PL204888B1

PL204888B1 - Wariant polipeptydu czynnika VII, konstrukcja kwasu nukleinowego, rekombinowana komórka gospodarza, zwierzę transgeniczne, sposób wytwarzania wariantu polipeptydu czynnika VII, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie wariantu polipeptydu czynnika VII

Info

Publication number: PL204888B1
Application number: PL360384A
Authority: PL
Inventors: Egon Persson; Ole Hvilsted Olsen
Original assignee: Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date: 2000-09-13
Filing date: 2001-09-13
Publication date: 2010-02-26
Also published as: HUP0301246A2; JP4361728B2; IL196482A; JP4814359B2; JP2009278980A; AU2001287550B2; WO2002022776A2; HUP0301246A3; EP2253703A1; EP2226385B1; JP2004508822A; IL154520A0; EP1319067A2; IL206229A; WO2002022776A9; WO2002022776A3; EP2226385A1; PL360384A1; IL154520A; AU8755001A

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wariant polipeptydu czynnika VII, konstrukcja kwasu nukleinowego, rekombinowana komórka gospodarza, zwierzę transgeniczne, sposób wytwarzania wariantu polipeptydu czynnika VII, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie wariantu polipeptydu czynnika VII.

Tło wynalazku

Krzepnięcie krwi jest procesem obejmującym złożoną interakcję różnych składników krwi (lub czynników), która w efekcie powoduje utworzenie skrzepu fibrynowego. Generalnie, składniki krwi, które biorą udział w procesie zwanym „kaskadą” krzepliwości, są białkami nieaktywnymi (proenzymy lub zymogeny) przekształcanymi w enzymy proteolityczne przez działanie aktywatora (który sam jest aktywowanym czynnikiem krzepliwości). Czynniki krzepliwości, które uległy takiej przemianie, opisuje się generalnie jako „czynniki aktywne” i są oznaczane przez dodanie litery „a” do nazwy czynnika krzepliwości (np. czynnik VIIa).

Zapoczątkowanie procesu hemostazy zachodzi za pośrednictwem kompleksu utworzonego między czynnikiem tkankowym, uwalnianym w wyniku uszkodzenia ściany naczynia a czynnikiem VIIa. Ten kompleks przekształca następnie czynniki IX i X w ich formy aktywne. Czynnik Xa przekształca ograniczoną ilość protrombiny w trombinę na komórce niosącej czynnik tkankowy. Trombina aktywuje płytki i czynniki V i VIII w czynniki Va i VIIIa, przy czym oba kofaktory w dalszym procesie prowadzą do pełnego wybuchu trombiny. Proces ten obejmuje tworzenie czynnika Xa przez czynnik IXa (w kompleksie z czynnikiem VIIIa) i zachodzi na powierzchni aktywowanych płytek. Trombina ostatecznie przekształca fibrynogen w fibrynę, co w efekcie daje utworzenie skrzepu fibrynowego. W ostatnich latach czynnik VII i czynnik tkankowy zostały uznane jako główne czynniki inicjujące krzepnięcie krwi.

Czynnik VII jest śladową glikoproteiną osocza, krążącą we krwi w postaci zymogenu o pojedynczym łańcuchu. Zymogen jest katalitycznie nieaktywny. Jednołańcuchowy czynnik VII może być przekształcony in vitro w dwułańcuchowy czynnik VIIa przez czynnik Xa, czynnik XIIa, czynnik IXa, czynnik VIIa lub trombinę. Czynnik Xa jest uważany za główny fizjologiczny aktywator czynnika VII. Podobnie jak kilka innych białek osocza zaangażowanych w hemostazę, czynnik VII potrzebuje do swojej aktywności witaminy K, która jest konieczna do gamma karboksylacji wielu reszt kwasu glutaminowego zgrupowanych przy końcu aminowym białka. Te gamma karboksylowane kwasy glutaminowe są wymagane do indukowanej jonami metalu interakcji czynnika VII z fosfolipidami. Konwersja zymogenu czynnika VII w aktywowaną dwułańcuchową cząsteczkę zachodzi przez rozszczepienie wewnętrznego wiązania peptydowego Arg152-Ile153. W obecności czynnika tkankowego, fosfolipidów i jonów wapnia, dwułańcuchowy czynnik VIIa szybko aktywuje czynnik X lub czynnik IX przez ograniczoną proteolizę.

Często potrzebne jest stymulowanie lub poprawienie kaskady krzepliwości u podmiotu. Czynnik VIIa został wykorzystany do kontroli schorzeń związanych z krwawieniem, które mają kilka przyczyn, takich jak niedobory czynników krzepnięcia (np. hemofilia A i B lub niedobór czynników krzepliwości XI lub VII) lub inhibitory czynnika krzepliwości. Czynnik VIIa zastosowano także do kontrolowania nadmiernego krwawienia występującego u podmiotów z normalnie funkcjonującą kaskadą krzepliwości krwi (brak niedoborów czynników krzepliwości lub inhibitorów przeciwko jakiemukolwiek czynnikowi krzepliwości). Takie krwawienie może być wywołane np. przez wadliwe działanie płytek, małopłytkowość lub chorobę von Willebranda. Krwawienie jest także głównym problemem związanym z operacją i innymi postaciami uszkodzenia tkanki.

Europejskie zgłoszenie patentowe nr 200,421 (ZymoGenetics) odnosi się do sekwencji nukleotydowej kodującej ludzki czynnik VII i rekombinowanej ekspresji czynnika VII w komórkach ssaków.

Dickinson i inni, (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1996)93, 14379-14384) odnosi się do wariantów czynnika VII, w których Lys157, Vall58, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 lub Lys337 zastąpiono indywidualnie Ala.

Iwanaga i inni (Thromb. Haemos. (suplement sierpień 1999), 466, skrót 1474) odnosi się do wariantów czynnika VIIa, w których reszty 316-320 usuwa się lub reszty 311-322 są zastępowane odpowiadającymi resztami z trypsyny.

Jednakże wciąż istnieje potrzeba wariantów czynnika VIIa mających aktywność koagulacyjną, wariantów o wysokiej aktywności, które można podawać we względnie niskich dawkach i wariantów, które nie powodują niepożądanych skutków ubocznych, takich jak odpowiednio układowa aktywacja systemu krzepliwości i krwawienie, związanych z konwencjonalnym leczeniem.

PL 204 888 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wariant polipeptydu czynnika VII o sekwencji SEQ ID Nr:1 zawierający podstawienie Met w pozycji 298, przy czym M298 jest zastąpiona Arg, Gln lub Asn.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, wariant polipeptydu charakteryzuje się tym, ż e aminokwas Val w pozycji 158 został zastąpiony innym aminokwasem.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku w wariancie polipeptydu aminokwas Glu w pozycji 296 jest zastąpiony innym aminokwasem.

W innym korzystnym wykonaniu wariantu polipeptydu wedł ug wynalazku, aminokwas Lys w pozycji 337 został zastąpiony innym aminokwasem.

Wariant polipeptydu według wynalazku w innym korzystnym wykonaniu, charakteryzuje się tym, że co najmniej jeden aminokwas w pozostałych pozycjach w domenie proteazy został zastąpiony innym aminokwasem.

W następnej korzystnej odmianie wariant polipeptydu według wynalazku posiada co najwyżej 20 dodatkowych aminokwasów w pozostałych pozycjach w domenie proteazy zastąpionych innymi aminokwasami.

Wariant polipeptydu według wynalazku może też mieć co najmniej jeden aminokwas odpowiadający aminokwasowi w pozycji wybranej spośród 159-170 w SEQ ID Nr:1, zastąpiony innym aminokwasem.

Wariant polipeptydu według wynalazku może też mieć co najmniej jeden aminokwas odpowiadający aminokwasowi w pozycji wybranej spośród 290-312 w SEQ ID Nr:1 zastąpiony innym aminokwasem.

Wariant polipeptydu według według wynalazku może też posiadać co najmniej jeden aminokwas odpowiadający aminokwasowi w pozycji wybranej spośród 330-339 w SEQ ID Nr:1, zastąpiony innym aminokwasem.

W przypadku gdy w wariancie polipeptydu według wynalazku Val w pozycji 158 korzystnie jest zastąpiona przez inny aminokwas to aminokwasem tym jest aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ser, Thr, Asn, Gin, Asp i Glu.

W przypadku gdy w wariancie polipeptydu wedł ug wynalazku Glu w pozycji 296 został zastą piony korzystnie przez inny aminokwas to aminokwasem tym jest aminokwas wybrany z grupy obejmującej Arg, Lys i Val.

W przypadku gdy w wariancie polipeptydu wedł ug wynalazku Lys w pozycji 337 został a zastą piona korzystnie przez inny aminokwas to aminokwasem tym jest aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp i Glu.

Bardziej korzystnie wariant polipeptydu według wynalazku stanowi M298Q-FVIIa.

Bardziej korzystnie wariant polipeptydu według wynalazku stanowi V158D/M298Q-FVIIa.

Bardziej korzystnie wariant polipeptydu według wynalazku stanowi V158T/M298Q-FVIla.

Bardziej korzystnie wariant polipeptydu według wynalazku stanowi E296V/M298Q-FVIIa.

Bardziej korzystnie wariant polipeptydu według wynalazku stanowi V158D/E296V/M298Q-FVIIa.

Bardziej korzystnie wariant polipeptydu według wynalazku stanowi V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa.

Przedmiotem wynalazku jest również konstrukcja kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą wariant polipeptyd czynnika VII jak zdefiniowano powyżej.

Konstrukcja kwasu nukleinowego według wynalazku korzystnie jest wektorem.

Przedmiotem wynalazku jest także rekombinowana komórka gospodarza zawierająca konstrukcję kwasu nukleinowego jak zdefiniowano.

Rekombinowana komórka gospodarza według wynalazku korzystnie pochodzi od ssaka.

Rekombinowana komórka gospodarza według wynalazku korzystnie może być wybrana z grupy obejmującej komórki CHO, komórki BHK lub komórki HEK.

Przedmiotem wynalazku jest także zwierzę transgeniczne nie-człowiek posiadające i wykazujące ekspresję konstrukcji kwasu nukleinowego według wynalazku jak opisano powyżej.

Kolejno, przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania wariantu polipeptydu czynnika VII, jak zdefiniowano powyżej, polegający na tym, że hoduje się komórki według wynalazku w odpowiedniej pożywce wzrostowej, w warunkach umożliwiających ekspresję konstrukcji kwasu nukleinowego, i odzyskuje się otrzymany polipeptyd z pożywki hodowlanej.

PL 204 888 B1

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera wariant polipeptydu czynnika VII o sekwencji SEQ ID Nr:1, w której co najmniej aminokwas Met w pozycji 298 został zastąpiony Arg, Gln lub Asn oraz ewentualnie, farmaceutycznie dopuszczalny noś nik.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera wariant polipeptydu według wynalazku oraz ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wariantu polipeptydu czynnika VII według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia przypadków krwawienia lub wzmacniania normalnego układu hemostatycznego.

Wynalazek zapewnia polipeptydy czynnika krzepliwości VIIa o aktywności koagulacyjnej.

W dodatkowym aspekcie, wynalazek zapewnia polipeptyd czynnika VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, przy czym dwa aminokwasy niezależnie wybrane z grupy składającej się z Lys w pozycji 157, Lys w pozycji 337, Asp w pozycji 334, Ser w pozycji 336, Val w pozycji 158, Glu w pozycji 296 i Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1, zostały zastąpione innymi aminokwasami.

W dodatkowym aspekcie, wynalazek zapewnia polipeptyd czynnika VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, przy czym trzy aminokwasy niezależnie wybrane z grupy składającej się z Lys w pozycji 157, Lys w pozycji 337, Asp w pozycji 334, Ser w pozycji 336, Val w pozycji 158, Glu w pozycji 296 i Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1, zostały zastąpione innymi aminokwasami.

W dodatkowym aspekcie, wynalazek zapewnia polipeptyd czynnika VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, przy czym cztery aminokwasy niezależnie wybrane z grupy składającej się z Lys w pozycji 157, Lys w pozycji 337, Asp w pozycji 334, Ser w pozycji 336, Val w pozycji 158, Glu w pozycji 296 i Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1, zostały zastąpione innymi aminokwasami.

W dodatkowym aspekcie, wynalazek zapewnia polipeptyd czynnika VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, przy czym pięć aminokwasów niezależnie wybranych z grupy składającej się z Lys w pozycji 157, Lys w pozycji 337, Asp w pozycji 334, Ser w pozycji 336, Val w pozycji 158, Glu w pozycji 296 i Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1, został o zastą pionych innymi aminokwasami.

W dodatkowym aspekcie, wynalazek zapewnia polipeptyd czynnika VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, przy czym sześć aminokwasów niezależnie wybranych z grupy składającej się z Lys w pozycji 157, Lys w pozycji 337, Asp w pozycji 334, Ser w pozycji 336, Val w pozycji 158, Glu w pozycji 296 i Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1, został o zastą pionych innymi aminokwasami.

W dodatkowym aspekcie, wynalazek zapewnia polipeptyd czynnika VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, przy czym aminokwasy obejmujące Lys w pozycji 157, Lys w pozycji 337, Asp w pozycji 334, Ser w pozycji 336, Val w pozycji 158, Glu w pozycji 296 i Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1, został y zastą pione innymi aminokwasami.

W dodatkowym aspekcie, wynalazek zapewnia wariant czynnika krzepliwości VII, przy czym jedna lub więcej z reszt Lys w pozycji 157, oraz reszta Lys w pozycji 337, oraz reszta Asp w pozycji 334, oraz reszta Ser w pozycji 336, oraz reszta Val w pozycji 158, oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1, została (zostały) zastąpione inną resztą aminokwasową, które mogą być kodowane przez konstrukcje kwasu nukleinowego i ewentualnie, w których jedna lub więcej dodatkowych reszt aminokwasowych w pozostałych pozycjach w domenie proteazy, zostały zastąpione inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego; pod warunkiem, że wariantem nie jest FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) lub FVII(Ala298).

Określenie „FVII(Ala157)”, jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza wariant czynnika krzepliwości VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, w których Lys w pozycji 157 SEQ ID Nr:1 została zastąpiona alaniną. To określenie nie obejmuje np. wariantów czynnika krzepliwości VII, w którym dwa lub więcej aminokwasów w pozycjach z SEQ ID Nr:1 zostało zastąpionych innymi aminokwasami.

Określenie „FVII(Ala337)”, jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza wariant czynnika krzepliwości VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, w którym Lys w pozycji 337 z SEQ ID Nr:1 została zastąpiona alaniną. To określenie nie obejmuje np. wariantów czynnika krzepliwości VII, w których dwa lub więcej aminokwasów w pozycjach z SEQ ID Nr:1 zostało zastąpionych innymi aminokwasami.

Określenie „FVII(Ala334)”, jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza wariant czynnika krzepliwości VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, w którym Asp w pozycji 334 z SEQ ID Nr:1 został zastąpiony alaniną. To określenie nie obejmuje np. wariantów czynnika krzepliwości VII, w których dwa lub więcej aminokwasów w pozycjach z SEQ ID Nr:1 zostało zastąpionych innymi aminokwasami.

Określenie „FVII(Ala336)”, jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza wariant czynnika krzepliwości VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, w którym Ser w pozycji 336 SEQ ID Nr:1 została zastąpiona

PL 204 888 B1 alaniną. To określenie nie obejmuje np. wariantów czynnika krzepliwości VII, w których dwa lub więcej aminokwasów w pozycjach z SEQ ID Nr:1 zostało zastąpionych innymi aminokwasami.

Określenie „FVII(Ala158)”, jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza wariant czynnika krzepliwości VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, w którym Val w pozycji 158 SEQ ID Nr:1 została zastąpiona alaniną. To określenie nie obejmuje np. wariantów czynnika krzepliwości VII, w którym dwa lub więcej aminokwasów w pozycjach z SEQ ID Nr:1 zostało zastąpionych innymi aminokwasami.

Określenie „FVII(Ala296)”, jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza wariant czynnika krzepliwości VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, w którym Glu w pozycji 296 z SEQ ID Nr:1 została zastąpiona alaniną. To określenie nie obejmuje np. wariantów czynnika krzepliwości VII, w których dwa lub więcej aminokwasów w pozycjach z SEQ ID Nr:1 zostało zastąpionych innymi aminokwasami.

Określenie „FVII(Ala298)”, jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza wariant czynnika krzepliwości VII z sekwencją z SEQ ID Nr:1, w którym Met w pozycji 298 z SEQ ID Nr:1 została zastąpiona alaniną. To określenie nie obejmuje np. wariantów czynnika krzepliwości VII, w których dwa lub więcej aminokwasów w pozycjach z SEQ ID Nr:1 zostało zastąpionych innymi aminokwasami.

W dodatkowym aspekcie, wynalazek odnosi się do konstrukcji kwasu nukleinowego kodujących polipeptyd czynnika VII według wynalazku.

Przy wykorzystaniu wariantu polipeptydu według wynalazku można wdrożyć leczenie przypadków krwawienia u podmiotu lub wzmocnienia normalnego układu hemostatycznego, przy czym leczenie to obejmuje podawanie terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości polipeptydu wariantu czynnika VII.

W dodatkowym aspektem wynalazku jest moż liwość leczenia lub profilaktyki schorze ń przebiegających z krwawieniem u podmiotu lub wzmacniania normalnego układu hemostatycznego, przy czym sposób obejmuje podawanie terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości warianta czynnika krzepliwości VII według wynalazku.

Stosunek między aktywności warianta według wynalazku i aktywnością natywnego polipeptydu czynnika VII ukazanego w SEQ ID Nr:1 wynosi co najmniej około 1,25 po przetestowaniu w „Próbie hydrolizy in vitro” określonej w niniejszym opisie. W innej postaci, stosunek wynosi co najmniej około 2,0; w innej postaci, co najmniej okoł o 4,0.

W korzystnej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym aminokwas odpowiadający Val w pozycji 158 w SEQ ID Nr:1 został zastąpiony innym aminokwasem.

W korzystnej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym aminokwas odpowiadający Glu w pozycji 296 w SEQ ID Nr:1 został zastąpiony innym aminokwasem.

W korzystnej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym aminokwas odpowiadający Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1 został zastąpiony innym aminokwasem.

W korzystnej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym co najmniej jeden aminokwas w pozostałych pozycjach w domenie proteazy został zastąpiony innym aminokwasem.

W korzystnej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym najwyżej 20 dodatkowych aminokwasów w pozostałych pozycjach w domenie proteazy zostało zastąpionych innymi aminokwasami.

W korzystnej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym co najmniej jeden aminokwas odpowiadający aminokwasowi w pozycji wybranej spośród 159-170 z SEQ ID Nr:1 został zastąpiony innym aminokwasem.

W korzystnej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym co najmniej jeden aminokwas odpowiadający aminokwasowi w pozycji wybranej spośród 290-312 z SEQ ID Nr:1 został zastąpiony innym aminokwasem.

W korzystnej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym co najmniej jeden aminokwas odpowiadający aminokwasowi w pozycji wybranej spośród 330-339 z SEQ ID Nr:1 został zastąpiony innym aminokwasem.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym wymieniona Lys w pozycji 157 w SEQ ID Nr:1 została zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp i Glu.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym wymieniona Lys w pozycji 337 w SEQ ID Nr:1 została zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp i Glu.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym wymieniony Asp w pozycji 334 w SEQ ID Nr:1 został zastąpiony przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Gly i Glu.

PL 204 888 B1

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym wymieniona Ser w pozycji 336 w SEQ ID Nr:1 została zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Gly i Glu.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym wymieniona Val w pozycji 158 w SEQ ID Nr:1 została zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ser, Thr, Asn, Gln, Asp i Glu.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym wymieniona Glu w pozycji 296 w SEQ ID Nr:1 został zastąpiony przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Arg, Lys i Val.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym wymieniona Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1 została zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Lys, Arg, Gln i Asn.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym aminokwas został zastąpiony innym aminokwasem, który może być kodowany przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym wymienionym polipeptydem czynnika VII jest ludzki czynnik VII.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd, w którym wymienionym polipeptydem czynnika VII jest ludzki czynnik VIIa.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd niezależ nie wybrany z grupy obejmującej [E296V]-FVII, [M298Q]-FVII i [S336G]-FVII.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest polipeptyd niezależnie wybrany z grupy obejmującej [V158T/M298Q]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII, [V158D/E296V1-FVII, [V158D/M298Q]-FVII i [V158D/M298K]-FVII.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest [V158D/E296V/M298Q]-FVII.

W dodatkowej postaci wynalazku, polipeptydem czynnika VII jest [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII.

W dodatkowej postaci, wariantami czynnika VII są warianty, w których jedna lub więcej z reszt Lys w pozycji 157 oraz reszta Lys w pozycji 337, oraz reszta Asp w pozycji 334, oraz reszta Ser w pozycji 336, oraz reszta Val w pozycji 158, oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego i gdzie ewentualnie, jedna lub więcej dodatkowych reszt aminokwasowych pozostałych pozycjach w domenie proteazy została zastąpiona inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego; pod warunkiem, że wariantem nie jest FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) ani FVII(Ala298).

W jednej postaci, wariantami czynnika VII są warianty, w których jedna lub więcej z reszt Lys w pozycji 157 oraz reszta Lys w pozycji 337, oraz reszta Asp w pozycji 334, oraz reszta Ser w pozycji 336, oraz reszta Val w pozycji 158, oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego; pod warunkiem, że wariantem nie jest FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) ani FVII(Ala298).

W dodatkowej postaci, jedna lub więcej z reszt Lys w pozycji 157 oraz reszta Lys w pozycji 337 SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, jedna lub wi ę cej z reszt Lys w pozycji 157 oraz reszta Val w pozycji 158, oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, Lys residue w pozycji 157 i jedna lub więcej reszt Val w pozycji 158 oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, jedna lub wi ę cej z reszt Lys w pozycji 157 oraz reszta Asp w pozycji 334 oraz reszta Ser w pozycji 336 SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, Lys residue w pozycji 157 i jedna lub wię cej reszt Asp w pozycji 334 oraz reszta Ser w pozycji 336 w SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

PL 204 888 B1

W dodatkowej postaci, jedna lub wię cej z reszt Lys w pozycji 337 oraz reszta Val w pozycji 158 oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 SEQ ID Nr: 1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, Lys residue w pozycji 337 i jedna lub wię cej reszt Val w pozycji 158 oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, jedna lub wi ę cej z reszt Lys w pozycji 337 oraz reszta Asp w pozycji 334 oraz reszta Ser w pozycji 336 SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, Lys residue w pozycji 337 i jedna lub wię cej reszt Asp w pozycji 334 oraz reszta Ser w pozycji 336 w SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, jedna lub wię cej reszt Val w pozycji 158 oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 i jedna lub więcej reszt Asp w pozycji 334 oraz reszta Ser w pozycji 336 w SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która moż e być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, reszta Lys w pozycji 157 SEQ ID Nr:1 została zastą piona inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, reszta Lys w pozycji 337 SEQ ID Nr:1 została zastą piona inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, jedna lub wię cej reszt Val w pozycji 158 oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 w SEQ ID Nr: 1 została(y) zastą piona(e) inną resztą aminokwasową , która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, jedna lub wię cej reszt Asp w pozycji 334 oraz reszta Ser w pozycji 336 w SEQ ID Nr:1 została(y) zastąpiona(e) inną resztą aminokwasową, która moż e być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego.

W dodatkowej postaci, reszta Lys w pozycji 157 została zastąpiona przez Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp lub Glu; i/lub reszta Lys w pozycji 337 została zastąpiona przez Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp lub Glu; i/lub reszta Val w pozycji 158 została zastąpiona przez Ser, Thr, Asn, Gln, Asp lub Glu; i/lub reszta Glu w pozycji 296 została zastąpiona przez Arg, Lys lub Val; i/lub reszta Met w pozycji 298 została zastąpiona przez Arg, Lys, Gln lub Asn; i/lub reszta Asp w pozycji 334 została zastąpiona przez Glu; i/lub reszta Ser w pozycji 336 została zastąpiona przez Gly.

W dodatkowej postaci reszta Lys w pozycji 157 albo reszta Lys w pozycji 337 albo reszta Asp w pozycji 334 albo reszta Ser w pozycji 336 jest jedyną resztą aminokwasową, która została zastąpiona.

W dodatkowej postaci, reszta Val w pozycji 158 oraz reszta Glu w pozycji 296 i reszta Met w pozycji 298 są jedynymi resztami aminokwasowymi, które został y zastą pione.

W dodatkowej postaci, stosunek między aktywności warianta według wynalazku i aktywnością natywnego polipeptydu czynnika VII ukazanego w SEQ ID Nr:1 wynosi co najmniej około 1,25 po przetestowaniu w „Próbie hydrolizy in vitro” określonej w niniejszym. W innej postaci, stosunek wynosi co najmniej około 2,0; w innej postaci, co najmniej około 4,0.

W dodatkowej postaci, reszta Gln w pozycji 312 w domenie proteazy nie został a zastą piona.

W dodatkowej postaci, rekombinowana komórka gospodarza pochodzi od ssaka. W innej postaci, komórka jest wybrana z grupy obejmującej komórki CHO, komórki BHK lub komórki HEK.

W dodatkowej postaci, najwyż ej 20 dodatkowych reszt aminokwasowych w pozostał ych pozycjach w domenie proteazy (pozycje 153-406) zostały zastąpione. W jednej postaci, najwyżej 15 dodatkowych reszt aminokwasowych jest zastąpionych; w innej postaci, zastąpionych jest najwyżej 10 reszt aminokwasowych; w innej postaci, zastąpionych jest najwyżej 5 reszt aminokwasowych.

W dodatkowej postaci, jedna lub więcej reszt aminokwasowych w pozycjach 157, 337, 158, 296, 298, 334, lub 336 jest/są jedyną resztą(ami), która(e) zostały zastąpione.

W dodatkowej postaci, jedna lub obie reszty Lys w pozycji 157 i w pozycji 337 została(y) zastąpione obojętną resztą aminokwasową, lub jedna z reszt została zastąpiona przez ujemnie naładowaną resztę aminokwasową, lub jedna reszta Lys została zastąpiona przez obojętną resztę aminokwasową i jedna reszta Lys została zastąpiona przez ujemnie naładowaną resztę aminokwasową.

W dodatkowej postaci, jedna lub obie reszty Asp w pozycji 334 oraz reszta Ser w pozycji 336 została(y) zastąpiona przez resztę aminokwasową zdolną do utworzenia wiązań wodorowych i/lub

PL 204 888 B1 zdolną do utworzenia mostka solnego, lub jedna albo obie reszty są zastąpione przez małą resztę aminokwasową.

W dodatkowej postaci, reszta Lys w pozycji 157 i/lub reszta Lys w pozycji 337 jest/są jedyną resztą(ami), która(e) została(y) zastąpiona(e). W jednej postaci, reszta Lys w pozycji 157 została zastąpiona. W innej postaci, reszta Lys w pozycji 337 została zastąpiona.

W dodatkowej postaci, reszta Val w pozycji 158 i/lub reszta Met w pozycji 298 jest/są jedyną resztą(ami) aminokwasową, która(e) została(y) zastąpiona(e).

W dodatkowej postaci, reszta Asp w pozycji 334 i/lub reszta Ser w pozycji 336 jest/są jedyną resztą(ami), która(e) została(y) zastąpiona(e).

W dodatkowej postaci, reszta Lys w pozycji 157 został a zastą piona przez resztę aminokwasową wybraną z listy Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp i Gln. W innej postaci, reszta Lys w pozycji 157 został a zastą piona przez resztę aminokwasow ą wybraną z grupy obejmującej Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp i Glu.

W dodatkowej postaci, reszta Lys w pozycji 337 został a zastą piona przez resztę aminokwasową wybraną z listy Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp lub Gln. W innej postaci, reszta Lys w pozycji 337 została zastąpiona przez Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp lub Glu.

W dodatkowej postaci, reszta Val w pozycji 158 został a zastą piona przez resztę aminokwasową wybraną z listy Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp i Gln. W dodatkowej postaci, reszta Val w pozycji 158 został a zastą piona przez resztę aminokwasową wybraną z grupy obejmującej Ser, Thr, Asn, Gln, Asp i Glu.

W dodatkowej postaci, reszta Glu w pozycji 296 została zastą piona przez resztę aminokwasową wybraną z listy Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Asp lub Gln. W dodatkowej postaci, reszta została zastąpiona przez Arg, Lys lub Val.

W dodatkowej postaci, reszta Met w pozycji 298 został a zastą piona przez resztę aminokwasową wybraną z listy Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Glu, Asp lub Gln. W innej postaci, reszta została zastąpiona przez Lys, Arg, Gln lub Asn.

W dodatkowej postaci, reszta Asp w pozycji 334 został a zastą piona przez Gly i Glu.

W dodatkowej postaci, reszta Ser w pozycji 336 została zastą piona przez Gly i Glu.

W dodatkowej postaci wynalazku stosunek między aktywnością warianta i aktywnością natywnego polipeptydu czynnika VII ukazanego w SEQ ID Nr:1, wynosi co najmniej około 1,25 po przetestowaniu w „Próbie hydrolizy in vitro” określonej w niniejszym (przykład 11). W innej postaci, stosunek wynosi co najmniej około 2,0; w jeszcze innej postaci, co najmniej około 4,0.

W dodatkowym aspekcie, wynalazek zapewnia warianty FVIIa o zwiększonej aktywności niezależnej od czynnika tkankowego w porównaniu z natywnym FVIIa. W jednej jego postaci, zwiększonej aktywności nie towarzyszą zmiany specyficzności substratowej. W jednej postaci, wiązanie wariantów z czynnikiem tkankowym nie jest zakłócone (w porównaniu z dzikiego typu FVIIa); w innej postaci, warianty po związaniu z czynnikiem tkankowym mają co najmniej taką aktywność jak dzikiego typu FVIIa.

W dodatkowej postaci, warianty czynnika VII, oprócz już wykonanych zmian aminokwasów w pozycjach 157, 158, 296, 298, 334, 336 lub 337 i ewentualnych zmian aminokwasów w innym miejscu w domenie proteazy, posiadają także pewne zmiany reszt aminokwasowych w N-terminalnej domenie Gla (reszty 1-37). W jednej postaci, jedna lub więcej reszt aminokwasowych w pozycjach 10 i 32 (w odniesieniu do SEQ ID Nr:1) w czynniku VII, zastą pionych jest drugą resztą aminokwasową , która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego. W jednej postaci, reszta aminokwasową Pro w pozycji 10 jest zastępowana przez Gln, Arg, His, Gin, Asn lub Lys; i/lub reszta aminokwasową Lys w pozycji 32 jest zastępowana przez Glu, Gln lub Asn.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 ukazuje pełną sekwencję aminokwasową natywnego ludzkiego czynnika krzepliwości VII (SEQ ID Nr:1).

W niniejszym wykazie, aminokwasy przedstawia się stosują c skróty, jak zaznaczono w tablicy 1, dopuszczone przez IUPAC-1UB Commission on Biochemical Nomenclature (CBN). Aminokwasy i inne mające izomery przedstawiane nazwą lub następującymi skrótami, są naturalnymi formami L chyba, że zaznaczono inaczej. Dodatkowo, lewe i prawe końce sekwencji aminokwasowej peptydu oznaczają odpowiednio, koniec N- i C- chyba, że zaznaczono inaczej.

PL 204 888 B1

T a b l i c a 1: Skróty dla aminokwasów:

Aminokwas	Kod trzyliterowy	Kod jednoliterowy
Glicyna	Gly	G
Prolina	Pro	P
Alanina	Ala	A
Walina	Val	V
Leucyna	Leu	L
Izoleucyna	Ile	I
Metionina	Met	M
Cysteina	Cys	C
Fenyloalanina	Phe	F
Tyrozyna	Tyr	Y
Tryptofan	Trp	W
Histydyna	His	H
Lizyna	Lys	K
Arginina	Arg	R
Glutamina	Gln	Q
Asparagina	Asn	N
Kwas glutaminowy	Glu	E
Kwas asparaginowy	Asp	D
Seryna	Ser	S
Treonina	Thr	T

Odkryto obecnie, że warianty FVIIa, w których co najmniej jedna z reszt aminokwasowych Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 lub Lys337 (i ewentualnie jedna lub więcej innych reszt) jest zastąpiona inną resztą aminokwasową, mają aktywność koagulacyjną.

Reszty znajdują się w obszarze uważanym za mający wpływ na insercję końca aminowego domeny proteazy i przez to na tworzenie katalitycznie aktywnej konformacji czynnika VIIa, który jest niezależny od mostka solnego między terminalną grupą aminową Ile153 i bocznym łańcuchem Asp343. Zmiany mogą usunąć odpychanie elektrostatyczne, dodać wiązania wodorowe lub w inny sposób ułatwić insercję końca aminowego.

Z powodu wyż szej naturalnej aktywnoś ci opisywanego warianta czynnika VIIa w porównaniu z natywnym FVIIa, przewiduje się , ż e do uzyskania funkcjonalnie adekwatnego stężenia w miejscu działania wystarczająca będzie niższa dawka, a więc możliwe będzie podawanie niższej dawki podmiotowi z przypadkami krwawień lub potrzebującemu wzmocnienia normalnego układu hemostatycznego.

Jak omówiono w skrócie powyżej, niniejsi wynalazcy zakładają, że przez zastąpienie jednej lub więcej reszt Lys w pozycji 157 oraz reszty Lys w pozycji 337, oraz reszty Val w pozycji 158, oraz reszty Glu w pozycji 296 i reszty Met w pozycji 298, oraz reszty Asp w pozycji 334, oraz reszty Ser w pozycji 336, czynnik VIIa będzie spontanicznie osiągać bardziej aktywną konformację, która normalnie musi być indukowana przez czynnik tkankowy. Takie warianty czynnika VIIa wykazują naturalną aktywność, która może być terapeutycznie użyteczna w sytuacjach, gdzie aktywność prokoagulacyjna jest niezależna od czynnika tkankowego (tworzenie czynnika Xa na powierzchni płytek), tak jak np. gdy podaje się wysokie dawki NovoSeven®.

Zastąpienie dodatkowych reszt aminokwasowych w domenie proteazy może, oprócz efektu uzyskanego przez zastąpienie jednej lub więcej reszt Lys w pozycji 157 oraz reszty Lys w pozycji 337,

PL 204 888 B1 oraz reszty Val w pozycji 158, oraz reszty Glu w pozycji 296, i reszty Met w pozycji 298, oraz reszty Asp w pozycji 334, oraz reszty Ser w pozycji 336, dodatkowo uł atwić tworzenie aktywnej konformacji czą steczki. Uważa się jednak, że najwyraźniejsze efekty będą widoczne gdy wyżej wymienione mutacje przeprowadzi się w sąsiedztwie (sekwencyjnym lub trójwymiarowym) tych siedmiu reszt.

Zastąpienie kilku reszt aminokwasowych w N-temninalnej domenie Gla (reszty 1-37) czynnika VII może zapewnić białko o znacznie wyższym powinowactwie do fosfolipidów błonowych, takich jak fosfolipidy błonowe komórek niosących czynnik tkankowy lub płytek. Tak więc, warianty czynnika VII wymienionej wyżej mogą, oprócz już przeprowadzonych zmian aminokwasów w pozycjach 157, 158, 296, 298, 334, 336 lub 337 oraz ewentualnych zmian aminokwasów w innym miejscu w domenie proteazy, posiadać także pewne zmiany aminokwasów w N-terminalnej domenie Gla, uzyskując przez to białko posiadające zwiększoną aktywność jak również zwiększone powinowactwo do fosfolipidów błonowych w porównaniu z natywnym czynnikiem VII. Korzystnie, reszty aminokwasowe w pozycjach 10 i 32 (w odniesieniu do SEQ ID Nr:l) czynnika VII można zastąpić inną resztą aminokwasową, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego. Przykładami przytaczanych reszt aminokwasowych, które można wprowadzić w wyżej wymienione pozycje są:

Reszta aminokwasową Pro w pozycji 10 jest zastąpiona przez Gln, Arg, His, Gln, Asn lub Lys, i/lub reszta aminokwasową Lys w pozycji 32 jest zastąpiona przez Glu, Gln lub Asn.

Inne reszty w domenie Gla, na podstawie różnych powinowactw do fosfolipidów oraz sekwencje białek osocza zależnych od witaminy K, można także brać pod uwagę przy zamianie.

W niniejszym kontekś cie trzyliterowe oznaczenia aminokwasów zastosowano w ich zwykł ym znaczeniu. O ile nie zaznaczono wyraźnie inaczej, aminokwasami wymienionymi w niniejszym opisie są L-aminokwasy.

Określenie „N-terminalna domena GLA” oznacza sekwencję aminokwasową 1-37 FVII.

Określenie „domena protezy” oznacza sekwencję aminokwasową 153-406 FVII (łańcuch ciężki FVIIa).

Trzyliterowy skrót „GLA” oznacza kwas 4-karboksyglutaminowy (γ-karboksyglutaminian).

Określenie „obojętna reszta aminokwasowa” (przy pH 6-8) obejmuje w zamierzeniu aminokwasy wybrane z listy Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln.

Określenie „mały aminokwas” obejmuje w zamierzeniu aminokwasy wybranej spośród Gly, Glu i Ala.

Określenie „ujemnie naładowana reszta aminokwasowi” (przy pH 6-8) obejmuje w zamierzeniu aminokwasy wybrane spośród Asp i Glu.

Określenie „polipeptyd czynnika VII” jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza każde białko obejmujące sekwencję aminokwasową 1-406 natywnego ludzkiego czynnika VII (SEQ ID Nr: 1) lub jego warianty. Obejmuje to, lecz nie ograniczając się, ludzki czynnik VII, ludzki czynnik VIIa i jego warianty.

Określenie „czynnik VII” jaki stosuje się w niniejszym opisie obejmuje w zamierzeniu nieaktywną jednołańcuchową zymogenową cząsteczkę czynnika VII, jak również aktywowaną dwułańcuchową cząsteczkę czynnika VII (czynnik VIIa). Obejmuje to białka, które mają sekwencję aminokwasową 1-406 natywnego ludzkiego czynnika VII lub czynnika VIIa. Obejmuje to także białka z delikatnie zmodyfikowaną sekwencją aminokwasową np. modyfikowanym końcem N, włączając N-terminalne delecje lub addycje aminokwasowe, na tyle aby białka te zasadniczo zachowały aktywność czynnika VIIa. Określenie „czynnik VIIa”, lub „FVIIa” jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza produkt składający się z aktywowanej formy (czynnik VIIa). „Czynnik VII” lub „czynnik VIIa” w powyższych definicjach, obejmuje także naturalne odmiany alleliczne, jakie mogą istnieć i pojawiać się wśród osobników. Również stopień i miejsce glikozylacji lub innych modyfikacji potranslacyjnych mogą się zmieniać w zależności od wybranej komórki gospodarza i charakteru środowiska komórki gospodarza.

Określenia „wariant” lub „warianty”, jaki stosuje się w niniejszym opisie, oznacza w zamierzeniu czynnik VII posiadający sekwencję SEQ ID Nr:1, w której jeden lub więcej aminokwasów rodzicielskiego białka podstawiono innym aminokwasem i/lub w której jeden lub więcej aminokwasów białka rodzicielskiego usunięto, i/lub w której do białka wprowadzono jeden lub więcej aminokwasów, i/lub w której do białka rodzicielskiego dodano jeden lub więcej aminokwasów. Taka addycja może mieć miejsce albo na końcu N albo na końcu C białka rodzicielskiego albo na obu. „Wariant” lub „warianty” w tej definicji, mają aktywność FVII w formie jego aktywowanej dwułańcuchowej cząsteczki. W jednej postaci, wariant jest w 65% identyczny z sekwencją z SEQ ID Nr:1. W jednej postaci wariant jest w 80% identyczny z sekwencją z SEQ ID Nr:1. W innej postaci wariant jest w 90% identyczny z sekwencją z SEQ ID Nr:1. W dodatkowej postaci wariant jest w 95% identyczny z sekwencją z SEQ ID Nr:1.

PL 204 888 B1

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „konstrukcja kwasu nukleinowego” oznacza w zamierzeniu każdą cząsteczkę kwasu nukleinowego cDNA, genomowego DNA, syntetycznego DNA, półsyntetycznego DNA, pochodzenia RNA lub pochodzenia mieszanego. Określenie „konstrukcja” oznacza w zamierzeniu segment kwasu nukleinowego, mogący mieć pojedynczą lub podwójną nić, i który może być bazować na pełnej lub częściowej naturalnie występującej sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Konstrukcja może ewentualnie zawierać inne segmenty kwasu nukleinowego. Podobnie, określenie „reszta aminokwasowa, która może być kodowana przez konstrukcje kwasu nukleinowego” pokrywa reszty aminokwasowe, które mogą być kodowane przez konstrukcje kwasu nukleinowego określone powyżej, to znaczy aminokwasy, takie jak Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp i Gln.

Określenie „inny aminokwas” jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza aminokwasy, które są inne niż aminokwas naturalnie występujący w tej pozycji. Obejmują one lecz bez ograniczenia, aminokwasy, które mogą być kodowane przez konstrukcję kwasu nukleinowego. Korzystnie, Inny aminokwas występuje w formie L i może być kodowany przez konstrukcję kwasu nukleinowego. Konkretnym przykładem jest L-cysteina (Cys).

W niniejszym kontekś cie, okreś lenie „leczenie” obejmuje zarówno zapobieganie przewidywanemu krwawieniu, takiemu jak zabieg chirurgiczny, jak i regulację już zaistniałego krwawienia, tak jak przy urazie, w celu zahamowania lub zminimalizowania krwawienia. Profilaktyczne podawanie warianta czynnika VIIa według wynalazku jest więc zawarte w określeniu „leczenie”.

Określenie „aktywność” jakie stosuje się w niniejszym opisie, oznacza zdolność polipeptydu czynnika VII lub jego warianta do przekształcenia swego substratu, czynnika X, w aktywny czynnik Xa. Aktywność polipeptydu czynnika VII można mierzyć za pomocą „Próby proteolizy in vitro”. Określenie „naturalna aktywność” obejmuje także zdolność do tworzenia trombiny na powierzchni aktywowanych płytek przy nieobecności czynnika tkankowego.

Określenie „wzmocnienie normalnego układu hemostatycznego” oznacza wzmocnienie zdolności do tworzenia trombiny.

Jak stosuje się w niniejszym opisie, określenie „schorzenie obejmujące krwawienie” odzwierciedla każdy defekt, wrodzony, nabyty lub indukowany, pochodzenia komórkowego lub cząsteczkowego, który przejawia się krwawieniami. Przykładami są niedobory czynników krzepliwości (np. hemofilia A i B lub niedobór czynników krzepliwości XI lub VII), inhibitory czynników krzepliwości, wadliwe działanie płytek, małopłytkowość lub choroba von Willebranda.

Określenie „przypadki krwawienia” obejmują niekontrolowane i nadmierne krwawienie, które stanowi główny problem zarówno w związku z operacją jak i innymi postaciami uszkodzenia tkanki. Niekontrolowane i nadmierne krwawienie może występować u podmiotów mających normalny układ krzepliwości i podmiotów mających schorzenia związane z krzepliwością lub krwawieniem. Niedobory czynnika krzepliwości (hemofilia A i B, niedobór czynnika krzepliwości XI lub VII) czy inhibitory czynników krzepliwości, mogą być powodem przypadków krwawień. Nadmierne krwawienie występuje także u podmiotów z normalnie funkcjonując ą kaskadą krzepliwoś ci krwi (brak niedoborów czynników krzepliwości lub inhibitorów przeciwko któremukolwiek z czynników krzepliwości) i może być powodowane przez wadliwe funkcjonowanie płytek, małopłytkowość lub chorobę von Willebranda. W takich przypadkach, krwawienia mogą być upodobnione do krwawień powodowanych przez hemofilię, ponieważ układ hemostatyczny, jak przy hemofilii, nie posiada lub ma nieprawidłowe zasadnicze „składniki” krzepliwości (takie jak płytki czy białka czynnika von Willebranda) co wywołuje większe krwawienie. U podmiotów, którzy doświadczają rozległ ego uszkodzenia tkanki w związku z operacją lub wielkim urazem, normalny mechanizm hemostatyczny może być przeciążony koniecznością pilnej hemostazy i mogą oni wywołać krwawienie mimo normalnego mechanizmu hemostatycznego. Uzyskanie zadowalającej hemostazy jest także problemem jeśli krwawienia mają miejsce w narządach takich jak mózg, region ucha wewnętrznego i oczu, przy ograniczonej możliwości homeostazy chirurgicznej. Ten sam problem może powstać w procesie pobierania biopsji z różnych narządów (wątroby, płuca, tkanki nowotworowej, przewodu pokarmowego) jak również przy chirurgii laparoskopowej. Cechą wspólną tych wszystkich sytuacji jest trudność zapewnienia homeostazy technikami chirurgicznymi (szwy, klamry, itd.), co również ma miejsce w przypadku gdy krwawienie jest rozległe (krwotoczne zapalenie żołądka i obfite krwawienie z macicy). Ostre i obfite krwawienia mogą także zachodzić u podmiotów w czasie terapii przeciwzakrzepowej, u których niedostateczna hemostaza został a indukowana przez daną terapię. Takie podmioty mogą potrzebować interwencji chirurgicznej w przypadku, gdy efekt przeciwzakrzepowy wystąpił gwałtownie. Radykalna prostatektomia załonowa jest powszechnie stosowaną

PL 204 888 B1 procedurą u podmiotów ze zlokalizowanym rakiem prostaty. Operację często komplikuje znacząca i czasem bardzo duża utrata krwi. Znacząca utrata krwi podczas prostatektomii związana jest głównie ze skomplikowaną sytuacją anatomiczną, z różnymi gęsto unaczynionymi miejscami, które nie są łatwo dostępne dla hemostazy chirurgicznej, i które mogą być przyczyną rozlanego krwawienia na wielkim obszarze. Inną sytuacją, która może sprawiać problemy w przypadku niezadawalającej hemostazy jest gdy podmiotom z normalnym mechanizmem hemostatycznym podaje się terapię przeciwzakrzepową aby zapobiec chorobie zakrzepowej. Taka terapia może obejmować heparynę, inne postacie proteoglikanów, warfarynę lub inne postacie antagonistów witaminy K, jak również aspirynę i inne inhibitory agregacji płytek.

W jednej postaci wynalazku, krwawienie jest związane z hemofilią. W innej postaci, krwawienie jest związane z hemofilią z nabytymi inhibitorami. W innej postaci, krwawienie jest związane z hemofilią z nabytymi inhibitorami. W innej postaci, krwawienie jest związane z małopłytkowością. W innej postaci, krwawienie jest związane z chorobą von Willebranda. W innej postaci, krwawienie jest związane z ciężkim uszkodzeniem tkanki. W innej postaci, krwawienie jest związane z ciężkim urazem. W innej postaci, krwawienie jest związane z operacją. W innej postaci, krwawienie jest związane z operacją laparoskopową. W innej postaci, krwawienie jest związane z krwotocznym zapaleniem żołądka. W innej postaci, krwawieniem jest obfite krwawienie z macicy. W innej postaci, krwawienie występuje w narządach o ograniczonej możliwości zastosowania hemostazy mechanicznej. W innej postaci, krwawienie występuje w mózgu, regionie ucha wewnętrznego lub oczu. W innej postaci, krwawienie jest związane z procesem pobierania biopsji. W innej postaci, krwawienie jest związane z terapią przeciwzakrzepową.

Określenie „podmiot” jaki stosuje się w niniejszym opisie oznacza każde zwierzę, w szczególności ssaka, takie jak człowieka, i może być, jeśli trzeba, stosowane wymiennie z określeniem „pacjent”.

Jak stosuje się w niniejszym opisie określenie „odpowiednia pożywka wzrostowa” oznacza pożywkę zawierającą składniki odżywcze i inne składniki konieczne do wzrostu komórek i ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego kodującego wariant czynnika VII według wynalazku.

Wytwarzanie wariantów czynnika VII

Warianty czynnika VII opisane w niniejszym opisie można wytworzyć za pomocą technik rekombinacji kwasu nukleinowego. Ogólnie, klonowaną sekwencję kwasu nukleinowego dzikiego typu czynnika VII modyfikuje się tak, aby kodowała żądane białko. Następnie tę zmodyfikowaną sekwencję wprowadza się do wektora ekspresji, który kolejno transformuje się lub transfekuje do komórek gospodarza. Wyższe komórki eukariotyczne, w szczególności hodowane komórki ssaków, są najkorzystniejsze jako komórki gospodarza. Pełne sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe dla ludzkiego czynnika VII, są znane (zobacz U.S. 4 784 950, gdzie opisany jest kloning i ekspresja rekombinowanego ludzkiego czynnika VII). Sekwencja bydlęcego czynnika VII jest opisana u Takeya i innych, J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988)).

Zmian w sekwencji aminokwasowej można dokonać rozmaitymi technikami. Modyfikacji sekwencji kwasu nukleinowego można dokonać przez miejscowo skierowaną mutagenezę. Techniki miejscowo skierowanej mutagenezy są dobrze znane w obecnym stanie techniki i są opisane np. w Zoller i Smith (DNA 3:479-488, 1984) lub „Splicing by extension overlap”, Horton i inni, Gene 77.1989, strony 61-68. Tak więc, wykorzystując sekwencję nukleotydową i aminokwasową czynnika VII, można wprowadzić wybraną(e) zmianę(y). Podobnie, procedury wytwarzania konstrukcji DNA przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy za pomocą specyficznych starterów, są dobrze znane osobom wykwalifikowanym (porównaj PCR Protocols. 1990, Academic Press, San Diego, California, USA).

Konstrukcja kwasu nukleinowego kodująca wariant czynnika VII według wynalazku może być odpowiednio pochodzenia genomowego lub cDNA, np. otrzymana przez sporządzenie biblioteki genomowego lub cDNA i przesiew pod względem sekwencji DNA kodujących całość lub część polipeptydu, przez hybrydyzację przy użyciu syntetycznych sond oligonukleotydowych, zgodnie ze standardowymi technikami (porównaj Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2-gie wydanie, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Konstrukcja kwasu nukleinowego kodująca wariant czynnika VII może być także wykonana syntetycznie ustalonymi standardowymi metodami, np. metodą fosfoamidynową opisaną przez Beaucage i Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 -1869, lub metodą opisaną przez Matthes i inni, EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805. Zgodnie z metodą fosfoamidynową, oligonukleotydy syntetyzuje się np. w automatycznym syntezatorze DNA, oczyszcza, wygrzewa, łączy i klonuje w odpowiednich wektorach.

Ponadto, konstrukcje kwasu nukleinowego mogą być pochodzenia mieszanego syntetycznego i genomowego, mieszanego syntetycznego i cDNA lub mieszanego genomowego i cDNA wytworzone

PL 204 888 B1 prze łączenie fragmentów pochodzenia syntetycznego, genomowego lub cDNA (jak potrzeba), przy czym fragmenty odpowiadają różnym częściom całej konstrukcji kwasu nukleinowego, zgodnie ze standardowymi technikami.

Konstrukcją kwasu nukleinowego jest korzystnie konstrukcja DNA.

Sekwencje DNA wykorzystywane przy wytwarzaniu warianta czynnika VII według niniejszego wynalazku, będą zwykle kodować polipeptyd w postaci pre-pro na końcu aminowym czynnika VII aby uzyskać odpowiednią obróbkę potranslacyjną (np. gamma-karboksylację reszt kwasu glutaminowego) i wydzielenie z komórki gospodarza. Polipeptyd w postaci pre-pro może być czynnikiem VII lub innym białkiem osocza zależnym od witaminy K, tak jak czynnik IX, czynnik X i protrombina, białko C lub białko S. Jak ocenią fachowcy, w sekwencji aminokwasowej wariantów czynnika VII można dokonać dodatkowych modyfikacji, jeśli te modyfikacje nie zaburzą w sposób znaczący zdolności białka do działania jako środek krzepliwości. Przykładowo, warianty czynnika VII można także modyfikować w aktywacyjnym miejscu rozszczepienia aby zahamować konwersję zymogenu czynnika VII do jego dwułańcuchowej formy aktywowanej, jak generalnie opisano w U.S. 5 288 629.

Wektory ekspresji stosowane przy ekspresji wariantów czynnika VIIa będą obejmować promotor umożliwiający kierowanie transkrypcją klonowanego genu lub cDNA. Korzystne promotory wykorzystywane w hodowanych komórkach ssaków obejmują promotory wirusowe i promotory komórkowe. Promotory wirusowe obejmują promotor SV40 (Subramani i inni, Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981) oraz promotor CMV (Boshart i inni, Cell 41:521-530, 1985). Szczególnie korzystnym promotorem komórkowym jest główny późny promotor adenowirusa 2 (Kaufman i Sharp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-1319, 1982). Promotory komórkowe obejmują mysi promotor genu kappa (Bergman i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983) oraz mysi promotor VH (Loh i inni, Cell 33:85-93, 1983). Szczególnie korzystnym promotorem komórkowym jest mysi promotor metalotioneiny-1 (Palmiter i inni, Science 222:809-814, 1983). Wektory ekspresji mogą także zawierać zbiór miejsc splicingu RNA położony w dół od promotora i w górę od miejsca insercji dla samej sekwencji czynnika VII. Korzystne miejsca składania RNA można uzyskać od adenowirusa i/lub genów immunoglobulin. W wektorach ekspresji zawarty jest także sygnał poliadenylacji umiejscowiony w dół od miejsca insercji. Szczególnie korzystne sygnały poliadenylacji obejmują wczesny lub późny sygnał poliadenylacji od SV40 (Kaufman i Sharp, jak wyżej.), sygnał poliadenylacji z regionu 5 Elb adenowirusa, terminator ludzkiego genu hormonu wzrostu (DeNoto i inni Nuci. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) lub sygnał poliadenylacji z ludzkiego genu czynnika VII albo bydlęcego genu czynnika VII. Wektory ekspresji mogą także obejmować niekodującą wirusową sekwencję liderową, taką jak trójdzielny lider adenowirusa 2, położony między promotorem i miejscami skł adania RNA; oraz sekwencje wzmacniaczowe, takie jak wzmacniacz SV40.

Klonowane sekwencje DNA wprowadza się do hodowanych komórek ssaków za pomocą np. transfekcji za pośrednictwem fosforanu wapnia (Wigier i inni, Cell 14:725-732, 1978; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham i Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) lub elektroporacji (Neumann i inni, EMBO J. 1:841-845, 1982). Aby zidentyfikować i wybrać sekwencje z ekspresją egzogenicznego DNA, gen, który nadaje fenotyp selekcji (marker selekcji) wprowadza się generalnie do komórek razem z genem lub cDNA będącym przedmiotem zainteresowania. Korzystne markery selekcji obejmują geny, które nadają oporność wobec leków, takich jak neomycyna, higromycyna i metotreksat. Marker selekcji może być markerem selekcji możliwym do powielenia. Korzystnym możliwym do powielenia markerem selekcji jest sekwencja reduktazy dihydrofolanowej (DHFR). Markery selekcji można przejrzeć u Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, załączonym w niniejszym przez odniesienie). Fachowiec łatwo będzie w stanie wybrać odpowiednie markery selekcji.

Markery selekcji można wprowadzić do komórek na oddzielnym plazmidzie w tym samym czasie co gen będący przedmiotem zainteresowania lub można je wprowadzić na tym samym plazmidzie. Jeśli na tym samym plazmidzie, marker selekcji oraz gen będący przedmiotem zainteresowania mogą być pod kontrolą różnych promotorów lub tego samego promotora, przy czym ten ostatni układ wytworzy informację dwucistronową. Konstrukcje tego typu są znane w technice (np. Levinson i Simonsen, U.S. 4,713,339). Korzystne może być także dodanie dodatkowego DNA, znanego jako „nośny DNA” do mieszaniny, którą wprowadza się do komórek.

Po wychwyceniu DNA przez komórki, rosną one w odpowiedniej pożywce wzrostowej, zwykle przez 1-2 dni, rozpoczynając ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania. Pożywka wykorzystana do hodowli komórek może być jakąkolwiek konwencjonalną pożywką odpowiednią do hodowania komórek gospodarza, taką jak minimalne kompleksowe pożywki zawierające odpowiednie składniki uzupełniające. Odpowiednie pożywki są dostępne u rynkowych dostawców lub można je wytworzyć zgodnie

PL 204 888 B1 z publikowanymi recepturami (np. w katalogach American Type Culture Collection). Pożywki wytwarza się stosując procedury znane w technice (zobacz np. odniesienia dla bakterii i drożdży; Bennett, J.W. i LaSure, L, wydawcy, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Pożywki wzrostowe generalnie obejmują źródło węgla, źródło azotu, podstawowe aminokwasy, podstawowe cukry, witaminy, sole, fosfolipidy, białka i czynniki wzrostu. Do wytworzenia gamma-karboksylowanych wariantów czynnika VII, pożywka będzie zawierać witaminę K. korzystnie o stężeniu wynoszącym około 0,1 mg/ml do około 5 mg/ml. Następnie wybiera się lek do selekcji wzrostu komórek, które wykazują ekspresję markera selekcji w sposób ustabilizowany. Dla komórek, które transfekowano markerem selekcji możliwym do powielenia stężenie leku może być większe aby wybrać pod względem większej liczby kopii klonowanych sekwencji, zwiększając przez to poziom ekspresji. Klony stabilnie transfekowanych komórek przesiewa się pod względem ekspresji żądanego warianta czynnika VII.

Korzystne ssacze linie komórkowe obejmują linie komórkowe CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), nerki młodych chomików (BHK) i 293 (ATCC CRL 1573; Graham i inni, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Korzystną linią komórkową BHK jest linia komórkowa BHK tk^- ts13 (Waechter i Baserga. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), przytaczana w niniejszym potem jako komórki BHK 570. Linia komórkowa BHK 570 jest dostępna w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, pod numerem dostępu ATCC CRL 10314. Linia komórkowa BHK tk tsl3 jest także dostępna w ATCC pod numerem dostępu CRL 1632. Poza tym, można stosować liczne inne linie komórkowe, łącznie z Rat Hep I (wątrobiak szczura; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (wątrobiak szczura; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), płuco człowieka (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) oraz komórki DUKX (Uriaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-422 0, 1980).

Technologię zwierząt transgenicznych można wykorzystać do wytworzenia wariantów czynnika VII według wynalazku. Korzystne jest wytworzenie białek w gruczołach sutkowych samicy ssaka gospodarza. Ekspresja w gruczole sutkowym i następnie wydzielanie białka będącego przedmiotem zainteresowania do mleka pokonuje wiele trudności napotykanych przy izolowaniu białka z innych źródeł. Mleko łatwo się zbiera, jest dostępne w wielkich ilościach, jest biochemicznie dobrze scharakteryzowane. Ponadto, główne białka mleka są obecne w mleku w wielkich stężeniach (zwykle od około 1 do 15 g/l).

Z handlowego punktu widzenia, wyraźnie korzystne jest wykorzystywanie jako gospodarzy gatunków, które mają wielką wydajność mleczną. Choć można wykorzystywać mniejsze zwierzęta, takie jak myszy czy szczury (i są korzystne na etapie udowadniania zasad), korzystne jest wykorzystywanie zwierząt gospodarskich włączając, lecz bez ograniczenia, świnie, kozy, owce i bydło mleczne. Owce są szczególnie korzystne, z powodu takich czynników jak wcześniejsza historia transgenezy w tym gatunku, wydajność mleczna, koszt i dostępność urządzeń do zbierania mleka owczego (zobacz np. WO 88/00239 dla porównania czynników wpływających na wybór gatunków gospodarza). Generalnie pożądane jest aby wybrać rasę zwierzęcia gospodarza, którą hodowano w celach produkcji mleka, taką jak owca East Friesland, albo do wprowadzenia mlecznej partii przez hodowlę linii mlecznej w późniejszym czasie. W każdym razie, powinny być użyte zwierzęta o znanym, dobrym stanie zdrowia.

Aby otrzymać ekspresję w gruczole sutkowym, wykorzystuje się promotor transkrypcji z genu białka mleka. „Geny białek” mleka obejmują te geny, które kodują kazeiny (zobacz U.S. 5 304 489), beta-laktoglobulinę, a-laktoalbuminę i kwasowe białka serwatki. Korzystny jest promotor beta-laktoglobuliny (BLG). W przypadku genu beta-laktoglobuliny jaja, generalnie będzie się region o co najmniej najbliższych 406 bp sekwencji oskrzydlającej 5' genu, choć korzystne są większe części sekwencji oskrzydlającej 5', aż do około 5 kbp, tak jak segment DNA o ~4,25 kbp DNA obejmujący promotor oskrzydlający 5' i niekodującą część genu beta-laktoglobuliny (zobacz Whitelaw i inni, Biochem. J. 286: 31-39 (1992)). Podobne fragmenty DNA promotora od innych gatunków są także odpowiednie.

Do konstrukcji mogą być także wpowadzane inne regiony genu beta-laktoglobuliny, jak regiony genomowe genu którego ekspresję chce się osiągnąć. Generalnie w technice przyjmuje się, że konstrukcje nie posiadające intronów, np. charakteryzują się słabą ekspresją w porównaniu z tymi, które zawierają takie sekwencje DNA (zobacz Brinster i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiter i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw i inni, Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO 89/01343; i WO 91/02318, z których każde załącza się w niniejszym przez odniesienie). Pod tym względem, generalnie jest korzystne aby tam gdzie to możliwe stosować sekwencje zawierające wszystkie lub niektóre z natywnych intronów genu kodującego białko albo polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, a więc korzystna jest dodatkowa inkluzja co najmniej niektórych intronów np. z genu beta-laktoglobuliny. Jednym takim regionem jest segment DNA, który zapewnia splicing intronowy i poliadenylowanie RNA od niekodującego regionu 3' genu beta-laktoglobuliny jaja. Po wstawieniu

PL 204 888 B1 zamiast naturalnych niekodujących sekwencji 3' genu, ten segment beta-laktoglobuliny jaja może zarówno wzmocnić jak i ustabilizować poziom ekspresji białka lub polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. W innych postaciach realizacji, region otaczający początek ATG sekwencji warianta czynnika VII jest zastępowany odpowiadającymi sekwencjami z genu białka specyficznego dla mleka. Taka zamiana zapewnia przypuszczalne specyficzne dla tkanki środowisko inicjacji do wzmocnienia ekspresji. Wygodnie jest zastąpić całe pre-pro warianta czynnika VII oraz niekodujące sekwencje 5' sekwencjami np. z genu BLG, choć zastąpić można mniejsze regiony.

Dla ekspresji wariantów czynnika VII w zwierzętach transgenicznych, segment DNA kodujący wariant czynnika VII jest operacyjnie połączony z dodatkowymi segmentami DNA koniecznymi dla jego ekspresji aby wytworzyć ugrupowania ekspresji. Takie dodatkowe segmenty obejmują wyżej wymieniony promotor, jak również sekwencje, które zapewniają terminację transkrypcji oraz poliadenylację mRNA. Ugrupowania ekspresji będą dodatkowo obejmować segment DNA kodujący sekwencję sygnału wydzielania operacyjnie połączoną z segmentem kodującym zmodyfikowany czynnik VII. Sekwencja sygnału wydzielania może być natywną sekwencją sygnału wydzielania czynnika VII lub może pochodzić z innego białka, jak np. białka mleka (patrz np. von Heijne, Nuci. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); oraz Meade i inni, U.S. 4,873,316, które załącza się w niniejszym przez odniesienie).

Konstruowanie ugrupowań ekspresji do stosowania w zwierzętach transgenicznych prowadzi się dogodnie przez wprowadzenie sekwencji warianta czynnika VII do plazmidu lub wektora fagowego zawierającego dodatkowe segmenty DNA, chociaż ugrupowanie ekspresji może być skonstruowane przez ligacje zasadniczo każdej sekwencji. Szczególnie wygodne jest zapewnienie wektora zawierającego segment DNA kodujący białko mleka i zastąpienie sekwencji kodującej białko mleka sekwencją polipeptydu warianta czynnika VII; tworząc przez to fuzję genową, która obejmuje sekwencje kontrolne ekspresji genu białka mleka. W każdym razie, kloning ugrupowań ekspresji w plazmidach lub innych wektorach ułatwia powielenie sekwencji warianta czynnika VII. Powielenie przeprowadza się dogodnie w bakteryjnych (np. E. coli) komórkach gospodarza, a więc wektory będą zwykle obejmować początek replikacji i marker selekcji funkcjonujący w bakteryjnych komórkach gospodarza. Następnie ugrupowanie ekspresji wprowadza się do zapłodnionych jaj (łącznie z zarodkami we wczesnym stadium rozwoju) wybranego gatunku gospodarza. Wprowadzenie heterologicznego DNA można wykonać jedną z kilku dróg, włączając mikroiniekcję (np. U.S. Patent No. 4 873 191), zakażenie retrowirusowe (Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988)) lub miejscowo skierowaną integrację przy użyciu komórek macierzystych zarodka (ES) (przegląd przez Bradley i inni, Bio/Technology 10: 534-539 (1992)). Następnie jaja wszczepia się do jajowodów lub macicy samic wykazujących ciążę rzekomą i pozostawia do rozwoju aż do terminu porodu. Potomstwo niosące wprowadzony DNA w swej linii zarodkowej może przenieść DNA na swe potomstwo w normalny Mendlowski sposób, umożliwiając rozwój transgenicznego stada. Generalne procedury tworzenia zwierząt transgenicznych są znane w technice (patrz np. Hogan i inni, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons i inni, Bio/Technology 6:179-183 (1988); Wall i inni, Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhleri inni, Bio/Technology 8: 140-143 (1990); Ebert i inni, Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort i inni, Bio/Technology 9:844-847 (1991); Wall i inni. J. Cell. Biochem. 49: 113-120(1992); U.S. 4 873 191; U.S. 4 873 316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; oraz GB 87/00458). Techniki wprowadzania obcych sekwencji DNA do ssaków oraz ich komórek zarodkowych opracowano początkowo w myszach (patrz np. Gordon i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon i Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter i Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); Brinster i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985); oraz Hogan i inni (jak wyżej)). Techniki te następnie dostosowano do wykorzystania w większych zwierzętach, łącznie z gatunkami gospodarskimi (patrz np. WO 88/00239, WO 90/05188 i WO 92/11757; oraz Simons i inni, Bio/Technology 6: 179-183 (1988)). Omawiając, w najskuteczniejszej drodze stosowanej do dzisiaj przy tworzeniu transgenicznych myszy lub zwierząt gospodarskich, do jednego z przedjądrzy zapłodnionego jaja wstrzykuje się kilkaset liniowych cząsteczek DNA będącego przedmiotem zainteresowania, zgodnie z ustalonymi technikami. Można także stosować wstrzykiwanie DNA do cytoplazmy zygoty.

Można także wykorzystać produkcję w roślinach transgenicznych. Ekspresja może być albo uogólniona albo skierowana do poszczególnego organu, takiego jak bulwa (patrz, Hiatt, Nature 344:469-479 (1990); Edelbaum i inni, J. Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons i inni, Bio/Technology 8:217-221 (1990); oraz EP 0 255 378).

Warianty czynnika VII według wynalazku odzyskuje się z pożywki hodowli komórkowej lub mleka. Warianty czynnika VII według niniejszego wynalazku można oczyszczać rozmaitymi procedurami

PL 204 888 B1 znanymi w technice włączając, lecz bez ograniczenia, chromatografię (np. jonowymienną, powinowactwa, hydrofobii, ogniskowania chromatograficznego oraz filtracji żelowej), procedur elektroforetycznych (np. preparatywne ogniskowanie izoelektryczne (IEF), rozpuszczalność różnicującą (np. strącanie siarczanem amonu), lub ekspresji (patrz np. Protein Purification, J.C. Janson i Lars Ryden, wydawcy, VCH Publishers, New York, 1989). Korzystnie, można je oczyszczać przez chromatografię powinowactwa na kolumnie z przeciwciałem anty-czynnik VI). stosowanie przeciwciała monoklonalnych zależnych od wapnia, jak opisano przez Wakabayashi i inni, J. Biol. Chem. 261:11097-11108. (1986) oraz Thim i inni, Biochemistry 27: 7785-7793. M9R8V jest szczególnie korzystne. Dodatkowe oczyszczanie można uzyskać konwencjonalnymi środkami chemicznymi, takimi jak wysokosprawna chromatografia cieczowa. Inne metody oczyszczania, włączając strącanie cytrynianem baru są znane w technice i mogą być stosowane do oczyszczania nowych wariantów czynnika VII opisanych w niniejszym (patrz np. Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982).

Dla celów terapeutycznych korzystne jest aby warianty czynnika VII według wynalazku były zasadniczo czyste. Tak więc, w korzystnej postaci realizacji wynalazku, warianty czynnika VII oczyszcza się do co najmniej 90 do 95% jednorodności, korzystnie do co najmniej około 98% jednorodności. Czystość można oszacować np. przez elektroforezę w żelu i sekwencjonowanie aminokwasu aminoterminalnego.

Warianty czynnika VII rozszczepia się w miejscu aktywacji w celu przekształcenie go w jego formę dwułańcuchową. Aktywację można przeprowadzić zgodnie z procedurami znanymi w technice, takimi jak opisane przez Osterud, i innych, Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, U.S. Patent No. 4 456 591; Hednerand Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983); lub Kisiel i Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983). Alternatywnie jak opisano u Bjoem i innych (Research Disclosure, 269 wrzesień 1986, strony 564-565), czynnik VII można aktywować przez przepuszczeniego przez kolumnę chromatografii jonowymiennej, taką jak Mono Q^® (Pharmacia fine Chemicals) lub podobne. Uzyskany aktywowany wariant czynnika VII można potem opracować w postać preparatu i podawać jak opisano poniżej.

Próby

Wynalazek ujawnia także odpowiednie próby selekcji „korzystnych wariantów czynnika VIla według wynalazku. Próby te można przeprowadzić jako prosty wstępny test in vitro.

A więc, przykł ad 11 w niniejszym opisuje prosty test (zatytu ł owany „Próba hydrolizy in vitro”) na aktywność wariantów czynnika VIla według wynalazku. W oparciu o niego, poszczególne warianty czynnika VIIa, będące przedmiotem zainteresowania to takie warianty, w których stosunek między aktywnością warianta i aktywnością natywnego czynnika VII ukazanego w Fig. 1, wynosi powyżej 1,0, np. co najmniej około 1,25, korzystnie co najmniej około 2,0, tak jak co najmniej około 3,0 lub jeszcze korzystniej, co najmniej około 4,0 po przetestowaniu w „Próbie hydrolizy in vitro” określonej w niniejszym.

Aktywność wariantów można także zmierzyć wykorzystując substrat fizjologiczny, taki jak czynnik X (Próba proteolizy in vitro, patrz przykład 12), odpowiednio o stężeniu wynoszącym 100-1000 nM, przy czym mierzy się wytworzony czynnik Xa po dodaniu odpowiedniego substratu chromogenicznego (np. S-2765). Poza tym, próbę aktywności można przeprowadzić w temperaturze fizjologicznej.

Zdolność wariantów FVIIa do tworzenia trombiny można też zmierzyć w próbie obejmującej wszystkie istotne czynniki krzepliwości oraz inhibitory w stężeniach fizjologicznych (minus czynnik VIII przy naśladowaniu stanu hemofilii A) oraz aktywowane płytki krwi (jak opisano na stronie 543 u Monroe i inni (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547 który tą drogą załącza się jako odniesienie).

Podawanie i kompozycje farmaceutyczne

Warianty czynnika VII według niniejszego wynalazku można stosować do kontrolowania schorzeń przebiegających z krwawieniem, które mają kilka przyczyn, takich jak niedobory czynników krzepliwości (np. hemofilia A i B lub niedobór czynników krzepliwości XI albo VII) albo inhibitory czynników krzepliwości, lub można je wykorzystywać do kontrolowania nadmiernego krwawienia występującego u podmiotów z normalnie funkcjonującą kaskadą krzepliwości krwi (brak niedoborów czynników krzepliwości lub inhibitorów przeciwko któremukolwiek z czynników krzepliwości). Krwawienia mogą być powodowane przez wadliwe działanie płytek, małopłytkowość lub chorobę von Willebranda. Mogą one także występować u podmiotów, u których zwiększona aktywność fibrynolityczna została indukowana różnymi bodźcami.

U podmiotów, które doś wiadczają rozległ ego uszkodzenia tkanki w zwią zku z operacją lub wielkim urazem, mechanizm hemostatyczny może być przeciążony wymaganiem pilnej hemostazy i mogą one wywołać krwawienie mimo normalnego mechanizmu krwawienia. Uzyskanie zadowalającej hemostazy jest także problemem gdy krwawienia występują w narządach, takich jak mózg, region ucha wewnętrznego i oczu i mogą również stanowić problem w przypadku rozlanych krwawień (krwotoczne

PL 204 888 B1 zapalenie żołądka i obfite krwawienie z macicy) kiedy trudno jest zidentyfikować źródło. Ten sam problem może powstać w procesie pobierania biopsji z różnych narządów (wątroba, płuco, tkanka nowotworowa, przewód pokarmowy) jak również w chirurgii laparoskopowej. Te sytuacje dzielą trudność zapewnienia hemostazy technikami chirurgicznymi (szwy, klamry, itd.). Ostre i obfite krwawienia mogą także wystąpić u podmiotów otrzymujących terapię przeciwzakrzepową, u których nieprawidłowa hemostaza została indukowana podawaną terapią. Takie podmioty mogą potrzebować interwencji chirurgicznej w przypadku gdy efekt przeciwzakrzepowy nastąpił gwałtownie. Inną sytuacją, która może wywoływać problemy w przypadku niezadowalającej hemostazy jest kiedy podmiotom z normalnym mechanizmem hemostatycznym podaje się terapię przeciwzakrzepową aby zapobiec chorobie zakrzepowej. Taka terapia może obejmować heparynę, inne postacie proteoglikanów, warfarynę lub inne postaci antagonistów witaminy K, jak również aspirynę i inne inhibitory agregacji płytek.

Aktywacja układowa kaskady krzepliwości może prowadzić do rozsianej krzepliwości wewnątrznaczyniowej (DIG). Jednak takie komplikacje nie występowały u podmiotów leczonych wysokimi dawkami rekombinowanego FVIIa, z powodu umiejscowionego procesu hemostatycznego rodzaju jaki jest indukowany przez tworzenie kompleksu między FVIIa i TF w miejscu uszkodzenia ścianki naczynia. Warianty czynnika VII według wynalazku można więc także wykorzystać w ich formie aktywowanej do kontroli takich nadmiernych krwawień związanych z normalnym mechanizmem hemostatycznym.

Przy leczeniu w związku z zamierzonymi interwencjami, warianty czynnika VII według wynalazku będą zwykle podawane w ciągu około 24 godzin przed przeprowadzeniem interwencji, i przez 7 dni lub dłużej potem. Podawanie jako środka wywołującego krzepliwość może się odbywać rozmaitymi drogami jakie opisano w niniejszym.

Zakres dawki wariantów czynnika VII wynosi od około 0,05 mg do 500 mg/dzień, korzystnie od około 1 mg do 200 mg/dzień, i jeszcze korzystniej od około 10 mg do około 175 mg/dzień dla podmiotu ważącego 70 kg jako dawki nasycające i podtrzymujące, w zależności od ciężaru podmiotu i ciężkości choroby.

Kompozycje farmaceutyczne są przeznaczone przede wszystkim do podawania pozajelitowego do traktowania profilaktycznego i/lub terapeutycznego. Korzystnie, kompozycje farmaceutyczne podaje się pozajelitowo, to znaczy dożylnie, podskórnie lub domięśniowo, albo można podawać poprzez ciągły lub pulsacyjny wlew. Kompozycje do podawania pozajelitowego obejmują wariant czynnika VII według wynalazku w połączeniu, korzystnie rozpuszczonym w nim, z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, korzystnie wodnym nośnikiem. Stosować można rozmaite wodne nośniki, takie jak woda, buforowana woda, 0,4% roztwór soli, 0,3% glicyna i temu podobne. Warianty czynnika VII według wynalazku można także opracowywać jako preparaty liposomowe do dostarczania lub namierzania miejsc uszkodzenia. Preparaty liposomowe są ogólnie opisane np. w opisach patentowych nr U.S. 4 837 028, U.S. 4 501 728 i U.S. 4 975 282. Kompozycje można wyjaławiać konwencjonalnymi, dobrze znanymi technikami sterylizacji. Uzyskane roztwory wodne można zapakować do użycia lub filtrować w warunkach aseptycznych i liofilizować, przy czym preparat liofilizowany łączy się z jałowym roztworem wodnym przed podaniem. Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze zgodnie z potrzebą aby uzyskać przybliżone warunki fizjologiczne, tak jak środki do regulacji pH i buforujące, środki do regulacji ciśnienia osmotycznego i temu podobne, np. octan sodu, mleczan sodu, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek wapnia, itd.

Stężenie warianta czynnika VII w tych preparatach może się szeroko zmieniać, to znaczy od mniej niż około 0,5% wagowego, zwykle do, lub co najmniej około 1% wagowego, aż do 15 lub 20% wagowych i będzie dobrane przed wszystkim przez objętość płynów, lepkości, itd., zgodnie z wybranym poszczególnym sposobem podawania.

Tak więc, typowa kompozycja farmaceutyczna do wlewu dożylnego mogłaby być tak wykonana aby zawierała 250 ml jałowego roztworu Ringera i 10 mg warianta czynnika VII. Właściwe metody sporządzania kompozycji możliwych do podawania doustnego będą znane lub jasne dla fachowców i są opisane bardzie szczegółów np. w Remington's Pharmaceutical Sciences. 18-te wydanie, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).

Kompozycje zawierające warianty czynnika VII według niniejszego wynalazku można podawać w celu traktowania profilaktycznego i/lub terapeutycznego. W zastosowaniach terapeutycznych, kompozycje podaje się podmiotowi już cierpiącemu z powodu choroby, jakie opisano powyżej, w ilości wystarczającej do wyleczenia, zmniejszenia lub częściowego zatrzymania choroby i jej powikłań. Ilość odpowiednią do uzyskania tego celu określa się jako „ilość skuteczną terapeutycznie”. Jak będzie rozumiane przez fachowca, ilość skuteczna do tego celu będzie zależeć od ciężkości choroby lub uszkodzenia jak również od ciężaru i stanu ogólnego podmiotu. Jednakże ogólnie, zakres ilości sku18

PL 204 888 B1 tecznej będzie wynosić od około 0,05 mg do około 500 mg warianta czynnika VII dziennie dla podmiotu ważącego 70 kg, przy czym dawki wynoszące od około 1,0 mg do około 200 mg warianta czynnika VII dziennie, są stosowane bardziej powszechnie.

Należy pamiętać, że materiały według niniejszego wynalazku można generalnie wykorzystywać w poważnych chorobach lub stanach po urazach, to znaczy sytuacjach zagrażających lub potencjalnie zagrażających życiu. W takich wypadkach, ze względu na minimalizację obcych substancji i ogólny brak immunogeniczności ludzkich wariantów czynnika VII u ludzi, możliwe jest, i przez lekarza leczącego może być odczuwane jako potrzebne, aby podać zasadniczy nadmiar tych kompozycji warianta czynnika VII.

W zastosowaniach profilaktycznych, kompozycje zawierają ce warianty czynnika VII wedł ug wynalazku podaje się podmiotowi podatnemu lub w innych sposób obarczonego ryzykiem stanu chorobowego lub uszkodzenia, aby wzmocnić własną zdolność krzepliwości u podmiotu. Taką ilość określa się jako „dawkę profilaktycznie skuteczną”. W zastosowaniach profilaktycznych, dokładne ilości raz jeszcze zależą od stanu zdrowia podmiotu i jego ciężaru, lecz dawka generalnie wynosi od około 0,05 mg do około 500 mg dziennie dla podmiotu ważącego 70 kilogramów, bardziej powszechnie od około 1,0 mg do około 200 mg dziennie dla podmiotu ważącego 70 kilogramów.

Pojedyncze lub wielokrotne podania kompozycji można przeprowadzić przy poziomie dawki i wzorcach wybranych przez lekarza leczącego. Dla podmiotów ambulatoryjnych wymagających dziennych dawek podtrzymujących, warianty czynnika VII można podawać przez ciągły wlew przy użyciu np. przenośnego systemu pomp.

Dostarczanie miejscowe warianta czynnika VII według niniejszego wynalazku, tak jak np. stosowanie miejscowe mona przeprowadzić np. za pomocą sprayu, perfuzji, cewnika z podwójnym balonikiem, rurek udrażniających, przez wprowadzenie do przeszczepów naczyniowych lub rurek udrażniających, hydrożeli stosowanych do powlekania cewników z balonikami lub innymi dobrze ustalonymi metodami. W każdym razie kompozycje farmaceutyczne powinny zapewnić ilość warianta czynnika VII wystarczającą do skutecznego leczenia podmiotu.

Niniejszy wynalazek jest dodatkowo zilustrowany następującymi przykładami, których jednakże nie należy traktować jako ograniczające zakres zabezpieczenia. Cechy ujawnione w powyższym opisie oraz następujące przykłady mogą być, zarówno oddzielnie jak i w jakiejkolwiek kombinacji, materiałem do realizacji wynalazku w różnych jego postaciach.

P r z y k ł a d y

Terminologia dla substytucji aminokwasowych stosowana w przedstawionych przykładach jest następująca. Pierwsza litera oznacza aminokwas naturalnie występujący w pozycji z SEQ ID Nr:1. Idąca za nią liczba oznacza pozycję w SEQ ID Nr:1. Druga litera oznacza inny aminokwas podstawiający (zastępujący) naturalny aminokwas. Przykładem jest M298Q, gdzie metionina w pozycji 298 z SEQ ID Nr:1 jest zastą piona przez glutaminę . W innym przykł adzie, V158T/M298Q, walina w pozycji 158 SEQ ID Nr:1 jest zastąpiona przez treoninę, a metionina w pozycji 298 SEQ ID Nr:1 jest zastąpiona przez glutaminę w tym samym polipeptydzie czynnika VII.

P r z y k ł a d 1

DNA kodujący [V158T/M298Q]-FVII, [K157A]-FVII, [E296V]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII i [V158D/E296V]-FVII, [V158D/M298Q]-FVII, [V158D/M298K]-FVII, [V158D/E296V/M298Q]-FVII, [M298Q]-FVII, [S336G]-FVII, [K337A]-FVII, [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII.

Wytworzono konstrukcję DNA kodującą [V158T/M298Q]-FVII, [K157A]-FVII, [E296V]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII i [V158D/E296V]-FVII, [V158D/M298Q]-FVII, [V158D/M298K]-FVII, [V158D/E296V/M298Q]-FVII, [M298Q]-FVII, [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII, [S336G]-FVII oraz [K337A]-FVII, przez miejscowo skierowaną mutagenezę przy użyciu superzwiniętej, podwójnej nici DNA wektora z insertem będącym przedmiotem zainteresowania i dwóch syntetycznych starterów zawierających żądaną mutację. Wykorzystano następujące pary starterów:

Dla [K157A]-FVII:

5'-CCG AAT TGT GGG GGG CGC GGT GTG CCC CAA AGG G-3' (SEQ ID Nr: 2)

5'-CCC TTT GGG GCA CAC CGC GCC CCC CAC AAT TCG G-3' (SEQ ID Nr: 3)

Dla [V158D]-FVII:

5'-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3' (SEQ ID Nr: 4) 5'-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3' (SEQ ID Nr: 5)

Dla [V158T]-FVII:

5'-GTG GGG GGC AAG ACG TGC CCC AAA GGG G-3' (SEQ ID Nr: 6)

5'-CCC CTT TGG GGC ACG TCT TGC CCC CCA C-3' (SEQ ID Nr: 7)

PL 204 888 B1

Dla [E296V/M298Q]-FVII:

5'-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID Nr: 8)

5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3' (SEQ ID Nr: 9)

Dla [M2980J -FVII:

5'-GCC CTG GAG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID Nr: 10)

5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CTC CAG GGC-3' (SEQ ID Nr: 11)

Dla [M298K]-FVII

5'-GCC CTG GAG CTC AAG GTC CTC AAC GTG-3' (SEQ ID Nr: 12)

5'-CAC CTT GAG GAC CTT GAG CTC CAG GGC-3' (SEQ ID Nr: 13)

Dla [S336G]-FVII:

5'-GGC TAC TCG GAT GGC GGC AAG GAC TCC TGC AAG -3' (SEQ ID Nr: 14)

5'-CTT GCA GGA GTC CTT GCC GCC ATC CGA GTA GCC-3' (SEQ ID Nr: 15)

Dla [K337A]-FVII:

5'-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3' (SEQ ID Nr: 16)

5'-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3' (SEQ ID Nr: 17)

Startery oligonukleotydowe, każdy komplementarny w stosunku do przeciwległej nici wektora, wydłużono podczas cykli wysokiej temperatury za pomocą polimerazy DNA Pfu. W czasie wprowadzania starterów, wytworzono zmutowany plazmid zawierający naprzemienne nacięcia. Po cyklach wysokiej temperatury, produkt potraktowano DpnI, który jest specyficzny wobec metylowanego i hemimetylowanego DNA aby strawić rodzicielską matrycę DNA i aby dokonać selekcji pod względem syntetyzowanego DNA zawierającego mutację.

Procedury wytwarzania konstrukcji DNA przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy z wykorzystaniem specyficznych starterów są dobrze znane osobom wykwalifikowanym (porównaj PCR Protocols. 1990, Academic Press, San Diego, California, USA).

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie [V158T/M298Q]-FVII.

Komórki BHK transfekowano zasadniczo zgodnie z wcześniejszym opisem (Thim i inni (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson i Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) uzyskując ekspresję warianta [V158T/M298Q]-FVII. Wariant czynnika VII oczyszczono następująco:

Kondycjonowaną pożywkę załadowano na 25-ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) po dodaniu 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 i 10 mM Tris, regulacji pH do 8,0 oraz regulacji przewodności do 10-11 mS/cm przez dodanie wody. Wymywanie białka uzyskano etapami od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 do 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Frakcje zawierające [V158T/M298Q]-FVII zlano i nałożono na 25-ml kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvsaerd, Dania) sprzężone z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolumnę zrównoważono za pomocą 50 mM Hepes, pH 7,5, zawierającego 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl i 0,02% Triton X-100. Po przemyciu buforem równoważącym i buforem równoważącym zawierającym 2 M NaCl, związany materiał wymywano buforem równoważącym zawierającym 10 mM EDTA zamiast CaCl2. Przed użyciem lub przechowywaniem, dodano nadmiar CaCl2 w stosunku do EDTA lub [V158T/M298Q]-FVII przeniesiono do buforu zawierającego Ca²⁺. Wydajność każdego etapu śledzono przez pomiary czynnika VII testem ELISA i oczyszczone białko analizowano przez SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie rK157A1-FVII.

Komórki BHK transfekowano zasadniczo zgodnie z wcześniejszym opisem (Thim i inni (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson i Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) uzyskując ekspresję warianta [K157A]-FVII. Wariant czynnika VII oczyszczono następująco:

Kondycjonowaną pożywkę załadowano na 25-ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) po dodaniu 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 i 10 mM Tris, regulacji pH do 8,0 oraz regulacji przewodności do 10-11 mS/cm przez dodanie wody. Wymywanie białka uzyskano etapami, wychodząc od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 do 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Frakcje zawierające [K157A]-FVII zlano i nałożono na 25-ml kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dania) sprzężone z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolumnę zrównoważono za pomocą 50 mM Hepes, pH 7,5, zawierającego 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl i 0,02% Triton X-100. Po przemyciu buforem równoważącym i buforem równoważącym zawierającym 2 M NaCl, związany materiał wymywano buforem

PL 204 888 B1 równoważącym zawierającym 10 mM EDTA zamiast CaCl2. Przed użyciem lub przechowywaniem, dodano nadmiar CaCl2 w stosunku do EDTA, lub [K157A]-FVII przeniesiono do buforu zawierającego Ca²⁺. Wydajność każdego etapu śledzono przez pomiary czynnika VII testem ELISA i oczyszczone białko analizowano przez SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie [V158D/M298Q]-FVII.

Komórki BHK transfekowano zasadniczo zgodnie z wcześniejszym opisem (Thim i inni (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson i Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) uzyskując ekspresję warianta [V158D/M298Q]-FVII. Wariant czynnika VII oczyszczono następująco:

Kondycjonowaną pożywkę załadowano na 25-ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) po dodaniu 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 i 10 mM Tris, regulacji pH do 8,0 oraz regulacji przewodności do 10-11 mS/cm przez dodanie wody. Wymywanie białka uzyskano etapami wychodząc od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 do 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Frakcje zawierające [V158D/M298Q]-FVII zlano i nałożono na 25-ml kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dania) sprzężone z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolumnę zrównoważono za pomocą 50 mM Hepes, pH 7,5, zawierającego 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl i 0,02% Triton X-100. Po przemyciu buforem równoważącym i buforem równoważącym zawierającym 2 M NaCl, związany materiał wymywano buforem równoważącym zawierającym 10 mM EDTA zamiast CaCl2. Przed użyciem lub przechowywaniem, dodano nadmiar CaCl2 w stosunku do EDTA, lub [V158D/M298Q]-FVII przeniesiono do buforu zawierającego Ca²⁺. Wydajność każdego etapu śledzono przez pomiary czynnika VII testem ELISA i oczyszczone biał ko analizowano przez SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie [V158D/M298K]-FVII.

Komórki BHK transfekowano zasadniczo zgodnie z wcześniejszym opisem (Thim i inni (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson i Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) uzyskując ekspresję warianta [V158D/M298K]-FV11. Wariant czynnika VII oczyszczono następująco:

Kondycjonowaną pożywkę załadowano na 25-ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) po dodaniu 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 i 10 mM Tris, regulacji pH do 8,0 oraz regulacji przewodności do 10-11 mS/cm przez dodanie wody. Wymywanie białka uzyskano etapami wychodząc od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 do 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2. 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Frakcje zawierające [V158D/M298K]-FVII zlano i nałożono na 25-ml kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dania) sprzężone z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolumnę zrównoważ ono za pomocą 50 mM Hepes, pH 7,5, zawierającego 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl i 0,02% Triton X-100. Po przemyciu buforem równoważącym i buforem równoważącym zawierającym 2 M NaCl, związany materiał wymywano buforem równoważącym zawierającym 10 mM EDTA zamiast CaCl2. Przed użyciem lub przechowywaniem, dodano nadmiar CaCl2 w stosunku do EDTA lub [V158D/M298K]-FVII przeniesiono do buforu zawierającego Ca²⁺. Wydajność każdego etapu śledzono przez pomiary czynnika VII testem ELISA i oczyszczone białko analizowano przez SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie [V158D/E296V/M298Q]-FVII.

Komórki BHK transfekowano zasadniczo zgodnie z wcześniejszym opisem (Thim i inni, (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson i Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) uzyskując ekspresję warianta [V158D/E296V/M298Q]-FVII. Wariant czynnika VII oczyszczono następująco:

Kondycjonowaną pożywkę załadowano na 25-ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) po dodaniu 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 i 10 mM Tris, regulacji pH do 8,0 oraz regulacji przewodności do 10-11 mS/cm przez dodanie wody. Wymywanie białka uzyskano etapami, wychodząc od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 do 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Frakcje zawierające [V158D/E296V/M298Q]-FVII zlano i nałożono na 25-ml kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvasrd, Dania) sprzężone z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolumnę zrównoważono za pomocą 50 mM Hepes, pH 7,5, zawierającego 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl i 0,02% Triton X-100. Po przemyciu buforem równoważącym i buforem równoważącym zawierającym 2 M NaCl, związany materiał wymywano buforem równoważącym zawierającym 10 mM EDTA zamiast CaCl2. Przed użyciem lub przechowywaniem, dodano nadmiar CaCl2 w stosunku do EDTA lub [V158D/E296V/M298Q]-FVII

PL 204 888 B1 przeniesiono do buforu zawierającego Ca²⁺. Wydajność każdego etapu śledzono przez pomiary czynnika VII testem ELISA i oczyszczone białko analizowano przez SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 7

Wytwarzanie [M298Q]-FVII.

Komórki BHK transfekowano zasadniczo zgodnie z wcześniejszym opisem (Thim i inni (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson i Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) uzyskując ekspresję warianta [M298Q]-FVII. Wariant czynnika VII oczyszczono następująco:

Kondycjonowaną pożywkę załadowano na 25-ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) po dodaniu 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 i 10 mM Tris, regulacji pH do 8,0 oraz regulacji przewodności do 10-11 mS/cm przez dodanie wody. Wymywanie białka uzyskano etapami, wychodząc od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 do 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Frakcje zawierające [M298Q]-FVII zlano i nałożono na 25-ml kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dania) sprzężone z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolumnę zrównoważono za pomocą 50 mM Hepes, pH 7,5, zawierającego 10 mM CaCl2,100 mM NaCl i 0,02% Triton X-100. Po przemyciu buforem równoważącym i buforem równoważącym zawierającym 2 M NaCl, związany materiał wymywano buforem równoważącym zawierającym 10 mM EDTA zamiast CaCl2. Przed użyciem lub przechowywaniem, dodano nadmiar CaCl2 w stosunku do EDTA lub [M298Q]-FVII przeniesiono do buforu zawierającego Ca²⁺. Wydajność każdego etapu śledzono przez pomiary czynnika VII testem ELISA i oczyszczone białko analizowano przez SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie [S336G]-FVII.

Komórki BHK transfekowano zasadniczo zgodnie z wcześniejszym opisem (Thim i inni (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson i Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) uzyskując ekspresję warianta [S336G]-FVII. Wariant czynnika VII oczyszczono następująco:

Kondycjonowaną pożywkę załadowano na 25-ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) po dodaniu 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 i 10 mM Tris, regulacji pH do 8,0 oraz regulacji przewodności do 10-11 mS/cm przez dodanie wody. Wymywanie białka uzyskano etapami, wychodząc od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 do 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Frakcje zawierające [S336G]-FVII zlano i nałożono na 25-ml kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dania) sprzężone z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolumnę zrównoważono za pomocą 50 mM Hepes, pH 7,5, zawierającego 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl i 0,02% Triton X-100. Po przemyciu buforem równoważącym i buforem równoważącym zawierającym 2 M NaCl, związany materiał wymywano buforem równoważącym zawierającym 10 mM EDTA zamiast CaCl2. Przed użyciem lub przechowywaniem, dodano nadmiar CaCl2 w stosunku do EDTA lub [S336G]-FVII przeniesiono do buforu zawierającego Ca²⁺. Wydajność każdego etapu śledzono przez pomiary czynnika VII testem ELISA i oczyszczone białko analizowano przez SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 9

Wytwarzanie [K337A]-FVII.

Komórki BHK transfekowano zasadniczo „zgodnie” z wcześniejszym opisem (Thim i inni (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson i Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) uzyskując ekspresję warianta [K337A]-FVII. Wariant czynnika VII oczyszczono następująco:

Kondycjonowaną pożywkę załadowano na 25-ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) po dodaniu 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 i 10 mM Tris, regulacji pH do 8,0 oraz regulacji przewodności do 10-11 mS/cm przez dodanie wody. Wymywanie białka uzyskano etapami, wychodząc od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 do 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Frakcje zawierające [K337A]-FVII zlano i nałożono na 25-ml kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvasrd, Dania) sprzężone z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolumnę zrównoważono za pomocą 50 mM Hepes, pH 7,5, zawierającego 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl i 0,02% Triton X-100. Po przemyciu buforem równoważącym i buforem równoważącym zawierającym 2 M NaCl, związany materiał wymywano buforem równoważącym zawierającym 10 mM EDTA zamiast CaCl2. Przed użyciem lub przechowywaniem, dodano nadmiar CaCl2 w stosunku do EDTA lub [K337A]-FVII przeniesiono do buforu zawierającego Ca²⁺. Wydajność każdego etapu śledzono przez pomiary czynnika VII testem ELISA i oczyszczone białko analizowano przez SDS-PAGE.

PL 204 888 B1

P r z y k ł a d 10

Wytwarzanie [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII.

Komórki BHK transfekowano zasadniczo zgodnie z wcześniejszym opisem (Thim i inni (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson i Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243) uzyskując ekspresję warianta [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII.

Wariant czynnika VII oczyszczono następująco:

Kondycjonowaną pożywkę załadowano na 25-ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) po dodaniu 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 i 10 mM Tris, regulacji pH do 8,0 oraz regulacji przewodności do 10-11 mS/cm przez dodanie wody. Wymywanie białka uzyskano etapami, wychodząc od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 do 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Frakcje zawierające [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII zlano i nałożono na 25-ml kolumnę zawierającą przeciwciało monoklonalne F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvsrd, Dania) sprzężone z aktywowanym CNBr Sepharose 4B (Phamnacia Biotech). Kolumnę zrównoważono za pomocą 50 mM Hepes, pH 7,5, zawierającego 10 mM CaCl2, 100 mM NaCl i 0,02% Triton X-100. Po przemyciu buforem równoważącym i buforem równoważącym zawierającym 2 M NaCl, związany materiał wymywano buforem równoważącym zawierającym 10 mM EDTA zamiast CaCl2. Przed użyciem lub przechowywaniem, dodano nadmiar CaCl2 w stosunku do EDTA lub [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII przeniesiono do buforu zawierającego Ca²⁺. Wydajność każdego etapu śledzono przez pomiary czynnika VII testem ELISA i oczyszczone białko analizowano przez SDS-PAGE.

P r z y k ł a d 11

Próba hydrolizy in vitro

Natywny (dzikiego typu) czynnik VIIa i wariant czynnika VIIa (oba przytaczane w niniejszym później jako „czynnik VIIa”) testuje się równolegle aby bezpośrednio porównać ich specyficzną aktywność. Próbę prowadzi się w płytce do mikromianowania (MaxiSorp, Nunc, Dania). Substrat chromogeniezny D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid (S-2288, Chromogenix, Szwecja), stężenie końcowe 1 mM, dodaje się do czynnika VIla (stężenie końcowe 100 nM) w 50 mM Hepes, pH 7,4, zawierającego 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl2 i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej. Absorbancję przy 405 nm mierzy się w sposób ciągły w czytniku pł ytek SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, USA). Absorbancję wywoł aną podczas 20-minutowej inkubacji, po odjęciu absorbancji w studzience czystej nie zawierającej enzymu, wykorzystuje się do obliczenia stosunku między aktywnością warianta i dzikiego typu czynnika VIIa:

Stosunek = (A405 nm warianta czynnika VIla)/(A405 nm dzikiego typu czynnika VIIa).

P r z y k ł a d 12

Próba proteolizy in vitro

Natywny (dzikiego typu) czynnik VIIa i wariant czynnika VIIa (oba przytaczane w niniejszym później jako „czynnik VIIa”) testuje się równolegle aby bezpośrednio porównać ich specyficzną aktywność. Próbę prowadzi się w płytce do mikromianowania (MaxiSorp, Nunc, Dania). Czynnik VIIa (10 nM) oraz czynnik X (0.8 microM) w 100 mikrolitrach 50 mM Hepes, pH 7,4, zawierającego 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl2 i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, inkubuje się przez 15 minut. Następnie zatrzymuje się rozszczepianie czynnika X przez dodanie 50 mikrolitrów 50 mM Hepes, pH 7,4, zawierającego 0,1 M NaCl, 20 mM EDTA i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej. Ilość wytworzonego czynnika Xa mierzy się przez dodanie substratu chromogenicznego Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilidu (S-2765, Chromogenix, Szwecja), stężenie końcowe 0,5 mM. Absorbancję przy 405 nm mierzy się w sposób ciągły w czytniku płytek SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, USA).

Absorbancję wywołaną w ciągu 10 minut, po odjęciu absorbancji w studzience czystej nie zawierającej FVIIa, wykorzystuje się do obliczenia stosunku między- aktywnością proteolityczną warianta i dzikiego typu czynnika VIIa:

Stosunek = (A405nm wariantu czynnika VIla) / (A405nm dzikiego typu czynnika VIIa).

P r z y k ł a d 13

Względna aktywność wariantów FVIIa mierzona w próbach opisanych w przykładach 11 i 12

Wariant	Stosunek w przykładzie 11	Stosunek w przykładzie 12
1	2	3
K157A	0,9	Nie określone
V158T/M298Q-FVIIa	3,8	10

PL 204 888 B1 cd.

1	2	3
V158D/M298Q-FVIIa	2,0	2,7
V158D/M298K-FVIIa	0,3	Nie określone
V158D/E296V/M298Q-FVIIa	7,8	28
M298Q-FVIIa	3,4	5,5
V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa	11,0	47
S336G-FVIIa	0,6	Nie określone
K337A-FVIIa	3,9	4,4
wt-FVIIa	1,0	1,0

Wykaz sekwencji

SEQ ID NR. 1 (Sekwencja aminokwasowa natywnego ludzkiego czynnika krzepliwości VII):

Ala-Asn-Ala-Ph Lau-GLA-GLA-Lau-Arg-Pro-Gly-Sar-Lau-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys5 10 15

GLA-GLA-Gln-Cys-Sar-Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GLA-Ile-Phe-Lys-Asp-Ala-GLA-Arg20 25 30 35

Thr-Lys-Lau-Pha-Trp-Ile-Sar-Tyr-Sar-Asp-Gly-Asp-Gln-Cys-Ala-Sar-Sar-Pro40 45 50

Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Sar-Cys-Lys-Asp-Gin-Leu-Gln-Ser-Tyr-Ile-Cys-Phe-Cys55 60 65 70

Len-Pro-Ala-Pha-Glu-Gly-Arg-Asn-Cys-Glu-Thr-His-Lys-Asp-Asp-Gln-Lau-Ila75 80 85 90

Cys-Val-Asn-Gla-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ser-Asp-His-Thr-Gly-Thr95 100 105

Lys-Arg-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Gly-Val-Ser110 115 120 125

Cys-Thr-Pro-Thr-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys-Ila-Pro-Ila-Lau-Glu-Lys-Arg130 135 140

Asn-Ala-Sar-Lys-Pro-Gln-Gly-Arg-Ila-Val-Gly-Gly-Lys-Val-Cys-Pro-Lys-Gly145 150 155 160

Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Le.u-Lau-Lau-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-Leu-Cys-Gly-Gly165 170 175 180

Thr-Lau-Ile-Asn-Thr-Ile-Trp-Val-Val-Sar-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lys-Ile185 190 195

Lys-Asn-Trp-Arg-Asn-Lau-Ila-Ala-Val-Lau-Gly-Glu-His-Asp-Lejj-Ser-Glu-His200 205 210 215

Asp-Gly-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg-Arg-Val-Ala-Gln-Val-Ila-Ile-Pro-Ser-Thr-Tyr220 225 230

PL 204 888 B1

Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn-His-Asp-Ile-Ala-Lau-Lau-Arg-Le.u-His-Gln-Pro-Val235 240 245 250

Val-Lau-Thr-Asp-His-Val-Val-Pro-Lau-Cys-Lau-Pro-Glu-Arg-Thr-Pha-Sar-Glu·

255 260 8G PVP 265 270

Arg-Thr-Lau-Ala-Pha-Val-Arg-Pha-Sar-Lau-Val-Sar-Gly-Trp-Gly-Gln-Lau-Le_u·

275 280 285

Asp-Arg-Gly-Ala-Thr-Ala-Lau-Glu-Lau-Mat-Val-Leu-Asn-Val-Pro-Arg-Lau-Mat·

290 295 300 305

Thr-Glr.-Asp-Cys-Lau-Gln-Gln-Sar-Arg-Lys-Val-Gly-Asp-Ser-Pro-Asn-Ile-Thr·

310 315 320

Glu-Tyr-Mat-Pha-Cys-Ala-Gly-Tyr-Sar-Asp-Gly-Sar-Lys-Asp-Sar-Cys-Lys-Gly325 330 335 340

Asp-Sar-Gly-Gly-Pro-His-Ala-Thr-His-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Tyr-Lau-Thr-Gly345 350 355 360

Ile-Val-Sar-Trp-Gly-Gln-Gly-Cys-Ala-Thr-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr365 370 375

Arg-Val-Sar-Gln-Tyr-Ila-Glu-Trp-Lau-Gln-Lys-Lau-Mat-Arg-Sar-Glu-Pro-Arg·

380 385 390 395

Pro-Gly-Val-Lau-Leu-Arg-Ala-Pro-Phe-Pro

400 405 406

SEQ ID Nr:2 (Starter DNA do wytwarzania [K157A]-FVII:

5'-CCG AAT TGT GGG GGG CGC GGT GTG CCC CAA AGG G-3'

SEQ ID Nr:3 (Starter DNA do wytwarzania [K157A]-FV11:

5'-CCC TTT GGG GCA CAC CGC GCC CCC CAC AAT TCG G-3'

SEQ ID Nr:4 (Starter DNA do wytwarzania [V158D]-FVH:

5' -GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3'

SEQ ID Nr:5 (Starter DNA do wytwarzania [V158D]-FVII:

5'-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3'

SEQ ID Nr:6 (Starter DNA do wytwarzania [V158T]-FVII:

PL 204 888 B1

5'-GTG GGG GGC AAG ACG TGC CCC AAA GGG G-3'

SEQ ID Nr:7 (Starter DNA do wytwarzania [V158T]-FVII:

5'-CCC CTT TGG GGC ACG TCT TGC CCC CCA C-3'

SEQ ID Nr: 8 (Starter DNA do wytwarzania [E296V/M298Q]

FVII:

5'-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3'

SEQ ID Nr: 9 (Starter DNA do wytwarzania [E296V/M298Q]

FVII:

5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3'

SEQ ID Nr:10 (Starter DNA do wytwarzania [M298Q]-FVII:

5'-GCC CTG GAG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3'

SEQ ID Nr:11 (Starter DNA do wytwarzania [M298Q]-FVII:

5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CTC CAG GGC-3'

SEQ ID Nr:12 (Starter DNA do wytwarzania [M298K]-FVII:

5'-GCC CTG GAG CTC AAG GTC CTC AAC GTG-3'

SEQ ID Nr:13 (Starter DNA do wytwarzania [M298K]-FVII:

5'-CAC CTT GAG GAC CTT GAG CTC CAG GGC-3'

SEQ ID Nr:14 (Starter DNA do wytwarzania [S336G]-FVII:

5'-GGC TAG TCG GAT GGC GGC AAG GAC TCC TGC AAG-3'

SEQ ID Nr:15 (Starter DNA do wytwarzania [S336G]-FVII:

5'-CTT GCA GGA GTC CTT GCC GCC ATC CGA GTA GCC-3'

SEQ ID Nr:16 (Starter DNA do wytwarzania [K337A]-FVII:

5'-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3'

SEQ ID Nr:17 (Starter DNA do wytwarzania [K337A]-FVII:

5'-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3'

Claims

1. Wariant polipeptydu czynnika VII o sekwencji SEQ ID Nr:1 zawierający podstawienie Met w pozycji 298, przy czym M298 jest zastą piona Arg, Gln lub Asn.

2. Wariant polipeptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że aminokwas Val w pozycji 158 został zastąpiony innym aminokwasem.

3. Wariant polipeptydu według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że aminokwas Glu w pozycji 296 został zastąpiony innym aminokwasem.

4. Wariant polipeptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że aminokwas Lys w pozycji 337 został zastąpiony innym aminokwasem.

PL 204 888 B1

5. Wariant polipeptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że, co najmniej jeden aminokwas w pozostał ych pozycjach w domenie proteazy został zastą piony innym aminokwasem.

6. Wariant polipeptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że co najwyżej 20 dodatkowych aminokwasów w pozostałych pozycjach w domenie proteazy zostało zastąpionych innymi aminokwasami.

7. Wariant polipeptydu wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e co najmniej jeden aminokwas odpowiadający aminokwasowi w pozycji wybranej spośród 159-170 w SEQ ID Nr: 1 został zastąpiony innym aminokwasem.

8. Wariant polipeptydu wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e co najmniej jeden aminokwas odpowiadający aminokwasowi w pozycji wybranej spośród 290-312 w SEQ ID Nr: 1, został zastąpiony innym aminokwasem.

9. Wariant polipeptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jeden aminokwas odpowiadający aminokwasowi w pozycji wybranej spośród 330-339 w SEQ ID Nr: 1, został zastąpiony innym aminokwasem.

10. Wariant polipeptydu według zastrz. 2, znamienny tym, ze Val w pozycji 158 została zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ser, Thr, Asn, Gln, Asp i Glu.

11. Wariant polipeptydu według zastrz. 3, znamienny tym, że Glu w pozycji 296 została zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Arg, Lys i Val.

12. Wariant polipeptydu według zastrz. 4, znamienny tym, że Lys w pozycji 337 została zamieniona przez aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp i Glu.

13. Wariant polipeptydu czynnika VII według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi go M298Q-FVIIa.

14. Wariant polipeptydu czynnika VII według zastrz. 10, znamienny tym, że stanowi go V158D/M298Q-FVIIa.

15. Wariant polipeptydu czynnika VII według zastrz. 10, znamienny tym, że stanowi go V158T/M298Q-FVIIa.

16. Wariant polipeptydu czynnika VII według zastrz. 11, znamienny tym, że stanowi go

E296V/M298Q-FVIIa.

17. Wariant polipeptydu czynnika VII według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że stanowi go V158D/E296V/M298Q-FVIIa.

18. 17. Wariant polipeptydu czynnika VII według zastrz. 10 albo 11, albo 12, znamienny tym, że stanowi go V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa.

19. Konstrukcja kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą wariant polipeptyd czynnika VII jak zdefiniowano w zastrz. 1-18.

20. Konstrukcja kwasu nukleinowego według zastrz. 19, znamienna tym, że jest nią wektor.

21. Rekombinowana komórka gospodarza zawierająca konstrukcję kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. od 19 do 20.

22. Rekombinowana komórka gospodarza według zastrz. 21, znamienna tym, że pochodzi od ssaka.

23. Rekombinowana komórka gospodarza według zastrz. 22, znamienna tym, że komórka jest wybrana z grupy obejmującej komórki CHO, komórki BHK lub komórki HEK.

24. Zwierzę transgeniczne nie-człowiek posiadające i wykazujące ekspresję konstrukcji kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 19-20.

25. Sposób wytwarzania wariantu polipeptydu czynnika VII, jak zdefiniowano w zastrz. 1-18, znamienny tym, że hoduje się komórki jak zdefiniowano w zastrz. 28-30 w odpowiedniej pożywce wzrostowej, w warunkach umożliwiających ekspresję konstrukcji kwasu nukleinowego, i odzyskuje się otrzymany polipeptyd z pożywki hodowlanej.

26. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera wariant polipeptydu czynnika VII o sekwencji SEQ ID Nr:1 w której co najmniej aminokwas Met w pozycji 298 został zastą piony Arg, Gln lub Asn oraz ewentualnie, farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

27. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera wariant polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 1-18 oraz ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

28. Zastosowanie wariantu polipeptydu czynnika VII jak zdefiniowano w zastrz. 1-18, do wytwarzania leku do leczenia przypadków krwawienia lub wzmacniania normalnego układu hemostatycznego.