BR102015012334A2 - processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea e fator vii de coagulação sanguínea - Google Patents

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Kamilla Swiech
Marcela Cristina Corrêa De Freitas
Virginia Picanço E Castro
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Abstract

processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea e fator vii de coagulação sanguínea a presente invenção se refere ao processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea em 3 linhagens celulares humanas (hepg2, sk-hep, hkb-11) e selecionar a melhor produtora da proteína recombinante. a linhagem murina bhk-21 foi utilizada como controle. os dados permitem afirmar que o sistema utilizado para a modificação das linhagens celulares foi eficiente, de maneira que todas as células foram modificadas satisfatoriamente, e produziram a proteína de interesse de forma estável. além disso, quando se comparam a linhagem murina bhk-21 com as células humanas (hepg2, sk-hep-1 e hkb-11), essas últimas mostraram-se capazes de produzir o rfvii de maneira mais eficiente, o que permite concluir que linhagens celulares humanas são uma ótima alternativa para a produção de fatores de coagulação sanguínea recombinantes.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DO FATOR VII DE COAGULAÇÃO SANGUÍNEA E FATOR VII DE COAGULAÇÃO SANGUÍNEA
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se insere no campo de aplicação da Química, Farmácia, Medicina, Biotecnologia e, mais especificamente, na área de preparações para finalidades médicas uma vez que se refere ao processo de produção do fator VII de coagulação sanguínea em linhagens celulares humanas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Coaqulopatias [002] A hemofilia A é uma doença sanguínea ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência ou anormalidade do fator VIII (FVIII), um cofator necessário para a geração da fibrina. Esta deficiência de proteína de coagulação é a mais comum dentre as coagulopatias, com uma incidência de aproximadamente 1 em cada 5.000 homens e atualmente afeta aproximadamente 400.000 pessoas no mundo. A hemofilia B é uma doença hereditária que também se encontra associada ao cromossomo X e consiste na deficiência do fator IX da coagulação sanguínea, com uma incidência de 1 em cada 30.000 homens. Clinicamente, tanto a hemofilia A quanto a B apresentam muitas similaridades, isto é, o paciente apresenta frequentes episódios de sangramento, na maioria das vezes em regiões cutâneas, musculoesqueléticas e em tecidos moles. 0 sangramento pode ocorrer também em outros espaços críticos como, por exemplo, no espaço intracranial ou retroperitoneal.
[003] A terapia convencional para os pacientes com hemofilias consiste na infusão intravenosa do fator VIII ou FIX derivado do plasma ou da proteína recombinante. Contudo, um dos maiores problemas é a formação de anticorpos inibitórios contra o FVIII e FIX, que é atualmente, a complicação mais significativa relacionada com o tratamento no atendimento clínico de pacientes hemofílicos. Aproximadamente 5% dos pacientes com hemofilia B e 20 a 30% dos pacientes com hemofilia A grave, submetidos à terapia de reposição de FIX e FVIII, respectivamente, desenvolvem anticorpos que inibem a atividade do fator infundido. Os tratamentos disponíveis para esses pacientes incluem o uso de agentes hemostáticos e a indução à tolerância imunológica utilizando infusões de altas doses de FVIII ou FIX. Essas abordagens são caras, devido ao alto custo dos fatores, e nem sempre bem sucedidas. Por esse motivo, muitos esforços têm sido feitos na tentativa de encontrar um tratamento hemostaticamente efetivo, independente da presença de fator VIII e IX.
[004] Ao longo dos anos, muitos estudos identificaram o fator VII ativado (FVIIa) como um candidato atrativo para a hemostasia, independente do uso de FVIII/FIX, em modelos animais com hemofilia. Além disso, o FVIIa purificado do plasma, mostrou induzir a hemostasia em alguns pacientes portadores de hemofilia severa. Em conjunto, esses dados sugerem que doses farmacológicas do FVIIa ligado ao fator tecidual (FT) exposto no local do ferimento, ativam o FX e promovem a formação de trombina no local da injuria, fazendo com que este fator de coagulação apresente-se como uma alternativa para os pacientes hemofílicos portadores de anticorpos inibidores.
Mecanismos de ação do FVII na hemostasia normal e o papel das doses farmacolóqicas [005] De acordo com o conceito atual, a hemostasia ocorre em dois tipos principais de superfície: as células que expressam o fator tecidual (FT) e as plaquetas ativadas pela trombina e é iniciada pela formação de um complexo entre o FT exposto e o FVIIa presente na circulação. O FVII/FVIIa é o ligante natural do fator tecidual e o complexo formado é bastante forte e estável.
[006] üma vez formado o complexo entre o FT e o FVIIa, ocorre a formação de uma quantidade limitada de trombina. Esse número limitado de moléculas de trombina formado na fase inicial da hemostasia ativa os cofatores FVIII, FV, FXI e as plaquetas. Uma vez ativadas, as plaquetas saem da circulação e vão se localizar no local da lesão. A ativação dos fatores VIII e IX na superfície das plaquetas ativadas promovem a ativação do fator X em FXa, que por sua vez se liga ao FVa gerando uma grande quantidade de trombina. O passo final do processo é a formação de um coágulo firme de fibrina, o qual é resistente à proteólise prematura e é capaz não só de iniciar, mas também, de manter a homeostase, enquanto o processo de cicatrização é estabelecido.
[007] Na ausência de FVIII ou FIX apenas uma pequena quantidade de trombina é gerada pelo complexo FT-FVIIa e a geração de trombina total, que se inicia na superfície das plaquetas, não ocorre. Essa ultima fase depende da formação do complexo FVIII-FIX na superfície das plaquetas ativadas. Como resultado, os coágulos de fibrina formados em pacientes hemofílicos são frágeis e facilmente dissolvidos pela proteólise prematura. A partir de estudos da hemofilia em modelos celulares, foi possível demonstrar que concentrações farmacológicas do fator Vila recombinante (rFVII) ligam-se inespecificamente nas plaquetas ativadas e geram trombina na superfície destas, mesmo na ausência de FVIII/FIX. Isso ocorre, pois o rFVIIa ativa o FX na superfície das plaquetas ativadas independente da presença de FVIII ou FIX.
[008] Dessa forma, a adição de doses farmacológicas de rFVIIa, resulta no rápido aumento na taxa de geração de trombina na superfície das plaquetas ativadas e como resultado da elevação da ativação das plaquetas no local da injuria, foi observado aumento da adesão plaquetária, assim como outros mecanismos necessários para manter a homeostase.
[009] Em 25 de março de 1999 a FDA (Food and Drug Administration) aprovou o uso do primeiro e único fator VII recombinante, o NovoSeven®. Distribuído pela NovoNordisK, o fator VII recombinante ativado (rFVIIa) é indicado no tratamento de episódios de sangramentos em pacientes portadores da hemofilia A e B que desenvolvem anticorpos contra os fatores VIII e IX respectivamente. Além disso, o rFVIIa é recomendado para o tratamento de sangramentos espontâneos e/ou cirúrgicos críticos que ameaçam a vida dos pacientes, bem como em portadores de outras doenças tais como: deficiência de FVII e trombastenia de Glanzmann.
O gene do Fator VII
[0010] O gene do fator VII tem seu lócus situado na região 34 do braço longo do cromossomo 13 (13q34. Estruturalmente e funcionalmente estão relacionadas ao grupo das serino proteases dependentes de vitamina K, que incluem ainda os fatores IX, X, protrombina (FII) e a proteina C. Seu tamanho é de aproximadamente 12,8 Kb e é composto de nove exons e oito introns. A sequência nucleotidica dos exons é completamente conhecida. Sabe-se que os exons la e lb e parte do exon 2 codificam um peptideo sinal que é removido durante o processamento. 0 restante do exon 2 e os exons 3 a 8 codificam uma proteina de 406 aminoácidos presente na circulação sanguínea.
[0011] O FVII é sintetizado no fígado e circula no sangue em uma concentração de 0,5 pg/mL na forma de uma cadeia única, com um peso molecular de 50 kDa. Na porção amino-terminal é constituído por um domínio rico em ácido glutâmico e γ-carboxilado (domínio GLA), seguido por dois domínios semelhantes ao fator de crescimento epidérmico (EGF), um peptideo curto de ligação e um domínio serino-protease na porção carboxi-terminal.
[0012] A conversão do fator VII na enzima ativa (FVIIa) ocorre pela divagem da ligação peptidica Argl52-Ilel53, na qual não ocorre a liberação de nenhum peptideo. Como consequência, o fator Vila é composto por duas cadeias polipeptídicas unidas por ponte dissulfeto. A cadeia leve compreende o domínio GLA, a hélice aromática e os dois domínios EGF. Esta cadeia é composta por 152 aminoácidos que codificam uma proteína com peso molecular de 20 kDa. A cadeia pesada possui o sítio catalítico da molécula e compreende 254 aminoácidos com aproximadamente 30 kDa de peso molecular.
Fator VII e a γ-carboxilação dependente de vitamina K
[0013] Um dos principais problemas com a produção de fatores de coagulação recombinantes dependentes de vitamina K para o uso terapêutico tem sido a recuperação funcional deficiente dessas proteínas do meio de cultura celular. Estudos têm demonstrado que esses resultados são devidos principalmente: 1) a incompleta γ-carboxilação das proteínas secretadas e 2) remoção ineficiente do propeptídeo pela protease furin no complexo de Golgi.
[0014] O sistema de γ-carboxilação vitamina K- dependente é um sistema composto de várias proteínas localizadas na membrana do reticulo endoplasmático. É composto de: 1) uma enzima γ-carboxilase vitamina K- dependente, que exige a forma reduzida de hidroquinona da vitamina K (vit. K1H2) como cofator e 2) a enzima sensível a varfarina, vitamina K 2,3-epóxido redutase (VKOR), que produz o cofator. Concomitante com γ-carboxilação, a hidroquinona é convertida no metabolito vitamina K 2,3 epóxido que é reduzido de volta ao cofator vit. K1H2 pela ação da VKOR, no chamado ciclo da vitamina K.
[0015] A proteína calumenina foi identificada como um dos fatores capazes de regular o sistema de y-carboxilação, em que a mesma se ligaria na γ-carboxilase como uma chaperona inibitória e também afetaria a proteína VKOR. Esta conclusão é baseada em dados que incluem: 1) a inibição da atividade da γ-carboxilase com transfecção de uma construção contendo o cDNA da calumenina, 2) o silenciamento do gene calumenina por um Smart siRNA e 3) uma abordagem proteômica que demonstra a existência de interações proteína-proteína entre γ-carboxilase e a calumenina. Também foi demonstrado que ao se utilizar células Hek293 houve um aumento na produção de FVII recombinante nessas células de 9% para 68%, quando estas eram transfectadas para a super expressão da proteína VK0RC1 e tinham concomitantemente o gene da calumenina suprimido estavelmente em mais de 80% pela expressão de um shRNA.
[0016] Dentro desse contexto é possível prever que uma linhagem celular humana possui a maquinaria adequada para γ-carbolixar e produzir de maneira mais eficientemente o FVII recombinante.
ESTADO DA TÉCNICA
[0017] Os documentos US2004023333, US2010172891, PI 1105317-8 e "Expression of human coagulation factor VIII in a human hybrid cell line, HKBll" descrevem a produção de FVIII, diferente da presente invenção que descreve a produção de FVII. Vale a pena ressaltar que apesar de ambos participarem da cascata de coagulação sanguínea, os fatores VII e VIII são proteínas que possuem modificações pós-traducionais diferentes e são classificados em famílias proteicas diferentes.
[0018] 0 documento US4784950 descreve a produção de proteínas a partir de construções plasmidial artificiais que combinam parte da proteína de interesse e parte do fator VII. Já a presente invenção visa a produção de FVII e na construção do DNA recombinante utiliza o FVII integro. O documento citado utiliza células murinas (BHK) enquanto a presente invenção utiliza linhagens celulares humanas.
[0019] O documento US2009088370 tem por objetivo o aumento da secreção das proteínas alvo a partir da modificação das condições de cultivo. Nesse documento é relatado que as células são cultivadas em condições especificas de meio livre de soro, com a adição de substâncias ao meio de cultura, principalmente substâncias iônicas. Na presente invenção são utilizados meios comerciais, quimicamente definidos, com a adição de soro fetal bovino e sem adição de substancias adicional. Células citadas pelo documento: 293, 293T, 293F, 293H, Cos, CHO, NSO, células de inseto. Não menciona nenhuma das linhagens celulares humanas utilizadas na presente invenção.
[0020] 0 documento US2010331255 tem como principal objetivo aumentar a expressão da proteína alvo por meio da manipulação do sistema de gama-carboxilação celular. Para isso utiliza como principal proteína o FIX e concomitante a expressão da proteína alvo, fazendo a superexpressão do gene VKORC1 e inibição do gene inibitório calumenina, utilizando siRNA, em células de camundongo (BHK). Na presente invenção, apesar de ter sido quantificada a expressão das proteínas ligadas ao processo de gama-carboxilação, nenhuma metodologia foi utilizada para intervir no processo natural das células.
Objetivos e vantagens da invenção [0021] O objetivo da presente invenção foi modificar linhagens celulares humanas com vetor lentiviral contendo cDNA do FVIII de coagulação sanguínea e selecionar a melhor célula produtora do FVII recombinante, para desenvolver um bioprocesso que possibilite a produção de FVII em larga escala utilizando células humanas.
[0022] Este projeto teve como inovação a utilização de linhagens celulares humanas para produzir rFVII mais eficientemente e, por se tratar de células humanas, evitar o desenvolvimento de possíveis epítopos imunogênicos expressos em células murinas, e por fim obter um produto recombinante mais seguro. A utilização de linhagens celulares murinas oferece desvantagens considerando a complexidade de modificações pós-traducionais do FVII.
[0023] A necessidade de um fator VII de coagulação mais segura, com um custo reduzido, e também, a necessidade de desenvolvimento de novos bioprocessos empregando linhagens celulares eficientes juntamente com estratégias que permitam a produção de altos níveis do produto justificaram a realização deste projeto que visa o desenvolvimento de um bioprocesso otimizado para a produção de fator VII. Trabalhos neste sentido podem trazer como benefícios para a sociedade brasileira a possibilidade de obtenção de medicamentos mais eficientes. Dentro deste contexto, a presente invenção teve como proposta a clonagem e expressão do FVII em linhagens celulares humanas para a produção de um rFVII idêntico, principalmente em relação as modificações pós-traducionais, ao do plasma humano.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0024] A presente invenção se refere ao processo de produção do fator VII de coagulação sanguínea em 3 linhagens celulares humanas (HepG2, Sk-Hep, HKB-11) e selecionar a melhor produtora da proteína recombinante. A linhagem murina BHK-21 foi utilizada como controle. Inicialmente, o gene do FVII (ATCC) foi clonado no vetor lentiviral bicistrônico pl054-CIGWS, que contem o gene do GFP, codificador de uma proteína fluorescente, a qual permite a observação da eficiência de modificação das linhagens celulares. Após a modificação das células, a expressão do gene marcador GFP foi observada por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, na qual 80% das células ΒΗΚ-21-rFVII apresentaram expressão de GFP. As células HepG2-rFVII mostraram uma expressão de 73% enquanto que as células HKB-ll-rFVII apresentaram 32% de células GFP positivas. Já a linhagem celular Sk-Hep-rFVII foi a que mostrou a melhor eficiência de transdução sendo aproximadamente 95% das células modificadas. A próxima etapa consistiu na caracterização do rFVII produzido pelas linhagens celulares modificadas. Foram realizados ensaios de quantificação pelo ensaio de ELISA. As análises mostraram que em 48h de cultivo, as células HepG2/rFVII produzem cerca de 1506 ng/mL de rFVII, seguida pelas linhagens SKHep/rFVII (951 ng/mL), HKB-ll/rFVII (808 ng/mL) e ΒΗΚ-21/rFVII (302 ng/mL). O mesmo sobrenadante celular foi utilizado para verificar a quantidade de FVII biologicamente ativo que as linhagens celulares produziram. Após o teste coagulométrico observou-se que as células HepG2/rFVII produzem cerca de 1,07 UI/mL de rFVII biologicamente ativo, seguida pelas linhagens SKHep/rFVII (0,56 UI/mL), HKB-ll/rFVII (0,60 UI/mL) e ΒΗΚ-21/rFVII (0,04 UI/mL). Com intuito de analisar a expressão do rrtRNA relativo ao rFVII bem como das enzimas relacionadas a y-carboxilação, foi realizado um PCR em tempo real. Após analise dos dados observou-se que as três linhagens humanas modificadas apresentaram expressão do mRNA relativo ao rFVII. Quando submetidas ao tratamento com vitamina K por um período de 10 passagens em cultura, a expressão do gene rFVII foi semelhante para as três linhagens (HepG2: 164563 URE, HKB-11: 119122 URE e Sk-Hep: 124919 URE) o que leva a crer que houve uma estabilização nos níveis de expressão da proteína recombinante. Em relação as enzimas de γ- carboxilação foi possível observar que tanto a γ- carboxilase, VK0RC1 quanto o inibidor calumenina apresentaram aumento nos níveis de expressão de mRNA quando tratadas com vitamina K, sugerindo que esta ativa as enzimas do ciclo.
[0025] Dessa forma, até o presente momento, os dados permitem afirmar que o sistema utilizado para a modificação das linhagens celulares foi eficiente, de maneira que todas as células foram modificadas satisfatoriamente, e produziram a proteína de interesse de forma estável. Além disso, quando se comparam a linhagem murina BHK-21 com as células humanas (HepG2, Sk-Hep-1 e HKB-11), essas últimas mostraram-se capazes de produzir o rFVII de maneira mais eficiente, o que permite concluir que linhagens celulares humanas são uma ótima alternativa para a produção de fatores de coagulação sanguínea recombinantes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0026] A figura 1 mostra a morfologia das linhagens celulares humanas - Foto em microscópio óptico de contraste de fases mostrando em (A) linhagem celular BHK-21, (B) linhagem celular HepG2, (C) linhagem celular HKB-11 e (D) linhagem celular Sk-Hep-1.
[0027] A figura 2 representa graficamente a expressão relativa dos genes CALU, VKORC1, γ-carboxilase e FatorVII nas linhagens celulares humanas.
[0028] A figura 3 mostra células Hek293T após 48h de transfecção com Lipof ectamina® e com PEI - Foto em microscópio óptico de contraste de fases mostrando em (A e D) linhagem celular Hek293T transfectadas; foto em microscópio óptico de fluorescência mostrando em (B e E) as células Hek293T após 48h da transfecção utilizando a Lipofectamina® (B) e o PEI (E); em C e F pode-se observar a porcentagem de células GFP positivas mensuradas por citometria de fluxo.
[0029] A figura 4 representa graficamente a expressão de GFP nas células Hek293T após 48h de infecção para cálculo do titulo viral - Diluições do sobrenadante viral - 1:3 (A e B), 1:2 (Ce D).
[0030] A figura 5 representa graficamente a expressão de GFP nas linhagens celulares recombinantes BHK-21, HepG2, HKB-11 e Sk-Hep. Em A, D, G e J dotplot mostrando tamanho (FSC) pela complexidade interna (SSC) das respectivas células; Em B, E, H e K dotplot mostrando a ausência de expressão do gene GFP nas células controle; Em C, F, I e L dotplot mostrando a expressão de GFP nas linhagens celulares modificadas com o vetor pl054-rFVII.
[0031] A figura 6 mostra linhagens celulares recombinantes modificadas com o vetor pl054-rFVII; Foto em microscópio óptico de contraste de fases mostrando em A, C, E e G as linhagens celulares BHK-21,HepG2, HKB-11 e Sk-Hep, respectivamente; Foto em microscópio óptico de fluorescência mostrando a expressão do gene GFP nas linhagens BHK-21 (B), HepG2 (D), HKB-11 (F) e Sk-Hep (H).
[0032] A figura 7 representa graficamente a expressão relativa do gene Fator VII recombinante nas linhagens celulares humanas.
[0033] A figura 8 mostra Western Blot; 1 - HepG2 não transduzida, 2 - HepG2/FVIIr, 3 - Sk-Hep-1 não transduzida, 4 - Sk-Hep-1 FVIIr, 5 - HHK-11 não transduzida, 6 - HKB-ll/FVIIr, 7 - BHK-21 não transduzida, 8 - ΒΗΚ-21/FVIIr, 9 - Novo Seven.
[0034] A figura 9 representa graficamente a expressão de GFP e quantificação do FVIIr na linhagem celular recombinante HKB-11 antes e após o sorting - Em A gráfico mostrando tamanho (FSC) pela complexidade interna (SSC), seguido pelo gráfico da expressão de GFP nas linhagens celulares modificadas antes do sorting; a partir da gate realizada, podemos observar no ultimo gráfico um enriquecimento na quantidade de células expressando GFP após o sorting celular - em B, quantificação do FVIIr por ELISA, antes e após o sorting celular.
[0035] A figura 10 representa graficamente a expressão relativa do RNAm relativo gene Fator VII recombinante nas linhagens celulares humanas HepG2, HKB-11 e Sk-Hep.
[0036] A figura 11 representa graficamente a expressão relativa do RNAm referente ao gene da enzima γ-carboxilase (A), VKORC1 (B) e da proteína inibitória Calumenina (C) nas linhagens celulares humanas HepG2, Sk-Hep-1 e HKB-11, antes e após a transdução, antes e após o tratamento com vitamina K.
[0037] A figura 12 representa graficamente a cinética de crescimento da linhagem celular SK-Hep-l-FVIIr - em A, crescimento e viabilidade celular durante o cultivo das células Sk-Hep-l-FVIIr em meio DMEM com 10% SFB, em placas de 10 cm2; em B, velocidade máxima especifica de crescimento (px.máx = 0,79 dia-1) (n=2).
[0038] A figura 13 representa graficamente a cinética de crescimento da linhagem celular HKB-ll-FVIIr -em A, crescimento e viabilidade celular durante o cultivo das células HKB-ll-l-FVIIr em meio DMEM-F12 com 10% SFB, em placas de 10 cm2 - em B, velocidade máxima especifica de crescimento (px.máx = 0,81 dia-1) (n=2).
[0039] A figura 14 representa graficamente a cinética de crescimento da linhagem celular ΒΗΚ-21-FVIIr -em A, crescimento e viabilidade celular durante o cultivo das células ΒΗΚ-21-l-FVIIr em meio EMEM com 10% SFB, em placas de 10 cm2; em B, velocidade máxima especifica de crescimento (px.máx = 0,98 dia-1) (n=2).
[0040] A figura 15 representa graficamente a cinética de produção das linhagens celulares produtoras de fator VII recombinante; quantificação realizada pelo teste de ELISA.
[0041] A figura 16 representa graficamente a cinética de produção das linhagens celulares produtoras de fator VII recombinante, mensurada pelo método de tempo de tromboplastina (TP).
[0042] A figura 17 representa graficamente o cultivo da linhagem celular Sk-Hep-FVIIr em microcarregadores em frascos spinner - crescimento celular (A), velocidade máxima especifica de crescimento (B) e perfil da concentração de glicose e lactato durante o cultivo das células Sk-Hep-l-FVIIr em meio DMEM 10% SFB em frascos spinner (n=2).
[0043] A figura 18 mostra a morfologia das células Sk-Hep-l-FVIIr aderidas em microcarregadores no sétimo dia de experimento - em A, fotomicrografia em contraste de fase, mostrando as células adaptadas aderidas aos microcarregadores; em B, microscopia eletrônica de fluorescência mostrando a expressão de GFP nas células aderidas.
[0044] A figura 19 representa graficamente a cinética de produção da linhagem celular Sk-Hep-1 produtora de fator VII recombinante cultivadas em frascos spinner por 10 dias.
[0045] A figura 20 representa graficamente a cinética de produção de FVIIr biologicamente ativo na linhagem celular Sk-Hep-l-FVIIr cultivadas em frascos spinner por 10 dias.
[0046] A figura 21 representa graficamente o cultivo da linhagem celular HKB-ll-FVIIr em microcarregadores em frascos spinner - crescimento celular (A), velocidade máxima especifica de crescimento (B) e perfil da concentração de glicose e lactato durante o cultivo das células HKB-11-1-FVIIr em meio DMEM-F12 10% SFB em frascos spinner (n=2).
[0047] A figura 22 mostra a morfologia das células HKB-ll-FVIIr aderidas em microcarregadores no sétimo dia de experimento - em A, fotomicrografia em contraste de fase, mostrando as células adaptadas aderidas aos microcarregadores; em B, microscopia eletrônica de fluorescência mostrando a expressão de GFP nas células aderidas.
[0048] A figura 23 representa graficamente a cinética de produção da linhagem celular HKB-11 produtora de fator VII recombinante cultivadas durante 10 dias em frascos spinner.
[0049] A figura 24 representa graficamente a cinética de produção de FVIIr biologicamente ativo na linhagem celular HKB-ll-FVIIr cultivadas em frascos spinner por 10 dias.
[0050] A figura 25 mostra a morfologia das células HKB-ll/rFVII em terceira passagem em meio livre de soro fetal bovino; Em A, fotomicrografia em contraste de fase, mostrando as células adaptadas ao crescimento em suspensão; Em B, microscopia eletrônica de fluorescência mostrando a expressão de GFP nas células adaptadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0051] A presente invenção descreve o processo de produção do fator VII de coagulação sanguínea compreendendo as etapas de: 1) Obtenção de partículas de vírus contendo FVII e a proteína GFP como gene repórter - utilizando vetor lentiviral; 2) Transdução das linhagens celulares humanas, preferencialmente, SK-Hep 1, HKB11, e HepG2 com partículas virais para formar células produtoras de FVII; 3) Cultura das células humanas produtoras de FVII em suspensão usando microcarregadores.
[0052] Foi realizada a transfecção da linhagem celular Hek293T para produção de partículas virais. Para a produção viral é importante que a linhagem celular (Hek293T) expresse estavelmente o gene para o grande antígeno T do SV40. Neste processo é necessário o uso de um vetor contendo o transgene e dois vetores auxiliares, que possuam a origem de replicação do SV40, para que após a transfecção os plasmideos dentro das células possam se replicar o que aumenta a transcrição do transgene e a produção de proteínas virais e por fim mais partículas virais serão secretadas no meio de cultura.
[0053] Para a produção de partículas virais foi utilizado o reagente polietilamina (PEI). Os três plasmideos foram transfectados na seguinte proporção: 10-20 pg vetor com o transgene (pl054-rFVII), 8-15 pg pCMVAR8.91 (contendo gag, pol, ver e tat do HIV-1), 5-10 μg pMD2 VSVG (codifica o envoltório do VSV-G).
[0054] Após a transfecção (15-20 horas) as células foram incubadas com meio fresco. Após 48 horas o sobrenadante foi coletado, centrifugado a 450 x g, por 5 minutos a 4°C, filtrados (filtro 0,45 μπ\) para a retirada de restos celulares. Alíquotas de 1 mL foram congeladas a -80°C para a determinação do título viral e para o uso nos experimentos de transdução. Uma vez congelado a -80°C e descongelado (a 37°C), o poder de infecção das partículas virais é diminuído em cerca de 20-40%. Entretanto, para padronização do uso e para que os experimentos possam ser reproduzíveis, as partículas virais foram primeiramente congeladas.
[0055] Para a titulação do sobrenadante viral, inicialmente foi plaqueado 2xl05 células Hek293T em cada poço, da placa de 6 poços. Após atingir a confluência de 80-90% as células foram infectadas com o sobrenadante contendo vírus pl054-rFVII nas seguintes diluições: 1:1, 1:2 e 1:3, sendo a proporção de sobrenadante viral para meio de cultura fresco. As diluições foram feitas em duplicata e foi utilizado polibreno 5,5 ug/mL.
[0056] Após 16h de infecção, o meio das células foi trocado por meio fresco (DMEM 10% soro fetal bovino). As células foram então cultivadas por 48h e após este período foram tripsinizadas e levadas para a citometria de fluxo para a análise da expressão do gene GFP contido no vetor pl054-rFVII. De posse dos resultados obtidos pela citometria de fluxo foi possível calcular o título viral.
[0057] O fator VII e o GFP não estão fusionados, estão separados por um elemento IRES; método compreende ainda identificação das células transduzidas e células não transduzidas pela presença da proteína GFP.
[0058] O sobrenadante produzido pelas células Hek293T que foram anteriormente transfectadas e congelado, foram descongelados e colocados sobre as culturas das linhagens celulares Sk-Hep, HepG2, HKB11 e BHK, na presença de polibreno 5,5 pg/mL. Para isso, 24h antes da transdução, as células foram plaqueadas na concentração de 2xl05 células por poço, na placa de 6 poços. Foi adicionada uma concentração viral de 10 vírus/célula, baseado nos valores obtidos pela titulação viral. Após a adição do sobrenadante viral, as células foram incubadas a 37°C em atmosfera úmida contendo 5% de C02, e os ciclos de transdução foram repetidos por dois a três dias consecutivos, dependendo da linhagem celular.
[0059] Inicialmente as células foram cultivadas em frascos de cultura de 75 cm2 para expansão, e mantidas em incubadora a 37°C e 5% de 002. Após atingir a confluência de aproximadamente 80%, as células foram desaderidas com Tripsina-EDTA e inoculadas em frascos T de 75 cm". A morfologia celular durante a expansão foi observada com a utilização de um microscópio invertido.
[0060] Após atingir o número de células suficientes (5x10° células), inoculou-se em frasco spinner (100-150 mL, com volume de trabalho de 50 mL) já contendo meio de cultura e microcarregador. Utilizou-se a concentração de 2,0 a 4,0 g/L do microcarregador Cytodex 3. O preparo e esterilização dos microcarregadores foi realizado de acordo com as normas do fabricante. O experimento foi dividido em 2 fases: a fase para a adesão e a fase para a expansão celular. A duração da fase de adesão foi de 6 horas, com agitação intermitente: de 30 em 30 minutos por 2 minutos. Para a fase de expansão utilizou-se agitação constante de 40 rpm.
[0061] Para avaliar a adesão das células nos microcarregadores, foram retiradas amostras a cada uma hora para determinação da densidade celular em suspensão e a viabilidade.
[0062] Para acompanhar o crescimento celular durante a fase para a expansão foram retiradas amostras a cada 24 horas para quantificação celular e para posteriores análises de glicose, glutamina, ácido láctico e amônia. As células livres em suspensão foram quantificadas utilizando o método de exclusão pelo corante azul de tripan. Já para as células aderidas nos microcarregadores, a quantificação foi determinada através do método Cristal Violeta.
[0063] Amostras do sobrenadante celular foram coletadas, centrifugadas e congeladas a -20°C para posteriores análises de ELISA e ensaio de atividade biológica.
[0064] O experimento teve duração de 10 dias, sendo que a cada 3 dias foram feitas fotomicrografias em microscopia de contraste de fases para analise das células aderidas aos microcarregadores e microscopia de fluorescência, para analises da expressão de GFP das células aderidas.
[0065] Para a etapa de adaptação utilizou-se a célula HKB-11 pós sorting. Inicialmente as células foram cultivadas em frascos T 75 cm2 em meio DMEM-F12 contendo 10% de soro fetal bovino. Após atingir a confluência de 90%, as células foram tripsinizadas com solução de Tripsina-EDTA e lxlO6 células foram plaqueadas em frascos T 25 cm2 com meio Free Style suplementado com Pluronic, ITS (Insulina, Transferrina e Selênio) e 10% (v/v) de Penicilina/Estreptomicina, na ausência de soro fetal bovino.
[0066] Depois de 48h, as células foram repicadas, contadas e a viabilidade observada pelo reagente azul de trypan (0,4%). Novamente lxlO6 células viáveis foram plaqueadas em frascos T 25 cm2 com meio Free Style suplementado. Esse procedimento foi realizado por 5 passagens, até que as células estivessem adaptadas ao crescimento em meio livre de soro e em suspensão.
[0067] Este processo produz cerca de três vezes mais proteína FVII do que uma quantidade de FVII proteína normalmente encontrada no plasma humano.
Resultados Caracterização das linhagens celulares [0068] As linhagens celulares humanas HepG2, Sk-Hep-1, HKB-11 e a linhagem celular murina BHK-21, foram cultivadas na intenção de produzir um banco de células master e um banco de células de trabalho. A produção de banco de células é de extrema importância, pois permite que haja uma reprodutibilidade dos experimentos ao longo do desenvolvimento do projeto.
[0069] Com o intuito de conhecer melhor as linhagens celulares utilizadas na presente invenção, foi realizada uma caracterização morfológica das células, por meio de fotografias em microscópio óptico de contraste de fase (Figura 1) .
[0070] Como se pode observar na Figura 1, as células da linhagem murina BHK-21 (A) são grandes, de morfologia alongada e com características fibroblastóides. Em B, podemos observar a linhagem HepG2 que cresce em aglomerados de células aderidas à placa de cultura. Esse perfil de crescimento deve-se, provavelmente, ao fato dessas células derivarem de um hepatocarcinoma.
[0071] A linhagem celular híbrida HKB-11 é mostrada em (C) , na qual se pode observar que as células crescem aderidas e possuem uma morfologia mais alongada, porém, de menor tamanho, quando comparadas com a BHK-21. Já a linhagem Sk-Hep-1 (D), apresenta morfologia de células epiteliais, condizendo com sua origem de adenocarcinoma hepático.
[0072] Além da caracterização morfológica, as linhagens celulares humanas também foram caracterizadas quanto a expressão dos genes envolvidos no processo de y-carboxilação. Para isso foi realizada a quantificação por PCR em tempo real dos genes γ-carboxilase e vitamina K 2,3-epóxido redutase (VKORC1), além do gene inibitório calumenina (CALU). Também foi possível a quantificação do mRNA referente ao gene do Fator VII endógeno, como mostra a Figura 2.
[0073] Em relação aos genes envolvidos no processo de γ-carboxilação, as linhagens celulares HepG2 é a que mais expressa γ-carboxilase e VKORC1. As células HepG2 expressaram 251 unidades relativas de expressão (URE) do gene γ-carboxilase e 305 URE do gene VKORC1. As células HKB-11 e SK-Hep expressam cerca de 63 URE e 35 URE do gene γ-carboxilase e 144 URE e 50 URE do gene VKORC1, respectivamente.
[0074] Como observado no gráfico, as linhagens HepG2 foi a que mais expressou o gene inibitório CALU, na ordem de 580 URE, seguidas pelas linhagens HKB-11 (371 URE) e SK-Hep (281 URE).
[0075] Com o objetivo de selecionar a melhor linhagem celular para a produção do fator VII recombinante, foi realizada uma razão entre a expressão do gene inibitório CALU e a expressão dos genes envolvidos na γ-carboxilação (Tabela 1).
Tabela 1. Razão entre a expressão dos genes CALU, VKORC1 e γ-carboxilase [0076] Como mostrado na Tabela 1, a linhagem celular que apresentou menor razão entre a expressão do gene inibitório CALU e os genes γ-carboxilase e VK0RC1 foi a HepG2, seguida da linhagem HKB-11.
[0077] Após a caracterização das linhagens celulares humanas, a próxima etapa consistiu na clonagem do gene fator VII. Tendo em vista os resultados de expressão gênica das linhagens celulares, bem como dados da literatura, iniciou-se o isolamento do mRNA das células HepG2, para posterior produção de cDNA, isolamento e clonagem do gene no vetor de expressão.
[0078] 0 fator VII é um gene que, pelo processo de splicing alternativo, apresenta A variantes sendo que uma delas não é transcrita. A forma predominante no fígado normal é variante 2, que devido ao processo de splicing alternativo, não contem o éxon lb e dessa forma codifica um peptídeo sinal menor. A variante 1 contem o éxon lb, que codifica dessa forma, um peptídeo sinal mais longo. Contudo, o peptídeo maduro codificado por ambas as variantes são idênticos. A terceira variante apresenta a ausência não só do éxon lb como também dos éxons 2 e 3 e dessa forma, gera um peptídeo maduro que não possui atividade biológica.
[0079] Dessa forma, optou-se por adquirir o gene do fator VII referente a variante 2 e dar prosseguimento aos experimentos. Esta foi clonada no vetor de expressão pl054-CIGWS. Vetores virais têm como principal vantagem a inserção do transgene no DNA da célula hospedeira, fazendo com que esta passe a expressar de forma estável o gene de interesse.
[0080] O vetor lentiviral utilizado nesta invenção possui o elemento WPRE que aumenta a eficiência do transporte e processamento do mRNA o que provavelmente contribuiu para uma maior expressão de FVII nas linhagens celulares humanas.
Clonagem do cNDA do FVII em um vetor lentiviral [0081] Após verificar a clonagem do gene FVII no vetor lentiviral pl054, o que culminou na geração do vetor pl054-rFVII, este vetor foi utilizado para a produção de partículas virais. Para a produção de vetores lentivirais em células Hek293T além do vetor contendo o transgene, dois outros vetores, pCMVAR 8.91 e pMD2.VSVG, responsáveis pela formação do capsídeo e envelope viral, respectivamente também são necessários para formação de partículas viáveis. Todos os vetores utilizados foram checados com enzimas de restrição para a confirmação da integridade.
[0082] Com os três vetores checados, procedeu-se a tripla co-transfeção da linhagem celular Hek293T para a produção de lentivírus utilizando o reagente PEI.
[0083] Uma vez que o vetor pl054 possui o gene da proteína verde fluorescente, GFP, foi possível verificar a eficiência de transfecção da linhagem celular por meio de microscopia de fluorescência e por citometria de fluxo.
[0084] Como mostrado na Figura 3, se pode observar a fotomicrografia das células Hek293T após 48h da transfecção com o reagente PEI. A porcentagem de células GFP positivas detectada por citometria de fluxo foi de 32,17% (Figura 3F).
[0085] Após a geração da linhagem celular Hek293T produtora de lentivírus, a próxima etapa consistiu em coletar o sobrenadante celular contendo as partículas virais e titular a quantidade de vírus com a intenção de saber exatamente quantos vírus seriam utilizados no próximo passo, a transdução das linhagens celulares alvo.
[0086] Para tanto foi utilizado o protocolo descrito previamente. Foram utilizadas 3 diferentes diluições do sobrenadante viral e cada uma delas feitas em duplicata. Após 48h da infecção, as células foram tripsinizadas e, uma vez que o vetor pl054-rFVII possui GFP, a porcentagem de infecção pode ser observada por citometria de fluxo e posterior cálculo do título viral.
[0087] Como mostrado na Figura 4 podemos observar as duplicatas A e B, C e D referentes às diluições de 1:3 e 1:2, respectivamente.
[0088] Com a finalidade de calcular o título viral foram utilizados os valores referentes à diluição 1:3. O título viral calculado foi de 2x106 vírus/mL.
Linhagens celulares modificadas para produção de rFVII
[0089] Após a transdução com o sobrenadante viral obtive-se 4 linhagens celulares modificadas com o vetor pl054-rFVII, sendo elas BHK-21 (murina), HepG2, Sk-Hep e HKB-11 (humanas) . Com o intuito de verificar se a modificação havia ocorrido de modo satisfatório foi observada a expressão do gene marcador GFP por citometria de fluxo. Como mostrado na figura 5, 80% das células BHK- 21-rFVII apresentaram expressão de GFP. As células HepG2-rFVII mostraram uma expressão de 73% enquanto que as células HKB-ll-rFVII apresentaram 32% de GFP. Já a linhagem celular Sk-Hep-rFVII foi a que mostrou a melhor eficiência de transdução sendo que aproximadamente 95% das células expressaram GFP após a modificação.
[0090] Com o intuito de verificar o sucesso da modificação das linhagens celulares, foram feitas fotomicrografias em microscópio óptico de fluorescência (Figura 6).
Caracterização do FVII recombinante produzido pelas linhagens celulares Expressão do rFVII nas linhagens celulares modificadas [0091] Após confirmar a expressão do gene GFP pelas metodologias de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência, a próxima etapa consistiu em analisar a expressão do mRNA referente ao gene do fator VII na linhagens celulares humanas, HepG2, HKB-11 e Sk-Hep (Figura 7) .
[0092] Como pode ser observado na Figura 7, as três linhagens celulares humanas apresentaram expressão do mRNA referente ao gene do fator VII da ordem de 8589 unidades relativas de expressão (URE) na HepG2-rFVII, 1361 URE na linhagem HKB-ll-rFVII e 5357 URE nas células Sk-Hep-rFVII.
[0093] Esses dados mostram não somente a eficiência na modificação das linhagens celulares, como mostrado por citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência, bem como a capacidade dessas linhagens em expressar a proteína recombinante de interesse.
Quantificação do rFVII nas linhagens celulares modificadas [0094] Com o objetivo de quantificar o total de rFVII (ativo e não ativo) produzido pelas linhagens celulares modificadas foi realizado o ensaio de ELISA. Para quantificar o rFVII biologicamente ativo (rFVIIa) produzido pelas linhagens celulares modificadas, realizou-se o teste coagulométrico de tempo de protrombina (TP). 0 resultado de ambos os testes são mostrados na Tabela 2.
Tabela 2. Quantificação do FVIIr pelo ensaio de ELISA
e TP
[0095] Como é possível observar, as três linhagens celulares humanas HepG2-rFVII, Sk-Hep-rFVII e HKB-ll-rFVII apresentaram quantidades de rFVII mais elevadas do que as encontradas no plasma humano, da ordem de l,7x, l,5x, e l,35x, respectivamente, mostrando que essas linhagens são promissoras para a produção da proteína recombinante.
[0096] Em relação ao rFVII produzido de forma ativa, a Sk-Hep/rFVII é a célula com capacidade de produzir mais proteína biologicamente ativa, seguida das linhagens HepG2/rFVII, HKB-ll/rFVII e por último a linhagem celular murina ΒΗΚ-21/rFVII.
Western blot [0097] Após quantificar a proteína recombinante por ELISA e verificar que as linhagens celulares estavam produzindo FVIIr biologicamente ativo, foi realizado um Western Blot com a finalidade de observar o tamanho da proteína produzida.
[0098] Após verificar o padrão de bandas no gel de poliacrilamida, foi realizado o blotting. Para isso o conteúdo do gel foi transferido para uma membrana de PVDF e marcado com anticorpo anti-FVII (Figura 8).
[0099] Como é possível observar na figura 8, as bandas de aproximadamente 55 kDa evidenciam a expressão da proteína recombinante nas linhagens celulares modificadas (raias 2, 4, 6 e 8), enquanto não há expressão do FVIIr nas células não transduzidas (raias 1, 3, 5, 7).
[00100] Pode-se observar também que as células que possuem maior expressão do RNAm relativo ao FVIIr, bem como maior quantificação no ELISA, são as células que apresentam bandas de maior intensidade no Western Blot (HepG2-FVIIr na raia 2 e Sk-Hep-l-FVIIr na raia 4) . Da mesma maneira, as células com menor expressão de RNAm e menor quantificação no ELISA, apresentam bandas refrentes ao FVIIr de intensidade mais fracas no Western Blot (HKB-11-FVIIr na raia 6 e ΒΗΚ-21-FVIIr na raia 8).
[00101] Na raia 9 pode-se observar o Novo Seven que foi utilizado como controle positivo da reação. A banda de peso molecular maior refere-se ao FVII de cadeia única não ativado (50 KDa) , e a banda de peso molecular menor (20 KDa) refere-se à cadeia leve do FVIIr ativado. A banda de 30 KDa, referente à cadeia pesada do FVIIr, não aparece do blotting uma vez que foi utilizado um anticorpo monoclonal que não marca essa cadeia especificamente.
Geração da população celular HKB-ll/rFVII homogênea [00102] Como mostrado anteriormente, a linhagem celular HKB-11 foi a que apresentou a menor eficiência de modificação, sendo que após a transdução apenas 32% das células estavam expressando o gene marcador GFP, enquanto que as linhagens Sk-Hep, HepG2 e BHK-21 expressavam 95%, 73% e 80%, respectivamente.
[00103] Após 12 meses de cultivo, utilizado para o estabelecimento das linhagens celulares, acompanhou-se a porcentagem de células que expressavam GFP (Tabela 3).
Tabela 3. Decaimento na porcentagem de GFP após 12 meses de cultivo [00104] Como é possível observar na Tabela 3, as células HKB-11 foram as que apresentaram maior perda na expressão do gene marcador GFP, em torno de 50%.
[00105] Com o intuito de gerar uma população mais homogênea e com níveis de expressão mais comparáveis as outras linhagens celulares mostradas nessa invenção, foi realizado a seleção de células HKB-11 GFP positivas por sorting celular, o qual é mostrado nas Figura 9.
[00106] Como observado, houve um aumento no número de células que expressam GFP da ordem de 3,9 vezes. Esses dados também foram confirmados por microscopia de fluorescência.
[00107] Além do aumento na porcentagem de células GFP positivas foi possível observar um aumento na quantidade de rFVII produzido, quando testou-se o sobrenadante pelo teste de ELISA. Após um período de 96h de cultivo, as células que não passaram por sorting estavam produzindo 604 ng/mL de rFVII, enquanto que as células pós-sorting, cultivadas sob as mesmas condições, produziram 1468 ng/mL. A partir destes resultados, utilizou-se para os experimentos seguintes, apenas as células HKB-ll/rFVII pós-sorting, citadas como HKB-ll/rFVII.
Caracterização das linhagens celulares produtoras de rFVII
[00108] Até o presente momento foram apresentados resultados referentes a geração das linhagens celulares produtoras de FVII recombinante, bem como uma caracterização global da proteína a nível de expressão, atividade biológica e western blot.
[00109] Os resultados que se seguem são referentes à caracterização das linhagens celulares recombinantes com o intuito de selecionar a melhor produtora de rFVII.
Linhagens celulares modificadas expressam mRNA do rFVII e das enzimas de y-carboxilação [00110] Inicialmente, foi realizada a análise da expressão do mRNA referente ao gene do fator VII e das enzimas γ-carboxilase, VK0RC1 e Calumenina.
[00111] Para analisar o perfil de expressão foram utilizadas somente as linhagens celulares humanas HepG2, HKB-11 e Sk-Hep em quatro condições distintas: 1) sem transdução e sem tratamento com vitamina K, 2) sem transdução e tratadas com 5 ng/mL de vitamina K, 3) transduzidas com vetor 1054-rFVII e sem tratamento com vitamina K e 4) transduzidas com vetor 1054-rFVII e tratadas com 5 μς/πΛ de vitamina K.
[00112] Após analise dos dados se pode observar que as três linhagens humanas apresentaram expressão do mRNA relativo ao recombinante FVII, após a transdução com vetor lentiviral. Quando submetidas ao tratamento com vitamina K por um período de 10 passagens em cultura, as células mostraram uma expressão semelhante (HepG2: 164563 URE, HKB-11: 119122 URE e Sk-Hep: 124919 URE) mostrando uma estabilização nos níveis de expressão da proteína recombinante (Figura 10).
[00113] É possível observar que a linhagem celular HepG2 não transduzida, por ser derivada de um hepatocarcinoma, expressa níveis de mRNA de FVII endógenos (como mostrado anteriormente) e que a expressão desse FVII endógeno é aumentada em 480 vezes quando as células são tratadas com vitamina K.
[00114] Quando se analisou a expressão das enzimas relacionadas a γ-carboxilação, foi possível observar que houve uma diferença nos níveis de expressão das enzimas γ-carboxilase, VKORC1 e o inibidor Calumenina (Figura 11).
[00115] Como observado na Figura 11, quando as células foram tratadas com 5 ug/ml de vitamina K, ocorreu um aumento no nível de expressão de enzimas. Quando se compara as células não transduzidas tratadas e não tratadas, pode-se observar que nas células HKB-11 a expressão do mRNA do gene VK0RC1 aumentou 4 3 vezes (de 64 para 2788 URE); a expressão de γ-carboxilase aumentou 351 vezes (de 20 para 7030 URE) e o nível de expressão do mRNA da calumenina aumentou 409 vezes (de 41 para 16783 URE) . Nas células SK-Hep-1 a expressão do mRNA do gene VKORC1 aumentou 91 vezes (de 10 para 914 URE) , da γ-carboxilase aumentou 416 vezes (de 12 para 4989 REU) e do gene inibitório calumenina aumentou 397 vezes (de 30 para 11922 URE). Nas células HepG2 a expressão do mRNA do gene VKORC1 aumentou 98 vezes (de 104 para 10172 URE); a expressão de γ-carboxilase aumentou 220 vezes (de 72 para 15880 URE) e o nível de expressão do mRNA da calumenina aumentou 211 vezes (de 55 para 11612 URE).
[00116] O mesmo padrão de expressão pode ser observado nas linhagens celulares modificadas com FVII antes e após o tratamento com vitamina K. Na linhagem celular HKB-ll-FVII a expressão do mRNA de VKORC1 aumentou 7 vezes (de 418 para 2883 URE), a expressão do mRNA de γ-carboxilase aumentou 150 vezes (de 59 para 8869 URE) e o nível de expressão do mRNA do gene calumenina aumentou 54 vezes (de 318 para 17244 URE). Nas células Sk-Hep-l-FVII a expressão do mRNA de γ-carboxilase aumentou 108 vezes (de 41 para 4416 REU) e nível de expressão de mRNA da calumenina aumentou 54 vezes (de 267 para 14331 REU) . Nas células HepG2-FVII observamos um aumento de 4 vezes na expressão de VKORC1 (de 2045 para 8491 URE), a expressão do mRNA de γ-carboxilase aumentou 58 vezes (de 197 para 11443 URE) e o nível de expressão do mRNA do gene calumenina aumentou 12 vezes (de 1317 para 15621 URE) .
Cinética de crescimento das linhagens celulares [00117] Com o objetivo de avaliar o perfil de crescimento das linhagens celulares Sk-Hep, HBK-11 e BHK-21 produtoras de fator VII recombinante, foram realizados experimentos por um período de 7 dias, em duplicata.
[00118] A Figura 12 nos permite observar que a célula Sk-Hep apresentou uma alta viabilidade, em torno de 95%, durante todo o período analisado. A máxima concentração celular foi de 0,48 x 106 cél/mL alcançada no sexto dia de experimento. A fase exponencial do crescimento ocorreu entre os dias 1 e 6 e a velocidade máxima específica de crescimento (px,máx) foi de 0,72 dia~J, como mostrado na figura 14. Pode-se observar que após este período ainda há crescimento celular, no entanto, com uma velocidade menor.
[00119] Com a analise da Figura 13 que mostra os dados relativos a linhagem celular HKB-11, foi possível observar que estas células apresentaram uma viabilidade, em torno de 90%, durante os quatro primeiros dias de experimentos, seguido de cerca de 80% nos três últimos dias. A máxima concentração celular foi de 0,82 x 106 cél/mL alcançada no sétimo dia de experimento. A fase exponencial do crescimento ocorreu entre os dias 0 e 4 e a velocidade máxima específica de crescimento (px,máx) foi de 0,80 dia'1.
[00120] Em seguida foram analisados os dados da célula BHK-21 (Figura 14).
[00121] A linhagem murina BHK-21 (Figura 14) apresentou uma viabilidade em torno de 92% no primeiro dia, a qual foi declinando ao longo do experimento, levando à morte das células no sexto dia. A máxima concentração celular foi de 0,67 x 106 cél/mL alcançada no quarto dia de experimento. A fase exponencial de crescimento ocorreu entre os dias 0 e 4 e a velocidade máxima especifica de crescimento (px,máx) foi de 1,0 dia'1. Após esse período, as células entraram em processo de morte celular.
Cinética de Produção do rFVII nas linhagens celulares [00122] Além da curva de crescimento, também foram realizados ensaios em placa de 100 mm2 com as mesmas linhagens celulares com o objetivo de avaliar a produção do fator VII recombinante. Com esse intuito, a concentração inicial de células foi maior do que a utilizada nos experimentos de cinética de crescimento.
[00123] A figura 15 mostra um gráfico da concentração de FVII (ng/mL) pelo tempo, das três linhagens celulares humanas e da linhagem murina BHK-21.
[00124] Ao analisar-se a quantidade de rFVII após o período de experimento, foi possível observar que as células HepG2 foram as que apresentaram maior produção de proteína recombinante sendo que em 24h já havia uma produção de 1227 ng/mL, chegando a 1843 ng/mL, após 96h de cultivo. Como as células foram cultivadas em 8 mL de meio, foi possível a produção de um total de 14,7 ^ig de rFVII, o que corresponde a 29,5 UI.
[00125] As células Sk-Hep apresentaram uma produção de 415 ng/mL em 24h, chegando a um total de 1432 ng/mL após 4 dias. A linhagem HKB-11 mostrou um perfil semelhante de produção quando comparada com a Sk-Hep, sendo que no primeiro dia havia uma quantidade de 435 ng/mL de rFVII e ao final das 96h foi possível quantificar cerca de 1468 ng/mL. Como havia 8 mL de meio de cultivo na placa, foi possível a produção de um total de 11,7 de rFVII, o que corresponde a 23,5 UI das células HKB-11 e 11,4 de rFVII, o que corresponde a 22,9 UI nas células Sk-Hep.
[00126] Já a linhagem celular murina BHK-21 foi a que apresentou menor produção de rFVII ao longo de todo experimento, sendo que em 24h havia 250 ng/mL e ao final das 96h apenas 449 ng/mL, totalizando em 8 mL uma produção de 3,6 pg de rFVII, o que corresponde a 7,2 UI.
Produção de rFVII nas linhagens celulares Sk-Hep e HKB-11 em frascos Spinner [00127] A análise dos resultados anteriores mostraram que as células HepG2 possuem um padrão de crescimento extremamente lento, o que impossibilitou seu uso na etapa subsequente do trabalho. Já a linhagem BHK-21, de origem murina, não é o foco da presente invenção, sendo utilizada apenas como controle. Dessa maneira, as duas linhagens celulares humanas produtoras de FVIIr, que foram utilizadas para os experimentos subsequentes de cultivo em suspensão são a Sk-Hep-l-FVIIr e a HKB-ll-FVIIr.
[00128] Os experimentos foram realizados por um período de 10 dias a fim de analisar o perfil de crescimento, bem como a produção de FVIIr nas linhagens celulares crescendo em suspensão utilizando microcarregadores em frascos spinner. Os experimentos foram realizados em duplicata e os resultados são apresentados como uma média de ambos.
[00129] Ao analisar os dados foi possível observar que a célula Sk-Hep-l-FVIIr atingiu a máxima concentração celular, no valor de 1,11 x 106 cel/mL, no décimo dia de experimento. A fase exponencial de crescimento ocorreu entre os dias 1 e 6 e a velocidade máxima específica de crescimento (μ mâx) foi de 0,35 dia*1.
[00130] Ao longo dos 10 dias de cultivo foi possível observar um consumo gradual de glicose, como era de se esperar, porém, não houve esgotamento devido às trocas de 50% do meio de cultura a cada 24h. Em relação à produção de lactato, observou-se que esta atingiu a concentração máxima no quinto dia de cultivo, com o valor médio de 1,25 g/L (Figura 17).
[00131] Para ilustrar o cultivo em microcarregadores e a expressão do gene marcador GFP, foram feitas imagens com microscopia de contraste de fases e de fluorescência, como mostrado na Figura 18.
[00132] A fim de quantificar a produção de FVIIr pela célula Sk-Hep-l-FVIIr foi realizado um ensaio de ELISA. Como mostrado na figura 19, a produção teve seu pico máximo alcançado no oitavo dia de experimento, chegando a uma concentração média de 1615 ng/mL (DP 74,47) de FVIIr. Ao final de 10 dias, obtivemos uma produção média de 4052 ng/mL de proteína recombinante em um volume de 50 mL, totalizando uma produção de 202, 6 pg de FVIIr, o que corresponde a aproximadamente 405 UI. A produtividade (Cmáx/t) na célula Sk-Hep-l-FVIIr foi de 201,8 ng/mL/dia.
[00133] A cinética de produção da proteína recombinante também foi medida em termos da quantidade de FVIIr biologicamente ativo que as células estavam produzindo. Para as células Sk-Hep-1, a cinética de produção é mostrada na figura 20. A figura 20 mostra que houve um pico de produção de FVIIr biologicamente ativo no oitavo dia de cultivo, da ordem de 4UI/mL.
[00134] Ao analisar as células HKB-ll-FVIIr, estas atingiram a máxima concentração celular, no valor de 1,61 x 10' cel/mL, no nono dia de experimento. A fase exponencial de crescimento ocorreu entre os dias 1 e 7 e a velocidade máxima especifica de crescimento (μ máx) foi de 0,36 dia'1 [00135] Assim como nas células Sk-Hep-1, ao longo dos 10 dias de cultivo foi possível observar um consumo gradual de glicose, como era de se esperar, porém, não houve esgotamento devido às trocas de 50% do meio de cultura a cada 24h. Em relação à produção de lactato, observou-se que esta atingiu a concentração máxima no nono dia de cultivo, com o valor médio de 0,47 g/L (Figura 21).
[00136] Novamente, com o objetivo de ilustrar o cultivo em microcarregadores e a expressão do gene marcador GFP foram feitas imagens com microscopia de contraste de fases e de fluorescência da célula HKB-ll-FVIIr, como mostrado na Figura 22.
[00137] O ensaio de ELISA também foi realizado para a linhagem HKB-11. Como mostrado na figura 23, a produção teve seu pico máximo alcançado no oitavo dia de experimento, chegando a uma concentração média de 1020 ng/mL (DP 9,8) de FVIIr. Ao final de 10 dias, obteve-se uma concentração média de 3038 ng/mL de FVIIr em 50 mL de meio de cultivo, totalizando uma produção de 152 μg de FVIIr, o que corresponde a aproximadamente 304 UI. A produtividade (Cmáx/t) na célula HKB-ll-FVIIr foi de 127,5 ng/mL/dia.
[00138] A cinética de produção da proteína recombinante também foi medida em termos da quantidade de FVIIr biologicamente ativo que as células estavam produzindo. Para as células HKB-ll-FVIIr, a cinética de produção é mostrada na figura 24. A figura 24 mostra que houve um pico de produção de FVIIr biologicamente ativo no sexto dia de cultivo, da ordem de 0,6 UI/mL.
Adaptação da linhagem celular HKB-11 produtora de fator VII ao crescimento em suspensão em meio livre de soro fetal bovino [00139] Por apresentar maior produtividade, a célula HKB-ll/rFVII foi selecionada para a adaptação ao crescimento em suspensão em meio livre de soro (Free Style), e posterior cultivo em biorreatores para produção de rFVII em larga escala.
[00140] Como mostra a Figura 25, a morfologia arredondada das células, a formação de aglomerados celulares, juntamente com a viabilidade superior a 85%, é indicativa de que as células estão num processo de adaptação ao crescimento em suspensão.
[00141] Esses resultados mostram que essa linhagem celular é uma excelente candidata a produção do rFVII em biorreatores com meio livre de soro fetal bovino em escala industrial, pois esta apresenta uma produção maior do que a BHK utilizada comercialmente.
Reivindicações

Claims (10)

1. Processo de produção do fator VII de coagulação sanguínea, CARACTERIZADO por compreender as etapas de: 1) Obtenção de partículas de vírus contendo FVII e a proteína GFP como gene repórter; 2) Transdução das linhagens celulares humanas, preferencialmente, SK-Hep 1, HKB11, e HepG2 com partículas virais para formar células produtoras de FVII; 3) Cultura das células humanas produtoras de FVII em suspensão usando microcarregadores.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por a etapa 1) ser realizada a partir da transfecção da linhagem celular Hek293T.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO por a transfecção utilizar um vetor lentiviral contendo o transgene e dois vetores auxiliares.
4. Processo, de acordo com as reivindicações 2 e 3, CARACTERIZADO por a transfecção utilizar o reagente polietilamina e os três plasmídeos serem transfectados na seguinte proporção: 10-25 ug, preferencialmente 20 μg vetor com o transgene - pl054-rFVII; 10-15 ug, prefercncialmente 13 μg pCMVAR8.91; 5-10 ug preferencialmente 7 pg pMD2 VSVG.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO por na etapa 1) o fator VII e o GFP não serem fusionados, sendo separados por um elemento IRES.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por na etapa 2) o sobrenadante produzido pelas células Hek293T transfectadas serem colocados sobre as culturas das linhagens celulares, na presença de polibreno 3-6 ug/mL, preferencialmente 5,5 pg/mL.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADQ por 24h antes da transdução, as células serem plaqueadas na concentração de 2xl05 células por poço, na placa de 6 poços e ser adicionada uma concentração viral de 10 virus/célula, baseado nos valores de titulação viral.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADQ por na etapa 3) as células serem cultivadas em frascos de cultura de 75 cm" para expansão, mantidas em incubadora a 37°C e 5% de CO2 até a confluência de 80%, sendo desaderidas com Tripsina-EDTA e inoculadas em frascos T de 75 cm2; após atingir o número 5xl06 células, serem inoculadas em frasco spinner já contendo meio de cultura e microcarregador.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADQ por o microcarregador ser o Cytodex 3 na concentração de 3,0 g/L.
10. Fator VII de coagulaçâo sanguínea, CARACTERIZADO por ser produzido conforme processo descrito nas reivindicações 1 a 9.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR102015012334A2 (pt) * 2015-05-27 2016-11-29 Fundação Hemoct De Ribeirão Preto Fundherp processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea e fator vii de coagulação sanguínea

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
EP0561034B1 (en) * 1991-08-26 1999-06-09 IMMUNO Aktiengesellschaft Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
WO2000028065A1 (en) 1998-11-06 2000-05-18 Novo Nordisk A/S Method for the production of fvii
AU2001249389A1 (en) * 2000-03-22 2001-10-03 The Children's Hospital Of Philadelphia Modified blood clotting factors and methods of use
MXPA02009221A (es) 2000-03-22 2005-07-25 Octagene Gmbh Produccion de factores de coagulacion sanguineo recombinantes en lineas celular humanas.
KR100880624B1 (ko) 2000-10-02 2009-01-30 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 비타민 ｋ-의존 단백질의 생산 방법
US20040185535A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Giles Wilson Industrial-scale serum-free production of recombinant FVII in mammalian cells
US20040185534A1 (en) 2000-10-02 2004-09-23 Knudsen Ida Molgaard Industrial-scale serum-free production of recombinant proteins in mammalian cells
DE602004025157D1 (de) * 2003-09-23 2010-03-04 Univ North Carolina Zellen, die Vitamin-K-Reduktase und Vitamin-K-abhängiges Protein coexprimieren und deren Anwendung zur Verbesserung der Produktivität von diesem Vitamin-K-abhängigen Protein
WO2006067116A1 (en) 2004-12-21 2006-06-29 Novo Nordisk Health Care Ag Expression of gamma-carboxylated polypeptides in gamma-carboxylation deficient host systems
EP1707634A1 (en) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
EP1904528B1 (en) * 2005-07-13 2012-10-31 Novo Nordisk Health Care AG Host cell protein knock-out cells for production of therapeutic proteins
ATE486128T1 (de) 2005-12-02 2010-11-15 Univ Wake Forest Health Sciences Zusammensetzungen und verfahren zur erhöhung der produktion rekombinanter gamma-carboxylierter proteine
CN101952440B (zh) * 2008-02-14 2012-11-14 财团法人牧岩生命工学研究所 适于表达用于基因治疗的编码序列的表达载体
BRPI0802690A2 (pt) * 2008-05-30 2010-03-02 Fundacao Hemoct De Ribeirao Pr proteÍna recombinante do fator ix de coagulaÇço sanguÍnea humana, composiÇço, uso de uma proteÍna recombinante do fator ix, uso de uma composiÇço, mÉtodo de obtenÇço de proteÍna recombinante do fator ix de coagulaÇço sanguÍnea humana e uso da mesma
BRPI0805767A2 (pt) 2008-09-18 2010-08-24 Fund Hemocentro De Ribeirao Preto proteÍna recombinante do fator viii de coagulaÇço sanguÍnea humana, composiÇço, uso de uma proteÍna recombinante do fator viii, uso de uma composiÇço, mÉtodo de obtenÇço de uma proteÍna recombinante do fator viii de coagulaÇço sanguÍnea humana e uso da mesma
BRPI1105317A2 (pt) 2011-01-24 2013-04-30 Fundacco Hemoct De Ribeirco Preto produÇço estÁvel e em larga escala de fviii humano em linhagem celular humana sk-hep-1
CA2868391A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Stephane Bancel Polynucleotides comprising n1-methyl-pseudouridine and methods for preparing the same
GB2526339A (en) * 2014-05-21 2015-11-25 Imp Innovations Ltd Lentiviral vectors
BR102015012334A2 (pt) * 2015-05-27 2016-11-29 Fundação Hemoct De Ribeirão Preto Fundherp processo de produção do fator vii de coagulação sanguínea e fator vii de coagulação sanguínea

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