KR20030081310A - 비타민 ｋ-의존 단백질의 생산 방법 - Google Patents
비타민 ｋ-의존 단백질의 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비타민 K-의존 단백질을 제조하기 위한 신규 방법에 관련된다. 게다가 본 발명은 비타민 K-의존 단백질을 제조하기 위한 본 개선된 방법에 사용되는 신규 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포 및 재조합 벡터에 관련된다.
Description
비타민 K-의존 단백질의 생합성은 성숙한 기능 단백질을 얻기 전에 몇몇 후번역 프로세싱 단계를 포함한다.
비타민 K는 이들 비타민 K-의존 단백질 내에 있는 글루탐산의 감마-카르복실화에 필요한 보조인자인데, 이 단백질은 응고촉진물질 인자 트롬빈, Factor Ⅶ, Ⅸ, 및 Ⅹ; 항응고 단백질 C 및 단백질 S; 및 오스테오칼신 (골 Gla 단백질), 매트릭스 Gla 단백질, 및 프롤린-풍부 Gla 단백질과 같은 다른 단백질을 포함한다. 이 카르복실화는 정상적인 지혈에 요구되는데, 이는 그것이 인지질에 응고촉진물질 및 항응고물질이 칼슘 결합 및 부착할 수 있게 하기 때문이다.
감마-글루타밀 카르복실라제는 조면소포체에 위치한 내재성 막 마이크로솜 효소이다. 이것은 비타민 K-의존 단백질의 Gla 도메인에 위치한 글루타메이트 잔기를 카르복실화 한다. 인간 감마-글루타밀 카르복실라제 cDNA는 최근에 분리되고 서열분석 되었다 (Wu SM et al. Science 254:1634, 1991). BHK 및 CHO 세포에서 비타민 K-의존 단백질의 생합성 연구는, 카르복실라제가 소포체 (ER) 및 골지 복합체 모두에 존재한다는 것, 및 카르복실라제 인식 부위를 함조한 프로펩티드가 감마-카르복실화의 완료 후 절단된다는 것을 나타낸다.
프로펩티드가 카르복실라제 활성을 자극할 수 있는지 여부가 추측되었다 (Sigiura, I. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., 9, 9069-9074, Knobloch and Suttie (1987) J. Biol. Chem. 262, 15334-15337, Furie et al (1999) Blood, 93, 1798-1808).
혈액 응고는 다양한 혈액 성분, 또는 인자의 복잡한 상호작용으로 구성되는 과정으로, 이는 결국 피브린 혈병을 발생시킨다. 일반적으로, 응고 "카스케이드"로서 지칭되고 있는 것에 관여하는 혈액 성분은 효소전구체 또는 효소원인데, 이는 그 스스로 활성화 응고 인자인, 활성화제의 작용에 의해 단백질 가수분해 효소로 전환되는 효소적으로 비활성 단백질이다. 이러한 전환을 겪고 일반적으로 "활성 인자"로서 지칭되는 응고 인자는, 소문자 "a" 접미사를 추가하여 명시된다 (예를 들어, 활성화 인자 Ⅶ (FⅦa)).
활성화 인자 Ⅹ (FⅩa)은 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환하는데에 필요한데, 이는 그 다음 피브린 혈병을 형성하는 최종 단계로서 피브리노겐을 피브린으로 전환한다. FⅩ의 활성화를 촉진시키는 두 개의 시스템, 또는 경로가 있다. "내재성 경로"는 플라즈마에만 존재하는 인자의 사용을 통하여 트롬빈 형성을 일으키는 반응을 지칭한다. 프로티아제-중재 활성화의 시리즈는 궁극적으로 인자 Ⅸa를 생성하는데, 이는 인자 Ⅶa와 함께, FⅩ을 FⅩa로 절단한다. 유사한 단백질 가수분해는 FⅦa 및, 혈액 응고의 "외재성 경로"에 있는 조직 인자인, 그것의 보조인자에 의해 일어난다. 조직 인자는 막 결합 단백질이고 정상적으로 플라즈마에서 순환하지 않는다. 그러나 혈관이 파열되면, 이것은 FⅦa와 복합되어 Ca++ 및 인지질의 존재에서 FⅩ 활성화 또는 인자 Ⅸ 활성화를 촉매작용할 수 있다. 지혈에서 두 응고 경로의 상대적 중요성이 불분명한 반면, 최근에 FⅦ 및 조직 인자는 혈액 응고의 조절에서 중추 역할을 담당하는 것으로 밝혀졌다.
FⅦ은 단일-사슬 효소원으로서 혈액에서 순환하는 미량 플라즈마 글리코단백질이다. 효소원은 혈병 비활성이다. 단일-사슬 FⅦ은 시험관 내에서 FⅩa, 인자 XIIa, 인자 Ⅸa 또는 트롬빈에 의해서 2-사슬 FⅦa로 전환된다. FⅩa는 FⅦ의 주요 생리학적 활성화제인 것으로 믿어진다. 지혈에 관련된 몇몇 다른 플라즈마 단백질과 마찬가지로, FⅦ는 그것의 생합성을 위하여 비타민 K에 의존하는데, 이는 단백질의 아미노 말단에 있는 10 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화에 필요하다. FⅦ의 세포내 후-번역 프로세싱은 소포체 (ER) 및 골지 복합체에서 일어난다. 비타민 K-의존 감마-카르복실화 외에, FⅦ은 제한적으로 단백질 가수분해되어 N-말단 프로펩티드를 제거하고, 아스파라긴 -145 및 -322, 및 세린 -52 및 -60을 글리코실화 한다 (도 1).
감마-카르복실화된 글루탐산 (Gla)은 인지질과 FⅦ의 금속-결합 상호작용에 필요하다.
조직 인자, 인지질 및 칼슘 이온의 존재에서, 2-사슬 FⅦa는 제한된 단백질 가수분해로써 신속하게 FⅩ 또는 인자 Ⅸ를 활성화한다.
단백질 C는 세린 프로테아제이고, 응고 카스케이드에서 인자 Ⅴa 및 Ⅷa를 비활성화 시킴으로써 항상성의 조절에서 역할을 담당하는, 자연적으로 발생하는 항응고제이다. 인간 단백질 C는 461 아미노산의 단일 폴리펩티드로서 간에서 일차적으로 생체내 생성된다. 단일 사슬 전구체 분자는 9개의 Gla 잔기를 생성하는, 9개 글루탐산 잔기의 카르복실화를 포함하는 다수의 후-번역 변형을 겪는다.
단백질 S는 또한 시험관 내 응고 검정에서 항응고 활성을 나타낸다. 단백질 S는 활성화 단백질 C에 대한 항응고 보조인자 활성을 예증한다. 단백질 S는 또한 활성화 단백질 C의 부재에서 항응고 인자인 것으로 나타났는데 이는 단백질 S가 활성화 단백질 C가 없는 검정에서 프로트롬비나제를 저해할 수 있고 인자 Ⅴa 또는 인자 Ⅹa에 결합하여 활성화 단백질 C 없이 항응고제로서 작용하기 때문이다.
단백질 S의 선천성 또는 후천성 결핍이 정맥 및 동맥 혈전성 질병에 연관되었기 때문에 단백질 S는 생리적으로 매우 관심있는 항혈전성 인자이다. 전체 단백질 S의 정상 수준을 갖는 유리 단백질 S의 결핍은 혈전성 질병을 갖는 몇몇 환자에서 설명되었다.
환자에서 응고 카스케이드를 선택적으로 차단하는 것이 종종 필요하다. 예를 들어, 신장 투석, 깊은 정맥 혈전증의 치료, 파종 혈관내 응고 (DIC), 급성 혈전증의 위험이 있는 환자, 단백질 S 결핍, 패혈증, 염증, 암, 수술 중인 환자 및 다른 의학적 이상의 숙주에서, 단백질 C 또는 단백질 S와 같은 항응고제가 사용될 수 있다.
오스테오칼신은 세 개의 Gla 잔기를 포함하는 49개의 아미노산 잔기로 구성된다. 이 단백질의 기능은 과도한 무기화를 억제하는 것으로 생각된다. 오스테오칼신은 골모세포에서 분비되는 골-특이적 단백질이다. 새롭게 합성된 오스테오칼신의 부분은 혈류 내로 방출되는데, 여기에서 그것의 농도는 골모세포 활성의 지수 및 골 형성률과 상호관련된다. 인간에서, 순환 오스테오칼신 수준의 변화는 골다공증 및 부갑상선항진증과 같은 대사성 골 질병과 연관되어 있다.
매트릭스 Gla 단백질 (MGP)은 5개의 Gla 잔기를 포함하는 79개의 아미노산으로 구성된다. 이 단백질은 보통 탈무기화된 매트릭스에서 발견되고 골 형성의 시작에서 어떤 기능을 갖는 것으로 믿어진다.
재조합 비타민 K-의존 단백질 및 특정 재조합 응고 인자의 생산을 위한 개선된 시스템이 업계에 필요하다. 본 발명은 재조합 비타민 K-의존 단백질, 특히 FⅦ의 더 효율적이고 더 빠른 생산 및/또는 더 높은 수율을 부여하는 방법을 제공함으로써 이러한 필요를 성취한다.
본 발명은 비타민 K-의존 단백질 및 특히 응고 인자 Ⅶ(FⅦ)의 제조를 위한 신규 방법에 관련된다. 게다가 본 발명은 비타민 K-의존 단백질 제조를 위한 이 개선된 방법에 이용되는 신규 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포 및 재조합 벡터에 관련된다.
도 1은 감마 카르복실화된 Glu-잔기 (γ) 및 글리코실화 (*)를 갖는 아미노산 1 내지 406의, 올바르게 프로세싱된 인간 응고 FⅦ의 구조를 나타낸다. 아미노산 잔기 152에 있는 화살표는 단일-사슬 FⅦ이 절단되어 활성화된 2-사슬 FⅦ (FⅦa)로 전환되는 부위를 나타낸다.
도 2는 유리 프로펩티드의 발현 및 결합된 프로펩티드를 갖는 재조합 인간 FⅦ의 발현을 위한 플라스미드의 구성을 나타낸다. 플라스미드 pLN171 및 PLN174는 FⅦ과 자연적으로 연결된 결합된 프로펩티드를 갖는 인간 FⅦ을 발현한다. 플라스미드 pLN329는 유리 프로펩티드만 발현하도록 FⅦ와 자연적으로 연결된 프로펩디드를 암호화한 다음에 FⅦ을 암호화하는 cDNA 내로 삽입된 정지 코돈을 갖는다.
도 3은 FⅦ 발현 CHO-K1 세포 (대조군)와 FⅦ 및 유리 FⅦ 프로펩티드를 공동발현하는 세포 (FⅦ 프로펩티드)의 비교를 나타낸다. 결과는 세포당 일당 pg FⅦ 발현으로 나타낸다.
본 발명은 비타민 K-의존 단백질 및 특히 응고 인자 Ⅶ (FⅦ)의 제조를 위한 신규 방법에 관련된다.
비타민 K-의존 단백질의 N-말단 프로세싱 단계 및 특히 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화는, 본 발명자들에 의하여 FⅦ로 예증된 것과 같이, 이 단백질의 생합성에서 제한 단계인 것으로 나타났다. 감마-카르복실화를 증가시키기 위한 방법은 재조합 비타민 K-의존 단백질의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.
비타민 K-의존 단백질의 프로펩티드는 카르복실라제에 결합하는데에 필수적이고, 이것은 후에 성숙 단백질의 N-말단이 될 Glu 잔기가 카르복실화 되기 위하여 비타민 K-의존 단백질에 공유적으로 결합되어야만 한다. 본 발명자들은 유리 프로펩티드의 농도가 증가할 때 감마-카르복실화 프로세싱의 활성 또한 증가한다는 점에서, 유리 프로펩티드가 알로스테릭 조절 분자로서 기능한다는 가설을 세웠다.
유리 프로펩티드의 농도에서 직접적인 증가는 유리 프로펩티드(군)의 공동-발현 그 자체에 의하여 얻어질 수 있다. 이것은 하나 이상의 복사체에서 돌연변이 및 일부절단을 갖거나 또는 갖지 않는 유리 프로펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션 시키고, 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이것을 함께 공동-발현시킴으로써 수행될 수 있다. 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현은, 세포 내로 관심있는 유전자를 트랜스펙션하거나 또는 척추동물 기원의 1차, 2차, 또는 불사화 세포에 이미 존재하는 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 내인성 유전자를 활성화 (즉, 작동)시킴으로써 얻어질 수 있는데, 이는 정상적으로 세포에서 발현되지 않거나 또는 세포에서 생리학적으로 유의한 수준으로 발현되지 않는다. 관심있는 유전자를 활성화하는데 있어서, 유전자가 상응하는 비트랜스펙션된 세포보다 명백히 더 높은 수준으로 발현되도록 하거나, 또는 유전자가 상응하는 비트랜스펙션된 세포와는 명백히 상이한 조절 또는 도입의 패턴을 나타내도록 하는 조절 서열을 갖는 세포 내의 유전자와 정상적으로 연관된 조절 구역을 대치 또는 무력화하는데에 상동 재조합이 이용될 수 있다.
첫번째 양태에서, 본 발명은 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 그것의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 발현하고, 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 발현하는 진핵 숙주 세포에 관련된다. 제 1 폴리뉴클레오티드가 제 1 발현 유닛에 위치한다는 것과 제 2 폴리뉴클레오티드가 제 2 발현 유닛에 위치하는데, 여기에서 제 1 및 제 2 발현 유닛은 상이하다는 것이 이해될 것이다.
두번째 양태에서, 본 발명은 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 그것의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션되고, 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된 진핵 숙주 세포에 관련된다. 제 1 폴리뉴클레오티드가 제 1 발현 유닛에 위치하고 제 2 폴리뉴클레오티드가 제 2 발현 유닛에 위치하는데, 여기에서 제 1 및 제 2 발현 유닛은 상이하다는 것이 이해될 것이다. 트랜스펙션의 실제 순서는 사소한 것이므로, 숙주 세포는 제 2 폴리뉴클레오티드로 먼저 트랜스펙션될 수 있고 그 역도 가능하다. 용어 "제 1 프로펩티드" 및 "제 2 프로펩티드"의 사용은 단지 편의상이고, 그러므로 제 1 및 제 2 프로펩티드는 동일하거나 상이할 수 있다.
여기에서 사용될 때, 용어 "진핵 숙주 세포"는 이종 DNA가 발현될 수 있는 어떠한 세포를 나타내며, 잡종 세포를 포함한다. 전형적인 숙주 세포는, 곤충 세포, 효모 세포, 인간 세포를 포함하고 BHK, CHO, HEK, 및 COS 세포와 같은 포유동물 세포를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실행에 있어서, 배양되는 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게는, CHO (예를들어, ATCC CCL 61), COS-1 (예를 들어, ATCC CRL 1650), 새끼 햄스터 신장 (BHK) 및 HEK293 (예를 들어, ATCC CRL 1573; Graham et al.,J. Gen. Virol.36:59-72, 1977)세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
바람직한 BHK 세포주는 tk-ts 13 BHK 세포주 (Waechter and Baserga,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79:1106-1110, 1982)이고, 이하 BHK 570 세포로서 지칭한다. BHK 570 세포주는 American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852)으로부터 구입가능하다 (ATCC No. CRL 10314). tk-ts 13 BHK 세포주는 또한 ATCC로부터 수납 번호 CRL 1632로 구입가능하다.
다른 적합한 세포주는 Rat Hep I (래트 간암; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (래트 간암; ATCC CRL 1548), TCMX (ATCC CCL 139), 인간 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) 및 DUKX 세포 (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 3T3세포, Namalwa 세포, 골수종 및 다른 세포와 골수종의 융합체 또한 유용하다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 5'로부터 3' 말단으로 읽혀지는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 표시한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 자연 공급원으로부터 분리되거나, 시험관 내에서 합성되거나, 또는 자연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 여기에서 뉴클레오티드 (줄여서 "nt") 또는 염기쌍 (줄여서 "bp")에 의하여 주어진다. 용어 "뉴클레오티드"는 본문이 허용하는 단일- 및 이중-가닥 분자 모두에 사용된다. 용어가 이중-가닥 분자에 적용될 때 이는 전체적인 길이를 표시하는데에 사용되고 용어 "염기쌍"에 동등하다는 것이 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥은 길이로 약간 상이할 수 있고 그것의 말단은 효소적 절단의 결과로서 엇갈릴 수 있으며; 그러므로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내에 있는 모든 뉴클레오티드가 쌍을 이루고 있는 것은 아니라는 것이 당업자들에 의해 인식될 것이다. 이러한 쌍을 이루지 않는 말단은 일반적으로 길이로 20 nt를 초과하지 않을 것이다.
여기에서 사용될 때, 용어 "프로펩티드"는 감마-글루타밀 카르복실라제에 결합할 수 있는 어떤 아미노산 서열을 나타낸다. 비타민 K-의존 단백질의 감마-카르복실화를 지시하는 전형적인 프로펩티드는, 비타민 K-의존 단백질의 N-말단에서 발견되고 감마-글루타밀 카르복실라제와의 상호작용을 위한 도킹 부위 또는 인식 서열의 역할을 하는데, 이는 보통 비타민 K-의존 단백질의 Gla 도메인에 위치한 글루타메이트 잔기를 카르복실화 한다. 하나의 프로펩티드에서 감마-글루타밀 카르복실라제에 대하여 하나 이상의 결합 부위 (예를 들어, 감마-글루타밀 카르복실라제 인식 서열)가 있을 수 있다. 그러므로 이러한 정의 내에 있는 프로펩티드의 한 예는 FⅦ의 자연 프로펩티드 서열이다. 이러한 정의 내에 있는 또다른 예는 동일한 아미노산 서열 내에서 인자 Ⅸ의 자연 프로펩티드 서열에 연결된 FⅦ의 자연 프로펩티드 서열이다.
여기에서 사용될 때, 용어 "유리 프로펩티드"는 감마-카르복실화되는 비타민 K-의존 단백질에 연결되지 않은 프로펩티드를 의미하도록 의도된다. 그러므로 유리프로펩티드의 예는 FⅦ의 아미노산 서열에 연결되어 있지 않은 FⅦ의 프로펩티드이다.
여기에서 사용될 때, 용어 "인자 Ⅶ" 또는 "FⅦ"는 비활성화 형태 (인자 Ⅶ)로 구성된 생성물을 의미한다. 여기에서 사용될 때, 용어 "인자 Ⅶa" 또는 "FⅦa"는 활성화 형태 (인자 Ⅶa)로 구성된 생성물을 의미한다. 이것은 천연 인간 인자 FⅦ 또는 FⅦa의 아미노산 서열 1-406을 갖는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 단백질이 FⅦa의 활성을 실질적으로 보유하는 만큼의 N-말단 아미노산 삭제 또는 첨가를 포함하는 변형된 N-말단과 같은, 약간 변형된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 또한 포함한다. 상기 정의 내에서 "FⅦ" 또는 "FⅦa"는 또한 존재할 수 있고 한 개체에서 또다른 개체로 발생할 수 있는 자연 대립 유전자 변체를 포함한다. 또한 글리코실화 또는 다른 후-번역 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 성질의 의존하여 변화할 수 있다.
여기에서 사용될 때, 용어 "변체"는 근원 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기가 또다른 아미노산 잔기에 의해 치환되고/또는 근원 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되고/또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 근원 단백질에 첨가된 FⅦ를 표시하도록 의도된다. 이러한 첨가는 근원 단백질의 N-말단 또는 C-말단 중 하나 또는 둘 모두에서 일어날 수 있다.
여기에서 사용될 때, 용어 "발현 유닛"은 하기의 실시 가능하게 연결된 요소: (a) 전사 프로모터; (b) 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (c) 전사 터미네이터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 그러므로 발현유닛의 예는 하기의 연결된 요소: (a) 전사 프로모터, (b) 유리 프로펩티드를 암호화하는 cDNA 서열; 및 (c) 전사 터미네이터를 포함하는 DNA 벡터이다.
여기에서 사용될 때, 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 증폭할 수 있는 어떤 핵산 독립체를 의미한다. 그러므로, 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체 외의 독립체로서 존재하여, 염색체 복제에 독립적으로 복제하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)가 될 수 있다. 대안으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입되었을 때, 숙주 세포 게놈 내로 통합되어 통합된 염색체(군)와 함께 복제되는 것이 될 수 있다. 벡터의 선택은 종종 도입될 숙주 세포에 의존할 것이다. 벡터는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 또는 코스미드 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터는 보통 복제 개시점 및 적어도 하나의 선택가능한 유전자, 즉 손쉽게 검출가능한 생성물 또는 세포 성장에 필수적인 존재를 암호화하는 유전자를 함유한다.
용어 "프로모터"는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 시작을 제공하는 DNA 서열을 함유한 유전자의 일부를 표시한다. 프로모터 서열은 정상적으로 유전자의 5' 비-코딩 구역에서 발견되지만 항상 그런 것은 아니다.
세번째 양태에서, 본 발명은 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 발현하는 진핵 숙주 세포에 관련된다.
나아간 양태에서, 본 발명은 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션 되고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된 진핵 숙주 세포에 관련된다.
여기에서 사용될 때, 용어 "비타민 K-의존 단백질"은 글루탐산 잔기에서 감마-카르복실화된 어떤 단백질을 의미한다. 전형적인 비타민 K-의존 단백질은 응고촉진물질 인자 트롬빈, Factor Ⅶ, Ⅸ, 및 Ⅹ; 항응고 단백질 C 및 단백질 S; 및 오스테오칼신 (골 Gla 단백질), 매트릭스 Gla 단백질, 및 프롤린-풍부 Gla 단백질 1과 같은 다른 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 세포에서 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 발현시키고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 공동-발현 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-발현 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, FⅦ 또는 그것의 변체를 생산하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 세포에서 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 발현시키고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 공동-발현 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-발현 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하는 단계를 포함하는, FⅦ 또는 그것의 변체를 생산하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, FⅦ 또는 그것의 변체를 생산하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하는 단계를 포함하는, FⅦ 또는 그것의 변체를 생산하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하고 활성화하는 단계를 포함하는, FⅦ 또는 그것의 변체를 생산하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 재조합 벡터에 관련되는데, 여기에서 상기 벡터는 발현 유닛 내에 유리 프로펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 제 2 폴리뉴클레오티드, 제 2 유리 프로펩티드, 및 제 2 발현 유닛에 관하여 아래에 설명된 구체예는 또한, 개별적 또는 조합으로 재조합 벡터 내에 포함된 폴리뉴클레오티드, 유리 프로펩티드, 및 발현 유닛의 구체예를 나타내도록 의도된다.
나아간 양태에서 본 발명은 재조합 벡터에 관련되는데, 여기에서 상기 벡터는 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
나아간 양태에서 본 발명은 재조합 벡터에 관련되는데, 여기에서 상기 벡터는 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 제 1 발현 유닛에서 FⅦ 및 그것의 프로펩티드의 아미노산 서열 -18 내지 406을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 진핵 숙주 세포에서 활성화하는 유전자 및 b) 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로의 트랜스펙션을 포함하는, FⅦ을 생산하는 진핵 숙주 세포를 제조하기 위한 방법에 관련된다. 이에 관하여, 아미노산 서열 -18 내지 -1은 SEQ ID NO:7로서 확인된 FⅦ의 프로펩티드와 동일하다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 진핵 숙주 세포를 트랜스펙션하는 단계 및 b) 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하는 단계를 포함하는, FⅦ 또는 이것의 변체를 생산하는 진핵 숙주 세포를 제조하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 진핵 숙주 세포에서 발현시키고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 발현하여 공동-발현 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-발현 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 비타민 K-의존 단백질을 생산하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 진핵 숙주 세포에서 발현시키고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 발현하여 공동-발현 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-발현 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 비타민 K-의존 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 비타민 K-의존 단백질을 생산하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 비타민 K-의존 단백질을 생산하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 비타민 K-의존 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 비타민 K-의존 단백질을 생산하기 위한 방법에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻을 수 있는, 재조합 FⅦ 또는 그것의 변체에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻을 수 있는, 재조합 FⅦ 또는 그것의 변체에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하고 활성화하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻을 수 있는, 재조합 FⅦ 또는 그것의 변체에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻을 수 있는, 재조합 비타민 K-의존 단백질에 관련된다.
나아간 양태에서 본 발명은 a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 비타민 K-의존 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻을 수 있는, 재조합 비타민 K-의존 단백질에 관련된다.
제 1 프로펩티드는 비타민 K-의존 단백질과 정상적으로 연결된 프로펩티드일수 있거나 또는 상이한 비타민 K-의존 단백질과 정상적으로 연결된 프로펩티드와 같은, 어떤 다른 프로펩티드일 수 있다.
한 구체예에서 제 1 프로펩티드는 감마-글루타밀 카르복실라제에 대하여 하나의 결합 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서 제 1 프로펩티드는 감마-글루타밀 카르복실라제에 대하여 두개 이상의 결합 서열을 포함한다. 그러므로 제 1 프로펩티드의 예는 동일한 발현 유닛에 공유적으로 부착된 FⅦ 및 프로트롬빈과 정상적으로 연결된 프로펩티드이다.
나아간 구체예에서 제 2 유리 프로펩티드는 감마-글루타밀 카르복실라제에 대하여 하나의 결합 서열을 포함한다. 나아간 구체예에서 제 2 유리 프로펩티드는 감마-글루타밀 카르복실라제에 대하여 두개 이상의 결합 서열을 포함한다. 그러므로 제 2 유리 프로펩티드의 예는 동일한 발현 유닛에 공유적으로 부착된 FⅦ 및 프로트롬빈과 정상적으로 연결된 프로펩티드이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 진핵 숙주 세포는 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 발현하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 발현하고 있다. 특정 구체예에서 FⅦ은 인간 FⅦ이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 진핵 숙주 세포는 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션되고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션 된다. 특정 구체예에서 FⅦ은 인간 FⅦ이다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 비타민 K-의존 단백질은 프로트롬빈, 인자 Ⅸ, FⅦ, 인자 Ⅹ, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 프롤린-풍부 Gla 단백질 1 또는 매트릭스 Gla 단백질로부터 독립적으로 선택된다. 이들 단백질 중 어느 하나가 본 발명의 대안적 구체예를 구성할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 진핵 숙주 세포는 발현 유닛에서 감마-글루타밀 카르복실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 더욱 트랜스펙션된다. 이 발현 유닛은 제 1 또는 제 2 발현 유닛과는 상이한 발현 유닛일 수 있고 감마-글루타밀 카르복실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제 1 또는 제 2 발현 유닛에 위치할 수 있다. 감마-글루타밀 카르복실라제의 예는 인간, 래트, 초파리, 마우스 또는 햄스터의 재조합 감마-글루타밀 카르복실라제로부터 선택된다.
본 발명의 나아간 구체예에서, 제 1 프로펩티드는 화학식:
X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17
의 아미노산 서열을 포함한다.
여기에서 X1, X4, X5, X6, X7, X9, X10및 X13은 G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S, 및 T로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X2, X3, X11및 X12는 V, L, P, N, A, I, S, F, M, W, Q, T 및 Y로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X8은 G 및 A로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X14, X15, X16및 X17은 R, H, A, T, W, L, I, V, Q, K, Y, P로부터 독립적으로 선택되거나 또는 없다.
제 1 프로펩티드의 한 구체예에서 X1은 A, S, N, R, T 및 H로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X2는 V, L, P, N 및 A로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X3은 L, I, V 및 S로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X4는 S, R, N, T, D 및 A로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X5는 R, Q, K, G, H, S 및 P로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X6은 E, R 및 Q로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X7은 Q, N, E, K 및 R로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X8은 A 및 G로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X9는 N, H, S 및 R로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X10은 Q, N, T, G, S, K 및 E로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X11은 V, I, F 및 L로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X12는 L, I 및 V로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X13은 Q, A, S, H, V, K, N 및 R로부터 선택된다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X14는 R, H, K, I 및 P로부터 선택되거나 또는 없다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X15는 R, H, K, Q, V, Y, P, A, T, W 및 L로부터 선택되거나 또는 없다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X16은 R, H, T, Q, K, Y 및 P로부터 선택되거나 또는 없다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X17은 R, H 및 K로부터 선택되거나 또는 없다.
제 1 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X17은 R이다.
본 명세서에서, 아미노산 잔기는 표 1에 지시된 것과 같이, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (CBN)에 의해 승인된 약어를 사용하여 나타낸다. 이성질체를 갖는 아미노산 등에 있어서, 하기 약어로써 표시되는 것들은 자연 L-형이다. 나아가, 펩티드의 아미노산 서열의 좌측 및 우측 말단은, 설명이 없다면 각각 N- 및 C-말단이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 프로펩티드는 1 mM 미만의 저해 상수 (Ki)를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 나아간 구체예에서 아미노산 서열은 0.5mM 미만의 Ki를 갖는다. 더 나아간 구체예에서 아미노산 서열은 0.1 nM 내지 0.5 mM 사이의 Ki를 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
나아간 구체예에서 제 1 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 40%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
나아간 구체예에서 제 1 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 50%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 프로펩티드는 1 mM 미만의 Ki 및 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 특정 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 유리 프로펩티드는 화학식:
X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17
의 아미노산 서열을 포함한다.
여기에서 X1, X4, X5, X6, X7, X9, X10및 X13은 G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S, 및 T로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X2, X3, X11및 X12는 V, L, P, N, A, I, S, F, M, W, Q, T 및 Y로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X8은 G 및 A로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X14, X15, X16및 X17은 R, H, A, T, W, L, I, V, Q, K, Y, P로부터 독립적으로 선택되거나 또는 없다.
제 2 유리 프로펩티드의 한 구체예에서 X1은 A, S, N, R, T 및 H로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X2는 V, L, P, N 및 A로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X3은 L, I, V 및 S로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X4는 S, R, N, T, D 및 A로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X5는 R, Q, K, G, H, S 및 P로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X6은 E, R 및 Q로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X7은 Q, N, E, K 및 R로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X8은 A 및 G로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X9는 N, H, S 및 R로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X10은 Q, N, T, G, S, K 및 E로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X11은 V, I, F 및 L로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X12는 L, I 및 V로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X13은 Q, A, S, H, V, K, N 및 R로부터 선택된다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X14는 R, H, K, I 및 P로부터 선택되거나 또는 없다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X15는 R, H, K, Q, V, Y, P, A,T, W 및 L로부터 선택되거나 또는 없다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X16은 R, H, T, Q, K, Y 및 P로부터 선택되거나 또는 없다.
제 2 유리 프로펩티드의 나아간 구체예에서 X17은 R, H, T, Q, K, Y 및 P로부터 선택되거나 또는 없다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 유리 프로펩티드는 1 mM 미만의 저해 상수 (Ki)를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 나아간 구체예에서 아미노산 서열은 0.5 mM 미만의 Ki를 갖는다. 더 나아간 구체예에서 아미노산 서열은 0.1 nM 내지 0.5 mM 사이의 Ki를 갖는다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 유리 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
나아간 구체예에서 제 2 유리 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 40%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
나아간 구체예에서 제 2 유리 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 50%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 유리 프로펩티드는 1 mM 미만의 Ki 및SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 유리 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 특정 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 나아간 구체예에서 진핵 숙주 세포는 효모 세포이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 진핵 숙주 세포는 곤충 세포이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 진핵 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 진핵 숙주 세포는 인간 세포이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 진핵 숙주 세포는 BHK 세포, HEK 세포, COS 세포 또는 CHO 세포로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 발현 유닛은 제 1 벡터 상에 존재하고 제 2 발현 유닛은 제 2의 분리된 벡터 상에 존재한다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 발현 유닛 및 제 2 발현 유닛은 동일한 벡터 상에 존재한다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 벡터는 플라스미드 벡터이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 벡터는 플라스미드 벡터이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 벡터는 파아지 벡터이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 벡터는 파아지 벡터이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 배양 배지는 무혈청 배지이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 DNA이다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 2 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 DNA이다.
여기에서 사용될 때 용어 "감마-글루타밀 카르복실라제에 대한 결합 서열"은 감마-클루타밀 카르복실라제와 결합 또는 도킹 또는 상호작용하기 위한, 서열 (즉, 인식 서열) 내의 필수 아미노산 잔기를 의미한다.
본 발명의 나아간 구체예에서 제 1 프로펩티드는 (저해 상수 (Ki)로 측정했을 때) 카르복실라제에 대하여 제 2 유리 프로펩티드보다 더 높은 친화도를 갖는다. 카르복실라제 상에 비타민 K-의존 단백질의 프로펩티드의 두 분리가능한 기능 (기질 결합 및 활성 조절)이 있다는 것이 제공된다면, 공유 결합된 프로펩티드 및 유리 프로펩티드의 상이한 친화도 및 농도는 생산 세포가 재조합 비타민 K-의존 단백질을 카르복실화하는 전반적인 능력에 영향을 미칠 수 있다. 유리 프로펩티드 및 공유 결합된 프로펩티드, 및 이들 조합의 공동-발현은 기능 재조합 FⅦ(rFⅦ)의 생산을 증가시킬 수 있다. 새롭게 합성된 Glu-함유 비타민 K-의존 단백질의 카르복실화를 저해하지 않기 위하여, 제 2 유리 프로펩티드는 감마-카르복실화되는 비타민 K-의존 단백질에 공유 결합된 프로펩티드보다 더 낮은 친화도를 갖는 것이 바람직하다.
유리 프로펩티드에 대한 Ki는 Stanley et al (Biochemistry, 38, 15681-15687 (1999) 및 J. Biol. Chem. 274, 16940-16944)에 따라 측정된다.
나아간 구체예에서 비타민 K-의존 단백질과 공동-발현되는 유리 프로펩티드는 표 2 및 3에 요약된 것과 같은 리스트로부터 바람직하게 선택된다.
본 발명은 또한 위에 언급된 것과 같이 비타민 K-의존 단백질을 제조하는 방법에 관련된다. 비타민 K-의존 단백질은 바람직하게 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 이를 위하여, 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA 서열은, 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 제조하고 표준 기술에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 혼성화에 의해 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열에 대하여 스크리닝 함으로써 분리될 수 있다 (Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조). 본 목적으로, 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 바람직하게 인간 기원, 즉 인간 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 유래한 것이다.
본 발명은 또한 척추동물 유래의 1차, 2차, 또는 불사화 세포에 존재하는 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 유전자를 활성화하는 (즉, 작동하는) 방법에 관련되는데, 이 유전자는 세포에서 정상적으로 발현하지 않거나 세포에서 생리학적으로 유의한 수준으로 발현되지 않는다. 유전자가 상응하는 비트랜스펙션된 세포보다 명백히 더 높은 수준으로 발현되도록 하거나, 또는 유전자가 상응하는 비트랜스펙션된 세포와는 명백히 상이한 조절 또는 도입의 패턴을 나타내도록 하는 조절 서열을 갖는 세포 내의 유전자와 정상적으로 연관된 조절 구역을 대치 또는 무력화하는데에 상동 재조합이 이용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 트랜스펙션된 1차, 2차, 또는 불사화 세포에서 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 내인성 유전자를 작동 또는 활성화시킴으로써 비타민 K-의존 단백질을 제조하는 방법에 관련된다. 내인성 유전자의 활성화는 US 5,968,502에 설명된 것과 같이 수행될 수 있다. 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 또한 확립된 표준 방법, 예를 들어 Beaucage 및 Caruthers (Tetrahedron Letters 22(1981), 1859-1869)에 의해 설명된 포스포아미디트 방법, 또는 Matthes et al.(EMBO Journal 3(1984), 801-805)에 의해 설명된 방법에 의하여 합성적으로 제조될 수 있다. 포스포아미디트 방법에 따라, 올리고뉴클레오티드는 자동 DNA 합성기 같은 것으로 합성된 후, 정제되고, 어닐되고, 라이게이션되고 적합한 벡터로 클로닝된다.
DNA 서열은 또한, 예를 들어 US 4,683,202, Saiki 등 (Science 239(1988), 487-491), 또는 Sambrook 등 (상기)에 설명된 것과 같이, 특정 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응에 의해 제조될 수 있다.
비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 보통 어떠한 벡터라도 될 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입되는데, 이는 재조합 DNA 방법으로 편리하게 될 수 있고, 벡터의 선택은 종종 벡터가 도입될 숙주 세포에 의존할 것이다. 따라서, 벡터는 자발적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체 외의 독립체로서 존재하여, 염색체 복제에 독립적으로 복제하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)가 될 수 있다. 대안으로,벡터는 숙주 세포 내로 도입되었을 때, 숙주 세포 게놈 내로 통합되어 통합된 염색체(군)와 함께 복제되는 것이 될 수 있다.
벡터는 바람직하게 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 필요한 추가적인 단편에 실시가능하게 연결된 발현 벡터이다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA 유래이거나 또는 둘 모두의 요소를 함유할 수 있다. 용어 "실시가능하게 연결된"은 단편들이 그것들의 의도된 목적 (예를 들어, 전사가 프로모터에서 시작하여 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 통해 진행하는 것)에 일치하여 기능하도록 정렬된 것을 가리킨다.
프로모터는 어떤 DNA 서열이 될 수 있는데, 이는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내고 숙주 세포에 동종 또는 이종 중 어느 한 쪽의 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래될 수 있다.
포유동물 세포에서 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA의 전사를 지시하기 위한 적합한 프로모터의 예는 SV40 프로모터 (Subramani et al.,Mol. Cell Biol. 1(1981), 854-864), MT-1 (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 (Palmitger et al.,Science 222(1983), 809-814), CMV 프로모터 (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985) 또는 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터 (Kaufman and Sharp, Mol, Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982)이다.
곤충 세포에서의 사용을 위한 적합한 프로모터의 예는 폴리헤드린 프로모터 (US 4,745,051; Vasuvedan et al.,FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), P10 프로모터 (J. M. Vlak et al.,J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776), Autographacalifornica 폴리헤드로시스 바이러스 기초 단백질 프로모터 (EP 397 485), 바큘로바이러스 중재 초기 유전자 1 프로모터 (US 5,155,037; US 5,162,222), 또는 바큘로바이러스 39K 지연-초기 유전자 프로모터 (US 5,155,037; US 5,162,222)이다.
효모 숙주 세포에서의 사용을 위한 적합한 프로모터의 예는 효모 해당 유전자 유래 프로모터 (Hitzeman et al.,J. Biol. Chem. 255(1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki,J. Mol. Appl. Gen. 1(1982), 419-434) 또는 알콜 탈수소효소 유전자 (Young et al.,Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982), 또는TPI1(US 4,599,311) 또는ADH2-4c(Russell et al.,Nature 304(1983), 652-654) 프로모터를 포함한다.
사상 진균 숙주 세포에서의 사용을 위한 적합한 프로모터의 예는, 예를 들어,ADH3프로모터 (Mcknight et al.,The EMBO J. 4(1985), 2093-2099) 또는 tpiA 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터의 예는A. oryzaeTAKA 아밀라제,Rhizomucor miehei아스파르트 프로티나제,A. niger중성 α-아밀라제,A. niger산 안정 α-아밀라제,A. niger또는A. awamori글루코아밀라제 (GluA),Rhizomucor miehei리파아제,A. oryzae알칼라인 프로테아제,A. oryzae트리오스 인산 이성화효소 또는A. midulans아세타미다제를 암호화하는 유전자로부터 유래된 것이다. 바람직한 것은 TAKA-아밀라제 및 gluA 프로모터이다. 적합한 프로모터는 EP 238 023 및 EP 383 779에 언급된다.
비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 또한, 필요하다면, 적합한터미네이터에 실시가능하게 결합될 수 있는데, 이러한 터미네이터는 인간 성장 호르몬 터미네이터 (Palmiter et al.,Science 222, 1983, pp. 809-814) 또는TPI1(Alber and Kawasaki,J. Mol. Appl. Gen. 1(1982), 419-434) 또는ADH3프로모터 (Mcknight et al.,The EMBO J. 4(1985), 2093-2099) 터미네이터이다. 벡터는 또한 프로모터로부터 하류 및 FⅦ 서열 자체에 대한 삽입 부위로부터 상류에 위치한 한 세트의 RNA 스플라이스 부위를 함유할 수 있다. 바람직한 RNA 스플라이스 부위는 아데노바이러스 및/또는 면역글로불린 유전자로부터 얻을 수 있다. 또한 발현 벡터에 함유되는 것은 삽입 부위의 하류에 위치하는 폴리아데닐화 신호이다. 특히 바람직한 폴리아데닐화 신호는 SV40 유래의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호 (Kaufman and Sharp, ibid.), 아데노바이러스 5Elb 영역 유래의 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 유전자 터미네이터 (DeNoto et al. Nuc. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) 또는 인간 FⅦ 유전자 또는 소 FⅦ 유전자 유래의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 발현 벡터는 또한 프로모터와 RNA 스플라이스 부위 사이에 위치한, 아데노바이러스 2 세 갈래 리더와 같은 비코딩 바이러스성 리더 서열; 및 SV40 인핸서와 같은 인핸서 서열을 포함할 수 있다.
재조합 벡터는 벡터를 문제의 숙주 세포에서 복제될 수 있게 하는 DNA 서열을 더욱 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 (숙주 세포가 포유동물 세포일 때) 복제의 SV40 복제 개시점이다.
숙주 세포가 효모 세포일 때, 벡터를 복제될 수 있게 하는 적합한 서열은 효모 플라스미드 2μ 복제 유전자 REP 1-3 및 복제의 개시점이다.
벡터는 또한 선별가능한 마커를 포함할 수 있는데, 이는 예를 들어, 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)를 코딩하는 유전자 또는Schizosaccharomyces pombeTPI 유전자 (P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130에 설명됨)와 같은, 숙주 세포에서 검출물을 보완하는 생성물인 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 네오마이신, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 내성을 부여하는 것이다. 사상 진균에 있어서 선별가능한 마커는amdS,pyrG,argB,niaD또는sC를 포함한다.
본 발명의 비타민 K-의존 단백질을 숙주 세포의 분비 경로 내로 지시하기 위해, 분비 신호 서열 (리더 서열, prepro 서열 또는 pre 서열로서 또한 공지됨)이 재조합 벡터로 제공될 수 있다. 분비 신호 서열은 올바른 판독 프레임에서 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 결합된다. 분비 신호 서열은 통상적으로 펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에 위치한다. 분비 신호 서열은 단백질과 정상적으로 결합된 것 또는 또다른 분비된 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
효모 세포로부터의 분비에 있어서, 분비 신호 서열은 어떤 신호 펩티드를 암호화할 수 있는데, 이는 세포의 분비 경로 내로 발현된 비타민 K-의존 단백질의 능률적인 지시를 보증한다. 신호 펩티드는 자연적으로 발생한 신호 펩티드, 또는 그것의 기능적 일부도 될 수 있고, 또는 합성 펩티드가 될 수도 있다. 적합한 신호 펩티드는 α-인자 신호 펩티드 (US 4,870,008 참조), 마우스 타액 아밀라제의 신호 펩티드 (O. Hagenbuchle et al.,Nature 289, 1981, pp. 643-646 참조), 변경된 카르복시펩티다제 신호 펩티드 (L.A. Valls et al.,Cell 48, 1987, pp.887-897 참조), 효모BAR1신호 펩티드 (WO 87/02670 참조), 또는 효모 아스파르트 프로테아제 3 (YAP3) 신호 펩티드 (M. Egel-Mitani et al.,Yeast 6, 1990, pp. 127-137 참조)인 것으로 밝혀졌다.
효모에서의 능률적인 분비를 위하여, 신호 서열의 하류 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 상류에 리더 펩티드를 암호화하는 서열을 또한 삽입할 수 있다. 리더 펩티드의 기능은 발현된 펩티드가 소포체로부터 골지체로 지시되고 배양 배지 내 분비를 위하여 분비낭으로 더욱 지시되도록 허용하는 것이다 (즉 세포벽 또는 적어도 세포 막을 통하여 효모 세포의 페리플라즈마 공간 내로 비타민 K-의존 단백질을 방출한다). 리더 펩티드는 효모 α-인자 리더가 될 수 있다 (이것의 사용은 US 4,546,082, US 4,870,008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 및 EP 163 529에 설명된다). 대안으로, 리더 펩티드는 합성 리더 펩티드가 될 수 있는데, 이는 자연에서 발견되지 않는 리더 펩티드를 일컷는 것이다. 합성 리더 펩티드는, 예를 들어, WO 89/02463 또는 WO 92/11378에 설명된 것과 같이 구성될 수 있다.
사상 균류에서의 사용에 있어서, 신호 펩티드는Aspergillus종 아밀라제 또는 글루코아밀라제를 암호화하는 유전자,Rhizomucor miehei리파아제 또는 프로테아제 또는Humicola lanuginosa리파아제를 암호화하는 유전자로부터 편리하게 유래될 수 있다. 신호 펩티드는 바람직하게A. oryzaeTAKA 아밀라제,A. niger중성 α-아밀라제,A. niger산-안정 아밀라제, 또는A. niger글루코아밀라제를 암호화하는 유전저로부터 유래될 수 있다. 적합한 신호 펩티드는, 예를 들어 EP 238 023및 EP 215 594에 개시된다.
곤충 세포에서의 사용에 있어서, 신호 펩티드는 인시류Manduca sexta지방동력 호르몬 전구체 신호 펩티드 (US 5,023,328 참조)와 같은, 곤충 유전자 (WO 90/05783 참조)로부터 편리하게 유래될 수 있다.
비타민 K-의존 단백질, 프로모터 및 임의적으로 터미네이터 및/또는 분비 신호 서열을 각각 코딩하는 DNA 서열을 라이게이션하고, 복제에 필요한 정보를 함유한 적합한 벡터 내로 이들을 삽입하는데에 사용된 방법은, 당업자에게 주지된다 (예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조).
포유동물 세포를 트랜스펙션하고 세포 내로 도입된 DNA 서열을 발현하는 방법은 예를 들어, Kaufman and Sharp,J. Mol. Biol. 159(1982), 601-621; Southern and Berg,J. Mol. Appl. Genet. 1(1982), 327-341; Loyter et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982), 422-426; Wigler et al.,Cell 14(1978), 725; Corsaro and Pearson,Somatic Cell Genetics 7(1982), 603, Graham and van der Eb,Virology 52(1973), 456; 및 Neumann et al.,EMBO J. 1(1982), 841-845에 설명된다.
선별가능한 마커는 관심있는 유전자와 동시에 개별적인 플라스미드 상에서 세포 내로 도입될 수 있고, 또는 동일한 플라스미드 상에서 도입될 수 있다. 동일한 플라스미드로 도입된다면, 선별가능한 마커 및 관심있는 유전자는 상이한 프로모터 또는 동일한 프로모터의 제어하에서, 후에 디시스트론성 메세지를 생산하는배치가 될 수 있다. 이 타입의 구성물은 업계에 공지된다 (예를 들어, Levinson and Simonsen, U.S. 특허 No. 4,713,339). "캐리어 DNA"로서 공지된 추가적인 DNA를 세포 내로 도입된 혼합물에 첨가하는 것이 또한 유리할 수 있다.
세포가 DNA를 흡수한 후, 전형적으로 1 내지 2일동안 관심있는 유전자를 발현하기 시작하도록 적합한 성장 배지에서 키운다. 여기에서 사용될 때 용어 "적합한 성장 배지"는 세포의 성장 및 관심있는 비타민 K-의존 단백질의 발현에 필요한 영양물질 및 성분을 함유한 배지를 의미한다. 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질 및 성장인자를 포함한다. 감마-카르복실화 단백질의 생산에 있어서, 배지는 비타민 K를, 바람직하게는 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 5 ㎍/ml의 농도로 함유할 것이다. 그 다음 약물 선택은 안정한 방식으로 선별가능한 마커를 발현하는 세포의 성장에 대하여 선택하도록 적용된다. 증폭성 선별가능한 마커로 트랜스펙션한 세포를 위하여 약물 농도는, 클로닝된 서열의 증가된 복제 수에 대하여 선택함으로써, 발현 수준을 증가시키도록 증가될 수 있다. 그 다음 안정하게 트랜스펙션된 세포의 클론은 관심있는 비타민 K-의존 단백질의 발현에 대하여 스크리닝 된다.
비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 도입된 숙주 세포는 어떠한 세포도 될 수 있는데, 이는 번역후 변환된 비타민 K-의존 단백질을 생산할 수 있는 것이고 효모, 진균 및 고등 진핵 세포를 포함한다.
본 발명에서의 사용을 위한 포유동물 세포의 예는 COS-1 (ATCC CRL 1650), 새끼 햄스터 신장 (BHK) 및 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol.36:59-72, 1977) 세포주이다. 바람직한 BHK 세포주는 tk-ts 13 BHK 세포주 (참고문헌으로서 여기 수록된, Waechter and Baserga,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79:1106-1110, 1982)이고, 이하 BHK 570 세포로서 지칭한다. BHK 570 세포주는 American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852)으로부터 구입가능하다 (ATCC No. CRL 10314). tk-ts 13 BHK 세포주는 또한 ATCC로부터 수납 번호 CRL 1632로 구입가능하다. 그 외에, Rat Hep I (래트 간암; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (래트 간암; ATCC CRL 1548), TCMX (ATCC CCL 139), 인간 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) CHO (ATCC CCL 61) 및 DUKX 세포 (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)를 포함하는, 많은 다른 세포주가 본 발명 내에서 사용될 수 있다.
적합한 효모 세포의 예는Sacchraomyces종 또는Schizosaccharomyces종의 세포, 특히Saccharomyces serevisiae또는Saccharonyces kluyveri의 균주를 포함한다. 이형 DNA로 효모 세포를 형질전환하여 그로부터 이형 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법은, 예를 들어 US 4,599,311, US 4, 931,373, US 4,870,008, US 5,037,743, 및 US 4,845,075에 설명되고, 이들 모두는 참고문헌으로서 여기 수록된다. 형질전환된 세포는, 통상적으로 약물 내성 또는 류신과 같은 특정 영양물의 부재에서 성장하는 능력 등의 선별가능한 마커에 의해 측정된 표현형으로써 선택된다. 효모에서의 사용을 위한 바람직한 벡터는 US 4,931,373에 개시된 POT1 벡터이다. 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 DNA 서열은, 예를 ㄷ르어 위에 설명된 것과 같이, 신호 서열 및 임의적으로 리더 서열에 의해 선행될 수 있다. 적합한 효모 세포의 나아간 예는Kluyveromyces(예를 들어,K. lactis),Hansenula(예를 들어,H. polymorpha), 또는Pichia(예를 들어,P. pastoris)의 균주이다.
다른 진균 세포의 예는 사상 진균의 세포로서, 예를 들어,Aspergillus종,Neurospora종,Fusarum종 또는Trichoderma종, 특히A. oryzae, A. nidulans또는A. niger의 균주이다. 단백질의 발현을 위한Aspergillus종의 사용은 예를 들어, EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438에 설명된다.F. oxysporum의 형질전환은 Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156에 설명된 것과 같이 수행될 수 있다.Trichoderma종의 형질전환은 EP 244 234에 설명된 것과 같이 수행될 수 있다.
사상 진균이 숙주 세포로서 사용될 때, 이것은 재조합 숙주 세포를 얻기 위하여 숙주 염색체에 DNA 구성체를 통합함으로써, 본 발명의 DNA 구성체로 쉽게 형질전환될 수 있다. 이러한 통합은, DNA 서열이 세포에서 안정하게 유지되는 것으로 생각되기 때문에, 일반적으로 장점으로 고려된다. 숙주 염색체 내로 DNA 구성체의 통합은 전통적인 방법, 예를 들어 동형 또는 이형 재조합에 따라 수행될 수 있다.
곤충 세포의 형질전환 및 이로부터 이형 폴리펩티드의 생산은 US 4,745,051; US 4,879,236; US 5,155,037; 5,162,222; EP 397,485에 설명된 것과 같이 수행될 수 있고, 이들 모두는 참고문헌으로서 여기 수록된다. 숙주로서 사용된 곤충 세포주는Spodoptera frugiperda세포 또는Trichoplusia ni세포 (US 5,077,214 참조)와 같은Lepidoptera세포주가 적당할 수 있다. 배양 조건은 예를 들어, WO 89/01029 또는 WO 89/01028, 또는 앞서 언급된 참고문헌 중 어느 것에서 설명된 것이 적당할 수 있다.
그 다음 위에 설명된 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포는 비타민 K-의존 단백질의 발현이 허용되고 그 후 결과 펩티드의 전부 또는 일부는 배양물로부터 회수될 수 있는 조건 하에서 적합한 영양 배지에서 배양된다. 세포를 배양하는데에 사용된 배지는, 적합한 첨가물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 어떠한 전통적인 배지도 될 수 있다. 적합한 배지는 제조 공급사로부터 시중 구입가능하고 또는 발표된 제조 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, American Type Culture Collection의 카탈로그). 세포에 의해 생산되는 비타민 K-의존 단백질은 전통적 방법에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있는데 이 방법은 문제의 폴리펩티드의 타입에 의존하여, 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 숙주 세포를 분리하는 단계, 황산 암모늄과 같은 염에 의해 상청액 또는 여과물의 단백질 수성 성분을 침전시키는 단계, 이온 교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 정제를 포함한다.
재조합 인간 FⅦ 또는 그것의 변체의 제조를 위하여, 클로닝된 야생형 FⅦ DNA 서열이 사용된다. 이 서열은 원하는 FⅦ 단백질 또는 그것의 변체를 암호화하도록 변형될 수 있다. 그 다음 서열은 발현 벡터 내로 삽입되는데, 이는 차례로 숙주 세포 내로 형질전환 또는 트랜스펙션된다. 고등 진핵 세포, 특히 배양된 포유동물 세포는, 숙주 세포로서 바람직하다. 인간 FⅦ에 대한 완전한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지된다. 참고문헌으로서 여기 수록된 U.S. 특허 No. 4,784,950을 참조하면 재조합 인간 FⅦ의 클로닝 및 발현이 설명된다. 소 FⅦ 서열은 Takeya et al., J. Biol. Chem, 263: 14868-14872 (1988)에 설명되고, 이는 참고문헌으로서 여기 수록된다.
아미노산 서열 변경은 여러 가지 기술에 의해 달성될 수 있다. DNA 서열 변형은 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 일어날 수 있다. 부위-특이적 돌연변이유발 기술은 본 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들어 Zoller과 Smith(DNA 3:479-488, 1984)에 의해 설명된다. 이와 같이, FⅦ의 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 사용하여 선택된 변경을 도입할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 DNA 서열은 전형적으로 FⅦ 단백질의 아미노-말단에서 프레-프로 펩티드를 암호화하여 적합한 번역-후 프로세싱(예를 들어, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화) 및 숙주 세포로부터의 분비를 획득할 것이다. 프레-프로 펩티드는 FⅦ 또는 다른 비타민 K-의존 혈장 단백질, 예를 들어 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 프로트롬빈, 단백질 C 또는 단백질 S의 것일 수 있다. 당업자에 의해 인정되는 대로, 추가의 변형이 아미노산 서열에서 만들어질 수 있으며, 이 경우 이들 변형은 응고 인자로서 작용하는 단백질의 능력을 유의하게 손상시키지 않는다. 예를 들어, 본원에 참고자료로 수록된 미국특허 번호 5,288,629에 일반적으로 설명된 대로, 3 작용기 촉매 내의 FⅦ이 또한 활성화 절단 부위에서 변형되어 효소원 FⅦ이 그것의 활성화된 2-사슬 형태로 전환되는 것을 억제할 수 있다.
본 발명에서, 트랜스제닉 동물 기술이 비타민 K-의존 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 숙주 암컷 포유류의 유선에서 단백질을 생산하는 것이 바람직하다. 유선에서의 발현과 이어서 밀크로 관심의 단백질이 분비되는 것은 다른 공급원에서 단백질을 분리하는데서 직면하는 많은 어려움을 극복한다. 더욱이, 주된 유단백질은 고농도로 밀크에 존재한다 (전형적으로 약 1 내지 15g/l). 상업적인 관점에서, 밀크를 다량 산출하는 종들을 숙주로서 사용하는 것이 분명히 바람직하다. 마우스나 래트와 같은 작은 동물이 사용될 수도 있지만 (원리 증명 단계에서는 이것이 바람직하다), 본 발명에서는 제한은 없지만 돼지, 염소, 양 및 소를 포함한 가축 포유류를 사용하는 것이 바람직하다. 양은 이 종들에서의 앞선 트랜스제네시스의 내력, 밀크 산출, 비용 및 양의 밀크를 수집하는 장치의 준비된 유용성과 같은 요인들 때문에 특히 바람직하다. 숙주 종의 선택에 영향을 미치는 요인들을 비교한 WIPO 공보 WO 88/00239 참조한다. 동부 프리즐란드 양과 같은 낙농용으로 사육된 숙주 동물 품종을 선택하거나, 또는 이후에 트랜스제닉 계통의 번식에 의해서 낙농용 가축을 도입하는 것이 일반적으로 바람직하다. 어떤 경우에도 공지된 건강 상태가 양호한 동물이 사용되어야 한다.
포유류 선에서의 발현을 획득하기 위해 유단백질 유전자로부터의 전사 프로모터가 사용된다. 유단백질 유전자는 카세인(미국특허 번호 5,304,489, 본원에 참고자료로 수록됨), 베타-락토글로불린, α-락트알부민, 및 유장 산성 단백질을 암호화하는 유전자들을 포함한다. 베타-락토글로불린(BLG) 프로모터가 바람직하다. 양 베타-락토글로불린 유전자의 경우, 유전자의 5' 측면 서열의 적어도 근위의 406bp 영역이 일반적으로 사용될 것이지만, 더 큰 5' 측면 서열 부분, 약 5kbp 이하, 예를 들어 베타-락토글로불린 유전자의 5' 측면 프로모터 및 비-코딩 부분을포함하는 약 4.25kbp DNA 단편이 바람직하다. Whitelaw 등의 Biochem J. 286: 31-39 (1992) 참조. 다른 종들로부터의 프로모터 DNA의 유사한 단편이 또한 적합하다.
또한, 유전자의 게놈 영역이 발현될 수 있다면 베타-락토글로불린 유전자의 다른 영역이 구성물에 결합될 수 있다. 인트론을 갖지 않는 구성물은 예를 들어 그러한 DNA 서열을 함유하는 것들과 비교하여 불충분하게 발현한다는 것이 일반적으로 본 분야에서 받아들여진다(Brinster 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836-840(1998), Palmiter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:478-482(1991); Whitelaw 등, Transgenic Res 1:3-13 (1991); WO 89/01343; 및 WO 91/02318 참조, 이것들은 각각 본원에 참고자료로 수록된다). 이와 관련하여, 가능하다면 관심의 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 원래의 인트론을 전부 또는 일부 함유하는 게놈 서열을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하며, 따라서 예를 들어 베타-락토글로불린 유전자로부터의 적어도 어떤 인트론을 더 포함하는 것이 바람직하다. 한 그러한 영역은 양 베타-락토글로불린 유전자의 3' 비-코팅 영역으로부터의 인트론-스플라이싱 및 RNA 폴리아데닐화를 제공하는 DNA 단편이다. 유전자의 자연 3' 비-코팅 서열이 치환되었을 때, 이 양 베타-락토글로불린 단편은 관심의 단백질 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 증진 및 안정화시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 서열의 개시 ATG를 둘러싼 영역이 밀크 특이적 담백질 유전자로부터의 상응하는 서열로 대체된다. 그러한 대체는 잠정적인 조직-특이적 개시 환경을 제공하여 발현을 증진시킨다. 비타민 K-의존 단백질의 전체 프레-프로 서열 및 5' 비-코딩 서열을 예를 들어 BLG 유전자의 그것들로 대체하는 것이 편리하지만, 더 작은 영역들이 대체될 수도 있다.
트랜스제닉 동물에서 비타민 K-의존 단백질의 발현에 대해서, 비타민 K-의존 단백질을 코드하는 DNA 단편은 그것의 발현이 발현 유닛들을 생산하기 위해서 필요한 추가 DNA 단편들에 작동가능하게 연결된다. 그러한 추가 DNA 단편들은 상기 언급된 프로모터 뿐만 아니라, mRNA의 전사 및 폴리아데닐화의 종결을 제공하는 서열을 포함한다. 발현 단위들은 비타민 K-의존 단백질을 코드하는 단편에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 코드하는 DNA 단편을 더 포함할 것이다. 분비 신호 서열은 비타민 K-의존 단백질의 원래의 분비 신호 서열일 수 있거나, 또는 유단백질과 같은 다른 단백질의 것일 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고자료로 수록된 von Heinje, Nuc. Acids Res. 14:4683-4690 (1986); 및 Meade 등의 미국특허 번호 4,873,316 참조한다.
트랜스제닉 동물에 사용되는 발현 단위들의 구성은 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 서열을 추가의 DNA 단편들을 함유하는 플라스미드 또는 파지 벡터에 삽입함으로써 편리하게 수행되지만, 발현 유닛은 본질적으로 라이게이션들의 어떤 서열에 의해 구성될 수 있다. 유단백질을 암호화하는 DNA 단편을 함유하는 벡터를 제공하고, 이 유단백질의 코딩 서열을 비타민 K-의존 단백질의 그것으로 대체함으로써, 유단백질 유전자의 발현 제어 서열을 포함하는 유전자 융합체를 만드는 것이 특히 편리하다. 어떤 경우에도 플라스미드 또는 다른 벡터 내의 발현 단위의 클로닝은 비타민 K-의존 단백질의 증폭을 용이하게 한다. 증폭은 박테리아(예를 들어,E. coli) 숙주 세포에서 편리하게 수행되며, 따라서 벡터는 전형적으로 복제 기원 및 박테리아 숙주 세포에서 기능하는 선택성 마커를 포함할 것이다.
다음에, 발현 단위는 선택된 숙주 종들의 (초기-단계 배를 포함하는) 수정란에 도입된다. 미세주사 (예를 들어, 미국특허 번호 4,873,191), 레트로바이러스 감염 (Jaenisch, Science 240:1468-1474 (1988)) 또는 배아줄기(ES) 세포를 사용한 부위-지정 통합(Bradley 등, Bio/Technology 10:534-539 (1992)) 참조)을 포함한 몇가지 경로 중 하나에 의해 이형 DNA의 도입이 달성될 수 있다. 다음에, 이 수정란을 가임신한 암컷의 난관이나 자궁에 이식하여 출산예정일까지 발달시킨다. 그것들의 생식 계열에 DNA가 도입된 자손은 정상적인 멘델 방식으로 그것들의 자손에 DNA를 전파하여 트랜스제닉 무리의 발생을 허용하게 된다.
트랜스제닉 동물을 생산하는 일반적인 과정은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Hogan 등, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons 등, Bio/Technology 6:179-183 (1988); Wall 등, Biol. Reprod. 32:645-651 (1985); Buhler 등, Bio/Technology 8:140-143 (1990); Ebert 등, Bio/Technology 9:835-838 (1991); Krimpenfort 등, Bio/Technology 9:844-847(1991); Wall 등, J. Cell. Biochem. 49:113-120 (1992); 미국특허 번호 4,873,191 및 4,873,316; WIPO 공보 WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; 및 GB 87/00458를 참조하며, 이것들은 각각 본원에 참고자료로 수록된다. 포유류 및 그것들의 배선에 외래 DNA 서열을 도입하는 기술은 원래 마우스에서 개발되었다. 예를 들어, Gorden 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384(1980); Gordon 및 Ruddle, Science 214:1244-1246 (1981); Palmiter 및 Brinster, Cell 41:343-345 (1985); Brinster 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985); 및 Hogen 등(상동) 참조. 후에 이들 기술은 가축들을 포함한 더 큰 동물에 사용되도록 개조되었다(예를 들어, WIPO 공보 WO 88/00239, WO 90/05188, 및 WO 92/11757; 및 Simons 등, Bio/Technology 6:179-183 (1988) 참조). 요약하면, 트랜스제닉 마우스 또는 가축의 발생에서 지금까지 사용된 가장 효과적인 경로에서는 관심의 DNA의 수백개의 선형 분자들이 확립된 기술에 따라서 수정란의 전핵 중 하나에 주입된다. 또한, 접합체의 세포질에 DNA의 주입이 사용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 식물에서의 생산이 사용될 수 있다. 발현은 결절과 같은 특정한 기관에서 일반화되거나 또는 지정될 수 있다. Hiatt, Nature 344:469-479 (1990): Edelbaum 등, J. Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons 등, Bio/Technology 8:217-221 (1990); 및 유럽특허청 공보 EP 255,378 참조.
본 발명에 따라서 생산된 FⅦ는 항-FⅦ 항체 칼럼 상의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 면역흡착 칼럼은 고-친화성 단일클론 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 본원에 참고자료로 수록된 Wakabayashi 등, J. Biol. Chem. 261:11097-11108 (1986) 및 Thim 등, Biochem 27:7785-7793 (1988)에 설명된 칼슘-의존성 단일클론 항체의 사용이 특히 바람직하다. 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 종래의 화학적 정제 수단에 의해 추가의 정제가 달성될 수 있다. 바륨 시트레이트 침전을 포함한 다른 정제 방법이 본 분야에 공지되어 있으며, 본원에 설명된 FⅦ의 정제에 적용될 수 있다(일반적으로, Scopes, R. Protein Purification,Springer-Verlag, N.Y. 1982 참조). 약학적 용도를 위해서는 적어도 약 90 내지 95% 상동성의 실질적으로 순수한 FⅦ가 바람직하며, 98 내지 99% 이상의 상동성이 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 원하는 상동성으로 일단 정제된 후, FⅦ는 치료적으로 사용될 수 있다.
단일-사슬 FⅦ의 활성 2-사슬 FⅦa로의 전환은 Hedner 및 Kisiel(1983, J. Clin. Invest. 71:1836-1841)에 의해 설명된 인자 XIIa를 사용하거나, 또는 티로신과 같은 특이성을 갖는 다른 프로테아제(Kisiel 및 Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42, 1983)를 사용하여 달성될 수 있다. 또는 달리, 모노 Q.RTM.(Pharmacia Fire Chemicals) 등과 같은 이온교환 크로마토그래피 컬럼을 통과시킴으로서 FⅦ을 활성화시킬 수 있다 (Bjoern 등, 1986, Research Disclosures 269:564-565). 본 발명의 FⅦ 분자 및 그것의 약학적 조성물은 사람에게 투여하여 혈관내 응고를 수반하는 여러 가지 상태를 치료하는데 특히 유용하다.
본 발명의 비타민 K-의존 단백질은 어떤 종류의 혈우병을 치료하는데 사용될 수 있다. 혈우병 A는 활성 인자 Ⅷ, 인자 Ⅷa의 부재나, 또는 인자 Ⅷ에 대한 억제제의 존재를 특징으로 한다. 혈우병 B는 활성 인자 Ⅸ, 인자 Ⅸa의 부재를 특징으로 한다. 드물지만 FⅦ 결핍이 인자 Ⅶ 투여에 잘 반응한다 (Bauer, K. A. 1996, Haemostasis, 26:155-158, suppl. 1). 인자 Ⅷ 대체 요법은 어떤 환자에서 고역가의 억제 인자 Ⅷ 항체의 발생으로 인해 제한된다. 또는 달리, FⅦa가 혈우병 A 및 B의 치료에 사용될 수 있다. 인자 Ⅸa 및 인자 Ⅷa는 인자 X를 활성화시킨다. 인자 Ⅶa는 인자 X를 직접 활성화시킴으로써 인자 Ⅸ 및 Ⅷ에 대한 필요를없애며, 거의 면역학적 결과를 갖지 않으면서 인자 Ⅸ 및 Ⅷ 결핍의 문제를 극복할 수 있다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 실시예에서 더 상세히 설명된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해서 더욱 예시되지만, 보호의 범위를 제한하는 것으로서 해석되는 것은 아니다. 앞선 설명 및 하기 실시예에서 개시된 특징들은, 독립적으로 및 그것의 어떠한 조합으로도, 그것의 다양한 형태에서 본 발명을 실현하기 위한 재료가 될 수 있다.
실시예 1
CHO-K1 세포에서 FⅦ 및 FⅦ 프로펩티드의 공동발현
인간 FⅦ의 발현을 위한 플라스미드 벡터 pLN174를 설명하였다 (Persson and Nielsen. 1996. FEBS Lett. 385: 241-243). 간단하게 말하면, 그것은 삽입된 cDNA의 전사를 위하여 마우스 메탈로티오네인 프로모터의 제어하에 있는 프로펩티드 및, 선별가능한 마커로서 사용을 위한 SV40 초리 프로모터의 제어하에 있는 마우스 디히드로폴레이트 환원효소 cDNA를 포함하는 인간 FⅦ을 암호화하는 cDNA 뉴클레오티드 서열을 지닌다.
감마-카르복실화 인식 서열을 암호화하는 플라스미드 벡터의 구성을 위하여, FⅦ의 프로펩티드를 포함한 FⅦ을 암호화하는 cDNA를 함유한 클로닝 벡터 pBluescript II KS+ (Stratagene)을 사용하였다 (pLN171). (Persson et al. 1997. J. Biol. Chem. 272: 19919-19924). 이 클로닝 벡터 상에 역 PCR-중재 돌연변이유발로써 FⅦ의 프로펩트드 다음으로 FⅦ을 암호화하는 cDNA 내로 정지 코돈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하였다. 주형 플라스미드는 NaOH로 처리하여 변성시킨 후 하기 프라이머를 사용하여 Pwo (Boehringer-Mannheim) 및 Taq (Perkin-Elmer) 중합효소로 PCR 하였다:
a) 5'-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3' (SEQ ID NO:19)
b) 5'-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC-3' (SEQ ID NO:20)
결과 혼합물은 DpnI으로 처리하여 잔류 주형 DNA를 효소 절단하고 PCR 생성물로Escherichia coli을 트랜스포메이션하였다. 서열분석으로 돌연변이의 존재에 대하여 클론을 스크리닝하였다. 올바른 클론으로부터의 cDNA는 BamHI-EcoRI 절편으로서 발현 플르스미드 pcDNA3 (Invitrogen)으로 옮겼다. 결과 플라스미드를 pLN329로 명명하였다.
Fugene6 방법 (Boehringer-Mannheim)을 사용하여 동일량의 pLN174 및 pLN329로 CHO K1 세포 (ATCC CCI61)을 트랜스펙션 하였다. 메토트렉세이트 1μM 및 G-415 0.45 mg/ml을 첨가하여 트랜스펙션체를 선별하였다. 제한 희석으로써 트랜스펙션체의 풀 (pool)을 클로닝하고 클론으로부터 얻은 FⅦ을 측정하였다.
고생산 클론을 더욱 서브클로닝하고 10% 소태아 혈정을 갖는 Dulbecco-modified Eagle's medium에서 2.4 pg/세포/일의 특이적 FⅦ 발현을 갖는 클론 E11을 선별하였다. 시중 구입가능한 CHO 배지 (JRH Bioscience)에서 무혈청 현탁 배지에 클론을 적응시켰다.
적응시킨 세포는 스피너 배양물에서 순차적으로 증식시키고 세포 수가 증가함에 따라, 새로운 배지를 첨가하여 부피를 점차 증가시켰다.
25일 후, 50 리터 생반응기 내로 6 ℓ의 스피너 배양물을 접종하였다. 생반응기 내에서 세포를 증식시키고, 세포 수가 증가함에 따라, 새로운 배지를 첨가하여 부피를 점차 증가시켰다.
최종적으로, 50 ℓ의 종자 배양물을 마크로포러스 (macroporus) Cytopore 1 캐리어 (Pharmacia)를 갖는 500-리터 생산 생물반응기에 접종하고, 그 후 현탁 세포는 캐리어에 부착되었다. 배양물을 36℃에서 7.0 내지 7.1의 pH 및 포화의 50%의 DOT에서 유지하였다. 세포수가 증가함에 따라 새로운 배지를 첨가하여 생산 생물반응기내의 부피를 점차 증가시켰다. 세포밀집도가 대략 10-12 x 105세포/ml에 도달하면, 생산 단계를 시작하고 매 24시간마다 배지 교환을 수행하였다: 세포-함유 캐리어의 침강을 허용하도록 교반을 중지하고, 80%의 배양 상청액을 수확하고 새로운 배지로 대치하였다. 수확한 배양 상청액을 여과하여 부착되지 않는 세포 (즉, 캐리어에 고정되지 않은 세포)를 제거한 후 다음 프로세싱을 위해 옮겼다.
생산 단계 도중에 세포는 2 내지 3 x 107세포/ml 및 8 mg 인자 Ⅶ/리터의 적정농도에 도달하였다.
실시예 2
FⅦ발현 CHO-K1 세포와 FⅦ 및 유리 FⅦ 프로펩티드를 공동발현하는 세포의 비교
실시예 1에서 설명한 것과 같이, CHO-K1 세포를 pLN174 및 1)빈 pcDNA3.1+ 벡터 또는 2) pcDNA3.1+ 내의 FⅦ 프로펩티드로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션체의 풀은 FⅦ 발현 및 세포 수에 대하여 분석하였다. FⅦ 산출량/세포/24시간은 도 3에 개설한다. 결과는 FⅦ 프로펩티드의 공동발현이 대략 1 pg/세포/일에서 4 pg/세포/일로 FⅦ 산출량을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 결과는 도 3에 나타난다.
(서열 목록)
Claims (66)
- 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 발현하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션되고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션되는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 제 1 프로펩티드 및 인간 FⅦ을 암호화하는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 발현하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션되고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션되는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 4 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 프로트롬빈, 인자 Ⅸ, FⅦ, 인자 Ⅹ, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 프롤린-풍부 Gla 단백질 1, 또는 매트릭스 Gla 단백질로부터 독립적으로 선택되는 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 발현 유닛에서 감마-글루타밀 카르복실라제를 암호화하는 그 이상의 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션되는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프로펩티드는 화학식:X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17의 아미노산 서열을 포함하는데,여기에서 X1, X4, X5, X6, X7, X9, X10및 X13은 G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S, 및 T로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X2, X3,X11및 X12는 V, L, P, N, A, I, S, F, M, W, Q, T 및 Y로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X8은 G 및 A로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X14, X15, X16및 X17은 R, H, A, T, W, L, I, V, Q, K, Y, P로부터 독립적으로 선택되거나 또는 없는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프로펩티드는 1 mM 미만의 Ki 및, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유리 프로펩티드는 화학식:X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17의 아미노산 서열을 포함하는데,여기에서 X1, X4, X5, X6, X7, X9, X10및 X13은 G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S, 및 T로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X2, X3, X11및 X12는 V, L, P, N, A, I, S, F, M, W, Q, T 및 Y로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X8은 G 및 A로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X14, X15, X16및 X17은 R, H, A, T, W, L, I, V, Q, K, Y, P로부터 독립적으로 선택되거나 또는 없는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유리 프로펩티드는 1 mM 미만의 Ki 및, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유리 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유동물세포인 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 14 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 14 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 BHK 세포, HEK 세포, COS 세포, 또는 CHO 세포로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
- a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 FⅦ 또는그것의 변체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, FⅦ 또는 그것의 변체를 생산하기 위한 방법.
- a) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 제 1 항 내지 제 3 항, 제 7 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따르는 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, FⅦ 또는 그것의 변체를 생산하기 위한 방법.
- a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하고 활성화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, FⅦ 또는 그것의 변체를 생산하기 위한 방법.
- a) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 제 1 항 내지 제 3 항, 제 7 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따르는 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하고 활성화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, FⅦ 또는 그것의 변체를 생산하기 위한 방법.
- 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 제 1 프로펩티드 및 인간 FⅦ을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
- a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 비타민 K-의존 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 K-의존 단백질을 생산하기 위한 방법.
- a) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 제 1 항 내지 제 3 항, 제 7 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따르는 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 배지로부터 비타민 K-의존 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 K-의존단백질을 생산하기 위한 방법.
- 제 24 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 프로트롬빈, 인자 Ⅸ, FⅦ, 인자 Ⅹ, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 프롤린-풍부 Gla 단백질 1, 또는 매트릭스 Gla 단백질로부터 독립적으로 선택되는 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 발현 유닛은 제 1 벡터 상에 존재하고 상기 제 2 발현 유닛은 제 2의 분리된 벡터 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 발현 유닛 및 상기 제 2 발현 유닛은 동일한 벡터 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프로펩티드는 화학식:X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17의 아미노산 서열을 포함하는데,여기에서 X1, X4, X5, X6, X7, X9, X10및 X13은 G, P, A, V, L, I, M, C, F,Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S, 및 T로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X2, X3, X11및 X12는 V, L, P, N, A, I, S, F, M, W, Q, T 및 Y로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X8은 G 및 A로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X14, X15, X16및 X17은 R, H, A, T, W, L, I, V, Q, K, Y, P로부터 독립적으로 선택되거나 또는 없는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프로펩티드는 1 mM 미만의 Ki 및, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유리 프로펩티드는 화학식:X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17의 아미노산 서열을 포함하는데,여기에서 X1, X4, X5, X6, X7, X9, X10및 X13은 G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S, 및 T로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X2, X3, X11및 X12는 V, L, P, N, A, I, S, F, M, W, Q, T 및 Y로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X8은 G 및 A로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X14, X15, X16및 X17은 R, H, A, T, W, L, I, V, Q, K, Y, P로부터 독립적으로 선택되거나 또는 없는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유리 프로펩티드는 1 mM 미만의 Ki 및, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유리 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지는 무혈청배지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 BHK 세포, HEK 세포, COS 세포, 또는 CHO 세포로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 발현 유닛에서 유리 프로펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 42 항에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 프로펩티드 및 인간 FⅦ을 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 44 항에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 프로트롬빈, 인자 Ⅸ, FⅦ, 인자 Ⅹ, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 프롤린-풍부 Gla 단백질 1, 또는 매트릭스 Gla 단백질로부터 독립적으로 선택되는 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 41 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프로펩티드는 화학식:X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17의 아미노산 서열을 포함하는데,여기에서 X1, X4, X5, X6, X7, X9, X10및 X13은 G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S, 및 T로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X2, X3, X11및 X12는 V, L, P, N, A, I, S, F, M, W, Q, T 및 Y로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X8은 G 및 A로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X14, X15, X16및 X17은 R, H, A, T, W, L, I, V, Q, K, Y, P로부터 독립적으로 선택되거나 또는 없는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 41 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프로펩티드는 1 mM 미만의 Ki 및, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 41 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 41 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유리 프로펩티드는 화학식:X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17의 아미노산 서열을 포함하는데,여기에서 X1, X4, X5, X6, X7, X9, X10및 X13은 G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S, 및 T로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X2, X3, X11및 X12는 V, L, P, N, A, I, S, F, M, W, Q, T 및 Y로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X8은 G 및 A로부터 독립적으로 선택되고 여기에서 X14, X15, X16및 X17은 R, H, A, T, W, L, I, V, Q, K, Y, P로부터 독립적으로 선택되거나 또는 없는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 41 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유리 프로펩티드는 1 mM 미만의 Ki 및, SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 서열과 적어도 30%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 41 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유리 프로펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 41 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제 41 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- a) 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 진핵 숙주 세포를 트랜스펙션하는 단계 및 b) 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, FⅦ 또는 이것의 유사체를 생산하는 진핵 숙주 세포를 제조하기 위한 방법.
- 제 54 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 감마-글루타밀 카르복실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 더욱 트랜스펙션되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 54 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 제 41 항 내지 제 43 항, 제 46 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 따른 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
- a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 FⅦ 또는 그것의 변체.
- a) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 제 1 항 내지 제 3 항, 제 7 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따르는 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 FⅦ 또는 그것의 변체.
- a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 제 1 프로펩티드 및 FⅦ 또는 이들의 변체를 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하고 활성화하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 FⅦa 또는 그것의 변체.
- a) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 제 1 항 내지 제 3 항, 제 7 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따르는 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 배지로부터 FⅦ 또는 그것의 변체를 분리하고 활성화하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 FⅦa 또는 그것의 변체.
- 제 57 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 제 1 프로펩티드 및 인간 FⅦ을 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 FⅦ 또는 그것의 변체.
- a) 진핵 숙주 세포를 제 1 발현 유닛에서 재조합 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하고 제 2 발현 유닛에서 제 2 유리 프로펩티드를 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션하여 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 생산하는 단계; b) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 공동-트랜스펙션된 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 c) 배지로부터 비타민 K-의존 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 비타민 K-의존 단백질.
- a) 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 허용하는 조건 하에서 제 4 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따르는 진핵 숙주 세포를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 배지로부터 비타민 K-의존 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 비타민 K-의존 단백질.
- 제 62 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 프로트롬빈, 인자 Ⅸ, FⅦ, 인자 Ⅹ, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 프롤린-풍부 Gla 단백질 1, 또는 매트릭스 Gla 단백질로부터 독립적으로 선택되는 제 1 프로펩티드 및 비타민 K-의존 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 비타민 K-의존 단백질.
- 제 57 항 내지 제 58 항, 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 제 19 항 내지 제 21 항, 제 23 항, 제 27 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 따르는 것을 특징으로 하는 제조합 FⅦ 또는 그것의 변체.
- 제 62 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 제 24 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 따르는 것을 특징으로 하는 재조합 비타민 K-의존 단백질.
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