JP2011527190A - 組換えフィブリノゲン - Google Patents
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Abstract
【選択図】図10
Description
ヒトフィブリノゲンポリペプチド鎖Aα、Bβ、γ、Aα伸長型(Fib420)、およびγ’をコードするcDNAは、野生型フォーマット(本実施例中では、最適化されていないフォーマットと呼ぶ)およびコドンが最適化されたフォーマットの両方でGeneArt(Regensburg,Germany)により合成された。(i)cis作用部位(スプライス部位、ポリ(A)シグナル)を除去し、(ii)Aα鎖の反復配列を修飾し、(iii)mRNA半減期を延長するためにGC含有量を増大させ、(iv)コドン使用頻度をCHOに適応させた(コドン適応指数−CAI− >0.95)。使用された野生型参照は、アルファ鎖についてはNM_021871、ベータ鎖についてはNM_005141、およびガンマ鎖についてはNM_000509であった。
最適化された配列がタンパク質発現を向上させるかどうかを検証するために、製造元の指示に従って、CHO−S細胞(Invitrogen,Carlsbad,USA)で一過性トランスフェクションを行なった。簡潔に述べると、トランスフェクション前日に、8mMのL−グルタミンを補充したFreeStyle培養培地中に0.6×106細胞/mlでCHO−S細胞を播種した。トランスフェクション当日に、125mlの振盪フラスコ(Corning Life Sciences,Corning,USA)中の15mlの培地に1×106細胞/mlの濃度になるまで細胞を希釈した。合計18.75μgの発現プラスミド(各々の個々の鎖について6.25μg)を0.3mlのOptiPro SFMと混合した。その後、0.3mlのFreeStyle MAXトランスフェクション試薬(16×、OptiPro SFMに希釈)を添加して、穏やかに混合した。室温で10分間のインキュベーションの後、振盪フラスコをゆっくりと撹拌しながら、DNA−FreeStyle MAX混合液をCHO−S細胞に穏やかに添加した。実験は2回1組で行なった。
トランスフェクションと解析は、実施例2に記載した通りに行なった。本実験で使用された伸長型Aα鎖cDNA配列は、最適化された伸長型Aα配列(配列番号7)であり、847アミノ酸の分泌型ポリペプチド(配列番号11)をコードしている。
本報告に記載の細胞株を作製するために、配列が最適化されたpcDNA3.1由来プラスミドを実施例1に記載した通りに使用した。簡潔に述べると、CHO−S細胞(Invitrogen)を、製造元の指示に従って、8mMのL−グルタミン(Invitrogen)が補充されたFreeStyle培地(Invitrogen)に植え継いだ。ごく普通に、10%(v/v)培養培地(=12.5ml)を含む125mlの振盪フラスコフォーマットで細胞を培養した。125rpmの水平振盪プラットフォーム上の37℃、5%CO2の加湿インキュベーターに培養物を入れた。製造元の指示に従って、CHO−S細胞(invitrogen)のトランスフェクションを行なった。トランスフェクション後、125rpmの水平振盪プラットフォーム上の37℃、5%CO2の加湿インキュベーターで培養物を一晩インキュベートした。
ヒトフィブリノゲンの変異体、すなわち、伸長型Aα鎖(625アミノ酸ではなく847アミノ酸)を有するFib420変異体を発現する安定細胞株を作製した。コドンが最適化されたコンストラクト(配列番号7)を使用し、実施例5に記載した通りに、無血清条件下でクローンを作製した。
PER.C6細胞(Fallauxら(1998)Hum.GeneTher.9(13)1909)を組換えヒトフィブリノゲン発現のための宿主として使用した。簡潔に述べると、PER.C6細胞をmAb培地(SAFC,Hampshire,UK)中で懸濁培養し、AMAXA(Lonza,Cologne,Germany)ヌクレオフェクション装置(プログラムA−27)を用いて、NucleofectorキットTを用いて、ヒトフィブリノゲンタンパク質の3つの異なる鎖(Aα鎖、Bβ鎖、およびγ鎖)をコードする3つのベクターならびに最適化されたcDNA鎖(それぞれ、配列番号4、配列番号5、および配列番号6)を含む3つのベクターをトランスフェクトした。
血液循環中の優勢型の血漿フィブリノゲンのAα610をコードする発現プラスミドを作製するために、Aα鎖のアミノ酸1〜610をコードする、先に記載したように最適化されたcDNA断片(配列番号8)を、標準的な手順に従って、発現プラスミドpcDNA3.1(+)neoにクローニングした。組換えヒトフィブリノゲンを産生するPER.C6細胞株の作製は、先に記載したものと同様である(実施例6参照)。Aα鎖、Bβ鎖、およびγ鎖に用いた配列は、それぞれ、配列番号8、配列番号5、および配列番号6である。
組換えヒトフィブリノゲンを産生するPER.C6細胞株の作製は、先に記載したものと同様である(実施例6および7参照)。手短に述べると、Aα鎖、Bβ鎖、およびγ鎖に用いた配列は、それぞれ、配列番号7、配列番号5、および配列番号6である。
一過性トランスフェクションと解析は、実施例2に記載した通りに行なった。本実験で使用された伸長型γ’鎖cDNA配列は、最適化された伸長型γ’配列(配列番号12)であり、453アミノ酸のポリペプチドをコードしている。シグナル配列の除去後、427アミノ酸の分泌型ポリペプチド(配列番号13のアミノ酸27〜453)。
実施例6の組換えヒトフィブリノゲンを、標準的な方法に従って、細胞培養上清から精製した。簡潔に述べると、(NH4)2SO4を40%飽和になるまで培養上清に添加し、沈殿を遠心分離により回収した。その後、沈殿をTBS(50mM Tris−HCl、pH7.4、100mM NaCl)に溶解し、ローディング緩衝液(5mM Tris−HCl pH7.4、0.01% Tween−20、0.5M (NH4)2SO4)に希釈し(10倍)、HiTrap Butyl FF(20ml)(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)疎水性相互作用カラム(HIC)に充填した。結合タンパク質を、20カラム容量中0.5−0Mの(NH4)2SO4の(NH4)2SO4勾配を含むローディング緩衝液で溶出した。HIC精製のピーク画分を、TMAEローディング緩衝液(5mM Tris−HCl pH8.5、0.01% Tween−20)に対する透析により緩衝液交換にかけ、その後、Fractogel EMD TMAE(m) 40−90μm(20ml)(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)イオン交換カラムに充填した。その後、20カラム容量中0−1MのNaClの連続塩勾配を用いて、組換えヒトフィブリノゲンを溶出した。(NH4)2SO4を40%飽和になるまで添加することにより、ピーク画分中の組換えヒトフィブリノゲンを再び沈殿させ、遠心分離により回収した。最後に、この物質をTBS(50mM Tris−HCl、pH7.4、100mM NaCl)に溶解し、TBSに対して透析して、残りの(NH4)2SO4を全て除去した。
品質と機能性を評価するためにおよび血漿由来フィブリノゲンと比較するために、実施例6で作製された細胞株により産生された、精製組換えPER.C6フィブリノゲンをいくつかの試験にかけた。フィブリノゲンのN−グリコシル化は、N−結合型の糖質構造をタンパク質から除去するアミダーゼ(Maley,Fら(1989)Anal.Biochem.180,195)である、PNGアーゼFでフィブリノゲンを処理することにより試験した。PER.C6培養物に由来する精製フィブリノゲンと血漿由来フィブリノゲン(FIB3ヒトフィブリノゲン、ERL)の試料を、製造元の指示に従って、PNGアーゼF(New England Biolabs,Ipswich,MA,US)で処理した。
組換えヒトフィブリノゲンをフィブリノゲン欠損症患者の治療に使用することができることをさらに示すために、健康なヒト個体由来の血液で実験を行なった。血液を乳酸リンゲル(Baxter,Utrecht,The Netherlands)と1:1に希釈することにより、フィブリノゲン欠損を模倣した。次に、実施例11に記載されたROTEM解析を用いて、凝血塊形成時間と凝血塊硬度を測定した。乳酸リンゲルで1:1に希釈した血液中のフィブリノゲンレベルを回復させるために、血漿由来フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンのいずれかを添加した。
Claims (21)
- 哺乳動物細胞培養系での発現に最適化されたフィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列。
- COS細胞、BHK細胞、NS0細胞、CHO細胞、Sp2/0、またはヒト細胞培養系での発現に最適化された、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
- PER.C6細胞またはHEK293細胞培養系での発現に最適化された、請求項1または2に記載のヌクレオチド配列。
- 好ましくは少なくとも0.95のコドン適応指数で、コドン使用頻度をCHO細胞に適応させるにことより最適化された、請求項1〜3に記載のヌクレオチド配列。
- 少なくとも55%のGC含有量を有する、請求項1〜4に記載のヌクレオチド配列。
- そのそれぞれの最適化されていない対応物と少なくとも70%の同一性を示す、請求項1〜5に記載のヌクレオチド配列。
- コドンが最適化されたフィブリノゲン鎖がcis作用部位を含まない、請求項1〜6に記載のヌクレオチド配列
- 配列番号4もしくは7のヌクレオチド配列、もしくはその部分、または配列番号4もしくは7と少なくとも85%同一な配列を有し、かつフィブリノゲンアルファ鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項1〜7に記載のヌクレオチド配列。
- 配列番号5もしくは8のヌクレオチド配列、もしくはその部分、または配列番号5と少なくとも85%同一な配列を有し、かつフィブリノゲンベータ鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項1〜7に記載のヌクレオチド配列。
- 配列番号6もしくは12のヌクレオチド配列、もしくはその部分、または配列番号6もしくは12と少なくとも85%同一な配列を有し、かつフィブリノゲンガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項1〜7に記載のヌクレオチド配列。
- 請求項1〜10に記載のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドコンストラクト。
- 請求項1〜10に記載のヌクレオチド配列または請求項11に記載のヌクレオチドコンストラクトを含む細胞。
- インタクトな組換えフィブリノゲンを少なくとも3ピコグラム/細胞/日のレベルで産生する細胞または細胞株。
- 真核細胞培養系でフィブリノゲンを産生する方法であって、フィブリノゲンが産生される条件下で請求項12または13に記載の細胞または請求項13に記載の細胞株を培養すること、および任意で、産生された該フィブリノゲンを回収することを含む、方法。
- 請求項14に記載の方法により調製されるフィブリノゲン製剤。
- 前記アルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖の10%よりも多くが変異体型であるフィブリノゲン製剤。
- 前記変異体型がガンマプライム鎖またはアルファ伸長鎖である、請求項16に記載のフィブリノゲン製剤。
- 医薬品として、組織シーラントとして、または組織の接着を促進するために使用される、請求項14〜17に記載のフィブリノゲン製剤。
- フィブリノゲン欠損症の治療または予防用の医薬品を調製するための請求項14〜18に記載のフィブリノゲン製剤の使用。
- 前記フィブリノゲンの85%よりも多くがインタクト形態である、組換え技術により産生されるフィブリノゲン製剤。
- インタクトな組換えフィブリノゲンを産生する細胞または細胞株を選択する方法であって、2つの抗体の使用を含み、ここで、一方の抗体が前記アルファ鎖のインタクトなN末端に選択的に結合し、もう一方の抗体が前記アルファ鎖のインタクトなC末端に選択的に結合する、方法。
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