JP2003521919A - プロテインｃ誘導体 - Google Patents

プロテインｃ誘導体

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JP2003521919A
JP2003521919A JP2001558008A JP2001558008A JP2003521919A JP 2003521919 A JP2003521919 A JP 2003521919A JP 2001558008 A JP2001558008 A JP 2001558008A JP 2001558008 A JP2001558008 A JP 2001558008A JP 2003521919 A JP2003521919 A JP 2003521919A
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ブルース・エドワード・ガーリッツ
ブライアン・エドワード・ジョーンズ
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Eli Lilly and Co
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Abstract

(57)【要約】 ヒトプロテインＣ誘導体を記載する。この誘導体は、野生型プロテインＣと比較して亢進された抗凝固活性およびセルピンによる不活性化に対する耐性を有しており、野生型ヒトプロテインＣの生物学的活性を保持している。この誘導体は、急性冠血管症候群、血管閉塞障害、凝固性亢進状態、血栓障害および血栓症にかかり易い疾患状態の処置において、野生型ヒトプロテインＣよりも少ない頻度での投与および／または少ない投薬量のいずれかを要求しよう。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、２０００年２月２日に出願された仮出願番号６０／１７９，８０１
、および２０００年３月１４日に出願された仮出願番号６０／１８９，１９７の
優先権を主張する。
【０００２】 本発明は、新規ポリヌクレオチド、それにコードされるポリペプチド、並びに
そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用に関する。より具体的に
は、本発明は野生型の活性化プロテインＣに比べて、セルピン不活性化に対する
耐性および亢進された抗凝固活性を有するヒトプロテインＣ誘導体、その調製方
法、およびこのヒトプロテインＣ誘導体を含む医薬組成物に関する。
【０００３】 プロテインＣはセリンプロテアーゼであり、凝血カスケードにおいて第Ｖａ因
子および第ＶＩＩＩａ因子を不活化することによって止血の調節に重要な役割を
果たす、天然の抗凝固剤である。ヒトプロテインＣは、４６１アミノ酸の単一の
ポリペプチドとしてインビボにて創製される。このポリペプチドは、１）４２ア
ミノ酸シグナル配列の切断；２）２鎖型不活性前駆体およびチモーゲン（ジスル
フィド結合を介して２６２アミノ酸残基重鎖に結合される１５５アミノ酸残基軽
鎖）を与える、リジン残基とアルギニン残基（１５６位および１５７位）の切断
；３）アミノ末端４５残基内に位置する９個のグルタミン酸残基（ｇｌａドメイ
ン）のビタミンＫ依存性カルボキシル化；並びに４）４つの部位（軽鎖中に１つ
および重鎖中に３つ）における炭水化物の結合：を含む複数の翻訳後修飾を受け
る。最終的に、２鎖型チモーゲンは、重鎖のＮ末端におけるドデカペプチドの除
去により活性化され、２鎖型チモーゲンよりもより強い酵素活性を有する活性化
プロテインＣ（ａＰＣ）を生じる。
【０００４】 血液凝固は、凝固促進（pro-coagulant）機構と抗凝固機構との間のバランス
により調節される、非常に複雑なプロセスである。このバランスは、正常な止血
か、あるいは異常な病理的な血栓、例えば急性冠血管症候群（ＡＣＳ；例えば、
不安定狭心症、心筋梗塞）となる冠血栓症の形成および進行のいずれかの状態を
決定する。主に２つの因子、即ちフィブリンの生成と血小板の活性化および次の
凝集とがこのバランスを制御おり、この両プロセスは、凝血カスケードの活性化
に従って生じる酵素トロンビンの生成により制御される。また、トロンビンはト
ロンボモジュリンとの複合体において、プロテインＣチモーゲンをａＰＣへと活
性化し、その後のトロンビン生成を阻害するので、強力な抗凝固剤として機能す
る。それゆえ、ａＰＣは、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子の不活性化を介し
たトロンビン生成のフィードバック調整を通じて、血液凝固のおそらく最も重要
な下方制御物質として機能し、血栓症に対する保護を与える。抗凝固効果に加え
て、ａＰＣは抗炎症効果を有しており、血栓溶解を容易にする繊維素溶解促進（
profibrinolytic）特性を発揮する。
【０００５】 動脈血栓症は、ＡＣＳにおいて内皮損傷に対する応答、典型的には脂質豊富プ
ラーク（lipid-rich plaque）の破壊の結果として生じる。この応答の初期段階
には、損傷部位および活性化血小板表面における、血小板接着、活性化および種
々の凝固促進因子（procoagulants）のアセンブリーが起こる。その結果のトロ
ンビン生成作用（elaboration）は、フィブリン沈着および血小板活性化の両方
による血栓形成の進行に重要な役割を果たし、このようにして凝固系の活性化が
増強される。ＡＣＳに対する従来の抗凝固療法（例えば、非分画型ヘパリン［Ｕ
ＦＨ］）および現行の抗凝固療法（例えば、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ））は
、トロンビンおよび／または第Ｘａ因子の阻害に依存する（例えば、ヘパリンは
、トロンビンおよび第Ｘａ因子とアンチトロンビンIIIとの相互作用を劇的に刺
激することによりそれらを不活化する）。しかし、これらの物質が血塊結合型第
Ｘａ因子またはトロンビンを阻害するのには、立体障害のために有効ではない。
血塊結合型Ｘａ／Ｖａ複合体を標的とし、不可逆的にそれを不活性化するａＰＣ
の能力は、局所的なトロンビン生成および血栓症の進行を減弱させる。従って、
トロンビン生成減少の効果はａＰＣ濃度が減衰した後も持続するので、ａＰＣは
現行のトロンビンまたはＸａ阻害物質に比べて有利である。
【０００６】 また、止血を制御する際のａＰＣの重要な役割は、異型接合性欠損症における
血栓形成速度の亢進、プロテインＣ耐性（例えば、共通の第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ
変異型に起因する)、および未処置の同型接合性プロテインＣ欠損症の致死的結
果により裏付けられている。血漿由来および組換え的に調製されたａＰＣは、静
脈血栓症および動脈血栓症の両方の種々の動物モデルにおいて、有効かつ安全な
抗血栓剤であることが示されている。
【０００７】 また、以下の疾患および状態ではプロテインＣレベルが異常に低いことが示さ
れた：播種性血管内凝固（ＤＩＣ)［Fourrier等、Chest 101：816-823、1992］
、敗血症［Gerson等、Pediatrics 91：418-422、1993］、重大な外傷／重大な外
科手術［Thomas等、Am J Surg. 158：491-494、1989］、火傷［Lo等、Burns 20
：186-187(1994)］、成人型呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ)［Hasegawa等、Chest 10
5（1）：268-277、1994］および移植［Gordon等、Bone Marrow Trans．11：61-6
5(1993)］。加えて、処置するにあたって、ａＰＣが有用な場合がある血栓異常
または合併症を伴う多数の疾患がある：例えば、ヘパリン誘発性血小板減少症（
ＨＩＴ)［Phillips等、Annals of Pharmacotherapy 28：43-45、1994］、鎌状赤
血球病またはサラセミア［Karayalcin等、The American Journal of Pediatric Hematology／Oncology 11(3)：320-323、1989］、ウィルス性出血熱［Lacy等、A dvances in Pediatric Infectious Diseases 12：21-53、1997］、血栓性血小板
減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒性症候群（ＨＵＳ)［Moake、Seminars in Hematology 34(2)：83-89、1997］。さらに、殺菌性透過亢進タンパク質（
（ＢＰＩ）と組合わせたａＰＣは、敗血症の処置に有用な場合がある［Fisher等
、Crit．Care Med．22(4)：553-558、1994］。
【０００８】 血小板阻害が血栓疾患の予防および処置の両方に有効であることは、非常によ
く立証されている。しかし、抗血小板剤、例えばアスピリンの使用は出血の危険
性を増大させるため、薬剤の投与量および処置期間が制限される。ａＰＣおよび
抗血小板剤の組合わせは、ａＰＣおよび抗血小板剤（群）の両方の投薬量の減少
を可能にする相乗効果を生じさせる。次に、この併用療法における薬剤の投与量
の減少は、抗凝固／抗血小板併用療法の際にしばしば観察される出血の増加など
の副作用を減少させる。
【０００９】 血漿からプロテインＣを入手するための種々の方法、および組換えＤＮＡ技術
を介してプロテインＣ、ａＰＣおよびプロテインＣ／ａＰＣポリペプチドを入手
するための種々の方法は、当分野において公知であり、記載されている。例えば
、米国特許第４,７７５,６２４号および第５,３５８,９３２号を参照のこと。組
換えＤＮＡ技術によりａＰＣを生産する方法は改善されているにも拘わらず、ａ
ＰＣおよびそのポリペプチドを生産することは困難であり、費用がかかる。
【００１０】 プロテインＣチモーゲンとは異なり、活性化プロテインＣの半減期は非常に短
い。半減期の短い主な理由は、セルピン（セリンプロテアーゼ阻害物質）として
知られる分子がａＰＣに共有結合し、不活性なセルピン／ａＰＣ複合体を形成す
ることによって、ａＰＣの血液レベルを調節するためでる。このセルピン／ａＰ
Ｃ複合体は、ａＰＣが結合し、セルピン内の反応部位ループをタンパク分解的に
切断すると形成され；セルピンは切断されると、ａＰＣを不可逆的に不活性化す
る構造変化を受ける。その後、このセルピン／ａＰＣ複合体は、セルピン／ａＰ
Ｃ複合体に対する肝臓レセプターを介して、血流から取り除かれる。結果として
、ａＰＣの半減期はチモーゲンと比較して相対的に短い；ヒトプロテインＣチモ
ーゲンがおよそ１０時間であるのに対して、ａＰＣはおよそ２０分である（Okaj
ima等、Thromb Haemost 63 (1) : 48-53, 1990)。
【００１１】 従って、ａＰＣの所望の生物活性（例えば、抗凝固活性、繊維素溶解活性およ
び抗炎症活性）を保持しつつ、セルピン不活性化に対して耐性を示すａＰＣ誘導
体は、増大した血漿半減期を有し、治療適用について十分に減少した投薬レベル
しか必要しないために、親化合物よりも潜在的にさらに有効な化合物を提供する
。この潜在的な利点は、セルピンレベルが上昇している疾患状態において特に重
要である。
【００１２】 科学的な実験、分析および革新技術を通じて、本発明者等は、セルピン／ａＰ
Ｃ複合体の形成に必須のセルピンおよびプロテインＣの結合部位を同定した。ａ
ＰＣ分子中の標的アミノ酸残基を修飾し、驚いたことに、それがａＰＣの本来の
基質（例えば、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子）に対するａＰＣ誘導体の特
異性を保持すると同時に、セルピン／ａＰＣ複合体（この複合体は、ａＰＣを不
可逆的に不活性化する）の形成を阻害した。加えて、セルピン／ヒトａＰＣ誘導
体結合の阻害が、配列番号：１のアミノ酸１９４（Ｌｅｕ）、１９５（Ａｌａ）
、２２８（Ｌｅｕ）、２４９（Ｔｙｒ）、２５４（Ｔｈｒ）、３０２（Ｔｙｒ）
、および３１６（Ｐｈｅ）の１つまたはそれ以上を、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、
Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙおよびＧｌ
ｎから選択されるアミノ酸（群）と置換（ただし、１９４位はＬｅｕで置換せず
、２５４位はＴｈｒで置換しない）することによって生じることを見出した。
【００１３】 加えて、ａＰＣの他の生物活性（例えば、繊維素溶解活性および抗炎症活性）
を保持しつつ、亢進された抗凝固活性を示すａＰＣ誘導体は、治療適用について
十分に減少した投薬レベルしか必要としないために、親化合物よりもさらに有効
に強力な化合物を提供する。
【００１４】 ｇｌａ−ドメインの部位特異的変異誘発によるヒトプロテインＣのカルシウム
および膜結合活性の増大は、幾人かの研究者により報告されている、例えば、Sh
en等（J Biol. Chem.、273（47）31086-91、1998）およびShen等（Biochemistry 、36（51）16025-31、1997）がある。本発明者等は継続的な科学実験、分析およ
び革新技術を通じて、ａＰＣ分子のｇｌａドメイン中の特定の部位を同定し、標
的アミノ酸残基を修飾した。驚いたことに、特定の部位特異的突然変異を行った
場合に、生じたａＰＣ誘導体の抗凝固活性が亢進することが観察された。特に、
配列番号：１の１０位（Ｈｉｓ）、１１位（Ｓｅｒ）、１２位（Ｓｅｒ）、３２
（Ｇｌｎ）および３３（Ａｓｎ）のアミノ酸での置換は、単独またはそれらの組
合わせにおいて、野生型ａＰＣと比較した場合に、抗凝固活性が亢進することが
見出された。
【００１５】 従って、本発明は新規ヒトプロテインＣ誘導体を記載する。このヒトプロテイ
ンＣ誘導体は、野生型プロテインＣの重要な生物学的活性を保持し、野生型ａＰ
Ｃよりも高い抗凝固活性を有し、ヒト血液中において野生型ａＰＣよりも長い半
減期を有する。それゆえ、本化合物は種々の利点、例えば、より少ない頻度での
投与および／またはより少ない投与量、それによる全体的な調製費用および治療
費用の減少を提供する。さらに、本化合物は、ＡＣＳのような疾患状態における
従来の抗凝固療法を超える利点を示す。重要なことは、ヒトプロテインＣ誘導体
の抗凝固活性およびセルピン不活性化に対する耐性の亢進は、好ましくは２〜６
個のアミノ酸置換を介して達成され得るということであり、これらの分子はおそ
らく、６個よりも多くのアミノ酸置換を有する分子と比較して免疫原性であるこ
とは相対的に少ないであろう（米国特許第5,358,932号；Holly等、Biochemistry 33：1876-1880,1994）。
【００１６】 本発明は、以下のアミノ酸置換：１０位のＨｉｓがＧｌｎで置換されている；
１１位のＳｅｒがＧｌｙで置換されている；１２位のＳｅｒがＬｙｓで置換され
ている；３２位のＧｌｎがＧｌｕで置換されている；３３位のＡｓｎがＡｓｐま
たはＰｈｅで置換されている；および、１９４、１９５、２２８、２４９、２５
４、３０２または３１６位のアミノ酸が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌ
ｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙおよびＧｌｎから選択
されるアミノ酸で置換されている置換を、少なくとも２つ含む配列番号：１を包
含する、ヒトプロテインＣ誘導体を提供する。
【００１７】 また、本発明は本発明のヒトプロテインＣ誘導体、特に配列番号：７、８、９
および１０を包含するヒトプロテインＣ誘導体をコードする組換えＤＮＡ分子を
提供する。
【００１８】 本発明のその他の側面は、上記ヒトプロテインＣ誘導体、特に配列番号：３、
４、５および６を包含するヒトプロテインＣ誘導体、並びにこれらのヒトプロテ
インＣ誘導体の活性型のタンパク質配列を提供する。
【００１９】 本発明はさらに、敗血症、播種性血管内凝固、電撃性紫斑症、重大な外傷、重
大な外科手術、火傷、成人呼吸窮迫症候群、移植、深在静脈血栓症、ヘパリン誘
発性血小板減少症、鎌状赤血球病、サラセミア、ウィルス性出血熱、血栓性血小
板減少性紫斑病および溶血性尿毒症症候群を含む、血管閉塞障害および凝固性亢
進状態を処置する方法を包含する。
【００２０】 本発明のその他の側面は、本明細書中にて規定するようなプロテインＣ誘導体
により引き起こされる、またはその結果生じる疾患および状態を処置することを
包含する。
【００２１】 さらに、本発明は処置を必要とする患者に製薬的有効量のヒトプロテインＣ誘
導体を投与することによって、上記疾患または状態を処置することを提供する。
【００２２】 さらに、本発明は以上に規定されるヒトプロテインＣ誘導体の活性型を用いて
、上述の疾患および状態を処置することを提供する。
【００２３】 本発明のその他の態様には、敗血症の処置を必要とする患者に製薬的有効量の
本発明のヒトプロテインＣ誘導体を、殺菌性透過亢進タンパク質と組み合わせて
投与することを包含する、敗血症を処置する方法がある。
【００２４】 本発明の他の態様には、血栓障害の処置を必要とする患者に製薬的有効量の本
発明のヒトプロテインＣ誘導体を、抗血小板剤と組み合わせて投与することを包
含する、血栓障害を処置する方法がある。
【００２５】 本発明の他の態様には、冠動脈、脳動脈または末梢血管、あるいは代用血管に
おける急性動脈血栓閉塞症、血栓塞栓症または狭窄症を処置する方法であって、
それを必要とする患者に製薬的有効量のヒト活性化プロテインＣ誘導体を、血栓
溶解剤と組み合わせて投与することを包含する方法がある。
【００２６】 さらに本発明の他の態様には、遺伝的にプロトロンビン症にかかり易い障害を
有する患者に、プロテインＣ誘導体をコードする組換えＤＮＡ分子を投与するこ
とを含む、該患者を処置する方法がある。遺伝的にプロトロンビン症にかかり易
い障害の例としては、プロテインＣ欠損症、第Ｖ因子ライデン（Leiden）突然変
異およびプロトロンビン遺伝子Ｇ２０２１０Ａ突然変異がある。
【００２７】 また、本発明は製薬的に許容される担体または希釈剤、および本発明のヒトプ
ロテインＣ誘導体を含む、医薬組成物を提供する。
【００２８】 また、本発明は上記適応症の処置用の医薬品を製造するための、本発明のヒト
活性化プロテインＣ誘導体の使用を提供する。
【００２９】 また、新規ヒトプロテイン誘導体を産生する方法および側面も、本発明の側面
である。
【００３０】 本明細書中に開示し、特許請求する本発明の目的のために、下記の用語を以下
に定義する。
【００３１】 抗血小板剤−血小板の凝集能力を減少させる、１つまたはそれ以上の薬剤の単
独またはその組合わせ。当分野において理解され、そして評価される薬剤には、
例えば、Remington、The Science and Practice of Pharmacy、第１９版、第II
巻、９２４〜２５頁、Mack Publishing Co.（引用により本明細書中に包含され
る）に記載されているものがある。そのような薬剤としては、これらに限定され
ないが、アスピリン（ＡＳＡ）、クロピドグレル（clopidogrel）、ＲｅｏＰｒ
ｏ（登録商標）(アブシキマブ（abciximab))、ジピリダモール、チクロピジンお
よびＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが挙げられる。
【００３２】 チモーゲン−本明細書中にて用いるプロテインＣチモーゲンは、分泌型、不活
性形態である、１本鎖または２本鎖のいずれかのプロテインＣまたはその誘導体
を意味する。
【００３３】 活性化プロテインＣは、活性化プロテインＣを与える、重鎖のＮ末端にあるド
デカペプチドの除去後に産生される、プロテインＣチモーゲンの活性型を意味す
る。
【００３４】 活性化プロテインＣまたはａＰＣは、組換えａＰＣを意味する。ａＰＣには組
換えヒトａＰＣが含まれ、それが好ましいが、ａＰＣにはプロテインＣタンパク
質分解活性、アミド分解活性、エステル分解活性および生物学的（抗凝固、抗炎
症または繊維素溶解促進）活性を有する他の種を含む場合もある。
【００３５】 ヒトプロテインＣ誘導体（群）は、野生型ヒトプロテインＣとは異なるが、活
性化されると、本質的な特性、即ちタンパク質分解活性、アミド分解活性、エス
テル分解活性および生物学的（抗凝固、抗炎症または繊維素溶解促進）活性を保
持する、組換え的に調製された本発明の誘導体を意味する。また、本明細書中に
て用いるヒトプロテインＣ誘導体の定義には、以上に定義されるヒトプロテイン
Ｃ誘導体の活性型も含まれる。
【００３６】 処置とは、疾患、状態または障害を排除するか、あるいは疾患、状態または障
害の徴候または合併症の発症を予防的に防ぐために、疾患、状態または障害と戦
うための患者の管理および介護を意味する。
【００３７】 連続注入−特定の期間の実質的に中断されない連続する溶液または懸濁液の静
脈内への導入。
【００３８】 ボーラス注射−約１２０分までの期間にわたる、規定量（ボーラスと称する）
の薬物の注射。
【００３９】 投与に適した−治療薬剤として投与されるのに適している、凍結乾燥製剤また
は溶液。
【００４０】 単位投薬形態−ヒト被験体のための単一投薬として適した物理的に分離された
単位を意味し、各単位には所望の治療効果が得られるように計算され、予め決定
された量の活性物質を適当な製薬賦形剤と共に含有する。
【００４１】 凝固性亢進状態−播種性血管内凝固、プレトロンビン性状態、凝固活性化、ま
たはａＰＣのような凝固因子の先天性若しくは後天性欠損症と関連した過度の凝
固能。
【００４２】 プロテインＣ欠損症−本明細書中にて用いるプロテインＣ欠損症は、先天性ま
たは後天性の場合がある。いずれのタイプについても、循環中のプロテインＣレ
ベルは正常範囲の下限値未満である。当業者であれば、プロテインＣレベルを決
定するためのＦＤＡにより認可された装置および診断用キットを用いる標準的な
プロトコルにより、正常範囲が確立されることを知っている。
【００４３】 製薬的有効量−医薬化合物の治療的に効果のある量。本発明に基づき投与され
る化合物の特定の投薬量は、当然のことながら、投与される化合物、処置される
特定の状態、患者の特性および類似する考慮を含む症例を取り巻く特定の環境を
、医師が評価することにより決定されよう。
【００４４】 急性冠血管症候群−冠プラーク破裂により悪化した冠アテローム動脈硬化症、
重複（superimposed）冠血栓症、並びに冠虚血および／または心筋梗塞を生じる
危険な冠血流の臨床症状。急性冠血管症候群のスペクトルには、不安定狭心症、
非Ｑ波（すなわち、ＳＴセグメント上昇なし）心筋梗塞、およびＱ波（すなわち
、ＳＴセグメント上昇あり）心筋梗塞が挙げられる。
【００４５】 遺伝子治療−治療用タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、直接治
療用タンパク質を産生させようとする発症した細胞（affected cell）に投与す
ることを含む治療レジメ。遺伝子送達のための標的組織としては、例えば、骨格
筋、血管平滑筋および肝臓が挙げられる。ベクターとしては、例えば、プラスミ
ドＤＮＡ、リポソーム、タンパク質−ＤＮＡ複合体およびアデノウィルスまたは
ヘルペスウィルスに基づくベクターが挙げられる。遺伝子治療は、例えば、Kess
ler等、PNAS、USA、93：14082-87、1996に記載されている。
【００４６】 血栓障害−血管内の血塊の形成または存在に関連した、またはその影響を受け
る障害。そのような障害には、発作、血管形成術またはステント配置に続く急激
な閉塞、および末梢血管手術の結果としての血栓症が挙げられるが、これらに限
定されない。
【００４７】 電撃性紫斑病−斑状出血皮膚損傷、発熱、細菌性敗血症、ウィルス性感染、細
菌性感染または原性動物性感染と関連する低血圧。播種性血管内凝固が通常存在
する。
【００４８】 組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）は、天然または組換え型のＴＦＰＩを意味す
る。このタンパク質は、臓器不全および死を引き起こす可能性がある、小血管中
の組織媒介性の凝固をブロックすると考えられている。
【００４９】 セルピン−阻害活性が超可変および可動ペプチドループ内の活性部位によって
与えられる、典型的にはセリンプロテアーゼ阻害物質である、プロテインＣ阻害
物質（ＰＣＩ）およびα1−抗トリプシン（α1−ＡＴ）などの（これらに制限さ
れない）、構造的に関連のあるタンパク質群のいずれか。
【００５０】 阻害物質認識配列Ｓ２：ＰＣＩまたはα1−ＡＴの開裂部位に対して、２番目
のＮ末端側残基。 阻害物質認識配列Ｓ３'：ＰＣＩまたはα1−ＡＴの開裂部位に対して、３番目
のＣ末端側残基。 阻害物質認識配列Ｓ４'：ＰＣＩまたはα1−ＡＴの開裂部位に対して、４番目
のＣ末端側残基。
【００５１】 野生型プロテインＣ−プロテインＣの天然または実験室の突然変異ポリペプチ
ド型とは対照的に、ヒトの自然個体群において支配的な型のプロテインＣ。
【００５２】 殺菌性透過亢進タンパク質には、次のものが含まれる：天然または組換え的に
調製された殺菌性透過亢進（ＢＰＩ）タンパク質；ＢＰＩタンパク質の生物学的
に活性な天然、合成および組換えポリペプチド断片；ハイブリッド融合タンパク
質およびダイマーを含む、ＢＰＩタンパク質の生物的に活性なポリペプチド改変
体、またはその断片；システイン置換アナログを含む、ＢＰＩタンパク質の生物
学的に活性な改変型アナログまたはその断片あるいはその改変型；並びにＢＰＩ
由来のペプチド。ヒトＢＰＩの完全なアミノ酸配列、およびＢＰＩをコードする
ＤＮＡのヌクレオチド配列は、Gray等、1989、J．Biol．Chem 264：9505により
説明されている。ＢＰＩホロタンパク質およびＢＰＩの断片を含む、ＢＰＩタン
パク質をコードする組換え遺伝子およびその発現方法は、米国特許第5,198,541
号に開示されている（引用により本明細書中に包含される）。
【００５３】 アミノ酸略語は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２ (ｄ)(１)(１９９８）に記載の
ように米国特許商標庁により承認されている。
【００５４】 本発明は、野生型プロテインＣと比較して、亢進された抗凝固活性およびセル
ピン不活性化に対する耐性を有する、活性型を含むヒトプロテインＣ誘導体を提
供する。ａＰＣまたはヒトａＰＣ誘導体の活性型は、組換えヒトプロテインＣチ
モーゲン若しくは組換えヒトプロテインＣ誘導体チモーゲンをインビトロにて活
性化することにより、または活性型のプロテインＣの直接分泌により調製できる
。活性化を起こす手段は重要ではなく、本発明のプロセスの側面には、任意およ
びすべての活性化手段が含まれる。ヒトプロテインＣ誘導体は、真核生物細胞、
トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物において調製でき、例
えば、ヒト腎臓２９３細胞またはＡＶ１２細胞からチモーゲンとして分泌させ、
次いで当業者に既知の技術により精製および活性化することが挙げられる。
【００５５】 本発明の好ましいヒトプロテインＣ誘導体には、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３
Ｄ：Ｌ１９４Ｓ、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、Ｈ
１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ
３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、およびその活性型が含まれる。
【００５６】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓは、通常
１１位に見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常３２位に見出され
るグルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基、通常３３位に見出されるアスパ
ラギン残基の代わりにアスパラギン酸残基、および通常１９４位に見出されるロ
イシン残基の代わりにセリンを含有する。１９４位における他の好ましいアミノ
酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙ
ｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００５７】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５
４Ｓは、通常１１位に見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常３２
位に見出されるグルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基、通常３３位に見出
されるアスパラギン残基の代わりにアスパラギン酸残基、通常１９４位に見出さ
れるロイシン残基の代わりにセリン残基、および通常２５４位に見出されるスレ
オニン残基の代わりにセリン残基を含有する。１９４位および２５４位における
他の好ましいアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇ
ｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる（ただ
し、１１位はＳｅｒではなく、３２位はＧｌｎではなく、３３位はＡｓｎではな
く、１９４位はＬｅｕでなく、そして２５４位はＴｈｒではない）。
【００５８】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４
Ｓは、通常１０位に見出されるヒスチジン残基の代わりにグルタミン残基、通常
１１位に見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常３２位に見出され
るグルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基、通常３３位に見出されるアスパ
ラギン残基の代わりにアスパラギン酸残基、および通常１９４位に見出されるロ
イシン残基の代わりにセリン残基を含有する。本発明の教示を用いれば、これら
の位置における他のアミノ酸置換が、結果として生じる誘導体分子に、亢進され
た抗凝固活性およびセルピン不活性化に対する耐性を与えることは、当業者には
明らかである。そのようなアミノ酸置換の例としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ
、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ 、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒおよび
Ｈｉｓが挙げられる。
【００５９】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４
Ｓ：Ｔ２５４Ｓは、通常１０位に見出されるヒスチジン残基の代わりにグルタミ
ン残基、通常１１位に見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常３２
位に見出されるグルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基、通常３３位に見出
されるアスパラギン残基の代わりにアスパラギン酸残基、通常１９４位に見出さ
れるロイシン残基の代わりにセリン残基、および通常２５４位に見出されるスレ
オニン残基の代わりにセリン残基を含有する。１９４位および２５４位における
他の好ましいアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇ
ｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００６０】 本発明のさらなる態様には、ヒトプロテインＣ誘導体：Ｓ１２Ｋ：Ｌ１９４Ｓ
、Ｓ１２Ｋ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ：Ｌ１９
４Ｓ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、Ｓ１１Ｇ：Ｌ
１９４Ｓ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｌ１９４Ｓ、Ｓ１１Ｇ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４
Ｓ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｌ１９４Ｓ、Ｓ１１Ｇ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、お
よび野生型の活性化プロテインＣと比べて抗凝固活性が亢進され、セルピン不活
性化に対して耐性である、それらの活性型が含まれる。
【００６１】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１２Ｋ：Ｌ１９４Ｓは、通常１２位に見出されるセ
リン残基の代わりにリシン残基、通常１９４位に見出されるロイシン残基の代わ
りにセリン残基を含有する。１９４位における他の好ましいアミノ酸残基には、
Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、
Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００６２】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１２Ｋ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓは、通常１２位に
見出されるセリン残基の代わりにリシン残基、通常１９４位に見出されるロイシ
ン残基の代わりにセリン残基、および通常２５４位に見出されるスレオニン残基
の代わりにセリン残基を含有する。１９４位および２５４位の他の好ましいその
ようなアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、
Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００６３】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ：Ｌ１９４Ｓは、通常
１０位に見出されるヒスチジン残基の代わりにグルタミン残基、通常１１位に見
出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常１２位に見出されるセリン残
基の代わりにリシン残基、および通常１９４位に見出されるロイシン残基の代わ
りにセリン残基を含有する。１９４位の他の好ましいアミノ酸置換には、Ａｌａ
、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ
、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００６４】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５
４Ｓは、好ましくは、通常１０位に見出されるヒスチジン残基よりもグルタミン
残基であり、通常１１位に見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常
１２位に見出されるセリン残基の代わりにリシン残基、通常１９４位に見出され
るロイシン残基の代わりにセリン残基、および通常２５４位に見出されるスレオ
ニン残基の代わりにセリン残基を含有する。１９４位および２５４位における他
の好ましいアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌ
ｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００６５】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｌ１９４Ｓは、通常１１位に見出されるセ
リン残基の代わりにグリシン残基、および通常１９４位に見出されるロイシン残
基の代わりにセリン残基を含有する。１９４位の他の好ましいアミノ酸置換には
、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ
、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００６６】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｌ１９４Ｓは、好ましくは、通
常１０位に見出されるヒスチジン残基よりもグルタミン残基であり、通常１１位
に見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、および通常１９４位に見出さ
れるロイシン残基の代わりにセリン残基を含有する。位置についての他の好まし
いアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅ
ｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００６７】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓは、通常１１位に
見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常１９４位に見出されるロイ
シン残基の代わりにセリン残基、および通常２５４位に見出されるスレオニン残
基の代わりに見出されるセリン残基を含有する。１９４位および２５４位の他の
好ましいこのようなアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる
。
【００６８】 加えて、本発明の好ましい態様には、プロテインＣ誘導体：Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２
Ｅ：Ｌ１９４Ｓ、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、Ｓ１１Ｇ：Ｑ
３２Ｅ：Ｎ３３Ｆ：Ｌ１９４Ｓ、およびＳ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｆ：Ｌ１９
４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、および野生型の活性化プロテインＣに比べて抗凝固活性が亢
進され、セルピン不活性化に対して耐性であるこれらの活性型が含まれる。
【００６９】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｌ１９４Ｓは、通常１１位に見
出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常３２位に見出されるグルタミ
ン残基の代わりにグルタミン酸残基、および通常１９４位に見出されるロイシン
残基の代わりにセリン残基を含有する。１９４位における他の好ましいこのよう
なアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅ
ｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００７０】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓは、通
常１１位に見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常３２位に見出さ
れるグルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基、通常１９４位に見出されるロ
イシン残基の代わりにセリン残基、および通常２５４位に見出されるスレオニン
残基の代わりにセリン残基が含有される。１９４位および２５４位における他の
好ましいこのようなアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる
。
【００７１】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｆ：Ｌ１９４Ｓは、通常
１１位に見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常３２位に見出され
るグルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基、通常３３位に見出されるアスパ
ラギン残基の代わりに見出されるフェニルアラニン残基、および通常１９４位に
見出されるロイシン残基の代わりにセリン残基を含有する。１９４位における他
の好ましいアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌ
ｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００７２】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｆ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５
４Ｓは、通常１１位に見出されるセリン残基の代わりにグリシン残基、通常３２
位に見出されるグルタミン残基の代わりにグルタミン酸残基、通常３３位に見出
されるアスパラギン残基の代わりにフェニルアラニン残基、通常１９４位に見出
されるロイシン残基の代わりにセリン残基、および通常２５４位に見出されるス
レオニン残基の代わりにセリン残基を含有する。１９４位および２５４位におけ
る他の好ましいアミノ酸置換には、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、ＴｈｒおよびＨｉｓが含まれる。
【００７３】 加えて、本発明のヒトプロテインＣ誘導体は、さらに上記プロテインＣ誘導体
のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含むが、本発明の基本的な特徴に影響
を及ぼさない。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、
親水性および／または両親媒性の性質に基づいて行なうことができる。従って、
本発明の誘導体には、保存的置換（conservative substitution)、即ちある残基
を類似の特徴を持つその他の残基と置換することにより、配列番号３、４、５お
よび６から改変したアミノ酸配列を有する誘導体が含まれる。典型的な置換は、
Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基Ａｓ
ｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；並びに塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒ
ｇ間；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒである。他の誘導体には、任意の組
合せにて、幾つかの、５〜１０、１〜５または１〜２アミノ酸を置換、欠失また
は付加した誘導体がある。好ましい態様は図１にて示し、配列番号２に見られる
ような、４２アミノ酸シグナルペプチド（プレ−プロリーダー）配列の付加を含
む配列番号：１に基づく。
【００７４】 本発明のヒトプロテインＣ誘導体は、さらなる置換または改変を行なわないこ
とが好ましい。これは、置換が本発明の誘導体に制限されるためである。
【００７５】 また、本発明はヒトプロテインＣ誘導体を調製する際に使用するＤＮＡ化合物
を提供する。これらのＤＮＡ化合物には、ヒトプロテインＣチモーゲンまたはヒ
トプロテインＣ誘導体チモーゲンのプレプロペプチド配列に対してすぐ横に、そ
の下流に、およびその翻訳読み取り枠に位置する、ヒトプロテインＣチモーゲン
またはヒトプロテインＣ誘導体チモーゲンの軽鎖のコード配列が含れる。ＤＮＡ
配列はプロテインＣ分子、活性型ペプチドおよびヒトプロテインＣ誘導体の重鎖
を成熟化する間にプロセシングされる、Ｌｙｓ−Ａｒｇジペプチドをコードする
ことが好ましい。このように、本発明のヒトプロテインＣ誘導体は、少なくとも
２つ、好ましくは１〜６つのアミノ酸を含有する改変型または変異型ポリペプチ
ドであり、配列番号１（４２アミノ酸シグナル配列を含まない）として規定され
ている野生型プロテインＣ配列、または配列番号２（４２アミノ酸シグナル配列
を含む）中の相当する野生型アミノ酸とは異なる。従って、当業者であれば、配
列番号：１として同定される野生型プロテインＣ配列のアミノ酸配列と異なるヒ
トプロテインＣ誘導体が、４２アミノ酸シグナル配列を除去した後に規定される
アミノ酸位置において、配列番号：２として規定される野生型プロテインＣ配列
に、本質的に相当することは理解しよう。さらに、当業者であれば、活性化の前
に、リシン残基およびアルギニン残基（１５６位および１５７位）の開裂が生じ
ることは理解しよう。
【００７６】 当業者であれば、遺伝子コードの縮重のために、種々のＤＮＡ化合物が上記の
誘導体をコードできることは認識できよう。米国特許第4,775,624号（この全教
示は全て引用により本明細書中に包含される）は、野生型のヒトプロテインＣ分
子を開示する。当業者であれば、ＤＮＡ配列中のどの変化が本明細書中に開示さ
れる正確な誘導体をコードし得るかを容易に決定することができる。本発明は、
開示された特定のＤＮＡ配列に限定されるものではない。結果的に以下に記載す
る、および好ましいＤＮＡ化合物に関する添付の実施例中の構築物は単なる例示
であり、本発明の範囲を限定しない。
【００７７】 本発明のＤＮＡ化合物の全ては、部位特異的変異誘発を用いて、ヒトプロテイ
ンＣチモーゲン内の特定の位置を変化させることにより製造した。部位特異的変
異誘発によりヌクレオチド配列を修飾する技術は、当業者に周知である。例えば
、Sambrook，Fritsch ＆ Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual
，第２版（1989）を参照のこと。
【００７８】 ヒトプロテインＣ誘導体は、真核細胞株、トランスジェニック動物またはトラ
ンスジェニック植物を利用する、当分野において周知の技術により調製すること
ができる。当業者であれば、適切な宿主真核細胞株には、ＨｅｐＧ２、ＬＬＣ−
ＭＫ2、ＣＨＯ−Ｋ１、２９３またはＡＶ１２細胞（これらの例としては、米国
特許第5,681,932号に記載されているされる（引用により本明細書中に包含され
る)）が含まれるが、これらに制限されないことは容易に理解しよう。さらに、
組換えタンパク質のトランスジェニック産物の例は、米国特許第5,589,604号お
よび同第5,650,503号（引用により本明細書中に包含される）に記載されている
。
【００７９】 当業者であれば、種々のベクターが真核生物宿主細胞中での目的のＤＮＡ配列
の発現に有用であることを認識する。哺乳動物細胞中での発現に適しているベク
ターとしては、以下に限定されるわけではないが、ｐＧＴ−ｈ、ｐＧＴ−ｄ；ｐ
ＣＤＮＡ３.０、ｐＣＤＮＡ３.１、ｐＣＤＮＡ３.１＋ＺｅｏおよびｐＣＤＮＡ
３.１＋Ｈｙｇｒｏ（インビトロゲン）；並びにｐＩＲＥＳ／Ｈｙｇｒｏおよび
ｐＩＲＥＳ／ｎｅｏ（クローンテック）が挙げられる。本発明の好ましいベクタ
ーは、実施例２に記載するようにｐＩＧ３である。
【００８０】 また、宿主細胞の増殖に関連しているタンパク質配列の発現の調節を可能とす
る他の配列も望ましいであろう。そのような調節配列は当業者に既知であり、例
としては、調節化合物の存在を含む、化学的刺激または物理的刺激に反応してス
イッチがオンまたはオフになり、遺伝子の発現を引き起こす配列が挙げられる。
また、他のタイプの調節エレメント、例えば、エンハンサー配列がベクター中に
存在してもよい。
【００８１】 制御配列および他の調節配列を、ベクター、例えば上記クローニングベクター
などのベクター中へ挿入する前に、コード配列に連結することができる。あるい
は、コード配列は、すでに制御配列および適切な制限部位を含有する発現ベクタ
ーに直接クローニングすることができる。
【００８２】 ある場合には、適切な配向をもって制御配列に結合させ得る、即ち、適切な読
み取り枠を維持させる場合に、コード配列を修飾することが必要な場合がある。
【００８３】 これらの方法のいずれかにより調製されるヒトプロテインＣ誘導体は、翻訳後
修飾、例えば、１０個のγ−カルボキシ−グルタメートの付加、１個のエリスロ
−β−ヒドロキシ−Ａｓｐの付加（β−ヒドロキシル化）、４個のＡｓｎ−結合
型オリゴサッカライドの付加（グリコシル化）およびリーダー配列（４２アミノ
酸残基）の除去を受けなければならない。このような翻訳後修飾は、哺乳動物細
胞からの十分な生産およびプロテインＣ誘導体の十分な分泌に必要である。
【００８４】 組換えタンパク質、例えば本発明のヒトプロテインＣ誘導体の翻訳後修飾が、
組換えタンパク質の発現に使用される宿主細胞株に依存して変化し得ることは、
当該分野において周知である。例えば、本発明のヒトプロテインＣ誘導体の抗凝
固活性に関して必須である翻訳後修飾のγ−カルボキシル化は、使用される宿主
細胞株に依存して、プラスミド由来の野生型プロテインＣγ−カルボキシル化よ
りも高いか、わずかに低いか、または非常に低い場合がある（Yan等、Bio/Techn ology 8(7):655-661,1990）。γ−カルボキシル化におけるこのような差異は、
抗凝固活性の亢進を生じる結果となるであろう、ヒトプロテインＣ分子内の特定
の位置を変化させる部位特異的変異誘発の使用についての基礎を提供する。
【００８５】 本発明の一態様には、実施例１に記載するように、正確にγ−カルボキシル化
されたプロテインＣの増大された産生レベルおよび上昇した比活性、および／ま
たは１２位のセリン残基のリン酸化を阻害することにより得られる亢進された抗
凝固活性およびセルピン不活性化に対する耐性を有するプロテインＣがある。こ
のリン酸化の阻害は、１２位のセリン残基を部位特異的変異誘発法によりリン酸
化可能ではないアミノ酸、即ちＳｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ以外のアミノ酸で置
換することにより、１２位のセリン残基のリン酸化に係るキナーゼを阻害するこ
とにより、例えば宿主細胞系を増殖させるために用いる組織培養培地中に非毒性
のキナーゼ阻害物質を含ませることによって行なうことができる。
【００８６】 それゆえ、本発明の一態様は、ヒトプロテインＣ誘導体をコードする核酸を含
有するベクターで宿主細胞を形質転換し；この宿主細胞を該ヒトプロテインＣ誘
導体の発現に適した培地中で培養し；この培養培地から該ヒトプロテインＣ誘導
体を単離し；そして該ヒトプロテイン誘導体を活性化する過程を含む方法により
産生される野生型の活性化プロテインＣと比較して亢進された抗凝固活性および
セルピン不活性化に対して耐性を有するヒトプロテインＣ誘導体である。
【００８７】 ヒトプロテインＣおよびヒトプロテインＣ誘導体チモーゲン型を、活性型ヒト
プロテインＣおよび活性型ヒトプロテインＣ誘導体へと活性化する方法は、古く
から当分野において周知である。ヒトプロテインＣはトロンビン単独により、ト
ロンビン／トロンボモジュリン複合体により、ＲＶＶ−Ｘ、ラッセルクサリヘビ
毒由来のプロテアーゼにより、膵臓由来トリプシンにより、または他のタンパク
質分解性酵素により、活性化され得る。
【００８８】 加えて、さらに本発明は、野生型ａＰＣと比較して亢進された抗凝固活性およ
びセルピン不活性化に対する耐性を有するａＰＣ誘導体を用いた、心筋梗塞およ
び不安定狭心症を含む急性冠血管症候群の処置に関する。
【００８９】 また、本発明の組換えヒトプロテインＣ誘導体は、卒中、血管形成術またはス
テント配置に続く急激な閉塞、および末梢血管外科手術の結果としての血栓症の
ような血栓障害の処置にも有用である。
【００９０】 加えて、本発明の組換えヒトプロテインＣ誘導体は、敗血症、播種性血管内凝
固、重大な外傷、重大な外科手術、火傷、成人呼吸窮迫症候群、移植、深部静脈
血栓症、ヘパリン誘発性血小板減少症、鎌状赤血球病、サラセミア、ウィルス性
出血熱、血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症候群に関連する血管閉塞
障害または凝固性亢進状態の処置に有用である。その他の態様において、本発明
の組換えヒトプロテインＣ誘導体は、殺菌性透過亢進タンパク質と組合わせての
敗血症の処置に有用である。本発明のさらに別の側面において、本発明の活性型
ヒトプロテインＣ誘導体は、抗血小板物質（群）と併用して、種々の血栓障害を
処置または予防する。
【００９１】 本発明の組換えヒトプロテインＣ誘導体は、組織プラスミノーゲン活性化因子
、ストレプトキナーゼおよび関連する化合物またはそれらのアナログなどの血栓
溶解剤と併用して、冠動脈、脳動脈または末梢血管、あるいは代用血管における
急性動脈血栓閉塞症、血栓塞栓症または狭窄症の処置に有用である。
【００９２】 その他の態様について、本発明の組換えヒトプロテインＣ誘導体は、組織因子
経路阻害剤と併用して、敗血症の処置に有用である。
【００９３】 本発明のその他の側面には、本明細書中に規定するようにプロテインＣ欠損症
から引き起こされる、または生じる疾患および症状を処置することが含まれる。
本発明の側面には、野生型ａＰＣと比較して亢進された抗凝固活性およびセルピ
ン不活性化耐性の結果を生じる、任意のａＰＣ分子に対する任意のおよび全ての
修飾が考えられる。
【００９４】 ヒトプロテインＣ誘導体は、活性薬剤としてａＰＣ誘導体、および製薬上許容
される充填剤を含有する医薬組成物を調製するための周知の方法に従って処方で
きる。例えば、所望の製剤は、ショ糖、トレハロースまたはラフィノースなどの
充填剤、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの塩、クエン酸ナトリウム、ト
リス酢酸またはリン酸ナトリウムなどの約５.５〜約６.５のｐＨの緩衝剤、並び
に活性型ヒトプロテインＣ誘導体を含有する、高純度の安定な凍結乾燥製剤であ
る。
【００９５】 本発明のヒトａＰＣ誘導体は、当分野において理解され、評価される適当な用
量レベルにて投与することができ、その事例を取り囲む特定の状況を医師が評価
することによって決定され得る。好ましくは、投与されるヒトａＰＣ誘導体の量
は、約０.０１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間であろう。より好ま
しくは、投与されるヒトａＰＣ誘導体の量は、約０.１μｇ／ｋｇ／時間〜約２
５μｇ／ｋｇ／時間であろう。さらに好ましくは、投与されるヒトａＰＣ誘導体
の量は、約０.１μｇ／ｋｇ／時間〜約１５μｇ／ｋｇ／時間であろう。さらに
より好ましくは、投与されるヒトａＰＣ誘導体の量は、約１μｇ／ｋｇ／時間〜
約１５μｇ／ｋｇ／時間であろう。最も好ましくは、投与されるヒトａＰＣ誘導
体の量は、約５μｇ／ｋｇ／時間〜約１０μｇ／ｋｇ／時間であろう。
【００９６】 ヒトａＰＣ誘導体は、有効な形態において血流中への送達を確実にするために
、１日に１〜６回の０.０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１.０ｍｇ／ｋｇ／日の用量を、
１〜１０日間注射することによって、非経口的に投与することが好ましいであろ
う。ヒトａＰＣ誘導体を、３日間、Ｂ.Ｉ.Ｄ（１日に２回）を投与することがよ
り好ましいであろう。
【００９７】 あるいは、ヒトａＰＣ誘導体は、約０.０１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／
ｋｇ／時間の用量にて、１〜２４０時間の連続注入によって投与されよう。
【００９８】 投与されるヒトプロテインＣ誘導体の量から得られる好ましい血漿範囲は、０
.０２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ未満であろう。
【００９９】 その他の代替法として、ヒトａＰＣ誘導体は、１時間当たりの適当な用量の一
部（１／３〜１／２）を、ボーラス注射として約５分〜約１２０分の間にわたり
注射によって投与し、続いて２４０時間までの間に、適当な用量を連続注入する
ことにより投与される。
【０１００】 その他の代替法について、ヒトａＰＣ誘導体は、危険性の高い血管形成術（ス
テント術を用いるおよび用いない、並びに抗血小板剤を用いた併用療法を伴うお
よび伴わない）に対する補助として、冠内カテーテルを通じる局所的な送達によ
って投与しよう。投与されるヒトａＰＣ誘導体の量は、連続注入、ボーラス注射
、またはそれらの組合せにより約０.０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１.０ｍｇ／ｋｇ／
日であろう。
【０１０１】 さらにその他の代替法について、ヒトａＰＣ誘導体は、よりゆっくりな血流へ
の放出を確実にするために、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／日
の用量で皮下投与されよう。皮下用調製物のための処方は、このような医薬組成
物を調製すための周知の方法を使用して行われよう。
【０１０２】 本明細書中で使用する語句「〜と組合わせて（〜と併用して）」は、追加の薬
剤をａＰＣと、同時に、連続的にまたはこれらを組合わせのいずれかにて投与す
ることを意味する。追加の薬剤の例としては、抗血小板剤、血栓溶解剤およびＢ
ＰＩタンパク質が挙げられる。
【０１０３】 本発明に記載のヒトａＰＣ誘導体は、野生型ヒトａＰＣと比較して、実質的に
亢進された抗凝固活性および亢進された血漿半減期を有する。それゆえ、本化合
物は、より少ない頻度での投与および／またはより少ない用量を必要としよう。
最終的に、ヒトａＰＣ誘導体抗凝固活性およびセルピン不活性化に対する耐性に
おけるより優れた亢進は、２〜６個のアミノ酸置換を介して達成することができ
、これは、おそらく３個より多くのアミノ酸置換を有するａＰＣ誘導体よりも免
疫原性が少ない。
【０１０４】 以下の実施例は、単に、本発明をさらに例示するために提供される。本発明の
範囲は、単に以下の実施例から構成されるものと解釈されるべきではない。
【０１０５】 実施例１ プロテインＣ誘導体の構築および産生 標準的な方法に従いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ヒトプロテ
インＣ誘導体を構築した。野生型コード配列の供給源は、プラスミドｐＬＰＣで
ある（Bio/Technology 5:1189-1192,1987）。用いたユニバーサルＰＣＲプライ
マーには、 ＰＣ００１ｂ；
【化１】 ［これは、サブクローニングに使用するＸｂａＩ制限部位（下線部）、Ｋｏｚａ
ｋコンセンサス配列（小文字）(Kozak, J Cell Biol 108(2)：229-41,1989）、
およびプロテインＣのコード領域の５'末端をコードする］、 ＰＣ００２Ｅ；
【化２】 ［これは、ヒトプロテインＣのコード領域の３'末端をコードし、サブクローニ
ング用のＢｃｌＩ制限部位（下線部）を含む］が含まれる。確立したＰＣＲ方法
により、所望の配列変更を含む相補的オリゴヌクレオチドを使用して、全ての部
位特異的変異誘発を行なった。ＰＣＲの１回目は、プロテインＣ遺伝子の２個の
断片を増幅するのに用いた：ＰＣ００１ｂおよびアンチセンス変異原性プライマ
ーを用いて５'断片を調製し、ＰＣ００２ｅおよびセンス変異原性プライマーを
用いて３'断片を調製した。得られた増幅産物を標準的手段により精製した。こ
れらの断片を合わせ、次いで、プライマー、ＰＣ００１ｂおよびＰＣ００２ｅを
用いる２回目のＰＣＲについての鋳型として使用した。最終的なＰＣＲ産物をＸ
ｂａＩおよびＢｃｌＩを用いて消化し、同様に消化した発現ベクターｐＩＧ３に
サブクローニングした。２個のユニバーサルプライマーおよび鋳型としてプラス
ミドｐＬＰＣを用いてＰＣＲを行ない、野生型構築物を同様に調製し、続いてｐ
ＩＧ３にサブクローニングした。コード鎖および非コード鎖の両方のＤＮＡ配列
決定により、変異を確認した。ｐＩＧ３ベクターは、「内部リボソーム進入部位
（internal ribosome entry site）」(ＩＲＥＳ）(Jackson等、Trends Biochem Sci 15(12):447-83,1990）およびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Cormack等
、Gene 173:33-38,1996）遺伝子を、哺乳動物発現ベクターであるｐＧＴＤ（Ger
litz等、Biochem J 295(Pt1):131-40,1993）へ挿入することにより調製された。
目的のｃＤＮＡがｐＩＧ３のマルチクローニングサイトにクローニングされた場
合に、ＧＢＭＴプロモータ（Berg等、Nucleic Acids Res 20(20):5485-6,1992）
は、２シストロン性のｍＲＮＡ（５'−ｃＤＮＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−３'）の発
現を誘導する。第１シストロンの効率良い翻訳は、ｍＲＮＡの５'−メチル化キ
ャップ構造上でのリボソームサブユニットの古典的なアセンブリにより開始され
；同時に、第２シストロンの通常不充分な翻訳は、ｍＲＮＡにおける内部リボソ
ームアセンブリを可能にするＩＲＥＳ配列により克服される。別々のタンパク質
として翻訳される、ｃＤＮＡおよび単一のｍＲＮＡ上のレポーターのカップリン
グにより、蛍光強度に基づいて最も産生の高いクローンについてスクリーニング
できる。また、発現ベクターは、プラスミドを大腸菌内に維持するためのアンピ
シリン耐性カセット、並びに哺乳動物の組織発現における選択および増幅目的の
ための適切な発現配列を有するマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。
【０１０６】 アデノウィルスで形質転換したゴールデンハムスターＡＶ１２−６６４細胞株
を、１０％ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、２００μｇ／ｍＬジ
ェネテシン（Ｇ４１８）および１０μｇ／ｍＬビタミンＫ１を補充したダルベッ
コ改変イーグル培地中で増殖させた。トランスフェクションの１日前に、細胞を
約１０5細胞／２５ｃｍ2の密度でプレーティングした。ＦｓｐＩ線状化プラスミ
ドを、リン酸カルシウム法（ProFection,Gibco BRL-Life Technologies）または
ＦｕＧｅｎｅ−６（Boehringer Mannheim）のいずれかを使用して、製造業元の
指示に従いトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ４８時間後、
選択のために２５０ｎＭメトトレキサートを含有する培地を用いて培地を交換し
た。メトトレキサート耐性コロニーを、薬剤選択を適用した後２〜３週間プール
し、増殖させた。このプールを、ＧＦＰ蛍光強度に基づく蛍光活性型細胞ソーテ
ィングにかけ（Cormack,1996）、蛍光細胞のうち最も強い５％を保持し、増殖さ
せた。精製用の材料を得るために、組換え細胞を、１μｇ／ｍＬヒトインシュリ
ン、１μｇ／ｍＬヒトトランスフェリンおよび１０μｇ／ｍＬビタミンＫ１を含
むダルベッコ改変イーグル培地およびＨａｍ'ｓ Ｆ−１２培地の改変型混合物（
１：３）中で増殖させた。条件培地を回収し、最終濃度を５ｍＭ ベンズアミジ
ンおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０に調節し、プロテインＣを、上記のように
アニオン交換クロマトグラフィーを介して精製した（Yan等、Bio/Technology 8:
655-661,1990）。精製したタンパク質を、バッファーＡ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ
、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を用いるウルトラフリー（Ultrafree
）−ＣＬ３０,０００ＮＭＷＬろ過ユニット（Millipore）中にて脱塩／濃縮し、
標準物質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いるピアス（Pierce）ＢＣＡ
アッセイにより定量した。
【０１０７】 実施列２ セルピン耐性変異体 セルピンによる不活性化を減少させるヒトプロテインＣ内の特定の部位を変更
することで血漿半減期が延長する結果となる、部位特異的突然変異誘発の使用を
記載する。２つの一次的なａＰＣ阻害物質であるα1−ＡＴおよびＰＣＩにおけ
る認識配列は、その配列と相互作用するａＰＣ中の残基を改変することによって
活用できる幾つかの差異を明らかにする。表Ｉは、ａＰＣによって認識される配
列を表す。開裂部位は、イタリック体で示した２つの残基の間で生じる。特定の
サブサイト、Ｓ２、Ｓ３'およびＳ４'を占める残基を、下線で表す。
【０１０８】 一般に、第Ｖａ因子の認識部位は、第ＶＩＩＩａ因子またはその阻害物質のい
ずれの部位とも異なる、そのため、より重要な第Ｖａ因子を優先的に開裂する一
方で、同時にセルピンによる阻害のａＰＣの可能性を減少させる、ａＰＣの活性
部位を調製することが可能である。
【表１】
【０１０９】 特に、活性部位内の３つの認識部位は、基質認識配列および阻害物質認識配列
：Ｓ２（開裂部位に対して２番目のＮ末端残基）、Ｓ３'部位およびＳ４'の間で
は、特徴的に異なることを示す。Ｓ２部位は、この部位に疎水性残基を有するＰ
ＣＩおよびα1−ＡＴとは異なり、第Ｖａ因子配列における極性残基により本来
占有されている。全ての基質配列においてＳ３'部位は、極性側鎖により占有さ
れるが、α1−ＡＴ整列においては疎水性側鎖により占有されていることは際立
っている。Ｓ４'部位は、第Ｖａ因子の３つ全ての配列において、荷電残基によ
って占有されているが、第ＶＩＩＩａ因子配列および阻害物質配列における疎水
性残基によって占有されている。
【０１１０】 ＰＰＡＣＫ阻害されたａＰＣ（Mather等、EMBO J. 15(24):6822-6831,1996）
およびＨｉｒｕｌｏｇ ３阻害されたトロンビン（Qiu等、Biochemistry 31(47):
11689-97,1992）の結晶構造に基づき、２つのａＰＣ基質モデル構造を提唱し、
ＣＨＡＲＭｍプロトコル： （１）第Ｖａ因子Ｒ５０６開裂配列を表す配列。 （２）ＡｒｇをＭｅｔで置換した、α1−ＡＴの認識配列（ａＰＣに非常に高
い親和性を示すα1−ＡＴのポリペプチドに相当する） を用いてエネルギーを最小にした。
【０１１１】 これらのモデルは、この３つの特定の部位における重要な接触を形成する残基
の同定を可能にする。活性部位内で特定の接触を形成することができる残基、並
びに特異性および／または活性の向上を提供することが期待される置換の要約を
、表IIにまとめる。一般に、活性部位の特定のサブサイト内で接触を形成する残
基の突然変異は、環境における変化を反映し、２つの第一の生物学的阻害物質の
認識を避けるヒトａＰＣ誘導体の特異性を導くために設計され、ヒトａＰＣ誘導
体のタンパク質分解活性を潜在的に向上させる。
【表２】
【０１１２】 実施例３ 組換えプロテインＣの活性化 プロテインＣおよびプロテインＣ誘導体のチモーゲン型の完全な活性化は、ト
ロンビン−セファロースとのインキュベーションにより達成される。トロンビン
−セファロースをバッファーＡで徹底的に洗浄した。パックしたトロンビン−セ
ファロース２００μＬを、同じバッファー１ｍＬ中の２５０μｇのプロテインＣ
と混合し、３７℃にて４時間、攪拌プラットホーム上で穏やかに攪拌した。イン
キュベーションの経過の間、トロンビン−セファロースを簡単にペレット化し、
色素原性基質であるＳ−２３６６（DiaPharma）を用いるａＰＣ活性について少
量の上清の部分標本をアッセイすることで、プロテインＣ活性化の程度をモニタ
ーした。完全に活性化した後、トロンビン−セファロースをペレット化し、上清
を回収した。ａＰＣ濃度をＰｉｅｒｃｅＢＣＡアッセイにより検証し、ａＰＣを
直接アッセイするか、または部分標本を−８０℃で凍結させた。完全な活性化を
確認するために、全ての誘導体をクマシーブルー染色またはウェスタンブロット
分析のいずれかを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（Laemmli, Nature
227:680-685,1970）。
【０１１３】 実施例４ 機能的な特徴づけ 組換えヒトａＰＣ誘導体のアミド分解活性を、トリペプチド基質であるＳ−２
３６６（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）、Ｓ−２２３８（Ｐｉ
ｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）およびＳ−２２８８（Ｉｌｅ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）の加水分解により測定した。
【０１１４】 １ｍｇ ｍＬ-1ＢＳＡ、３ｍＭ ＣａＣｌ2および０．５ｎＭ ａＰＣを含有する
バッファー Ａ中にて２５℃で、アッセイを行った。反応（２００μＬ／ウェル
）を９６穴マイクロタイタープレート中で行い、アミド分解活性をＴｈｅｒｍｏ
ｍａｘキネティックマイクロタイタープレートリーダーでモニターし、４０５ｎ
ｍでの吸光度（ユニット／分）の変化として測定した。反応動力学定数は、種々
の基質濃度（１６μＭ〜２ｍＭ）での速度データをミカエリス−メンテンの式に
当てはめることにより導き出した。０.５３ｃｍの経路長（Molecular Devices T
echnical Applications Bulletin 4-1）および遊離ｐ−ニトロアニリドの吸光係
数、９６２０Ｍ-1ｃｍ-1（Pfleiderer、Methods Enzymol 19:514-521,1970）を
用いてＡ405における変化を、ｍｍｏｌの生成物に変換した。活性型部分的トロ
ンボプラスチンタイム凝固アッセイ（activated partial thromboplastin time
clotting assay）(Helena Laboratories）において凝固時間の延長を測定するこ
とにより、抗凝固活性を評価した。凝固反応はＴｈｅｒｍｏｍａｘキネティック
マイクロタイタープレートリーダーでモニターし、濁度変化においてＶmaxまで
の時間を測定した。
【０１１５】 実施例５ ａＰＣ誘導体の不活性化 ａＰＣ誘導体の不活性の速度を、ラビット血漿または正常なヒト血漿（ヒーラ
研究所）を、２０ｎＭ ａＰＣ（または誘導体）と共に３７℃にてインキュベー
トすることによって決定した。血漿濃度は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ト
リス、ｐＨ ７.４および１ｍｇ ｍＬ-1 ＢＳＡを含有する最終反応バッファー中
９０％（ｖ／ｖ）であった。選ばれた時間に部分標本を取り出し、最終濃度１ｍ
ＭにおけるＳ−２３６６を用いて、アミド分解活性として測定した。ａＰＣ誘導
体Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ（ＧＥＤＳ）、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２
Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ（ＧＥＤＳＳ）、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：
Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ（ＱＧＥＤＳ）およびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ
３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ（ＱＧＥＤＳＳ）について測定した
半減期を、以下の表IIIにまとめる。
【表３】
【０１１６】 実施例６ インビボ薬物動態 突然変異の結果としてインビボにおいて観察される半減期の効果を検証するた
めに、正常なラビットにおいてインビボ薬物動態実験を行なった。意識のあるラ
ビットにおいて、辺縁の耳静脈および中心の耳動脈をカニューレ処理した。バッ
ファーＡ中の活性化プロテインＣ誘導体（３００μｇ／ｍｌ）を用いて、１００
μｇ／ｋｇまたは０.１ｍｇ／ｋｇボーラス用量を、辺縁の耳静脈カテーテルを
通じて投与した。ベンズアミジンを含む３.８％シトレート０.０５ｍｌを含有す
るシリンジ中に血液（０.４５ｍｌ）を採取し、シリンジ／ニードルの隙間を補
充するために調整を行い、シトレート／ベンゾアミジン：血液を１：９の最終濃
度にした。処置後、０、２、５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０
、１８０、２４０、３００および３６０分に、試料を採取し、採取後都合がつき
次第すぐに遠心し、血漿２００μｌを９６穴プレート中に部分標本した。活性化
プロテインＣ誘導体のレベルを、以上に記載するように（Gruber等、Blood 79(9
):2340-2348, 1992）、プールしたラビット血漿中に１〜２５０ｎｇ／ｍＬの範
囲に希釈した標準物と比較して、酵素捕獲（enzyme capture）アッセイ（ＥＣＡ
）を用いて決定した。
【０１１７】 ラビットにおける静脈内ボーラス投与後の薬物動態学的なａＰＣ誘導体Ｓ１１
Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ（ＧＥＤＳ）、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３
３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ（ＧＥＤＳＳ）、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ
：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ（ＱＧＥＤＳ）およびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：
Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ（ＱＧＥＤＳＳ）の半減期を表IVに示す。Ｔ 1/2 平均値は、ａＰＣ誘導体の全てが野生型ａＰＣと比較した場合に、亢進され
た半減期を有することを示している。
【表４】
【０１１８】 実施例７ ラビットにおける血栓症のモデルについての抗血栓効果 血栓症の動静脈（ＡＶ）シャント(shunt)モデルは、心肺バイパス機器または
腎臓透析機器などの人工装置を通じて血液を循環する、臨床状態を模した血栓症
の頻繁に用いられる、再現性の高いモデルである。ＡＶシャント血栓症の麻酔し
たラビットモデルにおいて、頚動脈から３部のプラスチックチューブシャントを
通じて、頚静脈に固定している間、血液を分岐する。チューブの中央部には、血
栓性の物質が沈着する針を含む。フィブリンおよび血小板は血栓を構成する一方
で、フィブリンが優勢である。抗血栓効果は、活性部位を修飾した変異体の機能
的な半減期がラビットにおいて引き延ばされるために、ラビットのＡＶシャント
モデルにおいて決定された。
【０１１９】 野生型活性化プロテインＣと比較して、セルピン不活性化に対する耐性および
亢進された抗凝固活性を有するヒトプロテインＣ誘導体を評価した。変異型それ
ぞれを７５分間、流速０.１５ｍｇ／ｋｇ／時間にて注入した。血栓症の１５分
期間が６０〜７５分の間に生じた。ａＰＴＴよびａＰＣ濃度を決定するために、
血液を採取した。この試料を、ａＰＴＴを用いて全血液において抗凝固活性、並
びに免疫捕獲(immunocapture)およびアミド活性を用いてａＰＣの血漿濃度につ
いて測定した。
【０１２０】 変異型それぞれおよび野生型（ｗｔ）ａＰＣについての平均血栓重量を表Ｖに
まとめるように、初速度０.１５ｍｇ／Ｋｇ／時間用量の抗血栓効果を表した。
この結果は、セルピン不活性化に対する耐性および亢進された抗凝固活性を有す
るヒトプロテインＣ誘導体が、野生型ａＰＣよりもより効能があることを実証し
ている。
【表５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、プレ−プロ（pre-pro）リーダー（シグナル）配列を含
む、プロテインＣ分子の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 9/10 9/00 31/04 9/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 9/10 1/19 31/04 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 9/50 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:91 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ 9/50 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 9/50 37/48 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブライアン・エドワード・ジョーンズ アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、ビーコン・パーク・ドライブ14772 番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA02 DA02 EA04 GA11 HA01 4B050 CC01 CC04 DD11 DD20 FF11E LL01 4B065 AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA33 CA44 4C084 AA02 AA07 AA13 AA14 AA19 BA01 BA08 BA22 BA23 BA35 BA44 CA18 CA53 CA56 CA59 DC03 MA02 NA05 NA14 ZA362 ZA392 ZA542 ZB352

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １０位のＨｉｓがＧｌｎで置換されている；１１位のＳｅｒ
    がＧｌｙで置換されている；１２位のＳｅｒがＬｙｓで置換されている；３２位
    のＧｌｎがＧｌｕで置換されている；３３位のＡｓｎがＡｓｐまたはＰｈｅで置
    換されている；および、１９４、１９５、２２８、２４９、２５４、３０２また
    は３１６位のアミノ酸がＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａ
    ｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸で
    置換されている；から成る群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも２つ有す
    る配列番号１を含む、ヒトプロテインＣ誘導体。
  2. 【請求項２】 該ヒトプロテインＣ誘導体がその活性型である、請求項１に
    記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  3. 【請求項３】 １１位のＳｅｒがＧｌｙで置換されている；３２位のＧｌｎ
    がＧｌｕで置換されている；３３位のＡｓｎがＡｓｐで置換されている；および
    １９４位のＬｅｕがＳｅｒで置換されている（配列番号：３）、請求項１に記載
    のヒトプロテインＣ誘導体。
  4. 【請求項４】 １１位のＳｅｒがＧｌｙで置換されている；３２位のＧｌｎ
    がＧｌｕで置換されている；３３位のＡｓｎがＡｓｐで置換されている；および
    １９４位のＬｅｕがＳｅｒで置換されている、および２５４位のＴｈｒがＳｅｒ
    で置換されている（配列番号：４）、請求項１に記載のヒトプロテインＣ誘導体
    。
  5. 【請求項５】 １０位のＨｉｓがＧｌｎで置換されている；１１位のＳｅｒ
    がＧｌｙで置換されている；３２位のＧｌｎがＧｌｕで置換されている；３３位
    のＡｓｎがＡｓｐで置換されている；および１９４位のＬｅｕがＳｅｒで置換さ
    れている（配列番号：５）、請求項１に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  6. 【請求項６】 １０位のＨｉｓがＧｌｎで置換されている；１１位のＳｅｒ
    がＧｌｙで置換されている；３２位のＧｌｎがＧｌｕで置換されている；３３位
    のＡｓｎがＡｓｐで置換されている；および１９４位のＬｅｕがＳｅｒで置換さ
    れている、および２５４位のＴｈｒがＳｅｒで置換されている（配列番号：６）
    、請求項１に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載のヒトプロテインＣ誘導体を
    コードする、組換えＤＮＡ分子。
  8. 【請求項８】 急性冠血管症候群、および血栓症にかかり易い疾患状態を処
    置する方法であって、それを必要とする患者に製薬的有効量の請求項１に記載の
    ヒトプロテインＣ誘導体を投与することを包含する方法。
  9. 【請求項９】 急性冠血管症候群、および血栓症にかかり易い疾患状態が、
    心筋梗塞および不安定狭心症から成る群から選択される、請求項８に記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 血管閉塞障害および凝固性亢進状態を処置する方法であっ
    て、それを必要とする患者に製薬的有効量の請求項１に記載のヒトプロテインＣ
    誘導体を投与することを包含する方法。
  11. 【請求項１１】 敗血症を処置する方法であって、それを必要とする患者に
    製薬的有効量の請求項１に記載のヒトプロテインＣ誘導体を、殺菌性透過亢進タ
    ンパク質と組み合わせて投与することを包含する方法。
  12. 【請求項１２】 血栓障害を処置する方法であって、それを必要とする患者
    に製薬的有効量の請求項１に記載の単離されたヒトプロテインＣ誘導体を、抗血
    小板剤と組み合わせて投与することを包含する方法。
  13. 【請求項１３】 プロテインＣ欠損症を処置する方法であって、それを必要
    とする患者に製薬的有効量の請求項１に記載のヒトプロテインＣ誘導体を投与す
    ることを包含する方法。
  14. 【請求項１４】 冠動脈、脳動脈または末梢血管、あるいは代用血管におけ
    る急性動脈血栓閉塞症、血栓塞栓症または狭窄症を処置する方法であって、それ
    を必要とする患者に製薬的有効量の請求項１に記載のヒト活性化プロテインＣ誘
    導体を、血栓溶解剤と組み合わせて投与することを包含する方法。
  15. 【請求項１５】 遺伝的にプロトロンビン症にかかり易い障害を有するヒト
    患者を処置する方法であって、該患者に請求項１に記載のプロテインＣ誘導体を
    コードする組換えＤＮＡ分子を用いて遺伝子療法を施すことを包含する方法。
  16. 【請求項１６】 血栓障害を処置する方法であって、請求項１に記載のヒト
    活性化プロテインＣ誘導体を、冠内カテーテルを通じる局所的な送達によって投
    与することを包含する方法。
  17. 【請求項１７】 敗血症を処置する方法であって、それを必要とする患者に
    、製薬的有効量の請求項１に記載のヒトプロテインＣ誘導体を、組織因子経路阻
    害剤と組み合わせて投与することを包含する方法。
  18. 【請求項１８】 該ヒトプロテインＣ誘導体が、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３
    ３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、
    Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ、およびＨ１０Ｑ：Ｓ１
    １Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓから成る群から選択される
    、請求項８〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 製薬的に許容される希釈剤中に、請求項１〜６のいずれか
    に記載のヒトプロテインＣ誘導体を含む、医薬組成物。
  20. 【請求項２０】 該ヒトプロテインＣ誘導体が、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３
    ３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、
    Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ、およびＨ１０Ｑ：Ｓ１
    １Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓから成る群から選択される
    、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 急性冠血管症候群、血管閉塞障害および凝固性亢進状態、
    殺菌性透過亢進タンパク質を組み合わせた敗血症、血栓障害、抗血小板剤と組み
    合わせた血栓障害、遺伝的にプロトロンビン症にかかり易い障害、および組織因
    子経路阻害剤と組み合わせた敗血症の処置用の医薬品を製造するための、請求項
    １に記載のヒト活性化プロテインＣ誘導体の使用。
  22. 【請求項２２】 請求項７に基づく核酸を含む、ベクター。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載のベクターによって形質転換された、宿
    主細胞。
  24. 【請求項２４】 請求項１に記載のヒトプロテインＣ誘導体を調製する方法
    であって、（ａ）ヒトプロテインＣ誘導体をコードする核酸を含有するベクター
    を用いて宿主細胞を形質転換し、（ｂ）該ヒトプロテインＣ誘導体の発現に適し
    た培地にて、該宿主細胞を培養し、（ｃ）その培養培地から該ヒトプロテインＣ
    誘導体を単離し、そして（ｄ）該ヒトプロテインＣ誘導体を活性化することを包
    含する方法。
  25. 【請求項２５】 該核酸が、Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ、
    Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ
    ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ、およびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｑ３２Ｅ：Ｎ
    ３３Ｄ：Ｌ１９４Ｓ：Ｔ２５４Ｓから成る群から選択されるヒトプロテインＣ誘
    導体をコードする、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 該宿主細胞が２９３細胞およびＡＶ１２細胞から成る群か
    ら選択される、請求項２４に記載の方法。
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