CN102089322B - 重组纤维蛋白原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码纤维蛋白原α、β或γ链的核苷酸序列。所述序列是针对在真核细胞培养系统中的表达优化的。这种优化的核苷酸序列可实现在真核细胞培养系统中以完整的形式高效表达重组纤维蛋白原及其变体。

Description

重组纤维蛋白原
技术领域
本发明涉及重组纤维蛋白原，涉及在哺乳动物细胞中以高水平产生重组纤维蛋白原的方法，还涉及它的应用。
背景技术
纤维蛋白原是可溶性血浆糖蛋白，主要是通过肝脏的肝实质细胞在人体内合成。它是由两对标记为Aα、Bβ和γ的三条多肽链组成的二聚体分子，所述三条多肽链由二硫桥键连接。三条多肽链由三个独立的基因编码。野生型Aα链合成为含625个氨基酸的前体，并作为含610个氨基酸的蛋白质存在于血浆中，Bβ含461个氨基酸，γ链含411个氨基酸。三种多肽分别由3种mRNA合成。三条组成链(Aα、Bβ和γ)组装成最终形式的六链二聚体(Aα、Bβ、γ)2发生于内质网(ER)腔内。
纤维蛋白原以高浓度(1-2g/L)循环于血液中，并显示出高度的异质性。通过基因多态性、糖基化和磷酸化的差异、Aα链的端羧基部分的(部分)蛋白水解以及选择性剪接产生变体(请参阅De Maat和Verschuur(2005)Curr.Opin.Hematol.12，377；Laurens等(2006)J.Thromb Haemost.4，932；Henschen-Edman(2001)Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 936，580)。据估计，在每个个体中，约有一百万个不同的纤维蛋白原分子循环。大部分的这些变体在功能和结构上都不同，所述的这些变体只占纤维蛋白原总数的一小部分(在大多数情况下不超过几个百分比)。Aα链的端羧基部分的蛋白水解导致具有明显不同分子量的纤维蛋白原的三种主要循环形式。纤维蛋白原以高分子量的形式合成(HMW；分子量为340kDa；循环中的Aα链的主要形式含610个氨基酸)。Aα链之一的降解产生低分子量形式(LMW；MW＝305kDa)；LMW形式(270kDa)是其中两个Aα链都在端羧基部分地降解的变体。在正常血液中，50-70％的纤维蛋白原是HMW，20-50％是具有一个或两个降解Aα链的纤维蛋白原(de Maat和Verschuur(2005)Curr.Opin.Hematol.12，377)。HMW和LMW变体在凝血时间和纤维蛋白聚合体结构方面显示出明显的差异(Hasegawa N，Sasaki S.(1990)Thromb.Res.57，183。
由选择性剪接产生的众所周知的变体是所谓的γ’变体和Fib420变体。
γ′变体占γ链总数的约8％。对于丰度最高的γ链来说，它由427个而不是411个氨基酸组成；四个末端C氨基酸(AGDV)被含2个硫酸化酪氨酸的20个氨基酸取代。纤维蛋白原γ′链不能与对调节血小板凝聚至关重要的血小板纤维蛋白原受体IIbβ3结合。
分子量为420kDa的Fib420变体占循环纤维蛋白原总数的1-3％(de Maat和Verschuur(2005)Curr.Opin.Hematol.12，377)。通过选择性剪接，使额外的开放读码框包括于Aα链的C-末端，从而用237个氨基酸将其扩展。附加的氨基酸形成结节结构。
血源性纤维蛋白原是市售纤维蛋白封闭剂的一个重要组分，所述纤维蛋白封闭剂临床应用于外科手术中，用以止血和减少血液及体液的流失。此外，其用于通过利用纤维蛋白的凝集性能促进组织粘连和用于改善伤口的愈合。纤维蛋白原临床上也用于补充遗传性纤维蛋白原缺乏症患者和后天性纤维蛋白原缺乏症患者的纤维蛋白原缺乏。已证实高剂量纤维蛋白原(3-10克)的静脉注射能在不同的临床情况下使血液凝固正常化并阻止或预防严重的出血。
人纤维蛋白原的重组生产，无论是野生型(HMW)形式或作为变体(如Fib420)，比使用血源性材料有很多优点。这些优点包括其优选的安全特性、以纯粹的方式产生变体的可能性和无限制供应。然而，为了以经济上可行的方式进行生产，需要完整、功能性纤维蛋白原的高表达水平。此外，针对具体的应用(如使用纤维蛋白原作为静脉注射(IV)止血剂)，需要正确的翻译后修饰(如糖基化)。
由于翻译后修饰的原因，哺乳动物系统中的表达是优选的。因此，生物活性重组纤维蛋白原已经在各种细胞中被表达，如幼仓鼠肾(BHK)(如Roy等，(1991)Biochemistry 30，9414)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(如Lord，(US6037457)，Binnie等，(1993)Biochemistry32，107)或非洲绿猴源性COS细胞(如Roy等，(1991)J.Biol.Chem.266，4758)。然而，表达水平只有大约1-15μg/ml，被认为不足以取代临床实践中所需的大量血浆纤维蛋白原。此外，人纤维蛋白原在酵母P.pastoris中的表达水平为8μg/ml，这对于商业生产来说也是不够的(Tojo等，(2008)Prot.Expr.和Purif.59，289)。
在EP 1 661 989中，据报道，对于商业上可行的生产来说，需要的产量为至少100mg/L。在这种应用中，报告称在转瓶中，CHO细胞的表达水平可高达631.5mg/L。然而，为了达到这种水平，细胞必须共同表达杆状病毒P35抗凋亡蛋白质，且必须使用甲氨蝶呤(抗代谢物)扩增载体。与工业上的标准相比(例如Wurm(Nature Biotechnol.(2004)22，1393)报告了3-4天的传代培养中的常规细胞密度为2×106细胞/ml)，细胞密度相对较低(在转瓶中，15天内最高为9.4×105细胞/ml)。
重组纤维蛋白原的成功生产的最重要问题是如何制备高纯度的足够完整、正确组装的生物活性产物。
具体实施方式
本发明涉及编码纤维蛋白原α、β或γ链的核苷酸序列，所述核苷酸序列是针对在真核细胞培养系统中的表达优化的。根据本发明的优化核苷酸序列可实现在真核细胞培养系统中以完整的形式高效表达重组纤维蛋白原。由优化核苷酸序列编码的蛋白质序列与由相应的非优化核苷酸序列编码的蛋白质序列相同。在本发明中，术语‘纤维蛋白原’可以指任何形式的纤维蛋白原，包括通过基因多态性、糖基化和磷酸化的差异、Aα链的端羧基部分的(部分)蛋白水解和选择性剪接产生的变体。在本发明中，术语‘α链’和‘Aα链’可互换使用。它们可以指α链的野生型和变体两者，包括含信号序列(SEQID No.8)的644个氨基酸的纤维蛋白原α链、无信号序列(SEQ IDNO.8的氨基酸20至644)的625个氨基酸的前体纤维蛋白原α链、见于循环中的610个氨基酸(SEQ ID NO.8的氨基酸20至629)的截短纤维蛋白原α链和含信号序列(SEQ ID NO.11)或无信号序列(SEQID NO.11的氨基酸20-866)的866个氨基酸的Fib420变体α链。在本发明中，术语‘β链’和‘Bβ链’可互换使用。它们可以指β链的野生型和变体两者，包括含信号序列(SEQ ID No.9)的491个氨基酸的纤维蛋白原β链和无信号序列(SEQ ID NO.9的氨基酸31至491)的461个氨基酸的纤维蛋白原β链。
在本发明中，术语‘伽玛链’和‘γ链’可互换使用。它们可以指γ链的野生型和变体两者，包括含信号序列(SEQ ID No.10)的437个氨基酸的纤维蛋白原γ链、无信号序列(SEQ ID NO.10的氨基酸27至437)的411个氨基酸的纤维蛋白原γ链、453个氨基酸的纤维蛋白原γ链(带有信号序列(SEQ ID NO.13)的γ’链)和427个氨基酸的纤维蛋白原γ链(无信号序列(SEQ ID NO.13的氨基酸27至453)的γ’链)。
在本发明中，当氨基酸序列含由核苷酸序列编码的所有氨基酸，任选不含在正常细胞(分泌)处理过程中被移除的氨基酸时，纤维蛋白原或纤维蛋白原链是‘完整形式的’。因此，具有644、625或610个氨基酸的α链是完整形式的α链的例子。
根据本发明的优化核苷酸序列的GC含量为至少55％，优选为至少58％，更优选为至少60或65％。在一个实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列的GC含量在约55％至70％范围内。在另一实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列的GC含量在约60％至65％范围内。
编码纤维蛋白原α、β或γ链的本分明的优化核苷酸序列是针对在真核细胞培养系统中的表达优化的。优选地，它们是针对在哺乳动物细胞培养系统中的表达优化的，如针对在COS细胞、BHK细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、CHO细胞、PER.C6细胞、HEK293细胞或昆虫细胞培养系统中的表达。更优选地，核苷酸序列是针对在人体细胞培养系统中的表达优化的，如针对PER.C6细胞或HEK293细胞培养系统。
根据本发明的优化的密码子适应指数为至少0.90，优选为至少0.95，更优选为至少0.97。在一个实施例中，根据本发明的核苷酸序列通过适应CHO细胞的密码子使用被优化，其中密码子适应指数为至少0.95。
根据本发明的核苷酸序列可以是编码任何类型的纤维蛋白原链的。优选地，它们编码哺乳动物纤维蛋白原链，更优选地，它们编码灵长类动物纤维蛋白原链，最优选地，它们编码人纤维蛋白原链。链的组合也是可能的，例如一个或两个哺乳动物纤维蛋白原链与两个或一个啮齿类动物纤维蛋白原链组合。优化核苷酸序列可以是DNA或RNA。优选是cDNA。
编码纤维蛋白原α、β或γ链的本发明的优化核苷酸序列显示出与其相应的非优化对应物至少70％的一致性。在一个实施例中，编码纤维蛋白原α、β和γ链的本发明的优化核苷酸序列显示出与其相应的非优化序列70-80％的一致性。优选地，编码纤维蛋白原α、β或γ链的本发明的优化核苷酸序列不包含顺式作用位点，如剪接位点和poly(A)信号。
编码纤维蛋白原α链的本发明的优化核苷酸序列不包含通常存在于编码人纤维蛋白原的α链的基因中的39个碱基对直接重复序列。在编码α链的本发明的优化核苷酸序列中，不用改变编码的蛋白质序列即可改变重复序列。
在一个优选的实施例中，编码α链的本发明的优化核苷酸序列包含根据SEQ ID No.4或7的序列。编码纤维蛋白原α链且包含部分的这些序列的核苷酸序列也涵盖在本发明中。在一个实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列包含SEQ ID NO.4的核苷酸60-1932。在另一实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列包含SEQ ID NO.4的核苷酸60-1887。在又一实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列包含SEQ IDNO.7的核苷酸60-2598。这样的核苷酸序列也涵盖在本发明中，该核苷酸序列包含与SEQ iD NO.4或7有至少85％、至少87％或至少90％、更优选至少92％、至少94％、96％、最优选至少98％或至少99％的一致性的序列，并且编码纤维蛋白原α链，例如带有根据SEQ IDNO.8或11的序列或部分的这些序列的纤维蛋白原α链，如上文所例示。在优选的实施例中，编码β链的本发明的优化核苷酸序列包含根据SEQ ID No.5的序列。
编码纤维蛋白原β链且包含部分此序列的核苷酸序列也涵盖在本发明中。在一个实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列包含SEQID NO.5的核苷酸93-1473。这样的核苷酸序列也涵盖在本发明中，该核苷酸序列包含与SEQ ID No.5有至少85％、至少87％或至少90％、更优选至少92％、至少94％、96％、最优选至少98％或至少99％的一致性的序列，并且编码纤维蛋白原β链，例如带有根据SEQ IDNO.9的序列或部分此序列(例如SEQ ID NO.9的氨基酸31至491)的纤维蛋白原β链。在优选的实施例中，编码纤维蛋白原γ链的本发明的优化核苷酸序列包含根据SEQ ID NO.6的序列。编码纤维蛋白原γ链且包含部分此序列的核苷酸序列也涵盖在本发明中。在一个实施例中，编码纤维蛋白原γ链的本发明的优化核苷酸序列包含SEQ IDNO.6的核苷酸81-1311。这样的核苷酸序列也涵盖在本发明中，该核苷酸序列包含与SEQ ID No.6有至少85％、至少87％或至少90％、更优选至少92％、至少94％、96％、最优选至少98％或至少99％的一致性的序列，并且编码纤维蛋白原γ链，例如带有根据SEQ IDNO.10的序列或部分此序列(例如SEQ ID NO.10的氨基酸27至437)的纤维蛋白原γ链。
在另一优选的实施例中，编码纤维蛋白原γ链的本发明的优化核苷酸序列包含根据SEQ ID NO.12的序列。编码纤维蛋白原γ链且包含部分此序列的核苷酸序列也涵盖在本发明中。在一个实施例中，编码纤维蛋白原γ链的本发明的优化核苷酸序列包含SEQ ID NO.12的核苷酸81-1359。这样的核苷酸序列也涵盖在本发明中，该核苷酸序列包含与SEQ ID No.12有至少85％、至少87％或至少90％、更优选至少92％、至少94％、96％、最优选至少98％或至少99％的一致性的序列，并且编码纤维蛋白原γ链，例如带有根据SEQ ID NO.13的序列或部分此序列(例如SEQ ID NO.13的氨基酸27至453)的纤维蛋白原γ链。
在另一方面，本发明涉及核苷酸构建体，所述核苷酸构建体包含编码纤维蛋白原α、β或γ链的本发明的优化核苷酸序列。核苷酸构建体可包含影响纤维蛋白原链的表达的调节序列，包括启动子、终止子和增强子。在一个实施例中，核苷酸构建体是载体，例如克隆载体或表达载体。核苷酸构建体可包含选择标记。
在另一方面，本发明涉及包含编码纤维蛋白原α、β或γ链的本发明的优化核苷酸序列的细胞。在所述细胞中，根据本发明的核苷酸可以本身或者在构建体中的形式存在，如在表达载体或克隆载体中。所述细胞通常是用于产生纤维蛋白原的宿主细胞。包含根据本发明的核苷酸序列的细胞优选为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的合适例子包括昆虫细胞、COS细胞、BHK细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、CHO细胞、PER.C6细胞和HEK293细胞。
根据本发明的细胞产生大量的完整生物活性纤维蛋白原。所述细胞通常是细胞系的一部分。在本发明中，短语‘产生大量完整纤维蛋白原的细胞或细胞系’是指产生超过85％、优选超过90％、95％或99％的完整产物的细胞或细胞系。优选地，这是在群体倍增为10、20或30的时期、更优选为40或50的时期测量的。在本发明中，‘生物活性’纤维蛋白原是指在凝血酶的存在下聚合成纤维蛋白的纤维蛋白原。这种细胞或细胞系也涵盖在本发明中。在优选的实施例中，根据本发明的细胞系产生完整重组纤维蛋白原的水平为每天每个细胞至少3微微克，更优选为每天每个细胞至少4或5微微克，甚至更优选为每天每个细胞至少7或10微微克。在细胞密度为30×106个细胞/ml的反应器中，每天每个细胞3微微克相当于每天每升反应器体积产生90mg纤维蛋白原，每天每个细胞5微微克相当于每天每升产生150mg纤维蛋白原，每天每个细胞7微微克相当于每天每升产生210mg纤维蛋白原。优选地，细胞群的至少50％、更优选细胞群的至少60％、70％或80％、最优选细胞群的至少90％、95％或99％每天每个细胞产生至少3微微克，更优选每天每个细胞产生至少5微微克，甚至更优选每天每个细胞产生至少7微微克。
产生大量完整纤维蛋白原的细胞或细胞系的选择优选在没有蛋白酶抑制剂的表达的情况下进行。在一个实施例中，使用抗体进行选择，优选的是与α链的完整N-末端和α链的完整C-末端结合的单克隆抗体。市售的这种抗体的合适例子包括由Koppert等((1985)Blood66，503)所描述的Y18抗体和由Hoegee-de Nobel等((1988)Thromb.Haemost.60(3)415)所描述的G8抗体。优选在无血清的环境中进行这种选择。选择产生完整纤维蛋白原的细胞系的方法也是本发明的一部分。
另一方面，本发明涉及在真核细胞培养系统中产生纤维蛋白原的方法。所述方法包括根据本发明在产生纤维蛋白原的条件下培养宿主细胞或细胞系。可任选回收产生的纤维蛋白原。可以组合优化和非优化的链。可以通过基因工程或者通过合成方法获得非优化链，并且它们的来源可以与优化链不同。在一个实施例中，每个纤维蛋白原分子中只有一个链是通过根据本发明的密码子优化核苷酸序列编码的，而两个其它链是通过两个没有优化的核苷酸序列编码的。在另一实施例中，每个纤维蛋白原分子的三个纤维蛋白原链中的两个是通过根据本发明的密码子优化核苷酸序列编码的。在优选的实施例中，所有三个纤维蛋白原链都是通过优化的核苷酸序列编码的。与血源性纤维蛋白原相比，因为产生了特定的纤维蛋白原链，所以由此方法产生的纤维蛋白原制剂相当均匀。所述方法能够产生纤维蛋白原制剂，其10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％以上、优选95％、98％或99％以上是仅少量存在于血浆中的变体。
另一方面，本发明涉及根据本发明的核苷酸序列在制备若干医疗应用的纤维蛋白原中的用途。在一个应用中，根据本发明的核苷酸序列用于制备用在纤维蛋白封闭剂中的纤维蛋白原，所述纤维蛋白封闭剂临床应用于外科手术中，用以止血和减少血液及体液的流失。在另一应用中，根据本发明的核苷酸序列可用于制备纤维蛋白原，从而通过利用纤维蛋白的凝集性能促进组织粘连和改善伤口的愈合。在又一应用中，根据本发明的核苷酸序列可用于制备纤维蛋白原，所述纤维蛋白原临床上用于通过静脉注射纤维蛋白原治疗先天性或后天性(如通过在创伤后或在手术过程中出血)纤维蛋白原缺乏症患者的急性出血发作。市场上销售的血源性纤维蛋白原制剂有Riastap(CSL BehringLLC；在美国市场销售)和Haemocomplettan(CSL Behring AG；在欧洲市场销售)。与血源性制剂相比，重组纤维蛋白原制剂有若干优点，包括优选的安全特性、无限制供应和以纯粹的方式针对此特定适应证生产具有优选活性特性的纤维蛋白原变体的可能性。
附图说明
图1在CHO细胞用野生型和编码Aα、Bβ和γ链的密码子优化构建体转染后的第1、2、3和6天时重组人纤维蛋白原的表达水平。实验重复进行两次，(opt)优化序列；(wt)野生型序列。
图2在CHO细胞用编码Aα、Bβ和γ链的密码子优化构建体和带有Aα-扩展的、Bβ和γ链(标记为Aα-ext.(opt)+Bβ(opt)+γ(opt))的密码子优化构建体(标记为Aα(opt)+Bβ(opt)+γ(opt))转染后的第1、2、3和6天时重组人纤维蛋白原的表达水平。实验重复进行两次。
图3来自表达重组人纤维蛋白原的克隆体M21、M25和M57的批处理运行的培养上清液的蛋白质印迹分析。对照泳道(contr)含血源性野生型纤维蛋白原(FIB3，Enzyme Research Laboratories)。箭头指示Aα链的分解产物。
图4来自表达具有扩展Aα链的变体人纤维蛋白原(Fib420)的克隆体P40的批处理运行的培养上清液的蛋白质印迹分析。泳道1是含血源性野生型纤维蛋白原(FIB3，Enzyme Research Laboratories)的对照泳道。泳道2和3含克隆体P40Aα扩展的培养上清液，分别取自比处理运行的第4天和第7天。
图5用含γ’的人纤维蛋白原瞬时转染的PER.C6细胞的培养上清液的蛋白质印迹分析(详见实例9中所述)。泳道1含表达重组γ’纤维蛋白原的PER.C6细胞的培养上清液。泳道2是对照泳道，含血源性野生型纤维蛋白原(FIB3，Enzyme Research Laboratories)。
图6通过PNGase F处理的N-糖基化的纤维蛋白原分析，接下来的SDS-PAGE分析。
泳道加载如下：
MW：分子量标准(基准，Invitrogen)
ERL FIB3：血源性纤维蛋白原(ERL)，用PNGase F处理(+)或不用PNGase F处理(-)。
PER.C6 fdg：PER.C6源性纤维蛋白原，用PNGase F处理(+)或不用PNGase F处理(-)。
每条泳道加载2μg纤维蛋白原；使用考马斯蓝(Coomassie Blue)完成染色。
使用还原的10％BisTris凝胶(NuPage，Invitrogen)进行分析。
图7ROTEM分析：凝血时间。
通过ROTEM分析确定凝血时间。200μl合并的正常(柠檬酸盐)血浆或100μl合并的正常(柠檬酸盐)血浆以1∶1的比例与Haemocomplettan(CSL Behring GmbH，Marburg，Germany)或PER.C6纤维蛋白原(均为在TBS中2mg/ml)混合。添加CaCl2至最终浓度为17mM。为了开始凝血，加入α-凝血酶至最终浓度为1U/ml。总反应体积是240μl。图中显示与纤维蛋白原以1∶1混合的血浆的凝血时间(秒)：
1.血源性纤维蛋白原(CSL Behring，Marburg，Germany)
2.PER.C6源性纤维蛋白原
所有的测量均重复两次。
图8ROTEM分析：血凝块硬度。通过ROTEM分析确定血凝块硬度。图中表示的是A10值(mm)，该值是在血浆与纤维蛋白原以1∶1混合10分钟时血凝块的硬度。实验细节与图7的图例中所述相同。
1.血源性纤维蛋白原(CSL Behring，Marburg，Germany)
2.PER.C6源性纤维蛋白原
所有的测量均重复两次。
图9ROTEM分析：血凝块形成时间。用或不用林格氏(Ringer’s)乳酸盐(Baxter，Utrecht，The Netherlands)稀释来自健康个体的柠檬酸盐血。随后给林格氏乳酸盐稀释的血液补充或不补充(对照)血源性或重组的纤维蛋白原。
图中显示如下：
1.300μl血液
2.150μl血液、100μl林格氏乳酸盐(RL)、50μl TBS
3.150μl血液、100μl RL、50μl Haemocomplettan 6.5mg/ml(最终浓度：1.1mg/ml)
4.150μl血液、100μl RL、50μl重组hFbg 6.5mg/ml(最终浓度：1.1mg/ml)
在任何情况下均使用20μl star-TEM和20μl ex-TEM试剂(Pentapharm GmbH，Munich，Germany)开始凝血。
正常范围(35-160秒)是见于健康个体的值。
160-220秒的CFT值见于止血功能正常未受损但储血减少的患者。
图10 ROTEM分析：血凝块硬度。
用或不用林格氏乳酸盐(Baxter，Utrecht，The Netherlands)稀释来自健康个体的柠檬酸盐血。随后给林格氏乳酸盐稀释的血液补充或不补充(对照)血源性或重组的纤维蛋白原。
测量条件如下：
1.300μl血液
2.150μl血液、100μl林格氏乳酸盐(RL)、50μl TBS
3.150μl血液、100μl RL、50μl Haemocomplettan 6.5mg/ml(最终浓度：1.1mg/ml)
4.150μl血液、100μl RL、50μl重组hFbg 6.5mg/ml(最终浓度：1.1mg/ml)
在任何情况下均使用20μl star-TEM和20μl ex-TEM试剂(Pentapharm GmbH，Munich，Germany)开始凝血。
正常范围(53-72mm)是见于无凝血功能障碍的健康患者的值。45-40mm的MCF值见于有出血危险指征的患者。
实例
实例1 优化的cDNA构建体的制备
在野生型(此例中指非优化形式)和由GeneArt(Regensburg，Germany)密码子优化的形式两者中合成编码人纤维蛋白原多肽链Aα、Bβ、γ、Aα-扩展(Fib420)和γ’的cDNA：(i)移除顺式作用位点(剪接位点，poly(A)信号)；(ii)修饰Aα链的重复序列；增加GC含量以延长mRNA的半衰期；(iv)使密码子使用适应CHO(密码子适应指数-CAI-＞0.95)。使用的野生型参照物，对于α链是NM_021871，对于β链是NM_005141，对于γ链是NM_000509。
将编码野生型形式中的Aα(SEQ ID NO.1)、Bβ(SEQ ID NO.2)和γ(SEQ ID NO.3)链的cDNA与编码优化的Aα(SEQ ID NO.4)、Bβ(SEQ ID NO.5)和γ(SEQ ID NO.6)的cDNA进行比较，结果示于表1。优化的Aα-扩展(Fib420)(SEQ ID NO.7)和γ’序列(SEQID NO.12)也示于表1。
野生型α(SEQ ID No.1)、β(SEQ ID NO.2)和γ(SEQ ID NO.3)链cDNA及优化的α(SEQ ID No.4)、β(SEQ ID NO.5)和γ(SEQ IDNO.6)链cDNA在pcDNA3.1衍生物(deriviate)中被亚克隆。野生型和优化的-Aα-链及Aα扩展(Fib420)均在pcDNA3.1(+)neo中，Bβ链均在pcDNA3.1(+)hygro中，γ链均在pcDNA3.1(-)hygro(Invitrogen，Carlsbad，USA)中。优化的γ′链在pcDNA3.1(+)hygro中被亚克隆。
表1
实例2 密码子优化和野生型纤维蛋白原序列在CHO细胞中的瞬时表达
为了验证优化的序列是否改善了蛋白质表达，按制造商的说明在CHO-S细胞(Invitrogen，Carlsbad，USA)中进行时转染。简言之，在补加了8mM L-谷氨酰胺的FreeStyle培养基中以0.6×106细胞/ml转染的前一天进行CHO-S细胞接种。在转染的当天，把细胞稀释到125ml摇瓶(Corning Life Sciences，Corning，USA)内的15ml培养基中至浓度为1×106个细胞/ml。将总共18.75μg的表达质粒(每个单独链为6.25μg)与0.3ml的OptiPro SFM混合。后加入0.3ml的FreeStyle MAX转染试剂(在OptiPro SFM中稀释16×)并轻轻混合。在室温下培育10分钟后，将DNA-FreeStyle MAX混合物缓缓地添加至CHO-S细胞，缓慢地旋转摇瓶。实验重复进行两次。
转染的细胞于37℃、5％的CO2的条件下在以125rpm旋转的定轨摇床平台上进行培育。在转染后的第1、2、3和6天，采集样本以测量重组纤维蛋白原的表达。
通过对人纤维蛋白原特异性的ELISA测量蛋白质表达。用100μl10μg/ml G8单克隆抗体(TNO KvL，Leiden，The Netherlands)过夜涂布合格的Maxisorb Elisa板(Nunc，Thermofisher Scientific，Roskilde，Denmark)，所述单克隆抗体是于4℃在PBS(Invitrogen)中针对人纤维蛋白原(Hoegee-de Nobel等，(1988)Thromb.5Haemost.60(3)415)培养的。然后用PBST(PBS/0.05％ Tween20片，Calbiochem，EMD，SanDiego，USA)清洗所述板，加入100μl的培养上清液样本或纤维蛋白原标准物。纤维蛋白原标准物包含溶并按以下浓度在PBST中稀释的纤维蛋白原(FIB3人纤维蛋白原，Enzyme Research Laboratories(ERL)，Swansea，UK)：100-75-50-25-12.5-6.25-3.125-0ng/ml。组织培养上清液样本在PBST中以1∶10-1∶500稀释。在室温下培育1小时后，所述板的每个孔用200μl PBST洗3次，并用纸巾轻轻拍干。然后添加100μl在PBST中以1∶10.000稀释的HRP共轭Y18单克隆抗体(TNO KvL，Leiden，The Netherlands)。在室温下将此培育1小时，接下来将所述板的每个孔用200μl PBST洗4次；每次清洗步后用纸巾将板轻轻拍干。然后向每个孔添加100μl TMB Ultra(Pierce，Thermofisher Scientific，Rockford，USA)，接着在室温下培育4-30分钟。通过向每个孔添加100μl 2M H2SO4(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)使反应停止，使用ELISA读板仪确定OD450。结果示于图1。数据清楚地表明优化的序列在样本分析的所有时间点上大幅度地改善了纤维蛋白原的表达。优化构建体的表达水平提高7.9-10.5倍。
实例3 密码子优化的纤维蛋白原420在无血清培养的CHO细胞中的瞬时表达
如实例2中所述进行转染和分析。用于本实验中的扩展Aα链cDNA序列是优化的扩展Aα序列(SEQ ID No.7)并为分泌的847个氨基酸(SEQ ID No.11)的多肽编码。
结果示于图2，其清楚地表明，纤维蛋白原变体(本例中为带有扩展Aα链的Fib420变体)的表达水平与优化的‘野生型’Aα链变体的提高的水平在同一范围内。
实施例4 在无血清条件下产生由密码子优化的纤维蛋白原cDNA稳定地表达人纤维蛋白原的CHO细胞
对于本报告中所述的细胞系的生成，如实例1中所述，使用序列优化的pcDNA3.1衍生质粒。简言之，按制造商的说明，在补加8mmL-谷氨酰胺的FreeStyle培养基(Invitrogen)中对CHO-S细胞(Invitrogen)进行次培养。按常规，细胞在含10％(体积/体积)培养基的125ml摇瓶形式(＝12.5ml)中进行培养。把培养物放入以125rpm水平摇动平台上的加湿培养箱(37℃和5％的CO2)中。按制造商的说明进行CHO-S细胞(invitrogen)的转染。转染后，将培养物在以125rpm水平摇动平台上的加湿培养箱(37℃和5％的CO2)中过夜培育。
转染次日对细胞进行计数，并接种到在补加8mM L-谷氨酰胺和选择剂遗传霉素(Invitrogen)和潮霉素B(Invitrogen)(最终浓度均为500μg/ml：以下称为“选择培养基”)的FreeStyle培养基中的96槽孔板内(接种密度为200个细胞/槽孔)。每个槽孔中的培养物体积为100-200μl。将所述板放到静止状态下的加湿培养箱(37℃和5％的CO2)中。用100μl选择培养基每周更换两次培养基。用显微镜对所述板拍摄细胞生长。10天后，抗性克隆变得明显。将这些克隆体转移至含500μl选择培养基的48槽孔板内。
当克隆体达到大约50％汇合时，对培养基取样并在-20℃储存，直到进行纤维蛋白原表达水平的ELISA分析(见实例2)。基于ELISA结果，对纤维蛋白原呈阳性的克隆体在6槽孔板中进行次培养。又在大约50％汇合时，对每个克隆体的培养基取样并通过ELISA对表达进行分析。基于ELISA数据，将选定的高表达克隆体转移至T25烧瓶中，3-5天后转移至T75cm2烧瓶中。然后将细胞转移至摇床培养物中，在那里它们在含12.5ml选择培养基的125ml摇瓶中以0.2×106个活细胞/ml的浓度进行接种。将烧瓶放在加湿培养箱(37℃和5％的CO2)中的125rpm ELMI水平摇床上。在细胞密度超过0.5×106个活细胞/ml后，将细胞在每周三次更新培养基的新的125ml摇瓶中进行次培养，接种浓度为0.2×106个活细胞/ml，直到建立起可重现的生长特征(通常在2周内)。将选定克隆的培养物保持在选择培养基中。
对于批量测试，摇床培养物始于在125ml摇瓶中补加8mM L-谷氨酰胺的12.5ml FreeStyle培养基中的选定克隆体。培养物以0.2×106个活细胞/ml进行接种。将烧瓶放在加湿培养箱中的DOS-10-ELMI水平摇床(125rpm，37℃和5％的CO2)上。在接种后的第1、2、3、4和7天时采集样本，(通过台盼蓝染色)确定总细胞计数及存活率。通过300x g离心将样本从细胞中清除，上清液保存于-20℃，直到可以确定纤维蛋白原浓度。
对于蛋白质印迹法，将含纤维蛋白原的样本与5μl 4x浓缩的NuPAGE LDS样本缓冲液(Invitrogen，Paisley，UK)与2μl 10x浓缩的NuPAGE样本还原剂(Invitrogen)混合。最终体积用去离子水(Invitrogen/Gibco)调至20μl。按制造商的说明，样本在70℃下加热10分钟，然后加载到NuPAGE Novex凝胶(10％；Bis-Tris小型凝胶，Invitrogen)上。凝胶在200V下保持1小时。通过混合44ml 25x Novex三甘氨酸转移缓冲液(Invitrogen)、836ml去矿质水和220ml甲醇(Merck)制备印迹缓冲液。所述溶液在-20℃下预冷至少30分钟。将PVDF膜(Pierce)片在甲醇中活化约15秒。然后将所述膜、6张凝胶印迹纸和2张印迹垫在印迹缓冲液中平培育几分钟。将所述膜放在印迹盒中的凝胶上，所述印迹盒放在保持-20℃冻结冷敷的印迹室(Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)中。在100V下，蛋白质穿越凝胶/膜组件的转移进行1小时。
为了在膜上显示纤维蛋白原带，将印迹在平台摇床上的50ml封闭缓冲液(在PBS中3％的低脂奶粉(Elk，Campina，Meppel，TheNetherlands)中进行培育。然后在50ml洗涤缓冲液(在PBS中0.05％Tween20)中清洗印迹10分钟，并用10ml封闭缓冲液培育1小时，所述封闭缓冲液含1/2000稀释的HR  共轭单克隆抗体Y18/PO(Koppert等，(1985)66，503)。然后在50ml洗涤缓冲液中清洗印迹2×短时间(不到1分钟)、1×15分钟和3×5分钟，接着在50ml PBS中培育10分钟。
用ECL(cat# 32209，Pierce)显示带。使用ChemiDoc-lt成像系统(UVP，California，US)捕获图像。
进行多轮稳定克隆体的生成。只收集在7天一批的培养物中每天每个细胞(pcd)产生超过3微微克的克隆体。在7天一批的培养物中，一些克隆体的产生超过5pcd。
如前所述，针对纤维蛋白原的产生以及针对产生的纤维蛋白原的质量对克隆体进行测试。一些克隆体产生高水平的完整纤维蛋白原，其它产生了完整的产物，但也显示有降解产物。与Bβ和γ链相比，Aα链对蛋白水解最敏感，所以初筛工具的筛选首先侧重于测试Aα链完整性。典型的例子示于图3，其中克隆体M21清楚地显示了Aα链的降解，而M25和M57却不是这样。针对这些样本的Bβ和γ完整性的蛋白质印迹分析证实，即使Aα链显示出蛋白水解破坏，这些链也仍然完整。
实例5 产生表达人变体Fib420的稳定细胞系
产生表达人纤维蛋白原的变体(即，具有扩展Aα链(847个氨基酸而不是625个)的Fib420变体)的稳定细胞系。使用密码子优化构建体(SEQ ID NO.7)，并且在无血清条件下产生克隆体，如实例5所述。
利用蛋白质印迹分析，检查在7天一批培养物中产生超过3pcd的两个阳性克隆体的上清液的完整扩展Aα链(Fib420)。很明显(图4)的是，即使在高产量克隆体中，Fib420的Aα链也是扩展和完整的。
实例6 在无血清条件下产生由密码子优化的纤维蛋白原cDNA稳定地表达人纤维蛋白原的PER.C6细胞
使用PER.C6细胞(Fallaux等，(1998)Hum.Gene Ther.9(13)1909)作为表达重组人纤维蛋白原的宿主。简言之，在mAb培养基(SAFC，Hampshire，UK)中的悬浮液中培养PER.C6细胞，并使用AMAXA(Lonza，Cologne，Germany)核转染装置进行转染(程序A-27，使用具有编码人纤维蛋白原蛋白质的三种不同链(Aα-、Bβ-和γ链)且含优化的cDNA链(分别为SEQ ID no.4、SEQ ID no.5和SEQ IDno.6)的Nucleofector试剂盒T)。
核转染之后，将细胞在T-烧瓶中培养1天，随后在96槽孔板(Greiner，Alphen a/d Rijn，The Netherlands)中以1000-3000个细胞/槽孔的密度进行接种。然后添加含125μg/ml遗传霉素(Invitrogen)的mAb培养基。大约三周后，在96槽孔板中的约10-30％的单个槽孔中出现克隆体，随后扩至48、24和6槽孔板，然后在T25和T80培养瓶内进行次培养。在整个扩展过程中，针对人纤维蛋白原的表达水平进行筛查。低表达和无表达的细胞被废弃。随后在摇瓶(125ml，Corning)中培养细胞。
总共在96槽孔板中确定了579个克隆体。基于在整个扩展过程中的纤维蛋白原表达水平，选出43个克隆体并在摇瓶中进行次培养。基于生长和生产特性，从这43个产生PER.C6细胞系的重组人纤维蛋白原中选出10个进行首批测试。VPRO培养基(SAFC)中的6个选定的PER.C6细胞系的批测试显示出高达279mg/L重组人纤维蛋白原的体积生产水平和19.8pcd的比生产率。最后，在VPRO培养基中进行分批培养，取样时改变培养基，这样得到高达515mg/L重组人纤维蛋白原的累积体积生产水平。
实例7 产生表达具有610个氨基酸的Aα链的人纤维蛋白原的稳定PER.C6细胞系
为了产生编码血液循环中主要形式的血浆纤维蛋白原的Aα610的表达质粒，按照标准程序，将编码Aα链的氨基酸1-610的cDNA片段(SEQUENCE ID 8)(如前述一样优化的)克隆到表达质粒pcDNA3.1(+)neo。产生重组人纤维蛋白原的PER.C6细胞系的生成与前述的(见实例6)类似。用于Aα-、Bβ-和γ链的序列分别是SEQID no.8、SEQ ID no.5、和SEQ ID no.6。
在PER.C6细胞转染和在96槽孔板中进行平板培养后，转移310个克隆体并在48槽孔板中进行筛查。在扩展路径的端部，将这310个中的24个转移至摇瓶，在首批测试后，选出其中8个进行分批培养物中的稳定性和生产率测试。
分批培养物中的产量类似于由表达625个氨基酸形式中的Aα链的细胞系获得的产量，这清楚地表明由编码610个氨基酸形式的cDNA表达Aα链不会损害表达水平。
利用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析进行的蛋白质分析表明，重组纤维蛋白原是以完整形式产生的。
实例8 基于扩展Aα链(Fib420变体)表达重组人纤维蛋白原的PER.C6细胞系
产生重组人纤维蛋白原的PER.C6细胞系的生成与前述的(见实例6和实例7)类似。总的来说，用于Aα-、Bβ-和γ链的序列分别是SEQ ID no.7、SEQ ID no.5和SEQ ID no.6。
在PER.C6细胞转染和在96槽孔板中进行平板培养后，转移325个克隆体并在48槽孔板中进行筛查。在扩展路径的端部，将24个克隆体转移至摇瓶，在连续的分批培养物测试中选出其中8个进行稳定性和表达分析。分批培养物中的产量类似于由表达610或625个氨基酸形式中的Aα链的细胞系获得的产量，这清楚地表明Aα链的扩展不损害表达水平。这是事先没有料到的，因为与含纤维蛋白原的610/625Aα链相比，血源性纤维蛋白原只含1-3％的扩展Aα链。利用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析的蛋白质分析表明，重组纤维蛋白原是以完整形式产生的，其中α链具有预期的大小(类似于CHO由Fib420产生的Aα链，如图4所示)。
例9 在无血清培养的CHO细胞中的γ’密码子优化的纤维蛋白原的瞬时表达
如实例中所述进行瞬时转染和分析。用于本实验的扩展γ’链cDNA序列是优化的扩展γ’序列(SEQ ID NO.12)并编码453个氨基酸的多肽。在移除信号肽后，形成427个氨基酸(SEQ ID NO.13的氨基酸27-453)的分泌性多肽。
结果表明，具有γ’链的纤维蛋白原变体的表达水平与优化的‘野生型’变体的提高的水平在同一范围内。通过蛋白质印迹分析法分析培养上清液。结果(图5)显示泳道1中的γ’链重组纤维蛋白原比泳道2中的‘野生型’纤维蛋白原运动慢。这表明与血源性纤维蛋白原中的γ链相比，重组纤维蛋白原中的γ’链被扩展，并且γ’链是完整和没有降解的。
实例10 重组人纤维蛋白原的纯化
按照标准方法纯化细胞培养上清液中的实例6的重组人纤维蛋白原。简言之，将(NH4)2S04添加到培养上清液中至40％饱和度，通过离心收集沉淀。随后将沉淀溶解于TBS(50mM Tris-HCI，pH7.4，100mM NaCI)，在上样缓冲液(5mM Tris-HCl pH 7.4，0.01％Tween-20，0.5M(NH4)2S04)中稀释(10倍)，并加载至HiTrap ButylFF(20ml)(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)疏水作用层析柱(Hydrophobic Interaction Column，HIC)。通过在20柱体积中含0.5-0M梯度的(NH4)2SO4的上样缓冲液洗脱结合蛋白质。通过与TMAE上样缓冲液(5mM Tris-HCI pH 8.5，0.01％Tween-20)的相对透析使HIC纯化的峰组分经历缓冲液变化，随后加载到Fractogel EMDTMAE(m)40-90μm(20ml)(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)离子交换柱上。随后利用20柱体积中的0-1M NaCI连续梯度的盐洗脱重组人纤维蛋白原。
再次通过添加(NH4)2SO4至40％的饱和度沉淀峰组分中的重组人纤维蛋白原，并通过离心收集沉淀。最后将材料溶于TBS(50mMTris-HCI，pH7.4，100mM NaCl)，并用TBS进行透析以除去任何剩余的(NH4)2SO4。
实例11 重组纤维蛋白原的功能性
对纯化的重组PER.C6纤维蛋白原(如通过在实例6中生成的细胞系所产生的)进行若干测试以评价其质量和功能性，并与血源性纤维蛋白原进行比较。通过用PNGase F处理纤维蛋白原来测试纤维蛋白原的N-糖基化，PNGase F是从蛋白质中去除N联碳水化合物结构的酰胺酶(Maley，F等，(1989)Anal.Biochem 180，195)。按制造商的说明，用PNGase F处理源自PER.C6培养物的纯化纤维蛋白原样本以及血源性纤维蛋白原(FIB3人纤维蛋白原，ERL)(New EnglandBiolabs，Ipswich，MA，US)。
结果(图6)表明，通过SDS-PAGE确定，对于血源性FIB3(ERL)和基于PER.C6的纤维蛋白原来说，PNGase F处理都造成Bβ-和γ-链的分子量减少。这与两个链都含一个N-糖基化位点(Henschen-Edman(2001)Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 936，580)的事实一致。数据显示进行前PNGase F处理和后PNGase F处理时，Bβ和γ链均可见明显的单带。这表明对于血源性纤维蛋白原来说，重组纤维蛋白原中的所有这些链都是糖基化的。人纤维蛋白原的Aα链不含N-聚糖，因此经PNGase F处理后分子量不改变。总之，这些数据表明基于纤维蛋白原的PER.C6的N-糖基化模式类似于血源性对应物。
在如Koopman等(1992)Blood 80(8)：1972中所述进行的聚合试验中进一步测试PER.C6源性纤维蛋白原的生物活性。所得结果与由CHO源性人纤维蛋白原所获得的结果类似。所述试验对纤维蛋白原在凝血酶的作用下聚合形成纤维蛋白进行了测量。通过及时记录OD350nm来测量聚合。重组PER.C6纤维蛋白原在血浆中的聚合相当于血浆和CHO源性纤维蛋白原。
添加α-凝血酶(7.5IU/ml)(ERL，Swansea，UK)和CaCl2(最终浓度为2mM)，接着在37℃培育1小时，由此测试按所述方法纯化的PER.C6源性纤维蛋白原的凝血性。然后通过在Eppendorf小瓶(15min，5000rpm，Eppendorf离心机)中离心收集产生的血凝块。将上清液转移至新试管中，将血凝块溶于碱性尿素。通过A280测量对上清液和血凝块中的蛋白质进行测量。通过ELISA(G8-Y18抗体)测量上清液的纤维蛋白原含量。血源性纤维蛋白原与PER.C6源性纤维蛋白原的结果相似：在溶解的血凝块(在上清液中5％和8％)中分别测得97％和94％的蛋白质。通过ELISA在上清液中未检测到纤维蛋白原。这些结果进一步支持血源性纤维蛋白原与重组人纤维蛋白原之间的生物学相似性。
利用ROTEM分析测量重组及血源性纤维蛋白原的凝血时间和血凝块硬度。ROTEM(Pentapharm GmbH，Munich，Germany)代表旋转凝血弹性测量计(Rotation ThromboElastoMetry)。该技术利用浸没在一次性试管中的(血)样中的旋转轴。不同凝血条件下的弹性变化导致轴的旋转变化，这在反映机械凝血参数的凝血弹性描记图中可以看到(参见例如Luddington R.J.(2005)Clin Lab Haematol.200527(2)：81)。将合并的正常(柠檬酸盐)血浆与Haemocomplettan(CSLBehring GmbH，Marburg，Germany)或PER.C6纤维蛋白原(均为在TBS中2mg/ml)进行1∶1的混合。添加CaCl2至最终浓度为17mM。为开始凝血，添加α-凝血酶到最终浓度为1IU/ml。通过ROTEM分析凝血时间和血凝块硬度。
稀释柠檬酸盐血浆在凝血时间和血凝块硬度方面是不利的。结果表明通过添加纯化的纤维蛋白原来恢复稀释血浆中的纤维蛋白原水平可将凝血时间(图7)和血凝块硬度(图8)都恢复到与血源性纤维蛋白原和重组纤维蛋白原相同的程度。由基于重组纤维蛋白原的CHO获得了类似的数据。
这些结果表明重组人纤维蛋白原会是用来补充遗传性纤维蛋白原缺乏症患者和后天性纤维蛋白原缺乏症患者的纤维蛋白原缺乏的良好替代品。
实例12 人血液中的ROTEM分析
为了进一步证明重组人纤维蛋白原可用于治疗纤维蛋白原缺乏症患者，对健康人个体的血液进行实验。通过用林格氏乳酸盐以1∶1稀释血液(Baxter，Utrecht，The Netherlands)来模拟纤维蛋白原缺乏。然后利用如实例11中所述的ROTEM分析确定血凝块形成时间和血凝块硬度。为了恢复用林格氏乳酸盐以1∶1稀释的血液中的纤维蛋白原水平，加入血源性纤维蛋白原或重组纤维蛋白原。
数据(图9)表明用林格氏乳酸盐稀释的血液的血凝块形成时间超出了正常范围，这与具有低纤维蛋白原水平的患者的临床表现一样。添加重组纤维蛋白原或血源性纤维蛋白原可使血凝块形成时间恢复到了正常范围内的水平。这表明了重组纤维蛋白原用于对低纤维蛋白原水平的患者进行静脉注射治疗的可能性。
当用林格氏乳酸盐稀释血液时，最大血凝块硬度(MCF)被降低到与患者的出血危险相关的水平(图10)。当用血源性纤维蛋白原或重组纤维蛋白原补充纤维蛋白原水平时，MCF就恢复到正常水平，从而更突出了重组纤维蛋白原对低纤维蛋白原水平的患者进行静脉注射治疗用途的可能性。要注意的是，关于Riastap在美国的批准，临床疗效基于替代疗效指标，后者是通过凝血弹性描记法测量的最大血凝块硬度。

Claims (7)

1.一种真核哺乳动物细胞或细胞系，其中所述细胞包含一种编码纤维蛋白原α、β和γ链的核苷酸序列，或一种包含所述核苷酸序列的核苷酸构建体，其中所述编码纤维蛋白原α链的核苷酸序列是根据SEQ ID No.4或7的核苷酸序列或SEQ ID No.4的核苷酸1-1887所示的编码纤维蛋白原α链Aα610的核苷酸序列，其中所述编码纤维蛋白原β链的核苷酸序列是根据SEQ ID No.5的核苷酸序列，其中所述编码纤维蛋白原γ链的核苷酸序列是根据SEQ ID No.6或12的核苷酸序列，所述细胞或细胞系以每天每个细胞至少3微微克的水平产生完整的重组纤维蛋白原。
2.一种在哺乳动物细胞培养系统中产生纤维蛋白原的方法，所述方法包括在产生纤维蛋白原的条件下培养根据权利要求1所述的细胞细胞系，可任选回收所产生的纤维蛋白原。
3.通过权利要求2所述的方法制备的纤维蛋白原制剂。
4.根据权利要求3所述的纤维蛋白原制剂，其中超过10％的α、β或γ链是变体型，其中所述变体型是γ’链或α扩展链，其中所述γ’链的核苷酸序列是根据SEQ ID No.12的核苷酸序列，其中所述α扩展链的核苷酸序列是根据SEQ ID No.7的核苷酸序列。
5.根据权利要求3-4任一项所述的纤维蛋白原制剂在制备用于止血或减少血液和体液流失的纤维蛋白封闭剂中的用途。
6.根据权利要求3-4任一项所述的纤维蛋白原制剂在制备用于治疗或预防纤维蛋白原缺乏症的药剂方面的用途。
7.根据权利要求3-4任一项所述的纤维蛋白原制剂在制备用于促进组织粘连的药物中的用途。
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