KR20160065925A - 응고 인자 vii 폴리펩티드 - Google Patents

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KR20160065925A
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헨릭 외스터가르트
프라풀 에스. 간디
올레 흐빌스테드 올센
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노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트
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Abstract

본 발명은 응고 활성을 가지는 변형된 인간 응고 인자 VII 폴리펩티드, 특히 활성화될 때 야생형 FVIIa에 비교하여 더 높은 단백질 가수분해 활성 및 감소된 항트롬빈 반응성 (항트롬빈에 의한 억제에 대해 증가된 저항)을 가지는 변이체에 관한 것이다. 변이체들은 성숙한 인간 FVII의 L288, W201 및/또는 K337에서의 특이적인 치환과 함께 위치 T293에 특정 치환을 가진다. 청구범위는 또한 상기 인자 VII 폴리펩티드의 약학 조성물, 및 의학적 용도에도 관련된다.

Description

응고 인자 VII 폴리펩티드{COAGULATION FACTOR VII POLYPEPTIDES}
본 발명은 응혈촉진 활성을 가지는 응고 인자 VII (인자 VII) 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그런 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물, 그런 폴리펩티드의 치료 방법 및 용도에 관한 것이다.
서열 목록
SEQ ID NO. 1: 야생형 인간 응고 인자 VII.
SEQ ID NO. 2: 인간 응고 인자 VII의 프로테아제 도메인.
SEQ ID NO. 3: 인간아족 (침팬지) 응고 인자 VII의 프로테아제 도메인.
SEQ ID NO. 4: 개 (개) 응고 인자 VII의 프로테아제 도메인.
SEQ ID NO. 5: 돼지 (돼지) 응고 인자 VII의 프로테아제 도메인.
SEQ ID NO. 6: 소 (소) 응고 인자 VII의 프로테아제 도메인.
SEQ ID NO. 7: 쥐과 동물 (마우스)의 응고 인자 VII의 프로테아제 도메인.
SEQ ID NO. 8: 쥐과 동물 (래트)의 응고 인자 VII의 프로테아제 도메인.
SEQ ID NO. 9: 토끼과 (토끼)의 응고 인자 VII의 프로테아제 도메인.
혈관에 대한 손상은 세포 성분들과 분자 성분들 사이의 복잡한 상호작용을 포함하는 지혈 시스템을 활성화시킨다. 궁극적으로 출혈의 중단을 유발하는 과정은 지혈로서 알려져 있다. 지혈의 중요한 부분은 혈액의 응고 및 손상 부위에서의 응혈의 형성이다. 응고 과정은 여러 단백질 분자들의 기능에 매우 의존적이다. 이것들은 응고 인자로서 알려져 있다. 응고 인자들의 일부는 비활성 자이모겐 또는 효소적으로 활성 형태로 존재할 수 있는 프로테아제이다. 자이모겐 형태는 다른 단백질 가수분해적으로 활성인 응고 인자를 특징으로 하는 폴리펩티드 사슬의 특이한 절단에 의해 효소적으로 활성인 형태로 전환될 수 있다.
인자 VII은 간에서 합성되고 단일-사슬 당단백질로서 혈액으로 분비되는 비타민 K-의존성 혈장 단백질이다. 인자 VII 자이모겐 (zymogen)은 단일 부위, 즉 SEQ ID NO:1의 R152와 I153 사이에서의 특이한 단백질 가수분해적 절단에 의해 활성화 형태 (인자 VIIa)로 전환되어, 단일 이황화 결합에 의해 연결된 2 사슬 분자를 초래한다. 인자 VIIa의 2개의 폴리펩티드 사슬은 각각 SEQ ID NO:1 (야생형 인간 응고 인자 VII)의 잔기 1 내지 152 및 153 내지 406에 해당하는 경쇄 및 중쇄로 언급된다. 인자 VII은 자이모겐을 우선적으로 순환시키지만, 소량의 분획은 활성화된 형태 (인자 VIIa)로 존재한다.
혈액 응고 과정은 3단계: 개시, 증폭 및 증식으로 나누어질 수 있다. 개시 및 증식 단계는 지혈에서 많은 중요한 기능을 가지는 응고 인자인 트롬빈의 형성에 기여한다. 응고 연쇄반응은 혈관의 내면을 라이닝하는 내피 세포들의 단일층 장벽이 손상되면 시작된다. 이것은 내피하 세포 및 혈관 밖의 매트릭스 단백질을 노출시키고 거기에 혈액 중의 혈소판들이 달라붙게 된다. 만약 이런 일이 일어나면, 내피하 세포의 표면상에 존재하는 조직 인자 (TF)는 혈액 중의 순환하는 인자 VIIa에 노출된다. TF는 막-결합 단백질이고 인자 VIIa에 대한 수용체로서 작용한다. 인자 VIIa는 본질적으로 낮은 활성을 가지고 있는 효소, 세린 프로테아제이다. 그러나, 인자 VIIa가 TF에 결합되면, 그것의 활성은 크게 증가한다. 인자 VIIa의 TF와의 상호작용은 또한 인자 VIIa를 TF 내포 세포의 인지질 표면 위 및 인자 X의 Xa로의 활성화에 대해 최적인 위치에 위치시킨다. 이런 일이 일어날 때, 제 Xa 인자는 TF 내포 세포의 표면에서 소위 "프로트롬비나제 (prothrombinase)"를 형성하기 위하여 Va 인자와 조합될 수 있다. 그러면 프로트롬비나제 복합체는 프로트롬빈의 절단에 의해 트롬빈을 생성한다. TF를 순환하는 인자 VIIa에 노출시키고 트롬빈의 초기 생성을 유도함으로써 활성화된 경로는 TF 경로로서 알려져 있다. TF:인자 VIIa 복합체는 또한 인자 IX의 인자 IXa로의 활성화를 촉매한다. 그러면 활성화된 인자 IXa는 손상 부위에 달라붙어 있고 활성화되어 있는 혈소판들의 표면으로 확산될 수 있다. 이것은 인자 IXa가 FVIIIa와 조합하여 활성화된 혈소판의 표면 상에서 "테나제" 복합체를 형성하는 것을 허용한다. 이 복합체는 인자 X의 인자 Xa로의 활성화에서 그것의 뚜렷한 효율로 인해 증식 단계에서 핵심 역할을 한다. 인자 Xa 활성의 효율적인 테나제 촉매된 생성은 계속해서 프로트롬비나제 복합체에 의해 촉매된 프로트롬빈의 트롬빈으로의 효율적인 절단을 유도한다.
만약 인자 IX 또는 인자 VIII 중 어느 하나에 어떠한 결핍이라도 있다면, 그것은 중요한 테나제 활성에 면역손상을 입히고, 응고에 필수적인 트롬빈의 생성을 감소시킨다. 초기에 TF 경로에 의해 형성된 트롬빈은 손상 부위에서의 혈소판의 충원 (recruitment), 활성화 및 응집을 고무시키는 응혈촉진 신호로서 작용한다. 이것은 혈소판의 느슨한 일차 플러그의 형성을 초래한다. 그러나, 이런 혈소판의 일차 플러그는 불안정하고 따라서 지혈을 지속시키기 위해서 강화를 필요로 한다. 플러그의 안정화는 혈소판을 피브린 섬유의 웹에 고정시키고 (anchoring) 엮는 것 (entangling)을 포함한다.
강력하고 안정한 응혈의 형성은 국소적인 트롬빈 활성의 왕성한 폭발의 생성에 의존한다. 그러므로, 혈관 손상에 이어지는 트롬빈 생성으로 유도하는 과정에서 결핍들은 출혈 장애, 예컨대 혈우병 A 및 B형을 유발할 수 있다. 혈우병 A 및 B형을 가진 사람들은 기능성 인자 VIIIa 또는 인자 IXa가 각각 결핍되어 있다. 증식 단계에서 트롬빈 생성은 결정적으로 테나제 활성에 의존적이다, 즉 인자 VIIIa 및 FIXa를 둘 다 필요로 한다. 그러므로, 혈우병 A 또는 B형을 가진 사람들에서 일차 혈소판 플러그의 적절한 통합은 실패하고 출혈이 지속된다.
대체 요법은 혈우병 A 및 B형에 대한 전통적인 치료법으로, 인자 VIII 또는 인자 IX의 정맥 내 투여를 포함한다. 그러나 많은 경우에, 환자들은 주입된 단백질에 대한 항체들 (또한 억제제로서도 알려짐)을 발달시키고, 그것들은 치료의 효능을 감소시키거나 무효화한다. 재조합 인자 VIIa (Novoseven®)는 억제제를 이용한 혈우병 A 또는 B형 환자들의 치료에 대해 승인되었고, 또한 외상 및/또는 수술과 관련된 출혈 에피소드를 중지하거나 방지하기 위하여 사용된다. 재조합 인자 VIIa는 또한 선천성 인자 VII 결핍증 환자의 치료에 대해서도 승인되었다. 재조합 FVIIa는 TF-무관한 메커니즘을 통해 작동하는 것으로 제시되었다. 이 모델에 따르면, 재조합 FVIIa는 활성화된 혈액 혈소판의 표면으로 그것의 Gla-도메인에 의해 지시되고, 그곳에서 단백질 가수분해적으로 인자 X를 인자 Xa로 활성화시킴으로써 기능성 테나제 복합체에 대한 요구를 우회한다. TF의 부재하에서의 FVIIa의 낮은 효소적 활성뿐 아니라 막에 대한 Gla-도메인의 낮은 친화성은 혈우병에 걸린 사람들에서 지혈을 이루기 위해 필요한 순환하는 FVIIa의 생리적 수준을 웃도는 수준에 대한 요구를 설명할 수 있었다.
재조합 인자 VIIa는 2 내지 3시간의 생체 내 기능성 반감기를 가지므로 환자들에서 출혈을 해결하기 위하여 빈번한 투여를 필요로 할 수 있다. 나아가, 환자들은 예방책으로서보다는 출혈이 시작된 후에 단지 인자 VIIa 치료법만을 받고, 그것은 자주 그들의 일반적인 삶의 질을 침해한다. 더 긴 생체 내 기능성 반감기를 가지는 재조합 인자 VIIa 변이체는 필요한 투여 횟수를 줄일 것이고, 그것은 덜 빈번한 투여를 지지하며, 그로써 환자들과 돌보미들의 유익에 대해 인자 VIIa 치료법을 상당히 향상시키겠다는 약속을 유지한다.
WO02/22776은 야생형 FVIIa에 비교하여 증강된 단백질 가수분해 활성을 가지는 인자 VIIa 변이체들을 개시한다. 임상 실험에서 WO02/22776에 개시된 치환들을 포함하고 있는 인자 VII 폴리펩티드는 증강된 단백질 가수분해 활성을 가지는 변이체의 효능의 관점에서 바람직한 임상 결과를 보인다 (de Paula et al (2012) J Thromb Haemost, 10:81-89).
WO2007/031559는 항트롬빈에 의한 억제에 대해 감소된 민감성을 가지는 인자 VII 변이체들을 개시한다.
WO2009/126307은 변경된 응혈촉진 활성을 가지는 변형된 인자 VII 폴리펩티드를 개시한다.
일반적으로, 응고장애를 가지고 있는 사람들에게 충족되지 못한 많은 의학적 요구가 있다. 응고 형성을 촉진하기 위한 재조합 인자 VIIa의 사용은 치료제로서의 그것의 커가는 중요성을 강조한다. 그러나, 재조합 인자 VIIa 치료법에는 여전히 충족되지 못한 의학적 요구가 상당히 남아 있고, 향상된 약학적 특성, 예를 들면 증가된 생체 내 기능성 반감기 및 증강된 또는 더 높은 활성을 가지는 재조합 인자 VIIa 폴리펩티드는 이들 요구의 일부를 충족시킬 수 있을 것이다.
발명의 요약
본 발명은 향상된 약학적 특성을 가지도록 디자인된 인자 VII 폴리펩티드를 제공한다. 광범위한 한 측면으로, 발명은 인간 야생형 인자 VIIa에 비교하여 증가된 생체 내 기능성 반감기를 나타내는 인자 VII 폴리펩티드에 관련된다. 다른 광범위한 측면으로, 발명은 인간 야생형 인자 VIIa에 비교하여 증강된 활성을 가지는 인자 VII 폴리펩티드에 관련된다. 추가의 광범위한 측면으로, 발명은 인간 야생형 인자 VIIa에 비교하여, 내인성 혈장 억제제, 특히 항트롬빈에 의한 비활성화에 대해 증가된 저항을 나타내는 인자 VII 폴리펩티드에 관련된다.
본원에는 항트롬빈 비활성화에 대한 저항 및 증강된 또는 손실이 거의 없거나 없는 단백질 가수분해 활성을 부여하는 돌연변이들의 조합을 포함하는 증가된 생체 내 기능성 반감기를 가지는 인자 VII 폴리펩티드가 제공된다. 특히 흥미로운 본 발명의 측면으로, 인자 VII 폴리펩티드는 생체 내 기능성 반감기를 증가시키기 위하여 하나 또는 그 이상의 "반감기 연장 부분"에 커플링된다.
한 측면으로, 발명은 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대하여 둘 또는 그 이상의 치환을 포함하고 있는 인자 VII 폴리펩티드에 관련되는데, 이때 T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 L288은 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N) 또는 Ala (A)에 의해 대체되며 및/또는 W201은 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되고 및/또는 K337은 Ala (A) 또는 Gly (G)에 의해ㅐ 대체된다.
발명의 인자 VII 폴리펩티드는 T293의 Lys (K)로의 치환 및 L288의 Phe (F)로의 치환을 포함할 수 있다. 인자 VII 폴리펩티드는 T293의 Lys (K)로의 치환 및 L288의 Tyr (Y)로의 치환을 포함할 수 있다. 인자 VII 폴리펩티드는 T293의 Arg (R)로의 치환 및 L288의 Phe (F)로의 치환을 포함할 수 있다. 인자 VII 폴리펩티드는 T293의 Arg (R)로의 치환 및 L288의 Tyr (Y)로의 치환을 포함할 수 있다. 인자 VII 폴리펩티드는 K337의 Ala (A)로의 치환을 포함하거나, 추가로 포함할 수 있다. 인자 VII 폴리펩티드는 T293의 Lys (K)로의 치환 및 W201의 Arg (R)로의 치환을 포함할 수 있다.
흥미로운 구체예에서 발명은 적어도 하나의 반감기 연장 부분과 커플링된 인자 VII 폴리펩티드에 관련된다.
다른 측면으로, 발명은 발명의 인자 VII 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관련된다.
추가의 측면으로, 발명은 발명의 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관련된다.
본 발명의 일반적인 목적은 응고장애를 가지고 있는 사람들에서 현재 이용가능한 치료 옵션들을 향상시키고 향상된 치료 유용성을 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 얻는 것이다.
본 발명이 가지는 한 가지 목적은 약학적으로 허용되는 단백질 가수분해 활성을 유지하면서 연장된 생체 내 기능성 반감기를 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 얻는 것이다. 이 목적을 이루기 위하여, 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 실질적으로 단백질 가수분해 활성을 보존하면서 혈장 억제제 항트롬빈에 의한 비활성화에 대한 감소된 민감성을 부여하는 돌연변이들의 조합을 포함하며; 특히 흥미로운 본 발명의 구체예에서 인자 VII 폴리펩티드는 또한 하나 또는 그 이상의 "반감기 연장 부분"에 커플링된다.
본 발명의 변형된 인자 VII 폴리펩티드를 사용한 의학적 치료는 현재 이용가능한 치료 처방을 능가하는 많은 장점, 예컨대 주사 사이의 더 긴 기간, 더 낮은 단위용량, 더욱 편리한 투여 및 주사 사이의 잠재적으로 향상된 지혈성 보호를 제공한다.
도 1은 상이한 종들로부터의 FVIIa 프로테아제 도메인의 아미노산 서열 배열을 도시한다.
도 2는 FVIIa-항트롬빈 복합체들의 생체 내 축적과의 시험관 내 항트롬빈 반응성 사이의 상관을 도시한다.
도 3은 FVIIa WT의 위치 201에서의 트립토판의 형태와 비교한 FVIIa 변이체 W201R T293Y 이중 돌연변이의 위치 201에서의 아르기닌의 형태를 도시한다.
도 4는 FVIIa 변이체 W201R T293Y 이중 돌연변이로부터의 위치 293에 있는 타이로신과 항트롬빈 사이의 상호작용의 가설적 모델을 도시한다. 이것은 항트롬빈과 막대기 모양으로 표시한 FVIIa 변이체 W201R T293Y 이중 돌연변이 사이의 복합체의 이론적 모델을 기초로 한다. 항트롬빈 아미노산은 접두어 "AT"로 표시되는 한편; FVIIa 아미노산은 접두어 "FVIIa"로 표시된다.
도 5는 (A) 헤파로산 및 (B) 환원 단부에서 말레이미드 기능성을 가지는 헤파로산 중합체의 구조를 도시한다.
도 6은 SDS-PAGE에 의한 포합체 순도의 평가를 도시한다. (A) 최종 FVIIa 포합체의 SDS-PAGE 분석. 겔은 HiMark HMW 표준 (레인 1); FVIIa (레인 2); 13k-HEP-[C]-FVIIa (레인 3); 27k-HEP-[C]-FVIIa (레인 4); 40k-HEP-[C]-FVIIa (레인 5); 52k-HEP-[C]-FVIIa (레인 6); 60k-HEP-[C]-FVIIa (레인 7); 65k-HEP-[C]-FVIIa (레인 8); 108k-HEP-[C]-FVIIa (레인 9) 및 157k-HEP-[C]-FVIIa407C (레인 10)로 로딩되었다. (B) 당포합된 52k-HEP-[N]-FVIIa의 SDS-PAGE. 겔은 HiMark HMW 표준 (레인 1), ST3Gal3 (레인 2), FVIIa (레인 3), 아시알로 FVIIa (레인 4) 및 52k-HEP-[N]-FVIIa (레인 5)로 로딩되었다. [N]은 HEParosan이 N-글리칸에 부착되어 있는 인자 포합체를 나타낸다. [C]는 HEParosan이 시스테인 잔기에 부착되어 있는 인자 포합체를 나타낸다.
도 7은 헤파로산 포합체와 글리코페길화된 FVIIa 참조의 FVIIa 응고 활성 수준의 분석을 도시한다.
도 8은 헤파로산 포합체와 글리코페길화된 FVIIa 참조의 단백질 가수분해 활성을 도시한다.
도 9는 스프라그 도울리 래트에서의 PK 결과 (LOCI)를 도시한다. 변형되지 않은 FVIIa (2개 연구), 13k-HEP-[C]-FVIIa407C, 27k-HEP-[C]-FVIIa407C, 40k-HEP-[C]-FVIIa407C, 52k-HEP-[C]-FVIIa407C, 65k-HEP-[C]-FVIIa407C, 108k-HEP-[C]-FVIIa407C 및 157k-HEP-[C]-FVIIa407C, 당포합된 52k-HEP-[N]-FVIIa 및 참조 분자 (40kDa-PEG-[N]-FVIIa (2개 연구) 및 40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)의 비교. 데이터는 반로그식 도표로 평균 ± SD (n = 3 내지 6)로서 도시된다. [N]은 HEParosan이 N-글리칸에 부착되어 있는 인자 포합체를 나타낸다. [C]는 HEParosan이 시스테인 잔기에 부착되어 있는 인자 포합체를 나타낸다.
도 10은 스프라그 도울리 래트에서의 PK 결과 (응혈 활성)를 도시한다. 변형되지 않은 FVIIa (2개 연구), 13k-HEP-[C]-FVIIa407C, 27k-HEP-[C]-FVIIa407C, 40k-HEP-[C]-FVIIa407C, 52k-HEP-[C]-FVIIa407C, 65k-HEP-[C]-FVIIa407C, 108k-HEP-[C]-FVIIa407C 및 157k-HEP-[C]-FVIIa407C, 당포합된 52k-HEP-[N]-FVIIa 및 참조 분자 (40kDa-PEG-[N]-FVIIa (2개 연구) 및 40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)의 비교. 데이터는 반로그식 도표로 도시된다. [N]은 HEParosan이 N-글리칸에 부착되어 있는 인자 포합체를 나타낸다. [C]는 HEParosan이 시스테인 잔기에 부착되어 있는 인자 포합체를 나타낸다.
도 11은 많은 HEP-[C]-FVIIa407C 포합체에 대해 HEP-크기와 평균 거주 시간 (MRT) 사이의 관계를 도시한다. PK 연구로부터의 MRT 값들이 포합체의 헤파로산 중합체 크기에 대해 도표화된다. 도표는 비-포합 FVIIa, 13k-HEP-[C]-FVIIa407C, 27k-HEP-[C]-FVIIa407C, 40k-HEP-[C]-FVIIa407C, 52k-HEP-[C]-FVIIa407C, 65k-HEP-[C]-FVIIa407C, 108k-HEP-[C]-FVIIa407C 및 157k-HEP-[C]-FVIIa407C에 대한 값들을 나타낸다. MRT (LOCI)는 Phoenix WinNonlin 6.0 (Pharsight Corporation)을 사용하여 비-구획 방법들에 의해 계산되었다. [N]은 HEParosan이 N-글리칸에 부착되어 있는 인자 포합체를 나타낸다. [C]는 HEParosan이 시스테인 잔기에 부착되어 있는 인자 포합체를 나타낸다.
도 12는 벤즈알데하이드기를 사용하는 글리실시알산 시티딘 모노포스페이트 (GSC)의 기능화를 도시한다. GSC는 4-포르밀벤조산으로 아실화되고 계속해서 환원성 아민화 반응에 의해 헤파로산 (HEP)-아민과 반응된다.
도 13은 벤즈알데하이드기를 사용하는 헤파로산 (HEP)의 기능화 및 후속되는 환원성 아민화 반응으로의 글리실시알산 시티딘 모노포스페이트 (GSC)와의 반응을 도시한다.
도 14는 티오기를 사용하는 글리실시알산 시티딘 모노포스페이트 (GSC)의 기능화 및 후속적인 말레이미드 기능화된 헤파로산 (HEP) 중합체와의 반응을 도시한다.
도 15는 헤파로산 (HEP)-글리실시알산 시티딘 모노포스페이트 (GSC)를 도시한다.
도 16은 스프라그 도울리 래트에서의 PK 결과 (LOCI)를 도시한다. 2x20K-HEP-[N]-FVIIa; 1x40K-HEP-[N]-FVIIa 및 1x40k-PEG-[N]-FVIIa의 반로그식 도표로의 비교. 데이터는 평균 ± SD (n = 3 내지 6)로서 도시된다.
도 17은 스프라그 도울리 래트에서의 PK 결과 (응혈 활성)를 도시한다. 2x20K-HEP-[N]-FVIIa; 1x40K-HEP-[N]-FVIIa 및 1x40k-PEG-[N]-FVIIa의 반로그식 도표로의 비교.
도 18은 아시알로FVIIa 당단백질이 ST3GalIII 시알릴트란스페라제의 존재하에 HEP-GSC와 반응하는 반응 계획도를 도시한다.
본 발명은 향상된 약학적 특성을 나타내는 인자 VII 폴리펩티드의 디자인 및 용도에 관련된다.
한 측면으로, 본 발명은 증가된 생체 내 기능성 반감기, 혈장 억제제 항트롬빈에 의한 비활성화에 대한 감소된 민감성 및 증강되거나 보존된 단백질 가수분해 활성을 나타내는 인자 VII 폴리펩티드의 디자인 및 용도에 관련된다. 본 발명의 발명자들에 의해 반감기 연장 부분에 포합으로 조합된 인간 인자 VII에서의 특정한 돌연변이 조합은 상기 언급된 특성들을 부여하는 것이 발견되었다. 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 더 길게 지속되는 응고-촉진 활성이 요구되는 상황들에서 치료적으로 유용한 연장된 기능성 반감기를 가진다. 그런 인자 VII 폴리펩티드는 T293의 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)로의 치환을 포함한다. 이 측면에서 발명은 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대해 둘 또는 그 이상의 치환을 포함하고 있는 인자 VII 폴리펩티드에 관련되며, 이때 T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 L288은 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N), Ala (A) 또는 Trp (W)에 의해 대체된다. 발명은 또한 인간 인자 VII (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열에 대해 둘 또는 그 이상의 치환을 포함하고 있는 인자 VII 폴리펩티드에 관련되며, 이때 T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 W201은 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체된다. 나아가, 발명은 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대해 둘 또는 그 이상의 치환을 포함하고 있는 인자 VII 폴리펩티드에 관련되며, 이때 T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 K337은 Ala (A) 또는 Gly (G)에 의해 대체된다. 임의로, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 추가로 Q176의 Lys (K), Arg (R) 또는 Asn (N)으로의 치환을 포함할 수 있다. 임의로 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 추가로 Q286의 Asn (N)으로의 치환을 포함할 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 증강된 단백질 가수분해 활성을 나타내는 인자 VII 폴리펩티드의 디자인 및 용도에 관련된다. 본 발명의 발명자들에 의해 인간 인자 VII의 위치 L288 및/또는 W201에서의 특정 돌연변이는 인자 VII 폴리펩티드에 대해 증강된 단백질 가수분해 활성을 부여하는 것이 발견되었다. 이 측면에서, 발명은 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대해 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하고 있는 인자 VII 폴리펩티드에 관련되며, 이때 L288은 Phe (F), Tyr(Y), Asn (N), Ala (A) 또는 Trp (W)에 의해 대체되고, 단 폴리펩티드는 다음의 치환쌍을 갖지 않아야 한다: L288N/R290S 또는 L288N/R290T. 추가로 이 측면에 따르면, 발명은 W201이 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되는 한 상황을 특징으로 하는, 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대해 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드에 관련된다.
인자 VII
응고 인자 VII (인자 VII)는 간에서 주로 생성되는 당단백질이다. 성숙한 단백질은 SEQ ID NO:1로 정의되는 (또한 예를 들면 미국 특허 제 4784950호에 개시됨) 406개의 아미노산 잔기로 구성되며 4개의 도메인으로 구성된다. N-말단 감마-카르복시글루탐산 (Gla) 풍부 도메인과 이어서 2개의 표피 성장 인자 (EGF)-유사 도메인 및 C-말단 트립신-유사 세린 프로테아제 도메인이 있다. 인자 VII은 혈장에서, 대부분 단일-사슬 분자로서 순환한다. 인자 VII은 잔기 Arg152와 Ile153 사이의 절단에 의해 인가 VIIa로 활성화되고, 그 결과 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 2-사슬 단백질이 유발된다. 경쇄는 Gla 및 EGF-유사 도메인을 함유하는 한편, 중쇄는 프로테아제 도메인이다. 인자 VII에서 SEQ ID NO:1에 따르는 특정 Glu (E) 잔기, 즉 E6, E7, E14, E16, E19, E20, E25, E26, E29 및 E35는 번역 후에 감마-카르복실화될 수 있다. Gla 도메인의 감마-카르복시글루탐산 잔기는 많은 칼슘 이온의 협조에 필요한데, 그것은 Gla 도메인을 인지질 막과의 상호작용을 중재하는 형태로 유지한다.
용어 FVII 및 "인자 VII"은 본원에서 절단되지 않은 단일-사슬 자이모겐, 인자 VII, 뿐만 아니라 절단된 2-사슬, 그로써 활성화된 프로테아제인 인자 VIIa를 나타낸다. "인자 VII"은 개별적으로 존재하고 서로 상이할 수 있는 인자 VII의 천연 대립유전자 변이체들을 포함한다. 인간 야생형 인자 VII 서열은 SEQ ID NO:1에 제공된다. 본원에서 용어 "인자 VII 폴리펩티드"는 인자 VII의 절단되지 않은 단일 사슬 자이모겐 폴리펩티드 변이체 (본원에서 기술된 것과 같음), 뿐만 아니라 절단된 2 사슬 및 그로써 활성화된 프로테아제를 나타낸다.
인자 VII 및 인자 VII 폴리펩티드는 잘 알려져 있는 제조 및 정제 방법들을 사용하여 혈장-유도되거나 재조합적으로 제조될 수 있다. 글리코실화, 감마-카르복실화 및 다른 번역-후 변형들의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 그것의 성장 조건에 따라 달라질 수 있다.
인자 VII 폴리펩티드
용어 "인자 VII" 또는 "FVII"은 인자 VII 폴리펩티드를 나타낸다.
용어 "인자 VII 폴리펩티드"는 인자 VII 변이체들, 인자 VII 포합체들 및 화학적으로 변형되어 있는 인자 VII뿐만 아니라 야생형 인자 VII 분자들을 포함한다. 그런 변이체들, 포합체들 및 화학적으로 변형된 인자 VII은 야생형 인간 인자 VIIa에 대하여 실질적으로 동일하거나, 향상된 활성을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 인자 VII 폴리펩티드의 "활성"은 야생형 인간 인자 VII에 의해 나타난 어떠한 활성을 말하고, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 응고 또는 응고제 활성, 응혈 촉진 활성, 인자 X 활성화 또는 인자 IX 활성화를 이루기 위한 것과 같은 단백질 가수분해적 또는 촉매적 활성; TF, 인자 X 또는 인자 IX에 결합하는 능력; 및/또는 인지질에 결합하는 능력을 포함한다. 이들 활성은 인식된 분석을 사용하여, 예를 들면 시험관 내 또는 생체 내에서 응고를 측정함으로써 시험관 내에서 또는 생체 내에서 평가될 수 있다. 그런 분석의 결과들은 폴리펩티드가 생체 내에서 폴리펩티드의 활성과 상관될 수 있는 활성을 나타내는 것을 가리키고, 이때 생체 내 활성은 생물학적 활성으로서 언급될 수 있다. 인자 VII 폴리펩티드의 활성을 측정하기 위한 분석들은 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있다. FVII 폴리펩티드의 활성을 평가하기 위한 예시적인 분석들은 하기 실시예들에 기술되는 것들과 같은 시험관 내 단백질 가수분해 분석들을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "증강된, 또는 보존된 활성"은 야생형 인간 인자 VIIa에 비교하여 실질적으로 동일하거나 증가된 활성을 나타내는 인자 VIIa 폴리펩티드, 예를 들면 i) TF의 존재 및/또는 부재하에 재조합 야생형 인간 인자 VIIa에 비교하여 실질적으로 동일하거나 증가된 단백질 가수분해 활성을 나타내는 인자 VIIa 폴리펩티드; ii) 재조합 야생형 인간 인자 VIIa에 비교하여 실질적으로 동일하거나 증가된 TF 친화성을 가지는 인자 VII 폴리펩티드; iii) 활성화된 혈소판에 대한 실질적으로 동일하거나 증가된 친화성을 가지는 인자 VII 폴리펩티드; 또는 iv) 재조합 야생형 인간 인자 VIIa에 비교하여 인자 X 또는 인자 IX에 결합하는 실질적으로 동일하거나 증가된 친화성/능력을 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 말한다. 예를 들어 보존된 활성은 보유된 활성의 양이 야생형 인간 인자 VIIa에 비교하여 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 또는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상인 것을 의미한다. 예를 들어 증강된 활성은 보유된 활성의 양이 야생형 인간 인자 VIIa에 비교하여 활성의 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 3000%, 5000%, 10 000%, 30 000% 또는 그 이상 또는 약 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 3000%, 5000%, 10 000%, 30 000% 또는 그 이상인 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "인자 VII 변이체"는 SEQ ID NO:1의 서열을 가지는 인자 VII을 명시하기 위한 것으로 의도되는데, 이때 원래의 단백질의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 자연 발생 아미노산에 의해 치환되어 있고 및/또는 원래의 단백질의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실되어 있으며 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산들이 단백질에 삽입되어 있고 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산들이 원래의 단백질에 첨가되어 있다. 그런 첨가는 원래의 단백질의 N- 또는 C-말단 중 어느 하나에서 또는 둘 다에서 일어날 수 있다. 한 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 적어도 95% 동일하다. 다른 구체예에서 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99 % 동일하다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 특정 위치에 대한 어떠한 참조는 SEQ ID NO:1의 해당하는 위치를 나타낸다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 인자 VII 변이체는 야생형 인간 인자 VIIa에 비교하여 증강된 또는 보존된 활성을 가진다.
본 기술에서 사용된 아미노산 치환에 대한 용어들은 다음과 같다. 첫 번째 문자는 SEQ ID NO:1의 위치에서 자연적으로 존재하는 아미노산을 나타낸다. 이어지는 수는 SEQ ID NO:1에서의 위치를 나타낸다. 두 번째 문자는 천연 아미노산을 치환하는 상이한 아미노산을 나타낸다. 예를 들면 K197A-인자 VII은, SEQ ID NO:1의 위치 197에 있는 라이신이 알라닌에 의해 대체된 것이다.
본 맥락에서, 아미노산의 3-문자 또는 1-문자 약어들이 아래에서 표시된 것과 같이 종래 의미로 사용되었다. 분명하게 표시되지 않는 한, 본원에서 언급된 아미노산들은 L-아미노산이다.
아미노산에 대한 약어들:
Figure pct00001
본원에서 사용되는 용어 "인자 VII 포합체"는 하나 또는 그 이상의 아미노산 및/또는 하나 또는 그 이상의 부착된 글리칸 부분이 화학적으로 및/또는 효소적으로, 예컨대 알킬화, 글리코실화, 아실화, 에스테르 형성, 이황화 결합 형성 또는 아미드 형성에 의해 변형되어 있는 인자 VII 폴리펩티드를 표시하기 위한 것으로 의도된다.
일부 구체예에서, 발명의 인자 VII 포합체는 야생형 인자 VII에 대하여 실질적으로 동일하거나 증강된 생물학적 활성을 나타낸다.
증강된 단백질 가수분해 활성
잔기 L288 및 W201의 특정 돌연변이를 가지는 인자 VII 폴리펩티드는 놀랍게도, 본 발명자들에 의해 증강된 단백질 가수분해 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
WO02/22776에 기술된 것과 같이, 인자 VII 변이체 K337A는 증강된 단백질 가수분해 활성을 가지는 것으로 설명되었다. WO03/027147에 기술된 것과 같이, 인자 VII 변이체 L305V 및 L305I 또한 더 높은 고유 활성을 가지는 것으로 기술되었다.
단백질 가수분해 활성은 아래에서 한층 더 논의되는 것과 같이 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 적당한 방법에 의해 측정될 수 있다.
예를 들어 증강된 단백질 가수분해 활성은 보유된 활성의 양이 야생형 인간 인자 VIIa에 비교하여 활성의 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 3000%, 5000%, 10 000%, 30 000% 또는 그 이상 또는 약 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 3000%, 5000%, 10 000%, 30 000% 또는 그 이상인 것을 의미한다.
반감기 - 혈장 억제제에 의한 비활성화에 대한 저항
생체 내 클리어런스 외에, 생체 내 기능성 반감기는 화합물이 체내에서 "치료적으로 유용한" 동안의 시간에 중요하다. 재조합 인간 야생형 인자 VIIa의 순환하는 반감기는 약 2.3시간이다 ("Summary Basis for Approval for NovoSevenⓒ", FDA 참조 번호 96 0597).
용어 "생체 내 기능성 반감기"는 그것의 일반적인 의미, 즉 최종 단계에서 신체/표적 기관에 남아있는 인자 VII 폴리펩티드의 생물학적 활성을 50%로 감소시키는 데 필요한 시간 또는 인자 VII 폴리펩티드의 활성이 그것의 초기 값의 50%가 되는 시간으로 사용된다. 생체 내 반감기에 대한 대체 용어는 말단 반감기, 혈장 반감기, 순환하는 반감기, 순환성 반감기 및 클리어런스 반감기를 포함한다. 반감기는 기술분야에 공지되어 있는 적당한 방법들, 예컨대 하기 실시예 17에 기술되어 있는 것 및 Pharmacokinetics and Pharmacodynamics: The Quantitative Basis of Drug Therapy (Thomas N. Tozer, Malcolm Rowland)의 서문에 기술되어 있는 것들에 의해 측정될 수 있다.
생체 내 기능성 반감기 또는 혈장 반감기에 대해 사용된 용어 "증가된"은 폴리펩티드의 관련 반감기가 참조 분자, 예컨대 비교되는 조건하에서 측정되는 야생형 인간 인자 VIIa의 그것에 대해 증가된 것을 나타내기 위해 사용된다.
일부 구체예에서, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 야생형 인간 인자 VIIa에 대하여 증가된 생체 내 기능성 반감기를 나타낸다. 예를 들어 관련된 반감기는 적어도 약 25%, 예컨대 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 100%, 150%, 200%, 500%, 1000%, 3000%, 5000%, 10 000%, 30 000% 또는 그 이상 증가될 수 있다.
응고 캐스케이드의 생화학 및 병리학에 대한 상세한 이해에도 불구하고, 순환계로부터의 개별적인 응고 인자들의 클리어런스에 대한 기계론적 기초는 대부분 모르는 채로 남아 있다. 다른 비타민 K-의존성 단백질의 자이모겐 및 효소 형태와 비교하여 인자 VII 및 그것의 활성화된 형태인 인자 VIIa의 순환하는 반감기의 뚜렷한 차이는 인자 VIIa에 대한 구체적이고 구별되는 클리어런스 메커니즘의 존재를 시사한다. 두 가지 유형의 경로가 인자 VIIa의 클리어런스에서 작동하는 것으로 나타나는데, 한 가지는 무상 단ㅂ개질의 제거를 초래하고, 다른 하나는 혈장 억제제들에 의해 중재되며 단백질 가수분해성 비활성화를 유도한다.
항트롬빈 III (항트롬빈, AT)은 풍부한 혈장 억제제이며 인자 VIIa를 포함하여, 응고 시스템의 대부분의 프로테아제들을 표적화한다. 그것은 혈장에 마이크로몰 농도로 존재하며 자멸 기질 메커니즘 (suicide substrate mechanism)에 의해 비가역적으로 결합하고 표적인 프로테아제를 비활성화하는 세린 프로테아제 억제제들의 세르핀 패밀리에 속한다. 항트롬빈에 의한 억제는 정맥 내 투여 후에 생체 내에서 재조합 인자 VIIa의 우세한 클리어런스를 구성하는 것으로 나타난다. 혈우병 환자에서 재조합 인자 VIIa의 약물동역학의 최근의 연구에서, 총 클리어런스의 약 60%가 이 경로에 기여하는 것 같았다 (Agerso et al. (2011) J Thromb Haemost, 9, 333-338).
일부 구체예에서, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 내인성 혈장 억제제, 특히 항트롬빈에 의한 비활성화에 대해 야생형 인간 인자 VIIa에 비하여 증가된 저항을 나타낸다.
본 발명의 발명자들에 의해 상기 언급된 2 그룹의 돌연변이들, 즉 증가된 AT 저항을 부여하는 돌연변이와 증강된 단백질 가수분해 활성을 부여하는 돌연변이를 조합함으로써, 억제제 비활성화에 대한 높은 저항을 유지하면서 증가된 또는 보존된 활성이 이루어진다는 것이 발견되었다. 즉, 돌연변이들의 조합을 포함하는 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 항트롬빈 비활성화에 대한 증가된 저항뿐 아니라 실질적으로 보존된 단백질 가수분해 활성을 나타낸다. 발명의 인자 VII 폴리펩티드가 하나 또는 그 이상의 반감기 연장 부분과 포합될 때 놀랍게도 반감기 연장에 대한 향상된 효과가 이루어진다. 이들 특성이 제공될 때, 발명의 그런 포합된 인자 VII 폴리펩티드는 약학적으로 허용되는 단백질 가수분해 활성을 유지하면서 증가된 순환성 반감기를 나타낸다. 결과적으로, 작용 부위에서 기능적으로 적절한 농도를 얻기 위해 그런 포합된 인자 VII 폴리펩티드의 더 낮은 용량이 필요할 수 있고 그로써 더 낮은 용량 및/또는 더 낮은 빈도로 출혈 에피소드를 가지고 있거나 정상적인 지혈 시스템의 증강을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것이 가능해질 것이다.
추가의 변형
발명의 인자 VII 폴리펩티드는 추가의 변형, 특히 인자 VII 폴리펩티드에 추가의 유리한 특성들을 부여하는 추가의 변형을 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 언급된 아미노산 치환 외에, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 예를 들면 추가의 아미노산 변형, 예컨대 하나의 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 그런 한 구체예에서, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 예컨대 WO2002077218에 기술된 것과 같이, 그룹 R396C, Q250C 및 407C로부터 선택된 추가의 돌연변이 또는 첨가를 가진다.
발명의 인자 VII 폴리펩티드는 인자 VII 폴리펩티드의 일차 서열에 있거나 있지 않은 추가의 변형을 포함할 수 있다. 추가의 변형은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 탄수화물 부분의 첨가, 반감기 연장 부분의 첨가, 예컨대 PEG 부분, Fc 도메인 등의 첨가를 포함한다. 예를 들어, 그런 추가의 변형은 인자 VII 폴리펩티드의 안정성 또는 반감기를 증가시키기 위해 만들어질 수 있다.
반감기 연장 부분 또는 기
용어 "반감기 연장 부분"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2 및/또는 하나 또는 그 이상의 N- 및/또는 O-글리칸 구조와 같이 하나 또는 그 이상의 아미노산 부위 사슬 기능성에 부착되고 이들 단백질/폴리펩티드에 포합/커플링될 때 단백질/폴리펩티드의 생체 내 기능성 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 화학적 기를 나타내는 것으로 이해된다.
생체 내 기능성 반감기는 아래에서 추가로 논의되는 것과 같이 (실시예 17) 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 적당한 방법에 의해 측정될 수 있다.
반감기 연장 부분의 실례는 다음을 포함한다: 생체적합성 지방산 및 그것의 유도체들, 하이드록시 알킬 전분 (HAS), 예컨대 하이드록시 에틸 전분 (HES), 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(Glyx-Sery)n (HAP), 히알루론산 (HA), 헤파로산 중합체 (HEP), 포스포릴콜린-계 중합체 (PC 중합체), 플렉시머 (Fleximer), 덱스트란, 폴리-시알산 (PSA), Fc 도메인, 트란스페린, 알부민, 엘라스틴 유사 (ELP) 펩티드, XTEN 중합체, PAS 중합체, PA 중합체, 알부민 결합 펩티드, CTP 펩티드, FcRn 결합 펩티드 및 그것들의 어떠한 조합.
특히 흥미로운 구체예에서, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 반감기 연장 부분과 커플링된다.
한 구체예에서, 발명의 시스테인-포합된 인자 VII 폴리펩티드는 인자 VII 폴리펩티드에 도입된 시스테인의 설프하이드릴기에 포합된 하나 또는 그 이상의 소수성 반감기 연장 부분을 가진다. 나아가 다른 아미노산 잔기에 반감기 연장 부분들을 연결시키는 것이 가능하다.
한 구체예에서, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 예컨대 WO2007115953에 기술된 것과 같이, 조직 인자에 이황화 결합된다.
다른 구체예에서, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 증가된 혈소판 친화성을 가지는 인자 VIIa 변이체이다.
헤파로산 포합체
본 발명에 따르는 인자 VII 폴리펩티드 헤파로산 포합체는 인자 VII 폴리펩티드의 어떠한 아미노산 잔기 또는 탄수화물 부분을 포함하여 FVII 폴리펩티드의 어떠한 부분에 부착된 하나 또는 그 이상의 헤파로산 중합체 (HEP)를 가질 수 있다. 그런 포합체의 실례는 본원에 참조로 포함되는 WO2014/060397에 제공된다. 화학적 및/또는 효소적 방법들이 인자 VII 폴리펩티드 상의 글리칸에 HEP를 포합시키기 위해 사용될 수 있다. 효소적 포합 방법의 한 실례는 예컨대 WO03031464에서 기술된다. 글리칸은 자연적으로 발생하거나 예컨대 기술분야에 잘 공지되어 있는 방법들을 사용하여 인자 VII의 아미노산 서열에 N-글리코실화 모티프 (NXT/S, 여기서 X는 어떠한 자연 발생하는 아미노산임)의 도입에 의해 엔지니어링될 수 있다.
본 발명에 따르는 "시스테인-HEP 인자 VII 폴리펩티드 포합체"는 FVII 폴리펩티드에 존재하거나 도입된 시스테인 잔기의 설프하이드릴기에 포합된 하나 또는 그 이상의 HEP 분자들을 가진다.
발명의 흥미로운 한 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 HEP 중합체에 커플링된다. 한 구체예에서 인자 VII 폴리펩티드에 커플링된 HEP 중합체는 13 내지 65kDa, 13 내지 55kDa, 25 내지 55kDa, 25 내지 50kDa, 25 내지 45kDa, 30 내지 45kDa, 36 내지 44kDa 및 38 내지 42kDaF부터 선택된 범위의 분자량 또는 40kDa의 분자량을 가진다.
발명의 흥미로운 한 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 인자 VII 폴리펩티드의 N-글리칸 상에서 HEP 중합체에 커플링된다.
발명의 추가의 구체예에서, 2개의 HEP 중합체들이 N-글리칸을 통해서 동일한 인자 VII 폴리펩티드에 커플링된다. 이 구체예에서 인자 VII 폴리펩티드에 커플링된 HEP 중합체의 각각은 13 내지 65kDa, 13 내지 55kDa, 25 내지 55kDa, 25 내지 50kDa, 25 내지 45kDa, 30 내지 45kDa, 36 내지 44kDa 및 38 내지 42kDaF부터 선택된 범위의 분자량 또는 40kDa의 분자량을 가진다. 바람직하게, 중합체는 동일한 분자량을 가진다.
특정 구체예에서, 2개의 20kDa-HEP 중합체가 그것의 N-글리칸을 통해 동일한 인자 VII 폴리펩티드에 커플링된다.
특정 구체예에서, 2개의 30kDa-HEP 중합체가 그것의 N-글리칸을 통해 동일한 인자 VII 폴리펩티드에 커플링된다.
특정 구체예에서, 2개의 40kDa-HEP 중합체가 그것의 N-글리칸을 통해 동일한 인자 VII 폴리펩티드에 커플링된다.
헤파로산 중합체
헤파로산 (HEP)은 반복부를 포함하는 (-GlcUA-베타1,4-GlcNAc-알파1,4-) 천연 당 중합체이다 (도 5a 참조). 그것은 글리코사미노글리칸 다당 패밀리에 속하고 생리적 pH에서 음으로 대전된 중합체이다. 그것은 특정 박테리아의 캡슐에서 발견될 수 있지만 고등 척추동물에서도 발견되는데, 이때 그것은 천연 중합체 헤파린 및 헤파란 설페이트에 대한 전구체로서 작용한다. 비록 상세하게 증명되지는 않았지만, 헤파로산은 리소좀에서 분해되는 것으로 여겨진다. Bolton-Hunter 시약으로 표지된 100 kDa 헤파로산 중합체의 주사는 헤파로산이 체액/폐기물에서 더 작은 단편으로서 분비되는 것으로 밝혀졌다 (US 2010/0036001).
본 발명에 사용하기 위하여, 헤파로산 중합체는 어떠한 적당한 방법, 예컨대 US 2010/0036001 또는 US 2008/0109236에 기술된 어떠한 방법에 의해 제조될 수 있다. 헤파로산은 박테리아-유도된 효소들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 파스퇴렐라 멀토시다 유형 D의 헤파로산 합성효소 PmHS1은 GlcUA 및 GlcNAc 둘 다를 옮김으로/서 헤파로산 당 사슬을 중합한다. 대장균 K5 효소 KfiA (알파 GlcNAc 트란스페라제) 및 KfiC (베타 GlcUA 트란스페라제)는 또한 함께 헤파로산의 2당 반복부를 형성할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 헤파로산 중합체는 전형적으로 식 (-GlcUA-베타1,4-GlcNAc-알파1,4-)n의 중합체이다.
헤파로산 중합체의 크기는 이 식에서 반복부의 수 n에 의해 규정될 수 있다. 상기 반복부 n의 수는 예를 들면 2 내지 약 5000이다. 반복부의 수는 예를 들면 50 내지 2000 유닛, 100 내지 1000 유닛 또는 200 내지 700 유닛일 수 있다. 반복부의 수는 200 내지 250 유닛, 500 내지 550 유닛 또는 350 내지 400 유닛일 수 있다. 이들 범위의 하한선 중 어느 것이든지 이들 범위의 어떠한 상한선과 조합하여 헤파로산 중합체의 많은 유닛들의 적당한 범위를 형성할 수 있다.
헤파로산 중합체의 크기는 그것의 분자량에 의해 규정될 수 있다. 분자량은 헤파로산 중합체 분자의 집단에 대한 평균 분자량, 예컨대 중량 평균 분자량일 수 있다.
헤파로산 중합체의 크기와 관련하여 본원에서 기술된 분자량 값은, 실제로 정확하게 열거된 크기가 아닐 수 있다. 헤파로산 중합체 제조 중에 배치마다 다른 변화로 인해, 중합체 변화가 예상될 것이다. 그러므로, 배치마다 다른 변화를 포함하기 위하여, 표적 HEP 중합체 크기 앞뒤로 약 +/- 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 변화가 예상되어야 한다. 예를 들어 40 kDa의 HEP 중합체 크기는 40 kDa +/- 10%를 나타내며, 예컨대 40 kDa는 예를 들면 실제로 38.8 kDa, 41.5 kDa 또는 43.8 kDa를 의미한다.
헤파로산 중합체는 예를 들면 500 Da 내지 1,000kDa의 분자량을 가질 수 있다. 중합체의 분자량은 500 Da 내지 650 kDa, 5 kDa 내지 750 kDa, 10 kDa 내지 500 kDa, 15 kDa 내지 550 kDa 또는 25 kDa 내지 250 kDa일 수 있다.
분자량은 인자 VII 폴리펩티드의 활성과 포합체의 반감기 또는 평균 거주 시간 사이의 적합한 균형을 이루기 위하여 이들 범위 내에 있는 특정 수준에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 중합체의 분자량은 15 내지 25 kDa, 25 내지 35 kDa, 35 내지 45 kDa, 45 내지 55 kDa, 55 내지 65 kDa 또는 65 내지 75 kDa로부터 선택된 범위에 있을 수 있다.
분자량의 보다 구체적인 범위가 선택될 수 있다. 예를 들어, 분자량은 20 kDa 내지 35 kDa, 예컨대 22 kDa 내지 32 kDa 예컨대 25 kDa 내지 30 kDa, 예컨대 약 27 kDa일 수 있다. 분자량은 35 내지 65 kDa, 예컨대 40 kDa 내지 60 kDa, 예컨대 47 kDa 내지 57 kDa, 예컨대 50 kDa 내지 55 kDa 예컨대 약 52 kDa일 수 있다. 분자량은 50 내지 75 kDa 예컨대 60 내지 70 kDa, 예컨대 63 내지 67 kDa 예컨대 ㅇ약 65 kDa일 수 있다.
특히 흥미로운 구체예에서, 발명의 인자 VII 포합체의 헤파로산 중합체는 13 내지 65 kDa, 13 내지 55 kDa, 25 내지 55 kDa, 25 내지 50 kDa, 25 내지 45 kDa, 30 내지 45 kDa 및 38 내지 42 kDa으로부터 선택된 범위의 크기를 가진다.
분자량의 이들 범위의 하한 중 어느 것이든지 이들 범위로부터의 더 높은 상한과 조합되어 발명에 따르는 헤파로산 중합체의 분자량에 대한 적당한 범위를 형성할 수 있다.
헤파로산 중합체는 좁은 크기 분포 (즉 단일분산) 또는 넓은 크기 분포 (즉 다중분산)를 가질 수 있다. 다중분산도 (PDI)의 수준은 식 Mw/Mn을 기초로 숫자로 나타낼 수 있고, 식에서 Mw는 중량 평균 분자량이고 Mn은 수평균 분자량이다. 이 식을 사용하여 이상적인 단일분산성 중합체에 대한 다중분산도 값은 1이다. 바람직하게, 본 발명에 사용하기 위한 헤파로산 중합체는 단일분산성이다. 그러므로 중합체는 약 1인 다중분산도를 가질 수 있고, 다중분산도는 1.25 미만, 바람직하게 1.20 미만, 바람직하게 1.15 미만, 바람직하게 1.10 미만, 바람직하게 1.09 미만, 바람직하게 1.08 미만, 바람직하게 1.07 미만, 바람직하게 1.06 미만, 바람직하게 1.05 미만일 수 있다.
헤파로산의 분자량 크기 분포는 아가로오스 겔 상에서 움직일 수 있는 단일분산성 크기 표준 (HA Lo-Ladder, Hyalose LLC)과의 비교에 의해 측정될 수 있다.
다르게는, 헤파로산 중합체의 크기 분포는 고성능 크기 축출 크로마토그래피-다중 각 레이저 광산란 (SEC-MALLS)에 의해 측정될 수 있다. 그런 방법은 헤파로산 중합체의 분자량 및 다중분산도를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
중합체 크기는 효소적 제조 방법으로 조절될 수 있다. 헤파로산 수용체 사슬의 UDP 당에 대한 몰 비를 조절함으로써, 원하는 최종 헤파로산 중합체 크기를 선택하는 것이 가능하다.
헤파로산 중합체는 추가로 인자 VII 폴리펩티드에의 그것의 부착을 허용하는 반응성 기를 포함할 수 있다. 적합한 반응성 기는, 예를 들면 알데하이드, 알킬, 케톤, 말레이미드, 티올, 아지드, 아미노, 하이드라지드, 하이드록실아민, 카보네이트 에스테르, 킬레이터 또는 그것들의 어떠한 것들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 도 5b는 말레이미드 기를 포함하는 헤파로산 중합체를 예시한다.
실시예들에서 설명되는 것과 같이, 말레이미드 또는 알데하이드 기능화된 규정된 크기의 헤파로산 중합체는 2당 뉴클레오티드 UDP-GlcNAc 및 UDP-GlcUA를 등몰량으로 사용하는 효소적 (PmHS1) 중합 반응에 의해 제조될 수 있다. 프라이밍 3당 (GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2는 반응을 개시하기 위해 사용될 수 있고, 중합화는 당 뉴클레오티드 빌딩 블록이 고갈될 때까지 이어진다. 그런 다음 말단 아민 (프라이머로부터 기원함)이 상기에서 기술된 것과 같은 반응성 기와 같은 적합한 반응성 기, 예컨대 유리 시스테인에 포합하기 위한 말레이미드 기능성 또는 아미노기에 대한 환원성 아민화를 위한 알데하이드로 기능화될 수 있다. 헤파로산 중합체의 크기는 당 뉴클레오티드의 변화: 프라이머 화학양론에 의해 예정될 수 있다. 그 기법은 US 2010/0036001에서 상세하게 기술된다.
반응성 기는 환원 또는 비-환원 말단에서 또는 전체 당 사슬을 통해 존재할 수 있다. 단지 하나의 그런 반응성 기의 존재는 헤파로산 중합체를 폴리펩티드에 포합시킬 때 바람직하다.
FVII -HEP 포합체의 제조 방법
예를 들어, WO 03/031464는 폴리펩티드의 글리칸 구조, 예컨대 인자 VII 또는 인자 VIIa 폴리펩티드를 리모델링하기 위한 방법 및 그런 폴리펩티드에 대해 수용성 중합체와 같은 변형기를 부착하기 위한 방법을 기술한다. 그런 방법은 본 발명에 따라 인자 VII 폴리펩티드에 헤파로산 중합체를 부착하기 위해 사용될 수 있다.
실시예들에서 설명되는 것과 같이, 인자 VII 폴리펩티드는 시알릴트란스페라제를 사용하여 그것의 글리칸 부분에 포합될 수 있다. 이 접근법의 구현을 위해, HEP 중합체는 먼저 시알산 시티딘 모노포스페이트에 연결될 필요가 있다. 글리실시알산 시티딘 모노포스페이트 (GSC)는 그런 화학에 대한 적합한 출발점이지만, 다른 시알산 시티딘 모노포스페이트 또는 그것의 단편들이 사용될 수 있다. 실시예들은 GSC 분자들에 HEP 중합체를 공유 연결하기 위한 방법들을 설명한다. 공유 부착에 의해, FVIIa의 글리칸 부분에 전달될 수 있는 HEP-GSC (HEP 포합된 글리실시알산 시티딘 모노포스페이트) 분자가 생성된다.
인자 VII-헤파로산 포합체는 일단 그것들이 제조된 후에 정제될 수 있다. 예를 들어, 정제는 인자 VII 폴리펩티드를 향해 지시된 고정된 mAb, 예컨대 FVIIa 상의 석회화된 gla-도메인에 대해 지시된 mAb를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 그런 친화성 크로마토그래피 방법에서, 포합되지 않은 HEP-중합체는 칼럼의 집중적인 세척에 의해 제거될 수 있다. FVII은 항체로부터 FVII을 방출시킴으로써 칼럼으로부터 방출될 수 있다. 예를 들어, 항체가 석회화된 gla-도메인에 특이적인 경우, 칼럼으로부터의 방출은 EDTA를 포함하는 완충액으로 세척함으로써 이루어질 수 있다.
크기 축출 크로마토그래피는 포합되지 않은 인자 VII로부터 인자 VII-헤파로산 포합체를 분리하기 위해 사용될 수 있다.
순수한 포합체는 한외여과에 의해 농축될 수 있다.
정제 과정으로부터 유발되는 인자 VII-헤파로산 포합체의 최종 농도는 예를 들면 HPLC 정량, 예컨대 FVII 경쇄의 HPLC 정량에 의해 측정될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 티오-변형된 GSC 분자에 말레이미도 기를 통해 HEP와 같은 탄수화물 중합체를 연결시키고 그 시약을 시알트란스페라제에 의해 당단백질 상의 무상 글리코실기에 전달함으로써, 고리형 석신이미드기를 함유하는 연쇄가 생성되는 것이 가능한 것으로 보인다.
그러나, 석신이미드 기초 연쇄는 포합체가 연장된 시간 동안 수용액으로 보관될 때 가수분해 고리 개방이 잰행될 수 있고 (Bioconjugation Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, 3rd edition 2013 p. 309) 연쇄가 무상을 유지할 수 있는 한편으로, 고리 개방 반응은 최종 포합체에 영역- 및 입체-이성질체의 형태로 바람직하지 못한 이질성을 첨가할 것이다.
상기로부터 이어지는 것은 1) 당단백질의 글리칸 잔기는 무상 형태로 보존되고 2) 무상 글리코실 잔기와 반감기 연장 부분 사이의 링커 부분에 이질성이 존재하지 않는 그런 방식으로 당단백질에 반감기 연장 부분을 연결시키는 것이 바람직하다는 것이다.
기술분야에는 2개의 화합물, 예컨대 반감기 연장 부분 예컨대 HEP의 단백질 또는 단백질 글리칸에의 포합 방법에 대한 요구가 있는데, 이때 화합물들은 안정라고 이성질체가 없는 포합체가 얻어지도록 연결된다.
한 측면으로 본 발명은 HEP의 FVII에의 글리실시알산 시티딘 모노포스페이트 (GSC) 기초 포합에 사용하기 위한 안정하고 이성질체가 없는 링커를 제공한다. 본 발명에 사용된 GSC 출발 물질은 화학적으로 합성되거나 (Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000, 1467-1482) 또는 그것은 WO07056191에 기술된 것과 같이 화학효소 경로에 의해 얻어질 수 있다. GSC 구조는 아래에 나타낸다:
Figure pct00002
한 구체예에서, 본 발명에 따르는 포합체는 다음의 구조를 포함하는 링커:
Figure pct00003
를 포함하는데, 그것은 또한 이하에서 하위링커 또는 하위연쇄로서도 언급되며 다음의 방법 중 어느 하나로 HEP-아민과 GSC를 연결시킨다:
Figure pct00004
Figure pct00005
그로써 강조된 4-메틸벤조일 하위링커는 표적 단백질에 반감기 연장 부분을 연결시키는 전체 연결 구조의 일부를 구성한다. 하위링커는 대체물, 예컨대 석신이미드 기초 링커 (설프하이드릴기와의 말레이미드 반응으로부터 제조됨)에 비교하여 자체 안정한 구조인데, 왜냐하면 후자 유형의 고리형 연쇄는 포합체가 연장된 기간 동안 수용액으로 보관될 때 가수분해 고리 개방이 진행되는 경향이 있다 (Bioconjugation Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, 3rd edition 2013 p. 309). 비록 이 경우에 (예컨대 HEP와 당단백질 상의 시알산 사이) 연쇄가 무상으로 유지될 수 있긴 하지만, 고리 개방 반응은 최종 포합체 조성물에 영역- 및 입체-이성질체의 형태의 이질성을 첨가하게 될 것이다.
그러므로 본 발명에 따르는 포합체와 관련된 한 가지 장점은 동질성 조성물이 얻어진다는 것, 즉 링커 구조 및 안정성에 기인한 이성질체 형성의 경향이 상당히 감소된 것이다. 다른 장점은 발명에 따르는 링커 및 포합체가 간단한 과정, 바람직하게 1-단계 과정으로 제조될 수 있다는 것이다.
이성질체들은 그것들이 이질성 생성물을 유발할 수 있고 인간에서 원치 않는 면역 반응의 위험을 증가시키기 때문에 바람직하지 못하다.
본 발명에 사용된 것과 같이 HEP와 GSC 사이의 4-메틸벤조일 하위연쇄는 입체- 또는 영역-이성질체를 형성할 수 없다. HEP 중합체들은 앞서 언급된 것과 같이 동시 발생된 효소적 중합화 반응 (US 20100036001)에 의해 제조될 수 있다. 이 방법은 대장균에서 말토오스 결합 단백질 융합 구성물로서 발현될 수 있는 파스투렐라 멀토시다로부터의 헤파란 합성효소 I (PmHS1)을 사용한다. 정제된 MBP-PmHS1은 당 뉴클레오티의 등몰 혼합물 (GlcNAc-UDP 및 GlcUA-UDP)에 첨가될 때, 동시발생된, 화학양론적으로 조절된 반응으로 단일분산성 중합체를 생성할 수 있다. 3당 개시제 (GlcUA-GlcNAc-GlcUA)가 반응을 프라임하기 위해 사용되고, 중합체 길이는 프라이머:당 뉴클레오티드 비율에 의해 결정된다. 중합화 반응은 약 90%의 당 뉴클레오티드가 소모될 때까지 작동될 것이다. 중합체들은 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응 혼합뭄ㄹ로부터 분리되고, 계속해서 안정한 분말로 냉동-건조된다.
기능성 HEP 중합체들의 제조 방법들은 예를 들면 알데하이드-, 아민- 및 말레이미드 기능화된 HEP 시약을 열거하는 US 20100036001에 기술된다. US 20100036001은 본원에 그것의 전체 내용이 전체적으로 본원에서 설명되는 것처럼 참조로 포함된다. 다양한 다른 기능적으로 변형된 HEP 유도체들이 유사한 화학을 사용하여 이용가능하다. 본 발명의 특정 구체예들에서 사용된 HEP 중합체는 처음에 US20100036001에 기술된 방법들을 따라 환원 말단에서 일차 아민 핸들로 제조된다.
US20100036001에 따라 제조된 아민 기능화된 HEP 중합체들 (즉 아민-핸들을 가지는 HEP)은 N-석신이미딜 4-포르밀벤조에이트와의 반응에 의해 HEP-벤즈알데하이드로 전환되고 계속해서 환원성 아민화 반응에 의해 GSC의 글리실아미노기에 커플링될 수 있다. 그 결과의 HEP-GSC 생성물은 계속해서 시알릴트란스페라제를 사용하여 당단백질에 효소적으로 포합될 수 있다.
예를 들어, 상기 HEP 상의 아민 핸들은 아래의 계획도에 따라 N-석신이미딜 4-포르밀벤조에이트와의 반응에 의해 벤즈알데하이드 기능성으로 전환될 수 있다:
Figure pct00006
HEP 아민 (1)의 4-포르밀벤즈아미드 화합물 (2)로의 전환은 4-포르밀벤조산의 아실 활성화된 형태와의 반응에 의해 수행될 수 있다.
N-석신이미딜은 많은 다른 아실 활성화기가 아닌 아실 활성화기가 숙련된 사람들에게 공지이기 때문에 선택될 수 있다. 비-제한적인 실례는 펩티드 화학으로부터 알려져 있는 것과 같이 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸-, 1-하이드록시-벤조트라이아졸-, 펜타플루오로페닐-에스테르를 포함한다.
벤즈알데하이드 기능성으로 변형된 HEP 시약들은 건식 형태로 냉동 보관될 때 (-80℃) 연장된 기간 동안 안정한 상태를 유지할 수 있다. 다르게는, 벤즈알데하이드 부분은 GSC 화합물에 부착될 수 있고, 그로써 아민 기능화된 반감기 연장 부분에의 포합에 적합한 GSC-벤즈알데하이드 화합물을 초래할 수 있다. 이 합성 경로는 도 12에 도시된다.
예를 들어, GSC는 반응성 알데하이드기를 함유하는 GSC 화합물을 제공하기 위하여 N-석신이미딜 4-포르밀벤조에이트와 pH 중성 조건 하에서 반응될 수 있다 (예를 들면 WO2011101267 참조). 그런 다음 알데하이드 유도체화된 GSC 화합물 (GSC-벤즈알데하이드)은 HEP-아민 및 환원제와 반응하여 HEP-GSC 시약을 형성할 수 있다.
상기 언급된 반응은 반전될 수 있고, 그로써 HEP-아민은 먼저 N-석신이미딜 4-포르밀벤조에이트와 반응하여 알데하이드 유도체화된 HEP-중합체를 형성할 수 있으며, 그것은 계속해서 환원제의 존재하에 GSC와 직접 반응된다. 실제로 이것은 GSC-CHO의 지루한 크로마토그래피적 취급을 제거한다. 이 합성 경로는 도 13에 도시된다.
그러므로, 본 발명의 한 구체예에서 HEP-벤즈알데하이드는 환원성 아민화에 의해 GSC에 커플링된다.
환원성 아민화는 다음과 같이 진행되는 2-단계 반응이다: 먼저 이민 (또한 쉬프-염기로도 알려짐)이 알데하이드 성분과 아민 성분 (본 구체예에서 GSC의 글리실 아미노기) 사이에서 형성된다. 그런 다음 이민은 두 번째 단계에서 아민으로 환원된다. 환원제는 그것이 형성된 이민을 아민 유도체로 환원시킬 수 있도록 선택된다.
많은 적합한 환원제가 숙련자들에게 활용될 수 있다. 비-제한적인 실례는 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaBH3CN), 나트륨 보로하이드라이드 (NaBH4), 피리딘 보란 복합체 (BH3:Py), 다이메틸설파이드 보란 복합체 (Me2S:BH3) 및 피롤린 보란 복합체를 포함한다.
비록 탄수화물의 환원 단부에 (예를 들면 HEP 중합체의 환원 말단에) 대한 환원성 아민화가 가능하긴 하지만, 그것은 일반적으로 느리고 비효율적인 반응으로서 기술되었다 (JC. Gildersleeve, Bioconjug Chem. 2008 July; 19(7):1485-1490). 초기에 형성된 이민이 케토 아민으로 재배열되는 부반응, 예컨대 아마도리 (Amadori) 반응이 또한 가능하며, 앞서 논의된 것과 같이 본 맥락에서 바람직하지 못한 이질성을 유발할 것이다.
벤즈알데하이드 유도체와 같은 방향족 알데하이드는 이민이 에놀화될 수 없고 또한 탄수화물 유도된 이민에서 전형적으로 발견된 필요한 이웃하는 하이드록시기가 결핍되어 있기 때문에 그런 재배열 반응을 형성할 수 없다. 벤즈알데하이드 유도체와 같은 방향족 알데하이드는 그러므로 특히 이성질체가 없는 HEP-GSC 시약을 생성하기 위한 환원성 아민화 반응에 유용하다.
과잉의 GSC 및 환원제가 환원성 아민화 화학을 완료되도록 구동시키기 위해 임의로 사용된다. 반응이 완료되었을 때 과잉의 (미-반응) GSC 시약 및 다른 작은 분자 성분들, 예컨대 과잉의 환원제는 계속해서 투석, 접선 유동 여과 또는 크기 축출 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다.
시알릴트란스페라제에 대한 천연 기질, Sia-CMP 및 GSC 유도체는 둘 다 대전되고 고도로 친수성인 다중기능성 분자들이다. 또한, 그것들은 만약 pH가 6.0 아래라면 연장된 기간 동안 용액에서는 안정하지 않다. 그런 낮은 pH에서, 기질 전달에 필요한 CMP 활성화기는 산 촉매된 포스페이트 다이에스테르 가수분해로 인해 소실된다. 그러므로 GSC 및 Sia-CMP 유도체의 선택적인 변형 및 분리는 CMP-가수분해를 피하기 위하여 pH의 세심한 조절뿐만 아니라 빠르고 효과적인 분리 방법을 필요로 한다.
본 발명에서, 큰 반감기 연장 부분들은 환원성 아민화 화학을 사용하여 GSC에 포합된다. 아릴알데하이드, 예컨대 벤즈알데하이드 변형된 반감기 연장 부분들은 그것들이 환원성 아민화 조건하에서 GSC와 효율적으로 반응할 수 있기 때문에 이런 유형의 변형에 최적인 것으로 밝혀졌다.
GSC는 산 배지에서 가수분해될 수 있기 때문에, HEP-벤즈알데하이드에 커플링되는 동안 중성에 가깝거나 약간 염기성인 환경을 유지하는 것이 중요하다. HEP 중합체 및 GSC는 둘 다 약간 수용성이고, 그러므로 pH를 거의 중성 수준으로 유지하기 위해서는 수성 완충액 시스템이 바람직하다. 많은 유기 및 무기 완충액 둘 다 사용될 수 있지만, 완충액 성분들은 바람직하게 환원성 아민화 조건하에서 반응성이 아니어야 한다. 이것은 예를 들면 일차 및 -더 적은 정도로- 이차 아미노기를 함유하고 있는 유기 완충액 시스템을 배제한다. 숙련된 사람들은 어떤 완충액에 적합하고 어떤 것이 적합하지 않은지를 알 것이다. 적합한 완충액의 일부 실례가 아래의 표 1에 제시된다:
완충액
공통 명칭 25℃에서의 pKa 완충액 범위 화합물 전체 명칭
Bicine 8.35 7.6 내지 9.0 N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신
Hepes 7.48 6.8 내지 8.2 4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산
TES 7.40 6.8 내지 8.2 2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산
MOPS 7.20 6.5 내지 7.9 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산
PIPES 6.76 6.1 내지 7.5 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)
MES 6.15 5.5 내지 6.7 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산
이 방법을 적용함으로써, 이성질체가 없는 안정한 연쇄를 가지고 있는, 반감기 연장 부분으로 변형된 GSC 시약들이 효율적으로 제조될 수 있고, CMP 활성화기의 가수분해에 대한 기회를 최소화하는 간단한 과정으로 분리될 수 있다.
상기 화합물들을 서로 반응시킴으로써 4-메틸벤조일 하위링커 부분을 포함하는 HEP-GSC 포합체가 생성될 수 있다.
GSC는 또한 티오부티로락톤과 반응됨으로써, 티올 변형된 GSC 분자 (GSC-SH)가 생성될 수 있다. 본 발명에서 증명된 것과 같이, 그런 시약들은 말레이미드 기능화된 HEP 중합체와 반응되어 HEP-GSC 시약이 형성될 수 있다. 이 합성 경로는 도 15에 도시된다. 그 결과의 생성물은 석신이미드를 포함하는 연쇄 구조를 가진다.
Figure pct00007
그러나, 석신이미드 기초 (하위)연쇄들은 변형된 GSC 시약이 수용액에 연장된 기간 동안 보관될 때 무엇보다도 가수분해 고리 개방이 진행될 수 있고 연쇄가 무상으로 유지되는 한편, 고리 개방 반응은 영역- 및 입체-이성질체의 형태로 바람직하지 못한 이질성을 첨가하게 될 것이다.
당포합 방법
(폴리)-펩티드와 HEP-GSC 포합체의 포합은 (폴리)-펩티드 골격의 잔기 상에 존재하는 글리칸을 통해 수행될 수 있다. 이 포합 형태는 또한 당포합으로서도 언급된다.
시알릴트란스페라제를 기초로 한 방법들은 수년 동안 혈액 응고 인자, 예컨대 응고 인자 FVII 상에서 N-글리칸 또는 O-글리칸을 변형시키기에는 미약하고 매우 선택적인 것으로 증명되어 왔다.
시스테인 알킬화, 라이신 아실화 및 단백질 골격에 아미노산을 포함하는 유사한 포합을 기초로 한 포합 방법들과는 대조적으로, 글리칸을 통한 포합은 단백질의 중합체/펩티드 단편들과 같은 더 큰 구조를 생체활성이 더 적게 방해되면서 생체활성 단백질에 부착시키는 매력적인 방법이다. 이것은 글리칸이 일반적으로 단백질 표면으로부터 멀리 배향되고 용액 밖에 있을 경향이 있으며 고도로 친수성이어서, 단백질 활성이 없도록 하기 위해 중요한 결합 표면을 남기기 때문이다.
글리칸은 자연 발생적이거나 예컨대 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들을 사용한 N-연결된 글리칸의 삽입을 통해 삽입될 수 있다.
GSC는 시알릴트란스페라제의 사용에 의해 당단백질에 전달될 수 있는 시알산 유도체이다. 그것은 PEG와 같은 치환기로 글리실 아미노기 상에서 선택적으로 변형될 수 있고 여전히 시알릴트란스페라제의 사용에 의해 당단백질로 효소적으로 전달될 수 있다. GSC는 대규모로 효소적 방법에 의해 효율적으로 제조될 수 있다 (WO07056191).
시알릴트란스페라제
시알릴트란스페라제는 시알산을 자연적으로 활성화된 시알산 (Sia) - CMP (시티딘 모노포스페이트) 화합물로부터 예컨대 단백질 상의 갈락토실-부분에 전달하는 글리코실트란스페라제의 한 부류이다. 많은 시알릴트란스페라제 (ST3GalIII, ST3GalI, ST6GalNAcI)가 무엇보다도 C5 아세트아미도기 상에서 40 kDa PEG와 같은 큰 기로 변형되어 있는 시알산 - CMP ()를 전달할 수 있다 (WO03031464). 본 발명에 사용될 수 있는, 광범위하지만 비-제한적인 관련된 시알릴트란스페라제의 목록은, 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 WO2006094810에서 개시된다.
본 발명의 한 측면으로, 당단백질 상의 말단 시알산은 시알리다제 처리에 의해 제거되어 아시알로 당단백질이 제공될 수 있다. 아시알로 당단백질 및 반감기 연장 부분으로 변형된 GSC는 함께 시알릴트란스페라제에 대한 기질로서 작용할 것이다. 그 반응의 생성물은 무상 글리코실 연결기 - 이 경우 무상 시알산 링커기를 통해 연결되어 있는 반감기 연장 부분을 가지는 당단백질 포합체이다. 아시알로 FVIIa 당단백질이 시알릴트란스페라제의 존재하에 HEP-GSC와 반응하는 반응 계획도는 도 18에 도시된다.
용어 "시알산"은 9-탄소 카르복실화된 당의 패밀리의 어떠한 구성원을 말한다. 시알산 패밀리의 가장 흔한 구성원은 N-아세틸뉴라민산 (2-케토-5-아세트아미도-3,5-다이데옥시-D-글리세로-D-갈락토노눌로피라노스-1-온산 (자주 Neu5Ac, NeuAc, NeuNAc 또는 NANA로 약칭됨)이다. 패밀리의 두 번째 구성원은 N-글리콜릴-뉴라민산 (Neu5Gc 또는 NeuGc)인데, 여기서 NeuNAc의 N-아세틸기는 하이드록실화되어 있다. 세 번째 시알산 패밀리 구성원은 2-케토-3-데옥시-노눌로손산 (KDN)이다 (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265:21811-21819 (1990)). 또한 9-O-락틸Neu5Ac 또는 9-O-아세틸-Neu5Ac와 같은 9-O-C1-C6 아실-Neu5Ac와 같은 9-치환된 시알산이 포함된다. 시알산 화합물의 합성 및 시알릴화 과정에서의 사용은 1992년 10월 1일에 공개된 국제 출원 WO92/16640에 개시되어 있다.
용어 "시알산 유도체"는 하나 또는 그 이상의 화학적 부분으로 변형되어 잇는 상기에서 규정된 시알산을 말한다. 변형기는 예를 들면 알킬기, 예컨대 메틸기, 아지도- 및 플루오로기, 또는 기능성 기, 예컨대 다른 화학적 부분을 부착시키기 위한 핸들로서 기능할 수 있는 아미노 또는 티올기일 수 있다. 실례로는 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac를 포함한다. 그 용어는 또한 카르복실기 또는 하나 또는 그 이상의 하이드록실기와 같은 더 많은 기능성 기 중 하나가 결핍되어 있는 시알산을 포함한다. 카르복실기가 카르복사미드기 또는 에스테르기로 대체되어 있는 유도체 또한 그 용어에 포함된다. 그 용어는 또한 하나 또는 그 이상의 하이드록실기가 카르보닐기로 산화되어 있는 시알산을 말한다. 나아가 그 용어는 예를 들면 페리오데이트로의 산화성 처리 후에 C9 탄소 원자 또는 두 가지 C9-C8 탄소 사슬이 결핍되어 있는 시알산을 말한다.
글리실 시알산은 상기 정의에 따르는 시알산 유도체로, 이때 NeuNAc의 N-아세틸기는 또한 아미노 아세틸기로서 알려져 있는 글리실기로 대체된다. 글리실 시알산은 다음의 구조로 대표될 수 있다:
Figure pct00008
용어 "CMP-활성화된" 시알산 또는 시알산 유도체는 시알산 부분과 시티딘 모노포스페이트 (CMP)를 함유하고 있는 당 뉴클레오티드를 말한다.
본 명세서에서, 용어 "글리실 시알산 시티딘 모노포스페이트"는 GSC를 기술하기 위해 사용되고, 동일한 CMP 활성화된 글리실 시알산의 대체 명칭부여에 대한 동의어이다. 대체 명칭부여는 CMP-5'-글리실 시알산, 시티딘-5'-모노포스포-N-글리실뉴라민산, 시티딘-5'-모노포스포-N-글리실 시알산을 포함한다.
용어 "무상 글리코실 연결기"는 당 단량체가 사이에 끼어 있고 폴리펩티드에 공유 부착되어 있으며 HEP 부분이 분해되지 않은, 예컨대 포합체 형성 중에 나트륨 메타페리오데이트에 의해 산화되지 않은 글리코실 부분으로부터 유도되는 연결기를 말한다. "무상 글리코실 연결기"는 글리코실 유닛의 첨가 또는 하나 또는 그 이상의 글리코실 유닛의 원래의 당 구조로부터의 제거에 의해 자연 발생적인 올리고당으로부터 유도될 수 있다.
용어 "아시알로 당단백질"은 하나 또는 그 이상의 말단 시알산 잔기가 예컨대 시알리다제로의 처리에 의해 또는 화학적 처리에 의해 제거되어 있고, 적어도 하나의 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기가 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민 ("노출된 갈락토오스 잔기")의 밑에 있는 "층"으로부터 노출되는 당단백질을 포함하기 위한 것으로 의도된다.
구조식에서 점선은 개방된 원자가 결합 (즉 다른 화학적 부분에 구조를 연결시키는 결합)을 나타낸다.
페길화된 유도체
본 발명에 따르는 "페길화된 인자 VII 폴리펩티드 변이체/유도체"는 인자 VII 폴리펩티드의 어떠한 아미노산 잔기 또는 탄수화물 부분을 포함하는 FVII 폴리펩티드의 어떠한 부분에 부착되어 있는 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자들을 가질 수 있다. 화학적 및/또는 효소적 방법들은 인자 VII 폴리펩티드 상의 글리칸에 PEG 또는 다른 반감기 연장 부분을 포합시키기 위해 사용될 수 있다. 효소적 포합 과정의 한 실례는 예컨대 WO03031464에 기술되어 있다. 글리칸은 자연적으로 발생하는 것이거나 상기에서 HEP 포합체에 대해 기술된 것과 같이 엔지니어링될 수 있다. 본 발명에 따르는 "시스테인-페길화된 인자 VII 폴리펩티드 변이체"는 FVII 폴리펩티드에 존재하거나 도입된 시스테인 잔기의 설프하이드릴기에 포합되어 있는 하나 또는 그 이상의 PEG 분자를 가진다.
융합 다백질
융합 단백질은 원래 별도의 단백질 또는 펩티드 또는 그것들의 단편을 코드화하는 둘 또는 그 이상의 DNA 서열들의 프레임내 연결 (in-frame joining)을 통해 생성된 단백질이다. 융합 단백질 DNA 서열의 번역은 원래의 단백질 또는 펩티드의 각각으로부터 유도된 기능적 특성들을 가질 수 있는 단일 단백질 서열을 초래할 것이다. 융합 단백질을 코드화하는 DNA 서열들은 중복 PCR 또는 DNA 결찰과 같은 표준 분자 생물학 방법들에 의해 인공적으로 생성될 수 있고 어셈블리는 3'-단부 DNA 서열에 중지 코돈을 보유하는 한편 첫 번째 5'-단부 DNA에 중지 코돈을 배제하면서 수행된다. 그 결과 생성된 융합 단백질 DNA 서열은 박테리아, 효모, 진균, 곤충 세포 또는 포유류 세포와 같은 표준 숙주 유기체에서 이종성 융합 단백질 발현을 지지하는 적절한 발현 벡터 안에 삽입될 수 있다.
융합 단백질은 융합 단백질을 규정하는 단백질 또는 펩티드 부분들을 분리시키는 링커 또는 스페이서 펩티드 서열을 함유할 수 있다.
발명의 흥미로운 한 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 인자 VII 폴리펩티드 및 융합 파트너 단백질/펩티드, 예를 들면 Fc 도메인 또는 알부민을 포함하는 융합 단백질이다.
Fc 융합 단백질
용어 "Fc 융합 단백질"은 본원에서 어떠한 항체 아이소타입으로부터 유도될 수 있는 Fc 도메인에 융합되어 있는 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다. IgG Fc 도메인이 자주 IgG 항체의 상대적으로 긴 순환성 반감기로 인해 바람직할 것이다. Fc 도메인은 나아가 특정 이펙터 기능, 예를 들면 예컨대 보충물 결합 및/또는 특정 Fc 수용체에 대한 결합을 조절하기 위해 변형될 수 있다. FcRn 수용체에 대한 결합 능력을 가지는, FVII 폴리펩티드와 Fc 도메인과의 융합은 보통 wt FVII 폴리펩티드의 반감기에 비교하여 융합 단백질의 연장된 순환성 반감기를 초래할 것이다. IgG Fc 도메인의 위치 234, 235 및 237에서의 돌연변이는 보통 FcγRI 수용체 및 아마도 또한 FcγRIIa 및 FcγRIII 수용체에 대해 감소된 결합을 초래할 것이다. 이들 돌연변이는 FcRn 수용체에 대한 결합을 변경하지 않으며, 식균작용성 재활용 경로에 의해 긴 순환성 반감기를 촉진한다. 바람직하게, 발명에 따르는 융합 단백질의 변형된 IgG Fc 도메인은 각각, 특정 Fc 수용체들에 대한 감소된 친화성을 초래할 (L234A, L235E 및 G237A) 및 감소된 C1q-중재된 보충물 고정을 초래할 (A330S 및 P331S) 다음 돌연변이 중 하나 또는 그 이상을 포함한다. 다르게는, Fc 도메인은 바람직하게 S241P/S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 Fc 도메인일 수 있다.
인자 VII 폴리펩티드의 제조
본 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 제조 및 정제의 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다; 이들 방법의 일부 실례는 아래에 기술되고; 제조 및 정제 방법들의 추가의 실례는, 그 중에서도 WO2007/031559에 기술되어 있다.
한 측면으로, 발명은 인자 VII 폴리펩티드의 제조 방법에 관련된다. 본원에서 기술된 인자 VII 폴리펩티드는 재조합 핵산 기법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 클론된 인간 야생형 인자 VII 핵산 서열은 원하는 단백질을 코드화하기 위하여 변형된다. 그런 다음 이 변형된 서열은 발현 벡터 안에 삽입되고, 그것은 계속해서 숙주 세포 안으로 형질전환되거나 트랜스펙션된다. 고등 진핵 세포, 특히 배양된 포유류 세포가 숙주 세포로서 바람직하다.
추가의 측면으로, 발명은 다중뉴클레오티드 구성물을 함유하고 있고 발현하는 유전자도입 동물에 관련된다.
인간 야생형 인자 VII에 대한 완전한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있다 (재조합 인간 인자 VII의 클로닝 및 발현이 기술되어 있는 U.S. 4,784,950 참조).
아미노산 서열 변경은 다양한 공지된 기법들에 의해 이루어질 수 있다. 핵산 서열의 변형은 부위-특이적 돌연변이생성에 의해 이루어질 수 있다. 부위-특이적 돌연변이생성에 대한 기법들은 기술분야에 잘 알려져 있고 예를 들면 문헌에 기술되어 있다 (Zoller and Smith (DNA 3:479-488, 1984) 또는 "Splicing by extension overlap", Horton et al., Gene 77, 1989, pp. 61-68). 그러므로, 인자 VII의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 사용하면, 선택된 변경(들)을 도입할 수 있다. 마찬가지로, 특이적인 프라이머들을 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 DNA 구성물의 제조 과정은 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다 (PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA 참조).
발명의 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 구성물은 적절하게 게놈 또는 cDNA 기원의 것일 수 있다. 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 구성물은 또한 수립된 표준 방법들, 예컨대 Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869에 기술된 포스포아미다이트 방법에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열은 또한 특이한 프라이머들을 사용한 중합효소 연쇄 반응에 의해, 예를 들면 US 4,683,202, Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491 또는 Sambrook et al. (상기 동일)에 기술된 것과 같이 제조될 수 있다.
나아가, 핵산 구성물은 표준 기법에 따라, 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편들 (필요에 따라), 전체 핵산 구성물의 다양한 부분들에 해당하는 단편들을 결찰함으로써 제조된 혼합된 합성 및 게놈 구성물, 혼합된 합성 및 cDNA 구성물 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원 구성물일 수 있다.
핵산 구성물은 바람직하게 DNA 구성물이다. 본 발명에 따르는 인자 VII 폴리펩티드의 제조에 사용하기 위한 DNA 서열은 전형적으로 적절한 번역후 프로세싱 (예컨대 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화) 및 숙주 세포로부터의 분비를 얻기 위해 인자 VII의 아미노-말단에서 프레-프로 폴리펩티드를 코드화할 것이다. 프레-프로 폴리펩티드는 인자 VII 또는 다른 비타민 K-의존성 혈장 단백질, 예컨대 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C 또는 단백질 S의 프레-프로 폴리펩티드일 수 있다. 기술분야의 숙련자들에 의해 인지될 것과 같이, 응고제로서 작용하는 단백질의 능력을 유의미하게 손상시키지 않는 추가의 변형은 인자 VII 폴리펩티드의 아미노산 서열에 만들어질 수 있다.
인간 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열은 보통 어떠한 벡터일 수 있고, 재조합 DNA 과정에 대해 편리하게 수행될 수 있는 재조합 벡터에 삽입되며, 선택된 벡터는 자주 그것이 도입될 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 그러므로, 벡터는 염색체 외재성 정체로서 존재하고, 그것의 복제는 염색체 복제와 무관한 자체적으로 복제하는 벡터, 즉 벡터, 예컨대 플라스미드일 수 있다. 다르게는, 벡터는 숙주 세포 안에 도입될 때, 숙주 세포 게놈에 통합되고 그것이 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다.
벡터는 바람직하게 인간 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 필요한 추가의 절편들에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터이다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 둘 다의 요소들을 함유할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 절편들이 그것들의 의도된 목적에 대해 협동적으로 기능하도록 배열되어 있는 것, 예컨대 전사는 프로모터에서 시작되고 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 통해 진행되는 것을 가리킨다.
인자 VIIa 폴리펩티드 변이체의 발현에 사용하기 위한 발현 벡터는 클론된 유전자 또는 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 것이다. 프로모터는 어떠한 DNA 서열일 수 있는데, 그것은 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내고 숙주 세포에 대해 동종성이거나 이종성인 단백질들을 코드화하는 유전자들로부터 유도될 수 있다.
포유류 세포에서 인간 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 DNA의 전사를 지시하기에 적합한 프로모터의 실례는 SV40 프로모터 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), MT-1 (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 (Pal-miter et al., Science 222 (1983), 809-814), CMV 프로모터 (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985) 또는 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터 (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982)이다.
인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열은 또한, 필요하다면, 적합한 터미네이터, 예컨대 인간 성장 호르몬 터미네이터 (Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809-814) 또는 TPI1 (Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434) 또는 ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099) 터미네이터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 벡터는 또한 프로모터로부터 하류에 및 인자 VII 서열 자체에 대한 삽입 부위로부터 상류에 위치한 RNA 스플라이스 부위 세트를 함유할 수 있다. 바람직한 RNA 스플라이스 부위는 아데노바이러스 및/또는 면역글로불린 유전자로부터 얻어질 수 있다. 또한 발현 벡터에는 삽입 부위의 하류에 위치한 폴리아데닐화 신호가 함유된다. 특히 바람직한 폴리아데닐화 신호는 SV40으로부터의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호 (Kaufman and Sharp, 상기 동일), 아데노바이러스, 5 Elb 영역으로부터의 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 유전자 터미네이터 (DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) 또는 인간 인자 VII 유전자 또는 소 인자 VII 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 발현 벡터는 또한 프로모터와 RNA 스플라이스 부위 사이에 위치한 비코딩 바이러스 리더 서열, 예컨대 아데노바이러스 2 트라이파타이트 리더; 및 인핸서 서열, 예컨대 SV40 인핸서를 포함할 수 있다.
본 발명의 인자 VII 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로에 지시하기 위하여, 분비 신호 서열 (또한 리더 서열, 프레프로 서열 또는 프레 서열로도 알려짐)이 재조합 벡터에 제공될 수 있다. 분비 신호 서열은 정확한 리딩 프레임에서 인간 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열에 결합된다. 분비 신호 서열은 통상 펩티드를 코드화하는 DNA 서열에 대해 5'에 위치한다. 분비 신호 서열은 단백질과 정상적으로 결합되거나, 다른 분비된 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유래될 수 있다.
인자 VII 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열들, 프로모터 및 임의로 터미네이터 및/또는 분비 신호 서열을 각각 결찰시키고, 그것들을 복제에 필요한 정보를 함유하고 있는 적합한 벡터 안에 삽입하기 위해 사용된 과정들은 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다 (예를 들면 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조).
포유류 세포를 트랜스펙션하고 세포에 도입된 DNA 서열들을 발현시키는 방법들은 예컨대 다음 문헌들에 기술되어 있다: Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; and Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845.
클론된 DNA 서열들은 배양된 포유류 세포에, 예를 들면 칼슘 포스페이트-중재된 트랜스펙션 (Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) 또는 일렉트로포레이션 (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982)에 의해 도입된다. 외인성 DNA를 발현하는 세포들을 확인하고 선택하기 위해, 선택가능한 표현형을 부여하는 유전자 (선택가능한 마커)는 일반적으로 관심의 유전자 또는 cDNA와 함께 세포 안에 도입된다. 바람직한 선택가능한 마커는 네오마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자들을 포함한다. 선택가능한 마커는 증폭가능한 선택가능한 마커일 수 있다. 바람직한 증폭가능한 선택가능한 마커는 다이하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 서열이다. 선택가능한 마커들은 별도의 플라스미드 상에서 관심의 유전자로서 동시에 세포 안에 도입될수 있거나, 또는 그것들은 동일한 플라스미드 상에 도입될 수 있다. 만약 동일한 플라스미드 상에서, 선택가능한 마커 및 관심의 유전자가 상이한 프로모터 또는 동일한 프로모터의 제어하에 있을 수 있다면, 후자의 배열은 다이시스트로닉 메시지를 생성한다. 이런 유형의 구성물은 기술분야에 알려져 있다 (예를 들면 Levinson and Simonsen, U.S. 4,713,339). 또한 "담체 DNA"로서 알려져 있는 추가의 DNA를 세포에 도입되는 혼합물에 첨가하는 것이 유리할 수 있다.
세포가 DNA를 흡수한 후에, 세포는 적절한 성장 배지에서, 전형적으로 1 내지 2일 동안 성장되고 관심의 유전자를 발현하기 시작한다. 본원에서 사용되는 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장 및 관심의 인자 VII 폴리펩티드의 발현에 필요한 영양분 및 다른 성분들을 함유하고 있는 배지를 의미한다. 배지는 일반적으로 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질 및 성장 인자들을 포함한다. 감마-카르복실화된 단백질의 제조를 위해, 배지는 비타민 K를, 바람직하게 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml의 농도로 함유할 것이다. 그런 다음 안정한 방식으로 선택가능한 마커를 발현하는 세포들의 성장에 대한 선택에 약물 선택이 적용된다. 증폭가능한 선택가능한 마커와 함께 트랜스펙션된 세포들에 대해 약물 농도는 클론된 서열들의 증가된 복사 수, 그로써 증가하는 발현 수준을 선택하기 위해 증가될 수 있다. 그런 다음 안정하게 트랜스펙션된 세포들의 클론들이 관심의 인간 인자 VII 폴리펩티드의 발현에 대해 스크리닝된다.
인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열이 도입되어 있는 숙주 세포는 번역후 변형된 인간 인자 VII 폴리펩티드를 생성할 수 있고 효모, 진균 및 고등 진핵 세포를 포함하는 어떠한 세포든지 될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 포유류 셀라인의 실례는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예컨대 ATCC CCL 61), CHO DUKX 세포 (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980), 베이비 햄스터 신장 (BHK) 및 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 셀라인이다.
상기 기술된 형질전환된 또는 트랜스펙션된 숙주 세포는 그런 다음 인자 VII 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에 적합한 영양 배지에서 배양되고, 그 후 결과적으로 생성된 펩티드는 모두 또는 일부가 배양으로부터 회수될 수 있다. 세포를 배양하기 위해 사용된 배지는 숙주 세포의 성장에 적합한 어떠한 종래의 배지, 예컨대 적절한 보충물을 함유하고 있는 최소 또는 복합 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적 공급체로부터 입수가능하거나 또는 공개된 레시피 (예컨대 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션의 카탈로그에 있는)에 따라 제조될 수 있다. 그런 다음 세포에 의해 생성된 인자 VII 폴리펩티드는 숙주 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리시키고, 상층액 또는 여과물의 단백질 함유 성분들을 염, 예컨대 암모늄 설페이트에 의해 침전시키며, 문제의 폴리펩티드의 유형에 따라 다양한 크로마토그래피 과정, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에 의해 정제하는 것을 포함하는 종래 과정들에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
유전자도입 동물 기술은 발명의 인자 VII 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 암컷 포유류의 유선 내에 있는 단백질을 제조하는 것이 바람직하다. 유선에서의 발현 및 후속되는 관심의 단백질의 우유로의 분비는 다른 공급원들로부터 단백질들을 분리할 때 조우하게 되는 많은 어려움을 극복한다. 우유는 쉽게 수집되고, 대량으로 입수가능하며, 생화학적으로도 잘 특성화되어 있다. 나아가, 주요 우유 단백질들은 우유에 고농도로 존재한다 (전형적으로 약 1 내지 15 g/l).
상업적 관점으로, 대량 우유 수율을 가지는 종을 숙주로서 사용하는 것이 명백하게 바람직하다. 마우스 및 래트와 같은 더 작은 동물을 사용할 수 있는 한편 (그리고 원리 단계의 증거로 바람직한 한편), 그것들에 제한되는 것은 아니지만, 돼지, 염소, 양 및 소를 포함하는 가축 포유류를 사용하는 것이 바람직하다. 양은 특히 이 종에서의 유전자 도입의 전력, 우유 수율, 비용 및 양의 우유를 수집하기 위한 장비의 용이한 이용률과 같은 인자들로 인해 바람직하다 (예를 들면 숙주 종의 선택에 영향을 미치는 인자들의 비교를 위해 WO 88/00239 참조). 일반적으로 낙농 용도를 위해 사육된 숙주 동물, 예컨대 이스트 프리슬란드 (East Friesland) 양의 새끼를 선택하거나, 또는 나중에 유전자도입 라인의 사육에 의해 착유용 가축을 도입하는 것이 바람직하다. 어떤 경우든, 양호한 건강 상태의 공지된 동물이 사용되어야 한다.
유선에서의 발현을 얻기 위해, 우유 단백질 유전자로부터의 전사 프로모터가 사용된다. 우유 단백질 유전자는 카제인 (U.S. 5,304,489 참조), 베타-락토글로불린, a-락트알부민 및 유장 산성 단백질을 코드화하는 유전자들을 포함한다. 베타-락토글로불린 (BLG) 프로모터가 바람직하다. 양의 베타-락토글로불린 유전자의 경우에, 유전자의 5' 플랭킹 서열의 적어도 기부의 406 bp의 영역이 보통 사용될 것이지만, 5' 플랭킹 서열의 더 큰 부분, 최대 약 5 kbp, 예컨대 베타-락토글로불린 유전자의 5' 플랭킹 프로모터와 비-코딩 부분을 포함하는 ~4.25 kbp DNA 절편이 바람직하다 (Whitelaw et al., Biochem. J. 286:31-39 (1992) 참조). 다른 종으로부터의 프로모터 DNA의 유사한 단편들이 또한 적합하다.
베타-락토글로불린 유전자의 다른 영역들 또한, 발현될 유전자의 게놈 영역으로서 구성물에 통합될 수 있다. 보통 기술분야에서는, 예를 들면 인트론이 결핍되어 있는 구성물들이 그런 DNA 구성물을 함유하는 것들과 비교하여 불량하게 발현한다는 것이 수용되어 있다 (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1:3-13 (1991); WO 89/01343; 및 WO 91/02318 참조, 각각 본원에 참조로 포함됨). 이런 견지에서, 일반적으로, 가능하다면, 관심의 단백질 또는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자의 천연 인트론을 전부 또는 일부 함유하고 있는 게놈 서열을 사용하는 것이 바람직하고, 그로써 예컨대 베타-락토글로불린 유전자로부터 적어도 일부의 인트론이 추가로 포함되는 것이 바람직하다. 그런 한 영역은 양의 베타-락토글로불린 유전자의 3' 비-코딩 영역으로부터 인트론 스플라이싱 및 RNA 폴리아데닐화를 제공하는 DNA 절편이다. 유전자의 천연 3' 비-코딩 서열에 대해 치환될 때, 이 양의 베타-락토글로불린 절편은 관심의 단백질 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 증강시키고 안정화시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 변이체 인자 VII 서열의 개시 ATG를 둘러싸고 있는 영역은 우유 특이적 단백질 유전자로부터의 해당 서열들로 대체된다. 그런 대체는 발현을 증강시키기 위하여 잠정적인 조직-특이적 개시 환경을 제공한다. 전체 변이체 인자 VII 프레-프로 및 5' 비-코딩 서열을, 예를 들면 BLG 유전자로 대체하는 것이 편리하지만, 더 작은 영역도 대체될 수 있다.
유전자 도입 동물에서 인자 VII 폴리펩티드의 발현을 위해, 변이체 인자 VII을 코드화하는 DNA 절편은 그것의 발현에 필요한 추가의 DNA 절편들에 작동가능하게 연결되어 발현 유닛이 생성된다. 그런 추가의 절편들은 상기 언급된 프로모터, 뿐만 아니라 mRNA의 전사 및 폴리아데닐화의 종결을 제공하는 서열들도 포함한다. 발현 유닛은 변형된 인자 VII을 코드화하는 절편에 작동가능하게 연결되어 있는 분비 신호 서열을 코드화하는 DNA 절편을 추가로 포함할 것이다. 분비 신호 서열은 천연 인자 VII 분비 신호 서열이거나 또는 다른 단백질, 예컨대 우유 단백질의 그것일 수 있다 (예를 들면 von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); and Meade et al., U.S. 4,873,316 참조, 이것들은 본원에 참조로 포함됨).
유전자도입 동물에 사용하기 위한 발현 유닛들의 구성은 편리하게 변이체 인자 VII 서열을 추가의 DNA 절편들을 함유하고 있는 플라스미드 또는 파지 벡터 안에 삽입함으로써 수행되지만, 발현 유닛은 본질적으로 어떠한 결찰 순서에 의해서든지 구성될 수 있다. 특히 우유 단백질을 코드화하는 DNA 절편을 함유하고 있는 벡터를 제공하고 우유 단백질에 대한 그 코딩 서열을 인자 VII 변이체의 그것으로 대체하고; 그로써 우유 단백질 유전자의 발현 제어 서열들을 포함하는 유전자 융합물을 생성하는 것이 편리하다. 어떤 경우든지, 플라스미드 또는 다른 벡터에서 발현 유닛의 클로닝은 변이체 인자 VII 서열의 증폭을 용이하게 한다. 증폭은 편리하게 박테리아 (예컨대 대장균) 숙주 세포에서 수행되고, 그로써 벡터는 전형적으로 박테리아 숙주 세포에서 기능적인 복제 기원 및 선택가능한 마커를 포함할 것이다. 그런 다음 발현 유닛은 선택된 숙주 종의 수정란 (초기-단계 배를 포함하여)에 도입된다. 이종성 DNA의 도입은 마이크로주사 (예컨대 미국 특허 제 4,873,191호), 레트로바이러스 감염 (Jaenisch, Science 240:1468-1474 (1988)) 또는 배아 줄기 (ES) 세포를 사용하는 부위-특정 통합 (Bradley et al., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)에 개관됨)을 포함하는 여러 경로 중 하나에 의해 이루어질 수 있다. 그런 다음 수정란은 위임신 암컷의 난관 또는 자궁에 이식되고 만삭이 되도록 허용된다. 생식선에 도입된 DNA를 포함하고 있는 새끼들은 정상적인 멘델의 법칙대로 그들의 자손에게도 DNA를 계대할 수 있어서 유전자도입 무리의 발생을 허용한다. 유전자 동물의 제조를 위한 일반적인 과정들은 기술분야에 알려져 있다 (예를 들면 Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32:645-651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology 8:140-143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:844-847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49:113-120 (1992); U.S. 4,873,191; U.S. 4,873,316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; 및 GB 87/00458 참조). 포유류 및 그것들의 생식 세포에 외래 DNA 서열들을 도입하기 위한 기법들은 원래 마우스에서 개발되었다 (예컨대 Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384 (1980); Gordon and Ruddle, Science 214:1244-1246 (1981); Palmiter and Brinster, Cell 41:343-345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985); and Hogan et al. (상기동일) 참조). 이들 기법은 계속해서 가축 종을 포함하여 더 큰 동물을 사용하기 위해서도 적용되었다 (예컨대 WO 88/00239, WO 90/05188 및 WO 92/11757; 및 Simons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988) 참조). 요약하면, 현재가지 유전자도입 마우스 또는 가축의 제조에 사용된 가장 효율적인 경로로, 관심의 DNA의 수백개의 선형 분자들이 수립된 기법들에 따라 수정란의 전핵 중 하나에 주입된다. DNA의 접합체의 세포질로의 주입이 또한 사용될 수 있다.
정제
발명의 인자 VII 폴리펩티드는 세포 배양 배지로부터 회수된다. 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 크로마토그래피 (예컨대 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 축출), 전기영동적 과정 (예컨대 분별용 등전점 포커싱 (IEF), 차등 용해도 (예컨대 암모늄 설페이트 침전) 또는 추출 (예컨대 Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)을 포함한, 기술분야에 공지되어 있는 다양한 과정들에 의해 정제될 수 있다. 바람직하게, 인자 VII 폴리펩티드는 항-인자 VII 항체 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 문헌에 기술된 것과 같이 (Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097-11108, (1986) and Thim et al., Biochemistry 27: 7785-7793, (1988)), 칼슘-의존성 단클론성 항체의 사용이 특히 바람직하다. 추가의 정제는 종래의 화학적 정제 수단, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 이루어질 수 있다. 바륨 시트레이트 침전을 포함한 다른 정제 방법들이 기술분야에 알려져 있고, 본원에서 기술된 신규한 인자 VII 폴리펩티드의 정제에 적용될 수 있다 (예를 들면 Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982 참조).
치료 목적에 대해, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 것이 바람직하다. 그러므로, 발명의 바람직한 구체예에서, 발명의 인자 VII 폴리펩티드는 적어도 약 90 내지 95%의 동질성으로, 바람직하게 적어도 약 98% 동질성으로 정제된다. 순도는 기술분야에 공지되어 있는 여러 방법들, 예컨대 HPLC, 겔 전기영동 및 아미노-말단 아미노산 서열화에 의해 평가될 수 있다.
인자 VII 폴리펩티드는 그것의 2-사슬 형태로 변환되기 위해 그것의 활성화 부위에서 절단된다. 활성화는 기술분야에 공지되어 있는 과정들, 예컨대 Osterud, et al., Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, U.S. Patent No. 4,456,591; Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983); 또는 Kisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983)에 개시되어 있는 과정들에 따라 수행될 수 있다. 다르게는, Bjoern 등에 의해 기술된 것과 같이 (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565), 인자 VII은 그것을 이온-교환 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) 등을 통해 통과시킴으로써 활성화될 수 있다. 그 결과의 활성화된 인자 VII 변이체는 그런 다음 아래에서 기술되는 것과 같이 제형되고 투여될 수 있다.
분석
본원에는 발명에 따르는 바람직한 인자 VII 폴리펩티드를 선택하기에 적합한 시험관 내 단백질 가수분해 및 항트롬빈 반응성 분석이 제공된다. 그런 분석은 실시예 5에서 상세하게 기술된다. 간단히 설명하면, 분석은 다음과 같이, 간단한 예비 시험관 내 시험으로서 수행될 수 있다:
FVIIa 폴리펩티드의 단백질 가수분해 활성은 생리적 pH에서 및 반응을 지지하기 위하여 칼슘 및 포스파티딜 콜린 (PC)과 포스파티딜 세린 (PS)으로 구성된 소포의 존재하에 기질로서 생리적 기질 혈장-유도된 인자 X (X)를 사용하여 측정될 수 있다. 분석은 반응에 대한 Km보다 아래의 기질 농도에서 및 FX의 전환율을 20% 아래로 유지하면서 FXa의 측정가능한 양의 생성을 허용하기에 충분한 긴 기간 동안 FVIIa를 FX와 함께 인큐베이션함으로써 수행된다. 생성된 FXa는 S-2765와 같은 적합한 발색 기질의 첨가 후에 정량되고 시험된 FVIIa 변이체의 농도에 따르는 표준화 후에 야생형 FVIIa의 그것에 대해 기록된다.
FVIIa 폴리펩티드의 항트롬빈 반응성은 과잉 혈장-유도된 항트롬빈, 저분자량 (LMW) 헤파린 및 칼슘의 존재하에 위 (pseudo)-1차 조건하의 생리적 pH에서 측정될 수 있다. 잔류하는 FVIIa 활성은 S-2288과 같은 발색 기질을 사용하여 억제 반응의 전 기간을 통해 불연속적으로 측정된다. 억제율은 단일 지수 감쇠 함수에 대한 데이터의 비-선형 최소 제곱법에 의해 얻어지고 사용된 항트롬빈 농도에 따르는 억제율의 표준화 후에 야새형 FVIIa의 그것에 대해 기록된다. 항트롬빈에 의한 혈액 응고 프로테이나제의 헤파린-촉매된 및 촉매되지 않은 억제의 동역학적 특성화는 문헌에 기술되어 있다 (Olson et al. (1993), Methods Enzymol. 222, 525-559).
약학 조성물
한 측면으로, 본 발명은 발명의 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 제형에 관련된다. 예를 들어, 발명은 발명의 인자 VII 폴리펩티드를 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형된 약학 조성물을 제공한다.
따라서, 발명의 한 가지 목적은 0.25 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도로 존재하는 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 약학 제형을 제공하는 것이고, 이때 상기 제형은 2.0 내지 10.0의 pH를 가진다. 제형은 추가로 하나 또는 그 이상의 완충제 시스템, 보존제, 긴장성 제제, 킬레이트화제, 안정화제, 항산화제 또는 계면활성제, 뿐만 아니라 그것들의 다양한 조합을 포함할 수 있다. 약학 조성물에의 보존제, 등장성 제제, 킬레이트화제, 안정화제, 항산화제 및 계면활성제의 사용은 숙련자들에게 잘 알려져 있다. 참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
한 구체예에서, 약학적 제형은 수성 제형이다. 그런 제형은 전형적으로 용액 또는 현탁액이지만, 또한 콜로이드, 분산액, 에멀션및 다-상 물질 (multi-phase material)을 포함할 수 있다. 용어 "수성 제형"은 적어도 50%의 w/w 물을 포함하는 제형으로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수용액"은 적어도 50%의 w/w 물을 포함하는 용액으로서 정의되고, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50%의 w/w 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다.
다른 구체예에서, 약학적 제형은 사용 전에 의사 또는 환자가 그것에 용매 및/또는 희석액을 첨가하는 냉동-건조된 제형이다.
추가의 측면으로, 약학적 제형은 인자 VII 폴리펩티드의 수용액 및 완충액을 포함하는데, 이때 폴리펩티드는 1 mg/ml 또는 그 이상의 농도로 존재하고, 상기 제형은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 가진다.
추가의 측면으로, 약학적 제형은 본원에 참조로 포함되는 WO2014/057069에 개시된 것들 중 어느 하나일 수 있거나, 또는 실시예 18에 기술된 제형일 수 있다.
발명의 인자 VII 폴리펩티드는 비경구로, 예컨대 정맥 내로, 예컨대 근육 내로, 예컨대 피하로 투여될 수 있다. 다르게는, 발명의 FVII 폴리펩티드는 비-비경구 경로를 통해, 예컨대 경구로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 발명의 폴리펩티드는 예방적으로 투여될 수 있다. 발명의 폴리펩티드는 치료적으로 (요구시) 투여될 수 있다.
치료적 용도
광범위한 측면으로, 발명의 인자 VII 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 제형은 의약으로서 사용될 수 있다.
한 측면으로, 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 제형은 응고장애를 가진 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 제형은 출혈 장애 또는 출혈 에피소드의 치료를 위한 또는 정상적인 지혈 시스템의 증강을 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
추가의 측면으로, 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 제형은 혈우병 A형, 혈우병 B형 또는 획득된 억제제를 가지는 혈우병 A 또는 B형의 치료를 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면으로, 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 제형은 대상의 출혈 장애 또는 출혈 에피소드의 치료를 위한 또는 정상적인 지혈 시스템의 증강을 위한 방법에 사용될 수 있고, 그 방법은 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드의 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양을 그런 필요가 있는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "대상"은 어떠한 인간 환자 또는 비-인간 척추동물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "치료"는 치료를 필요로 하는 어떠한 인간 또는 다른 척추동물 대상의 의학적 치료를 말한다. 상기 대상은 상기 특정 치료의 사용이 상기 인간 또는 다른 척추동물의 건강에 유익하다는 것을 가리키게 될 잠정적인 또는 최족적인 진단을 제공하는 의료 실시자 또는 수의학적 의료 실시자에 의해 신체검사가 진행되는 것이 예상된다. 상기 치료의 타이밍 및 목적은 대상의 현재 건강 상태에 따라 개개인마다 다를 수 있다. 그러므로 상기 치료는 예방적이거나, 고통 완화적이거나, 증상적이거나 및/또는 치료적일 수 있다. 본 발명의 견지에서 예방적, 고통 완화적, 증상적 및/또는 치료적 치료는 발명의 별도의 측면을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "응고장애"는 정상적인 응고 캐스케이드의 어떠한 응혈촉진 성분 또는 어떠한 섬유소 분해의 상향조절의 어떠한 정성적 또는 정량적 결핍에 의해 유발될 수 있는 증가된 출혈 성향을 말한다. 그런 응고장애는 선천성 및/또는 후천성 및/또는 의료원성일 수 있고 기술분야의 숙련자에 의해 확인된다. 선천성 저응고장애의 비-제한적 실례는 혈우병 A형, 혈우병 B형, 인자 VII 결핍증, 인자 X 결핍증, 인자 XI 결핍증, 폰 빌레브란트병 및 글란즈만 혈소판 무력증 및 베르나르트-술리에르 증후군과 같은 혈소판 감소증이다. 혈우병 A 또는 B형의 임상적 심각성은 혈액의 FIX/인자 VIII의 기능성 유닛의 농도에 의해 측정되고 미약, 중간 또는 심각으로서 분류된다. 심각한 혈우병은 정상 수준의 <1%에 해당하는 <0.01 U/ml의 응고 인자 수준에 의해 정의되는 한편, 중간 및 미약한 혈우병을 가진 사람들은 각각 1 내지 5% 및 >5%의 수준을 가진다. "억제제" (즉 인자 VIII에 대한 알로-항체)를 가진 혈우병 A형 및 "억제제" (즉 인자 IX에 대한 알로-항체)를 가진 혈우병 B형은 부분적으로 선천성이고 부분적으로 후천성인 응고장애의 비-제한적인 실례이다.
후천성 응고장애의 비-제한적인 실례는 비타민 K 결핍증에 의해 유발된 세린 프로테아제 결핍증이다; 그런 비타민 K-결핍증은 비타민 K 길항제, 예컨대 와파린의 투여에 의해 유발될 수 있다. 후천성 응고장애는 또한 광대한 외상 후에 일어날 수 있다. 다르게는 "출혈 악순환"으로서 알려져 있는 이 경우에, 그것은 혈액 희석 (희석성 혈소판 감소증 및 응고 인자들의 희석), 저체온증, 응고 인자의 소모 및 대사 교란 (산과다증)을 특징으로 한다. 수액 치료법 및 증가된 섬유소 분해는 이 상황을 악화시킬 수 있다. 상기 출혈은 신체의 어떠한 부분으로부터든지 일어날 수 있다.
의료원성 응고장애의 비-제한적인 실례는 혈전색전성 질병을 치료하기 위해 처방될 수 있는 항응고성 의약 - 예컨대 헤파린, 아스피린, 와파린 및 다른 혈소판 응집 억제제 -의 과량투여이다. 의료원성 응고장애의 비-제한적인 두 번째 실례는 과잉 및/또는 부적절한 수액 치료법에 유도된 것, 예컨대 수혈에 의해 유도될 수 있는 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 출혈은 혈우병 A 또는 B형과 관련된다. 다른 구체예에서, 출혈은 후천성 억제제를 가지는 혈우병 A 또는 B형과 관련된다. 또 다른 구체예에서, 출혈은 혈소판 감소증과 관련된다. 또 다른 구체예에서, 출혈은 폰 빌레브란트병과 관련된다. 또 다른 구체예에서, 출혈은 심각한 조직 손상과 관련된다. 또 다른 구체예에서, 출혈은 심각한 외상과 관련된다. 또 다른 구체예에서, 출혈은 수술과 관련된다. 또 다른 구체예에서, 출혈은 출혈성 위염 및/또는 장염과 관련된다. 또 다른 구체예에서, 출혈은 예컨대 태반 조기 박리에서의 많은 자궁 출혈이다. 또 다른 구체예에서, 출혈은 기계적 지혈에 대한 가능성이 제한되어 있는 기관에서, 예컨대 두개골 내에서, 귀 내에서 또는 눈 안에서 일어난다. 또 다른 구체예에서, 출혈은 항응고 치료법과 관련된다.
발명은 추가로 다음의 비-제한적인 구체예 목록에 의해 기술된다:
구체예 1: 인간 인자 VII (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열에 대해 둘 또는 그 이상의 치환을 포함하고 있는 인자 VII 폴리펩티드로서, 이때 T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 L288은 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N), Ala (A) 또는 Trp (W)에 의해 대체되며 및/또는 W201은 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되고 및/또는 K337은 Ala (A) 또는 Gly (G)로 대체되며; 임의로, Q176은 Lys (K), Arg (R) 또는 Asn (N)에 의해 대체되고; 또는 Q286은 Asn (N)에 의해 대체된다.
구체예 1(i): T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고; L288은 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N), Ala (A) 또는 Trp (W)에 의해 대체되며 및/또는 W201은 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되고 및/또는 K337은 Ala (A) 또는 Gly (G)로 대체되는, 구체예 1에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 1(ii): L288이 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N) 또는 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 1에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 1(iii): W201이 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되는, 구체예 1에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 1(iv): K337이 Ala (A) 또는 Gly (G)에 의해 대체되는, 구체예 1에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2: T293이 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되는, 구체예 1에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(i): T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 L288은 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N), Ala (A) 또는 Trp (W)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(ii): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 L288이 Phe (F)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(iii): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 L288이 Tyr (Y)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(iv): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 L288이 Asn (N)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(v): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 L288이 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(vi): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 L288이 Trp (W)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(vii): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 L288이 Phe (F)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(viii): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 L288이 Tyr (Y)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(ix): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 L288이 Asn (N)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(x): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 L288이 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xi): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 L288이 Trp (W)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xii): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 L288이 Phe (F)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xiii): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 L288이 Tyr (Y)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xiv): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 L288이 Asn (N)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xv): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 L288이 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xvi): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 L288이 Trp (W)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xvii): T293이 Phe (F)에 의해 대체되고 L288이 Phe (F)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xviii): T293이 Phe (F)에 의해 대체되고 L288이 Tyr (Y)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xix): T293이 Phe (F)에 의해 대체되고 L288이 Asn (N)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xx): T293이 Phe (F)에 의해 대체되고 L288이 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxi): T293이 Phe (F)에 의해 대체되고 L288이 Trp (W)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxii): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 K337이 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxiii): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 K337이 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxiv): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 K337이 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxv): T293이 Phe (F)에 의해 대체되고 K337이 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxvi): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 K337이 Gly (G)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxvii): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 K337이 Gly (G)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxviii): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 K337이 Gly (G)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxix): T293이 Phe (F)에 의해 대체되고 K337이 Gly (G)에 의해 대체되는, 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 2(xxx): K337이 Ala (A)에 의해 대체되는, 구체예 2(ii) 내지 2(xxii) 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 3: 폴리펩티드가 다음의 치환 그룹 중 하나를 포함하는, 구체예 2에 따르는 인자 VII 폴리펩티드:
L288F/T293K, L288F/T293K/K337A, L288F/T293K/L305V, L288F/T293K/L305I, L288F/T293R, L288F/T293R/K337A, L288F/T293R/L305V, L288F/T293R/L305I, L288F/T293Y, L288F/T293Y/K337A, L288F/T293Y/L305V, L288F/T293Y/L305I, L288F/T293F, L288F/T293F/K337A, L288F/T293F/L305V, L288F/T293F/L305I, L288Y/T293K, L288Y/T293K/K337A, L288Y/T293K/L305V, L288Y/T293K/L305I, L288Y/T293R, L288Y/T293R/K337A, L288Y/T293R/L305V, L288Y/T293R/L305I, L288Y/T293Y, L288Y/T293Y/K337A, L288Y/T293Y/L305V, L288Y/T293Y/L305I, L288Y/T293F, L288Y/T293F/K337A, L288Y/T293F/L305V, L288Y/T293F/L305I, L288N/T293K, L288N/T293K/K337A, L288N/T293K/L305V, L288N/T293K/L305I, L288N/T293R, L288N/T293R/K337A, L288N/T293R/L305V, L288N/T293R/L305I, L288N/T293Y, L288N/T293Y/K337A, L288N/T293Y/L305V, L288N/T293Y/L305I, L288N/T293F, L288N/T293F/K337A, L288N/T293F/L305V, L288N/T293F/L305I, L288A/T293K, L288A/T293K/K337A, L288A/T293K/L305V, L288A/T293K/L305I, L288A/T293R, L288A/T293R/K337A, L288A/T293R/L305V, L288A/T293R/L305I, L288A/T293Y, L288A/T293Y/K337A, L288A/T293Y/L305V, L288A/T293Y/L305I, L288A/T293F, L288A/T293F/K337A, L288A/T293F/L305V 또는 L288A/T293F/L305I.
구체예 4: 폴리펩티드가 다음의 치환을 가지는, 구체예 2에 따르는 인자 VII 폴리펩티드: L288F/T293K, L288F/T293K/K337A, L288F/T293R, L288F/T293R/K337A, L288Y/T293K, L288Y/T293K/K337A, L288Y/T293R, L288Y/T293R/K337A, L288N/T293K, L288N/T293K/K337A, L288N/T293R 또는 L288N/T293R/K337A.
구체예 5: Q176이 Lys (K), Arg (R) 또는 Asn (N)에 의해 대체되는, 구체예 1에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 6: 폴리펩티드가 다음의 치환 그룹 중 하나를 포함하는, 구체예 5에 따르는 인자 VII 폴리펩티드: L288F/Q176K/K337A, L288Y/Q176K/K337A, L288N/Q176K/K337A 또는 L288A/Q176K/K337A.
구체예 7: Q286이 Asn (N)에 의해 대체되는, 구체예 1에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 8: 하나의 치환이 L288이 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N) 또는 Ala (A)에 의해 대체된 것이고, 단 폴리펩티드는 다음의 치환 쌍: L288N/R290S 또는 L288N/R290T를 갖지 않아야 하는, 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대하여 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 9: 인자 VII 폴리펩티드가 다음의 치환: L305I, L305V 또는 K337A 중 하나 또는 그 이상을 포함하는, 구체예 1 내지 2(xxx), 5 및 7 내지 8 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 10: 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대하여 둘 또는 그 이상의 치환을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드로서, 이때 W201은 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되고 T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되며; Q176은 Lys (K), Arg (R) 또는 Asn (N)에 의해 대체되거나; 또는 Q286은 Asn (N)에 의해 대체된다.
구체예 10(i): T293이 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 W201이 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 1(ii) 또는 10 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11: T293이 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되는, 구체예 10에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(i): T293이 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 W201이 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(ii): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 W201이 Arg (R)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(iii): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 W201이 Met (M)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(iv): T293이 Lys (K)에 의해 대체되고 W201이 Lys (K)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(v): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 W201이 Arg (R)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(vi): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 W201이 Met (M)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(vii): T293이 Arg (R)에 의해 대체되고 W201이 Lys (K)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(viii): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 W201이 Arg (R)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(ix): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 W201이 Met (M)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(x): T293이 Tyr (Y)에 의해 대체되고 W201이 Lys (K)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(xi): T293이 Phe (F)에 의해 대체되고 W201이 Arg (R)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(xii): Phe (F)에 의해 대체되고 W201이 Met (M)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 11(xiii): Phe (F)에 의해 대체되고 W201이 Lys (K)에 의해 대체되는, 구체예 1 내지 2, 10 또는 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 12: 폴리펩티드가 다음의 치환 그룹 중 하나를 포함하는, 구체예 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드: W201R/T293K, W201R/T293K/K337A, W201R/T293K/L305V, W201R/T293K/L305I, W201R/T293R, W201R/T293R/K337A, W201R/T293R/L305V, W201R/T293R/L305I, W201R/T293Y, W201R/T293Y/K337A, W201R/T293Y/L305V, W201R/T293Y/L305I, W201R/T293F, W201R/T293F/K337A, W201R/T293F/L305V, W201R/T293F/L305I, W201K/T293K, W201K/T293K/K337A, W201K/T293K/L305V, W201K/T293K/L305I, W201K/T293R, W201K/T293R/K337A, W201K/T293R/L305V, W201K/T293R/L305I, W201K/T293Y, W201K/T293Y/K337A, W201K/T293Y/L305V, W201K/T293Y/L305I, W201K/T293F, W201K/T293F/K337A, W201K/T293F/L305V, W201K/T293F/L305I, W201M/T293K, W201M/T293K/K337A, W201M/T293K/L305V, W201M/T293K/L305I, W201M/T293R, W201M/T293R/K337A, W201M/T293R/L305V, W201M/T293R/L305I, W201M/T293Y, W201M/T293Y/K337A, W201M/T293Y/L305V, W201M/T293Y/L305I, W201M/T293F, W201M/T293F/K337A, W201M/T293F/L305V 또는 W201M/T293F/L305I.
구체예 13: 폴리펩티드가 다음의 치환을 가지는, 구체예 11에 따르는 인자 VII 폴리펩티드: W201R/T293K, W201R/T293K/K337A, W201R/T293R, W201R/T293R/K337A, W201R/T293Y, W201R/T293F, W201K/T293K 또는 W201M/T293K.
구체예 14: Q176이 Lys (K), Arg (R) 또는 Asn (N)에 의해 대체되는, 구체예 10에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 15: 폴리펩티드가 다음의 치환 그룹 중 하나를 포함하는, 구체예 14에 따르는 인자 VII 폴리펩티드: W201R/Q176K, W201R/Q176R, W201K/Q176K, W201K/Q176R, W201M/Q176K 또는 W201M/Q176R.
구체예 16: Q286이 Asn (N)에 의해 대체되는, 구체예 10에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 17: 인자 VII 폴리펩티드가 추가로 다음의 치환들 중 하나 또는 그 이상을 포함하는, 구체예 10 내지 11, 14 및 16 중 어느 하나에 따르는 인자 VII 폴리펩티드: L305I, L305V 또는 K337A.
구체예 18: 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대해 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드로서, 하나의 치환은 W201이 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 19: 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대해 둘 또는 그 이상의 치환을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드로서, 이때 L288은 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N) 또는 Ala (A)에 의해 대체되고; W201은 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되며, 임의로 T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고; Q176은 Lys (K), Arg (R) 또는 Asn (N)에 의해 대체되거나; 또는 Q286은 Asn (N)에 의해 대체된다.
구체예 20: 폴리펩티드가 다음의 치환 그룹 중 하나를 포함하는, 구체예 19에 따르는 인자 VII 폴리펩티드: L288F/W201K, L288F/W201R, L288F/W201M, L288N/W201K, L288N/W201R, L288N/W201M, L288Y/W201K, L288Y/W201R, L288Y/W201M, L288A/W201K, L288A/W201R, L288A/W201M, L288F/W201K/T293K, L288F/W201K/T293Y, L288F/W201R/T293K, L288F/W201R/T293Y, L288F/W201M/T293K, L288F/W201M/T293Y, L288N/W201K/T293K, L288N/W201K/T293Y, L288N/W201R/T293K, L288N/W201R/T293Y, L288N/W201M/T293K, L288N/W201M/T293Y, L288A/W201K/T293K, L288A/W201K/T293Y, L288A/W201R/T293K, L288A/W201R/T293Y, L288A/W201M/T293K, L288A/W201M/T293Y, L288Y/W201K/T293K, L288Y/W201K/T293Y, L288Y/W201R/T293K, L288Y/W201R/T293Y, L288Y/W201M/T293K 또는 L288Y/W201M/T293Y.
구체예 21: 인자 VII 폴리펩티드가 추가로 다음의 치환들 중 하나 또는 그 이상을 포함하는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드: R396C, Q250C 또는 407C.
구체예 22: 상기 인자 VII 폴리펩티드가 절단된 2-사슬 인자 VIIa 폴리펩티드인, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 22(i): 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대하여 2개의 아미노산 치환을 포함하고 있는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 22(ii): 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대하여 3개의 아미노산 치환을 포함하고 있는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 22(iii): 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대하여 4개의 아미노산 치환을 포함하고 있는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 22(iv): 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대하여 5개의 아미노산 치환을 포함하고 있는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 22(v): 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대하여 최대 10개의 아미노산 치환을 포함하고 있는, 구체예 22(i) 내지 (iv) 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 22(vi): 가용성 조직 인자의 부재시에 시험관 내에서 측정되는 바, 야생형 인간 인자 VIIa의 단백질 가수분해 활성의 적어도 110%, 예컨대 적어도 120%, 예컨대 적어도 130%, 예컨대 적어도 140%, 예컨대 적어도 150%, 예컨대 적어도 160%, 예컨대 적어도 170%, 예컨대 적어도 180%, 예컨대 적어도 190%, 예컨대 적어도 200%, 예컨대 적어도 300%, 예컨대 적어도 400%, 예컨대 적어도 500%, 예컨대 적어도 1000%, 예컨대 적어도 3000%, 예컨대 적어도 5000%, 예컨대 적어도 10 000%, 예컨대 적어도 30 000%의 단백질 가수분해 활성을 가지는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 22(vii): 저분자량 헤파린의 존재 및 가용성 조직 인자의 부재시에, 항트롬빈 억제 분석에서 측정되는 바, 야생형 인간 인자 VIIa (SEQ ID NO:1)의 항트롬빈 반응성과 비교하여 20% 미만, 예컨대 19% 미만, 예컨대 18% 미만, 예컨대 17% 미만, 예컨대 16% 미만, 예컨대 15% 미만, 예컨대 14% 미만, 예컨대 13% 미만, 예컨대 12% 미만, 예컨대 11% 미만, 예컨대 10% 미만, 예컨대 9% 미만, 예컨대 8% 미만, 예컨대 7% 미만, 예컨대 6% 미만, 예컨대 5% 미만의 항트롬빈 반응성을 가가지는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 23: 인자 VII 폴리펩티드가 적어도 하나의 반감기 연장 부분과 커플링되어 있는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 24: 반감기 연장 부분이 생체적합성 지방산 및 그것의 유도체들, 하이드록시 알킬 전분 (HAS) 예컨대 하이드록시 에틸 전분 (HES), 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(Glyx-Sery)n (HAP), 히알루론산 (HA), 헤파로산 중합체 (HEP), 포스포릴콜린-계 중합체 (PC 중합체), 플렉시머, 덱스트란, 폴리-시알산 (PSA), Fc 도메인, 트란스페린, 알부민, 엘라스틴 유사 (ELP) 펩티드, XTEN 중합체, PAS 중합체, PA 중합체, 알부민 결합 펩티드, CTP 펩티드, FcRn 결합 펩티드 및 그것들의 어떠한 조합으로부터 선택된, 구체예 23에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 25: 반감기 연장 부분이 헤파로산 중합체인, 구체예 24에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 26: 헤파로산 중합체는 13 내지 65kDa, 13 내지 55kDa, 25 내지 55kDa, 25 내지 50kDa, 25 내지 45kDa, 30 내지 45kDa 및 38 내지 42kDa로부터 선택된 범위의 분자량 또는 40kDa의 분자량을 가지는, 구체예 25에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 26(i): 다음 식 I에 나타낸 구조적 단편을 포함하는, 구체예 25 또는 26 중 어느 하나를 따르는 FVII 폴리펩티드:
Figure pct00009
식 I
식에서, n은 95 내지 115의 정수이다.
구체예 26(ii): 야생형 인간 인자 VIIa (SEQ ID NO:1)에 비교하여 적어도 100% 증가된 반감기를 가지는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 27: 상기 인자 VII 폴리펩티드가 조직 인자에 이황화 연결되는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 28: 상기 폴리펩티드가 폴리펩티드의 혈소판 친화성을 증가시키는 추가의 아미노산 변형을 가지는, 선행하는 구체예들 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 29: 상기 폴리펩티드가 구체예 1 내지 22 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드 및 융합 파트너 단백질/펩티드, 예를 들면 Fc 도메인 또는 알부민을 포함하는 융합 단백질인, 구체예 1 내지 22 중 어느 하나를 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 30: 구체예 1 내지 22 및 28 내지 29 중 어느 하나에서 정의된 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드.
구체예 31: 구체예 30에 따르는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포.
구체예 32: 세포를 적절한 배지에서 폴리뉴클레오티드 구성물의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하고 그 결과의 폴리펩티드를 배지로부터 회수하는 것을 포함하는, 구체예 1 내지 22 및 28 내지 29 중 어느 하나에서 정의된 인자 VII 폴리펩티드의 제조 방법.
구체예 33: 구체예 1 내지 29 중 어느 하나에서 정의된 인자 VII 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
구체예 34: 구체예 1 내지 29 중 어느 하나에서 정의된 인자 VII 폴리펩티드의 치료적 또는 예방적으로 유효한 양을 치료가 필요가 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 출혈 장애 또는 출혈 에피소드를 치료하기 위한 또는 정상적인 지혈 시스템의 증강을 위한 방법.
구체예 35: 의약으로서 사용하기 위한, 구체예 1 내지 26 중 어느 것에서 정의된 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 35(i): 응고장애의 치료에 사용하기 위한, 구체예 1 내지 26 중 어느 것에서 정의된 인자 VII 폴리펩티드.
구체예 36: 혈우병 A 또는 B형의 치료에 의약으로서 사용하기 위한, 구체예 35(i)에 따르는 인자 VII 폴리펩티드.
본 발명은 추가로 다음의 실시예에 의해 예시되지만, 그것들은 보호의 범주를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 전술한 설명 및 다음의 실시예에 개시된 특징들은, 별도로 및 어떠한 조합으로든지, 발명을 그것의 다양한 형태로 실현하기 위한 재료일 수 있다.
실시예
단백질
인간 혈장-유도된 인자 X (FX) 및 인자 Xa (FXa)를 Enzyme Research Laboratories Inc. (South Bend, IN)로부터 얻었다. 가용성 조직 인자 1-219 (sTF) 또는 1-209를 공개된 과정 (Freskgard et al., 1996)을 따라 제조하였다. 재조합 야생형 FVIIa의 발현 및 정제를 앞서 기술된 것과 같이 (Thim et al., 1988; Persson and Nielsen, 1996) 수행하였다. 인간 혈장-유도된 항트롬빈 (Baxter)을 헤파린 세파로오스 크로마토그래피 (GE Healthcare)에 의해 공개된 과정 (Olson et al., 1993)에 따라 재정제하였다. 소 혈청 알부민 (BSA)을 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)로부터 얻었다.
실시예 1 - FVIIa 변이체 디자인
기질로서 FX를 향한 더 높은 단백질 가수분해 활성을 가지는 FVIIa 변이체를 디자인하기 위하여, 양면 전략을 사용하였다. 활성-부위 영역 주변에 있는, FVIIa 루프 및 단일 아미노산을 상이한 종으로부터의 해당하는 FVII 아미노산들로의 스와핑 및 점 돌연변이생성을 위해 각각 선택하였다 (도 1). FVIIa 단백질 가수분해 활성을 실시예 5에서 개관하는 것과 같이 측정하였다. 3개의 루프-스와핑된 FVIIa 변이체에 대한 단백질 가수분해 활성을 표 1에 나타내는데, 표에서 위치 287 및 289에 있는 잔기들은 각각 트레오닌과 글루탐산으로 돌연변이되는 한편 위치 288의 아미노산은 교체된다. 위치 287 및 289에서의 동일한 아미노산을 유지하면서 위치 288에서의 변화는 단백질 가수분해 활성에 극적으로 영향을 미친 것으로 관찰되었다. 또한 위치 201의 아미노산을 래트 및 토끼 FVII에 의해 운반된 로이신 또는 소의 FVII에 의해 운반된 아르기닌 중 어느 하나에 대해 치환하는 것은 단백질 가수분해 활성에 영향을 미친 것으로 관찰되었다. 나아가, 위치 337의 아미노산을 말에 의해 운반된 글루타민 또는 덜 벌키한 아미노산, 예컨대 알라닌 중 어느 하나에 대해 치환하는 것은 단백질 가수분해 활성에 영향을 미친 것으로 관찰되었다 (표 1). 이들 관찰은 위치 288 및 201의 아미노산들이 FX 인식 및 활성화에 포함되었을 것을 시사하였다. 그러므로, 위치 288 및 201을 추가로 포화 돌연변이생성에 의해 조사하였고 대표적인 결과들을 표 2에 개략적으로 나타낸다.
선택된 FVIIa 변이체의 단백질 가수분해 활성. 결과들은 야생형 FVIIa의 퍼센트 (%)로 나타낸다.
FVIIa 변이체 단백질 가수 분해 활성
+ PS:PC ( % ) 		단백질 가수 분해 활성
+ sTF + PS:PC ( % )
FVIIa 100 100
FVIIa L287T L288F D289E 100 22.1
FVIIa L287T L288H D289E 27.3 4.5
FVIIa L287T L288R D289E 3.2 0.7
FVIIa W201L 66.5 72.8
FVIIa W201R 404.5 177.7
FVIIa K337Q 29.8 63.5
FVIIa K337A 347.3 97.7
FVIIa K337G 317.2 126.1
실시예 2 - FVIIa 변이체의 클로닝
돌연변이를 Novagen으로부터의 KOD XtremeTM Hot Start DNA 중합효소 또는 Stratagene으로부터의 QuickChange® 부위-특정 돌연변이생성 키트를 사용하여 부위 특정된 돌연변이생성 PCR-기초 방법을 사용하여 FVII cDNA를 코드화하는 포유류 발현 벡터 안에 도입시켰다. pQMCF 발현 벡터 및 Icosagen Cell Factory (Estonia)로부터의 CHOEBNALT85를 발현 시스템으로서 사용하였다. 바람직한 돌연변이의 도입을 DNA 서열화 (MWG Biotech. Germany)에 의해 증명하였다.
실시예 3 - FVIIa 발현
FVII 변이체를 Icosagen Cell Factory (Estonia)로부터의 CHOEBNALT85 세포에서 발현시켰다. 간단히 설명하면, CHOEBNALT85 현탁 세포를 일시적으로 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙션시켰다 (Gene Pulse Xcell, Biorad, Copenhagen, DK). 트랜스펙션된 세포를 700 ㎍/l의 Geneticin® (Gibco by Life Technologies)을 사용하여 선택하고, 총 300 ml을 10 리터의 상층액으로 확대시켰다. 세포를 제조업체의 지시를 따라 5 mg/l의 비타민 K1 (Sigma-Aldrich)이 첨가된 배지에서 배양하였다. 규모에 따라, 세포를 진동 플라스크에서 (37℃, 5 내지 8% CO2 및 85 내지 125 rpm) 또는 흔들리는 배양 주머니 (37℃, 5% CD2 및 30 rpm)에서 배양하였다. 작은 규모의 상층액을 원심분리와 이어서 0.22 ㎛의 PES 필터 (Corning; Fischer Scientific Biotech, Slangerup, DK)를 통한 여과에 의해 수확하고 더 큰 부피는 심츨 여과와 이어서 0.22 ㎛의 절대 여과 (3 ㎛ Clarigard, Opticap XL10; 0.22 ㎛Durapore, Opticap XL10, Merck Millipore, Hellerup, DK)에 의해 수확하였다.
실시예 4 - FVIIa 정제 및 농도 측정
FVII 변이체를 본질적으로 다른 곳에서 기술된 것과 같은 Gla-도메인 특정 항체 친화성 크로마토그래피 (Thim et al. 1988)에 의해 정제하였다. 간단히 설명하면, 프로토콜은 3단계로 구성된다. 단계 1에서, 5 mM CaCl2를 조건 배지에 첨가하고 샘플을 친화성 칼럼 상에 로딩하였다. 10 mM His, 2 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.005% Tween 80, pH 6.0를 사용한 집중적인 세척 후에, 결합된 단백질을 음이온 교환 칼럼 (Source 15Q, GE Healthcare) 상에서 (단계 2) 50 mM His, 15 mM EDTA, 0.005% Tween 80, pH 6.0을 사용하여 용출시켰다. 20 mM HEPES, 20 mM NaCl, 0.005% Tween 80, pH 8.0을 사용한 세척 후에, 결합된 단백질을 제조업체의 지시를 따라 인간 혈장-유도된 FXa가 1 mg/ml의 밀도로 커플링되어 있는 CNBr-Sepharose Fast Flow 칼럼 (GE Healthcare) 상에서 (단계 3) 20 mM HEPES, 135 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.005% Tween 80, pH 8.0을 사용하여 용출하였다. 유속을 정체된 자이모겐 변이체의 활성화된 형태로의 본질적으로 완전한 활성화를 보장하기 위해 최적화하였다. 조건 배지에서 또는 음이온 교환 칼럼 상에서 자동-활성화할 수 있는, 증강된 활성을 가지는 FVIIa 변이체를 위해, 단계 2 및/또는 단계 3을 생략하여 단백질 가수분해성 분해를 방지하였다. 정제된 단백질들을 -80℃에서 보관하였다. 단백질 품질을 SDS-PAGE 분석에 의해 평가하고 기능성 분자들의 농도를 아래에서 기술되는 것과 같이 활성 부위 적정 또는 rpHPLC에 의한 경쇄 함량의 정량에 의해 측정하였다.
활성 부위 적정에 의한 FVIIa 변이체의 측정
정제된 제제에서의 기능성 분자들의 농도를 본질적으로 다른 곳에서 기술된 (Bock P.E., 1992. J. Biol . Chem . 267. 14963-14973) d-Phe-Phe-Arg-클로로메틸 케톤 (FFR-cmk; Bachem)의 화학양론적 아래의 수준으로 적정시 아미돌라이틱 활성 (amidolytic activity)의 비가역적인 손실로부터 활성 부위 적정에 의해 측정하였다. 간단히 설명하면, 모든 단백질을 분석 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2. 1 mg/mL BSA 및 0.1% w/v PEG8000)으로 희석하였다. 150 nM FVIIa 변이체의 최종 농도를 500 nM의 가용성 조직 인자 (sTE)와 함께 10분 동안 예비인큐베이션한 후 FFR-cmk를 96-웰 플레이트에서 100 μL의 총 반응 부피 중의 0 내지 300 nM (n=2)의 최종 농도로 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 다른 96-웰 플레이트에서, 20 μL의 각 반응을 1 mM S-2288 (Chromogenix, Milano, Italy)을 함유하고 있는 분석 완충액에서 10배로 희석하였다. 흡광도 증가는 10분 동안 405 nM에서 SOFTmax PRO 소프트웨어가 장착되어 있는 Spectramax 190 마이크로플레이트 분광계에서 연속적으로 측정하였다. 아미돌라이틱 활성을 블랭크를 뺀 후 선형 진행 곡선의 기울기로서 기록하였다. 활성 부위 농도를 아미돌라이틱 활성을 완전히 폐기하기에 필요한 FFR-cmk의 최소 농도로서, 외삽에 의해 측정하였다.
역상 HPLC를 사용한 경쇄 함량으로부터의 FVIIa 변이체의 측정 - 대체 접근법으로, 정제된 제제에서의 기능성 FVIIa 분자들의 농도를 역상 HPLC (rpHPLC)에 의해 FVIIa 경쇄 (LC) 함량의 정량에 의해 측정하였다. 야생형 FVIIa을 사용한 보정 곡선을 0 내지 3 μM 범위의 FVIIa 농도를 사용하여 제조하는 한편, 미지 농도의 샘플을 1.5 μM (n=2)의 추정된 농도로 제조하였다. 모든 샘플을 0.5 M 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP; Calbiochem/Merck KGaA, Darmstadt, Germany)과 샘플에 20% (v/v)의 농도로 첨가된 포름산의 1:1 혼합물을 사용하여 환원시키고 이어서 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열하였다. 환원된 FVIIa 변이체를 30에서 유지시키는 C4 칼럼 (Vydac. 300 Å, 입자 크기 5 μM, 4.6 mm, 250 mm) 상에 로딩하였다. 이동상은 물 중의 0.09% TFA (용매 A) 및 아세토니트릴 중의 0.085% TFA (용매 B)로 구성된다. 80 μL의 샘플을 주사한 후, 시스템을 등용매적으로 4분 동안, 이어서 25 내지 46% B의 선형 구배에서 10분에 걸쳐 이동시켰다. 피크를 각각 280 및 348 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광에 의해 검출하였다. 경쇄 정량을 피크 통합에 의해 수행하고 FVIIa 변이체의 상대적인 양을 야생형 FVIIa 표준 곡선을 기초로 계산하였다.
실시예 5 - 증가된 활성을 부여하는 돌연변이에 대한 스크리닝
실시예 1 및 표 1에서 개관한 것과 같이, 그리고 위치 201 및 288에서 FVIIa 아미노산들의 역할을 평가하기 위하여; 이들 위치에 대해 엄격한 부위-특정 포화 돌연변이생성을 수행하였다. 추가로 증강된 단백질 가수분해 활성을 가지는 FVIIa 변이체를 확인하기 위하여, 다른 아미노산 위치, 305 및 337을 또한 포화 돌연변이생성에 대해 선택하였다. 간단히 설명하면, 활성을 인지질 소포의 존재하여 마크로분자 기질 인자 X를 단백질 가수분해적으로 활성화하는 각각의 변이체의 능력으로서 측정하였다 (시험관 내 단백질 가수분해 분석). 재조합 FVIIa의 작용의 가능한 TF 의존성 및 무관한 메커니즘을 모방하기 위해 각 반응을 공동-인자 조직 인자 (sTF)의 존재 또는 부재하에 수행하였다. 나아가, 항트롬빈에 의한 FVIIa 억제를 향한 이들 치환의 역할을 이해하기 위하여; 반응을 생체 내에서 가속화하는 내인성 헤파린-유사 글리코사미노글리칸 (GAG)의 능력을 모방하기 위하여 저분자량 헤파린의 존재하에 항트롬빈 억제를 위-1차 조건 하에서 정량하였다. 이들 결과를 표 2에 요약한다. 도 2에서 알 수 있는 것과 같이, 측정된 시험관 내 항트롬빈 반응성은 FVIIa-항트롬빈 복합체의 생체 내 축적과 상관이 있고 그로써 시험관 내 스크리닝 과정의 예측을 확인해주는 것으로 밝혀졌다.
선택된 아미노산 위치들의 포화 돌연변이생성. 결과들은 야생형 FVIIa의 퍼센트 (%)로 표시한다.
Figure pct00010
위치 201에서 글루타민, 타이로신, 메티오닌, 라이신 및 아르기닌을 포함하는 아미노산들은 인지질의 존재하에 기질로서 FX를 향한 단백질 가수분해 활성을 얻기 위해 필요하다. W201R은 인지질의 존재 및 sTF의 부재 또는 존재하에 단백질 가수분해 활성의 가장 큰 증가를 제공한다. 다른 한편으로, 페닐알라닌, 로이신 및 아스파라긴을 포함한 아미노산들은 FVIIa WT에 비교하여 단백질 가수분해 활성을 감소시킨다. 위치 288의 경우에, 알라닌, 아스파라긴, 세린, 트립토판, 페닐알라닌 및 타이로신은 인지질의 존재하에 기질로서 FX를 향한 단백질 가수분해 활성의 증가를 제공한다. L288F 및 L288Y는 인지질의 존재하에 단백질 가수분해 활성의 가장 큰 증가를 제공한다. 표 2에 나타낸 데이터는 단백질 가수분해 활성 및 연역적인 항트롬빈 반응성을 예측하는 데 있어 도전을 증명한다. 그러므로 포화 돌연변이생성을 사용하는 본 발명자들의 접근법은 상이한 아미노산들이 FVIIa 변이체를 불러 일으키는 활성의 영향의 전체 레퍼토리를 탐색하기 위해서 정당하다.
기질로서 인자 X를 사용하는 단백질 가수분해 활성의 측정 (시험관 내 단백질 가수분해 분석) - FVIIa 변이체의 단백질 가수분해 활성을 기질로서 혈장-유도된 인자 X (FX)를 사용하여 평가하였다. 모든 단백질을 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA 및 0.1% w/v PEG8000에서 희석하였다. 상대적인 단백질 가수분해 활성을 1 내지 10 nN의 각각의 FVIIa 포합체를 40 nM의 FX와 함께 25 μM의 75:25 포스파티딜 콜린:포스파티딜 세린 (PC:PS) 인지질 (Haematologic technologies, Vermont, USA)의 존재하에 30분 동안 실온에서 96-웰 플레이트 (n=2)에서 100 μL의 총 반응 부피로 인큐베이션함으로써 측정하였다. sTF의 존재하의 FX 활성화를 5 pM의 각 FVIIa 포합체를 30 nM의 FX와 함께 25 μM의 PC:PS 인지질의 존재하에 20분 동안 실온에서 100 μL의 총 반응 부피로 인큐베이션함으로써 (n=2) 측정하였다. 인큐베이션 후에, 반응을 중단 완충액 (50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 80 mM EDTA)에 100 μL의 1 mM S-2765 (Chromogenix, Milano, Italy)를 첨가함으로써 퀀칭하였다. 퀀칭 직후에, 흡광도 증가를 Envision 마이크로플레이트 판독기 (PerkinElmer, Waltham, MA)에서 405 nM에서 연속적으로 측정하였다. 모든 첨가, 인큐베이션 및 플레이트 이동을 Envision 마이크로플레이트 판독기에 온라인으로 연결되어 있는 Hamilton Microlab Star 로봇 (Hamilton, Bonaduz, Switzeland)에 의해 수행하였다. 외관상 촉매 속도 값 (kcat/Km)을 FX 기질 농도 ([S])가 활성화 반응에 대한 Km 아래에 있기 때문에 선형 회귀를 사용하여 데이터를 Michaelis Menten 방정식의 단순화된 형태 (v = kcat * [S] * [E] / Km)에 맞춤으로써 산정하였다. 생성된 FXa의 양을 동일한 조건 하에서 인간 혈장-유도된 FXa로 제조된 표준 곡선으로부터 산정하였다. 산정된 kcat/Km 값을 사용된 FVIIa 변이체의 농도에 따른 FXa 생성의 측정된 속도의 표준화 후에 야생형 FVIIa의 그것에 대해 기록하였다. 그 결과를 표 1, 표 2, 표 3 및 표 7에 나타낸다.
항트롬빈에 의한 FVIIa 억제의 측정 - 저분자량 (LMW) 헤파린 (Calbiochem/Merck KGaA, Darmstadt, Germany)의 존재하에 위-1차 조건하에서 인간 혈장-유도된 항트롬빈 (AT)에 의한 억제의 시험관 내 속도를 측정하기 위하여 불연속적 방법을 사용하였다. 분석을 96-웰 플레이트에서 50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA 및 0.1% w/v PEG8000을 함유하고 있는 완충액 중에서 총 200 μL의 반응 부피로 수행하였다. 200 nM의 FVIIa와 12 μM의 LMW 헤파린의 혼합물에 5 μM의 항트롬빈을 100 μL의 최종 반응 부피로 첨가하였다. 상이한 시간에, 반응을 20 μL의 반응 혼합물을 180 μL의 sTF (200 nM), 폴리브렌 (0.5 mg/mL; Hexadimethrine bromide, Sigma-Aldrich) 및 S-2288 (1 mM)을 함유하고 있는 다른 미세역가 플레이트에 옮김으로서 퀀칭하였다. 상이한 시간에 옮긴 직후, 기질 절단을 405 nm에서 10분 동안 Envision 마이크로플레이트 판독기에서 모니터링하였다. 위-1차 속도 상수 (kobs)를 지수 감쇠 함수에 데이터의 비-선형 최소 제곱법 적용에 의해 얻었고, 2-차 속도 상수 (k)를 다음의 관계로부터 얻었다: k = kobs/[AT]. 모든 첨가, 인큐베이션 및 플레이트 이동을 Envision 마이크로플레이트 판독기에 온라인으로 연결되어 있는 Hamilton Microlab Star 로봇 (Hamilton, Bonaduz, Switzeland)에 의해 수행하였다. 억제 속도를 야생형 FVIIa의 그것에 관하여 기록하였다. 결과를 표 2, 표 3 및 표 7에 나타낸다.
실시예 6 - 증가된 활성 및 항트롬빈 저항을 부여하는 FVIIa 돌연변이들의 조합
높은 단백질 가수분해 활성 및 항트롬빈 저항을 가지는 FVIIa 변이체를 디자인하기 위하여, 확인된 FVIIa 단백질 가수분해 활성 증강 변이체의 선택을 항트롬빈 저항을 부여하는 FVIIa 변이체와 조합하였다. 구체적으로, FVIIa 조합 변이체를 위치 293 및 201, 288, 305, 337, 176 및/또는 286에서의 치환으로 만들었다. 실시예 5에서 기술된 시험관 내 단백질 가수분해 및 항트롬빈 억제 분석을 사용한 조합 FVIIa 정제된 단백질 제제의 특성확인은 표 3에 요약한다.
표 3은 일부 조합이 동시에 바람직한 낮은 항트롬빈 반응성을 가지면서 바람직한 고활성을 나타내는 FVIIa 변이체를 초래하였음을 증명한다. 예를 들어, FVIIa 변이체 L288F T293K는 야생형 FVIIa에 비교하여 인지질의 존재하에 600%의 단백질 가수분해 활성 및 저분자량 헤파린의 존재하에 단지 6%의 항트롬빈 반응성을 나타냈다. 유사하게, FVIIa 변이체 L288Y T293K는 야생형 FVIIa에 비교하여 인지질의 존재하에 447.8%의 단백질 가수분해 활성 및 저분자량 헤파린의 존재하에 단지 5.8%의 항트롬빈 반응성을 나타냈다. 나아가, W201R T293K는 야생형 FVIIa에 비교하여 인지질의 존재하에 609%의 단백질 가수분해 활성 및 저분자량 헤파린의 존재하에 단지 9%의 항트롬빈 반응성을 나타냈다.
흥미롭게도, 2개의 FVIIa 돌연변이 L288F 및 K337A를 조합하는 것은 크게 증강된 활성을 제공하는데, 야생형 FVIIa에 비교하여 단백질 가수분해 활성이 2646% 증가한 것으로 측정되었다. 추가로 돌연변이 T293K와 공동-도입될 때, 증강된 활성은 보유되면서 낮은 항트롬빈 반응성이 이루어진다. 이 변이체는 야생형 FVIIa에 비교하여 인지질의 존재하에 1310%의 단백질 가수분해 활성 및 저분자량 헤파린의 존재하에 단지 17%의 항트롬빈 반응성을 나타낸다.
이들 결과를 함께 보면, 293K, T293R 및 T293Y 돌연변이는 W201R 또는 L288F와 조합될 때 야생형 FVIIa에 비교하여 항트롬빈 반응성을 효과적으로 감소시키는 한편 야생형 FVIIa에 비교하여 더 높은 단백질 가수분해 활성을 제공한 것으로 결론지을 수 있다.
FVIIa 조합 변이체의 단백질 가수분해 활성 및 항트롬빈 반응성. 결과는 야생형 FVIIa의 퍼센트 (%)로서 나타낸다.
FVIIa 변이체 단백질 가수 분해 활성 + PS:PC (%) 단백질 가수 분해 활성 + sTF + PS:PC (%) AT 반응성 + LMWH (%) AT 반응성 + sTF
(%)
FVIIa W201R T293Y 1026.9 202.6 11.1 2.3
FVIIa W201R T293R L305I 1573.6 411.3 46.6 8.9
FVIIa W201R T293R 217.2 375.5 7.1 9.1
FVIIa W201R T293K L305I 1734.6 446.4 82.5 3.4
FVIIa W201R T293K 590.6 272.2 7.9 7.7
FVIIa W201R L288F T293R 2542.8 427.2 40.4 33.2
FVIIa W201R L288F T293K 1476 307.2 16.7 18.2
FVIIa W201M T293Y 599.7 145.4 11.6 1.7
FVIIa W201M T293R 179.2 201.7 3 6.7
FVIIa W201M T293K 146.1 173.5 3.8 5.2
FVIIa W201K T293Y 617.7 176.7 15.4 2.6
FVIIa W201K T293R 553.5 8.8 11.6
FVIIa W201K T293K 217.2 214.6 6.3 7.3
FVIIa T293Y L305V K337A 1194.6 121 62.4 3.3
FVIIa T293Y K337A 213 162.9 26.5 2
FVIIa T293R L305V K337A 2552.5 427 37.4 6.9
FVIIa T293R L305V 1325.8 356.1 19.1 4.2
FVIIa T293R L305I 711 229.7 22.1 2.6
FVIIa T293R K337A 690.2 279 10.4 13.4
FVIIa T293K L305V K337A 956.8 170.1 34.2 5.7
FVIIa T293K L305I 524 152.2 17.9 1.7
FVIIa T293K K337A 773.1 264.9 7.2 6.9
FVIIa L305V T293Y 669.5 110.4 30.4 1.3
FVIIa L305V T293K 792.4 166.6 13.8 1.9
FVIIa L288Y T293R K337A 2530.2 323.8 19.1 10.1
FVIIa L288Y T293R 1059.7 298.4 7.5 4.8
FVIIa L288Y T293K 676.5 233.7 5.4 4.5
FVIIa L288N T293Y 783.2 116.2 10.6 0.8
FVIIa L288N T293R 209.5 78.7 20.7 3.5
FVIIa L288N T293K 168 69 4.4 0.9
FVIIa L288F T293Y 523.9 48.1 12.2 2
FVIIa L288F T293R L305V 1784.5 101.3 48.6 9.1
FVIIa L288F T293R L305I 1456.4 158.2 41.4 3.5
FVIIa L288F T293R K337A 2001.9 305 21.5 20.7
FVIIa L288F T293R 259.7 110 8.3 6.7
FVIIa L288F T293K L305V 466.3 181.4 8.2 10.2
FVIIa L288F T293K L305I 2147.7 147.6 33 2.8
FVIIa L288F T293K K337A 1310.7 133.6 17.1 9
FVIIa L288F T293K 600.6 210.2 6.1 4.3
실시예 7 - FVIIa 효능 및 혈장 수준의 산정
효능을 상업적 FVIIa 특이적 응고 분석; Diagnostica Stago로부터의 STACLOT®VIIa-rTF를 사용하여 산정하였다. 분석은 J. H. Morrissey et al. Blood. 81:734-744 (1993)에 의해 공개된 방법을 기초로 한다. 그것은 인지질의 존재하에 FVII 결핍 혈장에서 피브린 응고 형성까지의 sTF 개시된 FVIIa 활성-의존성 시간을 측정한다. 응고 시간을 ACL9000 (ILS) 응고 기기 상에서 측정하고, 결과들을 FVIIa 보정 곡선을 기초로 이중대수 규모로 선형 회귀를 사용하여 계산하였다. 동일한 분석을 동물 PK 연구로부터의 혈장 샘플에서 FVIIa 응고 활성을 측정하는 데 사용하였다. 혈장에서 정량의 하한 (LLOQ)은 0.25 U/ml로 산정하였다. 혈장 활성 수준을 비활성을 사용하여 nM로 전환하였다.
실시예 8 - FVIIa 변이체의 결정학적 분석
확인된 치환이 단백질 가수분해 활성 및 항트롬빈 인식에 영향을 미치는 메커니즘을 탐색하기 위하여, 대표적인 FVIIa 변이체 L288Y T293K, L288F T293K, W201R T293K, W201R T293Y 및 L288F T293K K337A의 결정 구조를 측정하였다.
3-차원 수준의 구조와 비교할 때, 가용성 조직 인자 [Banner, D. W. et al, Nature, (1996), Vol. 380, 41-46]와 복합체를 형성한 야생형 (WT) FVIIa의 1DAN 구조는 SEQID NO:1의 넘버링 계획도에 따라 다시 넘버링된 FVIIa의 중쇄 잔기들을 가졌다.
가용성 조직 인자 (단편 1 내지 219)와 복합체를 형성한 정제된 H-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤 (FFR-cmk; Bachem, Switzerland) 활성-부위 억제는 FVIIa 변이체를 문헌에 따라 행잉 드롭 (hanging drop) 방법을 사용하여 결정화하였다 [Kirchhofer, D. et al, Proteins Structure Function and Genetics, (1995), Vol. 22, pages 419-425]. 단백질 완충액 용액은 10　mM Tris pH 7.5 at 25℃, 100　mM NaCl, 15　mM CaCl2의 혼합물이었다. 단백질 농도를 FVIIa 변이체에 대한 침전제 용액 및 혼합 조건과 함께 표 4에 나타낸다. 24-웰 VDX-플레이트 및 1.0 ml의 웰 용액을 사용하는 행잉 드롭 방법을 활용하였다. 드롭은 1.5 ㎕의 단백질 용액과 0.5 ㎕의 웰 용액의 혼합물로 설정하였다. 스트리크 시딩 (streak seeding)을 사용하여 핵화를 초기화하였다.
냉동 조건을 표 4에 나타낸다. 결정을 냉동 용액에 약 30초 동안 담가지게 놓아둔 후 결정을 액체 질소에 옮겨서 그것에 급속 냉동시켰다. 결정학적 데이터를 Karplus 등에 의해 기술된 것과 같이 [Karplus, P. A. et al, Science (New York, N.Y.), (2012), Vol. 336, pages 1030-1033] 해상도 컷-오프를 사용하여 XDS 데이터 환원 소프트웨어 [Kabsch, W., Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, (2010), Vol. 66, pages 125-132]에 의해 처리하였다.
FVIIa 변이체에 대한 결정화 및 냉동 조건.
FVIIa 변이체 단백질 농도 침전제 용액 단백질:침전제 용액의 혼합 비율 냉동 조건
L288Y T293K 2.5 mg/ml 0.1　M 카코딜레이트 pH　5.1, 13　% Peg 8000 3:1 100　% TMAO (트라이메틸아민 N-옥사이드)
L288F T293K 2.14 mg/ml 0.1　M Na-시트레이트 pH　5.6, 17　% Peg 3350 및 12　% 1-프로판올 3:1 100　% TMAO
W201R T293K 1.0 mg/ml 0.1　M 카코딜레이트 pH　5.1, 13　% Peg 8000 3:1 침전제 용액으로서, 35　% PEG 8000 포함
W201R T293Y 2.93 mg/ml 0.1　M 카코딜레이트 pH　5.1, 12　% Peg 8000 3:1 침전제 용액으로서, 35　% PEG 8000 포함
L288F T293K K337A 1.0 mg/ml 0.1 M Na-시트레이트 pH　5.6, 16　% Peg 3350 및 12% 1-프로판올 3:1 침전제 용액으로서, 35　% PEG3350 포함
단백질 데이터 뱅크 (PDB) [Berman, H. M. et al, Nucleic Acids Res., (2000), Vol. 28, pages 235-242]로부터의 1DAN 엔트리의 결정학적 좌표를 기초로 한 내부 생성된 좌표 (미공개) [Banner, D. W. et al, Nature, (1996), Vol. 380, pages 41-46]를 phenix.phaser [Mccoy, A. J. et al, J.Appl.Crystallogr., (2007), Vol. 40, pages 658-674]에서 분자 대체 계산 또는 PHENIX 소프트웨어 패키지 [Adams, P. D. et al, Acta Cryst.D, (2010), Vol. 66, pages 213-221]의 phenix.refine 소프트웨어 [Afonine, P. V. et al, Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (2012), Vol. 68, pages 352-367]를 사용한 즉시 개선 중 어느 하나에 대한 출발 모델로서 사용하였다. 5개의 FVIIa 변이체에 대한 결정학적 데이터, 개선 및 모델 통계를 표 5에 나타낸다.
데이터 수집, 개선 및 모델 통계. 최고-해상도 쉘에 대한 통계는 괄호로 표시된다.
FVIIa 변이체 L288Y T293K L288F T293K W201R T293K W201R T293Y L288F T293K K337A
데이터 수집 빔라인 BLI911-3, MAX-lab BLI911-3, MAX-lab BLI911-3, MAX-lab BLI911-3, MAX-lab X10SA, SLS
파장 [Å] 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.9999
해상도 범위 [Å] 35.7 - 2.01
(2.082 - 2.01)		 29.25 - 2.37
(2.455 - 2.37)		 29.5 - 1.71
(1.772 - 1.71)		 29.16 - 2.5 (2.589 - 2.5) 49.75 - 2.216
(2.295 - 2.216)
스페이스 기 P 21 21 21 P 21 21 21 P 21 21 21 P 21 21 21 P 21 21 21
유닛 셀 [Å] 71.34 82.46 123.3 69.34 81.57 125.88 68.77 78.2 172.21 68.86 81.42 125.39 68.919 81.545 125.57
총 반사 321033 (9043) 103617 (6525) 501348 (14728) 91616 (9007) 234709 (20365)
독특한 반사 48292 (4010) 28995 (2424) 96329 (6505) 24966 (2433) 35724 (3412)
다중도 6.6 (2.3) 3.6 (2.7) 5.2 (2.3) 3.7 (3.7) 6.6 (6.0)
완성도 [ % ] 98.31 (83.26) 97.71 (83.50) 95.43 (63.97) 99.70 (99.43) 99.60 (96.82)
평균 I/sigma(I) 9.33 (0.68) 9.45 (0.79) 11.73 (0.42) 5.09 (0.54) 7.39 (0.53)
Wilson B-인자 [Å] 22.18 40.30 24.56 25.91 45.71
R-merge 0.2439 (1.316) 0.145 (1.431) 0.1141 (1.968) 0.3456 (2.778) 0.2599 (3.739)
R- meas 0.2647 0.1698 0.1266 0.4047 0.2822
CC1/2 0.987 (0.277) 0.992 (0.322) 0.997 (0.219) 0.951 (0.11) 0.992 (0.174)
CC* 0.997 (0.659) 0.998 (0.698) 0.999 (0.599) 0.987 (0.446) 0.998 (0.545)
개선에 사용된 반사 48286 28991 96323 24966 35721
R-유리에 사용된 반사 2497 1465 4773 1260 1853
R- 워크 0.2122 (0.3487) 0.2199 (0.3698) 0.2170 (0.5007) 0.2568 (0.3940) 0.2077 (0.4038)
R-유리 0.2561 (0.3880) 0.2755 (0.3826) 0.2556 (0.5132) 0.3102 (0.4015) 0.2556 (0.4045)
비-수소 원자의 수: 총 5446 4969 5382 4981 4566
마크로분자에서 4769 4700 4836 4679 4355
리간드에서 81 51 87 36 39
물에서 596 218 459 266 172
단백질 잔기 607 618 622 607 561
RMS (결합) [Å] 0.007 0.004 0.008 0.002 0.005
RMS (각) [°] 0.88 0.64 1.05 2.73 0.75
선호 라마찬드란 [ % ] 97 94 94 94 95
라마찬드란 이상점 [ % ] 0 0 0.99 0.51 0
클래시점수 1.69 1.41 3.60 2.19 1.74
평균 B-인자 [Å 2 ]: 총 30.70 51.70 60.40 43.70 61.80
마크로분자용 29.70 51.90 61.50 44.80 61.80
리간드용 56.10 65.60 68.50 43.60 109.30
용매용 35.30 44.70 46.70 23.60 50.10
3-차원 구조 분석
일반적으로 야생형 (WT) FVIIa 분자 1DAN 구조 [Banner, D. W. et al, Nature, (1996), Vol. 380, pages 41-46]와 FVIIa 변이체의 그것 사이에는 주요한 차이가 없다. 1DAN FVIIa 중쇄와 L288Y T293K, L288F T293K, W201R T293K, W201R T293Y 및 L288F T293K K337A FVIIa 변이체 사이의 gesamt [Krissinel, E., Journal of Molecular Biochemistry, (2012), Vol. 1, pages 76-85]에 의해 계산된 전체 평균 제곱근 편차 (RMSD)는 각각 0.424, 0.365, 0.451, 0.342 및 0.289 Å이다. 계산에 사용된 Ca-원자 쌍의 수는 각각 254, 254, 251, 254 및 254이다.
W201R T293Y FVIIa 변이체
돌연변이 FVIIa W201R :
상세한 수준으로, 이중 돌연변이의 중쇄 FVIIa Arg 201 잔기를 "60-루프" (키모트립신 넘버링)에 위치시킨다. 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도에서, 1.0 σ 컷-오프에는 전과 후의 잔기들 (각각 Asn 및 Arg 잔기)의 측쇄와 함께, Arg 201 잔기 (야생형 FVIIa의 Trp 잔기)의 측쇄에 대해 볼 수 없는 주요 사슬 루프가 신장된 표시가 있다. 이것은 그런 측쇄의 높은 가요성을 나타낸다. 구조 해석을 보조하기 위하여, 내부 야생형 단백질 결정으로부터 관찰된 구조 인자들과 FVIIa 이중 돌연변이 [Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)]로부터 관찰된 구조 인자들 사이의 차등 전자 밀도 지도를 CCP4 소프트웨어 프로그램 패키지 [Collaborative Computational Project, N. Acta crystallographica, Section D, Biological crystallography, 1994, 50, 760-763]로부터의 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 야생형 데이터 또는 이중 돌연변이 데이터로부터의 상들 (phases)을 사용하여 유사한 상이한 지도를 만들었다. 상이한 지도의 포지티브 측에서 야생형 FVIIa로부터의 Trp 잔기의 측쇄를 분명하게 볼 수 있는 (야생형 데이터로부터의 상들을 사용하여 5.6 σ 수준에서 최대 피크) 한편, 상이한 지도의 네거티브 측에서는 Arg 측쇄가 분명하게 나타나지 않는다. 이것은 또한 Arg 잔기가 야생형 단백질의 Trp 잔기보다 더 가요성인 것을 주장한다. 그러나, Trp 잔기 전이나 후 어느 것도 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도를 사용하여 FVIIa W201R T293Y/sTF 결정 구조로부터 유사하게 유발되는 1DAN 구조에서 명백하게 관찰될 수 없는 한편, Trp 201의 위치는 FVIIa WT 구조에서 명백하게 볼 수 있다는 것이 주지되어야 한다.
연구된 루프의 주요 사슬 배향과 관련하여, 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도 및 phenix.refine 개선은 200, 201 및 202 잔기를 공개된 1DAN 구조 [Banner. D. W., et al., Nature, 1996, 380, 41-46]에 관하여, 대체된 Trp 측쇄 잔기의 위치 쪽으로 더 가깝게 위치시킨다. 특히 잔기 Asn 200이 이동되었고 그것의 Cα 위치는 야생형 구조 (도 3)의 그것의 위치로부터 3.1 Å 떨어져 있다. 또한, 기술된 [Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)] 차등 지도에는 그런 잔기 Asn 200의 이동을 가리키는 피크들이 있다. 하나의 5.7 σ 포지티브 피크는 야생형 루프 형태의 위치에 가깝고 다른 4.3 σ 네거티브 피크는 정제된 이중 돌연변이 형태의 약간 내부쪽에 있다. 이것은 주요 사슬이 WT Trp 측쇄의 위치를 향해 더 가깝게 그리고 상대적으로 FVIIa 중쇄의 중심쪽으로 더 이동하는 것을 지지한다.
야생형 구조와 중쇄 FVIIa의 잔기 200, 201 및 202에 대한 이중 돌연변이된 단백질 사이에서 볼 수 있는 구조적 차이는 아마도 FVIIa 단백질에서 주로 소수성 부피를 채우고 그로써 야생형 구조에 루프를 고정시키는 WT 구조에서 Trp 201 잔기 측쇄를 가리키는 내부에 의한 안정화에 따라 달라진다. FVIIa W201R T293Y에서 해당하는 잔기 Arg의 측쇄는 측쇄가 단단하게 결합되어 있는 동일한 견고한 구조를 형성하지 못하지만, 보다 유연하고, 그러므로 WT FVIIa 구조에서와 같은 방식으로 루프를 고정하지 못한다.
도 3은 2개의 결정 구조를: 1) PDB 구조 1DAN [Banner. D. W., et al., Nature, 1996, 380, 41-46]과 동일한 유형의 결정으로부터의 내부 데이터 세트를 사용하여, 밝은 색의 탄소 원자, 즉 조직 인자와 복합체를 형성한 FVIIa 야생형 단백질과 비교한 것과, 및 2) 진한 색의 탄소 원자, 즉 조직 인자와 복합체를 형성한 FVIIa 이중 돌연변이 W201R T293Y와 비교한 것을 나타낸다. 잔기들의 일부는 아미노산 1-문자 코드로 표지하고 1)과 2)에 대해 각각 "-wt" 또는 "-m"으로 마친다. 여러 측쇄가 절단되었는데 (Cβ 외부의 원자들이 제거되었음) 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도가 그런 측쇄들에 대한 어떠한 전자 밀도도 보이지 않았기 때문이다. 예를 들어 FVIIa 이중 돌연변이 W201R T293Y의 잔기 N200, R201 및 R202가 그 이유로 모두 절단된다. EHAS을 분자 그래픽 소프트웨어 PyMOL [The PyMOL Molecular Graphics System. Version 1.6.0.0 Schrodinger, LLC]에 의해 제조하였다.
돌연변이 FVIIa T293Y :
중쇄 FVIIa Tyr 293 잔기를 활성화 루프 1에 위치시킨다. 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도는 1.0 σ 컷-오프에서, 명백하게 정제된 구조의 Tyr 잔기의 주요 사슬 및 측쇄를 보여준다. Tyr 측쇄 원자 Cβ-Cγ2는 야생형 Thr 잔기의 Cβ-Cγ2 원자들에 대한 동일한 방향을 따른다. C-Cα-Cβ-Cγ 및 C-Cα-Cβ-Cγ2 2면각은 이중 돌연변이 및 WT 형태의 FVIIa 잔기 293에 대해 각각 165 및 173°이다. 그로써 이중 돌연변이의 Tyr 293 잔기는 그것의 측쇄를 촉매 도메인의 방향으로 및 FFR-cmk 결합된 억제제의 결합 부위 족으로 향하게 한다. 계산된 [Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)] 차등 지도는 Tyr 고리 시스템에서 네거티브 피크 (4.7 σ 높이)를 가지고 잃어버린 Thr OY1 원자에서 포지티브 피크 (4.2 σ 높이)를 가지는 Tyr 측쇄의 배향을 확인해준다.
항트롬빈과 FVIIa 돌연변이된 T293Y 분자 사이의 가능한 상호작용을 연구하기 위하여, 인자 Xa 분자 복합체의 항트롬빈, PDB-코드 2GD4 [Johnson. D. J. D., et al., Embo J., 2006, 25, 2029-2037]와의 겹침을 FVIIa 이중 돌연변이 상에 만들었다. 분자 그래픽 소프트웨어 PyMOL [The PyMOL Molecular Graphics System, 버전 1.6.0.0 Schrodinger, LLC]을 사용하여 FXa와 FVIIa 분자의 겹침을 위해 사용하였고, 1194 원자들에 대해 0.769 Å의 RMSD를 초래하였다. 라이딩 (riding) 항트롬빈 분자 모델로부터, 이론적으로 생성된 분자 복합체 (FVIIa W201R T293Y/항트롬빈 III)의 FVIIa W201R T293Y 돌연변이의 Tyr 293 잔기가 특히 잔기 Leu 395와 공간적으로 중복을 형성하며, 또한 항트롬빈 분자의 Arg 399와도 중복을 형성하는 것이 분명하다, 도 4. 이것은 FVIIa 이중 돌연변이의 Tyr 293과 라이딩 항트롬빈 분자 사이의, CCP4 프로그램 슈트의 접촉 소프트웨어에서 수행된, 거리 계산에 의해 확인된다. 돌연변이 FVIIa 분자의 Tyr 293 잔기와 항트롬빈 분자 사이에서 3.5 Å의 컷-오프 거리를 사용하고 그 결과는 표 6에 나타낸다. FXa 복합체 후에 FVIIa W201R T293Y 이중 돌연변이의 잔기 Tyr 293과 항트롬빈-S195A FXa-5당 복합체, PDB:2GD4 [Johnson. D. J. D., et al., Embo J., 2006, 25, 2029-2037]로부터의 항트롬빈 사이의 3.5 Å 또는 그것보다 짧은 모든 거리를, FVIIa (W201R T293Y) 및 공통 분자로서 FXa를 사용하여, FVIIa 돌연변이 (W201R T293Y)/sTF 구조에 겹쳐 놓았고, 그 결과를 표 6에 요약한다. 공간적 중복은 대부분 아마도 항트롬빈이 그것의 반응성 센터 루프 (RCL)를 FVIIa의 활성 부위 안에 위치시킬 가능성에 대해 부정적으로 영향을 미칠 것이다. 그로써 T293Y 돌연변이된 FVIIa 분자는 항트롬빈에 의한 억제에 덜 민감해질 것이다. 이것은 항트롬빈에 의한 비활성화에 대한 증가된 저항 및 연장된 반감기를 보이는 실험적으로 관찰된 것과 일치하며, 그것에 대한 설명을 제공한다.
도 4는 항트롬빈 (밝은 색 탄소 원자들로 표시됨)과 FVIIa W201R T293Y 이중 돌연변이 (진한 색 탄소 원자들로 표시됨) 사이의 복합체의 이론적인 모델을 나타낸다. FVIIa 돌연변이 W201R T293Y의 잔기 Tyr 293, Gln 255, Lys 341, Gln 286의 상대적인 위치 및 항트롬빈 분자 잔기 Leu 395, Arg 399, Glu 295, Tyr 253 및 V317에 대한 상대적인 위치가 도시되고 표지된다. 모델은 항트롬빈/FXa 복합체 [Johnson. D. J. D., et al., Embo J., 2006, 25, 2029-2037], PDB 코드 2GD4의 구조를 기초로 구성하였고, 이때 FXa 분자는 항트롬빈이 라이딩되도록 놓아둔 채 FVIIa W201R T293Y 변이체 분자의 중쇄위에 겹쳐놓았다. FVIIa W201R T293Y 및 항트롬빈의 잔기들은 각각 "FVIIa" 및 "AT"의 접두어를 가지고, 이어서 한-문자 아미노산 코드 및 잔기 번호로 표시된다. 도면은 분자 그래픽 소프트웨어 PyMOL [The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.6.0.0 Schrodinger, LLC]에 의해 제조하였다.
2개의 분자 사이의 기술된 이론적 모델에서 FVIIa (W201R T293Y) 이중 돌연변이의 잔기 Tyr 293과 항트롬빈 아미노산 사이의 3.5 Å 또는 더 짧은 모든 거리.
FVIIa W201R T293Y 항트롬빈 거리 [Å]
잔기
유형		 잔기 번호 및
사슬		 원자
명칭		 잔기
유형		 잔기 번호 및 사슬 원자
명칭
Tyr 293H N Tyr 253A OH 3.41
Tyr 293H CD1 Leu 395A CD1 3.07
Tyr 293H CD2 Tyr 253A OH 3.50
Arg 399A NH2 2.54
Arg 399A CZ 3.40
Tyr 293H CE1 Leu 395A CG 2.88
Leu 395A CD1 1.89
Leu 395A CD2 3.40
Tyr 293H CE2 Glu 255A OE2 3.11
Arg 399A NH2 2.24
Leu 395A CD1 2.72
Arg 399A CZ 2.90
Tyr 293H CZ Arg 399A NH2 3.26
Leu 395A CG 2.51
Leu 395A CD1 1.60
Arg 399A CZ 3.43
Leu 395A CD2 2.59
Tyr 293H OH Leu 395A CB 2.78
Leu 395A CG 1.53
Leu 395A CD1 1.54
Leu 395A CD2 1.26
W201R T293K FVIIa 변이체
FVIIa의 잔기 201 주변의 영역: 상세한 수준으로, 이중 돌연변이의 중쇄 FVIIa Arg 201 잔기를 "60-루프" (키모트립신 넘버링)에 위치시킨다. 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도에서, 1.0 σ 컷-오프에는 주요 사슬 루프 신장이 분명하게 보인다. Arg 201 잔기 (야생형 FVIIa의 Trp 잔기)의 측쇄 또한 분명하게 관찰된다. 그러나 Arg 202 잔기의 바깥 부분인 구아니디늄기는 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도에서 및 선택된 컷-오프에서 잃어버린 전자 밀도를 가지며, 그것은 더 높은 운동성 또는 무질서를 가리킨다. 연구한 루프 ("60-루프")의 주요 사슬 배향과 관련하여, 그것은 W201R T293K 와 1DAN 구조 [Banner, D. W. et al, Nature, (1996), Vol. 380, pages 41-46] 사이의 변환을 보인다. 2개의 구조를 겹쳐 놓은 후 폴리펩티드를 따라 잔기 197부터 203까지 이동시킬 때 동등한 Cα 위치에서 각각 0.64, 2.48, 3.63, 6.41, 4.15 및 0.81 Å의 차이가 있는 것을 볼 수 있었다. 루프의 주요 사슬을 1DAN WT Trp 측쇄 위치에서의 위치를 향해 더 가깝게 이동시켰고 [Banner, D. W. et al, Nature, (1996), Vol. 380, pages 41-46] 또한 FVIIa 중쇄의 중심, 촉매 도메인을 향해 이동시켰다. W201R T293K FVIIa의 Arg 201 잔기는 공개된 1DAN 구조의 대체된 WT Trp 측쇄 잔기의 위치를 향해 놓여있는 겹쳐 있는 구조에 있다.
야생형 구조와 중쇄 "60-루프"의 W201R T293K FVIIa 변이체 사이에서 볼 수 있는 구조적 차이는 아마도 FVIIa 단백질에서 주로 소수성 부피를 채우고 그로써 루프를 야생형 구조에 고정시키는 WT 구조에서 Trp 201 잔기 측쇄를 가리키는 내부에 의한 안정화에 따라 달라진다. FVIIa W201R T293Y에서 해당하는 잔기 Arg의 측쇄는 WT FVIIa 구조에서 Trp과 같은 방식으로 루프를 고정하지 못한다.
FVIIa의 잔기 293 주변의 영역: 중쇄 FVIIa Lys 293 잔기를 활성화 루프 1에 위치시킨다. 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도는 1.0 σ 컷-오프에서 명백하게 정제된 구조의 Lys 잔기의 주요 사슬 및 측쇄를 보여준다. Lys 측쇄 원자 Cβ-Cγ는 야생형 Thr 잔기의 Cβ-Cγ2 원자들에 대한 것과 같은 방향을 따른다. C-Cα-Cβ-Cγ 및 C-Cα-Cβ-Cγ2 2면각은 이중 돌연변이의 FVIIa 잔기 293 및 WT 형태에 대해 각각 169 및 173°이다. Lys 293은 컴퓨터 그래픽 소프트웨어 COOT [Emsley, P. et al, Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (2010), Vol. 66, pages 486-501]에 의해 알 수 있는 것과 같이, Lys에 대한 가장 공통적인 로타머 배향인 "mttt" 로타머 (rotamer) 배향을 나타낸다 [Lovell, S. C. et al, Proteins, (2000), Vol. 40, pages 389-408]. 더욱이, W201R T293K FVIIa 변이체의 Lys 293 잔기 Nζ 원자는 2.68 Å의 거리로, 잔기 Gln 176 Oε1 원자와 강력한 수소 결합을 만들며, 그로서 2개의 측쇄를 안정화시킨다. 그러므로 WT FVIIa 1DAN 구조에 비교하면, Gln 176 잔기는 그것의 측쇄 형태를 그것이 W201R T293K FVIIa 변이체의 Lys 293 잔기와 만드는 수소 결합을 최적화하도록 변경시켰다. 로타머는 문헌에 기술된 표준 형태들 중에 있지 않은 로타머 형태로 WT 구조의 "ttOo" 형태를 바꾼다 [Lovell, S. C. et al, Proteins, (2000), Vol. 40, pages 389-408]. 그로써, 이중 돌연변이의 Lys 293 잔기는 그것의 측쇄를 촉매 도메인의 방향으로 및 FFR-cmk 결합된 억제제의 결합 부위 족으로 향하게 하며 FVIIa 활성 부위 클레프트의 프라임 부위를 채운다.
L288Y T293K FVIIa 변이체
FVIIa의 잔기 288 주변의 영역:
영역은 결정 구조 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도에서 1.0 σ 컷-오프에서 분명하게 볼 수 있다. 루프에서 Tyr 288 잔기에 이어지는 잔기인 FVIIa L288Y T293K FVIIa 변이체의 중쇄의 잔기 289 내지 292는 주요 사슬 형태의 변화를 보이는데 잔기 Arg 290에서 최대 차이를 가지고, 이때 Cα 원자들은 FVIIa L288Y T293K FVIIa 변이체의 겹쳐 놓은 분자들과 FVIIa의 WT 구조, 1DAN [Banner, D. W. et al, Nature, (1996), Vol. 380, pages 41-46] 사이에서 2.87 Å의 차이를 가진다. Tyr 288 잔기의 Cα 원자는 겹쳐 놓은 ET FVIIa의 Leu 288 잔기의 동등한 원자에 대해 0.80 Å의 차이를 나타낸다. FVIIa L288Y T293K FVIIa 변이체의 Tyr 288의 측쇄 로타머는 "p90°"인 한편, WT FVIIa 1DAN 구조의 Ley 측쇄 로타머의 그것은 "mt" 로타머를 나타낸다 [Lovell, S. C. et al, Proteins, (2000), Vol. 40, pages 389-408]. 그것은 L288Y T293K FVIIa 변이체 및 WT FVIIa에 대해 각각 -69° 및 157°인 C-Cα-Cβ-Cγ 2면각의 차이에서 볼 수 있는 것처럼, 2개의 동등한 측쇄가 상이한 방향으로 있는 것을 가리키는 결과를 초래한다. L288Y T293K FVIIa 변이체의 Tyr 288 측쇄의 하이드록실기는, 결정 구조로 질서정연하게 있는 주변의 물 분자와 우선적으로 상호작용하며, 측쇄는 FVIIa L288Y T293K 변이체의 Tyr 288에 이어지는 루프위로 접혀진다. 잔기 288에 이어지는 루프의 구조적 주요 사슬 변경 및 잔기 288 자체의 돌연변이는 이 FVIIa 변이체에서 보여지는 활성 향상을 적어도 부분적으로 설명해줄 수 있을 것이다.
FVIIa의 잔기 293 주변의 영역:
이 잔기 및 그것과 접촉하게 되는 다른 잔기의 3D 구조는 W201R T293K FVIIa 변이체에 대해 기술된 것과 매우 유사하다. 그러므로 그 변이체의 T293K 돌연변이에 대해 유도된 모든 결론들은 또한 L288Y T293K FVIIa 변이체의 T293K 돌연변이에 대해서도 적용된다.
L288F T293K FVIIa 변이체
FVIIa의 잔기 288 주변의 영역:
이 영역은 결정 구조 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도에서 1.0 σ 컷-오프에서 분명하게 볼 수 있다. 이 영역의 3D 구조는 L288F T293K FVIIa 변이체에 매우 유사하다. 2개의 변이체는 예를 들면 동일한 주요 사슬 배향을 공유한다. 2개의 FVIIa 변이체 사이에서 상이한 한 가지는 Phe 288 측쇄가 그것의 측쇄에 대해 또 다른 바람직한 로타머 ("m-85°")를 가진다는 것이고, 그것은 실제로 WT FVIIa의 Leu 288 측쇄와 동일한 배향을 가리킨다. L288F T293K FVIIa 변이체의 Phe 288 측쇄의 비통상적인 특성은 Phe 잔기에 대해 그것이 주변 용매에 대해 비통상적으로 노출된다는 것이다 (CCP4 결정학 프로그램 슈트 [Bailey, S., Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (1994), Vol. 50, pages 760-763]의 AREAIMOL에 의한 계산에 따르면 145 Å2).
FVIIa의 잔기 293 주변의 영역:
이 잔기 및 그것과 접촉하게 되는 다른 잔기의 3D 구조는 W201R T293K FVIIa 변이체에 대해 기술된 것과 매우 유사하다. 그러므로 그 변이체의 T293K 돌연변이에 대해 유도된 모든 결론들은 또한 L288F T293K FVIIa 변이체의 T293K 돌연변이에 대해서도 적용된다.
L288F T293K K337A FVIIa 변이체
FVIIa의 잔기 288 주변의 영역:
이 영역은 결정 구조 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도에서 1.0 σ 컷-오프에서 분명하게 볼 수 있다. 이 영역의 3D 구조는 L288F T293K FVIIa 변이체에 매우 유사하다. 2개의 변이체는 예를 들면 동일한 주요 사슬 배향을 공유한다. 2개의 FVIIa 변이체 사이에서 상이한 한 가지는 Phe 288 측쇄가 그것의 측쇄에 대해 또 다른 바람직한 로타머 ("m-85°")를 가진다는 것이고, 그것은 실제로 WT FVIIa 및 L288F T293K FVIIa 변이체의 Leu 288 측쇄와 동일한 배향을 가리킨다. 그러므로 그 변이체의 L288F 돌연변이에 대해 유도된 모든 결론들은 또한 L288F T293K K337A FVIIa 변이체의 L288F 돌연변이에 대해서도 적용된다.
FVIIa의 잔기 293 주변의 영역: 이 잔기 및 그것과 접촉하게 되는 다른 잔기의 3D 구조는 W201R T293K FVIIa 변이체에 대해 기술된 것과 매우 유사하다. 그러므로 그 변이체의 T293K 돌연변이에 대해 유도된 모든 결론들은 또한 L288F T293K K337A FVIIa 변이체의 T293K 돌연변이에 대해서도 적용된다.
FVIIa의 잔기 337 주변의 영역:
이 영역은 결정 구조 가능성-가중된 2mFo-DFc 전자 밀도 지도에서 1.0 σ 컷-오프에서 분명하게 볼 수 있다. 이 영역의 3D 구조는 FVIIa의 WT 구조, 1DAN [Banner, D. W. et al, Nature, (1996), Vol. 380, pages 41-46] 및 이 실시예의 다른 FVIIa 변이체들에 유사하다. 전체적인 주요- 및 측쇄 배향은 WT FVIIa 1DAN 구조 및 다른 FVIIa 변이체 구조에 가깝지만, 작은 차이가 있는데, phenix.refine 최대-가능성 기초 계산에 의하면 결정 구조의 0.40 Å만큼 약간 더 큰 좌표 에러가 있다. 잔기 337의 동등한 Cβ 원자들은 FVIIa의 WT 구조, 1DAN 및 L288F T293K K337A FVIIa 변이체에서 0.8 Å 떨어져 있다. 동일한 잔기의 Cα 원자들은 0.4 Å 떨어져 있다. 잔기 336의 동등한 Cα 원자들은 FVIIa의 겹쳐 있는 WT 구조, 1DAN 및 L288F T293K K337A FVIIa 변이체에서 0.6 Å 떨어져 있다. Phe 332 잔기에 대해 쉬프트된 측쇄는 FVIIa의 WT 구조, 1DAN [Banner, D. W. et al, Nature, (1996), Vol. 380, pages 41-46]에 비교하여 L288F T293K K337A FVIIa 변이체의 Ala 337 잔기 쪽으로 대략 0.5 Å 거리에 있다. 또한 이 실시예의 다른 FVIIa 변이체들은 L288F T293K K337A FVIIa 변이체에 대해 FVIIa의 WT 구조, 1DAN과 대략 동일한 편차를 나타낸다고 결론지을 수 있다. 더욱이 다른 FVIIa 변이체는 L288F T293K K337A FVIIa 변이체가 그런 것보다 훨씬 더 WT FVIIa 1DAN 구조에 가깝게 뭉친다. 이것은 이 변이체의 변경된 특성을 적어도 부분적으로 설명해줄 수 있을 것이다.
실시예 9 내지 14 - FVIIa 변이체의 화학적 변형
실시예 9 내지 14에서 사용된 약어들:
AUS: 아쓰로박터 우레아파시엔스 (Arthrobacter ureafaciens) 시알리다제
CMP-NAN: 시티딘-5'-모노포스페이트-N-아세틸 뉴라민산
CV: 칼럼 부피
GlcUA: 글루쿠론산
GlcNAc: N-아세틸글루코사민
GSC: 5'-글리실시알산 시티딘 모노포스페이트
GSC-SH: 5'-[(4-메르캅토부타노일)글리실]시알산 시티딘 모노포스페이트
HEP: HEParosan 중합체
HEP-GSC: GSC-기능화된 헤파로산 중합체
HEP-[N]-FVIIa: N-글리칸을 통해 FVIIa에 포합된 HEParosan
HEPES: 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄설폰산
His: 히스티딘
PABA: p-아미노벤즈아미딘
ST3GalIII: N-글리칸 특이적 2,3-시알릴트란스페라제
TCEP: 트리스(2-카르복시에틸)포스핀
UDP: 우리딘 다이포스페이트
실시예 9 내지 14에서 사용된 정량 방법:
발명의 포합체를 HPLC에 의해 순도에 대해 분석하였다. HPLC를 또한 FVIIa 참조 분자를 기초로 분리된 포합체의 양을 정량하기 위해 사용하였다. 샘플을 비-환원 또는 환원 형태 중 어느 하나로 분석하였다. Zorbax 300SB-C3 칼럼 (4.6x50 mm; 3.5 μm Agilent, Cat. No.:865973-909)을 사용하였다. 칼럼을 30℃에서 작동시켰다. 5 ㎍의 샘플을 주입하고, 칼럼을 0.1%의 트라이플루오로아세트산을 함유하고 있는 물 (A)-아세토니트릴 (B) 용매 시스템으로 용출하였다. 구배 프로그램은 다음과 같았다: 0 분 (25% B); 4 분 (25% B); 14 분 (46% B); 35 분 (52% B); 40 분 (90% B); 40.1 분 (25% B). 환원된 샘플을 10 ㎕의 TCEP/포름산 용액 (물 중의 70 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 및 10% 포름산)을 25 ㎕/30 ㎍ FVIIa (or conjugate)에 첨가함으로써 제조하였다. 반응을 HPLC (5 ㎕ 주입)상에서 분석하기 전에 70℃에서 10분 동안 놓아두었다.
실시예 9 내지 14에서 사용된 출발 물질:
HEP- 말레이미드 및 HEP- 벤즈알데하이드 중합체
규정된 크기의 말레이미드 및 알데하이드 기능화된 HEP 중합체를 US 2010/0036001에 기술된 것과 같이 효소적 중합화 반응에 의해 제조한다. 2개의 당 뉴클레오티드 (UDP-GlcNAc 및 UDP-GlcUA) 및 반응을 개시하기 위한 프라이밍 3당 (GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2가 사용되며, 중합화는 당 뉴클레오티드 빌딩 블록이 고갈될 때까지 계속된다. 과정은 단일 말단 아미노기를 가지는 HEP 중합체를 생성한다. HEP 중합체의 크기는 당 뉴클레오티드 대 프라이머 비율에 의해 결정된다. 그런 다음 말단 아민 (프라이머로부터 기원함)은 GSC-SH에의 포합을 위해 말레이미드 기능성, 또는 GSC의 글리실 말단에의 환원성 아민화를 위해 벤즈알데하이드 기능성 중 하나로 기능화된다.
HEP-벤즈알데하이드는 아민 기능화된 HEP 중합체를 수성 중성 용액에서 과잉의 N-석신이미딜-4-포르밀벤조산 (Nano Letters (2007), 7(8), 2207-2210)과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 벤즈알데하이드 기능화된 중합체는 이온-교환 크로마토그래피, 크기 축출 크로마토그래피 또는 HPLC에 의해 분리될 수 있다. HEP-말레이미드는 과잉의 N-말레이미도부티릴-옥시석신이미드 에스테르 (GMBS; Fujiwara, K., et al. (1988), J. Immunol . Meth . 112, 77-83)와 아민 기능화된 HEP 중합체를 반응시킴으로서 제조될 수 있다.
벤즈알데하이드 또는 말레이미드 기능화된 중합체는 이온-교환 크로마토그래피, 크기 축출 크로마토그래피 또는 HPLC에 의해 분리될 수 있다. 말단 일차 아민 기능성 (HEP-NH2)으로 기능화된 어떠한 HEP 중합체는 본 실시예에서 사용될 수 있다. 2가지 옵션은 아래에 나타낸다:
Figure pct00011
Figure pct00012
다당의 비-환원 단부의 말단 당 잔기는 N-아세틸글루코사민 또는 글루쿠론산 (글루쿠론산은 상기에 도시된다) 중 어느 하나일 수 있다. 전형적으로 두 가지 당 잔기의 혼합물은, 만약 등몰량의 UDP-GlcNAc 및 UDP-GlcUA가 중합화 반응에 사용된다면 비-환원 단부에서 예상될 것이다.
5'- 글리실시알산 시티딘 모노포스페이트 ( GSC ):
본 발명에 사용된 GSC 출발 물질은 화학적으로 합성되거나 (Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000, 1467-1482) 또는 WO07056191에 기술된 것과 같이 화학효소적 경로에 의해 얻어질 수 있다. GSC 구조는 아래에 나타낸다:
Figure pct00013
실시예 9 - 38.8k-HEP-[N]- FVIIa L288F T293K의 제조
단계 1: [(4- 메르캅토부타노일 )글리실]시알산 시티딘 모노포스페이트 ( GSC -CH)의 합성
Figure pct00014
글리실 시알산 시티딘 모노포스페이트 (200 mg; 0.318 mmol)를 물 (2 ml)에 녹이고, 티오부티로락톤 (325 mg; 3.18 mmol)을 첨가하였다. 2 상 용액을 21시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 물 (10 ml)로 희석하고 역상 HPLC 칼럼 (C18, 50 mm x 200 mm)에 적용하였다. 칼럼을 물 (A), 아세토니트릴 (B) 및 250 mM 암모늄 수소 카보네이트 (C)의 구배 시스템으로 50 ml/분의 유속으로 다음과 같이 용출하였다: 0분 (A: 90%, B: 0%, C:10%); 12분 (A: 90%, B: 0%, C:10%); 48분 (A: 70%, B: 20%, C:10%). 분획들 (20 ml 크기)을 수집하고 LC-MS에 의해 분석하였다. 순수한 분획을 모으고, 나트륨 형태의 Dowex 50W x 2 (100 - 200 메시) 수지의 짧은 패드를 통해 서서히 통과시킨 후에 건식 분말로 동결건조시켰다. 그런 다음 냉동 건조된 분말의 표제 물질의 함량을 260 nm에서의 흡광도 및 참조 물질로서 글리실 시알산 시티딘 모노포스페이트를 사용하여 HPLC에 의해 측정하였다. HPLC 분석을 위해, Waters X-Bridge 페닐 칼럼 (5 ㎛ 4.6mm x 250mm) 및 물 아세토니트릴 시스템 (0.1% 인산을 함유하고 있는 0 내지 85% 아세토니트릴로부터의 선형 구배로 30분 동안)을 사용하였다. 수율: 61.6 mg (26 %). LCMS: 732.18 (MH+); 427.14 (MH+-CMP). 화합물은 -80℃에서 보관했을 때 연장된 기간 동안 (>12 개월) 안정하였다.
단계 2: 석신이미드 연쇄를 가지는 38.8 kDa HEP- GSC 시약의 합성
Figure pct00015
HEP-GSC 시약을 단계 1로부터의 GSC-SH ([(4-메르캅토부타노일)글리실]시알산 시티딘 모노포스페이트)를 HEP-말레이미드와 1:1 몰비로 다음과 같이 커플링시킴으로서 제조하였다: 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0 (50 ㎕)에 녹인 GSC-SH (0.68 mg)를 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0 (1,35 ml)에 녹인 35 mg의 38.8k-HEP-말레이미드에 첨가하였다. 투명한 용액을 2시간 동안 25℃에서 방치하였다. 미반은 GSC-SH를 컷-오프가 10 kD인 슬라이드-A-Lyzer 카세트 (Thermo Scientific)를 사용하여 투석에 의해 제거하였다. 투석 완충액은 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0이었다. 반응 혼합물을 2.5시간 동안 2회 투석하였다. 회수한 물질을 그 자체로서 아래의 단계 4에서 사용하였고, GSC-SH와 HEP-말레이미드 사이에 정량 반응이 있을 것으로 추정한다. 이 과정에 의해 만들어진 HEP-GSC 시약은 석신이미드 연쇄를 통해 시알산 시티딘 모노포스페이트에 부착된 HEP 중합체를 함유할 것이다.
단계 3: FVIIa L288F T293K의 시알릴기 제거반응
FVIIa L288F T293K (30 mg)를 10 mM His, 100 mM NaCl, 60 mM CaCl2, 10 mM PABA pH 5.9 (10 ml)중의 시알리다제 (AUS , 100 ul, 20 U)에 첨가하고 1시간 동안 실온에 방치하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0 (30 ml)으로 희석하고, 얼음에서 냉각하였다. 거기에 수산화나트륨을 첨가함으로써 pH를 중성으로 유지하면서 250 mM EDTA 용액 (2.6 ml)을 소량씩 첨가하였다. 그런 다음 EDTA 처리된 샘플을 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0으로 평형화한 2x5 ml HiTrap Q FF 이온-교환 칼럼 (Amersham Biosciences, GE Healthcare)에 적용하였다. 미결합 단백질을 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0 (4 CV)과, 이어서 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0 (8 CV)으로 용출한 후, 아시알로 FVIIa L288F T293K를 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 (20 CV)으로 용출하였다. 아시알로 FVIIa L288F T293K를 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0에서 분리하였다. 역상 HPLC를 사용한 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 환원 후에 FVIIa 표준에 대한 FVIIa L288F T293K 경쇄 함량을 정량함으로써 수율 (19.15 mg)을 측정하였다.
단계 4: 석신이미드 연쇄를 사용한 38.8 kDa HEP-[N]- FVIIa L288F T293K의 합성
50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM PABA, pH 7.0 (18.0 ml) 중의 아시알로 FVIIa L288F T293K (19.2 mg)에 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 (2.3 ml) 중의 38.8kDa-HEP-GSC (단계 2로부터의 35 mg), 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 50% 글리세롤, pH 7,0 (7.2 ml) 중의 래트 ST3GalIII 효소 (5 mg; 1.1 유닛/mg)를 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 밤새 32℃에서 느린 회전 하에 인큐베이션하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 Gla-도메인 특이적 항체로 변형된 FVIIa 특이적 친화성 칼럼 (CV = 24 ml)에 적용하고, 처음에 2 칼럼 부피의 완충액 A (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) 및 나중에 2 칼럼 부피의 완충액 B (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.4)로 단계 용출하였다. 그 방법은 본질적으로 Thim, L et al. Biochemistry (1988) 27, 7785-779에 의해 기술된 원리를 따른다. 접히지 않은 Gla-도메인을 가진 생성물을 수집하고 직접 2x5 ml HiTrap Q FF 이온-교환 칼럼 (Amersham Biosciences, GE Healthcare)에 적용하였다. 칼럼을 10 mM His, 100 mM NaCl, 0.01 % Tween80, pH 7.5 (3 칼럼 부피), 및 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 7.5 (3.5 칼럼 부피)로 세척하였다. 그런 다음 pH를 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 6.0 (3 칼럼 부피)으로 6.0으로 낮춘 후, HEP일레이트화된 물질을 5 칼럼 부피의, 60% 완충액 A (10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 6.0) 및 40% 완충액 B (10 mM His, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 6.0)로 구성된 완충액 혼합물로 용출하였다. 회수한 아시알로 FVIIa L288F T293K (미변형)를 재순환시켰다, 즉 단계 4에서 기술된 것과 같은 HEP일레이트화를 한 번 더 시행하고 직전에 기술한 것과 같은 방식으로 정제하였다. 2회의 헤필화 작동으로부터 조합한 분획을 모으고 한외여과 (Millipore Amicon Ultra, cut off 10kD)에 의해 농축하였다 .
단계 5: 모노 당포합된 헤파로산 38.8k-HEP-[N]- FVIIa L288F T293K의 캡핑
38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K의 시알릴화되지 않은 N-글리칸을 ST3GalIII 효소 및 CMP-NAN을 사용하여 다음과 같이 최종적으로 캡핑하였다 (즉 시알릴화하였다): 38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K (5.85 mg)를 ST3GalIII (0.18 mg/ml); CMP-NAN (4.98 mM)과 함께 8.4 ml의 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01% Tween80, pH 6.0에서 1시간 동안 32℃에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 그 반응 혼합물을 Gla-도메인 특이적 항체로 변형된 FVIIa 특이적 친화성 칼럼에 적용하였고 처음에 2 칼럼 부피의 완충액 A (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) 및, 그런 다음 2 칼럼 부피의 완충액 B (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.4)로 단계 용출하였다. 38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K를 함유하는 모아진 분획을 조합하고 컷-오프가 10 kD인 슬라이드-A-Lyzer 카세트 (Thermo Scientific)를 사용하여 투석하였다. 투석 완충액은 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 6.0이었다. 단백질 농도를 TCEP 환원 후에 경쇄 HPLC 분석에 의해 측정하였다. 38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K의 전체 수율은 2.46 mg (13%)이었다.
실시예 10 - 41.5 kDa -HEP-[N]- FVIIa L288F T293K K337A의 제조
단계 1: 4 - 메틸벤조일 연쇄를 사용한 41.5 kDa HEP- GSC 시약의 합성
Figure pct00016
5.0 ml 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2 완충액, pH 7.0 중의 글리실 시알산 시티딘 모노포스페이트 (GSC) (20 mg; 32 μmol)를 41.5 kDa HEP-벤즈알데하이드 (99.7 mg; 2.5 μmol)에 첨가하였다. 그 혼합물을 모든 HEP-벤즈알데하이드가 녹을 때까지 부드럽게 회전하였다. 그 후로 2시간 동안 MilliQ 물 중의 1M 용액의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 일부씩 (5x50 μl) 첨가하여 최종 농도가 48 mM이 되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 놓아두었다. 그런 다음 과잉 GSC를 다음과 같이 투석에 의해 제거하였다: 총 반응 부피 (5250 μl)를 투석 카세트 (컷-오프가 10 kD이고 용량이 3 내지 12 ml인 슬라이드-A-Lyzer 투석 카세트, Thermo Scientific Prod No. 66810)에 옮겼다. 용액을 2시간 동안 2000 ml의 25 mM Hepes 완충액 (pH 7.2)에 대해 투석하고 한 번 더 17시간 동안 2000 ml의 25 mM Hepes 완충액 (pH 7.2)에 대해 투석하였다. 내부 챔버로부터 과잉 GSC의 완전한 제거를 Waters X-Bridge 페닐 칼럼 (4.6mm x 250mm, 5 ㎛) 및 물 아세토니트릴 시스템 (0.1% 인산을 함유하고 있는 0 내지 85% 아세토니트릴의 선형 구배로 30분에 걸침) 상에서의 HPLC에 의해 참조로서 GSC를 사용하여 확인하였다. 내부 챔버 물질을 수집하고 냉동 건조시켜서 41.5 kDa의 HEP-GSC를 백색 분말로서 얻었다. HEP-GSC 시약을 NMR에 의해 및 SEC 크로마토그래피 상에서 분석하였다. 이 과정에 의해 만들어진 P-GSC 시약은 4-메틸벤조일 연쇄를 통해 시알산 시티딘 모노포스페이트에 부착된 HEP 중합체를 함유한다.
단계 2: FVIIa L288F T293K K337A의 시알릴기 제거반응
21 ml의 10 mM His, 100 mM NaCl, 60 mM CaCl2, 10 mM PABA, pH 6.7 완충액 중의 FVIIa L288F T293K K337A (43.5 mg)의 용액에 시알리다제 (Arthrobacter ureafaciens, 9 유닛/ml)를 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 얼음에서 냉각시키고 14 ml의 10 mM His, 100 mM NaCl pH 7.7을 첨가하였다. 그런 다음 중성 pH를 유지하면서 50 ml의 100 mM EDTA 용액을 첨가하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 50 ml의 MilliQ 물로 희석하고, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.0으로 평형화한 4x5ml 상호연결된 HiTrap Q FF 이온-교환 칼럼 (Amersham Biosciences, GE Healthcare)에 적용하였다. 시알리다제를 포함하고 있는 미결합 단백질을 5 CV의 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0으로 용출하였다. 시알릴기 제거된 단백질을 12 CV의 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 30 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질을 함유하고 있는 분획들을 조합하고 최종 농도가 10 mM이 되도록 0.5 M PABA를 첨가하였다. 단백질 수율을, 상기에서 기술한 것과 같이 역상 HPLC를 사용한 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 환원 후에 FVIIa 표준에 대한 FVIIa L288F T293K K337A 경쇄를 정량함으로써 측정하였다. 32.5 mg의 아시알로 FVIIa L288F T293K K337A (2.83 mg/ml)를 이 방법으로 11.5 ml of 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 30 mM CaCl2, 10 mM PABA, pH 7.0에서 분리하였다.
5.75 ml의 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 30 mM CaCl2, 10 mM PABA, pH 7.0 중의 아시알로 FVIIa L288F T293K K337A (16.3 mg)에 41.5 kDa HEP-GSC (3 당량, 41.5 mg) 및 4.2 ml의 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 50 % 글리세롤, pH 7.0 중의 래트 ST3GalIII 효소 (2.93 mg; 1.1 유닛/mg)를 첨가하였다. 그런 다음 PABA 농도를 0.5 M 수성 PABA 용액으로 10 mM로 조정하였고, pH를 1N NaOH를 사용하여 6.7로 조정하였다. 반응 혼합물을 32℃에서 느린 교반 하에 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 (356 μl) 중의 157 mM CMP-NAN 용액을 첨가하고, 그 반응을 32℃에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. HPLC 분석은 미반응된 FVIIa L288F T293K K337A (68%), 단일 HEP일화된 FVIIa (25%) 및 다양한 폴리HEP일화된 형태 (7%)를 함유하고 있는 생성물 분포를 보였다.
그런 다음 전체 반응 혼합물을 Gla-도메인 특이적 항체로 변형된 FVIIa 특이적 친화성 카럼 (CV = 24 ml)에 적용하고 먼저 2 칼럼 부피의 완충액 A (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4)로, 그런 다음 2 칼럼 부피의 완충액 B (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.4)로 단계 용출하였다. 방법은 본질적으로 Thim, L et al. Biochemistry (1988) 27, 7785-779에 기술된 원리를 따른다.
접히지 않은 Gla-도메인을 포함한 생성물을 수집하고 직접 10 mM His, 100 mM NaCl, pH 6.0을 함유하고 있는 완충액으로 평형화한 3x5ml 상호연결된 HiTrap Q FF 이온-교환 칼럼 (Amersham Biosciences, GE Healthcare)에 직접 적용하였다. 칼럼을 4 칼럼 부피의 10 mM His, 100 mM NaCl, pH 6.0으로 세척하였다. 미변형 FVIIa L288F T293K K337A를 12 CV의 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0 (용출 완충액 A)으로 용출하였다. 그런 다음 41.5 kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A를 15 CV의 10 mM His, 325 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0으로 용출하였다. 순수한 분획을 조합하고, 단백질 농도를 앞서 기술한 HPLC 정량 방법에 의해 측정하였다. 3.42 mg (21%)의 순수한 41.5 kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A를 분리하였다. 41.5 kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A를 함유하고 있는 조합한 분획을 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0에 대하여 컷-오프가 10 kD인 슬라이드-A-Lyzer 카세트 (Thermo Scientific)를 사용하여 최종적으로 투석하였고, 투석 완충액을 첨가함으로써 농도를 (0.40 mg/ml)로 조정하였다.
실시예 11 - 41.5 kDa HEP-[N]- FVIIa W201 T293K의 제조
이 물질을 본질적으로 실시예 10에서 기술한 것과 같이 제조하였다. FVIIa W201R T293K (40 mg)를 먼저 시알릴기를 제거하고 아시알로 FVIIa W201R T293K (27.2 mg)를 Gla-특이적 이온-교환 방법에 의해 분리하였다. 그런 다음 시알릴기 제거된 유사체를 41.5 kDa의 HEP-GSC (실시예 10에서 기술된 것과 같이 생성됨) 및 ST3GalIII과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 포합 생성물을 이온-교환 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 최종 완충액 교환으로 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0 중의 2.9 mg (7.5%)의 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa W201 T293K를 얻었다.
실시예 12 - 41.5 kDa HEP-[N]- FVIIa L288Y T293K의 제조
이 물질을 본질적으로 실시예 10에서 기술한 것과 같이 제조하였다. FVIIa L288Y T293K (19.9 mg)를 먼저 시알릴기를 제거하고 아시알로 FVIIa L288Y T293K (16.9 mg)를 Gla-특이적 이온-교환 방법에 의해 분리하였다. 그런 다음 시알릴기 제거된 유사체를 41.5 kDa의 HEP-GSC (실시예 10에서 기술된 것과 같이 생성됨) 및 ST3GalIII과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 포합 생성물을 이온-교환 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 최종 완충액 교환으로 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0 중의 1.95 mg (11.5%)의 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293K를 얻었다.
실시예 13 - 41.5 kDa HEP-[N]- FVIIa L288Y T293R의 제조
이 물질을 본질적으로 실시예 10에서 기술한 것과 같이 제조하였다. 아시알로 FVIIa L288Y T293R (30 mg)을 시알릴기를 제거한 후에 41.5 kDa의 HEP-GSC (실시예 10에서 기술된 것과 같이 생성됨) 및 ST3GalIII과 반응시켰다. 그런 다음 포합 생성물을 이온-교환 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 최종 완충액 교환으로 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0 중의 1.95 mg (11.5%)의 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293R을 얻었다.
실시예 14 - 41.5 kDa HEP-[N]- FVIIa T293K K337A의 제조
이 물질을 본질적으로 실시예 10에서 기술한 것과 같이 제조하였다. 아시알로 FVIIa L288Y T293R (8 mg)을 시알릴기를 제거한 후에 41.5 kDa의 HEP-GSC (실시예 10에서 기술된 것과 같이 생성됨) 및 ST3GalIII과 반응시켰다. 그런 다음 포합 생성물을 이온-교환 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 최종 완충액 교환으로 10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0 중의 1.72 mg (15%)의 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa T293K K337A를 얻었다.
실시예 15 - 변형된 조합 FVIIa 변이체의 기능적 특성들
실시예 9 내지 14에서 기술된 것과 같이 PEG 또는 헤파로산 (HEP) 중 어느 하나에 당포합된 FVIIa 조합 변이체를 실시예 5에 기술된 것과 같은 단백질 가수분해 활성 및 항트롬빈 반응성에 대해 특성화하였다. 그 결과를 표 7에 요약한다. 이들 데이터는 PEG 또는 HEP를 사용한 경우에, FVIIa의 화학적 변형은 FVIIa 변이체 단백질 가수분해 활성을 감소시키지만, 일부 변이체에 대해서는 야생형 FVIIa 단백질 가수분해 활성보다 높은 활성을 유지하는 것을 허용하며 추가로 항트롬빈 저항을 유지하는 것도 허용한다.
변형된 FVIIa 변이체의 기능적 특성들. 결과는 야생형 FVIIa의 퍼센트 (%)로 나타낸다.
IUPAC 명칭 단백질 가수 분해 활성 + PS:PC (% WT) 단백질 가수 분해 활성 + sTF + PS:PC (% WT) ATIII 억제 + LMWH
( % WT) 		ATIII 억제 + sTF
( % WT)
40k-PEG-[N]-FVIIa W201R T293Y 266.9 88.8 5.9 1.9
40k-HEP-[N]-FVIIa W201R T293K 155.3 236.7 0.2 1.2
40k-HEP-[N]-FVIIa L288Y T293R 407 200.3 5.2 4.4
40k-HEP-[N]-FVIIa L288Y T293K 264.9 147.4 3.7 2.9
40k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A 555.5 115
40K-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K 279.3 116.4 4.4 3.6
실시예 16 - 혈우병 A형-유사 전혈 혈전탄성묘사도의 평가
혈전탄성묘사도 (TEG) 분석을 FVIIa에의 비교에 의하여 혈우병 A형-유사 전혈에서 FVIIa 변이체의 활성을 평가하기 위해 선택하였다. TEG 분석은 전체 응고 과정의 프로필 - 개시, 진전 및 최종 응고 강도 측정을 제공한다. 흐르는 혈액 및 맥관구조에서 전단력의 가능한 영향과 별도로, TEG 분석은 응고하는 전혈의 점탄성 특성을 측정하는 방법으로서 응고의 생체 내 조건을 모방한다 (Viuff, E. et al, Thrombosis Research, (2010), Vol. 126, pages 144-149). 각 TEG 분석을 카올린 및 TEG 변수를 사용하여 개시하였고, 응고 시간 (R) 및 최대 혈전 생성 속도 (MTG)를 기록하고, 표 8에 보고하였다. 응고 시간 (R)은 응혈이 형성될 때까지 (2 mm 크기) 샘플 컵에 혈액을 놓으면서부터의 잠복 시간을 나타내는 반면; 최대 혈전 생성 (MTG)은 응혈 형성 속도를 나타낸다. 초로 나타내는 응고 시간 (R)은 표준 TEG 소프트웨어를 사용하여 측정되는 한편, MTG는 100배 곱한 (100 x mm/초) TEG 트랙의 첫 번째 유도체로서 계산한다.
혈액 샘플을 덴마크 국립단의 자발적 헌혈자 구성원이고 혈액 기중의 기준을 충족한 건강한 정상인 공여자로부터 얻었다. 혈액을 3.2% 시트레이트 진공 채혈기 (Vacuette ref. 455322, Greiner bio-one, Lot A020601 2007-02)로 샘플링하고 60분 이내에 분석하였다. 혈우병 A형-유사 혈액을 정상인 전혈로부터, 항-인간 FVIII (양 항-인간 FVIII, Lot AA11-01, Haematologic Technologies, VT, USA) 항체를 10 베데스다 유닛 (BU)/ml의 최종 농도 (최종 0.1 mg/ml)로 첨가하고 2 rpm/분에서 30분 동안 실온에서 부드럽게 회전시킴으로써 제조하였다. FVIIa L288Y T293K를 0.069, 0.69, 6.9, 17.3 nM으로 시험하고, FVIIa W201R T293K를 0.076, 0.76, 7.6, 19.1 nM로 시험한 것 외에 시험 화합물을 0.1, 1, 10 및 25 nM 최종 농도로 첨가하였다.
카올린-유도된 TEG로부터의 데이터는 모든 화합물이 혈우병 A형-유사 혈액에서 용량-의존적으로 응고 시간 (R-시간)을 감소시켰고 최대 혈전 생성 (MTG)을 증가시키는 것을 보였다 (표 8). 모든 40k-HEP-[N]-FVIIa-변이체는 가장 높은 시험 농도에서 평가할 때 FVIIa에 비교하여 더 짧거나 유사한 응고 시간을 나타냈다. 또한 변이체의 최대 혈전 생성은 FVIIa에 비하여 유사하거나 증가되었다. 더욱이, 데이터는 FVIIa 변이체의 40k-HEP일화가 그것들의 해당하는 FVIIa 변이체 (40k-HEP일화가 없음)와 비교할 때 40k-HEP일화된 화합물의 활성을 감소시켰음을 나타냈다.
표 8은 혈우병 A형-유사 전혈에서 카올린-유도된 TEG의 시험 화합물의 R-시간 (응고 시간) 및 MTG (최대 혈전 생성)을 나타낸다. 시험 화합물의 가장 높은 농도는 25nM였고 그 외에 시험한 FVIIa L288Y T293K의 농도는 17.3 nM였으며 시험한 FVIIa W201R T293K의 농도는 19.1 nM이었다. FVIIa, 40k-PEG-[N]-FVIIa 및 40k-HEP-[N]-FVIIa를 4인의 개인 공여자 (n=4)에게서 시험한 반면, 나머지 화합물은 2인의 개인 공여자 (n=2)에게서 시험하였다. []로 나타낸 데이터는 4인의 개인 공여자로부터의 변수에 대한 범위를 나타낸다.
혈우병 A형-유사 전혈의 선택된 FVIIa 변이체에 대한 혈전탄성묘사도 변수들
시험 화합물
(가장 높은 농도에서)		 R-시간
평균 (초)		 MTG
(x 100 mm/초)
FVIIa 526
[480;580]		 21.6
[19.4;26.1]
40k-PEG-[N]-FVIIa 753
[680;835]		 17.9
[16.1;19.9]
40k-HEP-[N]-FVIIa 668
[580;835]		 19.0
[15.8; 22.4]
FVIIa L288Y T293K 345
[320;370]		 24.5
[24.1;24.8]
40k-HEP-[N]-FVIIa L288Y T293K 485
[465;505]		 21.5
[20.3;22.7]
FVIIa L288Y T293R 313
[305;320]		 25.5
[24.3;26.8]
40k-HEP-[N]-FVIIa L288Y T293R 398
[370;425]		 23.4
[23.1;23.7]
FVIIa L288F T293K 400
[375;425]		 25.9
[23.3;28.5]
40k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K 498
[425;570]		 21.6
[19.0;24.1]
FVIIa L288F T293K K337A 280
[255;305]		 27.2
[26.9;27.6]
40k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A 348
[335;360]		 25.7
[23.4;28.0]
FVIIa W201R T293K 390
[335;445]		 25.2
[22.4;28.1]
40k-HEP-[N]-FVIIa W201R T293K 345
[295;395]		 25.7
[23.7;27;7]
FVIIa T293K K337A 355
[350-360]		 25.5
[24.3;26.6]
40k-HEP-[N]-FVIIa T293K K337A 423
[420;425]		 22.2
[21.7;22.8]
실시예 17 - 래트에서 PK의 평가
PEG 또는 헤파로산 (HEP) 중 어느 하나로 당포합되거나 미변형된 형태의 확인된 FVIIa 변이체의 약물동역학적 분석을, FVIIa의 생체 내 생존에 대한 그것들의 영향을 평가하기 위해 래트에서 수행하였다. 스프라그 도울리 래트 (그룹당 3마리)에 정맥 내로 투여하였다. StabyliteTM (TriniLize Stabylite Tubes; Tcoag Ireland Ltd, Ireland) 안정화된 혈장 샘플을 적절한 시점에서 전체 프로필로서 수집하고, 추가의 분석을 할 때까지 냉동시켰다. 혈장 샘플을 응고 활성 (실시예 7에서 기술됨)에 대해 분석하고 ELISA에 의해 FVIIa-항트롬빈 복합체를 정량하였다. 약물동역학적 분석을 Phoenix WinNonlin 6.0 (Pharsight Corporation)을 사용하여 비-구획 방법에 의해 수행하였다. 다음의 변수들을 산정하였다: 응고 활성에 대한 FVIIa-항트롬빈 복합체의 Cmax (최대 농도), T1/2 (기능성 말단 반감기) 및 MRT (기능성 평균 거주 시간).
간단히 설명하면, FVIIa-항트롬빈 복합체를 효소 면역분석 (EIA)에 의해 측정하였다. EGF-도메인의 N-말단에 결합하고 항트롬빈 결합을 차단하지 못하는 단클론성 항-FVIIa 항체를 복합체 (Dako Denmark A/S, Glostrup; 제품 코드 O9572)의 포획에 사용한다. 다중클론성 항-인간 AT 항체 퍼옥시다제 포합체를 검출에 사용하였다 (Siemens Healthcare Diagnostics ApS, Ballerup / Denmark; product code OWMG15). 인간 야생형 또는 변이체 FVIIa 및 혈장-유도된 인간 항트롬빈의 사전형성된 정제 복합체를 EIA 보정 곡선을 제작하기 위한 표준으로서 사용하였다. 혈장 샘플을 희석하고 분석한 후 이중 측정의 평균 농도를 계산하였다. EIA의 내부 분석 정확도는 1 내지 8% 사이였다.
약물동역학적으로 산정된 변수들을 표 9에 열거한다. 야생형 FVIIa에 비교하여, 시험된 변이체들은 혈장 수준이 검출 수준에 도달하면서 FVIIa-항트롬빈 복합체 (래트 AT 복합체)의 감소된 축적을 나타냈다. 나아가, 40k-PEG-[N]-FVIIa (래트에서 7.4시간)에 비교하여 40k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K의 유의미하게 연장된 기능성 반감기 (래트에서 18.4시간)가 관찰되었다.
결론적으로, 위치 293에서 Lys의 존재는 래트에서 T1/2를 증가시키고 FVIIa-항트롬빈 복합체 형성을 감소시킨다. 나아가, 당포합된 헤파로산의 도입은 래트에서 T1/2를 실질적으로 개선한다.
래트에서 선택된 FVIIa 변이체에 대한 약물동역학적으로 산정된 변수들
FVIIa 변이체 래트에서의 T 1/2 (시간) 래트에서의 MRT (시간) Rat AT 복합체
Cmax /용량 (kg/l)
FVIIa 0.8±0.01 1.1±0.03 0.6±0.08
40k-PEG-[N]-FVIIa 7.4±0.20 8.3±0.30 0.7±0.05
40k-HEP-[N]-FVIIa L288Y T293K 15.9±0.5 20.6±1.0 0.04±0.004
40k-HEP-[N]-FVIIa L288Y T293R 11.5±0.5 13.9±0.6 0.05±0.004
FVIIa L288F T293K 1.2±0.02 1.6±0.30 0.07±0.01
40k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K 18.4±3.4 20.5±.6 0.04±0.000
40k-HEP-[N]-FVIIa W201R T293K 21.1±0.5 24.8±0.8 측정되지 않음
40k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A 11.0±1.6 11.5±0.8 0.14±0.01
40k-HEP-[N]-FVIIa T293K K337A 12.4±0.1 15.4±0.3 0.05±0.004
T 1/2 : IV 투여 후 활성 분자의 말단 반감기
MRT: IV 투여 후 활성 분자의 평균 거주 시간
AT 복합체 Cmax /용량: 용량으로 나눈 화합물-항트롬빈 복합체의 최대 측정 수준.
실시예 18 - 활성 부위 안정화를 통한 FVIIa L288Y T293K의 액체 제형
용액 중의 FVIIa의 안정성은 자가 단백질분해, 산화, 탈아미드화, 이성질체와 등의 결과로서 발생하는 폴리펩티드 사슬에 대한 많은 변형에 의해 제한된다. 이전 연구들은 자가 단백질분해 공격에 취약한 중쇄 상의 3 부위를 확인하였다: 그것들은 Arg290-Gly291, Arg315-Lys316 및 Lys316-Val317이다 (Nicolaisen et al., FEBS, 1993, 317:245-249). 칼슘-없는 조건은 추가로 γ-카르복시글루탐산 (Gla) 도메인을 포함하는 경쇄의 처음 38 잔기의 단백질 가수분해적 방출을 촉진한다.
본원에서 발명자들은 비-공유적 상호작용을 통해 FVIIa의 활성 부위를 안정화시키고, 액체 제형 중의 중쇄의 자가 단백질분해를 방지하기 위해 작은 분자 PCI-27483-S (2-{2-[5-(6-카바미미도일-1H-벤조이미다졸-2-일)-6,2'-다이하이드록시-5'-설파모일-비페닐-3-일]-아세틸아미노}-석신산)을 사용하였다 (PCI-27483-S에 대한 추가의 상세한 설명에 대해서는 WO2014/057069 참조).
중쇄 절단의 정량을 역상 HPLC (RP-HPLC)를 사용한 환원된 FVIIa L288Y T293K의 분석에 의해 평가하였다. 분석 용액을 127mM 다이티오트레이톨 (DTT) 및 3M 구아니디늄 염산염으로 환원하고, 그것을 60℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 1 μL의 농축된 아세트산 (원래의 분석 용액 50 μL당)을 첨가하고, 25℃로 냉각하였다. 그런 다음 25 ㎍의 환원된 FVIIa L288Y T293K를 40℃에서 온도 평형화하여 놓은 ACE 3 μM C4 칼럼 (300Å, 4.6x100mm; Advanced Chromatography Technologies LTD, Scotland)에 주입하였다. 단백질 단편을 물 중의 0.05% 트라이플루오로아세트산 (TFA)로 구성되는 이동상 A를 가지고 80% 아세토니트릴 중의 0.045% TFA로 구성되는 이동상 B의 35 내지 80%로 진행되는 선형 구배로 분리하였다. 구배 시간은 30분이었고 유속은 0.7 mL/분이었으며, 피크 용출은 215 nm에서의 흡광도로 검출하였다.
FVIIa L288Y T293K의 제형을 1.47 mg/mL CaCl2, 7.5 mg/mL NaCl, 1.55 mg/mL L-히스티딘, 1.32 mg/mL 글리실글리신, 0.5 mg/mL L-메티오닌, 0.07 mg/mL 폴리소르베이트 80, 0.021 mg/ml PCI-27483-S, 1 mg/ml의 단백질 농도 (즉 1:1.75의 단백질 억제제 몰 비율) 및 6.8의 최종 pH로 만들었다. 용액을 1개월 동안 30에서 조용하고 빛으로부터 멀리 떨어져 있는 조건 하에서 인큐베이션하였다. 표 10에서 알 수 있는 것과 같이 PCI-27483-S의 존재는 완전에 가까운 FVIIa L288Y T293K의 중쇄 절단의 억제를 유발한 반면; PCI-27483-S를 첨가하지 않은 것은 위치 315-316 및 290-291에서의 절단의 현저한 증가를 유발하였다.
PSI-27483-S 억제제가 있을 때와 없을 때의 28일간의 인큐베이션시 RP-HPLC 크로마토그램에서 측정되는 바 2개의 상이한 절단 부위에 해당하는 중쇄 단편들의 0일에 대한 피크 면적의 백분율 증가.
절단 부위 PCI-27483-S 포함 PCI-27483-S 없음
315-316 20 % 287 %
290-291 17 % 675 %
실시예 19 - 면역원성 위험의 가상적 (in silico ) 평가
가상적 연구는 FVIIa 유사체를 생성하기 위한 단백질 엔지니어링으로부터 유발되는 신규한 펩티드 서열이 인간에서 HLA-II로서도 알려져 있는 주요 조직적합성 복합체 부류 II (MHC-II)에 결합할 수 있는 펩티드 서열을 초래할 수 있는지를 조사하였다. 그런 결합은 T-세포 에피토프의 존재에 대한 전제조건이다. 이 연구에 사용한 펩티드/HLA-II 결합 예측 소프트웨어는 2개의 알고리즘, 즉 HLA-DR 예측을 수행하는 NetMHCIIpan 2.1 (Nielsen et al. 2010)과 HLA-DP/DQ 예측을 수행하는 NetMHCII 2.2 (Nielsen et al. 2009)를 기초로 하였다.
가능한 면역원성 위험과 관련하여 상이한 FVIIa 유사체들을 비교할 수 있게 하기 위해 면역원성 위험 점수 (IRS)를 계산하였다. 계산을 다음과 같이 수행하였다: FVIIa 야생형을 참조로서 사용하였고 10 이하의 예측된 등급을 가지는 참조 (FVIIa 야생형)에 포함되지 않은 것으로 유일하게 예측된 15량체를 분석에 포함시켰다. HLA-II 대립유전자들을 3 부류로 분류하였다: 부류 1 (등급 <=1)은 2의 중량을 가짐. 부류 2 (1>등급<=3)SMS 0.5의 중량을 가짐. 부류 3 (3>등급<=10)은 0.2의 중량을 가짐. 부류의 중량 (2. 0.5 또는 0.2)을 대립유전자 빈도로 곱하여 (각 집단에 대해) IRS를 구하였다. IRS의 합을 각 집단 및 각 HLA-II (DRB1, DP 및 DQ)에 대해 계산하였다.
단일 및 조합 변이체를 선택하기 위한 계산된 위험 점수를 표 11에 제시한다. 특히 선호할만한 조합은 L288F/T293K, L288F/T293K/K337A, L288Y/T293K 및 L288Y/T293K/K337A를 포함하고, 그것들은 항트롬빈에 의한 억제에 대해 감소된 민감성뿐 아니라 높은 단백질 가수분해 활성을 동시에 나타낸다.
단일 및 조합 FVIIa 변이체를 선택하기 위한 계산된 위험 점수
FVIIa 변이체 위험 점수
FVIIa L288F T293K 0.10
FVIIa L288F T293K K337A 0.10
FVIIa L288F T293K L305I 0.40
FVIIa L288F T293K L305V 0.35
FVIIa L288F T293R 0.12
FVIIa L288F T293R K337A 0.12
FVIIa L288F T293R L305I 0.42
FVIIa L288F T293R L305V 0.37
FVIIa L288F T293Y 0.32
FVIIa L288F T293Y K337A 0.32
FVIIa L288N T293K 0.06
FVIIa L288N T293R 0.08
FVIIa L288N T293Y 0.26
FVIIa L288Y T293K 0.06
FVIIa L288Y T293K K337A 0.06
FVIIa L288Y T293R 0.09
FVIIa L288Y T293R K337A 0.09
FVIIa L305V T293K 0.28
FVIIa L305V T293Y 0.49
FVIIa T293K K337A 0.02
FVIIa T293K L305I 0.32
FVIIa T293K L305V K337A 0.28
FVIIa T293R K337A 0.06
FVIIa T293R L305I 0.36
FVIIa T293R L305V 0.32
FVIIa T293R L305V K337A 0.32
FVIIa T293Y K337A 0.23
FVIIa T293Y L305V K337A 0.49
FVIIa W201K T293K 0.19
FVIIa W201K T293R 0.23
FVIIa W201K T293Y 0.39
FVIIa W201M T293K 1.03
FVIIa W201M T293R 1.06
FVIIa W201M T293Y 1.23
FVIIa W201R L288F T293K 0.32
FVIIa W201R L288F T293R 0.34
FVIIa W201R T293K 0.25
FVIIa W201R T293K L305I 0.55
FVIIa W201R T293R 0.29
FVIIa W201R T293R L305I 0.58
FVIIa W201R T293Y 0.45
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Coagulation Factor VII Polypeptide <130> 8719WO01 <140> 13188715.0 <141> 2013-10-15 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Human <400> 1 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> Human <400> 2 Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn 20 25 30 Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn 35 40 45 Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His 50 55 60 Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu 85 90 95 His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro 100 105 110 Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu 115 120 125 Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu 130 135 140 Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln 145 150 155 160 Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe 165 170 175 Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser 180 185 190 Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly 195 200 205 Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg 225 230 235 240 Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 245 250 <210> 3 <211> 254 <212> PRT <213> Chimpanzee <400> 3 Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn 20 25 30 Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn 35 40 45 Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His 50 55 60 Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Ile Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu 85 90 95 His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro 100 105 110 Glu Arg Ala Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu 115 120 125 Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu 130 135 140 Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln 145 150 155 160 Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe 165 170 175 Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser 180 185 190 Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly 195 200 205 Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Ser Val Gly His Phe Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg 225 230 235 240 Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 245 250 <210> 4 <211> 254 <212> PRT <213> Dog <400> 4 Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Val Lys Val Asp Gly Lys Leu Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asp 20 25 30 Ala Ala Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Glu Arg Ile Lys Asn 35 40 45 Trp Lys Asn Leu Thr Val Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Asp 50 55 60 Asp Gly Asp Glu Gln Glu Arg His Val Ala Arg Val Ile Val Pro Asp 65 70 75 80 Lys Tyr Ile Pro Leu Lys Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu His Leu 85 90 95 Arg Thr Pro Val Ala Tyr Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro 100 105 110 Glu Lys Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Ile Arg Phe Ser Ala 115 120 125 Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu Asp Arg Gly Ala Lys Ala Arg Val 130 135 140 Leu Met Ala Ile Gln Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Glu 145 150 155 160 Gln Ala Arg Arg Arg Pro Gly Ser Pro Ser Ile Thr Asp Asn Met Phe 165 170 175 Cys Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser 180 185 190 Gly Gly Pro His Ala Thr Lys Phe Gln Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly 195 200 205 Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Glu Gly His Phe Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Arg Gln Leu Met Val 225 230 235 240 Ser Ser His Thr Leu Arg Gly Leu Leu Arg Ala Pro Leu Pro 245 250 <210> 5 <211> 255 <212> PRT <213> Porcine <400> 5 Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Met Leu Lys Leu Lys Gly Ala Leu Leu Cys Gly Gly Thr Leu Leu Asn 20 25 30 Thr Ser Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Arg Ile Arg Ser 35 40 45 Trp Lys Asp Leu Thr Val Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Lys Asp 50 55 60 Glu Gly Asp Glu Gln Glu Arg Pro Val Ala Gln Val Phe Val Pro Asp 65 70 75 80 Lys Tyr Val Pro Gly Lys Thr Asp His Asp Leu Ala Leu Val Arg Leu 85 90 95 Ala Arg Pro Val Ala Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro 100 105 110 Glu Arg Ser Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Ile Arg Phe Ser Ala 115 120 125 Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu Asp Arg Gly Ala Lys Ala Arg Val 130 135 140 Leu Met Ala Ile Gln Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Glu 145 150 155 160 Gln Ala Arg Arg Arg Pro Gly Ser Pro Ser Ile Thr Asp Asn Met Phe 165 170 175 Cys Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser 180 185 190 Gly Gly Pro His Ala Thr Arg Phe Arg Gly Thr Trp Phe Leu Thr Gly 195 200 205 Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Thr Gly Arg Phe Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Arg Val Ser Arg Tyr Thr Ala Trp Leu Leu Gly Leu Met Ser 225 230 235 240 Ala Pro Pro Pro Pro Ser Glu Gly Leu Leu Arg Ala Pro Leu Pro 245 250 255 <210> 6 <211> 255 <212> PRT <213> Bovine <400> 6 Ile Val Gly Gly His Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Met Leu Lys Leu Asn Gly Ala Leu Leu Cys Gly Gly Thr Leu Val Gly 20 25 30 Pro Ala Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Glu Arg Leu Arg Ser 35 40 45 Arg Gly Asn Leu Thr Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Arg Val 50 55 60 Glu Gly Pro Glu Gln Glu Arg Arg Val Ala Gln Ile Ile Val Pro Lys 65 70 75 80 Gln Tyr Val Pro Gly Gln Thr Asp His Asp Val Ala Leu Leu Gln Leu 85 90 95 Ala Gln Pro Val Ala Leu Gly Asp His Val Ala Pro Leu Cys Leu Pro 100 105 110 Asp Pro Asp Phe Ala Asp Gln Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Ala 115 120 125 Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Glu Arg Gly Val Thr Ala Arg Lys 130 135 140 Leu Met Val Val Leu Val Pro Arg Leu Leu Thr Gln Asp Cys Leu Gln 145 150 155 160 Gln Ser Arg Gln Arg Pro Gly Gly Pro Val Val Thr Asp Asn Met Phe 165 170 175 Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser 180 185 190 Gly Gly Pro His Ala Thr Arg Phe Arg Gly Thr Trp Phe Leu Thr Gly 195 200 205 Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Ala Gly His Phe Gly Ile 210 215 220 Tyr Thr Arg Val Ser Arg Tyr Thr Ala Trp Leu Arg Gln Leu Met Gly 225 230 235 240 His Pro Pro Ser Arg Gln Gly Phe Phe Gln Val Pro Leu Leu Pro 245 250 255 <210> 7 <211> 253 <212> PRT <213> Mouse <400> 7 Ile Val Gly Gly Asn Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Val Leu Lys Ile Asn Gly Leu Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Leu Asp 20 25 30 Ala Arg Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Phe Asp Asn Ile Arg Tyr 35 40 45 Trp Gly Asn Ile Thr Val Val Met Gly Glu His Asp Phe Ser Glu Lys 50 55 60 Asp Gly Asp Glu Gln Val Arg Arg Val Thr Gln Val Ile Met Pro Asp 65 70 75 80 Lys Tyr Ile Arg Gly Lys Ile Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu 85 90 95 His Arg Pro Val Thr Phe Thr Asp Tyr Val Val Pro Leu Cys Leu Pro 100 105 110 Glu Lys Ser Phe Ser Glu Asn Thr Leu Ala Arg Ile Arg Phe Ser Arg 115 120 125 Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu 130 135 140 Leu Met Ser Ile Glu Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Glu 145 150 155 160 His Ala Lys His Ser Ser Asn Thr Pro Lys Ile Thr Glu Asn Met Phe 165 170 175 Cys Ala Gly Tyr Met Asp Gly Thr Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser 180 185 190 Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr His Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly 195 200 205 Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Ile Gly His Ile Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Asp Trp Leu Val Arg His Met Asp 225 230 235 240 Ser Lys Leu Gln Val Gly Val Phe Arg Leu Pro Leu Leu 245 250 <210> 8 <211> 253 <212> PRT <213> Rat <400> 8 Ile Val Gly Gly Tyr Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Val Leu Lys Phe Asn Glu Ala Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Arg Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Phe Gly Lys 35 40 45 Leu Val Asn Ile Thr Val Val Leu Gly Glu His Asp Phe Ser Glu Lys 50 55 60 Glu Gly Thr Glu Gln Val Arg Leu Val Glu Gln Val Ile Met Pro Asn 65 70 75 80 Lys Tyr Thr Arg Gly Arg Thr Asp His Asp Ile Ala Leu Val Arg Leu 85 90 95 His Arg Pro Val Thr Phe Thr Asp Tyr Val Val Pro Leu Cys Leu Pro 100 105 110 Glu Arg Ala Phe Ser Glu Asn Thr Leu Ala Ser Ile Arg Phe Ser Arg 115 120 125 Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu 130 135 140 Leu Met Val Ile Glu Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Glu 145 150 155 160 His Ala Lys His Ser Ala Asn Thr Pro Arg Ile Thr Glu Asn Met Phe 165 170 175 Cys Ala Gly Tyr Met Asp Gly Thr Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser 180 185 190 Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr His Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly 195 200 205 Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Ile Gly His Ile Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Asp Trp Leu Val Lys Tyr Met Asp 225 230 235 240 Ser Lys Leu Arg Val Gly Ile Ser Arg Val Ser Leu Leu 245 250 <210> 9 <211> 253 <212> PRT <213> Rabbit <400> 9 Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Leu Met Asn Gly Ser Thr Leu Leu Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asp 20 25 30 Thr His Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Leu Ser Ser 35 40 45 Leu Arg Asn Leu Thr Ile Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His 50 55 60 Glu Gly Asp Glu Gln Val Arg His Val Ala Gln Leu Ile Met Pro Asp 65 70 75 80 Lys Tyr Val Pro Gly Lys Thr Asp His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu 85 90 95 Leu Gln Pro Ala Ala Leu Thr Asn Asn Val Val Pro Leu Cys Leu Pro 100 105 110 Glu Arg Asn Phe Ser Glu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Arg Phe Ser Arg 115 120 125 Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Tyr Arg Gly Ala Leu Ala Arg Glu 130 135 140 Leu Met Ala Ile Asp Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Val Glu 145 150 155 160 Gln Ser Glu His Lys Pro Gly Ser Pro Glu Val Thr Gly Asn Met Phe 165 170 175 Cys Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser 180 185 190 Gly Gly Pro His Ala Thr Ser Tyr His Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly 195 200 205 Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Val Gly His Val Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Arg Val Ser Arg Tyr Thr Glu Trp Leu Ser Arg Leu Met Arg 225 230 235 240 Ser Lys Leu His His Gly Ile Gln Arg His Pro Phe Pro 245 250

Claims (15)

  1. 인간 인자 VII (SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열에 대하여 둘 또는 그 이상의 치환을 포함하고 있는 인자 VII 폴리펩티드로서, T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고; L288은 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N), Ala (A) 또는 Trp (W)에 의해 대체되며 및/또는 W201은 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되고 및/또는 K337은 Ala (A) 또는 Gly (G)에 의해 대체되는 인자 VII 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 L288은 Phe (F), Tyr (Y), Asn (N), Ala (A) 또는 Trp (W)에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, T293은 Lys (K)에 의해 대체되고 L288은 Phe (F)에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, T293은 Lys (K)에 의해 대체되고 L288은 Tyr (Y)에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, T293은 Arg (R)에 의해 대체되고 L288은 Phe (F)에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, T293은 Arg (R)에 의해 대체되고 L288은 Tyr (Y)에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, K337은 Ala (A)에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  8. 제 1항에 있어서, T293은 Lys (K), Arg (R), Tyr (Y) 또는 Phe (F)에 의해 대체되고 W201은 Arg (R), Met (M) 또는 Lys (K)에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  9. 제 8항에 있어서, T293은 Lys (K)에 의해 대체되고 W201은 Arg (R)에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 VII 폴리펩티드는 적어도 하나의 반감기 연장 부분과 커플링되어 있는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  11. 제 10항에 있어서, 반감기 연장 부분은 생체적합성 지방산 및 그것의 유도체들, 하이드록시 알킬 전분 (HAS), 예컨대 하이드록시 에틸 전분 (HES), 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(Glyx-Sery)n (HAP), 히알루론산 (HA), 헤파로산 중합체 (HEP), 포스포릴콜린-계 중합체 (PC 중합체), 플렉시머, 덱스트란, 폴리-시알산 (PSA), Fc 도메인, 트란스페린, 알부민, 엘라스틴 유사 (ELP) 펩티드, XTEN 중합체, PAS 중합체, PA 중합체, 알부민 결합 펩티드, CTP 펩티드, FcRn 결합 펩티드 및 그것들의 어떠한 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  12. 제 11항에 있어서, 반감기 연장 부분은 헤파로산 중합체인 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 조직 인자의 부재시에 시험관 내 단백질 가수분해 분석으로 측정되는 바 야생형 인간 인자 VIIa (SEQ ID NO:1)의 단백질 가수분해 활성의 적어도 110%인 단백질 가수분해 활성을 가지며; 그리고 저분자량 헤파린의 존재시 및 가용성 조직 인자의 부재시에 항트롬빈 억제 분석으로 측정되는 바, 야생형 인간 인자 VIIa에 비교하여 20% 미만의 항트롬빈 반응성을 가지는 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
  15. 제 14항에 있어서, 응고장애의 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 인자 VII 폴리펩티드.
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