IEU LEU HIS ASN TYS ILE HIS GLY HXS PRO-COOH em que R.j é seleccionado do grupo constituído por ASN e GLN, R.,, é sslecclonado do grupo constituído por ASN e SLN, R.t, é ssisccionado do grupo constituído por ASN e SLN e é selaccionado do grupo constituído por ASN e SLN; & (II) um composto de DNA compreendendo um promotor, de tal forma que o promotor está situado de modo a dirigir a expressão da sequência codificadora quando da ligação. 2ã. - Processo de acordo com a Reivindicação í, carac — ter.i2a.d0 por dar origem a um vector de expressão de DNA recomfoi™ nante compreendendo o composto de DNA da Reivindicação í. 3ã. " Processo de acordo com a Reivindicação 2, carac™ terizado por dar origem a um vector em que R, ê SLN, R._, ê ASN, R_, A Z o é ASN e R^ é ASN. 4i. ™ F!rocesso de acordo com a Reivindicação 3, carac™ terizado por dar origem a um plasmideo seleccionado a partir do grupo constit-uido pelo plasmideo pLPC™Q097 e pelo plasmideo pST~Q037“h. 5 a. Processo de acordo com a Reivindicação s carac- ASM, R.., é GLM, R.,, em que R X terizado por dar origem a um vedor é A8N e R,. é ASM. 4 p.a terizado por - Processo de acordo com a Reivindicação dar origem a um plasmídeo seleccionado a S, ca pa c partir do grupo constituído pelo plasmídeo PLPC--Q24S e pelo plasmídeo pQT™Q248-h. 7¾. ” Processo de acordo com terizado por dar origem a um vector em é ΘΙ..Ν e R „ é ASM. 4 a Reivindicação que Rj é ASM, R, f C «i V' C é ASM, R..., Sã. — Processo de terizado por dar origem a grupo constituído pelo pl acordo com a Reivindicação 7, carac-um plasmídeo seleccionado a partir do asmídeo pLPC-Q313 e pelo plasmídeo PGT-Q31 h. Processo de acordo com a Reivindicação arar terizado por dar origem a um vector é ASM e R, é QLN. 4 em que R., á ASM, R, X . é* ASM, R.-, 1Oâ. - Processo de caracterisado por dar origem a do grupo constituído pelo pia· acordo com um p1asmí oeo sm í deo pL-PC—Q· a r e i v i nd i c a ç ão 9 , se1ec c ionado a par t ir 23 e pelo plasmídeo pGT-Q3: 9~h. 11.1. - Método para a produção de proteína C humana quando da secreção por eucariótica, caracterizado por compreender uma forma z%mogéms da uma cé1u1a hospede i ra os passos de í CA') a transformação de uma célula ho vector de DMA recomhinanie, comp spede i ra euc a ri ó t i c a r eendendo o reí eri do c om um vector, UrfiS SeqUêHC IS de DIΜ A ^US C od 3. f 3. CS UíViS resíduos de aminoácidos compreendendo, dc para o extremo carbonilo, a sequência de sequência de :< extremo amina ami noáci dos! MET TRP GLN LED THR SER LEU LEU SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ASP PHE GLU GLU AU LYS GLU ILE AU PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP LEU GLU HIS PRO CYS AU SER LEU ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU SER CYS AU PRO GLY TYR LYS LEU PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU PRO R2 TYR SER LYS SER THR THR LEU AU GLN PRO AU THR LEU SER PRO ASP SER GLY LEU AU GLU ARG THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR LYS ARG R3 ARG THR PHE VAL LEU PRO HIS R4 GLU CYS SER GLU VAL MET LEU CYS AU GLY ILE LEU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL AU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG ILE ARG ASP LYS GLU AU PRO GLN LEU PHE VAL AU THR TRP GLY ILE SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG LYS ARG AU ASN SER PHE LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY PHE LEU R1 CYS SER LEU ASP ASN GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO LYS LYS LYS LEU AU CYS GLY AU LEU THR AU AU HIS CYS MET ASP LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS ASP ASN ASP ILE AU LEU LEU HIS GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU GLU LEU ASN GLN AU GLY GLN GLU HIS SER SER ARG GLU LYS GLU AU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN ASP ARG GLN ASP AU CYS GLU GLY SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS LYS SER TRP AU PRO-COOH em que é seleccionado do grupo seleccionado do grupo constituído constituído por ASN e <3LN, R._, é por ASN e 6LN, R.~, é selecc iona- do do grupo constituído por ASN e 6L..N e R^ é seleccionado do grupo constituído por ASN e SL..N; e Hss ζ 11 ,i um prUiiíu tur colocado de íorma a oxrxgxr a s xp í 1 s s s 1¾ o referxda sequência de DNAl em cond içS S?S 0 dequadas à e xpr essSo da re f © r ida. sequênc i a ..4.-. ΠΜΛ · e C) a. )10 C U P © )%a c Mo do r efe r i do zimogéni· O da pr oteina C a Pâ r 1x r dc?. r © "f Si rida cultur a. 12 'ã — Método de a cor do com a R e x v ind i c a ç Mo 11, ca r a c “ ter izado por ct 'ref er ida té 1 u 1 a hospede i ra. C L·! 11 x vada no F'a o (B) ser seleccxo na d a a pa r tir .•4.-. grupo c on sti tu i do pelas c él ulas hospedei ras 233/pLF‘G “QO 37, 233/pL ΟΛ i w -Q2 48, 233/pL. PC ™Q 313, *7Qp /p!_F‘C~Q32 :9, 293/ρβΤ- QOS 7-~h, 293/ρΘΤ “Q 248 •~h, 233/pfíT-Q 31 3“ h e 233/pQT~Q32S”h. L x sboa de Fevereiro de 1991

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