ES2344887T3

ES2344887T3 - Glicoformas de factor vii.

Info

Publication number: ES2344887T3
Application number: ES01971734T
Authority: ES
Inventors: Hans Kurt Pingel; Niels Kristian Klausen
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-10-02
Publication date: 2010-09-09
Anticipated expiration: 2021-10-02
Also published as: BR0114373A; US20020137673A1; AU2001295431A1; PL361058A1; AU2001291651A1; CA2422216A1; WO2002029083A3; CZ2003718A3; US20040058413A1; US20050075289A1; ATE465253T1; WO2002029025A2; AU9165201A; ATE425254T1; JP2004512835A; EP1325127A2; KR100861470B1; KR20030081310A; JP2004510439A; US20020151471A1

Abstract

Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de ácido siálico; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

Description

Glicoformas de Factor VII.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones comprendiendo Factor VII y otros factores de coagulación sanguínea que tienen modelos alterados de glicosilación ligados a la asparagina.

Antecedentes de la invención

Las proteínas implicadas en la cascada de la coagulación, incluyendo, p. ej., factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, y proteína C, están demostrando ser agentes terapéuticos útiles para tratar una variedad de condiciones patológicas. Por consiguiente, hay una necesidad en aumento de formulaciones que comprenden estas proteínas que son farmacéuticamente aceptables y exhiben una uniforme y predeterminada eficacia clínica.

Debido a las muchas desventajas de utilizar el plasma humano como una fuente de productos farmacéuticos, se prefiere producir estas proteínas en sistemas recombinantes. Las proteínas de coagulación, no obstante, se someten a una variedad de modificaciones co- y postranscipcionales, incluyendo, p. ej., glicosilación ligada a la asparagina (ligada a N); glicosilación ligada a O; y \gamma-carboxilación de los residuos glu. Estas modificaciones pueden ser diferentes de forma cualitativa o cuantitativa cuando se utilizan células heterólogas como huéspedes para la producción a gran escala de las proteínas. En particular, la producción en células heterólogas resulta a menudo en una selección de diferentes glicoformas, que son polipéptidos idénticos que tienen diferentes estructuras de oligosacáridos ligadas de manera covalente.

En diferentes sistemas, las variaciones en la estructura de oligosacáridos de las proteínas terapéuticas se han ligado a, entre otras cosas, cambios en la inmunogenicidad y en el aclaramiento in vivo. Así, hay una necesidad en la técnica de composiciones y métodos que proporcionen preparaciones de proteínas de coagulación, particularmente preparaciones que comprenden factor VII recombinante humano, factor VII modificado, o polipéptidos relacionados con el Factor VII, que contienen modelos predeterminados de glicoformas.

Kemball-Cook et al. (Gene 1994, 139(2): 275-279) describe experimentos en los que los cultivos a pequeña escala de factor VII que expresan células CHO-K1 se incubaron en medios carentes de suero.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a preparaciones que comprenden polipéptidos del Factor VII que exhiben modelos predeterminados de las glicoformas. Como se utiliza en este caso, una preparación de factor VII se refiere a una pluralidad de polipéptidos del factor VII, incluyendo variantes y formas químicamente modificadas, al igual que formas que se han activado proteolíticamente (p. ej..factor VIIa), que se han separado de la célula en la que se sintetizaron. Un modelo de glicoformas se refiere a la distribución en la preparación de cadenas de oligosacáridos que tienen estructuras variables que están ligadas de forma covalente a los polipéptidos del factor VII.

En un aspecto, la invención proporciona una preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde uno o más de los siguientes (i)-(iv) se aplica: (i) entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de ácido siálico; (II) entre aproximadamente un 1-7% de las cadenas de oligosacáridos tienen una carga neutra; (iii) entre aproximadamente un 6-16% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de galactosa terminal; y (iv) entre aproximadamente un 11-23% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosamina; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico. En algunas formas de realización, además de uno o más de (i)-(iv): todos los residuos de ácido siálico en las cadenas de oligosacáridos están ligadas a la galactosa mediante un enlace \alpha2->3; al menos algunos de los residuos de ácido siálico comprenden ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) además de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac); y/o las cadenas de oligosacáridos comprenden residuos de fucosa ligados \alpha1->6 a una N-acetilglucosamina de núcleo. En una forma de realización, la invención abarca una preparación que comprende un factor VIIa de tipo salvaje en la que entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos tienen al menos un residuo de ácido siálico y todos los residuos del ácido siálico están ligados a la galactosa mediante un enlace \alpha2->3. En otra forma de realización, la invención abarca una preparación que comprende un factor VIIa de tipo salvaje en el que entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos tiene al menos un residuo de ácido siálico y al menos algunos de los residuos de ácido siálico son ácido N-glicolilneuramínico. Las preparaciones de la presente invención no abarcan así el factor VII de tipo salvaje o factor VIIa que se ha aislado del plasma humano y que no se ha modificado ex vivo por tratamiento de glicosidasa.

En otro aspecto, la invención proporciona una preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde al menos aproximadamente un 2% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una fucosa ligada en \alpha1->3a un residuo antenario de N-acetilglucosamina (es decir, un residuo de N-acetilglucosamina que está ligado en \beta1->2,4 o 6 a un residuo Man) y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico. Preferiblemente, al menos aproximadamente un 5% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un tal residuo antenario de fucosa; más preferiblemente, al menos aproximadamente un 10% o 20%; y de la forma más preferible, al menos aproximadamente un 40%.

Las preparaciones según la invención pueden comprender uno o más de factor VII de tipo salvaje sin modificar; el factor VII de tipo salvaje que se han sometido a modificación química y/o enzimática; y variantes del factor VII que tienen una o más alteraciones en la secuencia de aminoácidos en relación al factor VII de tipo salvaje. Las preparaciones de la invención se pueden derivar de células humanas con expresión del factor VII de un gen endógeno de factor VII o de células programadas para expresar polipéptidos del factor VII de un gen recombinante.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para producir una preparación que comprende polipéptidos del factor VII con un modelo predeterminado de glicosilación ligada a N, los métodos que comprenden cultivar una célula que expresa los polipéptidos bajo condiciones en las que al menos aproximadamente un 94% de los oligosacáridos ligados a asparagina ligados a los polipéptidos del factor VII comprenden al menos un residuo de ácido siálico, p. ej., uno, dos, tres, o cuatro residuos de ácido siálico. En algunas formas de realización, los métodos se llevan a cabo cultivando una célula que expresa los polipéptidos bajo condiciones en las que al menos aproximadamente un 5% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una fucosa ligada en \alpha1->3 a un residuo antenario de N-acetilglucosamina. En algunas formas de realización, los polipéptidos del factor VII, con independencia de su fuente, se someten a tratamientos enzimáticos para conseguir los modelos de las glicoformas deseadas.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden las preparaciones de la invención y el uso de los mismos para la preparación de un medicamento para tratar los trastornos de la coagulación. Los métodos comprenden administrar las formulaciones farmacéuticas a un paciente en necesidad de tratamiento, bajo condiciones que resultan en bien un aumento o inhibición en la coagulación sanguínea. En una serie de formas de realización, las preparaciones de factor VII se administran cuando se desea aumentar la coagulación sanguínea, tal como, p. ej., en hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del factor XI, deficiencia del factor VII, trombocitopenia, o enfermedad de Von Willebrand; en síndromes acompañados de la presencia de un inhibidor del factor de coagulación; antes, durante, o después de la cirugía o terapia anticoagulante; o después de un traumatismo.

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores han descubierto que las preparaciones de proteínas de coagulación que tienen modelos predeterminados de glicoformas exhiben propiedades funcionales mejoradas. Por consiguiente, la presente invención se refiere a métodos y composiciones que proporcionan estas preparaciones de proteínas. En particular, la invención se refiere a preparaciones que comprenden polipéptidos del Factor VII que tienen modelos específicos predeterminados de oligosacáridos ligados a la asparagina (ligados a N). Las preparaciones de la invención exhiben propiedades alteradas, incluyendo, sin limitación, propiedades farmacocinéticas mejoradas y eficacia clínica mejorada. La invención también abarca formulaciones farmacéuticas que comprenden estas preparaciones, al igual que el uso de las formulaciones para la fabricación de medicamentos.

Polipéptidos del factor VII y polipéptidos relacionados con el Factor VII

La presente invención abarca polipéptidos del Factor VII humano, tal como, p. ej., aquellos que tienen la secuencia de aminoácidos divulgada en la patente estadounidense Nº. 4,784,950 (Factor VII de tipo salvaje). Como se utilizan en la presente, el "Factor VII" o "polipéptido del Factor VII" abarcan el factor VII de tipo salvaje, al igual que variantes del factor VII que exhiben sustancialmente la misma o mejorada actividad biológica en relación al factor VII de tipo salvaje. El término "Factor VII" se destina a abarcar los polipéptidos de factor VII en su forma (zimógeno) indivisa, al igual que aquellos que se han procesado proteolíticamente para producir sus formas bioactivas respectivas, que se pueden designar Factor VIIa. Típicamente, el Factor VII es dividido entre los residuos 152 e 153 para producir Factor VIIa.

Como se utiliza en la presente, los "Polipéptidos relacionados con el Factor VII" abarcan polipéptidos, incluyendo variantes, en los que la actividad biológica del factor VIIa se ha modificado o reducido sustancialmente en relación a la actividad del Factor VIIa de tipo salvaje. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, Factor VII o Factor VIIa que se ha modificado químicamente y variantes del Factor VII en los que se han introducido las alteraciones especificas de la secuencia de aminoácidos que modifican o interrumpen la bioactividad del polipéptido.

La actividad biológica del factor VIIa en la coagulación sanguínea deriva de su capacidad de (i) adherirse a un factor tisular (TF) y (ii) catalizar la escisión proteolítica del factor IX o factor X para producir un factor IX o X activado (factor IXa o Xa, respectivamente). Para los propósitos de la invención, la actividad biológica del factor VIIa se puede cuantificar midiendo la capacidad de una preparación para promover la coagulación sanguínea utilizando plasma deficiente del factor VII y tromboplastina, como se describe, p. ej., en la Patente estadounidense Nº. 5,997,864. En este ensayo, la actividad biológica se expresa como la reducción en tiempo de coagulación en relación a una muestra de control y se convierte en "unidades de Factor VII" por la comparación con un estándar colectivo de suero humano que contiene 1 unidad/ml de actividad del factor VII. De forma alternativa, la actividad biológica del factor VIIa se puede cuantificar por (i) medición de la capacidad del Factor VIIa para producir Factor Xa en un sistema que comprende TF integrado en una membrana lipídica y Factor X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) medición de la hidrólisis del Factor X en un sistema acuoso, (véase el ejemplo 5, abajo); (iii) medición de su adhesión física a TF utilizando un instrumento basado en la resonancia de plasmón superficial (Persson, FEBS. Letts 413:359-363, 1997) (iv) medición de la hidrólisis de un sustrato sintético, (véase el ejemplo 4, abajo); y (v) medición de la generación de trombina en un sistema independiente de TF in vitro.

Variantes del Factor VII que tienen sustancialmente la misma o mejorada actividad biológica en relación al Factor VIIa de tipo salvaje abarcan aquellas que exhiben al menos aproximadamente un 25%, preferiblemente al menos aproximadamente un 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 75% y de la forma más preferible al menos aproximadamente un 90% de la actividad específica del factor VIIa de tipo salvaje que se ha producido en el mismo tipo de célula, cuando se prueba en uno o más de un ensayo de coagulación, ensayo de proteólisis, o ensayo de adhesión de TF como se ha descrito anteriormente. Las variantes del factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente reducida en relación a un Factor VIIa de tipo salvaje son aquellos que exhiben menos de aproximadamente un 25%, preferiblemente menos de aproximadamente un 10%, más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% y de la forma más preferible menos de aproximadamente un 1% de la actividad específica del Factor VIIa de tipo salvaje que se ha producido en el mismo tipo de célula cuando se prueba en uno o más de un ensayo de coagulación, ensayo de proteólisis, o ensayo de adhesión de TF como se ha descrito anteriormente. Las variantes del factor VII con una actividad biológica sustancialmente modificada en relación al Factor VII de tipo salvaje incluyen, sin limitación, variantes del Factor VII que exhiben actividad proteolítica de factor TF independiente y aquellas que se adhieren a TF pero no dividen el Factor X.

Las variantes del Factor VII, bien si exhiben sustancialmente la misma o mejor bioactividad que el Factor VII de tipo salvaje, o, de forma alternativa, que exhiben bioactividad sustancialmente modificada o reducida en relación al factor VII de tipo salvaje, incluyen, sin limitación, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del Factor VII de tipo salvaje por inserción, eliminación, o sustitución de uno o más aminoácidos. Ejemplos no limitativos de variantes del factor VII que tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el Factor VII de tipo salvaje incluyen S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (lino et Al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); variantes de FVIIa que exhiben una estabilidad proteolítica mejorada como se divulga en la patente estadounidense Nº. 5,580, 560; factor VIIa que se ha dividido proteolíticamente entre los residuos 290 e 291 o entre los residuos 315 e 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); y formas oxidadas de factor VIIa (Komfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999). Ejemplos no limitativos de variantes del factor VII que tienen actividad biológica sustancialmente reducida o modificada en relación al factor VII de tipo salvaje incluyen R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), y factor VIIa que carece del dominio Gla, (Nicolaisen et al., FEBS. Letts 317:245-249, 1993). Ejemplos no limitativos de polipéptidos del factor VII químicamente modificados y variantes de la secuencia se describen, p. ej., en la patente estadounidense Nº. 5,997,864.

Glicosilación ligada a la asparagina

La presente invención proporciona preparaciones de polipéptidos del Factor VII que comprenden un particular espectro de las glicoformas del factor VII, es decir, polipéptidos del factor VII que tienen modelos predeterminados de cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina (ligadas a N).

Como se utiliza en este, un "modelo" de glicosilación ligada a N o un "modelo", "distribución", o "espectro" de glicoforma, se refiere a la representación de estructuras de oligosacárido particulares dentro de una determinada población de polipéptidos del factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII. Ejemplos no limitativos de tales modelos incluyen la proporción relativa de cadenas de oligosacáridos que (i) tienen al menos un residuo de ácido siálico; (ii) carecen de algún residuo de ácido siálico (es decir, son de carga neutra); (iii) tienen al menos un residuo de galactosa terminal; (iv) tienen al menos un residuo de N-acetilgalactosamina terminal; (v) tienen al menos una antena "destapada", es decir, tiene al menos un residuo de galactosa terminal o N-acetilgalactosamina; o (vi) tienen al menos una fucosa ligada en \alpha1->3 a un residuo antenario de N-acetilglucosamina.

Como se utiliza en este, una cadena de oligosacáridos se refiere a la estructura de oligosacárido entera que está ligada de forma covalente a un único residuo de asparagina. El Factor VII es glicosilado normalmente en Asn 145 y Asn 322. Una cadena de oligosacáridos ligada a N presente en el factor VII producida en un in situ humano puede ser bi-, tri, o tetra-antenaria, con cada antena teniendo la estructura Neu5Ac (\alpha2->3 o \alpha2->6)Gal(\beta1->4) GlcNAc ligada (\beta1->2,4, o 6) a un residuo Man que esta ligado (\alpha1->3 o 6) a Man(\beta1->4)GlcNAc(\beta1->4)GlcNAc-Asn. (Neu5Ac significa ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico), Gal significa galactosa, GlcNAc significa N-acetilglucosamina, y Man significa mañosa). Las cadenas de oligosacáridos también pueden comprender residuos de fucosa, que se pueden ligar con \alpha1->6 a GlcNAc. Cuando el factor VII se produce en un in situ humano, algunas de la cadenas de oligosacáridos carecen de residuos de fucosa de núcleo; todas las cadenas carecen de residuos de fucosa antenarios; y todas las cadenas están casi completamente sialiladas, es decir, el azúcar terminal de cada antena está ligada a ácido N-acetilneuramínico a la galactosa mediante un enlace \alpha2->3 o \alpha2->6.

Cuando se produce en otras circunstancias, no obstante, el Factor VII puede contener cadenas de oligosacáridos que tienen estructuras terminales diferentes en una o más de sus antenas, tal como, p. ej., carentes de residuos de ácidos siálicos; con contenido de residuos de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc); con contenido de un residuo de N-acetilgalactosamina terminal en lugar de galactosa (GalNAc); y similares. Cuando se produce en, p. ej., células BHK cultivadas en la presencia de suero de ternero, las preparaciones de factor VII exhiben los siguientes modelos de oligosacárido:

-: Un 87-93% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un único residuo de ácido siálico;

-: Un 7-13% son neutras (carecen de ácido siálico);

-: Un 9-16% contienen al menos un residuo de galactosa terminal;

-: Un 19-29% contienen al menos un residuo de N-acetilgalactosamina terminal; y

-: Un 30-39% contienen al menos una antena destapada, es decir, contienen al menos un residuo de galactosa terminal o N-acetilgalactosamina.

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Los presentes inventores han producido preparaciones del factor VII que contienen modelos específicos de oligosacáridos predeterminados que difieren de aquellos que se han descrito previamente. Las preparaciones que comprenden polipéptidos del factor VII que exhiben uno o más de los siguientes modelos de glicoformas:

(i): entre aproximadamente un 94-100% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico, tal como, p. ej., entre aproximadamente un 94-99%, entre aproximadamente un 95-98%, o entre aproximadamente un 96-97%. En diferentes formas de realización, al menos aproximadamente un 94%, 95%, 96%, o 97% de las cadenas de oligosacárido contienen al menos un residuo de ácido siálico.

(ii): Un 6% o menos de las cadenas de oligosacáridos son neutras, tal como, p. ej., entre aproximadamente un 1.5-6% o entre aproximadamente un 2-4%.

(iii): menos de aproximadamente un 16%, preferiblemente, menos de aproximadamente un 10% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una galactosa terminal, tal como, p. ej., entre aproximadamente un 6-10% o entre aproximadamente un 8-9%;

(iv): menos de aproximadamente un 25%, preferiblemente, menos de aproximadamente un 10% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de GalNAC terminal, tal como, p. ej., entre aproximadamente un 6-9% o entre aproximadamente un 7-8%;

(v): menos de aproximadamente 30, preferiblemente, menos de aproximadamente un 25% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una antena destapada, tal como, p. ej., entre aproximadamente un 11-23% o entre aproximadamente un 12-18%; y

(vi): al menos aproximadamente un 2%, preferiblemente, al menos aproximadamente un 5%, más preferiblemente, al menos aproximadamente un 10% o 20%; y de la forma más preferible, al menos aproximadamente un 40%, de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una fucosa ligada en \alpha1->3 a un residuo antenario de N-acetilglucosamina (es decir, un residuo de N-acetilglucosamina que está ligado en \beta1->2,4, o 6 a un residuo de Man).

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Se entenderá que cada uno de (i)-(vi) puede representar un modelo diferente de glicoforma, es decir, una preparación según la invención se puede describir por sólo uno de (i)-(vi). De forma alternativa, dependiendo del particular modelo de glicoforma, una preparación abarcada por la invención se puede describir por más de uno de (i)-(vi).

Además, una preparación abarcada por la invención se puede describir por uno o más de (i)-(vi) en combinación con una o más características estructurales adicionales. Por ejemplo, la invención abarca preparaciones que comprenden polipéptidos del factor VII en los que los residuos de ácido siálico (Neu5Ac o Neu5Gc) están ligados a la galactosa exclusivamente en una configuración \alpha2->3. La invención también abarca preparaciones que comprenden polipéptidos del Factor VII que contienen fucosa ligada en \alpha1->6 a una N-acetilglucosamina de núcleo y/o fucosa ligada en \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria. En una serie de formas de realización, las preparaciones abarcan polipéptidos relacionados con el Factor VII o Factor VII en las que más de un 99% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico y (a) los residuos de ácido siálico se vinculan exclusivamente en una configuración \alpha2->3 y/o (b) hay residuos de fucosa ligados a los núcleos N-acetilglucosaminas y/o (c) un número detectable de antena terminan en N-acetilgalactosamina. En una forma de realización, las preparaciones comprenden Factor VIIa de tipo salvaje en las que más de un 99% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico y los residuos de ácidos siálicos están ligados a la galactosa exclusivamente en una configuración \alpha2->3. En otra forma de realización, las preparaciones comprenden Factor VIIa de tipo salvaje en las que más de un 99% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico y al menos algunas cadenas de oligosacáridos comprenden N-acetilgalactosamina. La presente invención no abarca factor VII de tipo salvaje o factor VIIa de tipo salvaje que está aislado del plasma humano y no está modificado ex vivo por tratamiento con glicosidasas.

En una forma de realización, la preparación del factor VIIa comprende cadenas de oligosacáridos con una única fucosa ligada en \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria. En otra forma de realización, la preparación del Factor VIIa comprende cadenas de oligosacáridos que tienen residuos de fucosa ligados en \alpha1->3 a cada N-acetilglucosamina antenaria de un oligosacárido biantenario (estructura Sialyl Lewis X). En otra forma de realización, la preparación del Factor VIIa comprende cadenas de oligosacáridos que tienen (i) una fucosa ligada a una N-acetilglucosamina de núcleo y (ii) una única fucosa ligada en \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria. En otra forma de realización, la preparación del factor VIIa comprende cadenas de oligosacáridos que tienen (i) una fucosa ligada a una N-acetilglucosamina de núcleo y (ii) residuos de fucosa ligados en \alpha1->3 a cada N-acetilglucosamina antenaria de un oligosacárido biantenario.

En la práctica de la presente invención, el modelo de oligosacáridos ligados a N se pueden determinar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación: Cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC); electroforesis capilar (CE); resonancia magnética nuclear (RMN); espectrometría de masas (MS) utilizando técnicas de ionización tal como el bombardeo átomico rápido, electrospray, o desabsorción láser asistida por matriz (MALDI); cromatografía de gas (GC); y tratamiento con exoglicosidasas en conjunto con intercambio amónico (AIE)-HPLC, cromatografía de exclusión por tamaños (SEC), o MS. Véase, p. ej., Weber et al., Anal. Biochem. 225:135 (1995); Klausen et al., J. Chromatog. 718:195 (1995); Morris et Al., en Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen et al., eds., Marcel Dekker, (1990), pp 137-167; Conboy et al., Biol. Mass Spectrom. 21:397, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554 (1990); Sutton et al., Anal. Biochem. 318:34 (1994); Harvey et al., Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994).

Tras la resolución de las cadenas de oligosacáridos derivadas del Factor VII utilizando cualquiera de los métodos anteriores (o cualquier otro método que resuelve las cadenas de oligosacáridos que tienen estructuras diferentes), se asignan las especies resueltas, p. ej., a uno de los grupos (i)-(v). El contenido relativo de cada uno de (i)-(v) se calcula como la suma de los oligosacáridos asignados a ese grupo en relación al contenido total de las cadenas de oligosacáridos en la muestra.

Por ejemplo, utilizando AIE-HPLC, 13 o más picos de oligosacárido ligados a N se pueden resolver de una preparación de factor VII recombinante producida en las células BHK. Véase, p. ej., Klausen et al., Mol. Biotechnol. 9:195, 1998. Cinco de los picos (designados 1-5 en Klausen et al.) no contienen ácido siálico, mientras que ocho de los picos (designados 6, 7, y 10-15) sí contienen ácido siálico.

Se entenderá que, en un determinado análisis, el número y distribución de cadenas conteniendo ácido siálico y cadenas carentes de ácido siálico pueden depender de (a) el polipéptido que se está expresando; (b) el tipo de célula y condiciones de cultivo; y (c) el método de análisis que se emplea, y que los modelos resultantes puedan variar en consecuencia.

En cualquier caso, una vez que se hayan resuelto los oligosacáridos con ácido siálico de los oligosacáridos que no contienen ácido siálico, se utilizan programas de análisis de datos convencionales para calcular el área bajo cada pico; el área de pico total; y el porcentaje del área de pico total representado por un pico particular. De esta manera, para una determinada preparación, la suma de las áreas de picos conteniendo ácido siálico/área de pico total con ácido X 100 produce el % del valor de sialización para la preparación según la presente invención (es decir, la proporción de cadenas de oligosacáridos que tienen al menos un residuo de ácido siálico). De manera similar, el % de cadenas que no tienen ácido siálico o al menos una galactosa o N-acetilglucosamina se pueden calcular.

Métodos para producir preparaciones de factor VII que tienen un modelo predeterminado de oligosacáridos ligados a N

Las preparaciones de Factor VII, variantes del Factor VII, o polipéptidos relacionados con el Factor VII, cada uno con un modelo predeterminado de oligosacáridos unidos a N, se pueden producir utilizando cualquier célula huésped apropiada que expresa el Factor VII o los polipéptidos relacionados con el Factor VII.

Células huéspedes: en algunas formas de realización, las células huéspedes son células humanas que expresan un gen de Factor VII endógeno. En estas células, el gen endógeno puede ser intacto o puede haber sido modificado in situ, o una secuencia fuera del gen del Factor VII puede haber sido modificada in situ para alterar la expresión del gen éndogeno del Factor VII. Cualquier célula humana capaz de expresar un gen endógeno del Factor VII se puede utilizar.

En otras formas de realización, las células huéspedes heterólogas están programadas para expresar Factor VII humano de un gen recombinante. Las células huéspedes pueden ser células de vertebrado, insecto, o células fúngicas. Preferiblemente, las células son células mamíferas capaces del espectro íntegro de glicosilación ligada a N; glicosilación ligada a O; \gamma-carboxilación. Véase, p. ej., las Patentes estadounidenses Nos. 4,784,950. Líneas celulares de mamífero preferidas incluyen las líneas celulares CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), de riñón de cría de hámster (BHK) y HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Una célula BHK preferida es la línea celular BHK tk^{-} ts13 (Waechter y Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), de ahora en adelante denominadas células BHK 570. La línea celular BHK 570 está disponible de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, bajo el número de acceso ATCC CRL 10314. Una línea celular BHK tk^{-} ts13 también está disponible de la ATCC bajo el número de acceso CRL 1632. Además, se puede utilizar un número de otras líneas celulares, incluyendo células de Rat Hep I (hepatoma de la rata; ATCC CRL 1600), de Rat Hep II (hepatoma de la rata; ATCC CRL 1548), de TCMK (ATCC CCL 139), de pulmón humano (ATCC HB 8065), de NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y de DUKX (línea celular CHO) (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 77:4216-4220, 1980)). (Las células DUKX también denominadas células CXB11), y DG44 (línea celular CHO) (Cell, 33:405, 1983, y Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555, 1986). También son útiles las células 3T3, células de Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras células. En una forma de realización particularmente preferida, las células huéspedes son células BHK 21 que se han adaptado para crecer en ausencia de suero y se han programado para expresar Factor VII. En algunas formas de realización, las células pueden ser células mutantes o recombinantes que expresan un espectro cualitativa o cuantitativamente diferente de enzimas de glicosilación (tal como, p. ej., glicosil transferasas y/o glicosidasas) que del tipo de célula de la que se derivaron. Las células también se pueden programar para expresar otros péptidos o proteínas hetéreologas, incluyendo, p. ej., formas truncadas de Factor VII. En una forma de realización, las células huéspedes son células CHO que se han programado para coexpresar tanto el polipéptido del factor VII de interés (es decir, factor VII o un polipéptido relacionado con el factor VII) como otro péptido polipéptido heterólogo tal como, p. ej., una enzima modificante o un fragmento de factor VII.

Métodos: la presente invención describe métodos para producir una preparación que comprende cualquiera de los modelos de glicoformas que se describen anteriormente como (i)-(vi) y, en formas de realización adicionales, métodos para optimizar la distribución de glicoformas del factor VII y polipéptidos relacionados con el Factor VII. Estos métodos se llevan a cabo por las fases de:

(a): cultivar una célula que expresa el Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII bajo un primer conjunto de condiciones predeterminadas de cultivo;

(b): recuperar los polipéptidos del Factor VII o relacionados con el Factor VII del cultivo para obtener una preparación que comprende los polipéptidos; y

(c): analizar la estructura de los oligosacáridos ligados a los polipéptidos para determinar un modelo de glicoformas.

Los métodos pueden comprender además:

(d1): alterar las condiciones de cultivo de la fase (a) para conseguir un segundo conjunto de condiciones predeterminadas de cultivo;

(e1): repetir las fases (b)-(d1) hasta que se logre un modelo deseado de glicoformas.

De forma alternativa, los métodos puede comprender además

(d2): tratar la preparación químicamente y/o enzimáticamente para alterar la estructura del oligosacárido; y

(e2): repetir las fases (b)-(d2) hasta que se logre un modelo deseado de glicoformas.

Estos métodos pueden comprender además la fase de someter las preparaciones que tienen modelos de glicoformas predeterminados a al menos una prueba de bioactividad (incluyendo, p. ej., coagulación, proteólisis del factor X, o adhesión de TF) u otra funcionalidad (tal como, p. ej., perfil o estabilidad farmacocinética), y modelos particulares de glicoformas que tienen correlación con perfiles particulares de bioactividad o funcionalidad a fin de identificar un modelo deseado de glicoforma.

Las variables en las condiciones de cultivo que se pueden alterar en la fase (d1) incluyen, sin limitación: la célula de origen, tal como, p. ej., una célula derivada de una especie diferente de la utilizada originalmente; o una célula mutante o recombinante que tiene alteraciones en una o más glicosil-transferasas o glicosidasas u otros componentes del aparato de glicosilación (véase, Grabenhorst et al., Glycoconjugate J. 16:81, 1999; Bragonzi et al., Biochem. Biophys. Acta 1474:273, 2000; Weikert, Nature Biotechnol. 17:1116, 1999); el nivel de expresión del polipéptido; las condiciones metabólicas tales como, p. ej., concentraciones de glucosa o glutamina; la ausencia o presencia de suero; la concentración de vitamina K; hidrolizados de proteínas, hormonas, metales traza, sales al igual que los parámetros del proceso como la temperatura, nivel de oxígeno disuelto y pH.

Los tratamientos enzimáticos que se pueden utilizar en la fase (d2) para modificar el modelo de oligosacárido de una preparación incluyen, sin limitación, tratamiento con uno o más de sialidasa (neuraminidasa), galactosidasa, fucosidasa; galactosil transferasa, fucosil transferasa, y/o sialiltransferasa, en una secuencia y bajo condiciones que logran una deseada modificación en la distribución de cadenas de oligosacáridos que tienen estructuras terminales particulares. Las glicosil transferasas están disponibles comercialmente de Calbiochem (La Jolla, CA) y las glicosidasas están disponibles comercialmente de Glyko, Inc., (Novato, CA).

En una serie de formas de realización, las células huéspedes que expresan el factor VII o un polipéptido relacionado son sometidas a condiciones de cultivo específicas en las que segregan polipéptidos glicosilados del Factor VII con el modelo deseado de estructuras de oligosacárido anteriormente descritas como cualquiera de (i)-(vi). Tales condiciones de cultivo incluyen, sin limitación, una reducción, o completa ausencia de suero. Preferiblemente, las células huéspedes están adaptadas para crecer en ausencia de suero y se cultivan en ausencia de suero tanto en la fase de crecimiento como en la fase de producción. Tales procedimientos de adaptación se describen p. ej., en Scharfenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21st Century, E. C. Beuvery et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, págs. 619-623, 1995 (células BHK y CHO); Cruz, Biotechnol. Tech. 11: 117-120, 1997 (células de insecto); Keen, Cytotechnol. 17:203-211, 1995 (células de mieloma); Berg et al., Biotechniques 14:972-978, 1993 (células riñón humano 293). En una forma de realización preferida, el medio de crecimiento que se adiciona a las células no contiene proteína u otro componente que fue aislado de un tejido animal o un cultivo celular animal. Véase, p. ej., Ejemplo 1 a continuación. Típicamente, además de componentes convencionales, un medio adecuado para producir factor VII contiene vitamina K a una concentración entre 0.1-50 mg/litro, que se requiere para la \gamma-carboxilación de residuos de glutamina en Factor VII.

En otra serie de formas de realización, las glicoformas de la invención se producen sometiendo una preparación de polipéptidos del Factor VII a la modificación enzimática y/o química de los oligosacáridos ligados a N contenidos en la misma.

Preparaciones de Factor VII

Como se utiliza en este caso, una "preparación de Factor VII" se refiere a una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor VIIa incluyendo variantes y formas químicamente modificadas, que se han separado de la célula en la que fueron sintetizados.

La separación de polipéptidos de su célula de origen se puede conseguir por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, la eliminación del medio de cultivo celular que contiene el producto deseado de un cultivo celular adherente; centrifugación o filtración para eliminar las células no adherentes; y similares.

Opcionalmente, los polipéptidos del factor VII se pueden purificar adicionalmente. La purificación se puede conseguir utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, cromatografía de afinidad, tal como, p. ej., en una columna de anticuerpos anti-factor VII (véase, p. ej., Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; y Thim et AL, Biochem. 27:7785, 1988); cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía por exclusión de tamaño; procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio (IEF), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), o extracción y similares. Véase, de forma general, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, Nueva York, 1982; y Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, Editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989. Tras la purificación, la preparación contiene preferiblemente menos de aproximadamente un 10% en peso, más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% y de la forma más preferible menos de aproximadamente un 1%, de proteínas sin Factor VII derivadas de la célula huésped.

Los polipéptidos de Factor VII y relacionados con el Factor VII se pueden activar por rotura proteolítica, utilizando Factor XIIa u otras proteasas que tienen especificidad de tipo tripsina, tal como, p. ej., Factor IXa, calicreína, Factor Xa, y trombina. Véase, p. ej., Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, Patente estadounidense nº. 4,456,591; y Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). De forma alternativa, el Factor VII se puede activar pasándolo a través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal como Mono Q® (Pharmacia) o similar. El resultante Factor VII activado entonces puede ser formulado y administrado como se describe a continuación.

Propiedades funcionales de las preparaciones de Factor VII

Las preparaciones de polipéptidos del Factor VII que tienen modelos predeterminados de oligosacárido según la invención, exhiben propiedades funcionales mejoradas en relación a las preparaciones de referencia. Las propiedades funcionales mejoradas pueden incluir, sin limitación, a) propiedades físicas tal como, p. ej., estabilidad de almacenamiento; b) propiedades farmacocinéticas tal como, p. ej., biodisponibilidad y semidesintegración; y c) inmunogenicidad en los humanos.

Una preparación de referencia se refiere a una preparación que comprende un polipéptido que es idéntico a aquel contenido en la preparación de la invención a la que se está comparando (tal como, p. ej., Factor VII de tipo salvaje o una variante particular o forma químicamente modificada) excepto que exhibe un modelo diferente de glicosilación ligada a la asparagina. Por ejemplo, las preparaciones de referencia comprenden típicamente uno o más de los siguientes modelos de glicoforma: (i) menos de aproximadamente un 93% (tal como, p. ej. menos de aproximadamente un 92% o menos de aproximadamente un 90%) de las cadenas del oligosacárido contienen al menos un residuo de ácido siálico; (ii) al menos aproximadamente un 6% (tal como, p. ej., al menos aproximadamente un 7,5% o al menos aproximadamente un 10%) de las cadenas de oligosacáridos carecen de cualquier ácido siálico (es decir, son neutras); (iii) al menos aproximadamente un 10% (tal como, p. ej., al menos aproximadamente un 12,5% o al menos aproximadamente un 15%) de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de la galactosa terminal; (iv) al menos aproximadamente un 15% (tal como, p. ej., al menos aproximadamente un 20% o al menos aproximadamente un 25%) de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de N-acetilgalactosamina terminal; (v) al menos aproximadamente un 25% (tal como, p. ej., al menos aproximadamente un 30% o al menos aproximadamente un 35%) de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una antena destapada (es decir, contienen al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosamina); o (vi) niveles esencialmente no detectables (tal como, p. ej., menos de aproximadamente un 0,2%) de residuos antenarios de fucosa.

La estabilidad de almacenamiento de una preparación de Factor VII se puede evaluar midiendo (a) el tiempo requerido para el deterioro de un 20% de la bioactividad de una preparación cuando se almacena como un polvo seco a 25ºC y/o (b) el tiempo requerido para doblar la proporción de agregados del Factor VIIa en la preparación.

En algunas formas de realización, las preparaciones de la invención exhiben un aumento de al menos aproximadamente un 30%, preferiblemente al menos aproximadamente un 60% y más preferiblemente al menos aproximadamente un 100%, en el tiempo requerido para el deterioro de un 20% de la bioactividad en relación al tiempo requerido para el mismo fenómeno en una preparación de referencia, cuando ambas preparaciones se almacenan como polvos secos a 25ºC. Las mediciones de la bioactividad pueden realizarse usando cualquiera de un ensayo de coagulación, un ensayo de proteólisis, un ensayo de unión a TF, o un ensayo de generación de trombina independiente de TF.

En algunas formas de realización, las preparaciones de la invención exhiben un aumento de al menos aproximadamente un 30%, preferiblemente al menos aproximadamente un 60%, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 100%, en el tiempo requerido para doblar los agregados en relación a una preparación de referencia, cuando ambas preparaciones se almacenan como polvos secos a 25ºC. El contenido de los agregados se determina por permeación en gel HPLC en una columna de Protein Pak 300 SW (7,5 X 300 mm) (Waters, 80013) de la siguiente manera. La columna se equilibra con el eluyente A (0,2 M de sulfato amónico, 5% de isopropanol, pH ajustado a 2.5 con ácido fosfórico, y de ahí en adelante se ajusta el pH a 7.0 con trietilamina), después de lo cual se aplica una muestra de 25 \mug a la columna. La elución es con eluyente A a un caudal de flujo de 0,5 ml/min durante 30 min, y la detección se logra midiendo la absorbencia a 215 nm. El contenido de agregados se calcula como el área de pico de los agregados de Factor VII/área total de picos de Factor VII (monómero y agregados).

La "biodisponibilidad" se refiere a la proporción de una dosis administrada de un Factor VII o preparación relacionada con el Factor VII que se puede detectar en el plasma a tiempos predeterminados después de la administración. Típicamente, la biodisponibilidad se mide en animales de prueba administrando una dosis de entre aproximadamente 25-250 \mug/kg de la preparación; obteniendo muestras de plasma a tiempos predeterminados después de la administración; y determinando el contenido de Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII en las muestras utilizando uno o más de un ensayo de coagulación (o cualquier ensayo biológico), un inmunoensayo, o uno equivalente. Los datos típicamente se visualizan gráficamente como [Factor VII] v. tiempo y la biodisponibilidad se expresa como el área bajo la curva (AUC). La biodisponibilidad relativa de una preparación de prueba se refiere a la proporción entre el AUC de la preparación de prueba y el de la preparación de referencia.

En algunas formas de realización, las preparaciones de la presente invención muestran una biodisponibilidad relativa de al menos aproximadamente un 110%, preferiblemente al menos aproximadamente un 120%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 130% y de la forma más preferible al menos aproximadamente un 140% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia. La biodisponibilidad se puede medir en cualquier especie mamífera, preferiblemente perros, y los tiempos predeterminados utilizados para calcular AUC pueden abarcar incrementos diferentes de 10 min-8 h.

La "semivida" se refiere al tiempo requerido para la concentración del plasma de los polipéptidos del Factor VII de polipéptidos relacionados con el Factor VII para disminuir desde un valor particular a la mitad de ese valor. La semivida se puede determinar utilizando el mismo procedimiento que el utilizado para la biodisponibilidad. En algunas formas de realización, las preparaciones de la presente invención exhiben un aumento en semivida de al menos aproximadamente 0,25 h, preferiblemente al menos aproximadamente 0,5 h, más preferiblemente al menos aproximadamente 1 h, y de la forma más preferible al menos aproximadamente 2 h, en relación a la semivida de una preparación de referencia.

La "inmunogenicidad" de una preparación se refiere a la capacidad de la preparación, cuando se administra a un humano, de suscitar una respuesta inmunitaria deletérea, sea humoral, celular, o ambas. Los polipéptidos del Factor VIIa y polipéptidos relacionados al factor VIIa no se conoce que susciten respuestas inmunológicas detectables en los humanos. Sin embargo, en cualquier subpoblación humana, pueden existir individuos que exhiben sensibilidad a proteínas administradas particulares. La inmunogenicidad se puede medir cuantificando la presencia de anticuerpos anti-factor VII y/o células T sensibles al factor VII en un individuo sensible, utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica. En algunas formas de realización, las preparaciones de la presente invención exhiben una disminución en la inmunogenicidad en un individuo sensible de al menos aproximadamente un 10%, preferiblemente al menos aproximadamente un 25%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 40% y de la forma más preferible al menos aproximadamente un 50%, en relación a la inmunogenicidad de ese individuo a una preparación de referencia.

Composiciones farmacéuticas y métodos de uso

Las preparaciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar cualquier síndrome sensible al Factor VII, tal como, p. ej., trastornos de sangrado, incluyendo, sin limitación, aquellos provocados por deficiencias del factor de coagulación (p. ej., hemofilia A y B o deficiencia de los factores de coagulación XI o VII); por trombocitopenia o la enfermedad de Von Willebrand, o por los inhibidores del factor de coagulación, o sangrado excesivo por cualquier causa. Las preparaciones también se pueden administrar a pacientes en asociación con cirugía u otro traumatismo o a pacientes que están recibiendo terapia anticoagulante.

Las preparaciones que comprenden polipéptidos relacionados con el Factor VII según la invención, que tienen una bioactividad sustancialmente disminuida en relación al factor VII de tipo salvaje, se pueden utilizar como anticoagulantes, tal como, p. ej., en pacientes sometidos a una angioplastia u otros procedimientos quirúrgicos que pueden aumentar el riesgo de trombosis u oclusión de los vasos sanguíneos tal como ocurre, p. ej., en la restenosis. Otras indicaciones médicas para las que se prescriben anticoagulantes incluyen, sin limitación, la trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, ictus cerebral, coagulación diseminada intravascular (DIC), deposición de fibrina en los pulmones y riñones asociada a la endotoxemia gram-negativa, infarto de miocardio; síndrome de distrés respiratorio agudo (ARDS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), síndrome urémico hemolítico (HUS), MOF, y TTP.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden Factor VII y las preparaciones relacionadas con el Factor VII según la presente están destinadas principalmente para la administración parenteral para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, es decir, por vía intravenosa, subcutáneamente, o intramuscularmente. Se pueden administrar por infusión continua o pulsátil.

Las composiciones o formulaciones farmacéuticas comprenden una preparación según la invención en combinación con, preferiblemente disueltas en, un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador o diluyente acuoso. Se pueden utilizar una variedad de portadores acuosos, tal como agua, agua tamponada, 0,4% de solución salina, 0,3% de glicina y similares. Las preparaciones de la invención también se pueden formular en preparaciones de liposoma para la entrega o focalización en los lugares de lesión. Las preparaciones de liposoma se describen generalmente en, p. ej., Patentes estadounidenses Nos. 4,837,028, 4,501,728, y 4,975,282. Las composiciones se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las resultantes soluciones acuosas se pueden envasar para su uso o se pueden filtrar bajo condiciones asépticas y liofilizadas, la preparación liofilizada siendo combinada con una solución estéril acuosa antes de la administración.

Las composiciones pueden contener sustancias o adyuvantes auxiliares farmacéuticamente aceptables, incluyendo, sin limitación, agentes de ajuste del pH y agentes tamponantes y/o de ajuste de la tonicidad, tal como, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc.

La concentración de Factor VII o polipéptidos relacionados con el Factor VII en estas formulaciones pueden variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5% en peso, normalmente a o al menos aproximadamente el 1% en peso a tanto como el 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente por volúmenes fluidos, viscosidades, etc., conforme al modo particular de administración seleccionado.

Así, una típica composición farmacéutica para la infusión intravenosa se podría componer para contener 250 ml de solución de Ringer estéril y 10 mg de la preparación. Los métodos reales para preparar composiciones administrables parenteralmente serán conocidos o aparentes para los expertos en la técnica y se describen en más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).

Las composiciones que contienen las preparaciones de la presente invención se pueden administrar para los tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un sujeto que ya sufre una enfermedad, como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente como para curar, aliviar o detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "cantidad terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para cada propósito dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión además del peso y estado general del sujeto. En general, no obstante, la cantidad eficaz variará desde aproximadamente 0,05 mg hasta aproximadamente 500 mg de la preparación por día para un sujeto de 70 kg, con dosificaciones de desde aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 200 mg de la preparación por día siendo más comúnmente utilizada. Se entenderá que la determinación de una dosificación apropiada se puede conseguir utilizando experimentación rutinaria, construyendo una matriz de valores y probando diferentes puntos de la matriz.

La entrega local de las preparaciones de la presente invención, tal como, por ejemplo, aplicación tópica, se puede llevar a cabo, p. ej., por medio de un espray, perfusión, catéteres de balón doble, stent, incorporado en injertos vasculares o stents, hidrogeles utilizados para revestir los catéteres de balón, u otros métodos bien establecidos. De cualquier manera, las composiciones farmacéuticas deben proporcionar una cantidad de la preparación suficiente como para tratar al sujeto eficazmente.

Las composiciones farmacéuticas de la invención puede comprender además otros agentes bioactivos, tales como, p. ej., coagulantes o anticoagulantes no relacionados con el Factor VII.

Los siguientes ejemplos están destinados como ilustraciones no limitativas de la presente invención.

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Ejemplo 1

Producción y análisis de una preparación de Factor VII que exhibe un modelo alterado de glicoformas

El siguiente experimento se realizó para producir una preparación de Factor VII con un modelo alterado de glicoformas.

I. Producción

Una línea celular BHK transformada con un plásmido de codificación del factor VII se adaptó al crecimiento en cultivo de suspensión en la ausencia de suero. Las células se propagaron secuencialmente en cultivos celulares con agitación centrifuga y el número de células aumentó, el volumen aumentó gradualmente por la adición de medio nuevo.

Finalmente, se inocularon 6 L de cultivo de semillas en un biorreactor de producción de 100 litros con contenido de portadores Cytopore 1 (Pharmacia) macroporosos, después de lo cual se inmovilizaron las células de suspensión en los portadores. El cultivo se mantuvo a 36ºC a un pH de 6.7-6.9 y una DO del 50%. El volumen en el biorreactor de producción aumentó gradualmente por la adición de medio nuevo según aumentaba el número de células. Cuando la densidad de las células alcanzó aproximadamente 2 x 10^{6} células/ml, se inició la fase de producción y se realizó un cambio de medio cada 24 horas: se cesó la agitación para permitir la sedimentación de los portadores con contenido celular, y entonces se cosechó un 80% del sobrenadante del cultivo y se sustituyó con medio nuevo. El sobrenadante del cultivo cosechado se filtró para eliminar las células no retenidas y restos de células y entonces se transfirió para un proceso adicional.

Durante la fase de producción las células alcanzaron 3-6 x 10^{6} células/ml y una graduación de 2-7 mg de Factor VII/litro.

II. Análisis del modelo de glicoforma del factor VII recombinante

Se compararon los modelos de oligosacáridos de las siguientes preparaciones: (a) preparaciones del Factor VII recombinante producidos como se describe en la parte I (n=7); y dos preparaciones de referencia: (b) preparaciones de Factor VII recombinante producidas en células BHK en presencia de suero de ternero (n=10); y (c) una preparación de Factor VII purificado de plasma humano.

Los oligosacáridos ligados a N se liberaron de los polipéptidos por división química (hidrazinólisis, en una unidad GlycoPrep1000, Oxford GlycoSciences) o por división enzimática (N-glicosidasa F de, por ejemplo, Boehringer Mannheim). Los oligosacáridos liberados se marcaron con 2-aminobenzamida (utilizando un kit de marcado de señales, K-404, Oxford GlycoSciences o Glyko). Los oligosacáridos marcados se analizaron utilizando intercambio amónico de HPLC en una columna CarboPac PA100 (4x250 mm, Dionex, P/N 43055) con una columna Guard (4x50 mm, Dionex, P/N 43054). La columna se equilibró con 150 mM de hidróxido sódico y se eluyó con un gradiente de 0-150 mM de acetato sódico, 150 mM de hidróxido sódico. Los oligosacáridos se detectaron utilizando fluorescencia, con excitación a 330 nm y emisión a 420 nm.

El contenido relativo de las varias estructuras de oligosacáridos de Factor VII (Klausen et Al., 1998) se calcularon como las áreas de pico relativo para los picos de carbohidrato en el análisis de intercambio aniónico HPLC. En base de los elementos estructurales de cada oligosacárido, se asignó a uno de los siguientes: (i) cadenas con contenido de al menos un ácido siálico; (II) cadenas carentes de cualquier ácido siálico (es decir, neutras); (iii) cadenas con contenido de al menos un residuo de galactosa terminal; (iv) cadenas con contenido de al menos un residuo de N-acetilgalactosamina terminal; y (v) cadenas con contenido de al menos una antena destapada (es decir, al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosamina). Finalmente, la suma de los contenidos relativos de las cadenas de oligosacáridos asignadas a cada grupo se calculó como un porcentaje de las cadenas de oligosacáridos totales. La desviación estándar de esta determinación se calculó que era 0,08% (variación diaria); 0,7% (variación de día a día); y 0,5% (intervalo de 1-100 \mug).

Los resultantes modelos de glicoformas se ilustran en la siguiente tabla:

1

Las preparaciones de factor VII recombinante producidas según este ejemplo (es decir, en ausencia de suero) exhiben un modelo de glicoforma que difiere de ambos modelos de glicoforma del factor VII recombinante producido en presencia de suero y Factor VII nativo aislado del plasma humano. Los oligosacáridos de Factor VII recombinante producidos en ausencia de suero se sialilizan a una mayor medida que aquellas producidas en presencia de suero y contienen menos cadenas neutras v menos cadenas que terminan bien en galactosa o en N-acetilqalatosamina.

III. Biodisponibilidad

El siguiente experimento se realizó para comparar la biodisponibilidad de dos preparaciones de Factor VII producidas como arriba (I y II) con aquella de dos preparaciones de Factor VII de referencia (es decir, producidos en presencia de suero) (A y B).

Grupos de 8 ratas se administraron bien con una preparación de prueba o una preparación de referencia a una dosificación de 25 \mug/kg (\approx 100 \mug/rata) en un tampón de glicil-glicina (pH 7.4) con contenido de cloruro sódico (7.87 mg/ml), dihidrato de cloruro de calcio (1.48 mg/ml), manitol (2.5 mg/ml) y polisorbato 80. Las muestras de sangre se retiraron a los 10 min y 30 min tras la administración inicial. Se obtuvo plasma de las muestras y se cuantificó el Factor VII por ELISA. La biodisponibilidad de cada muestra se expresa como el área según dosificación bajo la curva de concentración de plasma para el factor VII en base de las muestras de 10 y 30-min (dosis AUC_{10-30}). La biodisponibilidad relativa se expresa como la proporción entre la AUC_{10-30}/dosis media de la prueba y muestras de referencia X 100. El 90% de los límites de seguridad para la biodisponibilidad relativa se calcularon del 90% de los límites de seguridad para las diferencias entre preparaciones.

Los resultados se resumen en la tabla a continuación (el % de sialilación de cada preparación, que se midieron como se ha descrito anteriormente, se indican entre paréntesis).

2

Los resultados indican que incluso las diferencias relativamente pequeñas en la proporción de cadenas de oligosacáridos que tienen al menos un residuo de ácido siálico, tal como, p. ej., entre un 93% y 96 o 97%, pueden tener un impacto marcado en la biodisponibilidad (un aumento del 20-30%). Un aumento del 10% en el % de sialilación, por otra parte, causa un aumento del 40-50% en biodisponibilidad.

Ejemplo 2

Análisis de las preparaciones de Factor VII que exhiben un modelo alterado de glicoformas

El Factor VII se produjo como se describe en el ejemplo 1 arriba, con la excepción de que el factor VII se cosechó de cultivos de 500-I. El análisis de las glicoformas se realizó como se describe en el ejemplo 1. Tres preparaciones independientes se analizaron y compararon (A, B, y C) con una preparación de referencia (D).

La biodisponibilidad se midió en un modelo de perro de la siguiente manera: el experimento se realizó como un estudio aleatorio de cuatro patas en 12 perros Beagle divididos en cuatro grupos. Todos los animales recibieron cada una de las tres preparaciones de prueba A, B, y C y la preparación de referencia D a una dosis de \approx90 \mug/kg en un tampón de glicil-glicina (pH 5.5) que contiene cloruro sódico (2,92 mg/ml), dihidrato de cloruro de calcio (1,47 mg/ml), manitol (30 mg/ml) y polisorbato 80. Se retiraron muestras de sangre a los 10, 30, y 60 minutos y 2, 3, 4, 6 y 8 horas tras la administración inicial. Se obtuvo plasma de las muestras y se cuantificó el factor VII por ELISA.

La biodisponibilidad de cada muestra se expresa como el área según la dosis bajo la curva de concentración de plasma para el factor VII (AUC/dosis). La biodisponibilidad relativa se expresa como la proporción entre la media AUC/dosis de prueba y preparación de referencia X 100 y se calculó el 90% de los límites de seguridad para la biodisponibilidad relativa.

Los resultados se resumen en la tabla a continuación. El % de sialilación de cada preparación, que se midieron como se describe en el ejemplo 1 arriba, se indican en paréntesis.

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Los resultados indican que las pequeñas diferencias en la proporción de cadenas de oligosacáridos que tienen al menos un residuo de ácido siálico tienen un impacto marcado en la biodisponibilidad del Factor VII. Un aumento del 10% en el % de sialilación causa un aumento del 30-50% en la biodisponibilidad con una relación cerca de lineal para las tres preparaciones de prueba y la preparación de referencia.

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Ejemplo 3

Preparaciones del Factor VII que exhiben un modelo alterado de glicoformas

I. Construcción de producción de líneas celulares y factor VII

Un vector del plásmido pLN174 para la expresión de FVII humano se ha descrito (Persson y Nielsen. 1996. FEBS Lett. 385: 241-243). Brevemente, lleva la secuencia de nucleótidos de ADNc humano que codifica FVII humano incluyendo el propéptido bajo el control de un promotor de metalotioneína de ratón para la transcripción del ADNc insertado, y el ADNc de dihidrofolato-reductasa de ratón bajo el control de un promotor temprano SV40 para el uso como un marcador seleccionable.

Para la construcción de un vector de plásmido que codifica una secuencia de reconocimiento de gamma-carboxilación, se utilizó un vector de clonación (vector pBluescript II KS+, Stratagene) que contiene ADNc que codifica FVII incluyendo su propéptido (pLN171). (Persson et al. 1997. J. Biol. Chem. 272: 19919-19924). Una secuencia de nucleótidos que codifica un codón de detención se insertó en el FVII que codifica ADNc después del propéptido de FVII por mutagénesis inversa mediada por PCR utilizando este vector de clonación. El plásmido templado se desnaturalizó por tratamiento con NaOH seguido de PCR con polimerasas Pwo (Boehringer-Mannheim) y Taq (Perkin-Elmer) con los siguientes cebadores:

a): 5'-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3'

b): 5'-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC-3'

La resultante mezcla se digirió con DpnI para digerir el ADN templado residual y Escherichia coli se transformaron con el producto de la PCR. Los clones se cribaron por la presencia de la mutación por secuenciación. El ADNc de un clon correcto se transfirió como un fragmento de BamHI-EcoRI al plásmido de expresión pcDNA3 (Invitrogen). El plásmido resultante se denominó pLN329. Las células CHO K1 (ATCC CCI61) se transfectaron con cantidades iguales de pLN174 y pLN329 con el Método Fugene6 (Boehriner-Mannheim). Los transfectantes se seleccionaron por la adición de metotrexato a 1 \muM y G-418 a 0,45 mg/ml. La agrupación de transfectantes se clonó por la limitación de dilución y se midió la expresión de FVII de los clones.

Un clon de alta producción se subclonó de forma adicional y se seleccionó un clon E11 con una expresión de FVII especifica de 2.4 pg/célula/día en medio de Eagle modificado con Dulbecco con un 10% de suero fetal de ternero. El clon se adaptó al cultivo de suspensión libre de suero en un medio de CHO disponible comercialmente (JRH Bioscience) libre de componentes derivados de animales.

Las células adaptadas se propagaron consecutivamente en cultivos celulares con agitación centrífuga y según aumentaba el numero de células, el volumen aumentó gradualmente por la adición de medio nuevo. Después de 25 días, 6 l del cultivo celular con agitación centrifuga se inoculó en un biorreactor de 50-litros. Las células se propagaron en el biorreactor y según aumentaba el número de célula, el volumen aumentó gradualmente por la adición de medio nuevo.

Finalmente, 50 l de las semillas del cultivo se inocularon en un biorreactor de producción de 500 litros que contenía portadores macroporosos Cytopore 1 (Pharmacia), después de lo cual las células de la suspensión se quedaron inmovilizadas en los portadores. El cultivo se mantuvo a 36ºC a un pH de 7.0-7.1 y una Tensión de Oxígeno Disuelto (TOD) del 50% de saturación. El volumen en el biorreactor aumentó gradualmente por la adición de medio nuevo según aumentaba el número de células. Cuando la densidad celular alcanzó aproximadamente 10-12 x 10^{5} células/ml, la fase de producción se inició y un cambio de medio se realizó cada 24 horas: la agitación se detuvo para permitir la sedimentación de los portadores que contenían células, y entonces un 80% del sobrenadante del cultivo se cosechó y sustituyó con medio nuevo. El sobrenadante del cultivo cosechado se filtró para eliminar las células no retenidas (es decir, las células que no se inmovilizaron en portadores) y restos de células y entonces se transfirió para un proceso adicional.

Durante la fase de producción las células alcanzaron 2-3 x 10^{7} células/ml y una graduación de 8 mg de Factor VII/litro.

II. Análisis de las Glicoformas

A. El modelo de oligosacáridos de una preparación de Factor VII producido como se describe anteriormente (a) se comparó con aquellos de (b) preparaciones de factor VII recombinante producidos en células BHK en la presencia de suero de ternero y (c) una preparación de factor VII purificada de plasma humano. Los métodos utilizados fueron esencialmente como se describen en el ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la Tabla a continuación. Las asignaciones de oligosacáridos son de la siguiente manera: (i) cadenas que contienen al menos un ácido siálico; (ii) cadenas que carecen de ácido siálico (es decir, neutras); (iii) cadenas que contienen al menos un residuo de galactosa terminal; (iv) cadenas que contienen al menos un residuo de N-acetilgalactosamina terminal; y (v) cadenas que contienen al menos una antena destapada (es decir, al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosamina).

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B. Los modelos de oligosacáridos de cinco preparaciones de Factor VII independientes producidas como se describe en este ejemplo (a) se compararon con aquellos de (b) preparaciones de factor VII recombinante producidas en células BHK en presencia de suero de ternero y (c) una preparación de Factor VII purificada de plasma humano, utilizando los métodos analíticos descritos en el Ejemplo 1.

En base de los elementos estructurales de cada oligosacárido, se asignó a uno de los siguientes: (i) cadenas que contienen al menos ácido siálico; (ii) cadenas que carecen de ácido siálico (es decir, neutras); (iii) cadenas que contienen al menos una fucosa ligada a la antena. Finalmente, la suma del contenido relativo de las cadenas de oligosacáridos asignadas a cada grupo se calculó como un porcentaje de las cadenas de oligosacáridos total. La desviación estándar de esta determinación se calculó como 0,08% (variación diaria); 0,7% (variación de día a día); y 0,5% (intervalo de 1-100 \mug).

Los resultantes modelos de glicoformas se ilustran en la siguiente tabla:

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Las preparaciones de Factor VII recombinante producidas según el Ejemplo 1 (es decir, producidas en ausencia de suero por la línea celular CHO) exhiben un modelo de glicoformas que difiere de ambos modelos de glicoformas del Factor VII recombinante producidos en presencia de suero y Factor VII nativo aislado de plasma humano. Los oligosacáridos de Factor VII recombinante producidos en ausencia de suero por la línea de 282,4 células CHO incluyen estructuras con fucosa ligada a la antena, que están ausentes de ambas de las preparaciones de referencia. Dos de las estructuras se han purificado por espectrometría de masas por desabsorción/ionización asistida por matriz, por tratamiento con enzimas fucosidasa de enlace específico y por HPLC de intercambio aniónico como se ha descrito anteriormente. Las dos estructuras han demostrado contener la estructura sialil Lewis X, es decir, ligada a la fucosa \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria en un oligosacárido sialilatado.

III. Bioactividad

Cinco preparaciones de Factor VII producidas como se describe en este ejemplo se analizaron por su (a) generación de trombina y (b) adhesión al factor tisular (TF) y se compararon con Factor VII recombinante producido en células BHK en la presencia de suero (referencia). La siguiente tabla correlaciona los modelos de las glicoformas (% de cadenas de oligosacáridos que contienen ácido siálico y el % que contiene antena fucosilatada) y las dos bioactividades.

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Los resultados indican que las preparaciones de Factor VII que tienen antenas fucosiladas exhiben mayor actividad de Factor VII independiente de TF (como se exhibe, p. ej. por generación de trombina) que las preparaciones de Factor VII que carecen de antenas fucosiladas.

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Ejemplo 4

Ensayo de hidrólisis in vitro

El siguiente método se puede utilizar para el ensayo de la bioactividad del Factor VIIa. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El sustrato cromogénico D-Ile-pro-Arg-p-nitroanilida (S-2288, Chromogenix, Suecia), a una concentración final de 1 mM, se añade al Factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, pH 7.4, que contiene 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a 405 nm se mide continuamente en un lector de placas SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, USA). La absorbencia desarrollada durante una incubación de 20 minutos, después de la sustracción de la absorbencia en un pocillo de blanco que no contiene ninguna enzima, se utiliza para calcular la proporción entre las actividades de una prueba y un Factor VIIa de referencia.

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Ejemplo 5

Ensayo de proteólisis in vitro

El siguiente método se puede utilizar para el ensayo de la bioactividad del Factor VIIa. El ensayo se lleva a cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). Factor VIIa (10 nm) y Factor X (0.8 microM) en 100 \mul de HEPES 50 mM, pH 7.4, que contiene 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino, se incuban durante 15 min. Entonces se detiene la división del Factor X por la adición de 50 \mul de HEPES 50 mM, pH 7.4, que contiene 0.1 M de NaCl, 20 mM de EDTA y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La cantidad generada de Factor Xa se mide por la adición del sustrato cromogénico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S-2765, Chromogenix, Suecia), concentración final 0.5 mM. La absorbencia a 405 nm se mide continuamente en un lector de placas de SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, USA). La absorbencia desarrollada durante 10 minutos, después de la sustracción de la absorbencia en un pocillo en blanco que no contiene FVIIa, se utiliza para calcular la proporción entre las actividades proteolíticas de una prueba y un factor VIIa de referencia.

Todas las patentes, solicitudes de patente, y referencias bibliográficas a las que se hace referencia aquí, se incorporan en la presente por referencia, en su integridad.

Muchas variaciones de la presente invención se sugerirán a los expertos en la técnica en vista de la anterior descripción detallada. Las variaciones tan obvias están dentro del alcance previsto completo de las reivindicaciones anexas.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Documentos de Patente citados en la descripción

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\sqbullet US 5580560 A [0017]

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Claims

1. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de ácido siálico; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

2. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 1-7% de las cadenas de oligosacáridos tienen una carga neutra; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

3. Preparación según la reivindicación 1 en donde dicha pluralidad de polipéptidos del factor VII comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 6-16% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de galactosa terminal.

4. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 11-23% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosamina; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

5. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde al menos aproximadamente un 2% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

6. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los residuos siálicos en las cadenas de oligosacáridos están ligados a la galactosa mediante un enlace \alpha2->3.

7. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los residuos de ácido siálico comprenden ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc).

8. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los oligosacáridos comprenden fucosa ligada en \alpha1->6 a una N-acetilglucosamina de núcleo.

9. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde entre aproximadamente un 95-98% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico.

10. Preparación tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde entre aproximadamente un 96-97% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de ácido siálico.

11. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde entre aproximadamente un 2-4% de las cadenas de oligosacáridos tienen una carga neutra.

12. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde entre aproximadamente un 8-12% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos un residuo de galactosa terminal.

13. Preparación tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde entre aproximadamente 12-18% de las cadenas de oligosacáridos contienen al menos una galactosa terminal o residuo de N-acetilgalactosami-
na.

14. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde al menos aproximadamente un 5% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

15. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde al menos aproximadamente un 10% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

16. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde al menos aproximadamente un 20% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

17. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde al menos aproximadamente un 40% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria.

18. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde los polipéptidos tienen la secuencia de aminoácidos del Factor VII de tipo salvaje.

19. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde los polipéptidos son Factor VII de tipo salvaje.

20. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VIIa que tienen la secuencia del factor VII de tipo salvaje, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde entre aproximadamente un 94-99% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos un residuo de ácido siálico; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia, comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

21. Preparación que comprende una pluralidad de polipéptidos del factor VIIa que tienen la secuencia del factor VII de tipo salvaje, en donde los polipéptidos comprenden cadenas de oligosacáridos ligadas a la asparagina y en donde al menos aproximadamente un 2% de las cadenas de oligosacáridos comprenden al menos una fracción de fucosa ligada en \alpha1->3 a una N-acetilglucosamina antenaria; y en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 110% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

22. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en donde los polipéptidos se producen en una célula huésped seleccionada del grupo que consiste en células fúngicas, de insecto, y de vertebrado.

23. Preparación como se define en la reivindicación 22, en donde la célula huésped es una célula mamífera.

24. Preparación como se define en la reivindicación 23, en donde la célula mamífera es derivada de un hámster.

25. Preparación como se define en la reivindicación 24, en donde la célula de hámster es seleccionada del grupo que consiste de células CHO y células BHK.

26. Preparación como se define en la reivindicación 23, en donde la célula mamífera es derivada de un humano.

27. Preparación como se define en la reivindicación 26, en donde la célula humana es una célula HEK.

28. Preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 120% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia, en donde aproximadamente un 93% o menos de las cadenas de oligosacáridos en la preparación de referencia comprenden al menos una fracción de ácido siálico.

29. Preparación como se define en la reivindicación 29, en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 130% de la biodisponibilidad de dicha preparación de referencia.

30. Preparación como se define en la reivindicación 29, en donde la preparación exhibe una biodisponibilidad que es al menos aproximadamente un 140% de la biodisponibilidad de dicha preparación de referencia.

31. Fórmula farmacéutica que comprende una preparación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-30 y un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

32. Uso de una preparación que comprende polipéptidos del factor VII como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 para la preparación de un medicamento para tratar los trastornos de la coagulación.

33. Uso como se define en la reivindicación 32, en donde el trastorno de la coagulación es seleccionado del grupo que consiste en hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del factor XI, deficiencia del factor VII, trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand, cirugía, y traumatismo.

34. Uso de una preparación que comprende polipéptidos del factor VII como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 para la preparación de un medicamento para la prevención del sangrado indeseado.