JP4477299B2 - 因子ｖｉｉグリコ型 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、因子VIIと、アスパラギン連結グリコシル化の変更されたパターンを有する他の血液凝固因子とを含んでなるに関する。
【０００２】
発明の背景
例えば、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、およびプロテインCを包含する、凝固カスケードに関係するタンパク質は、種々の病理学症状を治療する有用な治療剤であることが証明されている。したがって、薬学上許容され、かつ均一な前もって決定した臨床的効能を有する、それらのタンパク質を含んでなる処方物が必要とされている。
【０００３】
薬学的製品の源としてヒト血漿を使用することは多数の欠点を有するので、組換え系においてこれらのタンパク質を製造することが好ましい。しかしながら、凝固タンパク質は、例えば、アスパラギン連結 (N−連鎖) グリコシル化；O−連鎖グリコシル化；およびglu残基のγ−カルボキシル化を包含する、種々の共翻訳および翻訳後修飾に暴露される。異種細胞をタンパク質の大規模生産用宿主細胞として使用するとき、これらの修飾は定性的または定量的に異なる。特に、異種細胞における生産はしばしば異なるアレイのグリコ型を生じ、これらのグリコ型は異なように共有結合したオリゴサッカライド構造を有する同一ポリペプチドである。
【０００４】
異なる系において、治療用タンパク質のオリゴサッカライド構造における変動は、なかでも、免疫原性およびin vivoクリアランスの変化に関係付けられた。こうして、凝固性調製物、特に組換えヒト因子VII、修飾された因子VII、または因子VII関連ポリペプチドを含んでなり、前もって決定したグリコ型パターンを含有する調製物を提供する組成物および方法がこの分野において要求されている。
【０００５】
発明の要約
本発明は、前もって決定したグリコ型パターンを示す因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物に関する。本明細書において使用するとき、因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドは複数の因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを意味し、変異型および化学的修飾された形態、ならびにタンパク質分解的に活性化された (例えば、因子VIIa) 、それらが合成された細胞から分離された形態を包含する。グリコ型パターンは、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチド共有結合した、変化する構造を有するオリゴサッカライド鎖の調製物内の分布を言及する。
【０００６】
1つの面において、本発明は、複数の因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつ下記の1または2以上が適用される調製物を提供する：(i) オリゴサッカライド鎖の約94〜100％は少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなる；(ii) オリゴサッカライド鎖の約0〜7％は中性電荷を有する；(iii) オリゴサッカライド鎖の約6％より小、例えば、約6〜16％は少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含んでなる；(iv) オリゴサッカライド鎖の約25％より小、例えば、約6〜9％は少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる；または (v) オリゴサッカライド鎖の約30％より小、約11〜23％が少なくとも1つの末端のガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる。
【０００７】
ある態様において、(i) 〜 (v) の1または2以上に加えて、オリゴサッカライド鎖中のすべてのシアル酸残基はα2→3連鎖を介してガラクトースに連鎖されている；シアル酸残基の少なくともいくつかはN−アセチルノイラミン酸 (Neu5Ac) に加えてN−グリコリルノイラミン酸 (Neu5Gc) を含んでなる；および／またはオリゴサッカライド鎖はコアN−アセチルグルコサミンに対してα1→6連鎖したフコースを含んでなる。1つの態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の約94〜100％が少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖中のすべてのシアル酸残基がα2→3連鎖を介してガラクトースに連鎖されている、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。
【０００８】
本発明の他の態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の約94〜100％が少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなり、かつシアル酸残基の少なくともいくつかがN−アセチルノイラミン酸である、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。本発明のなお他の態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の約94〜100％が少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなり、かつシアル酸残基の少なくともいくつかがN−アセチルガラクトサミンである、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。こうして、本発明の調製物は、ヒト血漿から単離され、グルコシダーゼ処理によりex vivoで修飾されていない野生型因子VIIまたは因子VIIaを含まない。
【０００９】
他の面において、本発明は、複数の因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の少なくとも約2％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基 (すなわち、Man残基に対してβ1→2、4、または6に連鎖されているN−アセチルグルコサミン残基) に対してα1→3連鎖した少なくとも1つのフコース部分を含有する、調製物を提供する。好ましくは、オリゴサッカライド鎖の少なくとも約5％、より好ましくは少なくとも約10％または少なくとも20％、最も好ましくは少なくとも約40％は少なくとも1つのこのような触角状（antennary）フコース残基を含有する。
【００１０】
本発明による調製物は、1または2以上の非修飾野生型因子VII；化学的および／または酵素的に修飾された野生型因子VII；および野生型因子VIIに関してアミノ酸配列中に1または2以上の変更を有する因子VII変異型を含んでなることができる。本発明の調製物は、内因的因子VII遺伝子から因子VIIを発現するヒト細胞に由来するか、あるいは組換え遺伝子から因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを発現するようにプログラムされた細胞に由来することができる。
他の面において、本発明は、1または2以上の改良された機能的性質を示す因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物を提供する。このような機能的性質は、安定性、生物学的利用能、および／または半減期の増加を包含するが、これらに限定されない。
【００１１】
他の面において、本発明は、下記の工程を含んでなる、因子VIIおよび因子VII関連ポリペプチドのグリコ型パターンを決定する方法を包含する：
(a) 因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを発現する細胞を第1組の前もって決定した培養条件下に培養し、
(b) 培養物から因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを回収して、ポリペプチドを含んでなる調製物を獲得し、そして
(c) ポリペプチドに連鎖したオリゴサッカライドの構造を解析して調製物のグリコ型パターンを決定する。
【００１２】
これらの方法は、工程 (a) の培養条件を変更して第2組の前もって決定した培養条件を達成し、所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程を反復する、工程をさらに含むことができる。選択的に、これらの方法は、調製物を化学的または酵素的に処理してオリゴサッカライドの構造を変更し、そして所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程を反復する、工程をさらに含むことができる。さらに、これらの方法は、前もって決定したグリコ型パターンを有する調製物を生物学的活性または他の機能 (例えば、薬学的プロファイルまたは安定性) の少なくとも1つの試験に付し、そして特定のグリコ型パターンを特定の生物学的活性または機能のプロファイルに相関させる、追加の工程を含むことができる。
【００１３】
他の面において、本発明は、N−連鎖グリコシル化の前もって決定したパターンを有する因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物を調製する方法を提供する。ある態様において、これらの方法は、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドに連鎖されたアスパラギン連結オリゴサッカライドの少なくとも約94％が少なくとも1つ、2つ、3つ、または4つのシアル酸残基を含んでなる条件下に、ポリペプチドを発現する細胞を培養することによって実施される。
【００１４】
ある態様において、これらの方法は、オリゴサッカライド鎖の少なくとも約5％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基に対してα1→3連鎖した少なくとも1つのフコース部分を含んでなる条件下に、ポリペプチドを発現する細胞を培養することによって実施される。ある態様において、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを、それらの源に無関係に、酵素処理して所望のグリコ型パターンを達成する。
【００１５】
他の面において、本発明は、本発明の調製物を含んでなる医薬処方物、および因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドに対して応答性である症候群を予防および／または治療する方法を提供する。これらの方法は、血液凝固を増強または抑制する条件下に、治療を必要とする患者に医薬処方物を投与することを含んでなる。
【００１６】
1系列の態様において、血液凝固を増強しようとするとき、例えば、血友病A、血友病B、因子IX欠乏症、因子VII欠乏症、血小板減少症、またはフォン・ウィルブランド病において；凝固因子インヒビターの存在；外科手術または抗凝固治療の前、間、または後に；または外傷後に、因子VII調製物を投与する。他の系列の態様において、血液凝固を減少させるために、例えば、血管形成を受けている患者、または深静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発生血管内凝固症候群 (DIC) 、グラム陰性内毒素血症に関連する肺および腎臓におけるフィブリン沈着、および心筋梗塞に罹った患者に、因子VII関連ポリペプチドの調製物 (すなわち、野生型因子VIIに関して生物学的活性が減少したまたは変更された調製物) を投与する。
【００１７】
本発明によれば、因子VII関連ポリペプチドの調製物は、また、組織因子 (TF) 仲介経路を介する細胞内シグナリングを変更するために、例えば、減少させるために、症状、例えば、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS )、全身炎症応答症候群(SIRS)、溶血性尿毒症症候群 (HUS)、多発性器官不全 (MOF)、および血小板減少性紫斑病 (TTP)を治療するために、因子VII関連ポリペプチドを投与することができる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、前もって決定したグリコ型パターンを有する凝固タンパク質の調製物が改良された機能的性質を示すことを発見した。したがって、本発明は、これらのタンパク質調製物を提供する方法および組成物に関する。特に、本発明は、アスパラギン連結 (N−連鎖) オリゴサッカライドの特異的な前もって決定したパターンを有する因子VIIポリペプチドおよび残基因子VIIポリペプチドことを含んでなる調製物に関する。本発明の調製物は変更された性質を示す。このような性質は、改良された薬物速度論的性質および改良された臨床的効能を包含するが、これらに限定されない。本発明は、また、これらの調製物を含んでなる医薬処方物、ならびに医薬処方物を利用する治療法を包含する。
【００１９】
因子VIIポリペプチドおよび残基因子VIIポリペプチド
本発明は、ヒト因子VIIポリペプチド、例えば、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するもの (野生型因子VII) を包含する。本明細書において使用するとき、「因子VII」または「因子VIIポリペプチド」は野生型因子VII、ならびに野生型因子VIIに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を示す因子VIIの変異型を包含する。用語「因子VII」は非切断 (チモーゲン) 形態の因子VIIポリペプチド、ならびにそれぞれの生物活性形態を生ずるようにタンパク質分解的にプロセシングされたもの (これは因子VIIaと表示することができる) を包含する。典型的には、因子VIIは残基152と153との間で切断されて因子VIIaを生ずる。
【００２０】
本明細書において使用するとき、「因子VII関連ポリペプチド」は、因子VIIaの生物学的活性が野生型因子VIIaの活性に関して実質的に変更または減少されている変異型を含む、ポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、ポリペプチドの生物学的活性を変更または崩壊させる、特異的アミノ酸配列の変更が導入されている因子VIIまたは因子VIIaを包含するが、これらに限定されない。
【００２１】
血液凝固における因子VIIの生物学的活性は、(i) 組織因子 (TF) に結合するその能力および (ii) 活性化された因子IXまたはX (それぞれ、因子IXaまたはXa) を産生する因子IXまたは因子Xのタンパク質分解的切断を触媒するその能力に由来する。本発明の目的に対して、例えば、米国特許第5,997,864号に記載されているように、因子VIIaの生物学的活性は、因子VII欠乏血漿およびトロンボプラスチンを使用して血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって、定量することができる。このアッセイにおいて、生物学的活性は対照試料に関する凝固時間の減少として表され、1単位／mlの因子VII活性を含有するプールしたヒト血清標準と比較することによって「因子VII単位」に変換される。
【００２２】
選択的に、因子VIIaの生物学的活性は、(i) 脂質膜の中に埋め込まれたTFと因子Xとを含んでなる系中で因子Xaを産生する因子VIIaの能力を測定する (Persson et al., J. Biol. Chem. 272：19919−19924, 1997)；(ii) 水性系中の因子Xの加水分解を測定する；(iii) 表面プラズモン共鳴をベースとする計装を使用してTFに対するその結合を測定する (Persson et al., FEBS Letts. 413：359−363, 1997) ；(iv) 合成基質の加水分解を測定する (下記の実施例4参照)；および (v) TF独立的in vitro系中のトロンビン発生を測定することによって定量することができる。
【００２３】
野生型因子VIIに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を有する因子VIIの変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはTF結合アッセイの1または2以上において試験したとき、同一細胞型において産生された野生型因子VIIaの比活性の少なくとも約25％、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、最も好ましくは少なくとも約90％を示す変異型を包含する。
【００２４】
野生型因子VIIaに関して実質的に減少した活性を有する因子VII変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはTF結合アッセイの1または2以上において試験したとき、同一細胞型において産生された野生型因子VIIaの比活性の約25％より少ない、好ましくは約10％より少ない、より好ましくは約5％より少ない、最も好ましくは約1％より少ないを示す変異型を包含する。野生型因子VIIaに関して実質的に変更された活性を有する因子VII変異型は、TF独立的因子Xタンパク質分解活性を示す因子VII変異型およびTFに結合するが、因子Xを切断しない変異型を包含するが、これらに限定されない。
【００２５】
因子VIIの変異型は、野生型因子VIIと実質的に同一であるか、またはそれよりもすぐれた生物学的活性を示すか、あるいは野生型因子VIIに関して実質的に変更されたまたは減少した生物学的活性を示すかどうかにかかわらず、1または2以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により野生型因子VIIの配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、これらに限定されない。
【００２６】
野生型因子VIIと実質的に同一の生物学的活性を有する因子VII変異型の非限定的例は次の通りである：S52A−FVIIa、S60A−FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352：182−192, 1998)；米国特許第5,580,560号に開示されているような増加したタンパク質分解安定性を示すFVIIa変異型；残基290と291との間または残基315と316との間でタンパク質分解的に切断された因子VIIa (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48：501−505, 1995)；および因子VIIaの酸化された形態 (Komfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363：43−54, 1999)。
【００２７】
野生型因子VIIに関して実質的に減少したまたは変更された生物学的活性を有する因子VIIの非限定的例は次の通りである：R152E−FVIIa (Wildgoose et al., Biochem. 29：3413−3420,1990)、S344A−FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270：66−72, 1995 )、FFR−FVII (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15：515−520, 1998 )、およびGlaドメインを欠如する因子VIIa (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317：245−249, 1993)。化学的修飾された因子VIIポリペプチドおよび配列変異型の非限定的例は、例えば、米国特許第5,997,864号に開示されている。
【００２８】
アスパラギン連結グリコシル化
本発明は、因子VIIグリコ型の特定のスペクトル、すなわち、アスパラギン連結 (N−連鎖) オリゴサッカライド鎖の前もって決定したパターンを有する因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドの調製物を提供する。
【００２９】
本明細書において使用するとき、N−連鎖グリコシル化の「パターン」またはグリコ型の「パターン」、「分布」、または「スペクトル」は、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドの所定集団内の特定のオリゴサッカライド構造の表示を言及する。このようなパターンの非限定的例は、(i) 少なくとも1つのシアル酸残基を有する；(ii) シアル酸残基を欠如する (すなわち、電荷が中性である)；(iii) 少なくとも1つの末端ガラクトース残基を有する；(iv) 少なくとも1つのN−アセチルガラクトサミン残基を有する；(v) 少なくとも1つの「アンキャプド」触角を有する、すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基を有する；または (vi) 触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基に対してα1→3連鎖した少なくとも1つのフコースを有する、オリゴサッカライド鎖の相対的特性を包含する。
【００３０】
本明細書において使用するとき、オリゴサッカライド鎖は単一アスパラギン残基共有結合した全オリゴサッカライド構造を言及する。因子VIIは通常Asn 145およびAsn 322においてグリコシル化されている。ヒトにおいてその場で産生された因子VII上のN−連鎖オリゴサッカライドは、二成分、三成分、または四成分であることができ、各触角はMan残基に対する構造Neu5Ac (α2→3またはα2→6) Gal (β1→4) GlcNAc連鎖 (β1→2、4、または6) を有し、Man残基はMan (β1→4) GlcNAc (β1→4) GlcNAc−Asnに対して連鎖 (α1→3または6) されている。
【００３１】
(Neu5AcはN−アセチルノイラミン酸 (シアル酸) を意味し、Galはガラクトースを意味し、GlcNAcはN−アセチルグルコサミンを意味し、そしてManはマンノースを意味する)。また、オリゴサッカライド鎖はGlcNAcに対してα1→6連鎖することができるフコース残基を含んでなることができる。因子VIIがヒトにおいてその場で産生されるとき、オリゴサッカライド鎖のいくつかはコアフコース残基を欠如する；鎖のすべては触角状（antennary）フコース残基を欠如する；そして鎖のすべてはほとんど完全にシアリル化されている、すなわち、各触角の末端糖はα2→3またはα2→6連鎖を介してガラクトースに連鎖されたN−アセチルノイラミン酸である。
【００３２】
しかしながら、他の環境において産生されるとき、因子VIIは1または2以上のそれらの触角上に異なる末端構造を有するオリゴサッカライド鎖を含有することができる、例えば、シアル酸残基を欠如する；N−グリコリルノイラミン酸 (Neu5Gc) 残基を含有する；ガラクトースの代わりに末端N−アセチルガラクトサミン (GlcNAc) 残基を含有する；およびその他。例えば、仔ウシ血清の存在下に培養されたBHK細胞において産生されるとき、因子VII調製物は下記のオリゴサッカライドパターンを示す：
【００３３】
− オリゴサッカライド鎖の87〜93％は少なくとも1つのシアル酸残基を含有する；
− 7〜13％は中性である (シアル酸を欠如する)；
− 9〜16％は少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含有する；
− 19〜29％は少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含有する；そして
− 30〜39％は少なくとも1つのアンキャプド触角を含有する、すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基を含有する。
【００３４】
本発明者らは、以前に記載されたものと異なる特異的な前もって決定したオリゴサッカライドパターンを含有する因子VII調製物を調製した。本発明は、下記のグリコ型パターンの1または2以上を示す因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチド対応する調製物を包含する。
【００３５】
(i) オリゴサッカライド鎖の約94〜100％、例えば、約94〜99％、約95〜98％、または約96〜97％は少なくとも1つのシアル酸残基を含有する。異なる態様において、オリゴサッカライド鎖の少なくとも約94％、95％、96％、または97％は少なくとも1つのシアル酸残基を含有する；
(ii) オリゴサッカライド鎖の6％以下、例えば、約1.5〜6％または約2〜4％は中性である；
(iii) オリゴサッカライド鎖の約16％以下、好ましくは約10％以下、例えば、約6〜10％または約8〜9％は少なくとも1つの末端ガラクトースを含有する；
【００３６】
(iv) オリゴサッカライド鎖の約25％以下、好ましくは10％、例えば、約6〜9％または約7〜8％は少なくとも1つの末端GlcNAc残基を含有する；
(v) オリゴサッカライド鎖の約30％以下、好ましくは約25％以下、例えば、約11〜23％または約12〜18％は少なくとも1つのアンキャプド触角を含有する；そして
(vi) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約2％、好ましくは少なくとも約5％、より好ましくは少なくとも約10％または20％、最も好ましくは少なくとも約40％は触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基 (すなわち、Man残基に対してβ1→2、4、または6連鎖されたN−アセチルグルコサミン残基) にα1→3連鎖された少なくとも1つのフコースを含有する。
【００３７】
(i) 〜 (vi)の各々は本発明に包含される独特なグリコ型パターンを表すことができる、すなわち、本発明による調製物は (i) 〜 (vi) のただ1つにより記載することができることが理解されるであろう。選択的に、特定のグリコ型パターンに依存して、本発明に包含される調製物は(i) 〜 (vi) の2以上により記載できることがことが理解されるであろう。
【００３８】
さらに、本発明に包含される調製物は、(i) 〜 (vi) の1または2以上と他の構造的特徴の1または2以上との組み合わせにより記載することができる。例えば、本発明は、シアル酸残基 (Neu5AcまたはNeu5Gc) がもっぱらα2→3の立体配置においてガラクトースに連鎖されている、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物を包含する。本発明は、また、コアN−アセチルグルコサミンにα1→6連鎖されたフコースおよび／または触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンにα1→3連鎖されたフコースを含有する、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物を包含する。
【００３９】
1系列の態様において、本発明の調製物は、オリゴサッカライド鎖の99％より多くが少なくとも1つのシアル酸残基を含有し、かつ (a) シアル酸残基がもっぱらα2→3立体配置で連鎖されており、および／または (b) コアN−アセチルグルコサミンに連鎖されたフコース残基が存在し、および／または検出可能な数の触角がN−アセチルガラクトサミンにおいて終止する、因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを包含する。
【００４０】
1つの態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の99％より多くが少なくとも1つのシアル酸残基を含有し、かつシアル酸残基がもっぱらα2→3立体配置でガラクトースに連鎖されている、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。他の態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の99％より多くが少なくとも1つのシアル酸残基を含有し、かつオリゴサッカライド鎖の少なくともいくつかがN−アセチルガラクトサミンを含んでなる、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。本発明は、ヒト血漿から単離され、グルコシダーゼを使用するex vivo処理により変性されていない、野生型因子VIIまたは野生型因子VIIaを包含しない。
【００４１】
1つの態様において、因子VIIa調製物は1つの触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンにα1→3連鎖された単一のフコースを有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。他の態様において、因子VIIa調製物は二触角状（antennary）オリゴサッカライド (シアリルルイスX構造) の各触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンの各々にα1→3連鎖されたフコース残基を有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。他の態様において、因子VIIa調製物は、(i)コアN−アセチルグルコサミンに連鎖されたフコースおよび (ii) 1つの触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンにα1→3連鎖された単一のフコースを有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。他の態様において、因子VIIa調製物は、(i) コアN−アセチルグルコサミンに連鎖されたフコースおよび (ii) 二触角状（antennary）オリゴサッカライドの各触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンの各々にα1→3連鎖されたフコース残基を有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。
【００４２】
本発明を実施するとき、この分野において知られている方法を使用して、N−連鎖オリゴサッカライドのパターンを決定することができる。このような方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：高性能液体クロマトグラフィー (HPLC)；毛管電気泳動 (CE)；核磁気共鳴 (NMR)；イオン化技術、例えば、高速電子衝撃法、エレクトロスプレー、またはマトリックス援用レーザー脱着 (MALDI) を使用する質量分析 (MS)；ガスクロマトグラフィー (GC)；およびアニオン交換 (AIE)−HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)、MSと組み合わせたエキソグリコシダーゼを使用する処理。
【００４３】
例えば、下記の文献を参照のこと：Weber et al., Anal. Biol. Chem. 225：135 (1995)；Klausen et al., J. Chromatog. 718：195 (1995)；Morris et al., Mass Spectrometry of Biological Materials, MoEwen et al., 編者, Marcel Dekker, (1990), pp. 137−167；Conboy et al., Biol. Mass Biochem. 21：397, 1992；Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193：554 (1990)；Sutton et al., Anal. Biochem. 318：34 (1994)；Harvey et al., Organic Mass Spectrometry 29：752 (1994)。
【００４４】
前述の方法 (または異なる構造を有するオリゴサッカライド鎖を分離する他の方法) を使用して因子VII由来オリゴサッカライド鎖を分離した後、分離された種は、例えば、グループ (i) 〜 (vi) の1つに割り当てられる。試料中のオリゴサッカライド鎖の全含量に関するそのグループに割り当てられたオリゴサッカライドの合計として、(i) 〜 (vi) の各々の相対的含量を計算する。
【００４５】
例えば、AIE−HPLCを使用して、13またはそれより多いオリゴサッカライドピークをBHK細胞中で産生された組換え因子VII調製物から分離することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Klausen et al., Mol. Biotechnol. 9：, 1998。ピークのうちの５つ (Klausen et al.において1〜5と表示される) はシアル酸を含有しないが、ピークのうちの８つ (6、７、および10〜15と表示される) はシアル酸を含有する。
【００４６】
所定の解析において、シアル酸を含有する鎖およびシアル酸を欠如する鎖の数および分布は、(a) 発現されるポリペプチド；(b) 細胞型および培養条件；および (c) 使用する解析法に依存し、そして生ずるパターンはそれに応じて変化することが理解されるであろう。
【００４７】
いずれの場合においても、いったんシアル酸を含有するオリゴサッカライド鎖がシアル酸を含有しないオリゴサッカライド鎖から分離されると、慣用のデータ解析プログラムを使用して各ピークの下の面積；全ピーク面積；および特定のピークにより表される全ピーク面積の百分率を計算する。この方法において、シアル酸を含有するピークの面積の合計／全ピーク面積×100 ＝ 本発明による調製物についてのシアリル化値％ (すなわち、少なくとも1つのシアル酸残基を含有するオリゴサッカライド鎖の比率) である。同様な方法において、シアル酸を含有しないまたは少なくとも1つのまたはN−アセチルグルコサミンを含有する鎖の％を計算することができる。
【００４８】
N−連鎖オリゴサッカライドの前もって決定したパターンを有する因子VII調製物を調製する方法
因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを発現する適当な宿主細胞を使用して、各々がN−連鎖オリゴサッカライドの前もって決定したパターンを有する、因子VII、因子VII変異型、または因子VII関連ポリペプチドの調製物を調製することができる。
【００４９】
宿主細胞：ある態様において、宿主細胞は内因的因子VII遺伝子を発現するヒト細胞である。これらの細胞において、内因的遺伝子は完全であるか、あるいはその場で修飾されているか、あるいは因子VII遺伝子の外側の配列をその場で修飾して内因的因子VII遺伝子の発現が変更されていることができる。内因的因子VII遺伝子を発現することができるヒト細胞を使用することができる。
【００５０】
他の態様において、組換え遺伝子からヒト因子VIIを発現するように、異種宿主細胞をプログラムする。宿主細胞は脊椎動物門、昆虫、または真菌の細胞であることができる。好ましくは、細胞は哺乳動物のN−連鎖グリコシル化；O−連鎖グリコシル化；およびγ−カルボキシル化の全スペクトルが可能である哺乳動物細胞である。例えば、米国特許第4,784,950号参照。
【００５１】
好ましくは哺乳動物細胞は下記のものを包含する：CHO (例えば、ATCC CCL 61)、COS−1 (ATCC CRL 1650)、ベイビーハムスター腎 (BHK)、およびHEK 293 (ATCC CRL 1573；Graham et al., J. Gen. Virol. 36：59−72, 1977) 細胞系統。好ましいBHK細胞系統はtk- ts 13 BHK細胞系統 (WaechterおよびBaserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：1106−1110, 1982)、(以後においてBHK 570細胞と呼ぶ) である。BHK 570細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection) (米国マリイランド州20852、ロックビレパークローンドライブ12301) からATCC受け入れ番号CRL 10314で入手可能である。また、tk- ts 13 BHK細胞系統はATCCから受け入れ番号CRL 1632で入手可能である。
【００５２】
さらに、多数の他の細胞系統を使用することができ、下記のものを包含する：Rat Hep I (ラットヘパトーム；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (ラットヘパトーム；ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、ヒト肺 (ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)；DUKX細胞 (CHO細胞系統) (UrlaubおよびChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216−4220, 1980) (DUKX細胞をまたDXB11細胞と呼ぶ)、およびDG44 (CHO細胞系統) (Cell, 33：405, 1983およびSomatic Cell and Molecular Genetics 12：555, 1986)。また、3T3細胞、Namalwa細胞、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞と他の細胞との融合物は有用である。
【００５３】
特定の好ましい態様において、宿主細胞は血清の非存在下に増殖するように適合され、因子VIIを発現するようにプログラムされたBHK 21細胞である。ある態様において、細胞は、それらが由来された細胞型と品質的または定量的に異なるスペクトルのグリコシル化酵素 (例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび／またはグルコシダーゼ) を発現する突然変異または組換え体細胞であることができる。また、他の異種ペプチドまたはタンパク質、例えば、因子VIIのトランケートされた形態を発現するようにプログラムすることができる。1つの態様において、宿主細胞は問題の因子VIIポリペプチド (すなわち、因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチド) および他の異種ペプチドまたはポリペプチド、例えば、因子VIIフラグメントの修飾性酵素の両方を共発現するようにプログラムされたCHO細胞である。
【００５４】
方法：本発明は、(i) 〜 (vi) として前述したグリコ型パターンの任意のものを含んでなる調製物を調製する方法および、それ以上の態様において、因子VIIおよび因子VII関連ポリペプチドのグリコ型分布を最適化する方法を包含する。これらの方法は下記の工程を含んでなる：
(a) 因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを発現する細胞を第1組の前もって決定した培養条件下に培養し、
(b) 培養物から因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを回収して、ポリペプチドを含んでなる調製物を獲得し、そして
(c) ポリペプチドに連鎖したオリゴサッカライドの構造を解析して調製物のグリコ型パターンを決定する。
【００５５】
これらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：
(d1) 工程 (a) の培養条件を変更して第2組の前もって決定した培養条件を達成し、そして
(e1) 所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程 (b) 〜 (d1) を反復する。
選択的に、それらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：
(d2) 調製物を化学的または酵素的に処理してオリゴサッカライドの構造を変更し、そして
(e2) 所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程 (b) 〜 (d2) を反復する。
【００５６】
これらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：前もって決定したグリコ型パターンを有する調製物を生物学的活性 (例えば、凝固、因子Xタンパク質分解、またはTF結合を包含する) または他の機能 (例えば、薬物速度論的プロファイルまたは安定性) の少なくとも1つについて試験し、そして特定のグリコ型パターンを特定の生物学的活性または機能のプロファイルに相関させる。
【００５７】
工程 (d1) において変更できる培養条件の変動は下記のものを包含するが、これらに限定されない：細胞の起源、例えば、本来使用されたものと異なる種に由来する細胞；または1または2以上のグリコシルトランスフェラーゼまたはグルコシダーゼまたはグリコシル化装置の他の成分を有する突然変異体または組換え細胞 (下記の文献を参照のこと：Grabenhorst et al., Glycoconjugate J. 16：81, 1999；Bragonzi et al., Biochem. Biophys. Acta 1474：273, 2000；Weikert, Nature Biotechnol. 17：1116, 1999)；ポリペプチドの発現レベル；代謝条件、例えば、グルコースまたはグルタミン濃度；血清のの非存在または存在；ビタミンKの濃度；タンパク質加水分解物、ホルモン、微量金属、塩類ならびにプロセスのパラメーター、例えば、温度、溶解酸素レベルおよびpH。
【００５８】
調製物のオリゴサッカライドパターンを変更するために使用できる酵素処理は下記のものを包含するが、これらに限定されない：順次にかつ特定の末端構造を有するオリゴサッカライド鎖の分布の所望変更を達成する条件下に、シアリダーゼ (ニューロアミダーゼ)、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、および／またはシアリルトランスフェラーゼの1または2以上を使用する処理。グリコシルトランスフェラーゼはCalbiochem (カリフォルニア州ラジョラ) から商業的に入手可能であり、そしてグルコシダーゼはGlyko, Inc. (カリフォルニア州ノバト) から商業的に入手可能である。
【００５９】
1系列の態様において、因子VIIまたは関係ポリペプチドを発現する宿主細胞を特異的培養条件に対して暴露し、ここで宿主細胞は (i) 〜 (vi) のいずれかとして前述したオリゴサッカライド構造の所望のパターンを有するグリコシル化因子VIIポリペプチドを分泌する。このような条件は、血清の非存在または完全な非存在下の還元を包含するが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞を血清の非存在下に増殖するように適合させ、増殖期および調製期の両方において血清の非存在下に培養する。
【００６０】
このような手順は、例えば、下記の文献に記載されている：Scharfenberg et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21st Century, E. C. et al. (編者)、Kluwer Academic Publishers, pp. 619−623, 1995 (BHKおよびCHO細胞)；Cruz, Biotechnol. Tech. 11：117−120, 1997 (昆虫細胞)；Keen, Cytotechnol. 17：203−211, 1995 (骨髄腫細胞)；Berg et al., Biotechniques 14：972−978, 1993 (ヒト腎臓293細胞)。他の好ましい態様において、細胞に添加される増殖培地は動物組織または動物細胞培養物から単離されたタンパク質または他の成分を含有しない。
【００６１】
例えば、下記の実施例1参照。典型的には、慣用成分に加えて、因子VIIの産生に適当な培地は、因子VII中のグルタミン残基γ−カルボキシル化に必要なビタミンKを0.1〜50 mg／lの濃度で含有する。
他の系列の態様において、本発明のグリコ型は因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドの調製物をその中に含有されるN−連鎖オリゴサッカライドの酵素的および／または化学的修飾に付す。
【００６２】
因子VII調製物
本明細書において使用するとき、「因子VII調製物」は、それらが産生された細胞から分離された、複数の因子VIIポリペプチド、因子VIIaポリペプチド、または因子VII関連ポリペプチドを意味し、変異型および化学的に修飾された形態を包含する。
この分野において知られている方法により、ポリペプチドを由来細胞から分離することができる。このような方法は、付着細胞培養物からの所望産物を含有する細胞培地の収集；付着細胞を除去する遠心または濾過；およびその他を包含するが、これらに限定されない。
【００６３】
必要に応じて、因子VII調製物をさらに精製することができる。精製はこの分野において知られている方法により達成することができる。このような方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：アフィニティークロマトグラフィー、例えば、抗因子VII抗体カラム上のアフィニティークロマトグラフィー (例えば、下記文献を参照のこと、Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261：11097, 1986；およびThin et al., Biochem. 27：7785, 1988)；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手法 (例えば、調製用等電点電気泳動 (IEF)、分別溶解度 (例えば、硫酸アンモニウム沈降法)、または抽出およびその他。
【００６４】
一般に、下記の文献を参照のこと：Scopes, Protein Purification, Springer−Verlag, New York, 1982；およびProtein Purification, J.−C. JansonおよびLars Ryden, 編者, VCH Publishers, New York, 1989。精製後、調製物は好ましくは約10重量％より少ない、より好ましくは約5重量％より少ない、最も好ましくは約1重量％より少ない量の宿主細胞に由来する非因子VIIタンパク質を含有する。
【００６５】
因子VIIおよび因子VII関連ポリペプチドは、因子VIIaまたはトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば、因子IXa、カリクレイン、因子Xa、およびトロンビンを使用する、タンパク質分解的活性化により活性化することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Osterud et al., Biochem. 11：2853 (1972)；Thomas, 米国特許第4,456,591号；およびHedner et al., J. Clin. Invest. 71：1836 (1983)。選択的に、因子VIIは、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えば、Mono−QTM (Pharmacia) またはその他に通過させることによって活性化することができる。次いで、後述するように、生ずる活性化された因子VIIを処方し、投与することができる。
【００６６】
因子VII調製物の機能的性質
本発明による前もって決定したオリゴサッカライドパターンを有する因子VIIポリペプチドおよび因子VII関連ポリペプチドの調製物は、参照調製物に関して機能的性質を示す。改良された性質は下記のものを包含するが、これらに限定されない：a) 物理的性質、例えば、貯蔵安定性；b) 薬物速度論的性質、例えば、生物学的利用能および半減期；およびc) ヒトにおける免疫原性。
【００６７】
参照調製物は、アスパラギン連結グリコシル化の異なるパターンを示す以外、それが調製されている本発明による調製物の中に含有されるポリペプチドと同一であるポリペプチド (例えば、野生型因子VIIまたは特定の変異型または化学的に変更された形態) を意味する。例えば、参照調製物は典型的には下記のグリコ型パターンの1または2以上を含んでなる：(i) オリゴサッカライド鎖の約93より小 (例えば、約92％より小または約90％より小) は少なくとも1つのシアル酸残基を含有する；(ii) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約6％ (例えば、少なくとも約7.5％または少なくとも約10％) はシアル酸を欠如する (すなわち、中性である)；
【００６８】
(iii) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約10％ (例えば、少なくとも12.5％または少なくとも約15％) は少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含有する；(iv) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約15％ (例えば、少なくとも約20％または少なくとも約25％) は少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含有する；(v) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約25％ (例えば、少なくとも約30％または少なくとも約35％) は少なくとも1つのアンキャプド触角を含有する (すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基を含有する)；または (vi) 本質的に検出不可能レベルの (例えば、約0.2％より少ない) 触角状（antennary）フコース残基。
【００６９】
因子VII調製物の貯蔵安定性は、(a) 25 ℃において乾燥粉末として貯蔵したとき、調製物の生物学的活性の20％が崩壊するために要求される時間および／または (b) 調製物中の因子VIIa凝集物の比率が2倍となるために要求される時間を測定することによって評価することができる。
【００７０】
ある態様において、本発明の調製物は、それと参照調製物とを25 ℃において乾燥粉末として貯蔵したとき、参照調製物において同一現象に要求される時間に関して生物学的活性が20％崩壊するために要求される時間が少なくとも約30％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約100％増加することを示す。生物学的活性の測定は、凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、TF結合アッセイ、またはTF独立的トロンビン発生アッセイを使用して実施することができる。
【００７１】
ある態様において、本発明の調製物は、それと参照調製物とを25 ℃において乾燥粉末として貯蔵したとき、参照調製物に関して凝集物が2倍になるために要求される時間が少なくとも約30％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約100％増加することを示す。凝集物の含量は、次のようにしてProtein Pak 300 SWカラム (7.5×300 mm) (Waters、80013) 上のゲル透過HPLCにより測定される。このカラムを溶離液A (0.2 M硫酸アンモニウム、5％イソプロパノール、pHをリン酸で2.5に調節し、次いでpHをトリエチルアミンで7.0に調節する) と平衡化し、次いで25 μgの試料をカラムに適用する。溶離を溶離液Aで0.5 ml／分の流速で実施し、215 nmにおける吸収を測定することによって検出を達成する。凝集物含量を因子VII凝集物のピーク面積／因子VIIのピークの全面積として計算する。
【００７２】
「生物学的利用能」は、投与後、前もって決定した時間において血漿中で検出することができる因子VIIまたは因子VII関係調製物の投与量の比率を意味する。典型的には、生物学的利用能は、試験動物において、約25〜250 μg／kgの調製物を投与し、投与後、前もって決定した時間において血漿試料を採り、そして凝固アッセイ (またはバイオアッセイ)、イムノアッセイ、または同等のアッセイの1または2以上を使用して因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドの含量を測定することによって決定される。データは典型的には［因子VII］／時間としてグラフで表示され、そして生物学的利用能は曲線の下の面積として表される (AUC)。試験調製物の相対的生物学的利用能は、試験調製物のAUCと参照調製物のそれとの間の比を意味する。
【００７３】
ある態様において、本発明の調製物は、参照調製物の生物学的利用能の少なくとも約110％、好ましくは少なくとも約120％、より好ましくは少なくとも約130％、最も好ましくは少なくとも約140％の相対的生物学的利用能を示す。生物学的利用能は、任意の哺乳動物種、好ましくはイヌにおいて測定することができ、そしてAUCの計算に使用する前もって決定した時間は10分〜8時間の異なる増分を包含することができる。
【００７４】
「半減期」は、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドの血漿濃度を特定の値からその値の半分に減少させるために要求される時間を意味する。半減期は生物学的利用能についてと同一の手法を使用して測定することができる。ある態様において、本発明の調製物は、参照調製物の半減期に関して、少なくとも約0.25時間、好ましくは少なくとも約0.5時間、より好ましくは少なくとも約1時間、最も好ましくは少なくとも約2時間の半減期の増加を示す。
【００７５】
「免疫原性」は、ヒトに投与したとき、体液性、細胞性、または両方であるかどうかにかかわらず、有害な免疫応答を誘発する調製物の能力を意味する。因子VIIポリペプチドおよび因子VII関連ポリペプチドがヒトにおいて検出可能な免疫応答を誘発することは知られていない。それにもかかわらず、任意のヒトの下位集団において、特定の投与したタンパク質に対して感受性を示す個体が存在することがある。免疫原性は、この分野において知られている慣用法を使用して、感受性個体において抗因子VII抗体および／または因子VII応答性T細胞の存在を定量することによって測定することができる。ある態様において、本発明の調製物は、参照調製物のその個体についての免疫原性に関して、少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約40％、最も好ましくは少なくとも約50％の感受性個体における免疫原性の減少を示す。
【００７６】
医薬組成物および使用法
本発明の調製物は、因子VII応答性症候群、例えば、出血性障害を治療するために使用することができる。このような症候群は、凝固因子欠乏症 (例えば、血友病AおよびBまたは凝固因子XIまたはVIIの欠乏症)；血小板減少症尾残基フォン・ウィルブランド病；または凝固因子のインヒビター、またはいずれかの原因からの過剰の出血性により引き起こされる症候群を包含するが、これらに限定されない。また、調製物は、外科手術または他の外傷に関連する患者に、または抗凝固治療を受けている患者に投与することができる。
【００７７】
野生型因子VIIに関して実質的に減少した生物学的活性を有する、本発明による因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物は、例えば、血管形成、または再狭窄において起こるような血管の血栓症または閉塞の危険を増加することがある他の外科的手法を受けている患者において、抗凝固剤として使用することができる。抗凝固剤を処方される他の医学的適用は下記のものを包含するが、これらに限定されない：深静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発生血管内凝固症候群 (DIC) 、グラム陰性内毒素血症に関連する肺および腎臓におけるフィブリン沈着、心筋梗塞；急性呼吸窮迫症候群 (ARDS )、全身炎症応答症候群(SIRS)、溶血性尿毒症症候群 (HUS)、MOFおよびTTP。
【００７８】
本発明による因子VIIおよび因子VII関連ポリペプチドを含んでなる医薬組成物は、予防的および／または療法的治療のための非経口的投与に主とし意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内に投与される。それらは連続的または間欠的注入により投与することができる。
【００７９】
医薬組成物または処方物は、生理学上許容される担体、好ましくは水性担体または希釈剤と組み合わせた、好ましくはその中に溶解した、本発明による調製物を含んでなる。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、0.4％の生理食塩水、0.3％のグリシンおよびその他を使用することができる。本発明の調製物は、また、損傷部位への送達またはターゲッティングのためにリポソーム調製物に処方することができる。リポソーム調製物は、例えば、米国特許第4,837,028号、米国特許第4,501,728号、および米国特許第4,975,282号に一般的に記載されている。組成物は慣用のよく知られている滅菌技術により滅菌することができる。生ずる水溶液を使用するために包装するか、あるいは無菌的条件下に濾過し、凍結乾燥であることができ、凍結乾燥調製物は無菌の水溶液と組み合わせた後、投与することができる。
【００８０】
組成物は薬学上許容される助剤またはアジュバントを含有することができる。このような助剤またはアジュバントは、pH調節剤および緩衝剤および／または張度調節剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、およびその他を包含するが、これらに限定されない。これらの処方物中の因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドの濃度は、広く変化させることができ、すなわち、約0.5重量％から、通常少なくとも約1重量％から15または20重量％程度に多くあることができ、そして選択した特定の投与モードに従い、流体体積、粘度、およびその他により主として選択されるであろう。
【００８１】
こうして、静脈内注入のために典型的な医薬組成物は250 mlの無菌のリンガー溶液および10 mgの調製物を含有するように構成することができる。非経口的に投与可能な組成物について実際的方法は既知であるか、あるいは当業者にとって明らかでありそして、例えば、下記の文献にいっそう詳しく記載されている：Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, ペンシルベニア州イーストン (1990)。
【００８２】
本発明の調製物を含有する組成物は、予防的および／または療法的治療のために投与することができる。療法的適用において、組成物は、前述したように、既に疾患を患う患者に、疾患およびその合併症を治療し、軽減し、または部分的に抑制するために十分な量で投与される。これを達成するために適切な量は、「治療的に有効な量」として定義される。各目的に有効な量は、疾患または外傷の重症度ならびに被検体の体重および一般的状態に依存するであろう。しかしながら、一般に、有効量は70 kgの被検体について約0.05 mg〜約500 mgの調製物／日の範囲であり、約1.0 mg〜約200 mgの調製物／日はいっそう普通に使用されるであろう。日常的実験を使用して、値のマトリックスを構成し、マトリックス中の異なる点を試験することによって、適当な投与量を決定することができることが理解されるであろう。
【００８３】
例えば、局所的適用するための、本発明の調製物の局所的デリバリーは、例えば、噴霧、潅流、二重バルーンカテーテル、ステント、脈管の移植片またはステントの中への組込み、バルーンカテーテルの被覆に使用されるヒドロゲル、または他の十分に確立された方法により実施することができる。いずれの場合においても、医薬組成物は被検体を効果的に治療するために十分な量の調製物を提供すべきである。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、他の生物学的活性剤、例えば、非因子VII関係凝固剤または抗凝固剤をさらに含むことができる。
下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
【００８５】
実施例
実施例 1．変更されたグリコ型パターンを示す因子 VII ポリペプチドの調製および分析
変更されたグリコ型パターンを有する因子VII調製物を調製するために、下記の実験を実施した。
I. 調製：
因子VIIエンコーディングプラスミドで形質転換したBHK細胞系統を、血清の非存在下に懸濁培養で増殖するように適合させた。細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【００８６】
最後に、マクロ多孔質Cytopore 1担体 (Pharmacia) を含有する100リットルの調製バイオリアクターの中に6リットルの種子培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。36 ℃、pH 6.7〜6.9および50％のDOにおいて、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。細胞密度がほぼ2×106細胞／mlに到達したとき、調製期を開始させ、培地の交換を24時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の80％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
調製期間の間に、細胞は3〜6×106細胞／mlおよび2〜7 mgの因子VII／リットルの力価に到達した。
【００８７】
II. 組換え因子VIIのグリコ型パターンの解析：
下記の調製物のオリゴサッカライドパターンを比較した：(a) 部Iに記載したように調製された組換え因子VII調製物 (n＝7)；および2つの参照調製物：(b) 仔ウシ血清の存在下にBHK細胞中で産生された組換え因子VII調製物 (n＝10)；および (c) ヒト血漿から精製された因子VII調製物。
【００８８】
化学的切断 (ヒドラジン分解、GlycoPrep 1000ユニット、Oxford GlycoSciences)または酵素的切断 (N−グルコシダーゼ、例えば、Boehringer Mannheimから) により、N−連鎖オリゴサッカライドを解放させた。解放されたオリゴサッカライドを2−アミノベンズアミドで標識化した (シグナル標識化キット、K−404、Oxford GlycoSciences)。Guardカラム (4×50 mm、Dionex、P/N 43054)とともにCarboPac PA100カラム (4×250 mm、Dionex、P/N 43055) 上のアニオン交換HPLCを使用して、標識化オリゴサッカライドを分析した。カラムを150 mMの水酸化ナトリウムと平衡化し、0〜150 mMの酢酸ナトリウムの勾配、15 mMの水酸化ナトリウムで溶離した。蛍光、330 nmにおける励起および420 nmにおける放射を使用して、オリゴサッカライドを検出した。
【００８９】
種々の因子VIIオリゴサッカライド構造の相対的含量 (Klausene et al., 1998) を、アニオン交換HPLC分析において炭水化物ピークについての相対的ピーク面積として計算した。各オリゴサッカライドの構造要素に基づいて、それを下記の1つに割り当てた：(i) 少なくとも1つのシアル酸を含有する鎖；(ii) シアル酸を欠如する (すなわち、中性である) 鎖；(iii) 少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含有する鎖；(iv) 少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含有する鎖；および (v) 少なくとも1つのアンキャプド触角 (すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基) を含有する鎖。最後に、各グループに割り当てられたオリゴサッカライド鎖の相対的含量の合計を、全オリゴサッカライド鎖の百分率として計算した。この決定の標準偏差は0.08％であると計算された (その日の変動)；0.7％ (日々の変動)；および0.5％ (1〜100 μgの間隔)。
得られたグリコ型パターンを下記表に記載する：
【００９０】
【表１】
【００９１】
この実施例に従い (すなわち、血清の非存在下に) 調製した組換え因子VII調製物は、血清の存在下に調製された組換え因子VIIおよびヒト血漿から単離された自然因子VIIの両方のグリコ型パターンと異なるグリコ型パターンを示す。血清の非存在下に調製された組換え因子VIIのオリゴサッカライドは、血清の存在下に調製されたものよりも高い程度にシアリル化され、より少ない中性鎖およびガラクトースまたはN−アセチルガラクトサミンにおいて終止する、より少ない鎖を含有する。
【００９２】
III. 生物学的利用能：
前述したように調製された2つの因子VII調製物 (IおよびII) を2つの参照因子VII調製物 (すなわち、血清の存在下に調製した) (AおよびB) と比較するために、下記の実験を実施した。
塩化ナトリウム (7.87 mg／ml)、塩化カルシウム二水和物 (1.48 mg／l)、マンニトール (2.5 mg／ml) およびポリソルベート80を含有するグリシルグリシン緩衝液 (pH 7.4) 中の被験調製物または参照調製物を25 μg／kg (＝100 μg／ラット) の投与量で、8匹のラットのグループに投与した。
【００９３】
最初の投与後、10分および30分に血液試料を抜出した。試料から血漿を獲得し、因子VIIをELISAにより定量した。10および30分の試料に基づく因子VIIについての血漿濃度曲線下の投与量調節面積として、各試料の生物学的利用能を計算した (AUC10-30／投与量)。相対的生物学的利用能を、平均AUC10-30／投与量の被験および参照試料の比×100として表す。相対的生物学的利用能についての信頼限界を、調製物間の差についての90％信頼限界から計算した。
結果を下記表に要約する。(前述したように測定した、各調製物のシアリル化％を括弧中に示す)。
【００９４】
【表２】
【００９５】
これらの結果が示すように、少なくとも1つのシアル酸残基を有するオリゴサッカライド鎖の比率における差が比較的小さい、例えば、93％および96または97％であるが、生物学的利用能に対する衝撃は顕著であることがある (20〜30％の増加)。その上、シアリル化％の10％の増加は生物学的利用能を40〜50％増加させる。
【００９６】
実施例 2．変更されたグリコ型パターンを示す因子 VII 調製物の分析
因子VIIを500リットルの培養物から収集した以外、上記実施例1に記載されているように因子VIIを調製した。グリコ型の分析を実施例1に記載されているように実施した。3つの独立の調製物 (A、B、およびC) を分析し、参照調製物 (D) と比較した。
【００９７】
生物学的利用能を次のようにしてイヌモデルにおいて測定した：4つのグループに分割した12ビーグル犬においてについて脚交叉研究として、実験を実施した。塩化ナトリウム (2.92 mg／ml)、塩化カルシウム二水和物 (1.47 mg／l)、マンニトール (30 mg／ml) およびポリソルベート80を含有するグリシルグリシン緩衝液 (pH 5.5) 中の3つの被験調製物A、B、およびCおよび参照調製物Dを約90 μg／kg (＝100 μg／ラット) の投与量で、すべての動物に投与した。最初の投与後、10、30、および60分および2、3、4、6および8時間に血液試料を抜出した。試料から血漿を獲得し、因子VIIをELISAにより定量した。
【００９８】
各試料の生物学的利用能を因子VIIについての血漿濃度曲線の下の投与量調節面積として表す(AUC／投与量)。相対的生物学的利用能を、平均AUC／投与量の被験および参照試料の比×100として表し、相対的生物学的利用能についての90％信頼限界を計算した。
結果を下記表に要約する。上記実施例1に記載したように測定した、各調製物のシアリル化％を括弧中に示す。
【００９９】
【表３】
【０１００】
これらの結果が示すように、少なくとも1つのシアル酸残基を有するオリゴサッカライド鎖の比率における小さい差は、因子VIIについての生物学的利用能に対して顕著な衝撃を有する。シアリル化％の10％の増加は生物学的利用能を30〜50％増加させ、3つの被験調製物および参照調製物について密接〜直線的関係が存在する。
【０１０１】
実施例3．変更されたグリコ型パターンを示す因子 VII 調製物
変更されたグリコ型パターンを有する因子VII調製物を調製するために、下記の実験を実施した。
I. 細胞系統の構築および因子VIIの調製
ヒト因子VIIの発現用プラスミドベクターpLN174は記載された (PerssonおよびNielsen, 1996, FEBS Lett. 385：241−243)。簡単に述べると、それはヒト因子VIIをコードするcDNAヌクレオチド配列を保持し、挿入されたcDNAの転写用マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にポリペプチド、および選択可能なマーカーとして使用するためのSV40初期プロモーターの制御下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼcDNAを含む。
【０１０２】
γ−カルボキシル化認識配列をコードするプラスミドベクターを構築するために、そのポリペプチドを含む因子VIIをコードするcDNAを含有するクローニングベクター (pBluescript II KS+、Stratagene) を使用した (pLN171)。(Persson et al., 1997, J. Biol. Chem. 272：19919−19924)。このクローニングベクター上の逆位PCR仲介突然変異誘発により因子VIIのポリペプチド後に因子VIIをコードするcDNAの中に、停止コドンをコードするヌクレオチド配列を挿入した。NaOHを使用する処理および引き続く下記のプライマーとともにポリメラーゼPwo (Boehringer−Mannheim) およびTaq (Perkin−Elmer) ポリメラーゼを使用するPCRにより鋳型プラスミドを変性した：
a) 5’−AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC−3’
b) 5’−CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC−3’
【０１０３】
生ずる混合物をDpnIで消化して残留鋳型DNAを消化し、大腸菌 (Escherichia coli) をPCR生成物で形質転換した。クローンを配列決定により突然変異の存在についてスクリーニングした。正しいクローンからのcDNAをBamHI−EcoRIフラグメントとして、発現プラスミドpcDNA3 (Invitrogen) に移した。生ずるプラスミドをpLN329と命名した。CHO K1細胞 (ATCC CCL 61) を、Fugene6法 (Boehringer−Mannheim) に従い、等しい量のpLN174およびpLN329でトランスフェクトした。メトトレキセートを1 μMに添加し、G−418を0.45 mg／mlに添加することによって、トランスフェクタントを選択した。トランスフェクタントのプールを限界希釈法によりクローニングし、クローンからのFVIIの発現を測定した。
【０１０４】
高い生産性のクローンをさらにサブクローニングし、10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地中で2.4 pg／細胞／日の特異的FVII発現を示すクローンE11を選択した。商業的に入手可能な動物由来成分を含まないCHO培地 (JRH Bioscience) 中の無血清懸濁培養に対して、クローンを適合させた。
適合させた細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。25日後、6リットルの回転培養物を50リットルのバイオリアクターの中に接種した。細胞をバイオリアクター中で増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【０１０５】
最後に、マクロ多孔質Cytopore 1担体 (Pharmacia) を含有する500リットルの調製バイオリアクターの中に50リットルの種子培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。36 ℃、pH 7.0〜7.1および飽和の50％の溶解酸素テンション (DOT) において、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。
【０１０６】
細胞密度がほぼ10〜12×105細胞／mlに到達したとき、調製期を開始させ、培地の交換を24時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の80％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞 (すなわち、担体の中に固定化されなかった細胞) および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
調製期間の間に、細胞は2〜3×107細胞／mlおよび8 mgの因子VII／リットルの力価に到達した。
【０１０７】
II. グリコ型の分析：
A. 前述したように調製した因子VII調製物 (a) のオリゴサッカライドのパターンを、仔ウシ血清の存在下にBHK細胞中で調製した組換え因子VII調製物 (b) およびヒト血漿から精製した因子VII調製物 (c) のそれらと比較した。方法は実施例1に本質的に記載された通りであった。
【０１０８】
結果を下記表に要約する。オリゴサッカライドの割り当ては次の通りである：(i) 少なくとも1つのシアル酸を含有する鎖；(ii) シアル酸を欠如する (すなわち、中性である) 鎖；(iii) 少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含有する鎖；(iv) 少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含有する鎖；および (v) 少なくとも1つのアンキャプド触角 (すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基) を含有する鎖。
【０１０９】
【表４】
【０１１０】
B. 実施例1に記載したように調製した5つの独立の因子VII調製物 (a) のオリゴサッカライドのパターンを、仔ウシ血清の存在下にBHK細胞中で調製した組換え因子VII調製物 (b) およびヒト血漿から精製した因子VII調製物 (c)のそれらと比較した。実施例1に記載されている分析方法を使用した。
各オリゴサッカライドの構造的要素に基づいて、それを下記の1つに割り当てた：(i) 少なくとも1つのシアル酸を含有する鎖；(ii) シアル酸を欠如する (すなわち、中性である) 鎖；(iii) 触角に連鎖された少なくとも1つのフコースを含有する鎖。最後に、各グループに割り当てられたオリゴサッカライド鎖の相対的含量の合計を、全オリゴサッカライド鎖の百分率として計算した。この決定の標準偏差は0.08％であると計算された (その日の変動)；0.7％ (日々の変動)；および0.5％ (1〜100 μgの間隔)。
得られたグリコ型パターンを下記表に記載する：
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
実施例1に従い調製された組換え因子VII調製物 (すなわち、血清の非存在下にCHO細胞系統により産生された) は、血清の存在下に調製された組換え因子VIIおよびヒト血漿から単離された自然因子VIIの両方のグリコ型パターンと異なるグリコ型パターンを示す。血清の非存在下にCHO 282.4細胞系統により産生された組換え因子VIIのオリゴサッカライドは、参照調製物の両方に存在しない、触角に連鎖されたフコースを有する構造を含む。構造物の2つを精製し、前述したようにマトリックス援用レーザー脱着イオン化質量分析、連鎖特異的フコシダーゼ酵素を使用する処理、およびアニオン交換HPLCにより特性決定した。2つの構造物は、シアリルルイス×構造、すなわち、シアリル化オリゴサッカライド中の触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンにα1→3連鎖したフコースを含有することが示された。
【０１１３】
III. 生物学的利用能：
この実施例に記載されているように調製された5つの因子VII調製物を、(a) トロンビン発生および (b) 組織因子 (TF) に対する結合について分析し、そして血清の存在下にBHK細胞中で産生された組換え因子VII (参照) と比較した。グリコ型パターン (シアル酸を含有するオリゴサッカライド鎖の％およびフコシル化触角を含有するオリゴサッカライド鎖の％) と２つ生物学的利用能との相関を、下記表に示す。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
これらの結果が示すように、フコシル化触角を有する因子VII調製物はフコシル化触角を欠如する因子VII調製物よりも高いTF依存的因子VII活性 (例えば、トロンビン発生により示されるのような) を示す。
【０１１６】
実施例 4．in vitro 加水分解アッセイ
下記の方法を使用して因子VIIa生物学的活性をアッセイすることができる。このアッセイはマイクロタイタープレート中で実施する (MaxiSorp、デンマーク国ヌンク)。0.1 MのNaCl、5 mMのCaCl2および1 mg／mlのウシ血清アルブミンを含有する50 mMのHepes、pH 7.4中の因子VIIa (100 nMの最終濃度) に、色素形成基質D−Ile−Pro−Arg−p−ニトロアニリド (S−2288、Chromgenix、スウェーデン国) を1 mMの最終濃度で添加する。405 nmにおける吸収をSpectraMaxTM 340プレートリーダー (Molecular Devices、米国) により連続的に測定する。被験および参照因子VIIaの活性間の比を計算するために、20分のインキュベーション間に発生した吸収を、酵素を含有しないブランクウェルにおける吸収を減じた後、使用する。
【０１１７】
実施例 5．in vitro タンパク質分解アッセイ
下記の方法を使用して因子VIIa生物学的活性をアッセイすることができる。このアッセイはマイクロタイタープレート中で実施する (MaxiSorp、デンマーク国ヌンク)。0.1 MのNaCl、5 mMのCaCl2および1 mg／mlのウシ血清アルブミンを含有する100 mlの50 mMのHepes、pH 7.4中で因子VIIa (10 nM) および因子X (0.8 μM) を15分間インキュベートする。次いで0.1 MのNaCl、20 mlのEDTAおよび1 mg／mlのウシ血清アルブミンを含有する50 mlの50 mMのHepes、pH 7.4の添加により、因子Xの切断を停止する。
【０１１８】
色素形成基質Z−D−Arg−Gly−Arg−p−ニトロアニリド (S−2765、Chromgenix、スウェーデン国) を0.5 mMの最終濃度で添加して、因子Xaの発生量を測定する。405 nmにおける吸収をSpectraMaxTM 340プレートリーダー (Molecular Devices、米国) により連続的に測定する。被験および参照因子VIIaのタンパク質分解活性間の比を計算するために、10分のインキュベーション間に発生した吸収を、酵素を含有しないブランクウェルにおける吸収を減じた後、使用する。
【０１１９】
本明細書において言及したすべての特許、特許出願、および参考文献は、引用することによって本明細書の一部分とされる。
前述の説明に照らして見ると、本発明の多数の変形は当業者にとって明らかとなるであろう。このような明らかの変形は本発明の完全な意図する範囲内に入る。
発明の分野
本発明は、因子VIIと、アスパラギン連結グリコシル化の変更されたパターンを有する他の血液凝固因子とを含んでなるに関する。
【０００２】
発明の背景
例えば、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、およびプロテインCを包含する、凝固カスケードに関係するタンパク質は、種々の病理学症状を治療する有用な治療剤であることが証明されている。したがって、薬学上許容され、かつ均一な前もって決定した臨床的効能を有する、それらのタンパク質を含んでなる処方物が必要とされている。
【０００３】
薬学的製品の源としてヒト血漿を使用することは多数の欠点を有するので、組換え系においてこれらのタンパク質を製造することが好ましい。しかしながら、凝固タンパク質は、例えば、アスパラギン連結 (N−連鎖) グリコシル化；O−連鎖グリコシル化；およびglu残基のγ−カルボキシル化を包含する、種々の共翻訳および翻訳後修飾に暴露される。異種細胞をタンパク質の大規模生産用宿主細胞として使用するとき、これらの修飾は定性的または定量的に異なる。特に、異種細胞における生産はしばしば異なるアレイのグリコ型を生じ、これらのグリコ型は異なように共有結合したオリゴサッカライド構造を有する同一ポリペプチドである。
【０００４】
異なる系において、治療用タンパク質のオリゴサッカライド構造における変動は、なかでも、免疫原性およびin vivoクリアランスの変化に関係付けられた。こうして、凝固性調製物、特に組換えヒト因子VII、修飾された因子VII、または因子VII関連ポリペプチドを含んでなり、前もって決定したグリコ型パターンを含有する調製物を提供する組成物および方法がこの分野において要求されている。
【０００５】
発明の要約
本発明は、前もって決定したグリコ型パターンを示す因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物に関する。本明細書において使用するとき、因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドは複数の因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを意味し、変異型および化学的修飾された形態、ならびにタンパク質分解的に活性化された (例えば、因子VIIa) 、それらが合成された細胞から分離された形態を包含する。グリコ型パターンは、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチド共有結合した、変化する構造を有するオリゴサッカライド鎖の調製物内の分布を言及する。
【０００６】
1つの面において、本発明は、複数の因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつ下記の1または2以上が適用される調製物を提供する：(i) オリゴサッカライド鎖の約94〜100％は少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなる；(ii) オリゴサッカライド鎖の約0〜7％は中性電荷を有する；(iii) オリゴサッカライド鎖の約6％より小、例えば、約6〜16％は少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含んでなる；(iv) オリゴサッカライド鎖の約25％より小、例えば、約6〜9％は少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる；または (v) オリゴサッカライド鎖の約30％より小、約11〜23％が少なくとも1つの末端のガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる。
【０００７】
ある態様において、(i) 〜 (v) の1または2以上に加えて、オリゴサッカライド鎖中のすべてのシアル酸残基はα2→3連鎖を介してガラクトースに連鎖されている；シアル酸残基の少なくともいくつかはN−アセチルノイラミン酸 (Neu5Ac) に加えてN−グリコリルノイラミン酸 (Neu5Gc) を含んでなる；および／またはオリゴサッカライド鎖はコアN−アセチルグルコサミンに対してα1→6連鎖したフコースを含んでなる。1つの態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の約94〜100％が少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖中のすべてのシアル酸残基がα2→3連鎖を介してガラクトースに連鎖されている、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。
【０００８】
本発明の他の態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の約94〜100％が少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなり、かつシアル酸残基の少なくともいくつかがN−アセチルノイラミン酸である、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。本発明のなお他の態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の約94〜100％が少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなり、かつシアル酸残基の少なくともいくつかがN−アセチルガラクトサミンである、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。こうして、本発明の調製物は、ヒト血漿から単離され、グルコシダーゼ処理によりex vivoで修飾されていない野生型因子VIIまたは因子VIIaを含まない。
【０００９】
他の面において、本発明は、複数の因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物であって、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、かつオリゴサッカライド鎖の少なくとも約2％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基 (すなわち、Man残基に対してβ1→2、4、または6に連鎖されているN−アセチルグルコサミン残基) に対してα1→3連鎖した少なくとも1つのフコース部分を含有する、調製物を提供する。好ましくは、オリゴサッカライド鎖の少なくとも約5％、より好ましくは少なくとも約10％または少なくとも20％、最も好ましくは少なくとも約40％は少なくとも1つのこのような触角状（antennary）フコース残基を含有する。
【００１０】
本発明による調製物は、1または2以上の非修飾野生型因子VII；化学的および／または酵素的に修飾された野生型因子VII；および野生型因子VIIに関してアミノ酸配列中に1または2以上の変更を有する因子VII変異型を含んでなることができる。本発明の調製物は、内因的因子VII遺伝子から因子VIIを発現するヒト細胞に由来するか、あるいは組換え遺伝子から因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを発現するようにプログラムされた細胞に由来することができる。
他の面において、本発明は、1または2以上の改良された機能的性質を示す因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物を提供する。このような機能的性質は、安定性、生物学的利用能、および／または半減期の増加を包含するが、これらに限定されない。
【００１１】
他の面において、本発明は、下記の工程を含んでなる、因子VIIおよび因子VII関連ポリペプチドのグリコ型パターンを決定する方法を包含する：
(a) 因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを発現する細胞を第1組の前もって決定した培養条件下に培養し、
(b) 培養物から因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを回収して、ポリペプチドを含んでなる調製物を獲得し、そして
(c) ポリペプチドに連鎖したオリゴサッカライドの構造を解析して調製物のグリコ型パターンを決定する。
【００１２】
これらの方法は、工程 (a) の培養条件を変更して第2組の前もって決定した培養条件を達成し、所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程を反復する、工程をさらに含むことができる。選択的に、これらの方法は、調製物を化学的または酵素的に処理してオリゴサッカライドの構造を変更し、そして所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程を反復する、工程をさらに含むことができる。さらに、これらの方法は、前もって決定したグリコ型パターンを有する調製物を生物学的活性または他の機能 (例えば、薬学的プロファイルまたは安定性) の少なくとも1つの試験に付し、そして特定のグリコ型パターンを特定の生物学的活性または機能のプロファイルに相関させる、追加の工程を含むことができる。
【００１３】
他の面において、本発明は、N−連鎖グリコシル化の前もって決定したパターンを有する因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物を調製する方法を提供する。ある態様において、これらの方法は、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドに連鎖されたアスパラギン連結オリゴサッカライドの少なくとも約94％が少なくとも1つ、2つ、3つ、または4つのシアル酸残基を含んでなる条件下に、ポリペプチドを発現する細胞を培養することによって実施される。
【００１４】
ある態様において、これらの方法は、オリゴサッカライド鎖の少なくとも約5％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基に対してα1→3連鎖した少なくとも1つのフコース部分を含んでなる条件下に、ポリペプチドを発現する細胞を培養することによって実施される。ある態様において、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを、それらの源に無関係に、酵素処理して所望のグリコ型パターンを達成する。
【００１５】
他の面において、本発明は、本発明の調製物を含んでなる医薬処方物、および因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドに対して応答性である症候群を予防および／または治療する方法を提供する。これらの方法は、血液凝固を増強または抑制する条件下に、治療を必要とする患者に医薬処方物を投与することを含んでなる。
【００１６】
1系列の態様において、血液凝固を増強しようとするとき、例えば、血友病A、血友病B、因子IX欠乏症、因子VII欠乏症、血小板減少症、またはフォン・ウィルブランド病において；凝固因子インヒビターの存在；外科手術または抗凝固治療の前、間、または後に；または外傷後に、因子VII調製物を投与する。他の系列の態様において、血液凝固を減少させるために、例えば、血管形成を受けている患者、または深静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発生血管内凝固症候群 (DIC) 、グラム陰性内毒素血症に関連する肺および腎臓におけるフィブリン沈着、および心筋梗塞に罹った患者に、因子VII関連ポリペプチドの調製物 (すなわち、野生型因子VIIに関して生物学的活性が減少したまたは変更された調製物) を投与する。
【００１７】
本発明によれば、因子VII関連ポリペプチドの調製物は、また、組織因子 (TF) 仲介経路を介する細胞内シグナリングを変更するために、例えば、減少させるために、症状、例えば、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS )、全身炎症応答症候群(SIRS)、溶血性尿毒症症候群 (HUS)、多発性器官不全 (MOF)、および血小板減少性紫斑病 (TTP)を治療するために、因子VII関連ポリペプチドを投与することができる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、前もって決定したグリコ型パターンを有する凝固タンパク質の調製物が改良された機能的性質を示すことを発見した。したがって、本発明は、これらのタンパク質調製物を提供する方法および組成物に関する。特に、本発明は、アスパラギン連結 (N−連鎖) オリゴサッカライドの特異的な前もって決定したパターンを有する因子VIIポリペプチドおよび残基因子VIIポリペプチドことを含んでなる調製物に関する。本発明の調製物は変更された性質を示す。このような性質は、改良された薬物速度論的性質および改良された臨床的効能を包含するが、これらに限定されない。本発明は、また、これらの調製物を含んでなる医薬処方物、ならびに医薬処方物を利用する治療法を包含する。
【００１９】
因子VIIポリペプチドおよび残基因子VIIポリペプチド
本発明は、ヒト因子VIIポリペプチド、例えば、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するもの (野生型因子VII) を包含する。本明細書において使用するとき、「因子VII」または「因子VIIポリペプチド」は野生型因子VII、ならびに野生型因子VIIに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を示す因子VIIの変異型を包含する。用語「因子VII」は非切断 (チモーゲン) 形態の因子VIIポリペプチド、ならびにそれぞれの生物活性形態を生ずるようにタンパク質分解的にプロセシングされたもの (これは因子VIIaと表示することができる) を包含する。典型的には、因子VIIは残基152と153との間で切断されて因子VIIaを生ずる。
【００２０】
本明細書において使用するとき、「因子VII関連ポリペプチド」は、因子VIIaの生物学的活性が野生型因子VIIaの活性に関して実質的に変更または減少されている変異型を含む、ポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、ポリペプチドの生物学的活性を変更または崩壊させる、特異的アミノ酸配列の変更が導入されている因子VIIまたは因子VIIaを包含するが、これらに限定されない。
【００２１】
血液凝固における因子VIIの生物学的活性は、(i) 組織因子 (TF) に結合するその能力および (ii) 活性化された因子IXまたはX (それぞれ、因子IXaまたはXa) を産生する因子IXまたは因子Xのタンパク質分解的切断を触媒するその能力に由来する。本発明の目的に対して、例えば、米国特許第5,997,864号に記載されているように、因子VIIaの生物学的活性は、因子VII欠乏血漿およびトロンボプラスチンを使用して血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって、定量することができる。このアッセイにおいて、生物学的活性は対照試料に関する凝固時間の減少として表され、1単位／mlの因子VII活性を含有するプールしたヒト血清標準と比較することによって「因子VII単位」に変換される。
【００２２】
選択的に、因子VIIaの生物学的活性は、(i) 脂質膜の中に埋め込まれたTFと因子Xとを含んでなる系中で因子Xaを産生する因子VIIaの能力を測定する (Persson et al., J. Biol. Chem. 272：19919−19924, 1997)；(ii) 水性系中の因子Xの加水分解を測定する；(iii) 表面プラズモン共鳴をベースとする計装を使用してTFに対するその結合を測定する (Persson et al., FEBS Letts. 413：359−363, 1997) ；(iv) 合成基質の加水分解を測定する (下記の実施例4参照)；および (v) TF独立的in vitro系中のトロンビン発生を測定することによって定量することができる。
【００２３】
野生型因子VIIに関して実質的に同一のまたは改良された生物学的活性を有する因子VIIの変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはTF結合アッセイの1または2以上において試験したとき、同一細胞型において産生された野生型因子VIIaの比活性の少なくとも約25％、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、最も好ましくは少なくとも約90％を示す変異型を包含する。
【００２４】
野生型因子VIIaに関して実質的に減少した活性を有する因子VII変異型は、前述したように凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはTF結合アッセイの1または2以上において試験したとき、同一細胞型において産生された野生型因子VIIaの比活性の約25％より少ない、好ましくは約10％より少ない、より好ましくは約5％より少ない、最も好ましくは約1％より少ないを示す変異型を包含する。野生型因子VIIaに関して実質的に変更された活性を有する因子VII変異型は、TF独立的因子Xタンパク質分解活性を示す因子VII変異型およびTFに結合するが、因子Xを切断しない変異型を包含するが、これらに限定されない。
【００２５】
因子VIIの変異型は、野生型因子VIIと実質的に同一であるか、またはそれよりもすぐれた生物学的活性を示すか、あるいは野生型因子VIIに関して実質的に変更されたまたは減少した生物学的活性を示すかどうかにかかわらず、1または2以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により野生型因子VIIの配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、これらに限定されない。
【００２６】
野生型因子VIIと実質的に同一の生物学的活性を有する因子VII変異型の非限定的例は次の通りである：S52A−FVIIa、S60A−FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352：182−192, 1998)；米国特許第5,580,560号に開示されているような増加したタンパク質分解安定性を示すFVIIa変異型；残基290と291との間または残基315と316との間でタンパク質分解的に切断された因子VIIa (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48：501−505, 1995)；および因子VIIaの酸化された形態 (Komfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363：43−54, 1999)。
【００２７】
野生型因子VIIに関して実質的に減少したまたは変更された生物学的活性を有する因子VIIの非限定的例は次の通りである：R152E−FVIIa (Wildgoose et al., Biochem. 29：3413−3420,1990)、S344A−FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270：66−72, 1995 )、FFR−FVII (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15：515−520, 1998 )、およびGlaドメインを欠如する因子VIIa (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317：245−249, 1993)。化学的修飾された因子VIIポリペプチドおよび配列変異型の非限定的例は、例えば、米国特許第5,997,864号に開示されている。
【００２８】
アスパラギン連結グリコシル化
本発明は、因子VIIグリコ型の特定のスペクトル、すなわち、アスパラギン連結 (N−連鎖) オリゴサッカライド鎖の前もって決定したパターンを有する因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドの調製物を提供する。
【００２９】
本明細書において使用するとき、N−連鎖グリコシル化の「パターン」またはグリコ型の「パターン」、「分布」、または「スペクトル」は、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドの所定集団内の特定のオリゴサッカライド構造の表示を言及する。このようなパターンの非限定的例は、(i) 少なくとも1つのシアル酸残基を有する；(ii) シアル酸残基を欠如する (すなわち、電荷が中性である)；(iii) 少なくとも1つの末端ガラクトース残基を有する；(iv) 少なくとも1つのN−アセチルガラクトサミン残基を有する；(v) 少なくとも1つの「アンキャプド」触角を有する、すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基を有する；または (vi) 触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基に対してα1→3連鎖した少なくとも1つのフコースを有する、オリゴサッカライド鎖の相対的特性を包含する。
【００３０】
本明細書において使用するとき、オリゴサッカライド鎖は単一アスパラギン残基共有結合した全オリゴサッカライド構造を言及する。因子VIIは通常Asn 145およびAsn 322においてグリコシル化されている。ヒトにおいてその場で産生された因子VII上のN−連鎖オリゴサッカライドは、二成分、三成分、または四成分であることができ、各触角はMan残基に対する構造Neu5Ac (α2→3またはα2→6) Gal (β1→4) GlcNAc連鎖 (β1→2、4、または6) を有し、Man残基はMan (β1→4) GlcNAc (β1→4) GlcNAc−Asnに対して連鎖 (α1→3または6) されている。
【００３１】
(Neu5AcはN−アセチルノイラミン酸 (シアル酸) を意味し、Galはガラクトースを意味し、GlcNAcはN−アセチルグルコサミンを意味し、そしてManはマンノースを意味する)。また、オリゴサッカライド鎖はGlcNAcに対してα1→6連鎖することができるフコース残基を含んでなることができる。因子VIIがヒトにおいてその場で産生されるとき、オリゴサッカライド鎖のいくつかはコアフコース残基を欠如する；鎖のすべては触角状（antennary）フコース残基を欠如する；そして鎖のすべてはほとんど完全にシアリル化されている、すなわち、各触角の末端糖はα2→3またはα2→6連鎖を介してガラクトースに連鎖されたN−アセチルノイラミン酸である。
【００３２】
しかしながら、他の環境において産生されるとき、因子VIIは1または2以上のそれらの触角上に異なる末端構造を有するオリゴサッカライド鎖を含有することができる、例えば、シアル酸残基を欠如する；N−グリコリルノイラミン酸 (Neu5Gc) 残基を含有する；ガラクトースの代わりに末端N−アセチルガラクトサミン (GlcNAc) 残基を含有する；およびその他。例えば、仔ウシ血清の存在下に培養されたBHK細胞において産生されるとき、因子VII調製物は下記のオリゴサッカライドパターンを示す：
【００３３】
− オリゴサッカライド鎖の87〜93％は少なくとも1つのシアル酸残基を含有する；
− 7〜13％は中性である (シアル酸を欠如する)；
− 9〜16％は少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含有する；
− 19〜29％は少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含有する；そして
− 30〜39％は少なくとも1つのアンキャプド触角を含有する、すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基を含有する。
【００３４】
本発明者らは、以前に記載されたものと異なる特異的な前もって決定したオリゴサッカライドパターンを含有する因子VII調製物を調製した。本発明は、下記のグリコ型パターンの1または2以上を示す因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチド対応する調製物を包含する。
【００３５】
(i) オリゴサッカライド鎖の約94〜100％、例えば、約94〜99％、約95〜98％、または約96〜97％は少なくとも1つのシアル酸残基を含有する。異なる態様において、オリゴサッカライド鎖の少なくとも約94％、95％、96％、または97％は少なくとも1つのシアル酸残基を含有する；
(ii) オリゴサッカライド鎖の6％以下、例えば、約1.5〜6％または約2〜4％は中性である；
(iii) オリゴサッカライド鎖の約16％以下、好ましくは約10％以下、例えば、約6〜10％または約8〜9％は少なくとも1つの末端ガラクトースを含有する；
【００３６】
(iv) オリゴサッカライド鎖の約25％以下、好ましくは10％、例えば、約6〜9％または約7〜8％は少なくとも1つの末端GlcNAc残基を含有する；
(v) オリゴサッカライド鎖の約30％以下、好ましくは約25％以下、例えば、約11〜23％または約12〜18％は少なくとも1つのアンキャプド触角を含有する；そして
(vi) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約2％、好ましくは少なくとも約5％、より好ましくは少なくとも約10％または20％、最も好ましくは少なくとも約40％は触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基 (すなわち、Man残基に対してβ1→2、4、または6連鎖されたN−アセチルグルコサミン残基) にα1→3連鎖された少なくとも1つのフコースを含有する。
【００３７】
(i) 〜 (vi)の各々は本発明に包含される独特なグリコ型パターンを表すことができる、すなわち、本発明による調製物は (i) 〜 (vi) のただ1つにより記載することができることが理解されるであろう。選択的に、特定のグリコ型パターンに依存して、本発明に包含される調製物は(i) 〜 (vi) の2以上により記載できることがことが理解されるであろう。
【００３８】
さらに、本発明に包含される調製物は、(i) 〜 (vi) の1または2以上と他の構造的特徴の1または2以上との組み合わせにより記載することができる。例えば、本発明は、シアル酸残基 (Neu5AcまたはNeu5Gc) がもっぱらα2→3の立体配置においてガラクトースに連鎖されている、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物を包含する。本発明は、また、コアN−アセチルグルコサミンにα1→6連鎖されたフコースおよび／または触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンにα1→3連鎖されたフコースを含有する、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物を包含する。
【００３９】
1系列の態様において、本発明の調製物は、オリゴサッカライド鎖の99％より多くが少なくとも1つのシアル酸残基を含有し、かつ (a) シアル酸残基がもっぱらα2→3立体配置で連鎖されており、および／または (b) コアN−アセチルグルコサミンに連鎖されたフコース残基が存在し、および／または検出可能な数の触角がN−アセチルガラクトサミンにおいて終止する、因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを包含する。
【００４０】
1つの態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の99％より多くが少なくとも1つのシアル酸残基を含有し、かつシアル酸残基がもっぱらα2→3立体配置でガラクトースに連鎖されている、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。他の態様において、本発明は、オリゴサッカライド鎖の99％より多くが少なくとも1つのシアル酸残基を含有し、かつオリゴサッカライド鎖の少なくともいくつかがN−アセチルガラクトサミンを含んでなる、野生型因子VIIaを含んでなる調製物を包含する。本発明は、ヒト血漿から単離され、グルコシダーゼを使用するex vivo処理により変性されていない、野生型因子VIIまたは野生型因子VIIaを包含しない。
【００４１】
1つの態様において、因子VIIa調製物は1つの触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンにα1→3連鎖された単一のフコースを有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。他の態様において、因子VIIa調製物は二触角状（antennary）オリゴサッカライド (シアリルルイスX構造) の各触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンの各々にα1→3連鎖されたフコース残基を有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。他の態様において、因子VIIa調製物は、(i)コアN−アセチルグルコサミンに連鎖されたフコースおよび (ii) 1つの触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンにα1→3連鎖された単一のフコースを有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。他の態様において、因子VIIa調製物は、(i) コアN−アセチルグルコサミンに連鎖されたフコースおよび (ii) 二触角状（antennary）オリゴサッカライドの各触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンの各々にα1→3連鎖されたフコース残基を有するオリゴサッカライド鎖を含んでなる。
【００４２】
本発明を実施するとき、この分野において知られている方法を使用して、N−連鎖オリゴサッカライドのパターンを決定することができる。このような方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：高性能液体クロマトグラフィー (HPLC)；毛管電気泳動 (CE)；核磁気共鳴 (NMR)；イオン化技術、例えば、高速電子衝撃法、エレクトロスプレー、またはマトリックス援用レーザー脱着 (MALDI) を使用する質量分析 (MS)；ガスクロマトグラフィー (GC)；およびアニオン交換 (AIE)−HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)、MSと組み合わせたエキソグリコシダーゼを使用する処理。
【００４３】
例えば、下記の文献を参照のこと：Weber et al., Anal. Biol. Chem. 225：135 (1995)；Klausen et al., J. Chromatog. 718：195 (1995)；Morris et al., Mass Spectrometry of Biological Materials, MoEwen et al., 編者, Marcel Dekker, (1990), pp. 137−167；Conboy et al., Biol. Mass Biochem. 21：397, 1992；Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193：554 (1990)；Sutton et al., Anal. Biochem. 318：34 (1994)；Harvey et al., Organic Mass Spectrometry 29：752 (1994)。
【００４４】
前述の方法 (または異なる構造を有するオリゴサッカライド鎖を分離する他の方法) を使用して因子VII由来オリゴサッカライド鎖を分離した後、分離された種は、例えば、グループ (i) 〜 (vi) の1つに割り当てられる。試料中のオリゴサッカライド鎖の全含量に関するそのグループに割り当てられたオリゴサッカライドの合計として、(i) 〜 (vi) の各々の相対的含量を計算する。
【００４５】
例えば、AIE−HPLCを使用して、13またはそれより多いオリゴサッカライドピークをBHK細胞中で産生された組換え因子VII調製物から分離することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Klausen et al., Mol. Biotechnol. 9：, 1998。ピークのうちの５つ (Klausen et al.において1〜5と表示される) はシアル酸を含有しないが、ピークのうちの８つ (6、７、および10〜15と表示される) はシアル酸を含有する。
【００４６】
所定の解析において、シアル酸を含有する鎖およびシアル酸を欠如する鎖の数および分布は、(a) 発現されるポリペプチド；(b) 細胞型および培養条件；および (c) 使用する解析法に依存し、そして生ずるパターンはそれに応じて変化することが理解されるであろう。
【００４７】
いずれの場合においても、いったんシアル酸を含有するオリゴサッカライド鎖がシアル酸を含有しないオリゴサッカライド鎖から分離されると、慣用のデータ解析プログラムを使用して各ピークの下の面積；全ピーク面積；および特定のピークにより表される全ピーク面積の百分率を計算する。この方法において、シアル酸を含有するピークの面積の合計／全ピーク面積×100 ＝ 本発明による調製物についてのシアリル化値％ (すなわち、少なくとも1つのシアル酸残基を含有するオリゴサッカライド鎖の比率) である。同様な方法において、シアル酸を含有しないまたは少なくとも1つのまたはN−アセチルグルコサミンを含有する鎖の％を計算することができる。
【００４８】
N−連鎖オリゴサッカライドの前もって決定したパターンを有する因子VII調製物を調製する方法
因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを発現する適当な宿主細胞を使用して、各々がN−連鎖オリゴサッカライドの前もって決定したパターンを有する、因子VII、因子VII変異型、または因子VII関連ポリペプチドの調製物を調製することができる。
【００４９】
宿主細胞：ある態様において、宿主細胞は内因的因子VII遺伝子を発現するヒト細胞である。これらの細胞において、内因的遺伝子は完全であるか、あるいはその場で修飾されているか、あるいは因子VII遺伝子の外側の配列をその場で修飾して内因的因子VII遺伝子の発現が変更されていることができる。内因的因子VII遺伝子を発現することができるヒト細胞を使用することができる。
【００５０】
他の態様において、組換え遺伝子からヒト因子VIIを発現するように、異種宿主細胞をプログラムする。宿主細胞は脊椎動物門、昆虫、または真菌の細胞であることができる。好ましくは、細胞は哺乳動物のN−連鎖グリコシル化；O−連鎖グリコシル化；およびγ−カルボキシル化の全スペクトルが可能である哺乳動物細胞である。例えば、米国特許第4,784,950号参照。
【００５１】
好ましくは哺乳動物細胞は下記のものを包含する：CHO (例えば、ATCC CCL 61)、COS−1 (ATCC CRL 1650)、ベイビーハムスター腎 (BHK)、およびHEK 293 (ATCC CRL 1573；Graham et al., J. Gen. Virol. 36：59−72, 1977) 細胞系統。好ましいBHK細胞系統はtk- ts 13 BHK細胞系統 (WaechterおよびBaserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：1106−1110, 1982)、(以後においてBHK 570細胞と呼ぶ) である。BHK 570細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection) (米国マリイランド州20852、ロックビレパークローンドライブ12301) からATCC受け入れ番号CRL 10314で入手可能である。また、tk- ts 13 BHK細胞系統はATCCから受け入れ番号CRL 1632で入手可能である。
【００５２】
さらに、多数の他の細胞系統を使用することができ、下記のものを包含する：Rat Hep I (ラットヘパトーム；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (ラットヘパトーム；ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、ヒト肺 (ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)；DUKX細胞 (CHO細胞系統) (UrlaubおよびChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216−4220, 1980) (DUKX細胞をまたDXB11細胞と呼ぶ)、およびDG44 (CHO細胞系統) (Cell, 33：405, 1983およびSomatic Cell and Molecular Genetics 12：555, 1986)。また、3T3細胞、Namalwa細胞、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞と他の細胞との融合物は有用である。
【００５３】
特定の好ましい態様において、宿主細胞は血清の非存在下に増殖するように適合され、因子VIIを発現するようにプログラムされたBHK 21細胞である。ある態様において、細胞は、それらが由来された細胞型と品質的または定量的に異なるスペクトルのグリコシル化酵素 (例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび／またはグルコシダーゼ) を発現する突然変異または組換え体細胞であることができる。また、他の異種ペプチドまたはタンパク質、例えば、因子VIIのトランケートされた形態を発現するようにプログラムすることができる。1つの態様において、宿主細胞は問題の因子VIIポリペプチド (すなわち、因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチド) および他の異種ペプチドまたはポリペプチド、例えば、因子VIIフラグメントの修飾性酵素の両方を共発現するようにプログラムされたCHO細胞である。
【００５４】
方法：本発明は、(i) 〜 (vi) として前述したグリコ型パターンの任意のものを含んでなる調製物を調製する方法および、それ以上の態様において、因子VIIおよび因子VII関連ポリペプチドのグリコ型分布を最適化する方法を包含する。これらの方法は下記の工程を含んでなる：
(a) 因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを発現する細胞を第1組の前もって決定した培養条件下に培養し、
(b) 培養物から因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドを回収して、ポリペプチドを含んでなる調製物を獲得し、そして
(c) ポリペプチドに連鎖したオリゴサッカライドの構造を解析して調製物のグリコ型パターンを決定する。
【００５５】
これらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：
(d1) 工程 (a) の培養条件を変更して第2組の前もって決定した培養条件を達成し、そして
(e1) 所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程 (b) 〜 (d1) を反復する。
選択的に、それらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：
(d2) 調製物を化学的または酵素的に処理してオリゴサッカライドの構造を変更し、そして
(e2) 所望のグリコ型パターンが達成されるまで工程 (b) 〜 (d2) を反復する。
【００５６】
これらの方法は下記の工程をさらに含んでなる：前もって決定したグリコ型パターンを有する調製物を生物学的活性 (例えば、凝固、因子Xタンパク質分解、またはTF結合を包含する) または他の機能 (例えば、薬物速度論的プロファイルまたは安定性) の少なくとも1つについて試験し、そして特定のグリコ型パターンを特定の生物学的活性または機能のプロファイルに相関させる。
【００５７】
工程 (d1) において変更できる培養条件の変動は下記のものを包含するが、これらに限定されない：細胞の起源、例えば、本来使用されたものと異なる種に由来する細胞；または1または2以上のグリコシルトランスフェラーゼまたはグルコシダーゼまたはグリコシル化装置の他の成分を有する突然変異体または組換え細胞 (下記の文献を参照のこと：Grabenhorst et al., Glycoconjugate J. 16：81, 1999；Bragonzi et al., Biochem. Biophys. Acta 1474：273, 2000；Weikert, Nature Biotechnol. 17：1116, 1999)；ポリペプチドの発現レベル；代謝条件、例えば、グルコースまたはグルタミン濃度；血清のの非存在または存在；ビタミンKの濃度；タンパク質加水分解物、ホルモン、微量金属、塩類ならびにプロセスのパラメーター、例えば、温度、溶解酸素レベルおよびpH。
【００５８】
調製物のオリゴサッカライドパターンを変更するために使用できる酵素処理は下記のものを包含するが、これらに限定されない：順次にかつ特定の末端構造を有するオリゴサッカライド鎖の分布の所望変更を達成する条件下に、シアリダーゼ (ニューロアミダーゼ)、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、および／またはシアリルトランスフェラーゼの1または2以上を使用する処理。グリコシルトランスフェラーゼはCalbiochem (カリフォルニア州ラジョラ) から商業的に入手可能であり、そしてグルコシダーゼはGlyko, Inc. (カリフォルニア州ノバト) から商業的に入手可能である。
【００５９】
1系列の態様において、因子VIIまたは関係ポリペプチドを発現する宿主細胞を特異的培養条件に対して暴露し、ここで宿主細胞は (i) 〜 (vi) のいずれかとして前述したオリゴサッカライド構造の所望のパターンを有するグリコシル化因子VIIポリペプチドを分泌する。このような条件は、血清の非存在または完全な非存在下の還元を包含するが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞を血清の非存在下に増殖するように適合させ、増殖期および調製期の両方において血清の非存在下に培養する。
【００６０】
このような手順は、例えば、下記の文献に記載されている：Scharfenberg et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21st Century, E. C. et al. (編者)、Kluwer Academic Publishers, pp. 619−623, 1995 (BHKおよびCHO細胞)；Cruz, Biotechnol. Tech. 11：117−120, 1997 (昆虫細胞)；Keen, Cytotechnol. 17：203−211, 1995 (骨髄腫細胞)；Berg et al., Biotechniques 14：972−978, 1993 (ヒト腎臓293細胞)。他の好ましい態様において、細胞に添加される増殖培地は動物組織または動物細胞培養物から単離されたタンパク質または他の成分を含有しない。
【００６１】
例えば、下記の実施例1参照。典型的には、慣用成分に加えて、因子VIIの産生に適当な培地は、因子VII中のグルタミン残基γ−カルボキシル化に必要なビタミンKを0.1〜50 mg／lの濃度で含有する。
他の系列の態様において、本発明のグリコ型は因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドの調製物をその中に含有されるN−連鎖オリゴサッカライドの酵素的および／または化学的修飾に付す。
【００６２】
因子VII調製物
本明細書において使用するとき、「因子VII調製物」は、それらが産生された細胞から分離された、複数の因子VIIポリペプチド、因子VIIaポリペプチド、または因子VII関連ポリペプチドを意味し、変異型および化学的に修飾された形態を包含する。
この分野において知られている方法により、ポリペプチドを由来細胞から分離することができる。このような方法は、付着細胞培養物からの所望産物を含有する細胞培地の収集；付着細胞を除去する遠心または濾過；およびその他を包含するが、これらに限定されない。
【００６３】
必要に応じて、因子VII調製物をさらに精製することができる。精製はこの分野において知られている方法により達成することができる。このような方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：アフィニティークロマトグラフィー、例えば、抗因子VII抗体カラム上のアフィニティークロマトグラフィー (例えば、下記文献を参照のこと、Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261：11097, 1986；およびThin et al., Biochem. 27：7785, 1988)；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手法 (例えば、調製用等電点電気泳動 (IEF)、分別溶解度 (例えば、硫酸アンモニウム沈降法)、または抽出およびその他。
【００６４】
一般に、下記の文献を参照のこと：Scopes, Protein Purification, Springer−Verlag, New York, 1982；およびProtein Purification, J.−C. JansonおよびLars Ryden, 編者, VCH Publishers, New York, 1989。精製後、調製物は好ましくは約10重量％より少ない、より好ましくは約5重量％より少ない、最も好ましくは約1重量％より少ない量の宿主細胞に由来する非因子VIIタンパク質を含有する。
【００６５】
因子VIIおよび因子VII関連ポリペプチドは、因子VIIaまたはトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば、因子IXa、カリクレイン、因子Xa、およびトロンビンを使用する、タンパク質分解的活性化により活性化することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Osterud et al., Biochem. 11：2853 (1972)；Thomas, 米国特許第4,456,591号；およびHedner et al., J. Clin. Invest. 71：1836 (1983)。選択的に、因子VIIは、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えば、Mono−QTM (Pharmacia) またはその他に通過させることによって活性化することができる。次いで、後述するように、生ずる活性化された因子VIIを処方し、投与することができる。
【００６６】
因子VII調製物の機能的性質
本発明による前もって決定したオリゴサッカライドパターンを有する因子VIIポリペプチドおよび因子VII関連ポリペプチドの調製物は、参照調製物に関して機能的性質を示す。改良された性質は下記のものを包含するが、これらに限定されない：a) 物理的性質、例えば、貯蔵安定性；b) 薬物速度論的性質、例えば、生物学的利用能および半減期；およびc) ヒトにおける免疫原性。
【００６７】
参照調製物は、アスパラギン連結グリコシル化の異なるパターンを示す以外、それが調製されている本発明による調製物の中に含有されるポリペプチドと同一であるポリペプチド (例えば、野生型因子VIIまたは特定の変異型または化学的に変更された形態) を意味する。例えば、参照調製物は典型的には下記のグリコ型パターンの1または2以上を含んでなる：(i) オリゴサッカライド鎖の約93より小 (例えば、約92％より小または約90％より小) は少なくとも1つのシアル酸残基を含有する；(ii) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約6％ (例えば、少なくとも約7.5％または少なくとも約10％) はシアル酸を欠如する (すなわち、中性である)；
【００６８】
(iii) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約10％ (例えば、少なくとも12.5％または少なくとも約15％) は少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含有する；(iv) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約15％ (例えば、少なくとも約20％または少なくとも約25％) は少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含有する；(v) オリゴサッカライド鎖の少なくとも約25％ (例えば、少なくとも約30％または少なくとも約35％) は少なくとも1つのアンキャプド触角を含有する (すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基を含有する)；または (vi) 本質的に検出不可能レベルの (例えば、約0.2％より少ない) 触角状（antennary）フコース残基。
【００６９】
因子VII調製物の貯蔵安定性は、(a) 25 ℃において乾燥粉末として貯蔵したとき、調製物の生物学的活性の20％が崩壊するために要求される時間および／または (b) 調製物中の因子VIIa凝集物の比率が2倍となるために要求される時間を測定することによって評価することができる。
【００７０】
ある態様において、本発明の調製物は、それと参照調製物とを25 ℃において乾燥粉末として貯蔵したとき、参照調製物において同一現象に要求される時間に関して生物学的活性が20％崩壊するために要求される時間が少なくとも約30％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約100％増加することを示す。生物学的活性の測定は、凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、TF結合アッセイ、またはTF独立的トロンビン発生アッセイを使用して実施することができる。
【００７１】
ある態様において、本発明の調製物は、それと参照調製物とを25 ℃において乾燥粉末として貯蔵したとき、参照調製物に関して凝集物が2倍になるために要求される時間が少なくとも約30％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約100％増加することを示す。凝集物の含量は、次のようにしてProtein Pak 300 SWカラム (7.5×300 mm) (Waters、80013) 上のゲル透過HPLCにより測定される。このカラムを溶離液A (0.2 M硫酸アンモニウム、5％イソプロパノール、pHをリン酸で2.5に調節し、次いでpHをトリエチルアミンで7.0に調節する) と平衡化し、次いで25 μgの試料をカラムに適用する。溶離を溶離液Aで0.5 ml／分の流速で実施し、215 nmにおける吸収を測定することによって検出を達成する。凝集物含量を因子VII凝集物のピーク面積／因子VIIのピークの全面積として計算する。
【００７２】
「生物学的利用能」は、投与後、前もって決定した時間において血漿中で検出することができる因子VIIまたは因子VII関係調製物の投与量の比率を意味する。典型的には、生物学的利用能は、試験動物において、約25〜250 μg／kgの調製物を投与し、投与後、前もって決定した時間において血漿試料を採り、そして凝固アッセイ (またはバイオアッセイ)、イムノアッセイ、または同等のアッセイの1または2以上を使用して因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドの含量を測定することによって決定される。データは典型的には［因子VII］／時間としてグラフで表示され、そして生物学的利用能は曲線の下の面積として表される (AUC)。試験調製物の相対的生物学的利用能は、試験調製物のAUCと参照調製物のそれとの間の比を意味する。
【００７３】
ある態様において、本発明の調製物は、参照調製物の生物学的利用能の少なくとも約110％、好ましくは少なくとも約120％、より好ましくは少なくとも約130％、最も好ましくは少なくとも約140％の相対的生物学的利用能を示す。生物学的利用能は、任意の哺乳動物種、好ましくはイヌにおいて測定することができ、そしてAUCの計算に使用する前もって決定した時間は10分〜8時間の異なる増分を包含することができる。
【００７４】
「半減期」は、因子VIIポリペプチドまたは因子VII関連ポリペプチドの血漿濃度を特定の値からその値の半分に減少させるために要求される時間を意味する。半減期は生物学的利用能についてと同一の手法を使用して測定することができる。ある態様において、本発明の調製物は、参照調製物の半減期に関して、少なくとも約0.25時間、好ましくは少なくとも約0.5時間、より好ましくは少なくとも約1時間、最も好ましくは少なくとも約2時間の半減期の増加を示す。
【００７５】
「免疫原性」は、ヒトに投与したとき、体液性、細胞性、または両方であるかどうかにかかわらず、有害な免疫応答を誘発する調製物の能力を意味する。因子VIIポリペプチドおよび因子VII関連ポリペプチドがヒトにおいて検出可能な免疫応答を誘発することは知られていない。それにもかかわらず、任意のヒトの下位集団において、特定の投与したタンパク質に対して感受性を示す個体が存在することがある。免疫原性は、この分野において知られている慣用法を使用して、感受性個体において抗因子VII抗体および／または因子VII応答性T細胞の存在を定量することによって測定することができる。ある態様において、本発明の調製物は、参照調製物のその個体についての免疫原性に関して、少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約40％、最も好ましくは少なくとも約50％の感受性個体における免疫原性の減少を示す。
【００７６】
医薬組成物および使用法
本発明の調製物は、因子VII応答性症候群、例えば、出血性障害を治療するために使用することができる。このような症候群は、凝固因子欠乏症 (例えば、血友病AおよびBまたは凝固因子XIまたはVIIの欠乏症)；血小板減少症尾残基フォン・ウィルブランド病；または凝固因子のインヒビター、またはいずれかの原因からの過剰の出血性により引き起こされる症候群を包含するが、これらに限定されない。また、調製物は、外科手術または他の外傷に関連する患者に、または抗凝固治療を受けている患者に投与することができる。
【００７７】
野生型因子VIIに関して実質的に減少した生物学的活性を有する、本発明による因子VII関連ポリペプチドを含んでなる調製物は、例えば、血管形成、または再狭窄において起こるような血管の血栓症または閉塞の危険を増加することがある他の外科的手法を受けている患者において、抗凝固剤として使用することができる。抗凝固剤を処方される他の医学的適用は下記のものを包含するが、これらに限定されない：深静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発生血管内凝固症候群 (DIC) 、グラム陰性内毒素血症に関連する肺および腎臓におけるフィブリン沈着、心筋梗塞；急性呼吸窮迫症候群 (ARDS )、全身炎症応答症候群(SIRS)、溶血性尿毒症症候群 (HUS)、MOFおよびTTP。
【００７８】
本発明による因子VIIおよび因子VII関連ポリペプチドを含んでなる医薬組成物は、予防的および／または療法的治療のための非経口的投与に主とし意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内に投与される。それらは連続的または間欠的注入により投与することができる。
【００７９】
医薬組成物または処方物は、生理学上許容される担体、好ましくは水性担体または希釈剤と組み合わせた、好ましくはその中に溶解した、本発明による調製物を含んでなる。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、0.4％の生理食塩水、0.3％のグリシンおよびその他を使用することができる。本発明の調製物は、また、損傷部位への送達またはターゲッティングのためにリポソーム調製物に処方することができる。リポソーム調製物は、例えば、米国特許第4,837,028号、米国特許第4,501,728号、および米国特許第4,975,282号に一般的に記載されている。組成物は慣用のよく知られている滅菌技術により滅菌することができる。生ずる水溶液を使用するために包装するか、あるいは無菌的条件下に濾過し、凍結乾燥であることができ、凍結乾燥調製物は無菌の水溶液と組み合わせた後、投与することができる。
【００８０】
組成物は薬学上許容される助剤またはアジュバントを含有することができる。このような助剤またはアジュバントは、pH調節剤および緩衝剤および／または張度調節剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、およびその他を包含するが、これらに限定されない。これらの処方物中の因子VIIまたは因子VII関連ポリペプチドの濃度は、広く変化させることができ、すなわち、約0.5重量％から、通常少なくとも約1重量％から15または20重量％程度に多くあることができ、そして選択した特定の投与モードに従い、流体体積、粘度、およびその他により主として選択されるであろう。
【００８１】
こうして、静脈内注入のために典型的な医薬組成物は250 mlの無菌のリンガー溶液および10 mgの調製物を含有するように構成することができる。非経口的に投与可能な組成物について実際的方法は既知であるか、あるいは当業者にとって明らかでありそして、例えば、下記の文献にいっそう詳しく記載されている：Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, ペンシルベニア州イーストン (1990)。
【００８２】
本発明の調製物を含有する組成物は、予防的および／または療法的治療のために投与することができる。療法的適用において、組成物は、前述したように、既に疾患を患う患者に、疾患およびその合併症を治療し、軽減し、または部分的に抑制するために十分な量で投与される。これを達成するために適切な量は、「治療的に有効な量」として定義される。各目的に有効な量は、疾患または外傷の重症度ならびに被検体の体重および一般的状態に依存するであろう。しかしながら、一般に、有効量は70 kgの被検体について約0.05 mg〜約500 mgの調製物／日の範囲であり、約1.0 mg〜約200 mgの調製物／日はいっそう普通に使用されるであろう。日常的実験を使用して、値のマトリックスを構成し、マトリックス中の異なる点を試験することによって、適当な投与量を決定することができることが理解されるであろう。
【００８３】
例えば、局所的適用するための、本発明の調製物の局所的デリバリーは、例えば、噴霧、潅流、二重バルーンカテーテル、ステント、脈管の移植片またはステントの中への組込み、バルーンカテーテルの被覆に使用されるヒドロゲル、または他の十分に確立された方法により実施することができる。いずれの場合においても、医薬組成物は被検体を効果的に治療するために十分な量の調製物を提供すべきである。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、他の生物学的活性剤、例えば、非因子VII関係凝固剤または抗凝固剤をさらに含むことができる。
下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
【００８５】
実施例
実施例 1．変更されたグリコ型パターンを示す因子 VII ポリペプチドの調製および分析
変更されたグリコ型パターンを有する因子VII調製物を調製するために、下記の実験を実施した。
I. 調製：
因子VIIエンコーディングプラスミドで形質転換したBHK細胞系統を、血清の非存在下に懸濁培養で増殖するように適合させた。細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【００８６】
最後に、マクロ多孔質Cytopore 1担体 (Pharmacia) を含有する100リットルの調製バイオリアクターの中に6リットルの種子培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。36 ℃、pH 6.7〜6.9および50％のDOにおいて、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。細胞密度がほぼ2×106細胞／mlに到達したとき、調製期を開始させ、培地の交換を24時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の80％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
調製期間の間に、細胞は3〜6×106細胞／mlおよび2〜7 mgの因子VII／リットルの力価に到達した。
【００８７】
II. 組換え因子VIIのグリコ型パターンの解析：
下記の調製物のオリゴサッカライドパターンを比較した：(a) 部Iに記載したように調製された組換え因子VII調製物 (n＝7)；および2つの参照調製物：(b) 仔ウシ血清の存在下にBHK細胞中で産生された組換え因子VII調製物 (n＝10)；および (c) ヒト血漿から精製された因子VII調製物。
【００８８】
化学的切断 (ヒドラジン分解、GlycoPrep 1000ユニット、Oxford GlycoSciences)または酵素的切断 (N−グルコシダーゼ、例えば、Boehringer Mannheimから) により、N−連鎖オリゴサッカライドを解放させた。解放されたオリゴサッカライドを2−アミノベンズアミドで標識化した (シグナル標識化キット、K−404、Oxford GlycoSciences)。Guardカラム (4×50 mm、Dionex、P/N 43054)とともにCarboPac PA100カラム (4×250 mm、Dionex、P/N 43055) 上のアニオン交換HPLCを使用して、標識化オリゴサッカライドを分析した。カラムを150 mMの水酸化ナトリウムと平衡化し、0〜150 mMの酢酸ナトリウムの勾配、15 mMの水酸化ナトリウムで溶離した。蛍光、330 nmにおける励起および420 nmにおける放射を使用して、オリゴサッカライドを検出した。
【００８９】
種々の因子VIIオリゴサッカライド構造の相対的含量 (Klausene et al., 1998) を、アニオン交換HPLC分析において炭水化物ピークについての相対的ピーク面積として計算した。各オリゴサッカライドの構造要素に基づいて、それを下記の1つに割り当てた：(i) 少なくとも1つのシアル酸を含有する鎖；(ii) シアル酸を欠如する (すなわち、中性である) 鎖；(iii) 少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含有する鎖；(iv) 少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含有する鎖；および (v) 少なくとも1つのアンキャプド触角 (すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基) を含有する鎖。最後に、各グループに割り当てられたオリゴサッカライド鎖の相対的含量の合計を、全オリゴサッカライド鎖の百分率として計算した。この決定の標準偏差は0.08％であると計算された (その日の変動)；0.7％ (日々の変動)；および0.5％ (1〜100 μgの間隔)。
得られたグリコ型パターンを下記表に記載する：
【００９０】
【表１】
この実施例に従い (すなわち、血清の非存在下に) 調製した組換え因子VII調製物は、血清の存在下に調製された組換え因子VIIおよびヒト血漿から単離された自然因子VIIの両方のグリコ型パターンと異なるグリコ型パターンを示す。血清の非存在下に調製された組換え因子VIIのオリゴサッカライドは、血清の存在下に調製されたものよりも高い程度にシアリル化され、より少ない中性鎖およびガラクトースまたはN−アセチルガラクトサミンにおいて終止する、より少ない鎖を含有する。
【００９２】
III. 生物学的利用能：
前述したように調製された2つの因子VII調製物 (IおよびII) を2つの参照因子VII調製物 (すなわち、血清の存在下に調製した) (AおよびB) と比較するために、下記の実験を実施した。
塩化ナトリウム (7.87 mg／ml)、塩化カルシウム二水和物 (1.48 mg／l)、マンニトール (2.5 mg／ml) およびポリソルベート80を含有するグリシルグリシン緩衝液 (pH 7.4) 中の被験調製物または参照調製物を25 μg／kg (＝100 μg／ラット) の投与量で、8匹のラットのグループに投与した。
【００９３】
最初の投与後、10分および30分に血液試料を抜出した。試料から血漿を獲得し、因子VIIをELISAにより定量した。10および30分の試料に基づく因子VIIについての血漿濃度曲線下の投与量調節面積として、各試料の生物学的利用能を計算した (AUC10-30／投与量)。相対的生物学的利用能を、平均AUC10-30／投与量の被験および参照試料の比×100として表す。相対的生物学的利用能についての信頼限界を、調製物間の差についての90％信頼限界から計算した。
結果を下記表に要約する。(前述したように測定した、各調製物のシアリル化％を括弧中に示す)。
【００９４】
【表２】
これらの結果が示すように、少なくとも1つのシアル酸残基を有するオリゴサッカライド鎖の比率における差が比較的小さい、例えば、93％および96または97％であるが、生物学的利用能に対する衝撃は顕著であることがある (20〜30％の増加)。その上、シアリル化％の10％の増加は生物学的利用能を40〜50％増加させる。
【００９６】
実施例 2．変更されたグリコ型パターンを示す因子 VII 調製物の分析
因子VIIを500リットルの培養物から収集した以外、上記実施例1に記載されているように因子VIIを調製した。グリコ型の分析を実施例1に記載されているように実施した。3つの独立の調製物 (A、B、およびC) を分析し、参照調製物 (D) と比較した。
【００９７】
生物学的利用能を次のようにしてイヌモデルにおいて測定した：4つのグループに分割した12ビーグル犬においてについて脚交叉研究として、実験を実施した。塩化ナトリウム (2.92 mg／ml)、塩化カルシウム二水和物 (1.47 mg／l)、マンニトール (30 mg／ml) およびポリソルベート80を含有するグリシルグリシン緩衝液 (pH 5.5) 中の3つの被験調製物A、B、およびCおよび参照調製物Dを約90 μg／kg (＝100 μg／ラット) の投与量で、すべての動物に投与した。最初の投与後、10、30、および60分および2、3、4、6および8時間に血液試料を抜出した。試料から血漿を獲得し、因子VIIをELISAにより定量した。
【００９８】
各試料の生物学的利用能を因子VIIについての血漿濃度曲線の下の投与量調節面積として表す(AUC／投与量)。相対的生物学的利用能を、平均AUC／投与量の被験および参照試料の比×100として表し、相対的生物学的利用能についての90％信頼限界を計算した。
結果を下記表に要約する。上記実施例1に記載したように測定した、各調製物のシアリル化％を括弧中に示す。
【００９９】
【表３】
これらの結果が示すように、少なくとも1つのシアル酸残基を有するオリゴサッカライド鎖の比率における小さい差は、因子VIIについての生物学的利用能に対して顕著な衝撃を有する。シアリル化％の10％の増加は生物学的利用能を30〜50％増加させ、3つの被験調製物および参照調製物について密接〜直線的関係が存在する。
【０１０１】
実施例3．変更されたグリコ型パターンを示す因子 VII 調製物
変更されたグリコ型パターンを有する因子VII調製物を調製するために、下記の実験を実施した。
I. 細胞系統の構築および因子VIIの調製
ヒト因子VIIの発現用プラスミドベクターpLN174は記載された (PerssonおよびNielsen, 1996, FEBS Lett. 385：241−243)。簡単に述べると、それはヒト因子VIIをコードするcDNAヌクレオチド配列を保持し、挿入されたcDNAの転写用マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にポリペプチド、および選択可能なマーカーとして使用するためのSV40初期プロモーターの制御下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼcDNAを含む。
【０１０２】
γ−カルボキシル化認識配列をコードするプラスミドベクターを構築するために、そのポリペプチドを含む因子VIIをコードするcDNAを含有するクローニングベクター (pBluescript II KS+、Stratagene) を使用した (pLN171)。(Persson et al., 1997, J. Biol. Chem. 272：19919−19924)。このクローニングベクター上の逆位PCR仲介突然変異誘発により因子VIIのポリペプチド後に因子VIIをコードするcDNAの中に、停止コドンをコードするヌクレオチド配列を挿入した。NaOHを使用する処理および引き続く下記のプライマーとともにポリメラーゼPwo (Boehringer−Mannheim) およびTaq (Perkin−Elmer) ポリメラーゼを使用するPCRにより鋳型プラスミドを変性した：
a) 5’−AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC−3’
b) 5’−CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC−3’
【０１０３】
生ずる混合物をDpnIで消化して残留鋳型DNAを消化し、大腸菌 (Escherichia coli) をPCR生成物で形質転換した。クローンを配列決定により突然変異の存在についてスクリーニングした。正しいクローンからのcDNAをBamHI−EcoRIフラグメントとして、発現プラスミドpcDNA3 (Invitrogen) に移した。生ずるプラスミドをpLN329と命名した。CHO K1細胞 (ATCC CCL 61) を、Fugene6法 (Boehringer−Mannheim) に従い、等しい量のpLN174およびpLN329でトランスフェクトした。メトトレキセートを1 μMに添加し、G−418を0.45 mg／mlに添加することによって、トランスフェクタントを選択した。トランスフェクタントのプールを限界希釈法によりクローニングし、クローンからのFVIIの発現を測定した。
【０１０４】
高い生産性のクローンをさらにサブクローニングし、10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地中で2.4 pg／細胞／日の特異的FVII発現を示すクローンE11を選択した。商業的に入手可能な動物由来成分を含まないCHO培地 (JRH Bioscience) 中の無血清懸濁培養に対して、クローンを適合させた。
適合させた細胞を回転培養において順次に増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。25日後、6リットルの回転培養物を50リットルのバイオリアクターの中に接種した。細胞をバイオリアクター中で増殖させ、細胞の数が増加するにつれて、新しい培地の添加により体積を徐々に増加させた。
【０１０５】
最後に、マクロ多孔質Cytopore 1担体 (Pharmacia) を含有する500リットルの調製バイオリアクターの中に50リットルの種子培養物を接種し、次いで懸濁細胞は担体の中に固定化されるようになった。36 ℃、pH 7.0〜7.1および飽和の50％の溶解酸素テンション (DOT) において、培養を維持した。細胞数が増加するにつれて、新しい培地の添加により調製バイオリアクター中の体積を徐々に増加させた。
【０１０６】
細胞密度がほぼ10〜12×105細胞／mlに到達したとき、調製期を開始させ、培地の交換を24時間毎に実施した：攪拌を停止し、細胞を含有する担体を沈降させ、次いで培養上清の80％を収集し、新しい培地と置換した。収集した培養上清を濾過して非捕捉細胞 (すなわち、担体の中に固定化されなかった細胞) および細胞破片を除去し、次いでそれ以上プロセシングするために移した。
調製期間の間に、細胞は2〜3×107細胞／mlおよび8 mgの因子VII／リットルの力価に到達した。
【０１０７】
II. グリコ型の分析：
A. 前述したように調製した因子VII調製物 (a) のオリゴサッカライドのパターンを、仔ウシ血清の存在下にBHK細胞中で調製した組換え因子VII調製物 (b) およびヒト血漿から精製した因子VII調製物 (c) のそれらと比較した。方法は実施例1に本質的に記載された通りであった。
【０１０８】
結果を下記表に要約する。オリゴサッカライドの割り当ては次の通りである：(i) 少なくとも1つのシアル酸を含有する鎖；(ii) シアル酸を欠如する (すなわち、中性である) 鎖；(iii) 少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含有する鎖；(iv) 少なくとも1つの末端N−アセチルガラクトサミン残基を含有する鎖；および (v) 少なくとも1つのアンキャプド触角 (すなわち、少なくとも1つの末端ガラクトース残基またはN−アセチルガラクトサミン残基) を含有する鎖。
【０１０９】
【表４】
B. 実施例1に記載したように調製した5つの独立の因子VII調製物 (a) のオリゴサッカライドのパターンを、仔ウシ血清の存在下にBHK細胞中で調製した組換え因子VII調製物 (b) およびヒト血漿から精製した因子VII調製物 (c)のそれらと比較した。実施例1に記載されている分析方法を使用した。
各オリゴサッカライドの構造的要素に基づいて、それを下記の1つに割り当てた：(i) 少なくとも1つのシアル酸を含有する鎖；(ii) シアル酸を欠如する (すなわち、中性である) 鎖；(iii) 触角に連鎖された少なくとも1つのフコースを含有する鎖。最後に、各グループに割り当てられたオリゴサッカライド鎖の相対的含量の合計を、全オリゴサッカライド鎖の百分率として計算した。この決定の標準偏差は0.08％であると計算された (その日の変動)；0.7％ (日々の変動)；および0.5％ (1〜100 μgの間隔)。
得られたグリコ型パターンを下記表に記載する：
【０１１１】
【表５】
実施例1に従い調製された組換え因子VII調製物 (すなわち、血清の非存在下にCHO細胞系統により産生された) は、血清の存在下に調製された組換え因子VIIおよびヒト血漿から単離された自然因子VIIの両方のグリコ型パターンと異なるグリコ型パターンを示す。血清の非存在下にCHO 282.4細胞系統により産生された組換え因子VIIのオリゴサッカライドは、参照調製物の両方に存在しない、触角に連鎖されたフコースを有する構造を含む。構造物の2つを精製し、前述したようにマトリックス援用レーザー脱着イオン化質量分析、連鎖特異的フコシダーゼ酵素を使用する処理、およびアニオン交換HPLCにより特性決定した。2つの構造物は、シアリルルイス×構造、すなわち、シアリル化オリゴサッカライド中の触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンにα1→3連鎖したフコースを含有することが示された。
【０１１３】
III. 生物学的利用能：
この実施例に記載されているように調製された5つの因子VII調製物を、(a) トロンビン発生および (b) 組織因子 (TF) に対する結合について分析し、そして血清の存在下にBHK細胞中で産生された組換え因子VII (参照) と比較した。グリコ型パターン (シアル酸を含有するオリゴサッカライド鎖の％およびフコシル化触角を含有するオリゴサッカライド鎖の％) と２つ生物学的利用能との相関を、下記表に示す。
【０１１４】
【表６】
これらの結果が示すように、フコシル化触角を有する因子VII調製物はフコシル化触角を欠如する因子VII調製物よりも高いTF依存的因子VII活性 (例えば、トロンビン発生により示されるのような) を示す。
【０１１６】
実施例 4．in vitro 加水分解アッセイ
下記の方法を使用して因子VIIa生物学的活性をアッセイすることができる。このアッセイはマイクロタイタープレート中で実施する (MaxiSorp、デンマーク国ヌンク)。0.1 MのNaCl、5 mMのCaCl2および1 mg／mlのウシ血清アルブミンを含有する50 mMのHepes、pH 7.4中の因子VIIa (100 nMの最終濃度) に、色素形成基質D−Ile−Pro−Arg−p−ニトロアニリド (S−2288、Chromgenix、スウェーデン国) を1 mMの最終濃度で添加する。405 nmにおける吸収をSpectraMaxTM 340プレートリーダー (Molecular Devices、米国) により連続的に測定する。被験および参照因子VIIaの活性間の比を計算するために、20分のインキュベーション間に発生した吸収を、酵素を含有しないブランクウェルにおける吸収を減じた後、使用する。
【０１１７】
実施例 5．in vitro タンパク質分解アッセイ
下記の方法を使用して因子VIIa生物学的活性をアッセイすることができる。このアッセイはマイクロタイタープレート中で実施する (MaxiSorp、デンマーク国ヌンク)。0.1 MのNaCl、5 mMのCaCl2および1 mg／mlのウシ血清アルブミンを含有する100 mlの50 mMのHepes、pH 7.4中で因子VIIa (10 nM) および因子X (0.8 μM) を15分間インキュベートする。次いで0.1 MのNaCl、20 mlのEDTAおよび1 mg／mlのウシ血清アルブミンを含有する50 mlの50 mMのHepes、pH 7.4の添加により、因子Xの切断を停止する。
【０１１８】
色素形成基質Z−D−Arg−Gly−Arg−p−ニトロアニリド (S−2765、Chromgenix、スウェーデン国) を0.5 mMの最終濃度で添加して、因子Xaの発生量を測定する。405 nmにおける吸収をSpectraMaxTM 340プレートリーダー (Molecular Devices、米国) により連続的に測定する。被験および参照因子VIIaのタンパク質分解活性間の比を計算するために、10分のインキュベーション間に発生した吸収を、酵素を含有しないブランクウェルにおける吸収を減じた後、使用する。
【０１１９】
本明細書において言及したすべての特許、特許出願、および参考文献は、引用することによって本明細書の一部分とされる。
前述の説明に照らして見ると、本発明の多数の変形は当業者にとって明らかとなるであろう。このような明らかの変形は本発明の完全な意図する範囲内に入る。
Claims (34)
- 複数の因子VIIポリペプチドを含んでなる調製物であって、当該ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、当該オリゴサッカライド鎖の94〜99％が少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなり、前記調製物は、参照調製物の生物学的利用能の少なくとも110％の生物学的利用能を示し、ここで当該参照調製物においてはオリゴサッカライド鎖の93％以下が少なくとも１つのシアル酸部分を含む、ことを特徴とする、前記調製物。
- 前記複数の因子VIIポリペプチドが、アスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、そして当該オリゴサッカライド鎖の６％以下が中性電荷を有する、請求項１に記載の調製物。
- 前記複数の因子VIIポリペプチドが、ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、そして当該オリゴサッカライド鎖の6〜16％が少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含んでなる、請求項１に記載の調製物。
- 前記複数の因子VIIポリペプチドが、アスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、そして当該オリゴサッカライド鎖の11〜23％が少なくとも1つの末端のガラクトース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含んでなる、請求項１に記載の調製物。
- 前記複数の因子VIIポリペプチドが、アスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、そして当該オリゴサッカライド鎖の少なくとも２％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基に対してα1→3連鎖した少なくとも１つのフコース部分を含んでなる、請求項１に記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖中のシアル酸残基がα2→３連鎖を介してガラクトースに連鎖されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の調製物。
- 前記シアル酸残基がN−アセチルノイラミン酸 (Neu5Ac) およびN−グリコリルノイラミン酸 (Neu5Gc) を含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライドがコアN−アセチルグルコサミンに対してα1→６連鎖したフコースを含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖の95〜98％が少なくとも１つのシアル酸残基を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖の96〜97％が少なくとも１つのシアル酸残基を含有する、請求項１〜９のいずれかに記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖の２〜４％が中性電荷を有する、請求項１〜10のいずれか１項に記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖の８〜12％が少なくとも1つの末端ガラクトース残基を含有する、請求項１〜11のいずれか１項に記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖の12〜18％が少なくとも１つの末端ガラクトース残基又はN−アセチルガラクトサミン残基を含有する、請求項１〜12のいずれかに記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖の少なくとも５％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンに対してα1→３連鎖した少なくとも1つのフコース部分を含んでなる、請求項１〜13のいずれかに記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖の少なくとも10％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンに対してα1→3連鎖した少なくとも1つのフコース部分を含んでなる、請求項１〜14のいずれかに記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖の少なくとも20％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンに対してα1→３連鎖した少なくとも1つのフコース部分を含んでなる、請求項１〜15のいずれか１項に記載の調製物。
- 前記オリゴサッカライド鎖の少なくとも40％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミンに対してα1→３連鎖した少なくとも1つのフコース部分を含んでなる、請求項１〜16のいずれか１項に記載の調製物。
- 前記ポリペプチドが野生型因子VIIのアミノ酸配列を有する、請求項１〜17のいずれか１項に記載の調製物。
- 前記ポリペプチドが野生型因子VIIである、請求項１〜18のいずれか１項に記載の調製物。
- 野生型因子VII の配列を有する複数の因子VIIポリペプチドを含んでなる調製物であって、当該ポリペプチドがアスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、当該オリゴサッカライド鎖の94〜99％が少なくとも１つのシアル酸部分を含んでなり、前記調製物は、参照調製物の生物学的利用能の少なくとも110％の生物学的利用能を示し、ここで当該参照調製物においてはオリゴサッカライド鎖の93％以下が少なくとも１つのシアル酸部分を含む、ことを特徴とする、前記調製物。
- 野生型因子VIIの配列を有する複数の因子VIIaポリペプチドを含んでなる前記調製物が、アスパラギン連結オリゴサッカライド鎖を含んでなり、そして当該オリゴサッカライド鎖の少なくとも２％が触角状（antennary）N−アセチルグルコサミン残基に対してα1→３連鎖した少なくとも1つのフコース部分を含んでなる、請求項20に記載の調製物。
- ポリペプチドが真菌、昆虫、および脊椎動物門の細胞から成る群から選択される宿主細胞において産生される、請求項１〜21のいずれかに記載の調製物。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項22に記載の調製物。
- 前記哺乳動物細胞がハムスターに由来する、請求項23に記載の調製物。
- 前記ハムスター細胞がCHO細胞およびBHK細胞から成る群から選択される、請求項24に記載の調製物。
- 前記哺乳動物細胞がヒトに由来する、請求項23に記載の調製物。
- 前記ヒト細胞がHEK細胞である、請求項26に記載の調製物。
- 調製物が参照調製物の生物学的利用能の少なくとも120％である生物学的利用能を示し、参照調製物中のオリゴサッカライドの93％以下が少なくとも1つのシアル酸部分を含んでなる、請求項１〜27のいずれかに記載の調製物。
- 調製物が参照調製物の生物学的利用能の少なくとも130％である生物学的利用能を示す、請求項28に記載の調製物。
- 調製物が参照調製物の生物学的利用能の少なくとも140％である生物学的利用能を示す、請求項29に記載の調製物。
- 請求項１〜30のいずれかに記載の調製物を含んでなる医薬製剤。
- 出血性疾患の治療のための、請求項30に記載の医薬製剤。
- 出血性疾患が血友病A、血友病B、因子IX欠乏症、因子VII欠乏症、血小板減少症、フォン・ウィルブランド病、凝固因子インヒビターの存在、外科手術、外傷、および抗凝固治療から成る群から選択される、請求項32に記載の医薬製剤。
- 望ましくない血液凝固を防止するための、請求項31に記載の医薬製剤。
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