CZ2003718A3 - Glykoformy faktoru VII - Google Patents
Glykoformy faktoru VII Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2003718A3 CZ2003718A3 CZ2003718A CZ2003718A CZ2003718A3 CZ 2003718 A3 CZ2003718 A3 CZ 2003718A3 CZ 2003718 A CZ2003718 A CZ 2003718A CZ 2003718 A CZ2003718 A CZ 2003718A CZ 2003718 A3 CZ2003718 A3 CZ 2003718A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- factor vii
- polypeptides
- preparation
- oligosaccharide chains
- factor
- Prior art date
Links
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 title claims abstract description 254
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 title claims abstract description 253
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 title claims abstract description 248
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 63
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 158
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 145
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 144
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 142
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims description 129
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 56
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims description 37
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 35
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 34
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims description 25
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims description 23
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 claims description 23
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 claims description 23
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 claims description 22
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims description 22
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 19
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 19
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 19
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 18
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 16
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 12
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 12
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 11
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 11
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 8
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 8
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 7
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 7
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 6
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 6
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 claims description 6
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 5
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037487 Endotoxemia Diseases 0.000 claims description 4
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N N-glycoloyl-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(NC(=O)CO)C(O)CC(=O)C(O)=O SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 claims description 4
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 claims description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 4
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 claims description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 4
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 3
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007386 factor VII deficiency Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007219 factor XI deficiency Diseases 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 3
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 claims description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 4
- 208000032759 Hemolytic-Uremic Syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 201000007023 Thrombotic Thrombocytopenic Purpura Diseases 0.000 claims 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 claims 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims 1
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 claims 1
- FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N N-glycoloyl-beta-neuraminic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-AJKRCSPLSA-N 0.000 claims 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 150000001508 asparagines Chemical class 0.000 abstract 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 37
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 36
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 6
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical group OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 5
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 3
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- -1 N-acetylglucosamine oligosaccharide Chemical class 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 3
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229940099816 human factor vii Drugs 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 2
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 206010001053 acute respiratory failure Diseases 0.000 description 2
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 2
- NIGUVXFURDGQKZ-UQTBNESHSA-N alpha-Neup5Ac-(2->3)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc Chemical group O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@]3(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O NIGUVXFURDGQKZ-UQTBNESHSA-N 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007999 glycylglycine buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 208000009852 uremia Diseases 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 1
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000022852 Letis Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- YTTRPBWEMMPYSW-HRRFRDKFSA-N N(4)-(beta-N-acetyl-D-glucosaminyl)-L-asparagine Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1NC(=O)C[C@H]([NH3+])C([O-])=O YTTRPBWEMMPYSW-HRRFRDKFSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000035071 co-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000002446 fucosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O1)C)* 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000017570 negative regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Předmětný vynález se vztahuje k prostředkům, které obsahují faktor VII a jiné faktory srážení krve, které mají pozměněné profily N-glykosylace.
Dosavadní stav techniky
U proteinů, které jsou součástí kaskády srážení krve včetně např. faktoru VII, faktoru VIII, faktoru IX, faktoru X a proteinu C, se prokazuje, že jsou užitečnými terapeutickými činidly určenými pro léčbu řady patologických stavů. Proto tedy stále roste potřeba mít k dispozici formulace obsahující tyto proteiny, které by byly farmaceuticky přijatelné a které by vykazovaly jednotné a předem stanovené klinické účinky.
Vzhledem k řadě nevýhod při použití lidské plasmy jakožto zdroje farmaceutických produktů je výhodnější vyrábět tyto proteiny v rekombinantních systémech. Koagulační proteiny jsou však předmětem řady kotranslačních a posttranslačních modifikací včetně např. glykosylace přes asparagin (N-glykosylace); O-glykosylace a γ-karboxylace glukosových zbytků. Tyto modifikace mohou být v případě, že jsou jako hostitelé pro produkci proteinů ve velkém měřítku použity heterologní buňky, kvalitativně nebo kvantitativně různé. Konkrétně, výsledkem produkce v heterologních buňkách je často různé seskupení glykoforem, které jsou identickými polypeptidy s různě kovalentně vázanými oligosacharidovými strukturami.
U různých systémů byly variace v oligosacharidové struktuře terapeutických proteinů vázány mimo jiné na změny v imunogenitě a in vivo vymizení (clearance). Proto jsou v této oblasti techniky potřebné takové prostředky a způsoby, které poskytují preparáty koagulační ch proteinů, konkrétně preparáty obsahující rekombinantní lidský faktor VII, modifikovaný faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII, které obsahují předem určené profily glykoforem.
• · · · · « • * ···· ·· · · · · • · · · · · • · · · · · · · · · • · · · · · · ·· · ·· ·· ···
Podstata vynálezu
Předmětný vynález se vztahuje k preparátům obsahujícím póly peptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII, které vykazují předem určené profily glykoforem. Preparát faktoru VII nebo preparát příbuzný faktoru VII se vztahuje k více polypeptidům faktoru VII nebo polypeptidům příbuzným faktoru VII včetně variant a chemicky modifikovaných forem i k formám, které byly proteolyticky aktivovány (např. faktor Víla), které byly separovány z buňky, v níž byly syntetizovány. Profil glykoforem se vztahuje k distribuci oligosacharidových řetězců s různými strukturami, které jsou kovalentně vázané na polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII, v preparátu.
Z jednoho hlediska poskytuje vynález preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, přičemž polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a platí jeden nebo více následujících bodů: (i) mezi asi 94 až 100 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové; (ii) mezi asi 0 až 7 % oligosacharidových řetězců má neutrální náboj; (iii) méně než asi 16 %, jako např. mezi asi 6 až 16 %, oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální zbytek galaktosy; (iv) méně než asi 25 %, jako je např. mezi asi 6 až 9 %, oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální zbytek N- acetylgalaktosaminu; nebo (v) méně než asi 30 %, jako např. mezi asi 11 až 23 %, oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jednu terminální galaktosu nebo zbytek N-acetylgalaktosaminu. V některých provedeních kromě jednoho nebo více bodů (i) až (v) ještě platí: všechny zbytky kyseliny sialové jsou v oligosacharidových řetězcích vázány na galaktosu prostřednictvím vazby a2->3; alespoň některý ze zbytků kyseliny sialové obsahuje kromě N-acetylneuraminové kyseliny (Neu5Ac) N-glykolylneuraminovou kyselinu (Neu5Gc); a/nebo oligosacharidové řetězce obsahují zbytky fukosy vázané vazbou al->6 na jaderný N-acetylglukosamin. V jednom provedení vynález zahrnuje preparát obsahující divoký faktor Vila, v němž má mezi asi 94 až 100 % oligosacharidových řetězců alespoň jeden zbytek kyseliny sialové a všechny zbytky kyseliny sialové jsou vázány na galaktosu prostřednictvím vazby α2->3. V jiném provedení vynález zahrnuje preparát obsahující divoký faktor Vila, v němž má mezi asi 94 až 100 % oligosacharidových řetězců alespoň jeden zbytek kyseliny sialové a alespoň některý ze zbytků kyseliny sialové je N-glykolylneuraminová kyselina. V ještě jiném provedení vynález zahrnuje preparát obsahující divoký faktor Vila, v němž má mezi asi 94 až 100 % oligosacharidových řetězců alespoň jeden zbytek kyseliny sialové a alespoň některé z řetězců obsahují N-acetylgalaktosamin. Preparáty podle předmětného vynálezu tedy nezahrnují • · · · ·· ···· · · • · · · · · * • ···· · · · · · · • · · · · · · · « • · · ·· · · ♦ « · · · · · · · · · · · ·* ·· divoký faktor VII nebo faktor Vila, který byl isolován z lidské plasmy a nebyl modifikován ex vivo působením glykosidas.
Z jiného hlediska vynález poskytuje preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, přičemž polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a alespoň asi 2 % oligosacharidových řetězců obsahují alespoň jednu íukosu vázanou vazbou al->3 na vyčnívající zbytek N-acetylglukosaminu (tzn. zbytek N-acetylglukosaminu, který je vázán vazbou β1->2,4 nebo 6 na zbytek manosy). Výhodněji alespoň asi 5 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden takto vyčnívající zbytek (anténu) fukosy; ještě výhodněji alespoň asi 10 % nebo 20 % a nejvýhodněji alespoň asi 40 %.
Preparáty podle vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více nemodifikovaných divokých faktorů VII; divoký faktor VII, který byl podroben chemické a/nebo enzymové modifikaci a varianty faktoru VII, které mají v porovnání s divokým faktorem VII jednu nebo více změn v aminokyselinové sekvenci. Preparáty podle vynálezu mohou pocházet z lidských buněk, které exprimují faktor VII z endogenního genu faktoru VII nebo z buněk naprogramovaných na exprimování faktoru VII nebo polypeptidu příbuzného faktoru VII z rekombinantního genu.
Z jiného hlediska vynález poskytuje preparáty obsahující faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII, které vykazují jednu nebo více lepších funkčních vlastností včetně, aniž by tím však byly jakkoliv limitovány, zvýšené stability při skladování, biodostupnosti a/nebo poločasu rozpadu.
Z jiného hlediska vynález zahrnuje způsoby stanovení a/nebo optimalizace profilu glykoforem faktoru VII a polypeptidů příbuzných faktoru VII, které jsou prováděny v následujících krocích;
(a) kultivace buňky exprimující faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII za předem definovaných kultivačních podmínek, označených jako sada 1 (b) získání faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII z kultury s cílem získat preparát obsahující polypeptidy; a (c) analýza struktury oligosacharidů vázaných na polypeptidy s cílem stanovit profil glykoforem preparátu.
Způsoby mohou dále zahrnovat pozměnění kultivačních podmínek kroku (a) s cílem dosáhnout předem definovaných kultivačních podmínek označených jako sada 2; a opakování kroků tak dlouho dokud není dosaženo požadovaného profilu glykoforem. Někdy mohou způsoby zahrnovat ještě ošetření preparátu chemicky nebo enzymově, jehož cílem je pozměnit oligosacharidovou strukturu; a opakování kroků tak dlouho dokud není dosaženo požadovaného profilu glykoforem. Kromě toho mohou způsoby zahrnovat další kroky, během nichž jsou • · · · • · • · · · • · • · · · ··· · · · · · • ···· · ···· · · · preparáty s předem určenými profily glykoforem podrobeny alespoň jednomu testu bioaktivity nebo jiné funkčnosti (jako je např. farmakokinetický profil nebo stabilita) a porovnání konkrétních profilů glykoforem s konkrétní bioaktivitou nebo funkčními profily.
Z jiného hlediska poskytuje vynález způsoby přípravy preparátu obsahujícího polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII s předem určeným profilem N-glykosylace. V některých provedeních jsou způsoby provedeny pomocí kultivace buňky exprimující polypeptidy za takových podmínek, za nichž alespoň asi 94 % oligosacharidů vázaných přes asparagin na polypetidy faktoru VII nebo na polypeptidy příbuzné faktoru VII obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové např. jeden, dva, tři nebo čtyři zbytky kyseliny sialové. V některých provedeních jsou způsoby provedeny pomocí kultivace buňky exprimující polypeptidy za takových podmínek, za nichž alespoň asi 5 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jednu fukosu vázanou vazbou al->3 na vyčnívající zbytek N-acetylglukosaminu. V některých provedeních jsou polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII, bez ohledu na jejich zdroj, podrobeny působení enzymů za účelem dosažení požadovaných profilů glykoforem.
Z jiného hlediska vynález poskytuje farmaceutické formulace obsahující preparáty podle vynálezu a způsoby prevence a/nebo léčby syndromů, které jsou vyvolány odezvou na polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII. Způsoby zahrnují podávání farmaceutických formulací pacientovi, který potřebuje léčbu, za takových podmínek, jejichž výsledkem je buď zvýšení nebo inhibice srážení krve. V jedné skupině provedení jsou preparáty faktoru VII podávány tehdy, je-li žádoucí zvýšit srážení krve, jako např. u hemofilie A, hemofilie B, nedostatku faktoru XI, nedostatku faktoru VII, trombocytopenii nebo u Willebrandovy choroby; u syndromů vyvolaných přítomností inhibitoru koagulačního faktoru; před, během nebo po operaci nebo antikoagulační terapii; nebo po úrazu. V jiné skupině provedení jsou preparáty polypeptidů příbuzných faktoru VII (tzn. preparátů, které mají v porovnání s divokým faktorem VII sníženou nebo modifikovanou bioaktivitu) podávány s cílem snížit srážení krve, jako např. u pacientů, kteří podstoupili angioplastiku nebo u těch, kteří trpí trombózu hlubokých žil, prodělali plicní embolii, cévní mozkovou příhodu, trpí disiminovanou intravaskulámí koagulací (DIC), ukládáním fibrinu v plicích a ledvinách spojeným s gramnegativní endotoxemií nebo kteří prodělali infarkt myokardu. Podle vynálezu mohou být preparáty polypeptidů příbuzných faktoru VII podávány také tehdy, je-li žádoucí modifikovat, jako např. snížit, intracelulámí signalizaci prostřednictvím cesty zprostředkované tkáňovým faktorem (TF) za účelem léčby stavů jako je syndrom akutního respiračního selhání (ARDS), ·· ···· · · ···· ·· ···· ··· · · · · « · • ···· · ···· · < * ·· ···· · · · · · ·· · ·· · · · ♦ · ····· ····· ·· · · syndrom systémové zánětlivé odpovědi (SIRS), syndrom hemolytické urémie (HUS), multiorgánové selhání (MOF) a trombocytopenie purpura (TTP).
Autoři předmětného vynálezu objevili, že preparáty koagulačních proteinů, které mají předem určený profil glykoforem, vykazují zlepšené funkční vlastnosti. Proto se tedy předmětný vynález vztahuje ke způsobům a prostředkům, které tyto proteinové preparáty poskytují. Konkrétně se vynález vztahuje k preparátům obsahujícím polypeptidy faktoru VII a polypeptidy příbuzné faktoru VII, které mají specifické předem definované profily oligosacharidů vázaných přes asparagin (N-vázané). Preparáty podle vynálezu vykazují pozměněné vlastnosti včetně, avšak aniž by tím byly limitovány, zlepšených farmakokinetických vlastností a zlepšených klinických účinků. Vynález také zahrnuje farmaceutické formulace, které obsahují tyto preparáty a léčebné způsoby, které tyto formulace využívají.
Polypeptidy faktoru VII a polypeptidy příbuzné faktoru VII
Předmětný vynález zahrnuje polypeptidy lidského faktoru VII jako např. ty polypeptidy, které mají aminokyselinovou sekvenci odhalenou v US patentu č. 4 784 950 (divoký faktor VII). Zde používaný termín faktor VII nebo polypeptid faktoru VII zahrnuje divoký faktor VII i varianty faktoru VII vykazující v podstatě stejnou nebo lepší biologickou aktivitu než divoký faktor VII. Termín faktor VII by měl zahrnovat polypeptidy faktoru VII v jejich neštěpené formě (zymogeny) i ty, které byly proteolyticky zpracovány za vzniku příslušných bioaktivních forem, které mohou být označeny jako faktor Vila. Faktor VII je většinou štěpen mezi zbytky 152 a 153 za vzniku faktoru Vila.
Zde používaný termín polypeptidy příbuzné faktoru VII zahrnuje polypeptidy včetně variant, u nichž byla biologická aktivita faktoru Vila v porovnání s aktivitou divokého faktoru Vila podstatně modifikována nebo snížena. Tyto polypeptidy zahrnují, avšak aniž by tím byly limitovány, faktor VII nebo faktor Vila, který byl chemicky modifikován a varianty faktoru VII, do nichž byly začleněny specifické změny aminokyselinové sekvence, které modifikují nebo narušují bioaktivitu polypeptidu.
Biologická aktivita faktoru Vila při srážení krve pochází z jeho schopnosti (i) vázat tkáňový faktor (TF) a (ii) katalyzovat proteolytické štěpem faktoru IX nebo faktoru X za vzniku aktivovaného faktoru IX nebo X (faktor IXa nebo Xa). Pro účely vynálezu může být biologická aktivita faktoru Vila kvantifikována prostřednictvím měření schopnosti preparátu podporovat srážení krve za pomoci plasmy s nedostatečným obsahem faktoru VII a tromboplastinu, což je popsáno např. v US patentu č. 5 997 864. U tohoto stanovení je biologická aktivita vyjadřována • · · · • · fc · • ···· * r- ·· ·* • · · · O r. · « • · · · 6 « · -'*«· ····· ····· · <- · · jako snížení doby koagulace v porovnání s kontrolním vzorkem a je přepočítávána na jednotky faktoru VII tak, že je porovnána se standardem lidského séra obsahujícím aktivitu faktoru VII 1 jednotka/ml. Biologická aktivita faktoru Vila může být také někdy kvantifikována prostřednictvím (i) měření schopnosti faktoru Vila produkovat faktor Xa v systému obsahujícím TF zabudovaný do lipidové membrány a faktor X. (Persson a kol., J. Biol. Chem. 272: 19 919 až 19 924, 1997); (ii) měření hydrolýzy faktoru X ve vodném systému (viz příklad 5 níže);
(iii) měření jeho fyzikální vazby na TF pomocí zařízení na bázi povrchové plasmonové rezonance (Persson, FEBS Letíš. 413: 359 až 363, 1997) (iv) měření hydrolýzy syntetického substrátu (viz příklad 4 níže); a (v) měření tvorby thrombinu v TF-independentním in vitro systému.
Jsou-li varianty faktoru VII, které mají v porovnání s divokým faktorem Vila v podstatě stejnou nebo lepší biologickou aktivitu, testovány jedním nebo více měřeními koagulace, proteolýzy nebo vazby TF, pak mezi ně patří ty, které vykazují alespoň asi 25 %, výhodněji alespoň asi 50 %, ještě výhodněji alespoň asi 75 % a nejvýhodněji alespoň asi 90 % specifické aktivity divokého faktoru Vila, který byl produkován ve stejném typu buněk. Varianty faktoru VII, které mají v porovnání s divokým faktorem Vila podstatně sníženou biologickou aktivitu, jsou takové, které vykazují menší než asi 25%, výhodněji menší než asi 10%, ještě výhodněji menší než asi 5% a nejvýhodněji menší než asi 1% specifickou aktivitu divokého faktoru Vila, který byl produkován ve stejném typu buněk a to v případě, jsou-li testovány jedním nebo více měřeními koagulace, proteolýzy nebo vazby TF, což je popsáno výše. Varianty faktoru VII, které mají v porovnání s divokým faktorem Vil podstatně modifikovanou biologickou aktivitu, zahrnují, aniž by tím však byly limitovány, takové varianty faktoru VII, které vykazují TF-independentní proteolytickou aktivitu faktoru X a ty, které vážou TF, ale neštěpí faktor X.
Varianty faktoru Vil vykazující v podstatě stejnou nebo lepší bioaktivitu než divoký faktor VII nebo eventuelně vykazující podstatně modifikovanou nebo sníženou bioaktivitu v porovnání s divokým faktorem Vil zahrnují, aniž by tím však byly jakkoliv limitovány, polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí, která se liší od sekvence divokého faktoru VII inzercí, delecí nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin. Nelimitujícími příklady variant faktoru VII, které mají v podstatě stejnou biologickou aktivitu jako divoký faktor VII, zahrnují S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (lino a kol., Arch. Biochem. Biophys. 352:182 až 192, 1998); varianty FVHa vykazující zvýšenou proteolytickou stabilitu jako je odhaleno v US patentu 5 580 560; faktor Vila, který byl proteolyticky naštěpen mezi zbytky 290 a 291 nebo mezi zbytky 315 a 316 (Mollerup a kol., Biotechnol. Bioeng. 48:501 až 505, 1995); a oxidované formy faktoru Vila (Komfelt a kol., Arch. Biochem. Biophys. 363:43 až 54, 1999). Mezi nelimitující příklady variant
·· · · 4 4 4 ·
4 · 4 ·
4 4 4 4 4 »
4 4 4 4 «
4 4 4 4
44444 44 faktoru VII, které,mají v porovnání s divokým typem faktoru VII podstatně sníženou nebo modifikovanou biologickou aktivitu, patří R152E-FVIIa (Wildgoose a kol., Biochem. 29:3 413 až 3 420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama a kol., J. Biol. Chem. 270:66 až 72, 1995), FFR-FVIIa (Holst a kol., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515 až 520, 1998) a faktor Vila, který nemá Gla doménu (Nicolaisen a kol., FEBS Letts, 317:245 až 249, 1993). Nelimitující příklady chemicky modifikovaných polypeptidů faktoru VII a variant jejich sekvencí jsou popsány např. v US patentu č. 5 997 864.
Glykosylace přes asparagin
Předmětný vynález poskytuje preparáty polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, které obsahují konkrétní spektrum glykoforem faktoru VII tzn. polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, které mají předem určené profily oligosacharidových řetězců připojených přes asparagin (N-vázané).
Zde používané termíny profil N-glykosylace nebo profil glykoforem, distribuce nebo spektrum se vztahují k reprezentaci konkrétních oligosacharidových struktur v rámci dané populace polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII. Mezi nelimitující příklady těchto profilů patří relativní podíl oligosacharidových řetězců, které (i) mají alespoň jeden zbytek kyseliny sialové; (ii) neobsahují žádné zbytky kyseliny sialové (tzn. mají neutrální náboj); (iii) mají alespoň jeden terminální galaktosový zbytek; (iv) mají alespoň jeden terminální zbytek N-acetylgalaktosaminu; (v) mají alespoň jednu neobsazenou anténu tzn. mají alespoň jeden terminální zbytek galaktosy nebo N-acetylgalaktosaminu; nebo (vi) mají alespoň jednu íukosu vázanou vazbou al->3 na vyčnívající zbytek N-acetylglukosaminu.
Oligosacharidový řetězec, jak je zde používán, se vztahuje k celé oligosacharidové struktuře, která je kovalentně vázaná na jednotlivý zbytek asparaginu. Faktor VII je běžně glykosylován na Asn 145 a Asn 322. N-vázaný oligosacharidový řetězec přítomný na faktoru VII produkovaném u lidí in šitu, může obsahovat dvě, tři nebo čtyři antény, přičemž každá z nich má strukturu Neu5Ac(a2->3 nebo a2->6)Gal(pl->4)GlcNAc vázaný vazbou (β1->2,4 nebo 6) na manosový zbytek, který je vázán vazbou (al->3 nebo 6) na Man(pi->4)GlcNAc(pi->4)GlcNAc-Asn. (Neu5Ac znamená N-acetyneuraminovou kyselinu (kyselinu sialovou), Gal znamená galaktosu, GlcNac znamená N-acetylglukosamin a Man znamená manosu). Oligosacharidové řetězce mohou také obsahovat fukosové zbytky, které mohou být připojeny vazbou ccl->6 na GlcNAc. Je-li faktor VII produkován u lidí in šitu, postrádají některé oligosacharidové řetězce jaderné fukosové zbytky; všechny řetězce postrádají vyčnívající • ·· · • ···· · · ··* ·· ···* ·· • · · · · » · g ·· ··· ·· ··· ·» ·* fúkosové zbytky; a všechny řetězce jsou většinou zcela sialovány tzn. terminálním cukrem každé antény je kyselina N-acetylneuraminová vázaná na galaktosu vazbou a2->3 nebo a2->6.
Je-li však faktor VII produkován za jiných okolností, může obsahovat oligosacharidové řetězce, které mají na jedné nebo více anténách rozdílné terminální struktury jako jsou např. struktury bez zbytků kyseliny sialové; struktury, které obsahují zbytky N-glykolylneuraminové kyseliny (Neu5Gc); struktury, které obsahují na místě galaktosy terminální zbytek N-acetylgalaktosaminu (GalNAc) apod. Jestliže jsou preparáty faktoru VII produkovány např. v BHK buňkách kultivovaných v přítomnosti telecího séra, vykazují následující oligosacharidové profily:
--87 až 93 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové;
—7 až 13 % je neutrálních (nemají žádnou kyselinu sialovou);
—9 až 16 % obsahuje alespoň jeden terminální zbytek galaktosy;
—19 až 29 % obsahuje alespoň jeden terminální zbytek N-acetylgalaktosaminu; a —30 až 39 % obsahuje alespoň jednu neobsazenou anténu tzn. obsahuje alespoň jednu terminální galaktosu nebo zbytek N-acetylgalaktosaminu.
Autoři předmětného vynálezu připravili preparáty faktoru VII obsahující specifické předem určené oligosacharidové profily, které se od dříve popsaných profilů liší. Předmětný vynález zahrnuje preparáty, které obsahují polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII vykazující jeden nebo více z následujících profilů glykoforem:
(i) mezi asi 94 až 100 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové, jako je např. mezi asi 94 až 99 %, mezi asi 95 až 98 % nebo mezi asi 96 až 97 %. V různých provedeních obsahuje alespoň asi 94 %, 95 %, 96 % nebo 97 % oligosacharidových řetězců alespoň jeden zbytek kyseliny sialové.
(ii) 6 % nebo méně oligosacharidových řetězců jsou neutrální, jako je např. mezi asi 1,5 až 6 % nebo mezi asi 2 až 4 %.
(iii) méně než asi 16 %, výhodněji méně než asi 10 %, jako je např. mezi asi 6 až 10 % nebo mezi asi 8 až 9 %, oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jednu terminální galaktosu;
(iv) méně než asi 25 %, výhodněji méně než asi 10 %, jako je např. mezi asi 6 až 9 % nebo mezi asi 7 až 8 %, oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální zbytek GalNAc,;
(v) méně než asi 30, výhodněji méně než asi 25 %, jako je např. mezi asi 11 až 23 % nebo mezi asi 12 až 18 %, oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jednu neobsazenou anténu; a (vi) alespoň asi 2 %, výhodněji alespoň asi 5 %, ještě výhodněji alespoň asi 10 % nebo 20 % a nejvýhodněji alespoň asi 40 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jednu fukosu • · • · · · ··· · · * ·· » • · ··· · ···· · * · ·· ···· ·»·· * • · · ·· · · · · · ·· ··· ·· ··· ·· ·· vázanou vazbou al->3 na vyčnívající zbytek N-acetylglukosaminu (tj. zbytek N-acetylglukosaminu, který je vázán vazbou β 1 ->2,4 nebo 6 na Man zbytek).
Je zřejmé, že každý z (i) až (ví) může představovat charakteristický profil glykoforem, který je obsažen v předmětném vynálezu, tzn. preparát podle vynálezu může být popsán pouze jedním z bodů (i) až (vi). V závislosti na konkrétním profilu glykoforem může být eventuelně preparát zahrnutý ve vynálezu popsán více než jedním (i) až (vi).
Kromě toho může být preparát zahrnutý ve vynálezu popsán jedním nebo více body (i) až (vi) v kombinaci s jedním nebo více dalšími strukturními znaky. Vynález například zahrnuje preparáty, které obsahují polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII, v nichž jsou zbytky kyseliny sialové (Neu5Ac nebo Neu5Gc) vázány na galaktosu výhodně v a2->3 konfiguraci. Vynález také zahrnuje preparáty, které obsahují polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII obsahující fukosu vázanou vazbou ctl->6 na jaderný N-acetylglukosamin a/nebo fukosu vázanou vazbou al->3 na vyčnívající N-acetylglukosamin. V jedné skupině provedení zahrnují preparáty podle vynálezu faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII, v nichž více než 99 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové a (a) zbytky kyseliny sialové jsou vázány výhodně v a2->3 konfiguraci a/nebo (b) jsou zde zbytky fukosy vázané na jaderné N-acetylglukosaminy a/nebo (c) detekovatelný počet antén končí N-acetylgalaktosaminem. V jednom provedení vynález zahrnuje preparáty, které obsahují divoký faktor Vila, ve kterých více než 99 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové a zbytky kyseliny sialové jsou vázány na galaktosu výhradně v a2->3 konfiguraci. V jiném provedení vynález zahrnuje preparáty obsahující divoký faktor Víla, ve kterých více než 99 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové a alespoň některé oligosacharidové řetězce obsahují N-acetylgalaktosamin. Předmětný vynález nezahrnuje divoký faktor VII nebo divoký faktor Vila, který je isolován z lidské plasmy a není modifikován ex vivo působením glykosidas.
V jednom provedení obsahuje preparát faktoru Vila oligosacharidové řetězce, které mají jednu fukosu vázanou vazbou al->3 na jeden vyčnívající N-acetylglukosamin. V jiném provedení obsahuje preparát faktoru Vila oligosacharidové řetězce, které mají fukosové zbytky vázané vazbou al->3 na každý vyčnívající N-acetylglukosamin oligosacharidu se dvěma vyčnívajícími anténami (Sialyl Lewisova x struktura). V dalším provedení obsahuje preparát faktoru Vila oligosacharidové řetězce, které mají (i) fukosu vázanou na jaderný N-acetylglukosamin a (ii) jednu fukosu vázanou vazbou al->3 na jeden vyčnívající N-acetylglukosamin. V jiném provedení obsahuje preparát faktoru Vila oligosacharidové řetězce, které mají (i) fukosu vázanou na jaderný N-acetylglukosamin a (ii) fukosové zbytky « » » · • · » · *• ···· · * ··* • « · · » C * · • · · · « » ιθ ·· ··· ·· ··* vázané vazbou al->3 na každý vyčnívající N-acetylglukosamin oligosacharidů se dvěma vyčnívajícími anténami.
Při provádění předmětného vynálezu může být profil N-vázaných oligosacharidů stanoven pomocí způsobů, které jsou v dané oblasti techniky známé, včetně, avšak aniž by tím byly limitovány: vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC); kapilární elektroforézy (CE); nukleární magnetické rezonance (NMR); hmotnostní spektrometrie (MS) pomocí ionizačních technik jako je bombardování rychlými atomy, elektrosprej nebo nosičová laserová desorpce (MALDI); plynové chromatografie (GC) a působení exoglykosidas ve spojení s aniontovou výměnnou chromatografíi (AIE)-HPLC; gelové chromatografie (SEC) nebo MS. Viz např. Weber a kol., Anal. Biochem. 225: 135 (1995); Klausen a kol., J. Chromatog. 718: 195 (1995); Morris a kol., v Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen a kol., vyd. Marcel Dekker, (1990), str. 137 až 167; Conboy a kol., Biol. Mass Spectrom. 21: 397, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193: 554 (1990); Sutton a kol., Anal. Biochem, 318: 34 (1994); Harvey a kol., Organic Mass Spectrometry 29: 752 (1994).
Po rozlišení oligosacharidových řetězců odvozených od faktoru VII pomocí libovolného z výše uvedených způsobů (nebo jakéhokoliv jiného způsobu, kterým lze analyzovat oligosacharidové řetězce s různými strukturami) jsou analyzované druhy přiřazeny např. do jedné ze skupin (i) až (v). Relativní obsah každé (i) až (v) je vypočítán jako suma oligosachasaridů přiřazených do této skupiny ve vztahu k celkovému obsahu oligosacharidových řetězců ve vzorku.
Např. pomocí AIE-HPLC může být z preparátu rekombinantního faktoru VII produkovaného v BHK buňkách rozlišeno 13 nebo více chromatografických píků (vrcholů) N-vázaných oligosacharidů. Viz např. Klaussen a kol., Mol. Biotechnol. 9: 195, 1998. Pět chromatografických píků (označených v Klaussen a kol. jako 1 až 5) neobsahuje kyselinu sialovou, zatímco 8 píků (označených 6, 7, a 10 až 15) kyselinu sialovou obsahuje.
Je zřejmé, že v dané analýze může počet a distribuce řetězců obsahujících a neobsahujících kyselinu sialovou záviset (a) na polypeptidu, který je exprimován; (b) typu buněk a podmínkách kultivace a (c) na způsobu analýzy, která je použita a podle toho se také mohou lišit výsledné profily.
V každém případě, jestliže jsou oligosacharidy obsahující kyselinu sialovou odlišeny od oligosacharidů, které kyselinu sialovou neobsahují, jsou použity obvyklé programy na analýzu dat pro výpočet plochy pod každým chromatografickým pikem; celkové plochy píku a procenta celkové plochy píku reprezentované konkrétním pikem. Tímto způsobem a pro daný konkrétní preparát dává suma ploch píků obsahujících kyselinu sialovou/celková plocha píku x 100 • · φ · · · »« φ φ « φ · * .-.• * φ φ · ‘ * • · · · · φ · · · · φ φ φ φ φ φ * · * φ · φφφ φ «
..... ·· ·*· hodnotu % sialylace pro preparát podle předmětného vynálezu (tzn. podíl oligosacharidových řetězců, které mají alespoň jeden zbytek kyseliny sialové). Podobným způsobem může být vypočítáno % řetězců, které neobsahují kyselinu sialovou nebo které mají alespoň jednu galaktosu nebo N-acetylglukosamin.
Způsoby přípravy preparátů faktoru VII, které mají předem určený profil N-vázaných oligosacharidů
Preparáty faktoru VII, varianty faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII, z nichž každý má předem určený profil N-vázaných oligosacharidů, mohou být připraveny pomocí vhodné hostitelské buňky, která exprimuje faktor VII a polypeptidy příbuzné faktoru VII.
Hostitelské buňky: V některých provedeních jsou hostitelskými buňkami lidské buňky exprimující endogenní gen faktoru VII. V těchto buňkách může být endogenní gen neporušený nebo mohl být modifikován in šitu nebo mohla být modifikována in šitu sekvence vně genu pro faktor VII a to za účelem pozměnit expresi endogenního genu faktoru VII. Je možno použít libovolnou lidskou buňku schopnou exprimovat endogenní gen faktoru VII.
V dalších provedeních jsou heterologní hostitelské buňky naprogramovány tak, aby exprimovaly lidský faktor VII z rekombinantního genu. Hostitelskými buňkami mohou být buňky obratlovců, hmyzu nebo plísní. Výhodněji jsou buňkami savčí buňky, které jsou schopny řady N-glykosylací; O-glykosylací a γ-karboxylací. Viz např. US patent č. 4 784 950. Mezi výhodnější savčí buněčné linie patří buněčné linie CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), ledviny mláděte křečka (BHK) a HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham a kol., J. Gen. Virol. 36:59 až 72, 1977). Výhodnější BHK buněčnou linií je tk' tsl3 BHK buněčná linie (Waechter a Baserga, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 19: 1106 až 1110, 1982), zde uváděná jako buňky BHK 570. Buněčná linie BHK 570 je dostupná ve sbírce American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, pod přístupovým ATCC číslem CRL 10314. Buněčná linie tk' tsl3 BHK je rovněž dostupná v ATCC pod přístupovým číslem CRL 1632. Kromě toho může být použita řada jiných buněčných linií včetně Rat Hep I (hepatom potkana; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (hepatom potkana; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), buňky lidských plic (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) a DUKX buňky (buněčná linie CHO) (Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA ΊΊ: 4216 až 4220, 1980). (DUKX buňky jsou také označovány jako buňky CXB11) a DG44 (buněčná linie CHO) (Cell, 33: 405, 1983, a Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555, 1986). Použít lze také 3T3 buňky, Namalwa buňky, myelomy a fuze myelomů s jinými buňkami. V konkrétně výhodnějším β · » ? » v % · · · « ··« ««» * • · 0 * * * * · ··· 9 9 «« provedení jsou hostitelskými buňkami buňky BHK 21, které byly adaptovány na růst v nepřítomnosti séra a byly naprogramovány tak, aby exprimovaly faktor VII. V některých provedeních mohou být buňkami mutantní nebo rekombinantní buňky, které exprimují kvalitativně nebo kvantitativně odlišné spektrum glykosylačních enzymů (jako např. glykosyltransferasy a/nebo glykosidasy) než typ buněk, ze kterého pocházejí. Buňky mohou být také naprogramovány tak, aby exprimovaly jiné heterologní peptidy nebo proteiny včetně např. zkrácených forem faktoru VII. V jednom provedení jsou hostitelskými buňkami buňky CHO, které byly naprogramovány tak, aby současně exprimovaly jak polypeptid faktoru VII, který je předmětem zájmu (tzn. faktor VII nebo polypeptid příbuzný faktoru VII), tak i další heterologní peptid nebo polypeptid jako např. modifikační enzym nebo fragment faktoru VII.
Způsoby: Předmětný vynález zahrnuje způsoby přípravy preparátu obsahujícího jakýkoliv profil glykoforem popsaný výše jako (i) až (iv) a v dalších provedeních pak zahrnuje způsoby optimalizace distribuce glykoforem faktoru VII a polypeptidů příbuzných faktoru VII. Tyto způsoby jsou prováděny v následujících krocích:
(a) kultivace buňky exprimující faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII za předem určených kultivačních podmínek, které tvoří sadu 1;
(b) zisk faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII z kultury s cílem získat preparát obsahující polypeptidy; a (c) analýza struktury oligosacharidů vázaných na polypeptidy s cílem určit profil glykoforem.
Způsoby mohou dále zahrnovat:
(dl) změnu kultivačních podmínek z kroku (a) s cílem dosáhnout předem určených kultivačních podmínek, které tvoří sadu 2;
(el) opakování kroků (b) až (dl) tak dlouho, dokud není dosaženo požadovaného profilu glykoforem.
Někdy mohou způsoby dále zahrnovat:
(d2) ošetření preparátu chemicky a/nebo enzymově s cílem pozměnit oligosacharidovou strukturu; a (e2) opakování kroků (b) až (d2) tak dlouho, dokud není dosaženo požadovaného profilu glykoforem.
Tyto způsoby mohou dále zahrnovat také krok, ve kterém jsou preparáty, které mají předem určené profily glykoforem, podrobeny alespoň jednomu testu bioaktivity (včetně např. srážení, proteolýzy faktoru X nebo vazby TF) nebo jiné funkčnosti (jako je např. farmakokinetický profil nebo stabilita). Konkrétní profily glykoforem jsou porovnány s
9« 99(9 « W « » · * • »99· 9 ‘ • 9 9 * » · 9 9* • · ♦ 9 » « ' * · }3 ·· ♦·* ·* ··· ·· *· konkrétními profily bioaktivity nebo funkčnosti s cílem identifikovat požadovaný profil glykoforem.
Proměnné faktory v kultivačních podmínkách, které mohou být pozměněny v kroku (dl) zahrnují, aniž by tím však byly jakkoliv limitovány: buňku původce jako je např. buňka pocházející z jiných druhů než, které byly původně použity; nebo mutantní nebo rekombinantní buňku, která se liší v jedné nebo více glykosyltransferasach nebo glykosidasach nebo v jiných složkách glykosylačního aparátu (viz Grabenhorst a kol., Glykoconjugate J. 16:81, 1999; Bragonzi a kol., Biochem. Biophys. Acta 1474: 273, 2000; Weikert, Nátuře Biotechnol. 17: 1116, 1999); hladinu exprese polypeptidů; metabolické podmínky jako je např. koncentrace glukosy nebo glutaminu; nepřítomnost nebo přítomnost séra; koncentraci vitaminu K; proteinové hydrolyzáty, hormony, stopové kovy, soli ale i procesní parametry jako je teplota, množství rozpuštěného kyslíku a pH.
Působení enzymů, které může být použito v kroku (d2) za účelem modifikovat oligosacharidový profil preparátu, zahrnuje, aniž by tím však bylo jakkoliv limitováno, působení jedné nebo více sialidas (neuraminidas), galaktosidasy, fukosidasy; galaktosyltransferasy, fukosyltransferasy a/nebo sialyltransferasy na sekvenci a za podmínek, za nichž dojde k žádoucí modifikaci v distribuci oligosacharidových řetězců, které mají konkrétní terminální struktury. Glykosyltransferasy jsou komerčně dostupné od firmy Calbiochem (La Jolla, CA) a glykosidasy jsou komerčně dostupné od firmy Glyko, lne. (Novato, CA).
V jedné skupině provedení jsou hostitelské buňky exprimující faktor VII nebo příbuzné polypeptidy podrobeny specifickým kultivačním podmínkám, v nichž uvolňují glykosylované polypeptidy faktoru VII, které mají žádoucí profil oligosacharidových struktur popsaný výše (i) až (vi). Tyto kultivační podmínky zahrnují, aniž by tím byly jakkoliv limitovány, snížení obsahu séra nebo úplnou absenci séra. Hostitelské buňky jsou výhodněji adaptovány na růst v nepřítomnosti séra a jsou kultivovány v jeho nepřítomnosti jak v růstové fázi tak i v produkční fázi. Tyto adaptační postupy jsou popsány např. v Scharfenberg a kol., Animal Cell Technology Developments to-wards the 21st Century, E.C. Beuvery a kol., (Eds.), Kluwer Academie Publishers, str. 619 až 623, 1995 (BHK a CHO buňky); Cruz, Biotechnol. Tech. 11: 117 až 120, 1997 (buňky hmyzu); Keen, Cytotechnol., YT. 203 až 211, 1995 (myelomové buňky); Berg a kol., Biotechniques 14: 972 až 978, 1993 (buňky lidské ledviny 293). Ve výhodnějším provedení neobsahuje růstové médium, které je přidáváno k buňkám, žádné proteiny nebo jiné složky, které byly isolovány z tkáně zvířat nebo z tkáňové kultury odvozené od tkáně zvířat. Viz např. příklad 1 níže. Kromě běžných složek obsahuje většinou médium vhodné pro produkci faktoru VII ·· ···· ·· ···· · * · ·» » • · · · · Λ ♦ • ···· · ···· • · ···· · · β ·· · · · · ί * “ · ·· ... .. ... ·. ..
vitamin Κ v koncentraci mezi 0,1 až 50 mg/1, což je požadavek pro γ-karboxylaci glutaminových zbytků ve faktoru VII.
V jiné skupině provedení jsou glykoformy podle vynálezu produkovány tak, že jsou preparát faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII podrobeny enzymové a/nebo chemické modifikaci obsažených N-vázaných oligosacharidů.
Preparáty faktoru VII
Zde používaný termín preparát faktoru VII se vztahuje k množství polypeptidů faktoru VII, k polypeptidům faktoru Vila nebo k polypeptidům příbuzným faktoru VII včetně variant a chemicky modifikovaných forem, které byly separovány z buňky, v níž byly syntetizovány. Separaci polypeptidů z buňky z níž pocházejí je možné provést libovolným způsobem, který je známý v dané oblasti techniky včetně, avšak aniž by tím byl jakkoliv limitován, odstranění kultivačního buněčného média obsahujícího požadovaný produkt z kultury přilnavých buněk; odstředění nebo filtrace za účelem odstranit nepřilnavé buňky apod.
Někdy mohou být polypeptidy faktoru VII dále přečištěny. Přečištění je možno dosáhnout způsoby, které jsou v dané oblasti techniky známé včetně, avšak bez omezení, afinitní chromatografie jako je např. chromatografie na koloně s protilátkou proti faktoru VII (viz např. Wakabayashi a kol., J. Biol. Chem. 261: 11 097, 1986; a Thim a kol., Biochem. 27: 7785, 1988); chromatografie s hydrofobní interakcí; ionexové chromatografie; gelové chromatografie; elektroforetických postupů (např. preparativní isolelektrická fokusace (IEF)), způsobů využívajících různé rozpustnosti (např. srážení síranem amonným) nebo extrakce apod. Viz obecně Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; a Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, vydavatelé, VCH Publishers, New York, 1989. Po přečištění preparát výhodněji obsahuje méně než asi 10 hmotn. %, ještě výhodněji méně než asi 5 hmotn. % a nejvýhodněji méně než asi 1 hmotn. % proteinů jiných než faktor VII, které pocházejí z hostitelské buňky.
Faktor VII a polypeptidy příbuzné faktoru VII mohou být aktivovány proteolytickým štěpením pomocí faktoru Xlla nebo jiných proteas, které mají specifitu podobnou trypsinu jako je např. faktor IXa, kallikrein, faktor Xa a trombin. Viz např. Osterud a kol., Biochem. 11: 2853 (1972); Thomas, US patent č. 4 456 591; a Hedner a kol., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983). Faktor VII může být také aktivován při průchodu kolonou na ionexovou chromatografií jako je MonoQ (Pharmacia) apod. Výsledný aktivovaný faktor VII může být poté formulován a podáván způsobem popsaným níže.
• · · · • · · ·
Funkční vlastnosti preparátů faktoru VII
Preparáty polypeptidů faktoru VII a polypeptidy příbuzné faktoru VII, které mají předem určený oligosacharidový profil, podle vynálezu vykazují v porovnání s referenčními preparáty zlepšené funkční vlastnosti. Mezi zlepšené funkční vlastnosti mohou patřit, aniž by tím však byly jakkoliv limitovány, a) fyzikální vlastnosti jako je např. stabilita při skladování; b) farmakokinetické vlastnosti jako je např. biodostupnost a poločas rozpadu; a c) imunogenita u lidí.
Srovnávací (referenční) preparát se vztahuje k preparátu, který obsahuje polypeptid, který je identický s polypeptidem obsaženým v preparátu podle vynálezu, s nímž má být srovnáván (jako je např. divoký faktor VII nebo konkrétní varianta nebo chemicky modifikovaná forma) kromě toho, že vykazuje jiný profil N-glykosylace. Typické referenční preparáty například obsahují jednu nebo více následujících profilů glykoforem: (i) méně než asi 93 % (jako je např. méně než asi 92 % nebo méně než asi 90 %) oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové; (ii) alespoň asi 6 % (jako je např. alespoň asi 7,5 % nebo alespoň asi 10 %) oligosacharidových řetězců neobsahuje žádnou kyselinu sialovou (tzn. jsou neutrální); (iii) alespoň asi 10 % (jako je např. alespoň asi 12,5 % nebo alespoň asi 15 %) oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální galaktosový zbytek; (iv) alespoň asi 15 % (jako je např. alespoň asi 20 % nebo alespoň asi 25 %) oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální zbytek N-acetylgalaktosaminu; (v) alespoň asi 25 % (jako je např. alespoň asi 30 % nebo alespoň asi 35 %) oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jednu neobsazenou anténu (tzn. obsahuje alespoň jednu terminální galaktosu nebo zbytek N-acetylgalaktosaminu); nebo (vi) v podstatě nedetekovatelné hladiny (jako je např. méně než asi 0,2 %) vyčnívajících fukosových zbytků
Stabilita při skladování preparátu faktoru VII může být určena měřením (a) času, který je třeba pro 20% snížení bioaktivity preparátu, je-li skladován jako suchý prášek při teplotě 25 °C a/nebo (b) času, který je třeba pro zdvojnásobení podílu agregátů faktoru Vila v preparátu.
V některých provedeních vykazují preparáty podle vynálezu nárůst o alespoň asi 30 %, výhodněji alespoň asi 60 % a ještě výhodněji alespoň asi 100 % doby, která je třeba pro 20% pokles bioaktivity v porovnání s dobou potřebnou pro stejný jev v referenčním preparátu, a to tehdy, jsou-li oba preparáty skladovány jako suché prášky při teplotě 25 °C. Měření bioaktivity mohou být provedena pomocí libovolného srážecího způsobu, měření proteolýzy, měření TF-vazby nebo měření tvorby TF-independentního trombinu.
• · · · « >
• · · · ··· ··* · * * • ···· · · · · · · » ’· • · ···· · · · » *··*·«· ., .. ..
V některých provedeních vykazují preparáty podle vynálezu nárůst o alespoň asi 30 %, výhodněji alespoň asi 60 % a ještě výhodněji alespoň asi 100 % doby, která je třeba pro dvojnásobné množství agregátů v porovnání s referenčním preparátem, a to tehdy, jsou-li oba preparáty skladovány jako suché prášky při teplotě 25 °C. Obsah agregátů je stanovován gelovou permeační HPLC na koloně Protein Pak 300 SW (7,5 x 300 mm) (Waters, 80013) následovně. Kolona je ekvilibrována eluentem A (0,2 M síran amonný, 5% isopropanol, pH je upraveno na hodnotu 2,5 kyselinou fosforečnou a poté je pH triethylaminem upraveno na hodnotu 7,0), poté je na kolonu aplikováno 25 pg vzorku. Eluce eluentem A probíhá při průtoku 0,5 ml/min po dobu 30 min. a detekce je prováděna měřením absorbance při 215 nm. Obsah agregátů je vypočítán jako plocha píku agregátů faktoru VlI/celková plocha píků faktoru VII (monomer a agregáty).
Biodostupnost se vztahuje k určitému podílu aplikované dávky faktoru VII nebo preparátu příbuzného faktoru VII, který může být detekován v plasmě v předem stanovených časech po podání. Biodostupnost je většinou měřena u testovaných zvířat pomocí aplikace dávky mezi asi 25 až 250 pg/kg preparátu; získání vzorků plasmy v předem stanovených časech po podání; a stanovení obsahu faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru Vil ve vzorcích za pomoci jednoho nebo více srážecích postupů (nebo jiné biometody), imunometody nebo ekvivalentu. Data jsou většinou zobrazena graficky jako [faktor VII] versus čas a biodostupnost je vyjádřena jako plocha pod křivkou (AUC). Relativní biodostupnost testovaného preparátu se vztahuje k poměru mezi AUC testovaného preparátu a AUC referenčního preparátu.
V některých provedeních vykazují preparáty podle vynálezu relativní biodostupnost alespoň asi 110 %, výhodněji alespoň asi 120 %, ještě výhodněji alespoň asi 130 % a nejvýhodněji alespoň asi 140 % biodostupnost! referenčního preparátu. Biodostupnost může být měřena u libovolných savčích druhů, výhodněji u psů a předem stanovené časy pro výpočet AUC mohou zahrnovat různé časy od 10 min. do 8 h.
Poločas rozpadu se vztahuje k času, který je potřeba k tomu, aby se koncentrace polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII v plasmě snížila z konkrétní hodnoty na polovinu této hodnoty. Poločas rozpadu může být stanoven pomocí stejného postupu jako v případě biodostupnosti. V některých provedeních vykazují preparáty podle předmětného vynálezu zvýšení poločasu o alespoň asi 0,25 h, výhodněji o alespoň asi 0,5 h, ještě výhodněji o alespoň asi 1 h a nejvýhodněji o alespoň asi 2 h v porovnám s poločasem referenčního preparátu.
Imunogenita preparátu se vztahuje ke schopnosti preparátu, je-li podáván člověku, vyvolat negativní imunitní odezvu a to ať humorální, buněčnou nebo obě. O polypeptidech faktoru VII a polypeptidech příbuzných faktoru VII není známo, že by vyvolávaly detekovatelné • · · · • · • · · · • · · · · · ·» ··· ·«* ♦ » * • · · · · · ···· · Λ « ·· · · · · · · · * *
..... ····· .. ..
imunitní odezvy u lidí. U kterékoliv lidské subpopulace však mohou existovat jedinci, kteří vykazují citlivost vůči konkrétním podávaným proteinům. Imunogenita může být měřena prostřednictvím kvantifikace přítomnosti protilátek proti faktoru VII a/nebo T-buněk reagujících na faktor VII u citlivých jedinců a to pomocí běžných způsobů, které jsou v dané oblasti techniky známé. V některých provedeních vykazují preparáty podle vynálezu pokles imunogenity u citlivého jedince o alespoň asi 10 %, výhodněji alespoň asi 25 %, ještě výhodněji alespoň asi 40 % a nejvýhodněji alespoň asi 50 % v porovnání s imunogenitou referenčního preparátu.
Farmaceutické prostředky a způsoby použití
Preparáty podle předmětného vynálezu mohou být použity k léčbě jakéhokoliv syndromu reagujícího na faktor VII jako je např. krvácivost včetně, aniž by tím byly jakkoliv limitovány, těch, které jsou způsobeny nedostatky koagulačních faktorů (např. hemofilie A a B nebo nedostatek koagulačních faktorů XI nebo VII); trombocytopenie nebo von Willebrandovy choroby nebo inhibitory koagulačních faktorů nebo nadměrnou krvácivosti z jakéhokoliv důvodu. Preparáty mohou být také podávány pacientům v souvislosti s operací nebo jiným úrazem nebo pacientům, kteří podstupují antikoagulační terapii.
Preparáty podle vynálezu obsahující polypeptidy příbuzné faktoru VII, které mají v porovnání s divokým faktorem VII podstatně sníženou bioaktivitu, mohou být použity jako antikoagulanty jako např. u pacientů, podstupujících angioplastiku nebo jiné operační zákroky, které mohou zvýšit riziko trombózy nebo okluze cév jako se vyskytuje např. u restenózy. Mezi další indikace, kdy jsou předepisovány antikoagulanty, patří, avšak bez omezení, trombóza hlubokých žil, plicní embolie, cévní mozková příhoda, disiminovaná intravaskulámí koagulace (DIC), ukládání fibrinu v plicích a ledvinách související s gramnegativní endotoxemií, infarkt myokardu; syndrom akutního respiračního selhání (ARDS), syndrom systémové zánětlivé odpovědi (SIRS), syndrom hemolytické urémie (HUS), multiorgánové selhání (MOF) a trombocytopenie purpura (TTP).
Farmaceutické prostředky obsahující faktor VII a preparáty příbuzné faktoru VII jsou primárně zamýšleny pro parenterální podávání za účelem profylaktického a/nebo terapeutického ošetření. Farmaceutické prostředky jsou výhodně podávány parenterálně tzn. intravenózně, subkutáně nebo intramuskulámě. Mohou být podávány prostřednictvím kontinuální nebo pulsatilní iníuze.
Farmaceutické prostředky nebo formulace obsahují preparát podle vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem výhodněji vodným nosičem nebo ředidlem. Výhodněji je • · · A ι · · » · · · · • · · • · ·
I II · « preparát v nosiči rozpuštěn. Může být použita řada vodných nosičů jako je voda, pufrovaná voda, 0,4% roztok NaCl, 0,3% glycin apod. Preparáty podle vynálezu mohou být také formulovány do liposomových preparátů za účelem jejich dopravení do míst poranění nebo zacílení na ně. Liposomové preparáty jsou obecně popsány např. v US patentech č. 4 837 028, 4 501 728 a 4 975 282. Prostředky mohou být sterilizovány běžnými dobře známými způsoby. Výsledné vodné roztoky mohou být zabaleny a určeny přímo k použití nebo mohou být za aseptických podmínek zfiltrovány a lyofilizovány, přičemž lyofilizovaný preparát je následně před použitím smíchán se sterilním vodným roztokem.
Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky nebo adjuvans včetně, avšak aniž by tím byly jakkoliv limitovány, činidel na úpravu pH a pufrovacích činidel a/nebo činidel na úpravu tonicity jako je např. acetát sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý atd.
Koncentrace faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII se v těchto formulacích může značně lišit tzn. od méně než asi 0,5 hmotn. %, obvykle je koncentrace 1 hmotn. % nebo alespoň asi 1 hmotn. %, až do koncentrace 15 až 20 hmotn. %. Koncentrace bude určena zejména objemy tekutin, viskozitami atd., v souladu se zvoleným konkrétním způsobem podání.
Typický farmaceutický prostředek určený pro intravenózní infuzi by tedy mohl být vytvořen tak, aby obsahoval 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 10 mg preparátu. Současné způsoby přípravy parenterálně podávaných prostředků budou odborníkům v dané oblasti známé nebo zřejmé a detailněji jsou popsány např. v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18.vyd., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).
Prostředky obsahující preparáty podle předmětného vynálezu mohou být podávány za účelem profylaktického a/nebo léčebného působení. Při terapeutických aplikacích jsou prostředky podávány subjektu, který již trpí onemocněním popsaným výše a to v takovém množství, které je dostatečné pro léčbu, zmírnění nebo částečné zastavení onemocnění a jeho komplikací. Množství, pomocí kterého je dosaženo tohoto cíle, je definováno jako terapeuticky účinné množství. Účinná množství pro jednotlivé účely budou záviset na závažnosti onemocnění nebo poranění, ale i na hmotnosti a celkovém stavu subjektu. Obecně je však běžně používáno účinné množství pohybující se v rozmezí od asi 0,05 mg do asi 500 mg preparátu na den pro subjekt o hmotnosti 70 kg, s dávkami od asi 1,0 mg do asi 200 mg preparátu na den. Je zřejmé, že stanovení příslušné dávky je možno provést rutinními pokusy, vytvořením matice hodnot a testováním různých bodů v matici.
• · · · • · · · • ···· · ···· · · « • W · ·· · · · · · • · ··· · · · · · · · ··
Lokální aplikace preparátů podle předmětného vynálezu jako je např. topikální aplikace může být provedena např. prostřednictvím sprejů, promývání, pomocí dvoj balónkových cévek (katetrů), stenů začleněných do cévních štěpů nebo stenů, hydrogelů používaných pro potažení balónkových katetrů nebo jiných dobře zavedených způsobů. V každém případě by farmaceutické prostředky měly poskytovat takové množství preparátu, které je dostatečné pro efektivní léčbu subjektu.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou dále obsahovat jiná bioaktivní činidla jako např. koagulanty nepříbuzné faktoru VII nebo antikoagulanty.
Následující příklady ilustrují předmětný vynález, avšak nejsou zamýšleny jako jakkoliv limitující.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 Produkce a analýza preparátu faktoru VII vykazujícího pozměněný profil glykoforem
Aby byl připraven preparát faktoru VII, který má pozměněný profil glykoforem, byl proveden následující experiment.
I. Produkce
Linie BHK buněk transformovaná plasmidem, který kóduje faktor VII, byla adaptována na růst v suspenzní kultuře v nepřítomnosti séra. Buňky byly namnoženy postupně ve třepaných kulturách a jak se zvyšoval počet buněk, byl postupně zvyšován objem a to přídavkem nového média.
Nakonec bylo 6 1 inokulační kultury zaočkováno do 100 1 bioreaktoru, který obsahoval makroporézní nosiče Cytopore 1 (Pharmacia). Suspenze buněk byla mobilizována na nosiče. Kultura byla udržována při teplotě 36 °C a při pH 6,7 až 6,9 a DO 50 %. Objem v bioreaktoru byl se zvyšujícím se počtem buněk postupně zvyšován přídavkem nového média. Jakmile koncentrace buněk dosáhla přibližně 2x106 buněk/ml, byla zahájena produkční fáze a výměna média byla prováděna každých 24 h. Třepání bylo zastaveno, aby byla umožněna sedimentace nosičů nesoucích buňky a 80 % supematantu kultury bylo poté odebráno a nahrazeno novým médiem. Odebraný supernatant kultury byl zfíltrován, aby byly odstraněny nezachycené buňky a zbytky buněk a poté byl dále zpracováván.
• · · · •··· · · ···« o · « « • · · · ► e
V průběhu produkční fáze dosáhly buňky koncentrace 3 až 6x106 buněk/ml a titru 2 až 7 mg faktoru VII/litr.
II. Analýza profilu glykoforem rekombinantního faktoru VII
Byly porovnány oligosacharidové profily těchto preparátů: (a) preparátů rekombinantního faktoru VII připravené způsobem popsaným v části I (n=7); a dvou referenčních preparátů: (b) preparátů rekombinantního faktoru VII produkovaných v BHK buňkách v přítomnosti telecího séra (n=10); a (c) preparátu faktoru VII přečištěného z lidské plasmy.
N-vázané oligosacharidy byly z polypeptidů uvolněny chemickým naštěpením (hydrazinolýza, na GlycoPreplOOO, Oxford GlycoSciences) nebo enzymovým štěpením (N-glykosidasa F např. od Boehringer Mannheim). Uvolněné oligosacharidy byly označeny 2-aminobenzamidem (pomocí signální soupravy pro značení, K-404, Oxford Glycosciences nebo Glyko). Označené oligosacharidy byly analyzovány pomocí aniontové HPLC chromatografie na koloně CarboPac PA100 (4x250 mm, Dionex, P/N 43055) a předkolony (4x 50 mm, Dionex, P/N 43054). Kolona byla ekvilibrována 150 mM hydroxidem sodným a eluována byla gradientem acetátu sodného 0 až 150 mM, 150 mM hydroxidem sodným. Oligosacharidy byly detekovány fluorescenčně s excitací při 330 nm a emisí při 420 nm.
Relativní obsahy různých oligosacharidových struktur faktoru VII (Klausen a kol., 1998) byly vypočítány jako relativní plochy píků sacharidů po aniontové HPLC analýze. Na základě strukturních prvků každého oligosacharidů byl určen jeden z následujících znaků: (i) řetězce obsahující alespoň jednu kyselinu sialovou; (ii) řetězce, které neobsahují žádnou kyselinu sialovou (tzn. neutrální); (iii) řetězce obsahující alespoň jeden terminální galaktosový zbytek; (iv) řetězce obsahující alespoň jeden terminální zbytek N-acetylgalaktosaminu; a (v) řetězce obsahující alespoň jednu neobsazenou anténu (tzn. alespoň jednu terminální galaktosu nebo zbytek N-acetylgalaktosaminu). Nakonec byla vypočítána suma relativních obsahů oligosacharidových řetězců přiřazených do každé skupiny jako procento celkových oligosacharidových řetězců. Standardní odchylka stanovení byla vypočítána na 0,08 % (odchylka v rámci jednoho dne); 0,7 % (odchylka dne ode dne); a 0,5 % (interval 1 až 100 pg)
Výsledné profily glykoforem jsou uvedeny v následující tabulce:
·· ···« ·· ··»· ·· ···· * · · ··· ·· (k • ···· · ···· · » ·
| (i) | (ii) | (iii) | (iv) | (v) | |
| a | 93,1-98,7 | 1,3-6,9 | 5,9-16,4 | 5,9-8,7 | 11,7-23,9 |
| b | 88,3-92,5 | 7,5-12,9 | 9,4-16,8 | 19,0-28,6 | 30,1-39,0 |
| c | 99,5% | <0,5% | 2-3% | 0% | 2-3% |
Preparáty rekombinantního faktoru VII produkované podle tohoto příkladu (tzn. v nepřítomnosti séra) vykazují profil glykoforem, který se liší od profilu glykoforem rekombinantního faktoru VII produkovaného v přítomnosti séra i od nativního faktoru VII izolovaného z lidské plasmy. Oligosacharidy rekombinantního faktoru VII produkovaného v nepřítomnosti séra jsou sialovány do vyššího stupně než ty, které jsou produkovány v přítomnosti séra a obsahují méně neutrálních řetězců a méně řetězců, které končí buď galaktosou nebo N-acetylgalaktosaminem.
III. Biodostupnost
Následující experiment byl proveden proto, aby byla porovnána biodostupnost dvou preparátů faktoru VII produkovaných výše uvedeným způsobem (I a II) se dvěma referenčními preparáty faktoru VII (tzn. produkovanými v přítomnosti séra) (A a B).
Skupinám po 8 krysách byl podáván buď testovaný preparát nebo referenční preparát v dávce 25 pg/kg (~ 100 pg/krysu) v glycylglycinovém pufru (pH 7,4) obsahujícím chlorid sodný (7,87 mg/ml), chlorid vápenatý dihydrát (1,48 mg/ml), manitol (2,5 mg/ml) a polysorbát 80. Vzorky krve byly odebrány po 10 min. a po 30 min. od prvního podání preparátu. Ze vzorků byla získána plasma a faktor VII byl kvantifikován pomocí ELISA. Biodostupnost každého vzorku je vyjádřena jako plocha pod křivkou pro danou dávku vyjadřující koncentraci faktoru VII v plasmě pro 10 a 30 min. vzorky (AUCio-30/dávka). Relativní biodostupnost je vyjádřena jako poměr mezi střední hodnotou AUCio-30/dávka testovaného a referenčního vzorku x 100. Mezní hodnoty 90% spolehlivosti pro relativní biodostupnost byly vypočítány z mezních hodnot 90% spolehlivosti pro rozdíly mezi preparáty.
Výsledky jsou shrnuty v tabulce níže. (% sialylace každého preparátu, který byl měřen postupem popsaným výše, je uvedeno v závorkách).
• · • · • · · · • ·
| testovaný preparát | referenční preparát | relativní biodostupnost | 90% spolehlivost spodní hranice | 90% spolehlivost horní hranice |
| I (97,5%) | A (93%) | 128,6 | 116,1 | 141,1 |
| I (97,5%) | B (86%) | 154,9 | 141,2 | 168,5 |
| II (96,7%) | A (93%) | 117,3 | 104,8 | 129,8 |
| II (96,7%) | A (86%) | 141,2 | 127,5 | 154,8 |
Výsledky naznačují, že i relativně malé rozdíly v podílu oligosacharidových řetězců, které mají alespoň jeden zbytek kyseliny sialové, jako je např. mezi 93 % a 96 nebo 97 %, může mít znatelný vliv na biodostupnost (zvýšení o 20 až 30 %). 10% zvýšení % sialylace navíc způsobuje 40 až 50% zvýšení biodostupnosti.
Příklad 2 Analýza preparátů faktoru VII vykazujících pozměněný profil glykoforem
Faktor VII byl produkován způsobem, který je popsán v příkladu 1 avšak s tou výjimkou, že byl získán z 500 1 kultury. Analýza glykoforem byla provedena postupem, který je popsán v příkladu 1. Tři nezávislé preparáty (A, B a C) byly analyzovány a porovnány s referenčním preparátem (D).
Biodostupnost byla měřena na modelovém psu následovně: Experiment byl proveden formou zkřížené studie u 12 psů Beagle rozdělených do 4 skupin. Všechna zvířata dostala každý ze tří testovaných preparátů A, B a C a referenční preparát D v dávce 90 pg/kg v glycylglycinovém pufru (pH 5,5) obsahujícím chlorid sodný (2,92 mg/ml), chlorid vápenatý dihydrát (1,47 mg/ml), manitol (30 mg/ml) a polysorbát 80. Vzorky krve byly odebrány po 10, 30 a 60 min. a po 2, 3, 4, 6 a 8 h od prvního podání preparátu. Ze vzorků byla získána plasma a faktor VII byl kvantifikován pomocí ELISA.
Biodostupnost každého vzorku je vyjádřena jako plocha pod křivkou pro danou dávku vyjadřující koncentraci faktoru VII v plasmě (AUC/dávka). Relativní biodostupnost je vyjádřena jako poměr mezi střední hodnotou AUC/dávka testovaného a referenčního vzorku x 100. Mezní hodnoty 90% spolehlivosti pro relativní biodostupnost byly vypočítány.
» » • · · · • · · ·
Výsledky jsou shrnuty v tabulce níže. % sialylace každého preparátu, který byl měřen postupem popsaným v příkladu 1 výše, je uvedeno v závorkách.
| testovaný preparát | referenční preparát | relativní biodostupnost | 90% spolehlivost spodní hranice | 90% spolehlivost horní hranice |
| A (98,7%) | D (88,2%) | 144 | 135 | 153 |
| B (95,9%) | D (88,2%) | 127 | 119 | 136 |
| C (93,1%) | D (88,2%) | 112 | 105 | 120 |
Výsledky naznačují, že malé rozdíly v podílu oligosacharidových řetězců, které mají alespoň jeden zbytek kyseliny sialové, mají znatelný vliv na biodostupnost faktoru VII. 10% zvýšení % sialylace způsobuje 30 až 50% zvýšení biodostupnosti, přičemž vzájemný vztah mezi třemi testovanými preparáty a referenčním preparátem je téměř lineární.
Příklad 3 Preparáty faktoru VII vykazující pozměněné profily glykoforem
Za účelem vyrobit preparát faktoru VII, který má pozměněný profil glykoforem, byl proveden následující experiment.
I. Konstrukce buněčné linie a produkce faktoru VII
Plasmidový vektor pLN174 pro expresi lidského FVII byl již popsán (Persson a Nielsen. 1996. FEBS Lett. 385: 241 až 243. Krátce, vektor nese nukleotidovou sekvenci cDNA kódující lidský FVII včetně propetidu pod kontrolou myšího metalothioneinového promotoru pro transkripci inzertované cDNA a myší dihydrofolátreduktasovou cDNA pod kontrolou ranného promotoru SV40 pro selektivní označení.
Pro konstrukci plasmidového vektoru kódujícího γ-karboxylační rozpoznávací sekvenci byl použit klonovací vektor (pBluescript II KS+, Stratagene) obsahující cDNA kódující FVII včetně jeho propeptidu (pLN171). (Persson a kol., 1997. J. Biol. Chem. 272: 19 919 až 19 924). Nukleotidová sekvence kódující stop kodón byla inzertována do cDNA kódující FVII za propeptid FVII a to reverzní mutací zprostředkovanou PCR za pomoci tohoto klonovacího ···· · * ♦· ♦· « · ··«· ··· ··· · · * • ···· · ···· · · · «· · · · · · · · ·
..... ..... .. ..
vektoru. Templátový plasmid byl denaturován působením NaOH, následovala PCR s Pwo (Boehringer-Mannheim) a Taq (Perkin-Elmer) polymerasami s následujícími primery:
a) 5 -AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3'
b) 5 -CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC-3'
Výsledná směs byla naštěpena restrikčním enzymem DpnI, aby byla naštěpena zbytková templátová DNA a PCR produktem byla transformována Escherichia coli. U klonů byla pomocí sekvenování testována přítomnost mutace. cDNA ze správného klonu byla převedena jako fragment BamHI-EcoRI do expresního plasmidu pcDNA3 (Invitrogen). Výsledný plasmid byl označen jako pLN329. Buňky CHO KI (ATCC CCI61) byly transfekovány stejnými množstvími pLN174 a pLN329 pomocí způsobu Fugeneó (Boehringer-Mannheim). Transfektanty byly selektovány přídavkem metotrexátu do koncentrace 1 μΜ a G-418 do koncentrace 0,45 mg/ml. Nashromážděné transfektanty byly klonovány limitovaným ředěním a byla měřena exprese FVII z klonů.
Vysokoprodukční klon byl dále subklonován a byl vybrán klon Eli se specifickou expresí FVII 2,4 pg/buňku/den v modifikovaném Dulbecco Eaglově médiu obohaceném o 10% zárodečné telecí sérum. Klon byl přizpůsoben suspenzní kultuře bez séra v komerčně dostupném CHO médiu (JRH Bioscience), které neobsahovalo žádné složky zvířecího původu.
Přizpůsobené buňky byly postupně namnoženy v třepaných kulturách a s tím jak se zvyšoval počet buněk byl postupně zvyšován objem a to přídavkem nového média. Po 25 dnech bylo 6 1 kultury zaočkováno do 50 1 bioreaktoru. Buňky byly namnoženy v bioreaktoru a protože se zvyšoval počet buněk, byl postupně zvyšován objem kultury a to přídavkem nového média.
Nakonec bylo 50 1 této inokulační kultury zaočkováno do 500 1 produkčního bioreaktoru obsahujícího makroporézní nosiče Cytopore 1 (Pharmacia). Suspenze buněk byla imobilizována na nosiče. Kultura byla udržována při teplotě 36 °C, při pH 7,0 až 7,1 a při tlaku rozpuštěného kyslíku (DOT) 50% nasycení. Objem v bioreaktoru byl postupně přídavkem nového média zvyšován, protože se zvyšoval počet buněk. Jakmile hustota buněk dosáhla hodnoty přibližně 10 až 12xl05 buněk/ml, byla zahájena produkční fáze a výměna média byla prováděna každých 24 h: míchání bylo zastaveno, aby mohlo dojít k sedimentaci nosičů nesoucích buňky. Poté bylo odebráno 80 % supematantu kultury a nahrazeno novým médiem. Odebraný supematant kultury byl zfiltrován, aby byly odstraněny nezachycené buňky (tj. buňky, které nebyly imobilizovány na nosiče) a zbytky buněk a poté byl dále zpracováván.
• * · · · 1 • %
V průběhu produkční fáze dosáhla koncentrace buněk hodnot 2 až 3x107 buněk/ml a titru 8 mg faktoru VlI/litr.
II. Analýza glykoforem
A. Oligosacharidový profil preparátů faktoru VII produkovaných způsobem popsaným výše (a) byl porovnán s profily (b) tzn. preparátů rekombinantního faktoru VII produkovaných v BHK buňkách v přítomnosti telecího séra a (c) tzn. preparátu faktoru VII přečištěného z lidské plasmy. Postupy, které byly použity byly v podstatě stejné jako jsou popsány v příkladu 1.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce níže. Stanovení oligosacharidů je následující: (i) řetězce obsahující alespoň jednu kyselinu sialovou; (ii) řetězce, které neobsahují žádnou kyselinu sialovou (tzn. neutrální); (iii) řetězce obsahující alespoň jeden terminální galaktosový zbytek; (iv) řetězce obsahující alespoň jeden terminální zbytek N-acetylgalaktosaminu; a (v) řetězce obsahující alespoň jednu neobsazenou anténu (tzn. alespoň jeden terminální galaktosový zbytek nebo zbytek N-acetylgalaktosaminu).
| (i) | (ii) | (iii) | (iv) | (v) | |
| a | 95,2 | 4,8 | 22,9 | 0,1 | 23,0 |
| b | 88,3-92,5 | 7,5-12,9 | 9,4-16,8 | 19,0-28,6 | 30,1-39,0 |
| c | 99,5% | <0,5% | 2-3% | 0% | 2-3% |
B. Oligosacharidové profily 5 nezávislých preparátů faktoru VII produkovaných způsobem popsaným v tomto příkladu (a) byly pomocí analytických způsobů popsaných v příkladu 1 porovnány s profily (b) tzn. preparátů rekombinantního faktoru VII produkovaných v BHK buňkách v přítomnosti telecího séra a (c) tzn. preparátu faktoru VII přečištěného z lidské plasmy.
Podle strukturních prvků každého oligosacharidů byl zařazen do jednoho z následujících: (i) řetězce obsahující alespoň jednu kyselinu sialovou; (ii) řetězce, které neobsahují žádnou kyselinu sialovou (tzn. neutrální); (iii) řetězce obsahující alespoň jednu fukosu vázanou na anténu. Nakonec byla vypočítána suma relativních obsahů oligosacharidových řetězců přiřazených do každé skupiny jako procento všech oligosacharidových řetězců. Standardní odchylka tohoto stanovení byla vypočítána na 0,08 % (odchylka v rámci jednoho dne); 0,7 % (odchylka dne ode dne); a 0,5 % (interval 1 až 100 pg).
• · · ·
Výsledné profily glykoforem jsou uvedeny v následující tabulce:
| (i) | (ii) | (iii) | |
| a | 89,0-97,9% | 2,1-11,0% | 6,3-21,3% |
| b | 88,3-92,5% | 7,5-12,9% | 0% |
| c | 99,5% | <0,5% | 0% |
Preparáty rekombinantního faktoru VII produkované podle příkladu 1 (tzn. produkované linií buněk CHO v nepřítomnosti séra) vykazují profil glykoforem, který se liší od profilu glykoforem rekombinantního faktoru Vil produkovaného v přítomnosti séra i nativního faktoru VII izolovaného z lidské plasmy. Oligosacharidy rekombinantního faktoru VII produkovaného liní buněk CHO 282.4 v nepřítomnosti séra zahrnují struktury s fukosou vázanou na anténu, které nejsou přítomné ani v jednom referenčním preparátu. Dvě ze struktur byly přečištěny a charakterizovány hmotnostní spektrometrií MALDI, působením enzymů fukosidas specifických pro danou vazbu a aniontovou HPLC chromatografii, které jsou popsány výše. U dvou struktur bylo zjištěno, že obsahují sialyl Lewisovu x strukturu tzn. fiikosu vázanou vazbou al->3 na vyčnívající N-acetylglukosamin v sialylovaném oligosacharidu.
III. Bioaktivita
Pět preparátů faktoru Vil produkovaných způsobem popsaným v tomto příkladu bylo analyzováno z pohledu (a) tvorby trombinu a (b) vazby na tkáňový faktor (TF) a byly porovnány s rekombinantním faktorem VII produkovaným v BHK buňkách v přítomnosti séra (reference). Následující tabulka uvádí do souvislostí profily glykoforem (% oligosacharidových řetězců obsahujících kyselinu sialovou a % obsahující fukosylovanou anténu) a dvě bioaktivity.
| Preparát faktoru VII | oligosacharidový | profil | tvorba trombinu (% reference) | TF vazebná Kd (nM) |
| % sialyl | % fukosyl | |||
| 1 | 98 | 6 | 125 | 2,8 |
| 2 | 94 | 13 | 123 | 2,0 |
| 3 | 93 | 14 | 126 | 1,8 |
| 4 | 88 | 16 | 145 | 3,3 |
| 5 | 86 | 21 | 158 | 2,8 |
| reference | 86-93 | 0 | 100 | 2,2-6,6 |
Výsledky naznačují, že preparáty faktoru VII, které mají fukosylované antény, vykazují vyšší TF-independentní aktivitu faktoru VII (jak se projevuje např. tvorbou trombinu) než preparáty faktoru VII, který nemá žádné fukosylované antény.
Příklad 4 Stanovení hydrolýzy in vitro
Pro stanovení bioaktivity faktoru Vila může být použit následující postup. Stanovení je prováděno v mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Dánsko). K faktoru Vila (konečná koncentrace 100 nM) v 50 mM Hepes, pH 7,4 obsahujícím 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl2 a 1 mg/ml hovězího sérového albuminu je přidán chromogenní substrát D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid (S-2288, Chromogenix, Švédsko) v konečné koncentraci 1 mM. Na spektrofotometru určeném pro destičky SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, USA) je měřena absorbance při 405 nm. Absorbance vznikající po 20 min. inkubaci, po odečtení absorbance ve slepé jamce, kde není obsažen enzym, je použita pro výpočet poměru mezi aktivitami testovaného a referenčního faktoru Vila.
Příklad 5 Stanovení proteolýzy in vitro
Pro stanovení bioaktivity faktoru Vila může být použit následující postup. Stanovení je prováděno v mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Dánsko). Faktor Vila (10 nM) a faktor X (0,8 μΜ) ve 100 μΐ v 50 mM Hepes, pH 7,4 obsahujícím 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl2 a 1 mg/ml hovězího sérového albuminu byly inkubovány 15 min. Štěpení faktoru X je poté zastaveno přídavkem 50 μΐ 50 mM Hepes, pH 7,4 obsahujícího 0,1 M NaCl, 20 mM EDTA a 1 mg/ml hovězího sérového albuminu. Množství vytvořeného faktoru Xa je změřeno po přídavku chromogeního substrátu Z-D-Arg-Gly-Arg-/?-nitroanilid (S-2765, Chromogenix, Švédsko) v konečné koncentraci 0,5 mM. Na spektrofotometru určeném pro destičky SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, USA) je kontinuálně měřena absorbance při 405 nm. Absorbance vznikající v průběhu 10 min., po odečtení absorbance ve slepé jamce, kde není obsažen FVIIa, je použita pro výpočet poměru mezi proteolytickými aktivitami testovaného a referenčního faktoru Vila.
Všechny patenty, patentové přihlášky a odkazy na literaturu, které jsou zde uvedeny, jsou zde celé zahrnuty jako odkaz.
• · • · · ♦
Ve světle výše uvedeného podrobného popisu bude odborníkům v dané oblasti zřetelná možnost řady variací předmětného vynálezu. Tyto zřejmé variace jsou zahrnuty do zamýšleného rozsahu připojených nároků.
Claims (56)
- PATENTOVÉ NÁROKY · “Mál1. Preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, vyznačující se t í m, že polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a kde mezi asi 94 až 99 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové.
- 2. Preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, vyznačující se t í m, že polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a kde mezi asi 1 až 7 % oligosacharidových řetězců má neutrální náboj.
- 3. Preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, vyznačující se t í m, že polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a kde mezi asi 6 až 16 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální galaktosový zbytek.
- 4. Preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, vyznačující se t í m, že polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a kde mezi asi 6 až 9 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální zbytek N-acetylgalaktosaminu.
- 5. Preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, vyznačující se tím, že polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a kde mezi asi 11 až 23 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jednu terminální galaktosu nebo zbytek N-acetylgalaktosaminu.
- 6. Preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, vyznačující se tím, že polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a kde alespoň asi 2 % oligosacharidových řetězců obsahují alespoň jeden zbytek fukosy vázaný vazbou al->3 na vyčnívající N-acetylglukosamin.9 9 99 9 99 9 9 9
- 7. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 6, v y z n a č u j í c í se t í m, že zbytky kyseliny sialové v oligosacharidových řetězcích jsou připojeny na galaktosu prostřednictvím vazby a2->3.
- 8. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 7, v y z n a č u j í c í se t í m, že zbytky kyseliny sialové obsahují N-acetylneuraminovou kyselinu Neu5Ac a N-glykolylneuraminovou kyselinu Neu5Gc.
- 9. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 8, vyznačující se tím, že oligosacharidy obsahují fukosu vázanou vazbou ct 1 ->6 na jaderný N-acetylglukosamin.
- 10. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 9, vyznačující se tím, že mezi asi 95 až 98 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové.
- 11. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 10, vyznačující se tím, že mezi asi 96 až 97 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové.
- 12. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 11,vyznačující se tím, že mezi asi 2 až 4 % oligosacharidových řetězců má neutrální náboj.
- 13. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 12, v y z n a č u j í c í se t í m, že mezi asi 8 až 12 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální zbytek galaktosy.
- 14. Preparát podle jakéhokoliv nároku lažl3,vyznačuj ící se tím, že mezi asi 7 až8 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální zbytekN-acetylgalaktosaminu.
- 15. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 14, v y z n a č u j í c í se t í m, že mezi asi 12 až 18 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jednu terminální galaktosu nebo zbytek N-acetylgalaktosaminu.
- 16. Preparát podle jakéhokoliv nároku lažl5,vyznačující se tím, že alespoň asi 5 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek fukosy vázaný vazbou al->3 na vyčnívající N-acetylglukosamin.
- 17. Preparát podle jakéhokoliv nároku lažl 6, vyznačující se t í m, že alespoň asi 10 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek fukosy vázaný vazbou al->3 na vyčnívající N-acetylglukosamin.
- 18. Preparát podle jakéhokoliv nároku lažl7,vyznačující se tím, že alespoň asi 20 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek fukosy vázaný vazbou al->3 na vyčnívající N-acetylglukosamin.
- 19. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 18, v y z n a č u j í c í se t í m, že alespoň asi 40 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek fukosy vázaný vazbou al->3 na vyčnívající N-acetylglukosamin.
- 20. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 19, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptidy mají aminokyselinovou sekvenci jako divoký faktor VII.
- 21. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 20, vyznačující se tím, že polypeptidy jsou divoký faktor VII.
- 22. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 19, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptidy faktoru VII jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: S52A-faktor VII, S60A-faktor VII, faktor VII, který byl proteolyticky naštěpen mezi zbytky 290 a 291; faktor VII, který byl proteolyticky naštěpen mezi zbytky 315 a 316; a faktor VII, který byl oxidován.
- 23. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 19, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptidy příbuzné faktoru VII jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří: R152E-faktor VII, S344A-faktor VII, FFR-faktor VII a faktor VII, který nemá Gla doménu.
- 24. Preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII, vyznačující se t í m, že polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a kde (i) mezi asi 94 až 100 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové a (ii) mezi asi 6 až 9 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden terminální zbytek N-acetylgalaktosaminu.44 ·*·· ·· · ·* » ··« · » ’ · » » • · » · · · »··· » a ·· ···· · · · ^ · ·· · ·· · ···· • · · · · 4 · · · · ·· ··
- 25. Preparát podle nároku 24, v y z n a č u j í c í se t í m, že polypeptidy faktoru VII mají sekvenci jako divoký faktor VII.
- 26. Preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII, které mají sekvenci jako divoký faktor VII, vyznačující se tím, že polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a kde mezi asi 94 až 99 % oligosacharidových řetězců obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové.
- 27. Preparát obsahující množství polypeptidů faktoru VII, které mají sekvenci jako divoký faktor VII, vyznačující se t í m, že polypeptidy obsahují oligosacharidové řetězce vázané přes asparagin a kde alespoň 2 % oligosacharidových řetězců obsahují alespoň jeden zbytek fukosy vázaný vazbou al->3 na vyčnívající N-acetylglukosamin.
- 28. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1 -27, vyznačující se t í m, že polypeptidy jsou produkovány v hostitelské buňce vybrané ze skupiny, kterou tvoří buňky plísní, hmyzu a obratlovců.
- 29. Preparát podle nároku 28, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je savčí buňka.
- 30. Preparát podle nároku 29, v y z n a č u j í c í se t í m, že hostitelská buňka pochází z křečka.
- 31. Preparát podle nároku 30, v y z n a č u j í c í se t í m, že buňka křečka je vybrána ze skupiny, kterou tvoří CHO buňky a BHK buňky.
- 32. Preparát podle nároku 29, v y z n a č u j í c í se t í m, že savčí buňka pochází z člověka.
- 33. Preparát podle nároku 32,vyznačující se tím, že lidskou buňkou je HEK buňka.
- 34. Preparát podle jakéhokoliv nároku 1-33, vyznačující se tím, že vykazuje biodostupnost, která odpovídá alespoň asi 110 % biodostupnosti referenčního preparátu, « * • * · · <· * · · · · • · * · ··· ·«« · * » • · · · · # r · · · · * » ·· ··»· ·»·« ·33 ..... ·· ···’ ’*· *’·* přičemž asi 93 % nebo méně oligosacharidových řetězců v referenčním preparátu obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové.
- 35. Preparát podle nároku 34, v y z n a č u j í c í se t í m, že vykazuje biodostupnost, která odpovídá alespoň asi 120 % biodostupnosti referenčního preparátu.
- 36. Preparát podle nároku 35, v y z n a č u j i c i se t i m, že preparát vykazuje biodostupnost, která odpovídá alespoň asi 130 % biodostupnosti referenčního preparátu.
- 37. Preparát podle nároku 36, v y z n a č u j í c í se t í m, že vykazuje biodostupnost, která odpovídá alespoň asi 140 % biodostupnosti referenčního preparátu.
- 38. Způsob stanovení profilu glykoforem faktoru VII a polypeptidů příbuzných faktoru VII, vyznačující se tím, že zahrnuje:a) kultivaci buněk exprimujících faktor VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII za předem určených kultivačních podmínek, které tvoří sadu 1 podmínek;b) získání faktoru VII nebo polypeptidů příbuzných faktoru VII z kultury s cílem získat preparát obsahující polypetidy; ac) analýzu struktury oligosacharidů vázaných na polypeptidy s cílem stanovit profil glykoforem preparátu.
- 39. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že dále zahrnuje dl) změnu kultivačních podmínek z kroku a) s cílem dosáhnout předem určených kultivačních podmínek, které tvoří sadu 2 podmínek el) opakování kroků b) až dl) tak dlouho, dokud není dosaženo požadovaného profilu glykoforem.
- 40. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že dále zahrnuje d2) ošetření preparátu chemicky nebo enzymově s cílem pozměnit oligosacharidovou strukturu; a e2) opakování kroků b) až d2) tak dlouho, dokud není dosaženo požadovaného profilu glykoforem.• * • » » · » · • · · · • · ♦ · « · · · · · * · * · · « ···* • « · · · · • · ··· ·· ·*·
- 41. Způsob produkce preparátu obsahujícího polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII, které mají předem stanovený profil N-glykosylace, vyznačující se tím, že zmíněný způsob zahrnuje kultivaci buňky exprimuj ící polypeptidy za podmínek, za nichž alespoň asi 94 % oligosacharidů vázaných přes asparagin přítomných na polypeptidech obsahuje alespoň jeden zbytek kyseliny sialové.
- 42. Farmaceutická formulace, vyznačující se t í m, že obsahuje preparát podle jakéhokoliv nároku 1 až 37 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo adjuvants.
- 43. Způsob léčby syndromu vyvolaného odezvou na faktor VII, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceutické formulace podle nároku 42 pacientovi v případě, že je této léčby třeba, za podmínek, jejichž výsledkem je snížení krvácivosti a/nebo zvýšení srážení krve, přičemž formulace obsahuje polypeptidy faktoru VII.
- 44. Způsob podle nároku 43, v y z n a č u j í c í se tím, že syndrom je vybrán ze skupiny, kterou tvoří hemofilie A, hemofilie B, nedostatek faktoru XI, nedostatek faktoru VII, trombocytopenie, von Willebrandova choroba, přítomnost inhibitoru koagulačního faktoru, operace, úraz a antikoagulační terapie.
- 45. Způsob prevence nežádoucí krvácivosti, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceutické formulace podle nároku 42 pacientovi, v případě, že je této léčby třeba, za podmínek jejichž výsledkem je snížení krvácivosti a/nebo zvýšení srážení krve, přičemž formulace obsahuje polypeptidy faktoru VII.
- 46. Způsob prevence nežádoucího srážení krve, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceutické formulace podle nároku 42 pacientovi v případě, že je této léčby třeba, za podmínek, které jsou účinné pro inhibici koagulace, přičemž formulace obsahuje polypeptidy příbuzné faktoru VII.
- 47. Způsob prevence reakcí zprostředkovaných tkáňovým faktorem, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání farmaceutické formulace podle nároku 42 pacientovi v případě, že je této léčby třeba, za podmínek, které jsou účinné pro inhibici koagulace, přičemž formulace obsahuje polypeptidy příbuzné faktoru VII.·· «·«· ·* · · # 99 «·«· • •β · · * · · ·V · «·* t » · · · · « » • « 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 925 ·· *·· ** ··· *· ··
- 48. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že nežádoucí srážení krve je spojeno se stavem vybraným ze skupiny, kterou tvoří: angioplastika, trombóza hlubokých žil, plicní embolie, cévní mozková příhoda, disiminovaná intravaskulámí koagulace (DIC), ukládání fibrinu v plicích a ledvinách spojené s gramnegativní endotoxemií nebo infarkt myokardu.
- 49. Způsob podle nároku 47, v y z n a č u j í c í se tím, že reakce zprostředkované tkáňovým faktorem jsou spojeny se stavem vybraným ze skupiny, kterou tvoří SIRS, ARDS, MOF, HUS a TTP.
- 50. Použití preparátu obsahujícího polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII podle kteréhokoliv nároku 1 až 37 pro přípravu léku určeného k léčbě syndromu vyvolaného odezvou na faktor VII.
- 51. Použití podle nároku 50, kde je syndrom vybrán ze skupiny, kterou tvoří hemofilie A, hemofilie B, nedostatek faktoru XI, nedostatek faktoru VII, trombocytopenie, von Willebrandova choroba, přítomnost inhibitoru koagulačního faktoru, operace, úraz a antikoagulační terapie.
- 52. Použití preparátu obsahujícího polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII podle kteréhokoliv nároku 1 až 37 pro přípravu léku určeného k prevenci nežádoucí krvácivosti.
- 53. Použití preparátu obsahujícího polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII podle kteréhokoliv nároku 1 až 37 pro přípravu léku určeného k prevenci nežádoucího srážení krve.
- 54. Použití podle nároku 53, kde je nežádoucí srážení krve spojeno se stavem vybraným ze skupiny, kterou tvoří: angioplastika, trombóza hlubokých žil, plicní embolie, cévní mozková příhoda, disiminovaná intravaskulámí koagulace (DIC), ukládání fibrinu v plicích a ledvinách spojené s gramnegativní endotoxemií nebo infarkt myokardu.9« ·«·· • »1 • 9 9 99 • · · * «9 9 »9 99499 9994 • «99 9 · · 9 fc · · «9 ·9 9 9 · 9
- 55. Použití preparátu obsahujícího polypeptidy faktoru VII nebo polypeptidy příbuzné faktoru VII podle kteréhokoliv nároku 1 až 37 pro přípravu léku určeného k prevenci reakcí zprostředkovaných tkáňovým faktorem.
- 56. Použití podle nároku 55, kde jsou reakce zprostředkované tkáňovým faktorem spojeny se stavem vybraným ze skupiny, kterou tvoří SIRS, ARDS, MOF, HUS a TTP.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200001456 | 2000-10-02 | ||
| DKPA200100262 | 2001-02-16 | ||
| DKPA200100430 | 2001-03-14 | ||
| DKPA200100751 | 2001-05-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2003718A3 true CZ2003718A3 (cs) | 2003-08-13 |
Family
ID=27439823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2003718A CZ2003718A3 (cs) | 2000-10-02 | 2001-10-02 | Glykoformy faktoru VII |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US20020151471A1 (cs) |
| EP (6) | EP1325127B1 (cs) |
| JP (4) | JP4477299B2 (cs) |
| KR (2) | KR100880624B1 (cs) |
| CN (3) | CN1468303B (cs) |
| AT (2) | ATE425254T1 (cs) |
| AU (5) | AU2001291651A1 (cs) |
| BR (2) | BR0114373A (cs) |
| CA (2) | CA2422214A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2003718A3 (cs) |
| DE (2) | DE60137950D1 (cs) |
| ES (2) | ES2323761T3 (cs) |
| HU (2) | HUP0301267A3 (cs) |
| IL (2) | IL154879A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA03002853A (cs) |
| NO (1) | NO20031471L (cs) |
| PL (2) | PL361017A1 (cs) |
| WO (4) | WO2002029045A2 (cs) |
Families Citing this family (122)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050032690A1 (en) * | 1997-09-10 | 2005-02-10 | Rojkjaer Lisa Payne | Factor VII polypeptides for preventing formation of inhibitors in subjects with haemophilia |
| US7786070B2 (en) | 1997-09-10 | 2010-08-31 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Subcutaneous administration of coagulation factor VII |
| US7247708B2 (en) * | 1997-10-23 | 2007-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US6747003B1 (en) | 1997-10-23 | 2004-06-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| SI1308455T1 (sl) | 1998-05-06 | 2006-08-31 | Genentech Inc | Sestavek, ki obsega protitelesa anti-HER2 |
| RU2278123C2 (ru) * | 2000-02-11 | 2006-06-20 | Максиджен Холдингз Лтд. | Молекулы, подобные фактору vii или viia |
| US7812132B2 (en) | 2000-04-28 | 2010-10-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US7220837B1 (en) | 2000-04-28 | 2007-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US20030211094A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
| US20030040480A1 (en) * | 2001-07-20 | 2003-02-27 | Rasmus Rojkjaer | Pharmaceutical composition comprising factor VII polypeptides and factor XI polypeptides |
| HUP0402158A2 (hu) | 2001-10-02 | 2005-01-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Rekombináns fehérjék előállítási eljárása eukarióta sejtekben |
| US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
| US7157277B2 (en) | 2001-11-28 | 2007-01-02 | Neose Technologies, Inc. | Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII |
| US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
| KR20040065278A (ko) * | 2001-12-21 | 2004-07-21 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 변경된 인자 ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물 |
| IL162239A0 (en) | 2001-12-21 | 2005-11-20 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Liquid composition of factor vii polypeptides |
| SI1499719T1 (sl) * | 2002-04-30 | 2011-03-31 | Bayer Healthcare Llc | Polipeptidne variante faktorja VII ali VIIa |
| US20040009918A1 (en) * | 2002-05-03 | 2004-01-15 | Hanne Nedergaard | Stabilised solid compositions of modified factor VII |
| UA86744C2 (en) * | 2002-06-21 | 2009-05-25 | Ново Нордиск Хэлс Кеа Аг | Pegylated factor vii glycoforms |
| ES2523655T5 (es) * | 2002-06-21 | 2018-04-23 | Novo Nordisk Health Care Ag | Composiciones sólidas estabilizadas de polipéptidos del Factor VIIa |
| US20060166874A1 (en) * | 2002-09-30 | 2006-07-27 | Haaning Jesper M | Fvii or fviia variants having increased clotting activity |
| WO2004082708A2 (en) * | 2003-03-18 | 2004-09-30 | Novo Nordisk Health Care Ag | Liquid, aqueous, pharmaceutical compositions of factor vii polypeptides |
| CA2519020A1 (en) * | 2003-03-18 | 2004-09-30 | Novo Nordisk Health Care Ag | Method for the production of gla-residue containing serine proteases |
| DK2085470T3 (da) * | 2003-03-20 | 2012-08-06 | Bayer Healthcare Llc | FVII- eller FVIIa-varianter |
| US7897734B2 (en) | 2003-03-26 | 2011-03-01 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Method for the production of proteins |
| US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
| EP2338333B1 (en) | 2003-04-09 | 2017-09-06 | ratiopharm GmbH | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| RU2364609C2 (ru) * | 2003-05-23 | 2009-08-20 | Ново Нордиск Хелт Кэр Аг | Стабилизация белка в растворе |
| CN1839203B (zh) * | 2003-06-19 | 2011-11-16 | 拜耳医药保健有限公司 | 因子VII或VIIa的GLA结构域变体 |
| ATE547114T1 (de) * | 2003-06-25 | 2012-03-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Flüssige zusammensetzungen von factor vii polypeptiden |
| AU2004252028B2 (en) * | 2003-06-30 | 2008-05-08 | Glytech, Inc. | Disialoundecasaccharide chain asparagine/fatty acid amide and medical drug containing the same |
| DE602004023848D1 (de) * | 2003-07-01 | 2009-12-10 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Von factor vii polypeptiden |
| WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
| CN102872451A (zh) * | 2003-08-14 | 2013-01-16 | 诺和诺德医疗保健公司 | 因子vii多肽类的含水液体药物组合物 |
| ATE547519T1 (de) | 2003-09-09 | 2012-03-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Gerinnungsfaktor-vii-polypeptide |
| EP2380985B1 (en) | 2003-09-23 | 2014-01-01 | University of North Carolina at Chapel Hill | Cells expressing vitamin K epoxide reductase and use thereof |
| WO2005035748A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Novo Nordisk Health Care Ag | Method for large-scale production of a polypeptide in eukaryote cells and a culture vessel suitable therefor |
| GB0324044D0 (en) * | 2003-10-14 | 2003-11-19 | Astrazeneca Ab | Protein |
| EP2189523B1 (en) * | 2003-10-14 | 2012-01-04 | Baxter International Inc. | Vitamin K epoxide recycling polypeptide VKORC1, a therapeutic target of coumarin and their derivatives |
| US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
| PL1711513T3 (pl) | 2003-12-01 | 2014-12-31 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Nanofiltracja roztworów czynnika vii w celu usunięcia wirusów |
| US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
| RU2373953C2 (ru) * | 2003-12-19 | 2009-11-27 | Ново Нордиск Хелс Кеа Аг | Стабилизированная композиция, содержащая полипептид фактора vii |
| WO2005068620A1 (en) * | 2004-01-07 | 2005-07-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Method for the production of recombinant proteins |
| CA2565414A1 (en) | 2004-05-04 | 2005-11-24 | Novo Nordisk Health Care Ag | O-linked glycoforms of polypeptides and method to manufacture them |
| RU2396347C2 (ru) * | 2004-08-17 | 2010-08-10 | Ксл Бехринг Гмбх | Модифицированные витамин к-зависимые полипептиды |
| JP2008514216A (ja) * | 2004-09-29 | 2008-05-08 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | Ｄｅｓｇｌａ−ｖｉｉ因子ポリペプチド構造の除去による、ｖｉｉ因子ポリペプチドの原体の精製 |
| SI2586456T1 (sl) | 2004-10-29 | 2016-05-31 | Ratiopharm Gmbh | Preoblikovanje in glikopegliacija fibroblastnega rastnega faktorja (FGF) |
| WO2006067116A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-29 | Novo Nordisk Health Care Ag | Expression of gamma-carboxylated polypeptides in gamma-carboxylation deficient host systems |
| ES2395544T3 (es) * | 2004-12-23 | 2013-02-13 | Novo Nordisk Health Care Ag | Reducción del contenido de contaminantes proteínicos en composiciones que comprenden una proteína dependiente de la vitamina K de interés |
| EP1858543B1 (en) | 2005-01-10 | 2013-11-27 | BioGeneriX AG | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| EP1851305B1 (en) * | 2005-02-11 | 2012-01-18 | Novo Nordisk Health Care AG | Production of a polypeptide in a serum-free cell culture liquid containing plant protein hydrolysate |
| JP2008531026A (ja) | 2005-02-28 | 2008-08-14 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | ビタミンｋ依存性タンパク質発現を改善するための、ビタミンｋエポキシドレダクダーゼサブユニット１の組換え同時発現 |
| US20090325226A1 (en) | 2005-03-15 | 2009-12-31 | Stafford Darrel W | Methods and Compositions for Producing Active Vitamin K-Dependent Proteins |
| WO2006121569A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-16 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| CN101198696B (zh) | 2005-04-13 | 2014-02-26 | 阿斯利康(瑞典)有限公司 | 包含产生需要γ-羧化的蛋白质用的载体的宿主细胞 |
| EP2975135A1 (en) | 2005-05-25 | 2016-01-20 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
| US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
| PT1969127E (pt) * | 2005-12-21 | 2014-09-23 | Univ North Carolina | Processo de produção de proteínas dependentes da vitamina k biologicamente activos por métodos recombinantes |
| EP1816201A1 (en) | 2006-02-06 | 2007-08-08 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factor VIIa with extended half-life |
| US8461115B2 (en) | 2006-03-16 | 2013-06-11 | Stellaris Pharmaceuticals Aps | Methods for local treatment with factor VII |
| PL2007885T3 (pl) * | 2006-04-11 | 2010-12-31 | Csl Behring Gmbh | Sposób zwiększania odzysku peptydów terapeutycznych in vivo |
| FR2901707B1 (fr) * | 2006-05-31 | 2017-09-29 | Lab Francais Du Fractionnement | Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis |
| JP5122562B2 (ja) * | 2006-07-17 | 2013-01-16 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 増加した活性を有する第ｖｉｉａ因子アナログの新規用途 |
| CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
| FR2904558B1 (fr) * | 2006-08-01 | 2008-10-17 | Lab Francais Du Fractionnement | "composition de facteur vii recombinant ou transgenique, presentant majoritairement des formes glycanniques biantennees, bisialylees et non fucosylees" |
| EP2054521A4 (en) | 2006-10-03 | 2012-12-19 | Novo Nordisk As | METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES |
| JP5167449B2 (ja) * | 2006-11-07 | 2013-03-21 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 直鎖状核酸分子懸架支持体、直鎖状核酸分子伸長方法および直鎖状核酸分子標本 |
| DK2101821T3 (da) * | 2006-12-15 | 2014-10-06 | Baxter Healthcare Sa | Faktor VIIA-(poly)sialinsyre-konjugat med forlænget halveringstid in vivo |
| WO2008077616A1 (en) | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
| EP2099475B1 (en) * | 2007-01-03 | 2016-08-24 | Novo Nordisk Health Care AG | Subcutaneous administration of coagulation factor viia-related polypeptides |
| ES2406267T3 (es) | 2007-04-03 | 2013-06-06 | Biogenerix Ag | Métodos de tratamiento usando G-CSF glicopegilado |
| PL2147096T3 (pl) * | 2007-04-13 | 2015-08-31 | Catalyst Biosciences Inc | Zmodyfikowane polipeptydy czynnika VII i ich zastosowania |
| EP2139499A4 (en) * | 2007-04-26 | 2010-05-05 | Inspiration Biopharmaceuticals | RECOMBINANT VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS WITH HIGH SIALIC ACID CONTENT AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
| AU2014202989B2 (en) * | 2007-04-26 | 2016-07-07 | Aptevo Biotherapeutics Llc | Recombinant vitamin k dependent proteins with high sialic acid content and methods of preparing same |
| AU2016238889B2 (en) * | 2007-04-26 | 2019-06-27 | Aptevo Biotherapeutics Llc | Recombinant vitamin K dependent proteins with high sialic acid content and methods of preparing same |
| WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
| US8206967B2 (en) | 2007-07-06 | 2012-06-26 | Medimmune Limited | Method for production of recombinant human thrombin |
| EP2014299A1 (en) * | 2007-07-11 | 2009-01-14 | Novo Nordisk A/S | Subcutaneous administration of coagulation factor VII |
| US11197916B2 (en) | 2007-12-28 | 2021-12-14 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Lyophilized recombinant VWF formulations |
| CN105816858A (zh) | 2007-12-28 | 2016-08-03 | 巴克斯特国际公司 | 重组vwf配方 |
| PL2257311T3 (pl) | 2008-02-27 | 2014-09-30 | Novo Nordisk As | Koniugaty cząsteczek czynnika VIII |
| TWI538916B (zh) | 2008-04-11 | 2016-06-21 | 介控生化科技公司 | 經修飾的因子vii多肽和其用途 |
| AU2009307648C1 (en) | 2008-10-21 | 2016-12-08 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Lyophilized recombinant VWF formulations |
| HUE026210T2 (en) * | 2008-11-12 | 2016-05-30 | Baxalta Inc | Procedure for serum-free, insulin-free VII. factor |
| JP5027106B2 (ja) * | 2008-12-25 | 2012-09-19 | 一般財団法人阪大微生物病研究会 | 日本脳炎ウイルス抗原 |
| WO2011012850A2 (en) | 2009-07-27 | 2011-02-03 | Lipoxen Technologies Limited | Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins |
| JP5908401B2 (ja) | 2009-07-27 | 2016-04-26 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ | 血液凝固タンパク質複合体 |
| US8642737B2 (en) | 2010-07-26 | 2014-02-04 | Baxter International Inc. | Nucleophilic catalysts for oxime linkage |
| US8809501B2 (en) | 2009-07-27 | 2014-08-19 | Baxter International Inc. | Nucleophilic catalysts for oxime linkage |
| HUE028056T2 (en) | 2009-07-27 | 2016-11-28 | Baxalta GmbH | Blood coagulation protein conjugates |
| US8580554B2 (en) | 2009-07-31 | 2013-11-12 | Baxter International Inc. | Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture |
| EP2494040B1 (en) * | 2009-10-30 | 2018-08-29 | Aptevo BioTherapeutics LLC | Method of producing recombinant vitamin k dependent proteins |
| WO2011069056A2 (en) * | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Antennary fucosylation in glycoproteins from cho cells |
| FR2954349A1 (fr) | 2009-12-22 | 2011-06-24 | Agronomique Inst Nat Rech | Sulfatase modifiant selectivement les glycosaminoglycanes |
| WO2012075138A1 (en) * | 2010-11-30 | 2012-06-07 | Progenetics Llc | Method of producing biologically active vitamin k dependent proteins in transgenic animals |
| EP2655607A4 (en) | 2010-12-21 | 2014-05-14 | Univ North Carolina | METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING ACTIVE VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS |
| CA2822591C (en) | 2010-12-22 | 2020-12-29 | Baxter International Inc. | Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein |
| EP2702077A2 (en) | 2011-04-27 | 2014-03-05 | AbbVie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
| US9181572B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Methods to modulate lysine variant distribution |
| US9334319B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-05-10 | Abbvie Inc. | Low acidic species compositions |
| US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
| US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| WO2014057068A1 (en) | 2012-10-10 | 2014-04-17 | Novo Nordisk Health Care Ag | Liquid pharmaceutical composition of factor vii polypeptide |
| SG11201507230PA (en) | 2013-03-12 | 2015-10-29 | Abbvie Inc | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
| US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
| US9499614B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-22 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides |
| FR3006591B1 (fr) | 2013-06-11 | 2016-05-06 | Lab Francais Du Fractionnement | Composition de facteur vii presentant un point isoelectrique substantiellement homogene |
| US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
| US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
| US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| US20150139988A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
| BR112016023893A2 (pt) * | 2014-04-16 | 2017-08-15 | Cmc Biologics As | processo de fermentação por extração e preenchimento a alta densidade celular |
| ES2709994T3 (es) | 2014-06-04 | 2019-04-22 | Amgen Inc | Métodos de recolección en cultivos de células de mamífero |
| US9714302B2 (en) | 2014-10-10 | 2017-07-25 | W. R. Grace & Co.—Conn. | Process for preparing spherical polymerization catalyst components for use in olefin polymerizations |
| FR3034669B1 (fr) | 2015-04-07 | 2020-02-14 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Nouvelle utilisation du facteur von willebrand |
| BR102015012334A2 (pt) | 2015-05-27 | 2016-11-29 | Fundação Hemoct De Ribeirão Preto Fundherp | processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea e fator vii de coagulação sanguínea |
| WO2017025566A1 (en) * | 2015-08-10 | 2017-02-16 | Glycotope Gmbh | Improved recombinant factor vii |
| ES2803773T3 (es) * | 2015-12-02 | 2021-01-29 | CSL Behring Lengnau AG | Medios mejorados para la expresión de proteínas recombinantes dependientes de vitamina k |
| EP3488858A1 (en) | 2017-11-27 | 2019-05-29 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | A von willebrand factor composition for use in treating a pathology mediated by angiogenesis |
| EP3833381B1 (en) | 2019-08-15 | 2022-08-03 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration |
Family Cites Families (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4189534A (en) * | 1976-11-11 | 1980-02-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell culture microcarriers |
| US4357422A (en) * | 1980-08-14 | 1982-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of enhancing interferon production |
| US4335215A (en) * | 1980-08-27 | 1982-06-15 | Monsanto Company | Method of growing anchorage-dependent cells |
| US4456591A (en) | 1981-06-25 | 1984-06-26 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Therapeutic method for activating factor VII |
| US4501728A (en) | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
| US4664912A (en) * | 1984-10-01 | 1987-05-12 | Wiktor Tadeusz J | Process for the large scale production of rabies vaccine |
| US4978616A (en) * | 1985-02-28 | 1990-12-18 | Verax Corporation | Fluidized cell cultivation process |
| GR860984B (en) * | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
| US4975282A (en) | 1985-06-26 | 1990-12-04 | The Liposome Company, Inc. | Multilamellar liposomes having improved trapping efficiencies |
| SE464816B (sv) * | 1985-10-15 | 1991-06-17 | Nilsson Kjell | Makroporoesa partiklar, foerfarande foer dess framstaellning och dess anvaendning |
| GB2184759B (en) * | 1985-12-28 | 1990-07-18 | Shimizu Construction Co Ltd | Concrete-filled tubular steel piece, concrete-filled steel tube column and method of constructing same. |
| US5595886A (en) * | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| US5576194A (en) * | 1986-07-11 | 1996-11-19 | Bayer Corporation | Recombinant protein production |
| JPH01502080A (ja) * | 1986-11-17 | 1989-07-27 | ニュー・イングランド・メディカル・センター | 組み換えビタミンｋ依存性蛋白質のガンマカルボキシル化の増強 |
| US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| US5580560A (en) * | 1989-11-13 | 1996-12-03 | Novo Nordisk A/S | Modified factor VII/VIIa |
| EP0540650A1 (en) | 1990-07-23 | 1993-05-12 | Zymogenetics, Inc. | Gamma-carboxylase and methods of use |
| ATE158816T1 (de) * | 1990-11-26 | 1997-10-15 | Genetics Inst | Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung |
| US5965789A (en) * | 1991-01-11 | 1999-10-12 | American Red Cross | Engineering protein posttranslational modification by PACE/furin in transgenic non-human mammals |
| JP3459416B2 (ja) * | 1991-02-28 | 2003-10-20 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | 修飾されたファクター▲ｖｉｉ▼ |
| US5997864A (en) | 1995-06-07 | 1999-12-07 | Novo Nordisk A/S | Modified factor VII |
| US5661008A (en) * | 1991-03-15 | 1997-08-26 | Kabi Pharmacia Ab | Recombinant human factor VIII derivatives |
| US5268275A (en) * | 1991-05-08 | 1993-12-07 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Vitamin K-dependent carboxylase |
| US5968502A (en) | 1991-11-05 | 1999-10-19 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
| IL104385A (en) * | 1992-01-17 | 1995-12-31 | Applied Research Systems | Method and device for growing biomass particles |
| DK53792D0 (da) * | 1992-04-24 | 1992-04-24 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
| WO1993022448A1 (en) * | 1992-05-01 | 1993-11-11 | Teijin Limited | Fed batch culture method for protein secreting cells |
| DE4221863C2 (de) | 1992-07-03 | 1997-04-17 | Stockhausen Chem Fab Gmbh | Copolymere der Allyliminodiessigsäure mit ungesättigten Carbonsäuren und deren Verwendung als Komplexbildner, Peroxidstabilisatoren, Builder in Wasch- und Reinigungsmitteln und Dispergatoren |
| US5510328A (en) * | 1994-04-28 | 1996-04-23 | La Jolla Cancer Research Foundation | Compositions that inhibit wound contraction and methods of using same |
| WO1998004680A1 (en) * | 1996-07-26 | 1998-02-05 | University Of Manitoba | Serum-free medium for growth of anchorage-dependant mammalian cells |
| PT973544E (pt) * | 1997-04-08 | 2001-12-28 | Baxter Ag | Preparacao de complexo de protrombina imunotolerante |
| AT407255B (de) * | 1997-06-20 | 2001-02-26 | Immuno Ag | Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons |
| US6475725B1 (en) * | 1997-06-20 | 2002-11-05 | Baxter Aktiengesellschaft | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
| ATE408020T1 (de) * | 1998-11-06 | 2008-09-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Verfahren zur herstellung von faktor vii |
| WO2000054787A1 (en) | 1999-03-16 | 2000-09-21 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Enhanced gamma-carboxylation of recombinant vitamin k-dependent clotting factors |
| JP2003506077A (ja) * | 1999-08-05 | 2003-02-18 | バクスター アクチェンゲゼルシャフト | 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 |
| UA74557C2 (en) * | 1999-09-03 | 2006-01-16 | Applied Research Systems | A method for producing a heterologous secreted protein from chinese hamster ovaries cells grown on microcarriers |
| WO2001081573A1 (en) * | 2000-04-26 | 2001-11-01 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Edg8 receptor, its preparation and use |
-
2001
- 2001-10-02 DE DE60137950T patent/DE60137950D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 AU AU2001291651A patent/AU2001291651A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-02 CN CN018167462A patent/CN1468303B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-02 ES ES01976037T patent/ES2323761T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 WO PCT/DK2001/000635 patent/WO2002029045A2/en active Application Filing
- 2001-10-02 AT AT01976037T patent/ATE425254T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-02 PL PL01361017A patent/PL361017A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2001-10-02 CZ CZ2003718A patent/CZ2003718A3/cs unknown
- 2001-10-02 AU AU2001295431A patent/AU2001295431A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-02 CN CNA018166423A patent/CN1481438A/zh active Pending
- 2001-10-02 AU AU9165201A patent/AU9165201A/xx active Pending
- 2001-10-02 BR BR0114373-5A patent/BR0114373A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-10-02 PL PL01361058A patent/PL361058A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2001-10-02 JP JP2002532595A patent/JP4477299B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-02 EP EP01976037A patent/EP1325127B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 KR KR1020037004725A patent/KR100880624B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-10-02 CA CA002422214A patent/CA2422214A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-02 JP JP2002532615A patent/JP4361730B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-02 AU AU2001291653A patent/AU2001291653A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-02 EP EP01971734A patent/EP1325113B1/en not_active Revoked
- 2001-10-02 WO PCT/DK2001/000632 patent/WO2002029083A2/en active Application Filing
- 2001-10-02 AU AU2001291652A patent/AU2001291652B2/en not_active Ceased
- 2001-10-02 HU HU0301267A patent/HUP0301267A3/hu unknown
- 2001-10-02 JP JP2002532653A patent/JP2004512835A/ja active Pending
- 2001-10-02 JP JP2002532652A patent/JP2004510439A/ja active Pending
- 2001-10-02 IL IL15487901A patent/IL154879A0/xx unknown
- 2001-10-02 MX MXPA03002853A patent/MXPA03002853A/es not_active Application Discontinuation
- 2001-10-02 WO PCT/DK2001/000634 patent/WO2002029084A2/en active Application Filing
- 2001-10-02 HU HU0301245A patent/HUP0301245A3/hu unknown
- 2001-10-02 KR KR1020037004723A patent/KR100861470B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-10-02 BR BR0114374-3A patent/BR0114374A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-10-02 EP EP01971735A patent/EP1325147A2/en not_active Withdrawn
- 2001-10-02 US US09/969,358 patent/US20020151471A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-02 CN CN201210226379.9A patent/CN102766668B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-02 US US10/398,422 patent/US8202973B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-02 CA CA2422216A patent/CA2422216C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-02 EP EP01971733A patent/EP1356074A2/en not_active Withdrawn
- 2001-10-02 IL IL15488001A patent/IL154880A0/xx unknown
- 2001-10-02 WO PCT/DK2001/000633 patent/WO2002029025A2/en active Application Filing
- 2001-10-02 US US09/969,357 patent/US6903069B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 AT AT01971734T patent/ATE465253T1/de active
- 2001-10-02 EP EP10010149A patent/EP2311943A3/en not_active Withdrawn
- 2001-10-02 ES ES01971734T patent/ES2344887T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-02 EP EP10003073A patent/EP2261330A1/en not_active Withdrawn
- 2001-10-02 DE DE60141908T patent/DE60141908D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-04-01 NO NO20031471A patent/NO20031471L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-12-02 US US10/725,843 patent/US20050075289A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-12-21 US US11/643,607 patent/US20070122884A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-07-15 US US12/503,498 patent/US20090281022A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ2003718A3 (cs) | Glykoformy faktoru VII | |
| AU2001291652A1 (en) | Factor VII glycoforms | |
| US10844110B2 (en) | O-linked glycoforms of polypeptides and method to manufacture them | |
| EP1517710B1 (en) | Pegylated factor vii glycoforms | |
| US20080039373A1 (en) | Pegylated Factor VII Glycoforms | |
| EP1952822A1 (en) | Factor VII polypeptides with increased affinity to platelets | |
| US20150225711A1 (en) | Factor VII Conjugates | |
| RU2325181C2 (ru) | Гликоформы фактора vii | |
| AU2007214306A1 (en) | Factor VII glycoforms | |
| US20190211319A1 (en) | FACTOR VIIa GLYCOFORMS | |
| WO2017025566A1 (en) | Improved recombinant factor vii |