ES2585246T3

ES2585246T3 - Fibrinógeno recombinante

Info

Publication number: ES2585246T3
Application number: ES09793957.3T
Authority: ES
Inventors: Abraham Bout; Joseph Grimbergen; Jacob Koopman
Original assignee: Profibrix BV
Current assignee: Profibrix BV
Priority date: 2008-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2016-10-04
Anticipated expiration: 2029-07-09
Also published as: MX2011000281A; KR20110040895A; CA2730030A1; BRPI0915574A2; WO2010004004A1; EP2310411A1; CA2730030C; US10562956B2; IL210495A0; CN102089322A; EP3078673A2; HK1151184A1; EP3078673A3; EP2310411B2; IL210495A; CN102089322B; JP5819725B2; JP2011527190A; EP2310411B1; AU2009268052A1

Abstract

Una secuencia de nucleótidos que está optimizada para su expresión en un sistema de cultivo de células de mamíferos, preferiblemente para la expresión en una célula COS, una célula BHK, una célula NS0, una célula CHO, Sp2/0 o un sistema de cultivo celular humano, más preferiblemente para su expresión en células PER.C6 o un sistema de cultivo celular HEK293, que comprende (i) una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO. 4 o 7, o una parte de la misma que comprende los nucleótidos 60 a 1932 de SEQ ID NO. 4, nucleótidos 60 a 1887 de SEQ ID NO. 4 o nucleótidos 60-2598 de SEQ ID NO. 7, o una secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO. 4 o 7 y que codifica una cadena alfa de fibrinógeno, o (ii) una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO. 5, o la parte de la misma que comprende los nucleótidos 93 a 1473 de SEQ ID NO. 5, o una secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO. 5 y que codifica una cadena beta del fibrinógeno o (iii) una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO. 6 o 12, o una parte de la misma que comprende los nucleótidos 81 a 1311 de SEQ ID NO. 6 o nucleótidos 81 a 1359 de SEQ ID NO. 12, o una secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO. 6 o 12 y que codifica una cadena gamma del fibrinógeno.

Description

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DESCRIPCIÓN

Fibrinógeno recombinante

Campo técnico

La presente invención se refiere al fibrinógeno recombinante, a los métodos para producirlo a altos niveles en células de mamíferos y a sus aplicaciones.

Antecedentes de la invención

El fibrinógeno es una glicoproteina soluble del plasma que se sintetiza en el cuerpo humano principalmente por las células del parénquima del hígado. Es una molécula dímera, que consta de dos pares de tres cadenas polipeptídicas denominadas Aα, Bβ y γ, que están unidas por puentes disulfuro. Las tres cadenas polipeptídicas están codificadas por tres genes separados. La cadena de tipo nativo Aα se sintetiza como un precursor de 625 aminoácidos y está presente en el plasma como una proteina de 610 aminoácidos, la Bβ contiene 461 y la cadena γ 411 aminoácidos. Los tres polipéptidos se sintetizan individualmente a partir de 3 mRNAs. El conjunto de las tres cadenas componentes (Aα, Bβ y γ) en su forma final como un dímero de seis cadenas (Aα, Bβ, γ)2 se produce en el lumen del retículo endoplásmico (ER).

El fibrinógeno circula en sangre a elevadas concentraciones (1-2 g/L) y manifiesta un alto grado de heterogeneidad. Se originan variantes debido a polimorfismos genéticos, diferencias en glicosilación y fosforilaciones, proteolisis (parcial) de la parte carboxi-terminal de la cadena Aα y empalmes alternativos (para revisiones véase De Maat y Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377; Laurens y colaboradores (2006) J. Thromb Haemost. 4, 932; Henschen-Edman (2001) Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 936, 580). Se estima que en cada individuo circulan alrededor de un millón de diferentes moléculas de fibrinógeno. La mayoría de estas variantes, que representan sólo una pequeña porción del fibrinógeno total (en la mayoría de los casos no más de un pequeño porcentaje), difieren en función y estructura. La proteolisis de la parte carboxi-terminal de la cadena Aα da lugar a las tres principales formas circulantes del fibrinógeno que tienen claramente diferentes pesos moleculares. El fibrinógeno es sintetizado en la forma de alto peso molecular (HMW; peso molecular 340 kDa); la forma predominante de las cadenas Aα en la circulación contiene 610 aminoácidos). La degradación de una de las cadenas Aα da formas de bajo peso molecular (LMW; MW= 305 kDa); la forma LMW’ (270 kDa) es la variante donde ambas cadenas Aα están parcialmente degradadas en el extremo carboxi. En sangre normal, 50 – 70% del fibrinógeno es HMW, 20 – 50% es fibrinógeno con una o dos cadenas Aα degradadas (de Maat y Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377). Las variantes HMW y LMW’ muestran claras diferencias en el tiempo de coagulación y en la estructura del polímero de fibrina (Hasegawa N, Sasaki S. (1990) Thromb. Res. 57, 183).

Variantes bien conocidas que son el resultado de empalmes alternativos son la variante llamada γ’ y la variante Fib420.

La variante γ’ representa aproximadamente el 8% del total de las cadenas γ. Consta de 427 aminoácidos en lugar de los 411 de la cadena γ más abundante; los cuatro aminoácidos C-terminales (AGDV) son remplazados por 20 aminoácidos que contienen 2 tirosinas sulfatadas. La cadena de fibrinógeno γ’ no es capaz de unirse al receptor de fibrinógeno de plaquetas llbβ3, que es crítico en la regulación de la agregación plaquetaria.

La variante Fib420, que tiene un peso molecular de 420 kDa, representa el 1-3% del fibrinógeno total circulante (de Maat y Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12, 377). Mediante empalmes alternativos, un marco de lectura abierto adicional es incluido en el extremo C de la cadena Aα, alargándolo así con 237 aminoácidos. Los aminoácidos adicionales forman una estructura nodular.

El fibrinógeno de origen plasmático es un importante componente de los selladores de fibrina comercializados que son aplicados clínicamente durante intervenciones quirúrgicas para detener el sangrado y disminuir la pérdida de sangre y fluidos. Además se usa para facilitar la adherencia del tejido usando la propiedad de aglutinación de la fibrina y mejorar la cicatrización de las heridas. El fibrinógeno es también utilizado clínicamente para suplir la deficiencia de fibrinógeno en pacientes con fibrinogenemia hereditaria y en pacientes con una deficiencia de fibrinógeno adquirida. La administración intravenosa de altas dosis de fibrinógeno (3 – 10 gramos) ha demostrado normalizar la coagulación de la sangre y detener o evitar graves hemorragias en diferentes situaciones clínicas.

La producción de fibrinógeno humano recombinante, ya sea en el formato de tipo nativo (HMW) o como una variante (por ejemplo como Fib420), tiene muchas ventajas sobre el uso de materiales de origen plasmático. Estos incluyen su perfil de seguridad preferido, la posibilidad de hacer variantes en una forma pura y suministros ilimitados.

La solicitud de patente US 6,037,457 expone la producción de fibrinógeno recombinante en células adherentes usando un combinado de inhibidores de proteasa. Los niveles de expresión están alrededor de 1 – 15 µg/ml.

Sin embargo, para producirlo de una manera económicamente viable, se necesitan altos niveles de expresión de fibrinógeno intacto, funcional. Además, para aplicaciones específicas (por ejemplo uso de fibrinógeno como pinza

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hemostática intravenosa (IV)) se requieren modificaciones post-traduccionales apropiadas (por ejemplo glicosilación).

En la solicitud de patente US 2003/221223 se producen proteínas transgénicas en plantas, incluyendo fibrinógeno. El fibrinógeno producido comprende grupos glicosilo vegetales.

Debido a las modificaciones post-traduccionales, se prefiere la expresión en sistemas de mamíferos. Por consiguiente, el fibrinógeno recombinante biológicamente activo ha sido expresado en varias células, tales como riñón de cría de hámster (BHK) (por ejemplo Farrel y colaboradores (1991) Biochemistry 30, 9414), células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo Lord, (US6037457), Binnie y colaboradores (1993) Biochemistry 32, 107), células COS derivadas del mono verde africano (por ejemplo Roy y colaboradores (1991) J. Biol. Chem. 266, 4758). Sin embargo, los niveles de expresión son solo alrededor de 1 – 25 µg/ml y se consideran inadecuados para reponer las grandes cantidades de fibrinógeno en plasma en la práctica clínica. Además, la expresión del fibrinógeno humano en levadura P. pastoris produjo 8 µg/ml, que no es tampoco adecuado para la producción comercial (Tojo y colaboradores (2008) Prot. Expr. and Purif. 59, 289).

El documento de patente WO2006/122822 describe la expresión de anticuerpos usando vectores de expresión de genes dobles que comprenden genes gen-optimizados. Los niveles de producción de anticuerpos aumentan de este modo de 37,8 microgramos/ml a 51,3 microgramo/ml.

En la solicitud de patente EP 1 661 989 se informa que son necesarios rendimientos de al menos 100 mg/ml para una producción comercial viable. La doctrina de la solicitud de patente EP 1 661 989 es que se alcanzan niveles tan altos usando vectores de expresión mixtos de genes para expresión combinada de cadenas alfa y gamma o cadenas beta y gamma, que conduce a un exceso de expresión de la cadena gamma. En esta solicitud, se presentan niveles de hasta 631,5 mg/ml para células CHO en un matraz con agitación. Sin embargo, para alcanzar tales niveles, las células tienen que co-expresar la proteína anti-apoptosis del baculovirus P35, y tiene que usarse metotrexato, un anti-metabolito, para la amplificación de los vectores. Las densidades celulares son relativamente bajas (máximo en un matraz con agitación 9,4 x 105 células/ml en 15 días) si se compara con lo que es estándar en la industria por ejemplo Wurm (Nature Biotechnol. (2004) 22, 1393) informa de densidades celulares de rutina de 2 x 106 células/ml en 3-4 días de subcultivación).

La cuestión más importante para la producción exitosa de fibrinógeno recombinante es cómo hacer un producto lo suficientemente intacto, correctamente ensamblado, biológicamente activo con alta pureza.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está definida en su sentido más amplio por las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena de fibrinógeno alfa, beta o gamma que es optimizada para su expresión en un sistema de cultivo de células eucarióticas. Una secuencia de nucleótidos optimizada de acuerdo con la invención permite la expresión eficaz de fibrinógeno recombinante en forma intacta en un sistema de cultivo de células eucarióticas. La secuencia de la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos optimizada es idéntica a la secuencia de la proteína codificada por la correspondiente secuencia de nucleótidos no optimizada.

En el contexto de la presente invención, el término “fibrinógeno” puede referirse a cualquiera de las formas del fibrinógeno e incluye variantes que se han originado a partir de polimorfismos genéticos, diferencias en glicosilación y fosforilación, proteolisis (parcial) de la parte carboxi-terminal de la cadena Aα y empalmes alternativos. En el contexto de la presente invención, los términos ‘cadena alfa’ y ‘cadena Aα’ se usan indistintamente. Ellos pueden referirse tanto al tipo nativo como a variantes de la cadena alfa, incluyendo una cadena alfa del fibrinógeno de 644 aminoácidos que contiene una secuencia señal (SEQ ID NO.8), un precursor de la cadena alfa del fibrinógeno de 625 aminoácidos sin secuencia señal (aminoácidos 20 a 644 de SEQ ID NO. 8), una cadena alfa truncada de fibrinógeno de 610 aminoácidos (aminoácidos 20 a 629 de SEQ ID NO. 8) como se encuentra en circulación y la variante Fib420 de la cadena alfa de 866 aminoácidos que contiene una secuencia señal (SEQ ID NO.11) o sin secuencia señal (aminoácidos 20-866 de SEQ ID NO. 11).

En el contexto de la presente invención, los términos ‘cadena beta’ y ‘cadena Bβ’ son utilizados indistintamente. Ellos se refieren tanto al tipo nativo como a variantes de la cadena beta, que incluyen una cadena beta de fibrinógeno de 491 aminoácidos que contiene una secuencia señal (SEQ ID No. 9) y una cadena beta de fibrinógeno de 461 aminoácidos sin secuencia señal (aminoácidos 31 a 491 de SEQ ID NO. 9).

En el contexto de la presente invención, el término ‘cadena gamma’ y ‘cadena γ’ se utilizan indistintamente. Ellos se refieren tanto al tipo nativo como a variantes de la cadena gamma, que incluyen una cadena gamma de fibrinógeno de 437 aminoácidos que contiene una secuencia señal (SEQ ID No. 10), una cadena gamma del fibrinógeno de 411 aminoácidos sin secuencia señal (aminoácidos 27 a 437 de SEQ ID NO. 10), una cadena gamma del fibrinógeno de 453 aminoácidos, que es la cadena gamma principal con secuencia señal (SEQ ID No. 13) y una cadena gamma del

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fibrinógeno de 427 aminoácidos, que es la cadena gamma principal sin secuencia señal (aminoácidos 27 a 453 de SEQ ID NO. 13).

En el contexto de la presente invención, fibrinógeno o una cadena de fibrinógeno está ‘en forma intacta’ cuando la secuencia de aminoácidos contiene todos los aminoácidos que estaban codificados por la secuencia de nucleótidos, opcionalmente sin los aminoácidos que son separados durante el procesamiento (secreción) normal de las células. Por lo tanto, las cadenas alfa que tienen 644, 625 o 610 aminoácidos son ejemplos de una cadena alfa en forma intacta.

La secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención tiene un contenido GC de al menos 55%, preferiblemente de al menos 58%, más preferiblemente de al menos 60 o 65%. En una realización, las secuencias optimizadas de nucleótidos de acuerdo con la invención tienen un contenido GC en el intervalo de 55 a 70%. En otra realización, las secuencias optimizadas de nucleótidos de acuerdo con la invención tienen un contenido GC en el intervalo de 60 a 65%.

Las secuencias optimizadas de nucleótidos de la invención que codifican una cadena de fibrinógeno alfa, beta y gamma son optimizadas para su expresión en un sistema de cultivo de células de mamífero, como para su expresión en un sistema de cultivo de una célula COS, célula BHK, célula NS0, célula Sp2/0, célula CHO, célula PER.C6 o célula HEK293. Más preferiblemente, las secuencias de nucleótidos son optimizadas para su expresión en un sistema de cultivo de células humanas, tal como un sistema de cultivo para una célula PER.C6 o una célula HEK293.

La optimización de acuerdo con la invención tiene un índice de adaptación de codones de al menos 0,90, preferiblemente de al menos 0,95, más preferiblemente de al menos 0,97. En una realización, una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención se optimiza por adaptación del uso de codones a células CHO con un índice de adaptación de codones de al menos 0,95.

Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención codifican cadenas de fibrinógeno de mamíferos, más preferiblemente codifican cadenas de fibrinógeno de primates, lo más preferible codifican cadenas de fibrinógeno humano. También son posibles combinaciones, tal como por ejemplo una o dos cadenas de fibrinógeno de mamíferos combinadas con dos o una cadenas de fibrinógeno de roedor. La secuencia de nucleótidos que está optimizada puede ser DNA o RNA. Preferiblemente, es cDNA.

Una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención que codifica una cadena de fibrinógeno alfa, beta o gamma muestra al menos 70% de identidad con sus respectivos homólogos no optimizados. En una realización, una secuencia optimizada de nucleótidos de la invención que codifica una cadena de fibrinógeno alfa, beta y gamma muestra un 70-80% de identidad con sus respectivas secuencias no optimizadas. Preferiblemente, las secuencias optimizadas de nucleótidos de la invención que codifican una cadena de fibrinógeno alfa, beta o gamma no contienen sitios con actuación cis, tal como sitios de empalme y señales poli(A).

Una secuencia de nucleótidos optimizada de acuerdo con la invención que codifica una cadena de fibrinógeno alfa no contiene secuencias de repetición directa de 39 pares de bases que están normalmente presentes en el gen que codifica la cadena alfa del fibrinógeno humano. En una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención que codifica una cadena alfa, la secuencia de repetición es cambiada sin cambiar la secuencia de la proteína codificada.

Una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención codifica una cadena alfa que comprende una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 4 o 7. Las secuencias de nucleótidos que codifican una cadena alfa de fibrinógeno y que comprenden parte de estas secuencias son también abarcadas por la presente invención y están así definidas en las siguientes realizaciones. En una realización, una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención comprende los nucleótidos 60-1932 de SEQ ID NO.4. En otra realización, una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención comprende los nucleótidos 60-1887 de SEQ ID NO. 4. En otra realización, una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención comprende los nucleótidos 60-2598 de SEQ ID NO.7. También una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que es al menos 90%, más preferiblemente al menos 92%, al menos 94%, 96%, la más preferible al menos 98% o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO. 4 o 7 y que codifica una cadena alfa de fibrinógeno, por ejemplo una cadena alfa de fibrinógeno con una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 8 o 11 o parte de estas secuencias que comprenden los aminoácidos 20-644 de SEQ ID NO. 8, los aminoácidos 20-629 de SEQ ID NO. 8 o los aminoácidos 20-866 de SEQ ID NO.11, es abarcada por la presente invención.

Una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención que codifica una cadena beta comprende una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 5. Secuencias de nucleótidos que codifican una cadena beta de fibrinógeno y que comprenden la parte de esta secuencia que comprende los nucleótidos 93-1473 de SEQ ID NO. 5 son también abarcadas por la presente invención. También una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia al menos 90%, más preferiblemente al menos 92%, al menos 94%, 96%, lo más preferiblemente al menos 98% o al menos 99% idéntica al SEQ ID NO. 5 y que codifica una cadena beta de fibrinógeno, por ejemplo una cadena beta

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de fibrinógeno con una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 9 o parte de esta secuencia, tal como por ejemplo los aminoácidos 31 a 491 de SEQ ID NO.9, es abarcada por la presente invención.

Una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención que codifica una cadena gamma de fibrinógeno comprende una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 6. Las secuencias de nucleótidos que codifican una cadena gamma de fibrinógeno y que comprenden la parte de esta secuencia que comprende los nucleótidos 811311 de SEQ ID NO. 6 son también abarcadas por la presente invención. También una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que es al menos 90%, más preferiblemente al menos 92%, al menos 94%, 96%, lo más preferible al menos 98% o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO. 6 y que codifica una cadena gamma de fibrinógeno, por ejemplo una cadena gamma de fibrinógeno con una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 10 o parte de esta secuencia, tal como por ejemplo los aminoácidos 27 a 437 de SEQ ID NO. 10, es abarcada por la presente invención.

Una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención que codifica una cadena gamma de fibrinógeno comprende una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 12. Secuencias de nucleótidos que codifican una cadena gamma de fibrinógeno y que comprende la parte de esta secuencia que comprende los nucleótidos 81-1359 de SEQ ID NO. 12 son también abarcados por la presente invención. También una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que es al menos 90%, mas preferiblemente al menos 92%, al menos 94%, 96%, lo más preferible al menos 98% o al menos 99% idéntica al SEQ ID NO. 12 y que codifica una cadena gamma de fibrinógeno, por ejemplo una cadena gamma de fibrinógeno con una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 13 o parte de esta secuencia, tal como por ejemplo los aminoácidos 27 a 453 de SEQ ID NO. 13, es abarcado por la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una construcción de nucleótidos que comprende una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención que codifica una cadena de fibrinógeno alfa, beta o gamma. La construcción de nucleótidos puede comprender secuencias reguladoras que influyen en la expresión de las cadenas de fibrinógeno, incluyendo promotores, terminadores y potenciadores. En una realización, la construcción de nucleótidos es un vector, tal como por ejemplo un vector de clonación o un vector de expresión. La construcción de nucleótidos puede también comprender un marcador de selección.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a células mamíferas que comprenden una secuencia optimizada de nucleótidos de acuerdo con la invención que codifica una cadena de fibrinógeno alfa, beta o gamma. En la célula, los nucleótidos de acuerdo con la invención pueden estar presentes como tales o en una construcción, tal como en un vector de expresión o un vector de clonación. La célula es típicamente una célula huésped que se utiliza para la producción de fibrinógeno. La célula que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención es una célula de mamíferos. Ejemplos adecuados de células de mamíferos incluyen células de insectos, células COS, células BHK, células NS0, células Sp2/0, células CHO, células PER.C6 y células HEK293.

Las células de acuerdo con la invención producen elevadas cantidades de fibrinógeno intacto, biológicamente activo. La célula es típicamente parte de una línea celular. En el presente contexto, la frase ‘una célula o línea celular que produce elevadas cantidades de fibrinógeno intacto’ se refiere a una célula o línea celular que produce más de 90%, 95% o 99% de productos intactos. Preferiblemente, esto se mide a lo largo de un periodo de 10, 20 o 30, más preferiblemente a lo largo de 40 o 50, duplicaciones de la población. En el contexto de la presente invención, fibrinógeno ‘biológicamente activo’ se refiere a fibrinógeno que se polimeriza en fibrina en presencia de trombina. Tales células o líneas celulares son también abarcadas por la presente invención. En una realización preferida, una línea celular de acuerdo con la invención produce fibrinógeno recombinante intacto en niveles de al menos 3 picogramos por célula por día, más preferiblemente al menos 4 o 5 picogramos por célula por día, incluso más preferiblemente al menos 7 o 10 picogramos por célula por día. En un reactor con una densidad celular de 30 x 106 células/ml, 3 picogramos por célula por día corresponde a 90 mg de fibrinógeno por volumen de reactor de litro por día, 5 picogramos por célula por día corresponde a 150 mg de fibrinógeno por litro por día y 7 picogramos por célula por día corresponde a 210 mg de fibrinógeno por litro por día. Preferiblemente al menos 50% de la población celular, más preferiblemente al menos 60%, 70% o 80% de la población celular, lo más preferible al menos 90%, 95% o 99% de la población celular produce al menos 3 picogramos por célula por día, más preferiblemente al menos 5 picogramos por célula por día, incluso más preferiblemente al menos 7 picogramos por célula por día.

La selección de células o líneas celulares que producen elevadas cantidades de fibrinógeno intacto se lleva a cabo preferiblemente sin la expresión de inhibidores de proteasa. En una realización, la selección es realizada utilizando anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales que se unen al extremo N intacto de la cadena alfa y al extremo C intacto de la cadena alfa. Ejemplos adecuados comercialmente disponibles de tales anticuerpos incluyen el anticuerpo Y18 descrito por Koppert y colaboradores (1985) Blood 66, 503 y el anticuerpo G8 descrito por Hoegee-de Nobel y colaboradores (1988) Thromb. Haemost. 60(3) 415. Preferiblemente, esta selección es realizada en un ambiente libre de suero.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir fibrinógeno en un sistema de cultivo de células de mamíferos. El método comprende cultivar una célula o línea celular huésped de acuerdo con la invención bajo condiciones en las que el fibrinógeno es producido. Opcionalmente, el fibrinógeno producido es recuperado. Todas las tres cadenas del fibrinógeno son codificadas por las secuencias optimizadas de nucleótidos. En contraste

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con el fibrinógeno de origen plasmático, la preparación de fibrinógeno producido por este método será bastante homogénea porque se producen cadenas específicas de fibrinógeno. El método permite la producción de preparaciones de fibrinógeno que constan de más de 10%, 20%, 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, preferiblemente más de 95%, 98% o 99% de variantes, que están presentes en el plasma tan solo en pequeñas cantidades.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención para la preparación de fibrinógeno para varias aplicaciones médicas. En una aplicación, las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención son usadas para preparar fibrinógeno para uso en selladores de fibrina que son clínicamente aplicados durante intervenciones quirúrgicas para detener el sangrado y disminuir la pérdida de sangre y líquidos. En otra aplicación, las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención pueden ser utilizadas para preparar fibrinógeno para facilitar la adherencia del tejido mediante el uso de la propiedad de aglutinación de la fibrina y mejorar la cicatrización de la herida. En otra aplicación, las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención pueden ser usadas para preparar fibrinógeno que es usado clínicamente para el tratamiento de episodios de hemorragias agudas en pacientes con deficiencias de fibrinógeno congénitas o adquiridas (por ejemplo a través de la hemorragia después de un traumatismo o durante la cirugía) por administración intravenosa de fibrinógeno. Preparaciones de fibrinógeno de origen plasmático comercializadas son Riastap (CSL Behring LLC; comercializado en Estados Unidos) y Haemocomplettan (CSL Behring AG; comercializado en Europa). Las preparaciones de fibrinógeno recombinante tendrían varias ventajas sobre las preparaciones de origen plasmático, incluyendo un perfil preferido de seguridad, suministro ilimitado y la posibilidad de fabricación de la variante de fibrinógeno con el perfil de actividad preferido para esta indicación específica de una manera pura.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 Niveles de expresión de fibrinógeno recombinante humano a 1, 2, 3 y 6 días después de la transfección de células CHO con construcciones de tipo nativo y con condones optimizados que codifican las cadenas Aα, Bβ y γ. El experimento fue hecho por duplicado. (opt) secuencias optimizadas; (wt) secuencias tipo nativo.

Figura 2 Niveles de expresión de fibrinógeno recombinante humano a 1, 2, 3 y 6 días después de la transfección de células CHO con construcciones con codones optimizados que codifican las cadenas Aα, Bβ y γ y construcciones con codones optimizados (marcadas como Aα(opt) + Bβ(opt) + γ(opt)) con la cadena Aα-extendida, Bβ y γ (marcadas como Aα-ext.(opt) + Bβ(opt) + γ(opt)). El experimento fue hecho por duplicado.

Figura 3 Análisis de Western Blot del sobrenadante de cultivos de lotes de clones M21, M25 y M57, que expresan fibrinógeno recombinante humano. El carril de control (contr) contiene fibrinógeno tipo nativo de origen plasmático (FIB3, Enzime Research Laboratories). Las flechas indican los productos de ruptura de la cadena Aα.

Figura 4 Análisis de Western Blot del sobrenadante de cultivos de un lote del clon P40 que expresa la variante de fibrinógeno humano (Fib420), que tiene una cadena Aα extendida. El carril 1 es un control que contiene fibrinógeno tipo nativo de origen plasmático (FIB3, Enzyme Research Laboratories). Los carriles 2 y 3 contienen sobrenadante de cultivo del clon P40 Aα-extendida, tomado el día 4 y 7 de un lote, respectivamente.

Figura 5 Análisis Western Blot del sobrenadante de cultivo de células PER.C6 que fueron transfectadas transitoriamente con fibrinógeno humano que contiene γ’ (los detalles están descritos en el ejemplo 9). El carril 1 contiene sobrenadante de cultivo de células PER.C6 que expresan el fibrinógeno recombinante γ’. El carril 2 es un control, que contiene fibrinógeno tipo nativo de origen plasmático (FIB3, Enzyme Research Laboratories).

Figura 6 Análisis de fibrinógeno para N-glicosilación por tratamiento PNGase F seguido por análisis SDS-PAGE.

Los carriles son cargados como sigue:

MW: el marcador de peso molecular (Benchmark, Invitrogen)

ERLFIB3: fibrinógeno de origen plasmático ( ERL ), o tratado con PNGase F (+) o no tratado (-) con PNGase F.

PER.C6 fbg: fibrinógeno derivado PER.C6, o tratado con PNGase F (+) o no tratado (-) con PNGase F.

2µg de fibrinógeno fue cargado por carril; la tinción fue hecha usando azul de Coomassie. El análisis fue realizado usando gel BisTris reducido un 10% (NuPage, Invitrogen).

Figura 7 Análisis ROTEM: tiempo de coagulación.

El tiempo de coagulación fue determinado por el análisis ROTEM. 200µl de plasma normal mezclado (citrato) o 100 µl de plasma normal mezclado mixto 1:1con Haemocomplettan (CSL Behring GmbH, Marburg, Alemania) o fibrinógeno PER.C6 (ambos 2 mg/ml en TBS). CaCl2 fue añadido a una concentración final de 17 mM. Para empezar la coagulación α-trombina fue añadida a una concentración final de 1IU/ml. El volumen total de reacción fue 240 µl. La figura muestra el tiempo de coagulación (segundos) para el plasma mezclado 1:1 con fibrinógeno:

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1.: Fibrinógeno de origen plasmático (CSL Behring, Marburg, Alemania)

2.: Fibrinógeno derivado de PER.C6

Todas las medidas fueron hechas por duplicado.

Figura 8 Análisis ROTEM: firmeza del coágulo. La firmeza del coágulo fue determinada por el análisis ROTEM. La figura expresa el valor A10 (mm), que es la firmeza del coágulo a un tiempo de 10 minutos, para plasma mezclado 1:1 con fibrinógeno. Los detalles experimentales son los mismos que se describen en la leyenda de la figura 7.

1.: Fibrinógeno de origen plasmático (CSL Behring, Marburg, Alemania)

2.: Fibrinógeno derivado de PER.C6 Todas las medidas fueron hechas por duplicado.

Figura 9 Análisis ROTEM: tiempo de formación del coágulo. Sangre citrada de un individuo sano fue si o no diluida con lactato de Ringer (Baxter, Utrecht, Países Bajos). Después, la sangre diluida con lactato de Ringer fue si

o no repuesta (control) con fibrinógeno de origen plasmático o recombinante. La figura muestra lo siguiente:

1.: 300 µl de sangre

2.: 150 µl de sangre, 100 µl de lactato de Ringer (RL), 50 µl TBS

3.: 150 µl de sangre, 100 µl (RL), 50 µl Haemocomplettan 6,5 mg/ml (1,1 mg/ml concentración final)

4.: 150 µl de sangre, 100 µl (RL), 50 µl hFbg recombinante 6,5 mg/ml (1,1 mg/ml concentración final)

En todas las condiciones 20 µl del reactivo star-TEM y 20 µl del reactivo ex-TEM (Pentapharm GMBH, Munich, Alemania) fueron usados para comenzar la coagulación. Intervalo normal (35 – 160 segundos) son los valores encontrados para individuos sanos. Valores CFT de 160 – 220

segundos son encontrados en pacientes con hemostasia normalmente intacta pero con reserva reducida.

Figura 10 Análisis ROTEM: firmeza del coágulo. La sangre citrada de un individuo sano fue si o no diluida con lactato de Ringer (Baxter, Utrecht, Países Bajos). Después, la sangre diluida con el lactado de Ringer fue si o no repuesta (control) con fibrinógeno de origen

plasmático o recombinante. Las condiciones de medida fueron las siguientes:

1.: 300 µl de sangre

2.: 150 µl de sangre, 100 µl de lactato de Ringer (RL), 50 µl TBS

En todas las condiciones 20 µl del reactivo star-TEM y 20 µl del reactivo ex-TEM (Pentapharm GMBH, Munich, Alemania) fueron usados para comenzar la coagulación.

Intervalos normales (53 – 72 mm) son valores encontrados para pacientes sanos sin trastornos de coagulación. Valores MCF de 45 – 40 mm encontrados en pacientes indican un riesgo de hemorragia.

Ejemplos

Ejemplo 1 Preparación de construcciones optimizadas de cDNA.

Los cDNAs que codifican las cadenas polipeptídicas Aα, Bβ, γ, Aα-extendida (Fib420) y γ’ del fibrinógeno humano fueron sintetizados tanto en tipo nativo (en este ejemplo se refiere al formato no optimizado) y en formato con codones optimizados por GeneArt (Regensburg, Alemania): (i) los sitios de actuación en cis (sitios de empalme, señales poli(A)) fueron eliminados; (ii) la secuencia repetitiva de la cadena Aα fue modificada; (iii) el contenido GC fue incrementado para prolongar la vida media del mRNA; (iv) El uso de codones fue adaptado a CHO (índice de adaptación de codones – CAI-> 0,95). La referencia del tipo nativo utilizado fue NM_021871 para la cadena alfa, NM_005141 para la cadena beta y NM_000509 para la cadena gamma.

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Se compraron los cDNAs que codifican la cadena Aα (SEQ ID NO. 1), Bβ (SEQ ID NO. 2) y γ (SEQ ID NO. 3) en formato tipo nativo y cDNAs para Aα optimizada (SEQ ID NO. 4), Bβ (SEQ ID NO. 5) y γ (SEQ ID NO. 6) y los resultados se muestran en la Tabla 1. Las secuencias Aα-extendida (Fib420) (SEQ ID NO. 7) y secuencias γ’ optimizadas también se muestran en la Tabla 1.

cDNA de cadena alfa (SEQ ID no. 1), beta (SEQ ID NO.2) y gamma (SEQ ID NO. 3) de tipo nativo y cDNA de cadena alfa (SEQ ID no. 4), beta (SEQ ID NO. 5), y gamma (SEQ ID no. 6) optimizado, fueron subclonados en derivados pcDNA3.1. Ambas cadenas Aα –tipo nativo y optimizada-, y Aα-extendida (Fib420) en pcDNA3.1 (+) neo, ambas cadenas Bβ en pcDNA3.1 (+) higro y ambas cadenas γ en pcDNA3.1 (-) higro (Invitrogen, Carlsbad, USA). La cadena γ’ optimizada fue subclonada en pcDNA3.1 (+) higro.

Tabla 1

Cadena de fibrinógeno: Aciertos (%) Índice de adaptación de codones (CAI) Contenido GC (%)

tipo nativo/opt: Tipo nativo Optimizado Tipo Nativo Optimizado

Cadena Aα: 72 0,71 0,97 48 65

Cadena Bβ: 77 0,69 0,96 45 60

Cadena γ: 76 0,68 0,97 42 60

Cadena Aα Fib420: 72 0,71 0,98 48 63

Cadena γ’: 75 n. d. 0,97 42 60

Ejemplo 2 Expresión transitoria de las secuencias de fibrinógeno tipo nativo y de codones optimizados en células CHO.

Para verificar si las secuencias optimizadas mejoraban la expresión de proteínas, se hicieron transfecciones transitorias en células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células CHO-S fueron sembradas el día antes de la transfección a 0,6 x 106 células/ml en un medio de cultivo FreeStyle enriquecido con L-glutamina 8mM. En el día de la transfección, las células fueron diluidas a una concentración de 1 x 106 células/ml en 15 ml de medio en un matraz con agitación de 125 ml (Corning Life Sciences, Corning, USA). Se mezcló un total de 18,75 µg de plásmido de expresión (6,25 µg por cada cadena individual) con 0,3 ml OptiPro SFM. Después se añadieron 0,3 ml del reactivo de transfección FreeStyle MAX (16 x diluido en OptiPro SFM) y se mezcló suavemente. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, la mezcla DNA-FreeStyle MAX fue añadida suavemente a las células CHO-S, arremolinándose lentamente en el matraz con agitación. El experimento fue realizado por duplicado.

Las células transfectadas fueron incubadas a 37 ºC, 5% de CO2 en una plataforma de agitación orbitalica rotando a 125 rpm. En el día 1, 2, 3 y 6 después de la transfección se tomaron muestras para medir la expresión del fibrinógeno recombinante.

La expresión de proteínas se midió con un ELISA específico para fibrinógeno humano. Placas certificadas Maxisorb Elisa (Nunc, Thermofisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) fueron recubiertas durante una noche con 100 µl 10 µg/ml de anticuerpo monoclonal G8 (TNO KvL, Leiden, Países Bajos) generado contra el fibrinógeno humano (Hoegee-de Nobel y colaboradores (1988) Thromb. Haemost. 60(3) 415) en PBS (Invitrogen) a 4 ºC. Después las placas se lavaron con PBST (PBS/0,05% tabletas Tween20, Calbiochem, EMD, San Diego, USA) y se añadieron 100 µl de ya sea muestra de sobrenadante de cultivo o estándar de fibrinógeno. El fibrinógeno estándar contiene fibrinógeno (Fibrinógeno humano FIB3, Enzyme Research Laboratories (ERL), Swansea, UK) disuelto y diluido en PBST a las siguientes concentraciones: 100 – 75 – 50 – 25 – 12,5 – 6,25 – 3,125 – 0 ng/ml. Muestras del sobrenadante de cultivo de tejido fueron diluidas 1:10 – 1:500 en PBST. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente las placas fueron lavadas tres veces con 200 µl de PBST por pocillo y se dio un golpe seco en una servilleta de papel. Después se añadieron 100 µl de HRP conjugado con anticuerpo monoclonal Y18 (TNO KvL, Leiden, Países Bajos), diluido 1:10.000 en PBST. Este fue incubado durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por el lavado de las placas 4 veces con 200 µl de PBST por pocillo; después de cada etapa de lavado las placas fueron golpeadas en seco en una servilleta de papel. Después, 100 µl de TMB Ultra (Pierce, Thermofisher Scientific, Rockford, USA) fue añadido a cada pocillo, seguido por una incubación de 4-30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró por adición de 100 µl H2SO4 2M (Merk KGaA, Darmstadt, Alemania) a cada pocillo y el OD450 fue determinado usando un lector de placas ELISA.

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Los resultados se muestran en la Figura 1. Los datos muestran claramente que las secuencias optimizadas mejoran drásticamente la expresión del fibrinógeno en todos los tiempos en los que las muestras fueron analizadas. El incremento en el nivel de expresión para construcciones optimizadas oscila desde 7,9 – 10,5 veces.

Ejemplo 3 Expresión transitoria de Fibrinógeno 420 con codones optimizados en células de cultivo CHO libres de suero.

La transfección y el análisis fueron realizados como se describe en el Ejemplo 2. La secuencia de cDNA de cadena Aα extendida utilizada en este experimento es una secuencia Aα extendida optimizada (SEQ ID No. 7) y codifica un polipéptido secretado de 847 aminoácidos (SEQ ID No. 11).

Los resultados se muestran en la Figura 2 y muestran claramente que los niveles de expresión de una variante de fibrinógeno, en este caso la variante Fib420 con cadenas Aα extendidas, están en el mismo intervalo que los niveles mejorados para la variante de la cadena Aα tipo nativo optimizada.

Ejemplo 4 Generación de células CHO que expresan de forma estable el fibrinógeno humano a partir de cDNAs de fibrinógeno con codones optimizados bajo condiciones libres de suero.

Para la generación de las líneas celulares descritas en este informe se usaron plásmidos derivados de la secuencia optimizada pcDNA3.1, como se describe en el ejemplo 1. Brevemente, las células CHO-S (Invitrogen) fueron subcultivadas en un medio FreeStyle (Invitrogen) enriquecido con L-glutamina 8mM (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. De manera rutinaria, las células fueron cultivadas en un matraz con agitación de 125 ml que contenía 10% (v/v) de medio de cultivo (=12,5 ml). Los cultivos fueron colocados en un incubador humidificado a 37 ºC y 5% de CO2 en una plataforma de agitación horizontal a 125 rpm. Se realizaron transfecciones de células CHO-S de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la transfección los cultivos fueron incubados durante una noche en un incubador humidificado a 37 ºC y 5% de CO2 en una plataforma de agitación horizontal a 125 rpm.

Al día siguiente de la transfección, las células fueron contadas, y sembradas en placas de 96 pocillos (densidad de sembrado 200 células/pocillo) en un medio FreeStyle enriquecido con L glutamina 8 mM y agentes de selección Geneticina (Invitrogen) y Higromicina B (Invitrogen) (ambos a una concentración final de 500 µg/ml: a partir de aquí “medio de selección”). El volumen de cultivo en cada pocillo fue 100-200 µl. Las placas fueron colocadas en un incubador humidificado a 37 ºC y 5% de CO2 bajo condiciones estacionarias. El medio fue cambiado dos veces en una semana por 100 µl de medio de selección. Las placas fueron seleccionadas para el crecimiento celular al microscopio. Después de 10 días los clones resistentes se hicieron aparentes. Estos clones fueron transferidos a placas de 48 pocillos que contenían 500 µl de medio de selección.

Cuando los clones alcanzaron aproximadamente el 50% de confluencia se tomó una muestra del medio y se almacenó a -20 ºC hasta que el análisis ELISA para los niveles de expresión del fibrinógeno fue realizado (véase el ejemplo 2). Basado en los resultados de ELISA los clones positivos para el fibrinógeno fueron subcultivados en placas de 6 pocillos. Otra vez a una confluencia aproximada del 50% fue cogida una muestra del medio de cada clon y analizada para la expresión por ELISA. En base a los datos de ELISA, los clones de alta expresión seleccionados fueron transferidos a matraces T25 y 3 – 5 días después a matraces de T75 cm2. Después, las células fueron transferidas a cultivos agitados, donde fueron inoculados a una concentración de 0,2 x 106 células viables/ml en matraces con agitación de 125 ml que contenían 12,5 ml de medio de selección. Los matraces fueron colocados en un agitador horizontal ELMI a 125 rpm en un incubador humidificado a 37 ºC y 5% de CO2. Después de alcanzar la densidad celular de más de 0,5 x 106 células viables/ml, las células fueron subcultivadas en un nuevo matraz con agitación de 125 ml con medio fresco tres veces a la semana a una concentración de inoculación de 0,2 x 106 células viables/ml hasta que se establecieron características de crecimiento reproducibles (normalmente en 2 semanas). Los cultivos de los clones seleccionados se mantuvieron en el medio de selección.

Para el ensayo del lote, se iniciaron los cultivos agitados de los clones seleccionados en 12,5 ml de medio FreeStyle enriquecidos con L-glutamina 8mM en matraces con agitación de 125 mL. Los cultivos fueron inoculados a 0,2 x 106 células viables/ml. Los matraces fueron colocados en el agitador horizontal DOS-10-ELMI a 125 rpm a 37 ºC y 5% de CO2 en un incubador humidificado. Las muestras fueron recogidas en el día 1, 2, 3, 4, y 7 después de la siembra, y se determinó el recuento total de células y la viabilidad (por tinción con azul de Tripano). Las muestras fueron limpiadas de células por centrifugación 300 x g y los sobrenadantes fueron almacenados a -20 ºC hasta que las concentraciones de fibrinógeno pudieron ser determinadas.

Para la transferencia Western, las muestras que contenían fibrinógeno fueron mezcladas con 5 µl de muestra tampón 4x concentrada NuPAGE LDS (Invitrogen, Paisley, UK) y 2 µl de muestra de agente reductor 10x concentrada NuPAGE (Invitrogen). El volumen final fue ajustado a 20 µl con agua desionizada (Invitrogen/Gibco). Las muestras fueron calentadas durante 10 minutos a 70 ºC y cargadas en un gel NuPAGE Novex (10%; Bis-Tris Mini gel, Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gel fue corrido durante 1 hora a 200 Voltios. El tampón de transferencia fue preparado por la mezcla de 44 ml 25x de tampón de transferencia Novex Tris-glicina (Invitrogen), 836 ml de agua desmineralizada y 220 ml de metanol (Merck). La solución fue preenfriada durante un mínimo de 30 minutos a -20 ºC. Un trozo de membrana de PVDF (Pierce) es activado durante aproximadamente 15

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segundos en metanol. La membrana, 6 piezas de papel secante de gel y 2 almohadillas secantes fueron entonces incubadas en un tampón de transferencia durante unos pocos minutos. La membrana fue colocada en el gel en un cartucho de transferencia que se puso en una cámara de transferencia (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) sosteniendo una bolsa fría congelada a -20 ºC. La transferencia de la proteína se realizó a 100 Voltios a través del conjunto gel/membrana durante 1 hora.

Para visualizar las bandas de fibrinógeno en la membrana, la transferencia fue incubada en 50 ml de tampón de bloqueo (3% leche en polvo baja en grasa (Elk, Campina, Meppel, Países Bajos) en PBS) en una plataforma agitadora. Después, la transferencia fue lavada durante 10 minutos en 50 ml de tampón de lavado (0,05% de Tween20 en PBS) e incubada durante 1 hora con 10 ml de tampón de bloqueo que contiene una dilución 1/2000 del anticuerpo HRP monoclonal conjugado Y18/PO (Koppert y colaboradores (1985) 66, 503). Después la transferencia fue lavada 2x lavado corto (menos de 1 minuto), 1 x 15 min, y 3 x 5 min. en 50 ml de tampón de lavado, seguido por unos 10 minutos de incubación en 50 ml de PBS.

Las bandas fueron visualizadas con ECL (cat# 32209, Pierce). La imagen fue capturada usando un sistema de imagen ChemiDoc-It (UVP, California, US).

Múltiples ciclos de generación de clones estables fueron realizados. Solo los clones que produjeron más de 3 picogramos por célula por día (pcd) en lotes de cultivos de 7 días fueron recogidos. Algunos clones produjeron más de 5 pcd en lotes de cultivo de 7 días.

Como se indicó antes, los clones fueron probados tanto para la producción de fibrinógeno como para la calidad del fibrinógeno producido. Algunos clones produjeron elevados niveles de fibrinógeno intacto, otros generaron producto intacto pero también mostraron productos de degradación. La cadena Aα es la más sensible a la proteolísis comparada con la Bβ y γ, así la primera exploración con la herramienta de detección se centró en primera instancia en las pruebas para la integridad de la cadena Aα. Un ejemplo típico se muestra en la Figura 3, donde el clon M21 muestra claramente la degradación de la cadena Aα, mientras que M25 y M57 no. El análisis de la transferencia Western de estas muestras para la integridad de Bβ y γ probó que estas cadenas estaban todavía intactas, incluso si la cadena Aα mostraba ruptura proteolítica.

Ejemplo 5 Generación de líneas celulares estables que expresan la variante humana Fib420

Líneas celulares estables que expresan una variante del fibrinógeno humano, viz. la variante Fib420 que tiene una cadena Aα extendida (847 aminoácidos en lugar de 625) fueron generadas. Una construcción codón optimizada (SEQ ID No. 7) fue utilizada y los clones fueron generados bajo condiciones libres de suero, como se describe en el Ejemplo 5.

El sobrenadante de dos clones positivos que produjeron más de 3 pcd en un lote de cultivo de 7 días se comprobaron para la cadena Aα extendida intacta (Fib420) utilizando el análisis de Western Blot. Estaba claro (Figura 4) que incluso en elevadas producciones de clones la cadena Aα del Fib420 estaba extendida e intacta.

Ejemplo 6 Generación de células estables PER.C6 que expresan el fibrinógeno humano desde cDNAs de fibrinógeno de codones optimizados bajo condiciones libres de suero.

Células PER.C6 (Fallaux y colaboradores (1998) Hum. Gene Ther. 9(13) 1909) fueron usadas como un huésped para la expresión del fibrinógeno recombinante humano. Brevemente, las células PER.C6 fueron cultivadas en suspensión en un medio mAb (SAFC, Hampshire, UK) y transfectadas utilizando el dispositivo de nucleofección AMAXA (Lonza, Cologne, Alemania) (programa A-27, que utiliza el Nucleofector Kit T con tres vectores que codifican las tres diferentes cadenas de la proteína fibrinógeno humano (cadena Aα, Bβ y γ) y que contiene las cadenas del cDNA optimizado (SEQ ID no.4, SEQ ID no.5, y SEQ ID no.6, resp).

Después de la nucleofección, las células fueron cultivadas durante 1 día en un matraz T y posteriormente sembradas en placas de 96 pocillos (Greiner, Alphen a/d Rijn, Países Bajos) a una densidad de 1.000-3.000 células/pocillo. Después el medio mAB que contiene 125 µg/ml de Geneticina (Invitrogen) fue añadido. Después de aproximadamente 3 semanas, aparecieron clones en aproximadamente 10 – 30% de pocillos individuales de la placa de 96 pocillos, que se ampliaron posteriormente a placas de 48-, 24-y 6 pocillos y después subcultivados en matraces de cultivo T25 y T80. Durante toda la expansión los cultivos fueron seleccionados por los niveles de expresión del fibrinógeno humano. Las células de baja y no-expresión fueron descartadas. Posteriormente las células fueron cultivadas en matraces con agitación (125 mL, Corning).

En total, 579 clones fueron identificados en las placas de 96 pocillos. Basado en los niveles de expresión del fibrinógeno a través de la expansión, 43 clones fueron seleccionados y subcultivados en matraces de agitación. 10 fuera de estas 43 líneas celulares PER.C6 que producen fibrinógeno humano recombinante fueron seleccionadas para un lote de ensayo inicial, basado en las características de crecimiento y producción.

El ensayo del lote de las 6 líneas celulares PER.C6® seleccionadas en medio VPRO (SAFC) mostró niveles de producción volumétrica de hasta 279 mg/L de fibrinógeno recombinante humano, y una productividad específica de

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19,8 pcd. Finalmente un lote de cultivo en medio VPRO fue realizado con un cambio de medio en el tiempo de toma de muestra, que resultó en niveles de producción volumétrica acumulativa de hasta 515 mg/L de fibrinógeno recombinante.

Ejemplo 7 Generación de líneas celulares estables PER.C6 que expresan el fibrinógeno humano con una cadena Aα de 610 aminoácidos

Para generar un plásmido de expresión que codifique la Aα610 de la forma predominante del fibrinógeno de origen plasmático en la circulación sanguínea, un fragmento de cDNA (SECUENCIA ID 8), optimizado como se describió anteriormente, que codifique aminoácidos 1 – 610 de la cadena Aα fue clonado en el plásmido de expresión pcDNA3.1 (+) neo, de acuerdo con los procedimientos estándar. La generación de líneas celulares PER.C6 que producen fibrinógeno recombinante humano es similar a como se describió anteriormente (véase ejemplo 6). Las secuencias utilizadas para las cadenas Aα, Bβ y γ son SEQ ID no.8, SEQ ID no.5, y SEQ ID no.6, resp.

Después de la trasfección de las células PER.C6 y cultivado en placas de 96 pocillos, 310 clones fueron transferidos y seleccionados en placas de 48 pocillos. Al final de la trayectoria de expansión, 24 fuera de los 310 fueron transferidos a matraces con agitación, que después de un ensayo de lote inicial, 8 fueron seleccionados para el ensayo de estabilidad y productividad en el cultivo de lote.

Los rendimientos del cultivo de lote fueron similares a los rendimientos obtenidos con líneas celulares que expresan la cadena Aα en el formato de 625 aminoácidos, que demuestra claramente que la expresión de las cadenas Aα del cDNA que codifica la forma de 610 amino no afecta a los niveles de expresión.

El análisis de proteínas que utiliza el análisis SDS-PAGE y de transferencia Western indicó que el fibrinógeno recombinante fue producido en formato intacto.

Ejemplo 8 Líneas celulares PER.C6 que expresan fibrinógeno recombinante humano basado en la cadena Aα extendida (variante Fib420)

La generación de líneas celulares PER.C6 que producen fibrinógeno recombinante humano es similar a la descrita antes (véase ejemplos 6 y 7). En resumen, las secuencias utilizadas para la cadena Aα, Bβ, y γ son SEQ ID no.7, SEQ ID no.5, y SEQ ID no.6, resp.

Después de la transfección y cultivo en las placas de 96 pocillos, 325 clones fueron transferidos y seleccionados en placas de 48 pocillos. Al final de la trayectoria de expansión, 24 clones fueron transferidos a matraces de agitación, de los cuales 8 fueron seleccionados por el análisis de estabilidad y expresión para continuar con el ensayo de cultivo de lote.

Los rendimientos en el cultivo de lote fueron similares a los rendimientos obtenidos con líneas celulares que expresan la cadena Aα en formato de 610 o 625 aminoácidos, indicando que la extensión de la cadena Aα no afecta a los niveles de expresión. Esto no era de esperar a priori, un fibrinógeno de origen plasmático solo contiene 1-3% de cadena Aα extendida en comparación con fibrinógeno que contiene la cadena Aα 610/625. El análisis de la proteína utilizando el análisis SDS-PAGE y de transferencia Western indica que el fibrinógeno recombinante es producido en formato intacto, con la cadena α que tiene el tamaño esperado (similar a la cadena Aα producida por CHO desde el Fib420 como se muestra en la Figura 4).

Ejemplo 9 Expresión transitoria de fibrinógeno γ’ codones optimizados en células cultivadas CHO libres de suero.

La transfección transitoria y análisis fueron realizados como se describe en el Ejemplo 2. La secuencia cDNA de cadena γ’ extendida utilizada en este experimento es una secuencia γ’ extendida optimizada (SEQ ID No. 12) y codificada para el polipéptido de 453 aminoácidos. Después de la eliminación del péptido señal, un polipéptido secretado de 427 aminoácidos (aminoácidos de 27 a 453 de SEQ ID NO. 13).

Los resultados mostraron que los niveles de expresión de la variante de fibrinógeno con las cadenas γ’ están en el mismo intervalo que los niveles mejorados para la variante optimizada de ‘tipo nativo’. El sobrenadante del cultivo fue analizado mediante el análisis de transferencia Western. Los resultados (Figura 5) muestran que la cadena γ’ del fibrinógeno recombinante, en el carril 1, corre más lento que el fibrinógeno ‘tipo nativo’, en el carril 2. Esto indica que la cadena γ’ en el fibrinógeno recombinante está extendida si se compara con la cadena γ en el fibrinógeno de origen plasmático y que la cadena γ’ está intacta y no degradada.

Ejemplo 10 Purificación del fibrinógeno recombinante humano.

El fibrinógeno recombinante humano del Ejemplo 6 fue purificado desde el sobrenadante del cultivo celular de acuerdo con los métodos estándar. Brevemente, (NH4)2SO4 fue añadido al sobrenadante del cultivo a 40% de saturación y el precipitado fue recogido por centrifugación. Posteriormente, el precipitado fue disuelto en TBS (Tris

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HCl 50mM, pH 7,4, NaCl 100mM), diluido (10 veces) en un tampón de carga (Tris-HCl 5mM pH 7,4, 0,01% Tween20, (NH4)2SO4 0,5M) y cargado en una columna de interacción hidrofóbica (HIC) Hi Trap Butyl FF (20mL) (GE Healthcare, Upsala, Suecia). La proteína unida fue eluida por el tampón de carga que contiene un gradiente de (NH4)2SO4 de 0,5 – 0 M (NH4)2SO4 en 20 volúmenes de columna. Las fracciones de picos de la purificación HIC fueron sometidas a un cambio de tampón por diálisis frente al tampón de carga TMAE (Tris-HCl 5mM pH8,5, 0,01% Tween-20) y posteriormente cargado en una columna de intercambio iónico Fractogel EMD TMAE (m) 40 – 90 µm (20 ml) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). El fibrinógeno recombinante humano fue posteriormente eluido utilizando un gradiente de sal continuo de NaCl 0 – 1 M en 20 volúmenes de columna.

El fibrinógeno recombinante humano en las fracciones de pico fue precipitado otra vez por adición de (NH4)2SO4 al 40% de saturación y recogido por centrifugación. Finalmente el material fue disuelto en TBS (Tris-HCl 50mM, pH 7,4, NaCl 100mM) y dializado frente al TBS para eliminar cualquier resto de (NH4)2SO4.

Ejemplo 11 Funcionalidad del fibrinógeno recombinante

El fibrinógeno recombinante purificado PER.C6, como el producido por las líneas celulares generado en el Ejemplo 6, fue sometido a un número de ensayos para evaluar su calidad y funcionalidad y compararlo con el fibrinógeno de origen plasmático. La N-glicosilación del fibrinógeno fue probada por tratamiento del fibrinógeno con PNGase F, que es una amidasa que elimina las estructuras de carbohidratos N-unidas de las proteínas (Maley, F. y colaboradores (1989) Anal. Biochem. 180, 195). Las muestras de fibrinógeno purificado, derivado de los cultivos PER.C6, así como el fibrinógeno de origen plasmático (Fibrinógeno humano FIB3, ERL) fueron tratadas con PNGase F (New England Biolabs, Ipswich, MA, US), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los resultados (Figura 6) indican que el tratamiento con PNGase F da lugar a un descenso de la masa molecular para las cadenas Bβ y γ, según lo determinado por SDS-PAGE, para ambos FIB3 (ERL) de origen plasmático y fibrinógeno base PER.C6. Esto es consistente con el hecho de que ambas cadenas contienen un sitio de Nglicosilación (Henschen-Edman (2001) Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 936, 580). Los datos muestran que ambos precomo post tratamiento con PNGase F, diferentes bandas sencillas son visibles para ambas cadenas bβ y γ. Esto indica que, así para el fibrinógeno de origen plasmático, todas estas cadenas en el fibrinógeno recombinante estás glicosiladas. La cadena Aα del fibrinógeno humano no contiene N-glicanos, por eso el peso molecular no cambia tras el tratamiento PNGase F. En conclusión, estos datos indican que el modelo de la N-glicosilación de PER.C6 basado en el fibrinógeno es similar a del homólogo de origen plasmático.

La actividad biológica del fibrinógeno derivado de PER.C6 fue además probada en ensayos de polimerización, realizados como describieron Koopman y colaboradores (1992) Blood 80(8):1972. Los resultados obtenidos fueron similares a aquellos obtenidos con fibrinógeno humano derivado de CHO. El ensayo mide la polimerización del fibrinógeno bajo la acción de trombina para formar fibrina. La polimerización es medida mediante el registro OD350 nm en el tiempo. La polimerización del fibrinógeno recombinante PER.C6 en plasma fue igual al plasma y al fibrinógeno derivado de CHO.

La capacidad de coagulación de fibrinógeno derivado de PER.C6, purificado como se describió, fue probada por adición de α-trombina (7,5 IU/ml) (ERL, Swansea, UK) y CaCl2 (concentración final 2mM), seguido por una incubación a 37 ºC durante 1 hora. El coagulo resultante fue entonces recogido por centrifugación en un vial Eppendorf (15 min, 5.000 rpm, centrífuga eppendorf). El sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo y el coagulo fue disuelto en urea alcalina. La proteína fue medida en el sobrenadante y el coagulo por medición A280. El contenido en fibrinógeno del sobrenadante fue medido mediante ELISA (anticuerpos G8-Y18). Los resultados fueron similares para el fibrinógeno de origen plasmático y fibrinógeno derivado de PER.C6: 97 y 94% de la proteína fue medida en el coagulo disuelto (5% y 8% en el sobrenadante), respectivamente. Ningún fibrinógeno podía ser detectado en el sobrenadante mediante ELISA. Estos resultados apoyan aún más la similitud biológica entre el fibrinógeno de origen plasmático y recombinante humano.

El tiempo de coagulación y la firmeza del coagulo del recombinante y del fibrinógeno de origen plasmático fueron medidos usando el análisis ROTEM. ROTEM® (Pentapharm GMBH, Munich, Alemania) representa ROtation ThromboElastoMetry. La técnica utiliza un eje de rotación sumergido en una muestra (sangre) en una cubeta desechable. Los cambios en la elasticidad bajo diferentes condiciones de coagulación producen un cambio en la rotación de los ejes, que es visualizado en un tromboelastograma, que refleja parámetros mecánicos del coagulo (véase por ejemplo Luddington R. J. (2005) Clin Lab Haematol. 2005 27(2):81). Plasma normal combinado (citrato) fue mezclado 1:1 con Haemocomplettan (CSL Behring GmbH, Marburg, Alemania) o fibrinógeno PER.C6 (ambos 2 mg/ml en TBS). CaCl2 fue añadido a una concentración final de 17 mM. Para empezar la coagulación, α-trombina fue añadida a una concentración final de 1 IU/ml. El tiempo de coagulación y la firmeza del coágulo fueron analizados mediante ROTEM.

La dilución del plasma citrado compromete tanto el tiempo de coagulación como la firmeza del coagulo. Los resultados indican que la restauración de los niveles de fibrinógeno en el plasma diluido por adición de fibrinógeno purificado restaura tanto el tiempo de coagulación (Figura 7) como la firmeza del coagulo (Figura 8) en la misma

medida para el fibrinógeno de origen plasmático y el fibrinógeno recombinante. Datos similares fueron obtenidos para el fibrinógeno recombinante basado en CHO.

Estos resultados indican que el fibrinógeno recombinante humano sería una buena alternativa para suplir la deficiencia de fibrinógeno en pacientes con fibrinogenemia congénita y en pacientes con una deficiencia de 5 fibrinógeno adquirida.

Ejemplo 12 Análisis de ROTEM en sangre humana

Para demostrar además que el fibrinógeno recombinante humano puede ser usado para el tratamiento de pacientes con deficiencia de fibrinógeno, fueron realizados experimentos en sangre de un individuo humano sano. La deficiencia de fibrinógeno fue simulada por dilución de la sangre 1:1 con lactato de Ringer (Baxter, Utrecht, Países

10 Bajos). Después, usando el análisis de ROTEM como se describió en el ejemplo 11, el tiempo de formación del coagulo y la firmeza del coagulo fueron determinados.

Para restablecer los niveles de fibrinógeno en la sangre que fue diluida 1:1 con el lactato de Ringer, o fibrinógeno de origen plasmático o fibrinógeno recombinante fueron añadidos.

Los datos (Figura 9) indican que el tiempo de formación del coagulo en la sangre diluida con lactato de Ringer

15 estaba fuera del intervalo normal, así como en una situación clínica para un paciente que tiene bajos niveles de fibrinógeno. La adición de o fibrinógeno recombinante o fibrinógeno de origen plasmático produce la restauración del tiempo de formación del coagulo a un nivel dentro del intervalo normal. Esto indica el potencial del fibrinógeno recombinante para tratamiento intra venoso de pacientes con bajos niveles de fibrinógeno.

Cuando la sangre fue diluida con lactato de Ringer la máxima firmeza de coagulo (MCF) fue reducida a un nivel

20 asociado con el riesgo de hemorragia en pacientes (Figura 10). Cuando los niveles de fibrinógeno fueron repuestos con fibrinógeno de origen plasmático o fibrinógeno recombinante MCF fue restaurado a niveles normales, lo que destaca el potencial para uso del fibrinógeno recombinante para tratamiento intravenoso de pacientes con bajos niveles de fibrinógeno. Es de notar, que para la aprobación de Riastap en US, la eficacia clínica estaba basada en un criterio indirecto de valoración, en el que la máxima firmeza de coagulo fue medida por tromboelastografía.

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Claims

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REIVINDICACIONES

1. Una secuencia de nucleótidos que está optimizada para su expresión en un sistema de cultivo de células de mamíferos, preferiblemente para la expresión en una célula COS, una célula BHK, una célula NS0, una célula CHO, Sp2/0 o un sistema de cultivo celular humano, más preferiblemente para su expresión en células PER.C6 o un sistema de cultivo celular HEK293, que comprende

(i)

una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO. 4 o 7, o una parte de la misma que comprende los nucleótidos 60 a 1932 de SEQ ID NO. 4, nucleótidos 60 a 1887 de SEQ ID NO. 4 o nucleótidos 60-2598 de SEQ ID NO. 7, o una secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO. 4 o 7 y que codifica una cadena alfa de fibrinógeno, o

(ii)

una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO. 5, o la parte de la misma que comprende los nucleótidos 93 a 1473 de SEQ ID NO. 5, o una secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO. 5 y que codifica una cadena beta del fibrinógeno o

(iii) una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO. 6 o 12, o una parte de la misma que comprende los nucleótidos 81 a 1311 de SEQ ID NO. 6 o nucleótidos 81 a 1359 de SEQ ID NO. 12, o una secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO. 6 o 12 y que codifica una cadena gamma del fibrinógeno.
2.

Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, que está optimizada mediante adaptación de uso de codones a células CHO, preferiblemente con un índice de adaptación de codones de al menos 0,95.
3.

Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que tiene un contenido de GC de al menos 55%.
4.

Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, que muestra al menos 70% de identidad con sus respectivos homólogos no optimizados.
5.

Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, que no contiene sitios de actuación en cis.
6.

Una construcción de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-5.
7.

Una célula de mamíferos que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1-5.
8.

Una célula de mamíferos que produce fibrinógeno recombinante intacto a niveles de al menos 3 picogramos por célula por día, donde la célula comprende una construcción de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 6.
9.

Una línea celular que produce fibrinógeno recombinante intacto a niveles de al menos 3 picogramos por célula por día, donde la línea celular esta basada en una célula de acuerdo con la reivindicación 8.
10.

Un método para la producción de fibrinógeno en un sistema de cultivo de células de mamífero cuyo método comprende cultivar células de mamífero de acuerdo con las reivindicaciones 7 o 8 o una línea celular de acuerdo con la reivindicación 9 bajo condiciones donde el fibrinógeno es producido, y opcionalmente, el fibrinógeno producido es recuperado.
11.

Una preparación de fibrinógeno preparada por el método de la reivindicación 10.
12.

Una preparación de fibrinógeno de acuerdo con la reivindicación 11, en la que más del 10% de las cadenas alfa, beta y gamma son de un tipo variante, donde el tipo variante es preferiblemente una cadena gamma prima o una cadena alfa extendida.
13.

Una preparación de fibrinógeno de acuerdo con las reivindicaciones 11 o 12 para uso como un medicamento, como un sellador de tejidos o para facilitar la adherencia del tejido.
14.

Uso de una preparación de fibrinógeno de acuerdo con las reivindicaciones 11-13 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la deficiencia de fibrinógeno.
15.

Una preparación de fibrinógeno producida por el método de acuerdo con la reivindicación 10, en la que en dicha preparación más del 90% del fibrinógeno está en la forma intacta.

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