JP2021078526A - 第ｉｘ因子融合タンパク質及びそれらの製造方法及び使用方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】第ＩＸ因子融合タンパク質及びそれらの製造方法及び使用方法の提供。【解決手段】本発明は、少なくとも１のＸＴＥＮなどの異種部分を含む第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質を提供する。本発明は、上記ＦＩＸ融合タンパク質の製造方法及び使用方法を更に開示する。本発明は、ＦＩＸポリペプチドと、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合され、長さが４２のアミノ酸より長く且つ１４４のアミノ酸より短いアミノ酸配列を含むＸＴＥＮとを含むＦＩＸ融合タンパク質も提供する。本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、それを必要とする患者における凝固疾患もしくは疾病の予防、治療、改善、または管理方法を提供することを含むいくつかの用途を有する。【選択図】なし

Description

電子的に提出した配列表の参照
本出願と共に提出したＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：２１５９＿４６６ＰＣ０３
＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ:６８８，１５４バイト；及び作成
日：２０１６年８月２日）中で電子的に提出した配列表の内容は、参照によりその全体が
本明細書に援用される。
血友病Ｂ（クリスマス病としても知られる）は、世界で最も多く見られる遺伝性出血障
害の１つである。血友病は、インビボ及びインビトロでの血液凝固活性の低下を引き起こ
し、罹患した個体の生涯にわたって広範な医学的監視を要する。介入を行わない場合、罹
患した個体は関節内における突発性出血を起こすこととなり、該出血によって重度の痛み
及び衰弱性の不可動状態を生じ；筋肉中への出血は筋組織における血液貯留を引き起こし
；咽喉及び頸部の突発性出血は、直ちに治療しなければ窒息を引き起こす場合があり；腎
出血を引き起こし；及び手術、軽度の偶発的な受傷、または抜歯の後の重篤な出血もよく
見られる。
正常なインビボでの血液凝固は、少なくとも、セリンプロテアーゼ第ＩＩ因子（プロト
ロンビン）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子及び第ＸＩ因子（可溶性血漿タンパク
質）；膜貫通タンパク質組織因子及び血漿タンパク質第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子を含む補助
因子；フィブリノゲン、トランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩ因子、リン脂質（活性化血小
板を含む）、及びカルシウムを必要とする。一部のインビトロ凝固試験に関しては、カリ
クレイン、高分子量キニノゲン、及び第ＸＩＩ因子を含む更なるタンパク質が必要であり
、これらは病理学的条件下においてインビボで役割を果たし得る。
血友病においては、血液凝固が特定の血漿凝固因子の欠損によって妨げられる。血友病
Ｂは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質の合成の低下もしくは該ＦＩＸタンパク質の欠損
のいずれかに起因し得るＦＩＸの不足または活性が低い欠陥のあるＦＩＸ分子よって起こ
る。血友病の治療は、ＦＩＸを高度に富化させた外因性因子濃縮物によって、欠損した凝
固因子を置換することによって行われる。しかしながら、かかる濃縮物を血液からつくり
出すことは、以下に記載するように技術的困難を伴う。
血漿からのＦＩＸの精製（血漿由来ＦＩＸ；ｐｄＦＩＸ）では、ほぼ、完全にγ−カル
ボキシル化されたＦＩＸのみが得られる。しかしながら、ＦＩＸは血漿中に低濃度（５μ
ｇ／ｍＬ）でしか存在しないために、かかる血漿からのＦＩＸの精製は非常に困難である
。Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：４５１ ４５９
（１９７５）。更に、血液からの精製はＨＩＶ及びＨＣＶなどの感染性因子の除去または
不活性化を要する。加えて、ｐｄＦＩＸは半減期が短く、そのために頻繁に投与する必要
がある。組換え第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）も利用可能であるが、ｐｄＦＩＸと同様の短い半
減期及び頻繁な投与の必要性（例えば、予防のために週に２〜３回）という悩みがある。
死亡率の低下、関節損傷の予防及び生活の質の改善は、血漿由来及び組換えＦＩＸの開
発による重要な成果であった。長期的に出血から保護することは、血友病Ｂ患者の治療に
おけるもう１つの重要な進歩となる。したがって、有効な活性を維持しながら半減期がよ
り長い、改良された組換えＦＩＸに対する必要性が依然として存在する。
Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：４５１ ４５９（１９７５）
少なくとも１のＸＴＥＮを含む第ＩＸ因子融合タンパク質が開示される。一態様におい
て、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸１０３、配
列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９
、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１
７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ
酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より
選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入された少なく
とも１のＸＴＥＮとを含み、凝血促進活性を示すＦＩＸ融合タンパク質を提供する。
本発明は、ＦＩＸポリペプチドと、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合され、長さ
が４２のアミノ酸より長く且つ１４４のアミノ酸より短いアミノ酸配列を含むＸＴＥＮと
を含むＦＩＸ融合タンパク質も提供する。
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、それを必要とする患者における凝固疾患もしくは疾
病の予防、治療、改善、または管理方法を提供することを含むいくつかの用途を有する。
一実施形態において、上記方法は、有効量の本明細書に記載のＦＩＸ融合タンパク質を（
例えば、皮下投与によって）投与するステップを含む。
本発明はまた、ＦＩＸポリペプチドの半減期の延長方法であって、配列番号２のアミノ
酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のア
ミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２
のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番
号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせか
らなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内にＸＴ
ＥＮを挿入し、それによってＦＩＸ融合タンパク質を構築することを含み、上記ＦＩＸタ
ンパク質が凝血促進活性を示す、上記方法も提供する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のア
ミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２
のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番
号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配
列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるア
ミノ酸に対応する挿入部位で前記ＦＩＸポリペプチド内に挿入された少なくとも１のＸＴ
ＥＮとを含み、凝血促進活性を示すＦＩＸ融合タンパク質。
（項目２）
前記挿入部位が、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番
号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４及びそれらの任意の組み合わせから
なる群より選択されるアミノ酸に対応する、項目１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
（項目３）
前記ＸＴＥＮが、少なくとも約５アミノ酸、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約
１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、約７２の
アミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む
、項目１または２に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
（項目４）
第２のＸＴＥＮを更に含む、項目１〜３のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質
。
（項目５）
前記ＸＴＥＮが、配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で前記ＦＩＸポリペ
プチド内に挿入され、第２のＸＴＥＮが前記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された、
項目４に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
（項目６）
Ｆｃドメインを更に含む、項目１〜５のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
（項目７）
第２のＦｃドメインを含む、項目６に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
（項目８）
２のポリペプチド鎖を含み、前記第１のポリペプチド鎖が前記Ｆｃドメインに融合され
た前記ＦＩＸポリペプチドを含み、前記第２のポリペプチド鎖が第２のＦｃドメインを含
み、前記第１のＦｃドメインと前記第２のＦｃドメインとが共有結合によって会合してい
る、項目７に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
（項目９）
前記ＦＩＸポリペプチドがＲ３３８Ｌ ＦＩＸ変異体である、項目１〜８のいずれか１
項に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質をコードする配列を含む単離
されたポリヌクレオチド。
（項目１１）
項目１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目１２）
項目１０に記載のポリヌクレオチドまたは項目１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目１３）
項目１〜９のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質、項目１０に記載のポリヌク
レオチド、項目１１に記載の発現ベクター、または項目１２に記載の宿主細胞、及び薬学
的に許容される担体を含む組成物。
（項目１４）
有効量の項目１〜９のいずれか１項に記載のＦＩＸ融合タンパク質、項目１０に記載の
ポリヌクレオチド、項目１１に記載の発現ベクター、項目１２に記載の宿主細胞、または
項目１３に記載の組成物を投与することを含む、それを必要とする患者における凝固疾患
もしくは疾病の予防、治療、改善、または管理方法。
（項目１５）
第１の連鎖及び第２の連鎖を含む第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質であって、
ａ．前記第１の連鎖が、
ｉ．ＦＩＸポリペプチドと、
ｉｉ．配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で前記ＦＩＸポリペプチド内に
挿入され、少なくとも約７２のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１のＸＴ
ＥＮと、
ｉｉｉ．前記少なくとも１のＸＴＥＮの前記ＦＩＸポリペプチドに融合された第１のＦ
ｃドメインと
を含み、
ｂ．前記第２の連鎖が第２のＦｃドメインを含み、
前記第１のＦｃドメインと前記第２のＦｃドメインとが共有結合によって会合しており、
凝血促進活性を示す前記ＦＩＸ融合タンパク質。
更なる発明の実施形態は以下の説明及び図面から明らかになろう。
参照による援用
本明細書に開示される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許または
特許出願が、具体的且つ個別に参照により援用されることが示されているのと同様の程度
に、参照により本明細書に援用される。
種々の挿入部位で（例えば、配列番号２のアミノ酸に対応する、アミノ酸５２、アミノ酸５９、アミノ酸６６、アミノ酸８０、アミノ酸８５、アミノ酸８９、アミノ酸１０３、アミノ酸１０５、アミノ酸１１３、アミノ酸１２９、アミノ酸１４２、アミノ酸１４９、アミノ酸１６２、アミノ酸１６６、アミノ酸１７４、アミノ酸１８８、アミノ酸２０２、アミノ酸２２４、アミノ酸２２６、アミノ酸２２８、アミノ酸２３０、アミノ酸２４０、アミノ酸２５７、アミノ酸２６５、アミノ酸２７７、アミノ酸２８３、アミノ酸２９２、アミノ酸３１６、アミノ酸３４１、アミノ酸３５４、アミノ酸３９２、アミノ酸４０３、及びアミノ酸４１３で）挿入された、または上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された、４２のアミノ酸のＸＴＥＮ（例えばＡＥ４２）を含むＦＩＸ融合タンパク質の活性を示すグラフである。Ｃ末端融合ＸＴＥＮ配列は、ＦＩＸと上記Ｃ末端融合物との間にトロンビン開裂性部位を含む。Ｙ軸は、発色アッセイによる、馴化培地中の、ベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の活性のパーセントとしてのＦＩＸ活性を示す。Ｘ軸は特定の挿入部位を、（配列番号２に対応する）アミノ酸番号及び１文字のアミノ酸の略称として示す。ＦＩＸの対応するドメイン（例えば、ＧＬＡ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、リンカー、ＡＰ、及び触媒ドメイン）、リンカー領域、ならびにＣ末端がＸ軸の下に示される。 種々の挿入部位で（例えば、配列番号２のアミノ酸に対応するアミノ酸１０３、アミノ酸１０５、アミノ酸１４２、アミノ酸１４９、アミノ酸１６２、アミノ酸１６６、アミノ酸１７４、アミノ酸２２４、アミノ酸４１３で）挿入された、または上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端（アミノ酸４１５）に融合された、４２のアミノ酸の（ＡＥ４２）、７２のアミノ酸の（ＡＥ７２）、１４４のアミノ酸の（ＡＥ１４４）、２８８のアミノ酸の（ＡＥ２８８）、及び８６４のアミノ酸の（ＡＥ８６４）ＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質の活性を示すグラフである。Ｙ軸は、発色アッセイによる、馴化培地中の、ベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の活性のパーセントとしてのＦＩＸ活性を示す。Ｘ軸は、各挿入部位及び特定の挿入部位のドメイン（例えば、ＥＧＦ２、ＡＰ、及び触媒ドメイン）または領域（例えば、リンカー及びＣ末端）を、（配列番号２に対応する）アミノ酸番号として示す。矢印は、更なる実験のために選択された挿入部位を示す（図３の３Ａ〜３Ｂを参照のこと）。 ３ＡはＲ３３８Ｌ ＦＩＸ変異体の上記領域及びドメインの概略図である。特定のアミノ酸残基（例えば、Ｎ１０５、Ｄ１６６、及びＥ２２４）及びＣ末端が、潜在的な異種部分、例えばＸＴＥＮの挿入部位として強調されている。３Ｂは３種の異なる角度からのブタＦＩＸ（ＰＤＢ：１ＰＦＸ）の３次元構造の図解を示す図である。挿入部位Ｎ１０５、Ｄ１６６、及びＥ２２４、Ｃ末端、及びＲ３３８Ｌ突然変異体の位置（例えば、Ｒ３３８Ｌ ＦＩＸ変異体における）を表示する。 １もしくは２のＸＴＥＮ（例えば、４２、７２、１４４、及び２８８のアミノ酸のＸＴＥＮ）、または１のＸＴＥＮ及び１のＦｃドメイン、またはＦＩＸＦｃを含むＦＩＸ融合タンパク質の相対的な活性をまとめた図である。Ｙ軸は、発色アッセイによる、馴化培地中の、ベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の活性のパーセントとしてのＦＩＸ活性を示す。Ｘ軸は構築物番号を示し、Ｘ軸の下の表は試験した各構築物のＸＴＥＮ及びＦｃの組成を示す。ＥＧＦ２（１０５）、ＡＰ（１６６）、６０ループ（２２４）、及びＣ末端ＸＴＥＮまたはＦｃは、ＸＴＥＮまたはＦｃが挿入または融合された位置を示す。Ｘ軸の下の表の各ボックス中の数字（ＸＴＥＮの大きさを示す、例えば４２、７２、１４４、及び２８８）ならびに「Ｆｃ」は、いずれの部分が当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されているかまたは該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されているかを示す。 ５Ａは、血友病Ｂマウスにおいて単回ボーラス静脈内投与後に測定し、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃと比較した、種々の長さのトロンビン開裂性Ｃ末端ＸＴＥＮ融合物を有する様々なＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ＦＩＸ−ＣＴ．２８８（２８８のアミノ酸のＸＴＥＮ、例えばＡＥ２８８）及びＦＩＸ−ＣＴ．８６４（８６４のアミノ酸のＸＴＥＮ、例えばＡＥ８６４））の、時間に対する投与したＦＩＸの凝固活性の血漿百分位数を示すグラフである。５Ｂは、血友病Ｂマウスにおいて単回ボーラス静脈内投与後に測定し、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃと比較した、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインに挿入された種々の長さのＸＴＥＮ融合物を有する様々なＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ＦＩＸ−ＡＰ．１４４、ＦＩＸ−ＡＰ．７２、及びＦＩＸ−ＡＰ．４２）の、時間に対する投与したＦＩＸの凝固活性の血漿百分位数を示すグラフである。５Ｃは、５Ａ及び５Ｂに示した単回静脈内ボーラス投与したＦＩＸ融合タンパク質の、計算した薬物動態学的パラメータの編集したグラフである。Ｙ軸には、表示した分子のそれぞれの血漿活性回収率の百分位数を示す。Ｘ軸は計算した平均滞留時間（ＭＲＴ、単位：時間）を示し、円の面積は用量当たりの計算した相対的な曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表わす。 ６Ａは、血友病Ｂマウスにおいて単回ボーラス静脈内投与後に測定し、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃと比較した、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインに挿入された種々の長さのＸＴＥＮ融合物を有する様々なＦＩＸ融合タンパク質（例えばＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２及びＦＩＸＦｃ−ＡＰ．４２）またはＥＧＦ２ドメインに挿入された上記ＸＴＥＮ融合物を有する上記融合タンパク質（例えばＦＩＸＦｃ−ＥＧＦ．４２）の、時間に対する投与したＦＩＸの凝固活性の血漿百分位数を示すグラフである。６Ｂは、６Ａに示した単回静脈内ボーラス投与したＦＩＸ融合タンパク質の計算した薬物動態学的パラメータの編集したグラフである。Ｙ軸には、表示した分子のそれぞれの血漿活性回収率の百分位数を示す。Ｘ軸は計算した平均滞留時間（ＭＲＴ、単位：時間）を示す。円の面積は用量当たりの計算した相対的な曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表わす。 ７Ａは、血友病Ｂマウスにおいて単回ボーラス皮下投与後に測定し、ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃと比較した、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された２８８のアミノ酸のトロンビン開裂性ＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク（ｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８）、ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内に挿入された７２のアミノ酸のＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質（ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）、及びＦＩＸポリペプチドのＥＧＦ２ドメイン内に挿入された４２のアミノ酸のＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質（ｒＦＩＸＦｃ−ＥＧＦ２．４２）の、時間に対する投与したＦＩＸの凝固活性の血漿百分位数を示すグラフである。７Ｂは、７Ａに示した単回皮下ボーラス投与したＦＩＸ融合タンパク質の計算した薬物動態学的パラメータの編集したグラフである。Ｙ軸には、表示した分子のそれぞれの生物学的利用能の百分位数を示す。Ｘ軸は計算した平均滞留時間（ＭＲＴ、単位：時間）を示す。円の面積は用量当たりの計算した相対的な曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表わす。 ８Ａは、回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ）によって測定した、ヒト血友病Ｂ血液における、ｒＦＩＸＦｃ及びＦＩＸのＡＰドメイン内に挿入された７２のアミノ酸のＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ−ＸＴＥＮ．７２）の凝固時間（単位：秒）のグラフである。８Ｂは、ヒト血友病Ｂ血液における、ｒＦＩＸＦｃ及びＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ−ＸＴＥＮ．７２）のアルファ角（単位：度）のグラフである。８Ｃは、ヒト血友病Ｂ血液における、ｒＦＩＸＦｃ及びＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ−ＸＴＥＮ．７２）の最大血餅硬度（ＭＣＦ）（単位：ｍｍ）のグラフである。 尾切断出血モデルにおいてｒＦＩＸＦｃと比較したｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の急性の有効性を示すグラフである。示した結果は、表示した治療薬及び投与に対する、投与５分後における、３０分間にわたる各個体の及び中央値での失血量（μｌ）である。アスタリスクは、ビヒクル対他の全ての治療薬に関して有意なｐ値であることを示している。データは、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を投与したマウスにおいて、ｒＦＩＸＦｃと比較して類似のまたは向上した有効性を示している。 尾静脈の切断後の時間（単位：時間）（Ｘ軸）に対してプロットした、生存するＨｅｍＢマウスのパーセンテージ（Ｙ軸）を示すグラフである。全てのマウスに、尾静脈の切断の７２時間前に、ＦＩＸＦｃ（点線）を静脈内でまたはＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を皮下で、表示したＩＵ／ｋｇ（ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２：１００ＩＵ／ｋｇ（黒丸）、５０ＩＵ／ｋｇ（灰色の三角）、及び１５ＩＵ／ｋｇ（灰色の逆三角）；ｒＦＩＸＦｃ：１００ＩＵ／ｋｇ（白丸）、５０ＩＵ／ｋｇ（白三角）、及び１５ＩＵ／ｋｇ（白の逆三角）；ビヒクル（閉じた灰色の丸）で事前投与した。ｒＦＩＸＦｃまたはＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２のいずれかを投与したマウスの生存率のプロットは、ビヒクル処置したマウスと比較した場合、全て有意に異なる（ｐ＜０．０００１、ログランク（マンテル・コックス）検定。 １１Ａは、時間に対してプロットした、静脈内注射（破線）または皮下注射（実線）のいずれかによって単回ボーラス（２００ＩＵ／ｋｇ）のｒＦＩＸ（灰色）またはｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２融合タンパク質（黒）を投与した血友病Ｂマウスの、１段階血漿アッセイによって測定したＦＸ活性の血漿レベルを示すグラフである。１１Ｂは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ６．２．１ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｃｅｒｔａｒａ）を用いたノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を用いて決定された薬物動態学的パラメータを示す図である。 １２ＡはｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２一本鎖Ｆｃのドメイン構造を図解する模式図である。１２ＢはｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２二本鎖Ｆｃのドメイン構造を示す模式図である。「ＦＩＸ ＨＣ」とはＦＩＸの重鎖を指し、「ＦＩＸ ＬＣ」とはＦＩＸの軽鎖を指し、これはＦＩＸのＥＧＦ及びＧＬＡドメインを含み、ＡＰとはＦＩＸの活性化ペプチドを指す。 実施例で用いられるＦＩＸ−ＸＴＥＮ構築物を、一致する配列番号、説明及びプラスミドコードでまとめた表である。
本開示は、ＦＩＸポリペプチド及び少なくとも１の異種部分を含むＦＩＸ融合タンパク
質、ならびにその製造及び使用方法を提供する。ある特定の態様において、本ＦＩＸ融合
タンパク質は、上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入された、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末
端に融合された、またはそれらの両方である少なくとも１の異種部分を含み、本ＦＩＸ融
合タンパク質は凝血促進活性を示す。特定の態様において、上記異種部分はＸＴＥＮであ
る。
Ｉ．定義
本開示を通じて、用語“ａ” ｅｎｔｉｔｙ（実体）または“ａｎ” ｅｎｔｉｔｙと
は１または複数の当該実体を指し、例えば、「ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ポリ
ヌクレオチド）」は１または複数のポリヌクレオチドを表すと理解されるべきものである
。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１または複数の」、及び「少なくとも１の
」という用語は、本明細書では同義で用いることができる。
更に、本明細書では、「及び／または」とは、２の指定された特徴または構成要素のそ
れぞれの、それらの他方を伴うまたは伴わない明示と解釈されるべきものである。したが
って、本明細書における「Ａ及び／またはＢ」などの句において用いられる「及び／また
は」という用語は、「Ａ及びＢ」と、「ＡまたはＢ」と、「Ａ」（単独）と、「Ｂ」（単
独）とを含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」などの句において用い
られる「及び／または」という用語は、以下の態様、すなわち、Ａ、Ｂ及びＣと；Ａ、Ｂ
またはＣと；ＡまたはＣと；ＡまたはＢと；ＢまたはＣと；Ａ及びＣと；Ａ及びＢと；Ｂ
及びＣと；Ａ（単独）と；Ｂ（単独）と；Ｃ（単独）とのそれぞれを包含することを意図
する。
本明細書において、態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語によって何処
に記載されていても、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「〜
から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」という言葉
で記述される他の類似の態様も提供されるということが理解されるべきものである。
別段の定義がなされない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、
本開示が関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有す
る。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２
ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ
Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏ
ｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖ
ｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示にお
いて用いられる多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）に承認された形態によって表示
される。数値範囲は当該範囲を画定する数字を含む。別段の表示がない限り、アミノ酸配
列は、アミノからカルボキシの向きで左から右に書かれる。本明細書に記載される見出し
は本開示の種々の態様を限定するものではなく、該態様は本明細書全体を参照することに
よって理解することができる。したがって、このすぐ後に定義される用語は、明細書全体
を参照することにより完全に定義される。
本明細書では、「約」という用語は、概略、おおまかに、おおよそ、またはほぼを意味
するために用いられる。「約」という用語が数値範囲と共に用いられる場合には、記載さ
れた数値の上下に境界を拡張することによって当該範囲を変更する。一般に、「約」とい
う用語は、数値を記載された値の上下に、例えば１０パーセントの上下（高低）の変動に
より変更することができる。
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、単一の核酸ならびに複数
の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子または構築物、例えばメッセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ある特定の実施形態
において、ポリヌクレオチドは、在来型のホスホジエステル結合または非在来型の結合（
例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に存在するようなアミド結合）を含む。「核酸」という
用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１または複数の核酸セグメント、例えばＤ
ＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その本
来の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター
中に含まれるＦＩＸポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的
のために単離されたと考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異
種宿主細胞中に維持されるかまたは溶液中の他のポリヌクレオチドから（部分的にまたは
実質的に）精製された組換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子とし
ては、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が挙げられる
。本発明に係る単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に生成したかかる分子
を更に包含する。更に、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハンサー、
リボソーム結合部位、または転写終結シグナルなどの調節エレメントを含んでいてもよい
。
本明細書では、「コード領域」または「コード配列」とは、アミノ酸に翻訳可能なコド
ンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終結コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡ
Ａ）は一般的にはアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると見なしてもよい
が、但し、いずれの隣接する配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写終結
因子、イントロンなどはコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、一般的には、
得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドンと、得られるポリ
ペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳終結コドンとによって決定され
る。本発明の２以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一の
ベクター上に、または別個の複数のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別個の（異なる
）複数のベクター上に存在してもよい。その結果、単一のベクターが単一のコード領域の
みを含有していてもよく、または２以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば以下に
説明するように、単一のベクターが結合ドメイン−Ａ及び結合ドメイン−Ｂを別々にコー
ドしてもよいこととなる。更に、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本
発明の結合ドメインをコードする核酸に融合しているかまたは融合していないかのいずれ
かの異種コード領域をコードしていてもよい。異種コード領域としては、限定はされない
が、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊化したエレメントまたはモ
チーフが挙げられる。
哺乳動物細胞によって分泌されるある特定のタンパク質は分泌シグナルペプチドと会合
しており、該分泌シグナルペプチドは、粗面小胞体を通る成長タンパク質鎖の輸送が開始
されると成熟タンパク質から切断される。当業者であれば、シグナルペプチドは一般に当
該ポリペプチドのＮ末端に融合しており、完全なすなわち「全長」ポリペプチドから切断
される、分泌された、すなわち「成熟した」形態のポリペプチドを生成することを認識し
ている。ある特定の実施形態においては、天然のシグナルペプチド、または作動可能に会
合している当該ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持している、その配列の機能性誘
導体。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子（ＴＰＡ）もしくはマウスβ−グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはそれ
らの機能を有する誘導体を用いることもできる。
「下流」という用語は、基準となるヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレ
オチド配列を指す。ある特定の実施形態において、下流のヌクレオチド配列は転写の開始
点に続く配列に関係する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に
位置する。「下流」は、基準となるヌクレオチド配列のＣ末端側に位置するペプチド配列
を指す場合もある。
「上流」という用語は、基準となるヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレ
オチド配列を指す。ある特定の実施形態において、上流のヌクレオチド配列はコード領域
または転写の開始点の５’側に位置する配列に関係する。例えば、殆どのプロモーターは
転写の開始部位の上流に位置する。「上流」は、基準となるヌクレオチド配列のＮ末端側
に位置するペプチド配列を指す場合もある。
本明細書では、「調節領域」という用語は、コード領域の上流（５’側非コード配列）
、内部、または下流（３’側非コード配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮ
Ａプロセシング、安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節領域
としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、Ｒ
ＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を挙げることができ
る。コード領域が真核細胞における発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナル及び転
写終結配列は通常、当該コード配列に対して３’側に位置することとなる。
例えばポリペプチドである遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター
及び／または１もしくは複数のコード領域に作動可能に会合している他の転写または翻訳
調節エレメントを含んでいてもよい。作動可能な会合において、例えばポリペプチドであ
る遺伝子産物のためのコード領域は、上記遺伝子産物の発現を１または複数の調節領域の
影響下または制御下に置くような形態で、上記調節領域（複数可）に会合している。例え
ば、プロモーターの機能を誘導することによって、コード領域によってコードされる遺伝
子産物をコードするｍＲＮＡが転写され、且つ上記プロモーターと上記コード領域との間
の連結の特質が、上記プロモーターの上記遺伝子産物の発現を指示する能力に干渉しない
、または転写されるＤＮＡテンプレートの能力に干渉しないならば、当該コード領域とプ
ロモーターとは「作動可能に会合している」。プロモーター以外の他の転写調節エレメン
ト、例えばエンハンサー、作動因子、抑制因子、及び転写終結シグナルも、コード領域に
作動可能に会合して、遺伝子産物発現を指示することができる。
種々の転写調節領域が当業者に公知である。これらの転写調節領域としては、限定はさ
れないが、サイトメガロウイルス（最初期プロモーター、イントロン−Ａと共に）、シミ
アンウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイル
ス）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントなどの、但しこれらに限定されない
、脊椎動物細胞で作用する転写調節領域が挙げられる。他の転写調節領域としては、アク
チン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンなどの脊椎動物
遺伝子に由来する転写調節領域、ならびに真核細胞中で遺伝子発現を制御することができ
る他の配列が挙げられる。更なる好適な転写調節領域としては、組織特異的プロモーター
及びエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロ
ンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
同様に種々の翻訳調節エレメントが当業者に公知である。これらの翻訳調節エレメント
としては、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び終結コドン、ならびにピコルナウイ
ルス由来のエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＣＩＴＥ配列とも呼ば
れるＩＲＥＳ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書では、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＲＮＡ
またはポリペプチドを産生するプロセスを指す。発現には、限定はされないが、当該ポリ
ヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）
、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他の
ＲＮＡ産物への転写、及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。発現は「遺伝子
産物」を産生する。本明細書では、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって
産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれか
であってよい。本明細書に記載の遺伝子産物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化また
はスプライシングを伴う核酸、または、翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂
質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、またはタンパク質分解切断を伴うポリ
ペプチドを更に包含する。
「ベクター」とは、宿主細胞への核酸のクローニング及び／または導入のための任意の
ビヒクルを指す。ベクターはレプリコンであってもよく、レプリコンには、別の核酸セグ
メントが複製されるように、該別のセグメントが結合する。「レプリコン」とは、インビ
ボでの自律複製の単位として作用する、すなわちそれ自体の制御下で複製する能力を有す
る任意の遺伝エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス
）を指す。「ベクター」という用語は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を
細胞に導入するためのウイルス及び非ウイルスビヒクルの両方を包含する。例えば、プラ
スミド、改変真核生物ウイルス、または改変細菌ウイルスを含む多数のベクターが公知で
あり、本技術分野で使用されている。適宜のベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、適
宜のポリヌクレオチド断片を、相補的な付着端を有する選択されたベクターに結合するこ
とによって実現することができる。
ベクターを、当該ベクターを取り込んだ細胞を選別または識別する選別可能なマーカー
またはレポーターをコードするように操作してもよい。選別可能なマーカーまたはレポー
ターの発現によって、当該ベクター上に含まれる他のコード領域を取り込んで発現する宿
主細胞を識別及び／または選別することが可能になる。本技術分野において公知であり且
つ使用されている選別可能なマーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマ
イシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマ
イシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミド等に対する耐性を付与する遺伝子、及び表
現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわちアントシアニン調節遺伝子、イソペンタ
ニルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。本技術分野において公知であり且つ使用
されているレポーターの例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、−ガラクトシ
ダーゼ（ＬａｃＺ）、−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等が挙げられる。選別可能なマーカ
ーはレポーターと見なすこともできる。
「プラスミド」とという用語は、多くの場合、当該細胞の中心代謝の一部ではなく、通
常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を有する染色体外エレメントを指す。かか
るエレメントは、多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモータ
ー断片及びＤＮＡ配列を適宜の３’非翻訳配列と共に細胞中に導入することができる特有
の構築物中に結合されまたは組換えられている、任意の起源に由来する、一本鎖もしくは
二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状、環状、または高次コイルである、自律的に複製す
る配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってよい。
用いることができる真核生物ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レトロ
ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びポックスウイルススベクター、例
えばワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルス
ベクターが挙げられるが、これらに限定はされない。非ウイルスベクターとしては、プラ
スミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、及び
生体高分子が挙げられる。
「クローニングベクター」とは、逐次複製する単位長さの核酸であり、プラスミド、フ
ァージまたはコスミドなどの複製開始点を含む「レプリコン」を指し、上記複製開始点に
は、別の核酸セグメントが複製されるように、該別のセグメントが結合する。ある特定の
クローニングベクターは、１つの細胞型、例えばバクテリアにおいて複製することが可能
であり、且つもう一方の細胞型、例えば真核細胞において発現することが可能である。ク
ローニングベクターは一般的には、目的の核酸配列を挿入するためのベクター及び／また
は１もしくは複数の多重クローニング部位を含む細胞の選択に使用できる１つまたは複数
の配列を含む。
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞への挿入後に、挿入された核酸配列の発現を
可能にするように設計されたビヒクルを指す。上記挿入された核酸配列は、上述の調節領
域に作動可能に会合している。
ベクターは、本技術分野で周知の方法、例えば、トランスフェクション、電気穿孔、微
量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェ
クション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーター
によって宿主細胞に導入される。
本明細書では、「培養する」、「培養すること」及び「培養」とは、細胞増殖または分
裂を可能にする、または細胞を生存状態に維持するインビトロ条件下で細胞をインキュベ
ートすることを意味する。本明細書では、「培養細胞」とはインビトロで増殖させる細胞
を意味する。
本明細書では、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数
の「ポリペプチド」を指し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線
的に連結された単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は
、２以上のアミノ酸の任意の連鎖または複数の連鎖を指し、特定の長さの産物を指すもの
ではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タン
パク質」、「アミノ酸鎖」、または２以上のアミノ酸の連鎖または複数の連鎖を指すため
に用いられる任意の他の用語は「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、「ポリペプチド」
という用語はこれらの用語のいずれかに代えて、またはこれらの用語のいずれかと同義で
用いることができる。「ポリペプチド」という用語はまた、限定はされないが、グリコシ
ル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タ
ンパク質分解切断、または非天然起源のアミノ酸による修飾を含む上記ポリペプチドの発
現後修飾の産物をいうことも意図する。ポリペプチドは天然の生物学的供給源または生み
出された組換え技術に由来してもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるもので
はない。ポリペプチドは化学合成によることを含む、任意の形態で生成させることができ
る。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体とは、その天然
の環境にないポリペプチドを指す。特定のレベルの精製を必要とはしない。例えば、単離
されたポリペプチドは、単にその天然または自然の環境から取り出されていてもよい。組
み換えによって産生されたポリペプチド及び宿主細胞中で発現されたタンパク質は、任意
且つ適宜の技法によって分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製された
天然または組換えポリペプチドがそうであるように、本発明の目的のために単離されたと
見なされる。
本明細書では、「宿主細胞」という用語は、組換え核酸を内部に保有するもしくは内部
に保有することができる細胞または細胞の集団を指す。宿主細胞は原核細胞（例えばＥ．
ｃｏｌｉ）であってもよく、あるいは、該宿主細胞は真核細胞、例えば真菌細胞（例えば
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ、もしくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどの酵母細胞）、
及び昆虫細胞（例えばＳｆ−９）または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ
、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ−３Ｔ３）などの種々の動物細胞であってもよい。
ポリペプチドの断片または変異体、及びそれらの任意の組み合わせも本発明に包含され
る。「断片」または「変異体」という用語は、本発明のポリペプチド結合ドメインまたは
結合分子に言及する場合、言及しているポリペプチドの特性（例えば、ＦｃＲｎ結合ドメ
インもしくはＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合親和性、またはＦＩＸ変異体の凝固活性）の少な
くとも一部を保持している任意のポリペプチドを包含する。ポリペプチドの断片は、本明
細書の他の箇所で論じる特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片ならびに欠失断片
を包含するが、天然起源の全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）は含まない。本
発明のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子の変異体は、上述の断片、及びアミノ酸
の置換、欠失、または挿入に起因する改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを包
含する。変異体は天然起源または非天然起源であってよい。非天然起源の変異体は本技術
分野で公知の変異誘発技法を用いて産生させることができる。変異体ポリペプチドは、保
存的なもしくは非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を含むことができる。本明細
書に開示される１つの特定のＦＩＸ変異体はＲ３３８Ｌ ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配
列番号２）である。例えば、Ｓｉｍｉｏｎｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｘ−Ｌｉｎｋｅ
ｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ ｗｉｔｈ ａ Ｍｕｔａｎｔ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ（
Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ Ｐａｄｕａ），’’ ＮＥＪＭ ３６１：１６７１−７５（Ｏｃｔ
ｏｂｅｒ ２００９）を参照されたく、該文献はその全体が参照により本明細書に援用さ
れる。
「保存的アミノ酸置換」とは、当該アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基
によって置き換えられた置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の群は本技術分野
において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸
性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン
、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側
鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン
、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソ
ロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒ
スチジン）が含まれる。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が同一の側鎖群に属する
別のアミノ酸によって置換されている場合、当該の置換は保存的であると見なされる。別
の実施形態において、アミノ酸のストリング（ａ ｓｔｒｉｎｇ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａ
ｃｉｄｓ）は、側鎖群を構成するアミノ酸の順序及び／または組成が異なる構造的に類似
したストリングによって保存的に置換することができる。
２のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「パーセント表記配列同一性」とい
う用語は、当該の２の配列の最適なアラインメントに対して導入する必要がある付加また
は削除（すなわちギャップ）を考慮に入れた、比較ウィンドウ全体にわたる、該配列が共
有する、同一の一致する位置の数を指す。一致する位置は、任意の位置であって、同一の
ヌクレオチドまたはアミノ酸が標的配列及び参照配列の両方の当該位置に示されている上
記位置である。ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸ではないことから、標的配列に示
されるギャップはカウントされない。同様に、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸は
カウントされ、参照配列に属するヌクレオチドまたはアミノ酸はカウントされないことか
ら、参照配列に示されるギャップはカウントされない。
配列同一性のパーセンテージは、両方の配列において同一のアミノ酸残基または核酸塩
基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得ること、上記一致する位置の数を
比較するウィンドウ内の位置の総数で除すこと、及び上記結果に１００を乗じて配列同一
性のパーセンテージを得ることによって算出される。２の配列間の配列の比較及びパーセ
ント表記配列同一性の決定は、オンライン使用及びダウンロード用の両方の、容易に利用
可能なソフトウェアを用いて実施することができる。好適なソフトウェアプログラムは、
様々な供給源から且つタンパク質配列及びヌクレオチド配列の両方のアラインメント用に
入手可能である。パーセント表記配列同一性を決定するための１つの好適なプログラムと
しては、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から利用可能であるＢＬＡＳＴプログラム一式の一部であるｂｌ２
ｓｅｑがある。ｂｌ２ｓｅｑはＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれか
を使用して２の配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用いられ
る一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられる。他の好適なプログラ
ムとしては、例えば、ＥＭＢＯＳＳ生命情報科学プログラム一式の一部であるＮｅｅｄｌ
ｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅrがあり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．
ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにおいてｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒ
ｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも利用可能である。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドま
たはポリペプチドの標的配列内の異なる領域は、それぞれ独自のパーセント表記配列同一
性を有していてもよい。上記パーセント表記配列同一性の値は小数第２位で四捨五入され
ることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４
は８０．１に切り捨てられる一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、
及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数になることにも
留意されたい。
当業者であれば、パーセント表記配列同一性の計算のための配列アラインメントの作成
は、専ら一次配列データによって進められるバイナリー配列−配列比較に限定されるもの
ではないことを理解しよう。配列アラインメントは多重整列に由来してもよい。多重配列
アラインメントを作成するための１つの好適なプログラムとしては、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔ
ａｌ．ｏｒｇから利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２がある。別の好適なプログラムとしては
、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から利用可能なＭＵＳＣＬＥがある。
ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、上記に代えて、例えばＥＢＩからも利用可能で
ある。
配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば結晶学的タンパク質構造）
、機能データ（例えば変異の位置）、または系統発生学的データなどの異種の出所からの
データと統合することによって作成することができることも理解されよう。多重配列アラ
インメントを作成するために異種データを統合する好適なプログラムとしては、ｗｗｗ．
ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇにおいて利用可能な、また上記に代えてＥＢＩからも利用可能な
Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅがある。また、パーセント表記配列同一性を計算するために用いられる
最終的なアラインメントは、自動的にまたは手動でのいずれでキュレートされてもよいこ
とも理解されよう。
本明細書では、第ＩＸ因子タンパク質配列における「〜に対応するアミノ酸」、「〜に
対応する部位」、または「等価なアミノ酸」は、第１のＦＩＸ配列と第２のＦＩＸ配列と
の間の同一性または類似性を最大化するようなアラインメントによって識別される。第２
のＦＩＸ配列において等価なアミノ酸を識別するために用いられる番号は、第１のＦＩＸ
配列において対応するアミノ酸を識別するために用いられる番号に基づく。
本明細書では、「挿入部位」という用語は、ＦＩＸポリペプチド（一般的には成熟ＦＩ
Ｘポリペプチド）、またはその断片、変異体、もしくは誘導体における、異種部分を挿入
することができる位置の隣接する上流のアミノ酸残基の番号を指す。「挿入部位」は番号
として特定され、該番号は、上記挿入部位が対応し、上記挿入の位置に隣接するＮ末端側
である、Ｒ３３８Ｌ ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配列番号２）中のアミノ酸の番号であ
る。例えば、「上記ＥＧＦ２ドメインは配列番号２のアミノ酸１０５に対応する挿入部位
にＸＴＥＮを含む」という表現は、異種部分が、配列番号２のアミノ酸１０５とアミノ酸
１０６とに対応する２のアミノ酸の間に位置することを示す。但し、当業者であれば、い
ずれのＦＩＸ変異体においても対応する位置を容易に識別することができるであろうし、
本開示はＲ３３８Ｌ ＦＩＸ（パドゥバ）変異体において単独で行われる挿入に限定され
るものではない。逆に、本明細書に開示される挿入は、凝血促進活性を有する任意のＦＩ
Ｘ変異体またはその断片において、上記Ｒ３３８Ｌ ＦＩＸ変異体の位置に対応する位置
で行うことができる。
本明細書では、「アミノ酸の隣接する下流」という表現は、当該アミノ酸の末端カルボ
キシル基のすぐ隣の位置を指す。同様に、「アミノ酸の隣接する上流」という表現は、当
該アミノ酸の末端アミン基のすぐ隣の位置を指す。したがって、本明細書では、「挿入部
位の２のアミノ酸の間」という表現は、ＸＴＥＮまたは任意の他のポリペプチドが挿入さ
れる２の隣接するアミノ酸の間の位置を指す。
本明細書では、「挿入されている」（ｉｎｓｅｒｔｅｄ）、「挿入される」（ｉｓ ｉ
ｎｓｅｒｔｅｄ）、「〜に挿入された」（ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ）という用語また
は文法的に関連する用語は、Ｒ３３８Ｌ ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配列番号２）にお
ける類似の位置に対応する、融合ポリペプチド中のＸＴＥＮの位置を指す。当業者であれ
ば、配列番号１として示されるものなどの他のＦＩＸポリペプチド配列に関する、対応す
る挿入位置を識別する方法を理解しよう。本明細書では、上記用語は、当該組換えＦＩＸ
ポリペプチドのＲ３３８Ｌ ＦＩＸ（パドゥバ）変異体と対比した特徴を指し、当該融合
ポリペプチドを製造したいずれの方法またはプロセスも示さず、示唆せずまたは暗示しな
い。例えば、本明細書において提供される融合ポリペプチドに関して、「ＸＴＥＮが、Ｆ
ＩＸポリペプチドの残基１０５の隣接する下流で、ＥＧＦ２ドメイン中に挿入されている
」という表現は、当該融合ポリペプチドがＸＴＥＮを、Ｒ３３８Ｌ ＦＩＸ変異体（配列
番号２）中のアミノ酸１０５に対応するアミノ酸の隣接する下流に、例えば、Ｒ３３８Ｌ
ＦＩＸ変異体のアミノ酸１０５及び１０６アミノ酸に対応するアミノ酸によって囲まれ
た状態で含んでいる。
「融合」または「キメラ」タンパク質は、第２のアミノ酸配列に連結した第１のアミノ
酸配列を含み、第１のアミノ酸配列は天然においては第２のアミノ酸配列に自然に連結す
ることはない。通常、別個のタンパク質中に存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド
中で結合することができ、または通常同一のタンパク質中に存在するアミノ酸配列を本融
合ポリペプチド、例えば、本発明のＦＩＸドメインのＩｇ Ｆｃドメインとの融合物中に
新たな編成で配置することができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、ま
たはペプチド領域が所望の関係でコードされたポリヌクレオチドを創生し、翻訳すること
によって創生される。融合タンパク質は、非ペプチド結合である共有結合または非共有結
合によって第１のアミノ酸配列と会合している第２のアミノ酸配列を更に含んでいてもよ
い。
「異種の」及び「異種部分」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または
他の部分が、当該ポリヌクレオチド等が比較されている相手の実体のポリヌクレオチド等
とは異なる実体に由来することを意味する。例えば、異種ポリペプチドは、合成品であっ
ても、あるいは異なる種、１つの個体の異なる細胞型、または別個の個体の同一もしくは
異なる型の細胞に由来していてもよい。一態様において、異種部分は、別のポリペプチド
に融合し、融合ポリペプチドまたは融合タンパク質を生成するポリペプチドである。別の
態様において、異種部分は、ポリペプチドまたはタンパク質に接合したＰＥＧなどの非ポ
リペプチドである。
本明細書では、「半減期」という用語は、インビボでの特定のポリペプチドの生物学的
半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半量が当該の動物における循環及び／ま
たは他の組織から除去されるのに要する時間によって表すことができる。所与のポリペプ
チドのクリアランス曲線が時間の関数として描かれている場合、該曲線は通常、急速なα
相及びより長いβ相を有する二相性である。上記α相は一般的には、投与されたポリペプ
チドの血管内空間と血管外空間との間での平衡化を表しており、部分的にはポリペプチド
の大きさによって決定される。上記β相は一般的には、血管内空間における当該ポリペプ
チドの異化を表わす。いくつかの実施形態において、ＦＩＸ及びＦＩＸを含む融合タンパ
ク質は単相性であり、したがってα相がなく、単一のβ相のみを有する。したがって、あ
る特定の実施形態において、本明細書では、半減期という用語は、上記β相中の当該ポリ
ペプチドの半減期を指す。一般的なヒトにおけるヒト抗体のβ相での半減期は２１日であ
る。
本明細書では、「連結された」及び「融合された」という用語は、第１のアミノ酸配列
またはヌクレオチド配列であって、それぞれ第２のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配
列に共有結合もしくは非共有結合した上記アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。
第１のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列は、直接第２のアミノ酸配列もしくはヌク
レオチド配列と結合しているかまたは並べられていてもよく、あるいは、介在する配列が
第１の配列を第２の配列に結合させてもよい。「連結された」という用語は、第１のアミ
ノ酸配列の第２のアミノ酸配列に対する、そのＣ末端またはＮ末端での融合を意味するの
みならず、第１のアミノ酸配列（または第２のアミノ酸配列）全体の、第２のアミノ酸配
列（または第１のアミノ酸配列）中の任意の２のアミノ酸への挿入も包含する。一実施形
態において、第１のアミノ酸配列はペプチド結合またはリンカーによって第２のアミノ酸
配列に連結されている。第１のヌクレオチド配列はホスホジエステル結合またはリンカー
によって第２のヌクレオチド配列に連結することができる。上記リンカーは、ペプチドも
しくはポリペプチド（ポリペプチド鎖に対して）またはヌクレオチドもしくはヌクレオチ
ド鎖（ヌクレオチド鎖に対して）または任意の化学的部分（ポリペプチド及びポリヌクレ
オチド鎖の両方に対して）であってよい。「連結された」という用語はまた、ハイフン（
−）によっても示される。
本明細書では、「〜と会合している」という用語は、第１のアミノ酸鎖と第２のアミノ
酸鎖との間に形成された共有結合または非共有結合を指す。一実施形態において、「〜と
会合している」という用語は、非ペプチド結合である共有結合または非共有結合を意味す
る。この会合はコロン、すなわち（：）で表示してもよい。別の実施形態において、会合
はペプチド結合以外の共有結合を意味する。例えば、アミノ酸システインは、第２のシス
テイン残基上のチオール基とジスルフィド結合すなわちブリッジを形成することができる
チオール基を含む。殆どの天然起源のＩｇＧ分子においては、ＣＨ１及びＣＬ領域はジス
ルフィド結合によって会合し、２の重鎖は、Ｋａｂａｔ付番方式を用いた２３９及び２４
２に対応する位置（ＥＵ付番方式では２２６位または２２９位）で２のジスルフィド結合
によって会合している。共有結合の例としては、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジ
スルフィド結合、シグマ結合、パイ結合、デルタ結合、グリコシド結合、アゴスチック結
合、曲がった結合、双極子結合、パイの逆結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結
合、六重結合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数、または反結合が挙げられるが、これ
らに限定はされない。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えば、カチオ
ン−パイ結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素錯体、
低障壁水素結合、または対称水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械
的結合、ハロゲン結合、金親和性、インターカレーション、スタッキング、エントロピー
力、または化学的極性が挙げられる。
本明細書では、「切断部位」または「酵素切断部位」という用語は、酵素によって認識
される部位を指す。ある特定の酵素切断部位は細胞内プロセシング部位を含む。一実施形
態において、ポリペプチドは、凝固カスケードの間に活性化される酵素によって切断され
る酵素切断部位を有しているので、かかる部位の切断は血餅形成の部位で起こる。例示的
なかかる部位としては、例えば、トロンビン、第ＸＩａ因子または第Ｘａ因子によって認
識される部位が挙げられる。例示的なＦＸＩａ切断部位としては、例えば、ＴＱＳＦＤＦ
ＴＲ（配列番号１６６）及びＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号１６７）が挙げられる。例
示的なトロンビン切断部位としては、例えば、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号１６８）
、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号１６９）、ＬＶＰＲＧ（配列番号１７０）及びＡＬＲＰＲ（
配列番号１７１）が挙げられる。他の酵素切断部位は本技術分野において公知である。
本明細書では、「プロセシング部位」または「細胞内プロセシング部位」という用語は
、ポリペプチドの翻訳後に作用する酵素の標的である、当該ポリペプチド中の一種の酵素
切断部位を指す。一実施形態において、かかる酵素はゴルジ内腔からトランス−ゴルジ区
画への輸送中に作用する。細胞内プロセシング酵素は、当該細胞からのタンパク質の分泌
の前にポリペプチドを切断する。かかるプロセッシング部位の例としては、ＰＡＣＥ／フ
ューリン（ＰＡＣＥはＰａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉ
ｎｇ Ｅｎｚｙｍｅの頭字語である。）群のエンドペプチダーゼによって標的とされる部
位が挙げられる。これらの酵素はゴルジ膜に局在化しており、配列モチーフＡｒｇ−［任
意の残基］−（ＬｙｓまたはＡｒｇで）−Ａｒｇのカルボキシ末端側でタンパク質を切断
する。本明細書では、「フューリン」群の酵素としては、例えば、ＰＣＳＫ１（ＰＣ１／
Ｐｃ３としても知られる）、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２としても知られる）、ＰＣＳＫ３（フュ
ーリンもしくはＰＡＣＥとしても知られる）、ＰＣＳＫ４（ＰＣ４としても知られる）、
ＰＣＳＫ５（ＰＣ５もしくはＰＣ６としても知られる）、ＰＣＳＫ６（ＰＡＣＥ４として
も知られる）、またはＰＣＳＫ７（ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８、もしくはＳＰＣ７としても
知られる）が挙げられる。その他のプロセシング部位は本技術分野で公知である。本明細
書において言及される「プロセシング可能なリンカー」という用語は、細胞内プロセシン
グ部位を含むリンカーを指す。
複数のプロセシング部位または切断部位を含む構築物においては、かかる部位は同一で
あってもまたは異なっていてもよいことが理解されよう。
本明細書では、「プロセシング可能なリンカー」とは、少なくとも１の細胞内プロセシ
ング部位を含むリンカーを指し、該リンカーは本明細書の他の箇所に記載される。
本明細書では、「ベースライン」とは、投薬を行う前の対象における最低の血漿ＦＩＸ
レベルの測定値である。上記ＦＩＸ血漿レベルは投与前の２の時点で測定することができ
る。すなわち、スクリーニングのための往訪時及び投与の直前である。あるいは、（ａ）
治療前のＦＩＸ活性が１％未満であり、検出可能なＦＩＸ抗原を有しておらず、且つナン
センス遺伝子型を有する対象におけるベースラインは０％と定義することができ、（ｂ）
治療前のＦＩＸ活性が１％未満であり、且つ検出可能なＦＩＸ抗原を有する対象のベース
ラインは０．５％に設定することができ、（ｃ）治療前のＦＩＸ活性が１〜２％である対
象のベースラインはＣｍｉｎ（ＰＫの検討全体を通じて最低の活性）であり、及び（ｄ）
治療前のＦＩＸ活性が２％以上である対象のベースラインは、２％に設定することができ
る。
本明細書では、「対象」とはヒトを意味する。本明細書における対象としては、少なく
とも１回の制御されない出血症状の発現があったことが判っている個人、制御されない出
血症状の発現を伴う疾患または障害、例えば出血性疾患または障害、例えば血友病Ｂであ
ると診断されている個人、制御されない出血症状の発現を起こしやすい個人、またはそれ
らの任意の組み合わせが挙げられる。対象としてはまた、特定の活動、例えば、外科手術
、スポーツ活動、または任意の激しい活動の前に、１または複数の制御されない出血症状
の発現の危険性がある個人も挙げることができる。上記対象のベースラインＦＩＸ活性は
、１％未満、０．５％未満、２％未満、２．５％未満、３％未満、または４％未満であっ
てよい。対象としては小児のヒトも挙げられる。小児のヒトの対象は、出生時〜２０才、
好ましくは出生時〜１８才、出生時〜１６才、出生時〜１５才、出生時〜１２才、出生時
〜１１才、出生時〜６才、出生時〜５才、出生時〜２才、及び２〜１１才である。
本明細書では、治療する、治療、治療することとは、例えば、疾患もしくは疾病の重篤
度の低減；疾患経過の継続期間の短縮；疾患もしくは疾病に伴う１もしくは複数の症状の
改善；疾患もしくは疾病を有する対象に対する有益な効果の提供であって、必ずしも当該
疾患もしくは疾病の治癒を伴わない上記提供；または疾患もしくは疾病に伴う１もしくは
複数の症状の予防を指す。一実施形態において、「治療すること」または「治療」とは、
本発明の融合タンパク質を投与することによって、対象において、ＦＩＸのトラフレベル
を、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／
ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１
１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１
６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、または２０ＩＵ／ｄ
Ｌに維持することを意味する。別の実施形態において、治療することまたは治療とは、Ｆ
ＩＸのトラフレベルを、約１〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約２〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約３〜約２
０ＩＵ／ｄＬ、約４〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約５〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約６〜約２０ＩＵ／
ｄＬ、約７〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約８〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約９〜約２０ＩＵ／ｄＬ、ま
たは約１０〜約２０ＩＵ／ｄＬに維持することを意味する。疾患もしくは疾病の治療また
はそれらを治療することとは、対象におけるＦＩＸ活性を、非血友病の対象におけるＦＩ
Ｘ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％
、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または
２０％に相当するレベルに維持することも包含する。治療に必要な最低限のトラフレベル
は1種または複数種の公知の方法によって測定することができ、それぞれの人に対して調
節（増加または減少）することができる。
本明細書では、止血障害とは、フィブリン血餅を形成する能力の低下または該能力の欠
如に起因する、自発的にまたは外傷の結果としてのいずれかで出血する傾向を特徴とする
、遺伝性または後天性の疾病を意味する。かかる障害の例としては血友病が挙げられる。
３種の主たる形態は血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠乏症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症ま
たは「クリスマス病」）及び血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠乏症、軽度の出血傾向）である。他
の止血障害としては、例えば、フォンビルブラント病、第ＸＩ因子欠乏症（ＰＴＡ欠乏症
）、第ＸＩＩ因子欠乏症、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、
第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠乏または構造上の異常、ＧＰＩｂの欠損症または欠乏
症であるバーナード・スーリエ症候群が挙げられる。ＶＷＦの受容体であるＧＰＩｂは欠
損する場合があり、一次血餅形成（一次止血）の不足及び出血傾向の増加）、ならびにグ
ランツマン及びネーゲリの血小板無力症（グランツマン血小板無力症）に繋がる場合があ
る。（急性及び慢性の形態の）肝不全において、肝臓による凝固因子の産生が不十分にな
り、これが出血の危険性を高める場合がある。
本明細書では、「急性出血」という用語は、根本的な原因にかかわらず、出血症状の発
現を指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害（例えば、第ＶＩＩ因子欠乏
症）、血小板障害、または凝固因子に対する抗体の発生に起因する抵抗性を有する場合が
ある。
ＩＩ．ＦＩＸ融合タンパク質
本発明は、ＦＩＸポリペプチド、及び該ＦＩＸポリペプチド内に挿入された少なくとも
１の異種部分、該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合された少なくとも１の異種部分、ま
たはそれらの両方を含むＦＩＸ融合タンパク質を対象とする。本ＦＩＸ融合タンパク質は
、上記異種部分の挿入または該異種部分への融合後に、１または複数のＦＩＸ活性を保持
することができる。一実施形態において、上記ＦＩＸ活性は凝血促進活性である。「凝血
促進活性」という用語は、天然ＦＩＸに代わって血液における凝固カスケードに関与する
、本発明のＦＩＸタンパク質の能力を意味する。例えば、本発明の組換えＦＩＸタンパク
質は、該タンパク質が、例えば発色アッセイにおいて試験される、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶ
ＩＩＩ）の存在下で第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化された第Ｘ因子（ＦＸａ）へと変換するこ
とができる場合に、凝血促進活性を有する。別の実施形態において、上記ＦＩＸ活性はテ
ナーゼ複合体を生成する能力である。他の実施形態において、上記ＦＩＸ活性はトロンビ
ン（または血餅）を生成する能力である。
本発明の組換えＦＩＸタンパク質は、天然の成熟ヒトＦＩＸの凝血促進活性の１００％
を示す必要はない。実際、特定の態様において、本発明のＦＩＸポリペプチドに挿入され
た異種部分は当該タンパク質の半減期または安定性を有意に増加させることができ、その
結果より低い活性は十分に許容される。したがって、ある特定の態様において、本発明の
ＦＩＸ融合タンパク質は、天然ＦＩＸの凝血促進活性の少なくとも約１０％、約２０％、
約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１０
０％を有する。但し、いくつかの発明の実施形態において、本発明の組換えＦＩＸタンパ
ク質は、ＦＩＸパドゥバＲ３３８Ｌ高活性変異体を含有するタンパク質に関して、天然Ｆ
ＩＸの活性の１００％よりも大きな活性、例えば、天然ＦＩＸの活性の少なくとも約１０
５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８
０％、１９０％もしくは２００％またはそれ以上を有する場合がある。
凝血促進活性は、任意且つ適宜のインビトロまたはインビボアッセイによって測定する
ことができる。ＦＩＸの上記活性は、血餅の生成を監視すること（凝固アッセイ）によっ
て凝固カスケードの下流で、またはＦＶＩＩＩ−ＦＩＸ複合体による活性化に続くＦＸの
酵素活性を直接測定すること（発色アッセイ）によって上流でのいずれかで測定すること
ができる（例えば、Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍ
ｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２８：２４７−５６（２００２）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：１６４４−４７（１９９９）；Ｌｉｐｐｉ ｅｔ ａｌ
．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４５：２−１２（２００７）を参照されたい
。）。したがって、凝血促進活性は、発色基質アッセイ、凝固アッセイ（例えば、１段階
もしくは２段階凝固アッセイ）、またはそれらの両方を用いて測定することができる。発
色アッセイの機構は、活性化されたＦＩＸがＦＶＩＩＩ、リン脂質及びカルシウムイオン
の存在下でＦＸをＦＸａへと変換する血液凝固カスケードの原理に基づいている。ＦＸａ
活性はＦＸａに特異的なｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解によって評価され
る。４０５ｎＭで測定されるｐ−ニトロアニリンの初期放出速度は、ＦＸａ活性に、延い
ては当該試料中のＦＩＸ活性に正比例する。上記発色アッセイは、国際血栓症及び止血学
会（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ
ｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）（ＩＳＴＨ）の科学及び標準化委員会（ｔｈｅ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）
（ＳＳＣ）の第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子小委員会（ｔｈｅ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ
ａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって推奨されている。
凝血促進活性を測定するために有用な他の好適なアッセイとしては、例えば、Ｓｃｈｅ
ｉｆｌｉｎｇｅｒ及びＤｏｃｋａｌに対する米国出願公開第２０１０／００２２４４５号
に開示されるアッセイが挙げられ、該公開公報はその全体が参照により本明細書に援用さ
れる。
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＩＸタンパク質の凝血促進活性が天然の成
熟ＦＩＸと比較され、ある特定の態様において、該活性が国際標準と比較される。
上記少なくとも１の異種部分は、以下により詳細に説明するように、任意の異種部分を
含んでいてもよく、または当該ＦＩＸタンパク質の特性を改善することができる部分であ
ってもよい。例えば、一態様において、本発明に有用な異種部分は、当該ＦＩＸタンパク
質の半減期を延長することができる部分、または当該ＦＩＸタンパク質の安定性を向上さ
せることができる部分であってもよい。本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸポ
リペプチド中に挿入または該ポリペプチドに融合された複数の異種部分を有していてもよ
い。一実施形態において、上記複数の異種部分は同一である。別の実施形態において、上
記複数の異種部分は異なる。他の実施形態において、上記異種部分は、ＸＴＥＮ、アルブ
ミン、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合性低分子、Ｆｃドメイン、ＦｃＲｎ結合
パートナー、ＰＡＳ、ＣＴＰ、ＰＥＧ、ＨＥＳ、ＰＳＡ、またはそれらの任意の組み合わ
せからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１の異種部分が当該ＦＩＸポリペプチドのド
メイン内に挿入され、ドメイン間には挿入されない。ＦＩＸポリペプチドは、複数のドメ
イン、例えば、γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン、上皮成長因子様１（Ｅ
ＧＦ１）ドメイン、上皮成長因子様２（ＥＧＦ２）ドメイン、活性化ペプチド（ＡＰ）ド
メイン、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカー、及び触媒ドメイン（例えば
、セリンプロテアーゼドメイン）を含む。ＦＩＸ酵素前駆体は４６１のアミノ酸を含む。
すなわち、アミノ酸１〜２８（配列番号３に対応する）がシグナルペプチドであり、アミ
ノ酸２９〜４６（配列番号３に対応する）がプロペプチドであり、その後に４１５のアミ
ノ酸のＦＩＸタンパク質配列が続く。この４１５のプロセッシングを受けたＦＩＸにおい
て、アミノ酸１〜１４５（配列番号１または配列番号２に対応する）はＦＩＸ軽鎖であり
、アミノ酸１４６〜１８０は活性化ペプチドであり、アミノ酸１８１〜４１５（配列番号
１または配列番号２に対応する）は触媒ＦＩＸ重鎖である。上記軽鎖及び重鎖内で、ＧＬ
Ａドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸１〜４６に対応し、ＥＧＦ１ドメイ
ンは配列番号１または配列番号２のアミノ酸４７〜８４に対応し、ＥＧＦ２ドメインは配
列番号１または配列番号２のアミノ酸８５〜１２７に対応し、ＥＧＦ２ドメインとＡＰド
メインとの間のリンカーは配列番号１または配列番号２のアミノ酸１２８〜１４５に対応
し、ＡＰドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４６〜１８０に対応し、触
媒ドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸１８１〜４１５に対応する。
ある特定の実施形態において、少なくとも１の異種部分がＦＩＸポリペプチドの１また
は複数のドメイン内に挿入される。例えば、少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは
、ＧＬＡドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、ＡＰドメイン、ＥＧＦ２ドメ
インとＡＰドメインとの間のリンカー、触媒ドメイン、及びそれらの任意の組み合わせか
らなる群より選択されるドメイン内に挿入されていてもよい。１つの特定の実施形態にお
いて、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＧＬＡドメイン、例えば配列番
号１または配列番号２のアミノ酸１〜４６内に挿入される。１つの特定の実施形態におい
て、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＥＧＦ１ドメイン、例えば配列番
号１または配列番号２のアミノ酸４７〜８３内に挿入される。１つの特定の実施形態にお
いて、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＥＧＦ２ドメイン、例えば配列
番号１または配列番号２のアミノ酸８４〜１２５内に挿入される。いくつかの実施形態に
おいて、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮは、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメ
インとの間のリンカー、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１３２〜１４５内
に挿入される。１つの特定の実施形態において、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸ
ＴＥＮは、ＡＰドメイン、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４６〜１８０
内に挿入される。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分、例えばＸ
ＴＥＮは、触媒ドメイン、例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１８１〜４１５
内に挿入される。
いくつかの実施形態において、１または複数の異種部分は種々の挿入部位内に挿入され
てもよい。ある特定の実施形態において、少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮが１
または複数のこれらの挿入部位に挿入されることによって、ＦＩＸ活性を喪失することは
なく、及び／または当該ＦＩＸタンパク質の特性の向上を誘導する。例えば、少なくとも
１の異種部分が、配列番号２のアミノ酸１０３（すなわち、配列番号２のアミノ酸１０３
に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１０５（すなわち、配列番
号２のアミノ酸１０５に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１４
２（すなわち、配列番号２のアミノ酸１４２に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列
番号２のアミノ酸１４９（すなわち、配列番号２のアミノ酸１４９に対応するアミノ酸の
隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１６２（すなわち、配列番号２のアミノ酸１６２
に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１６６（すなわち、配列番
号２のアミノ酸１６６に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸１７
４（すなわち、配列番号２のアミノ酸１７４に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列
番号２のアミノ酸２２４（すなわち、配列番号２のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の
隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸２２６（すなわち、配列番号２のアミノ酸２２６
に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸２２８（すなわち、アミノ
酸２２８に対応するアミノ酸の隣接する下流）、配列番号２のアミノ酸４１３（すなわち
、配列番号２のアミノ酸４１３に対応するアミノ酸の隣接する下流）及びそれらの任意の
組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプ
チド内に挿入されていてもよく、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。
一実施形態において、上記異種部分、例えばＸＴＥＮは、配列番号１または配列番号２
のアミノ酸１４９、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号１または配
列番号２のアミノ酸１６６、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１７４、及びそれら
の任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸ
ポリペプチド内に挿入される。別の実施形態において、上記異種部分、例えばＸＴＥＮは
、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号１または配列番号２のアミノ
酸２２６、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号１または配列番号２
のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に
対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入される。他の実施形態において、上
記異種部分、例えばＸＴＥＮは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１０３、配列番
号１または配列番号２のアミノ酸１０５、及びそれらの両方からなる群より選択されるア
ミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入される。別の実施形態にお
いて、上記異種部分、例えばＸＴＥＮは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１０３
、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４２で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され
る。
以下により詳細に考察するように、上記異種部分は、様々な長さであってよいＸＴＥＮ
であってよい。例えば、上記ＸＴＥＮは、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７
２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、少なくとも約２８８のアミノ酸、または
少なくとも約８６４のアミノ酸を含んでいてよい。いくつかの実施形態において、上記Ｘ
ＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ２
８８、ＡＧ２８８、ＡＥ８６４、及びＡＧ８６４からなる群より選択される。ＦＩＸポリ
ペプチド中に挿入されてもよい、または該ポリペプチドに融合されていてもよいＸＴＥＮ
の非限定的な例は本明細書の他の箇所に挙げられる。
いくつかの実施形態において、４２のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えばＡＥ４２または
ＡＧ４２が、配列番号１または２のアミノ酸１０３、配列番号１または２のアミノ酸１０
５、配列番号１または２のアミノ酸１４２、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列
番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１ま
たは２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２の
アミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸
４１３及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入
部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性
を示す。
いくつかの実施形態において、７２のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えば、ＡＥ７２また
はＡＧ７２が、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１
６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配
列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１
または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３及びそれらの任意の組
み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチ
ド内に挿入されるか、または上記ＸＴＥＮがＣ末端に融合され、当該ＦＩＸ融合タンパク
質は凝血促進活性を示す。
いくつかの実施形態において、１４４のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えば、ＡＥ１４４
またはＡＧ１４４が、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミ
ノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７
４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列
番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３及びそれらの任
意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリ
ペプチド内に挿入され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。
いくつかの実施形態において、２８８のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えば、ＡＥ２８８
またはＡＧ２８８が、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミ
ノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７
４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列
番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３及びそれらの任
意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリ
ペプチド内に挿入され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。
更に他の実施形態において、８６４のアミノ酸を含むＸＴＥＮ、例えば、ＡＥ８６４ま
たはＡＧ８６４８が、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミ
ノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７
４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列
番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１ま
たは２のアミノ酸４１３及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ
酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、当該ＦＩＸ融合タンパク
質は凝血促進活性を示す。
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ内に挿入された、当該ＦＩＸのＣ末端に
融合された、またはそれらの両方である第２の異種部分、例えば第２のＸＴＥＮを更に含
んでいてもよい。第２の異種部分は、配列番号１または２のアミノ酸１０３、配列番号１
または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１４２、配列番号１または２
のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ
酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４
、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番
号１または２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され
るアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されていてもよく、ま
たは第２のＸＴＥＮは当該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されている。いくつかの実
施形態において、第１のＸＴＥＮ及び第２のＸＴＥＮは、それぞれ、配列番号１または２
のアミノ酸１０５及び配列番号１または２のアミノ酸１６６；配列番号１または２のアミ
ノ酸１０５及び配列番号１または２のアミノ酸２２４；配列番号１または２のアミノ酸１
０５及びＣ末端に融合された；配列番号１または２のアミノ酸１６６及び配列番号１また
は２のアミノ酸２２４；配列番号１または２のアミノ酸１６６及びＣ末端に融合された；
ならびに配列番号１または２のアミノ酸２２４及びＣ末端に融合されたからなる群より選
択される、配列番号１または２のアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド
内に挿入され及び／または当該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合される。一実施形態に
おいて、第１のＸＴＥＮは配列番号１または２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で当
該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されており、第２のＸＴＥＮは当該ＦＩＸポリペプチドの
Ｃ末端に融合されている。
第２のＸＴＥＮは、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なく
とも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少
なくとも約１４４のアミノ酸、または少なくとも約２８８のアミノ酸を含んでいてもよい
。いくつかの実施形態において、第２のＸＴＥＮは、６のアミノ酸、１２のアミノ酸、３
６のアミノ酸、４２のアミノ酸、７２のアミノ酸、１４４のアミノ酸、または２８８のア
ミノ酸を含む。第２のＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ
２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、及びそれらの
任意の組み合わせからなる群より選択されてもよい。１つの特定の実施形態において、第
２のＸＴＥＮはＡＥ７２またはＡＥ１４４である。
１つの特定の実施形態において、第２のＸＴＥＮは、配列番号３４、３５、３６、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配
列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９
５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９
９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、第３、第４、第５、及び／
または第６のＸＴＥＮを更に含む。
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記シグナルペプチド及び
プロペプチド配列を含まない、配列番号５４〜配列番号１５３からなる群より選択される
配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約
９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約
９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において
、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含まない、
配列番号５４〜配列番号１５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形
態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を
含まない、配列番号１１９、１２０、１２１、及び１２３からなる群より選択される配列
と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５
％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９
％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、本ＦＩＸ
融合タンパク質は、上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含まない、配列番号１
１９、１２０、１２３、１２１及び２２６または１２２からなる群より選択されるアミノ
酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記シグナル
ペプチド及びプロペプチド配列を含まない、ＦＩＸ−ＡＰ．７２、ＦＩＸ−ＡＰ．１４４
、ＦＩＸ−ＣＴ．７２、ＦＩＸ−ＣＴ．１４４、ＦＩＸ−ＡＰ．２８８及びＦＩＸ−ＣＴ
．２８８からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は２種の異なる型の異種部分を
含む。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、
ＸＴＥＮ、及びＦｃドメイン（もしくはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片を含む
。いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは当該ＦＩＸ内に挿入され、上記Ｆｃドメ
イン（もしくはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片は当該ＦＩＸのＣ末端に融合さ
れる。いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは、表３に列挙される挿入部位から選
択される１または複数の挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入される。一実施形態
において、上記ＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１０３、配列番号１または２
のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１４２、配列番号１または２のアミノ
酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６
、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番
号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、及び配列番号１
または２のアミノ酸４１３からなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該
ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、上記Ｆｃドメイン（もしくはＦｃＲｎ結合パートナー
）またはその断片は当該ＦＩＸのＣ末端に融合される。ある特定の実施形態において、上
記ＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１
６６、及び配列番号１または２のアミノ酸２２４からなる群より選択されるアミノ酸に対
応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、上記Ｆｃドメイン（もしくはＦ
ｃＲｎ結合パートナー）またはその断片は当該ＦＩＸのＣ末端に融合される。いくつかの
実施形態において、上記ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、及びＡＥ１４４から選択され
る。
本発明のある特定の態様において、本ＦＩＸ融合タンパク質は１または２のポリペプチ
ド鎖を含む。一実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は２のポリペプチド鎖を含み
、第１のポリペプチド鎖はＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）に融合された
当該ＦＩＸポリペプチドを含み、第２のポリペプチド鎖は第２のＦｃドメインを含み、第
１のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と第２のＦｃドメイン（またはＦｃ
Ｒｎ結合パートナー）とは共有結合によって会合している。
別の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド及びＦｃドメ
イン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含む単一のポリペプチド鎖を含む。１つの特定
の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸポリペプチドと上記Ｆｃド
メイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）とを連結するリンカーを更に含む。別の実施形
態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、Ｆｃドメイン、及び第２
のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含む。１つの特定の実施形態におい
て、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と
第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）とを連結するリンカーを更に含む
。別の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、Ｆｃドメイ
ン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）、及び第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パ
ートナー）を含み、上記ＦＩＸポリペプチドはリンカーによって上記Ｆｃドメイン（また
はＦｃＲｎ結合パートナー）と連結している。別の実施形態において、本ＦＩＸ融合タン
パク質は、ＦＩＸポリペプチド、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）、及び
第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含み、上記ＦＩＸポリペプチド
は第１のリンカーによって上記Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と連結し
、上記Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）はリンカーによって第２のＦｃド
メイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と連結している。ある特定の実施形態において
、本ＦＩＸ融合タンパク質は、
（ｉ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１、
（ｉｉ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１、
（ｉｉｉ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１−Ｆ２、
（ｉｖ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１−Ｆ２、
（ｖ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ２−Ｆ２、
（ｖｉ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１−Ｌ１−Ｆ２、
（ｖｉｉ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１：Ｆ２、
（ｖｉｉｉ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１：Ｆ２、及び
（ｉｘ） それらの任意の組み合わせ
からなる群より選択される式を含み、式中、ＦＩＸ（Ｘ）は１または複数の本明細書に記
載の挿入部位に挿入されたＸＴＥＮを有するＦＩＸポリペプチドであり、Ｌ１及びＬ２の
それぞれはリンカーであり、Ｆ１はＦｃドメインまたはＦｃＲｎ結合パートナーであり、
Ｆ２は第２のＦｃドメインまたは第２のＦｃＲｎ結合パートナーであり、（−）はペプチ
ド結合または１もしくは複数のアミノ酸であり、（：）は共有結合、例えばジスルフィド
結合である。
上記リンカー（ＬＩ及びＬ２）は同一であってもまたは異なっていてもよい。上記リン
カーは開裂性であってもまたは非開裂性であってもよく、該リンカーは１または複数の細
胞内プロセシング部位を含んでいてもよい。上記リンカーの非限定的な例は本明細書の他
の箇所に記載される。任意の上記リンカーを用いて、ＦＩＸを異種部分（例えばＸＴＥＮ
もしくはＦｃ）と結合させてもよく、または第１の異種部分（例えば第１のＦｃ）を第２
の異種部分（例えば第２のＦｃ）と結合させてもよい。
ある特定の実施形態において、上記リンカーはトロンビン切断部位を含む。１つの特定
の実施形態において、上記トロンビン切断部位はＸＶＰＲを含み、但し、Ｘは任意の脂肪
族アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン）で
ある。１つの特定の実施形態において、上記トロンビン切断部位はＬＶＰＲを含む。いく
つかの実施形態において、上記リンカーは、ＳＦＬＬＲＮ（配列番号１９０）を含むＰＡ
Ｒ１非活性部位相互作用モチーフを含む。いくつかの実施形態において、上記ＰＡＲ１非
活性部位相互作用モチーフは、Ｐ、ＰＮ、ＰＮＤ、ＰＮＤＫ（配列番号１９１）、ＰＮＤ
ＫＹ（配列番号１９２）、ＰＮＤＫＹＥ（配列番号１９３）、ＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号
１９４）、ＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９５）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号１９６
）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号１９７）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ（配列番号１９
８）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ（配列番号１９９）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥ（配
列番号２００）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＳ（配列番号２０１）、またはそれらの任
意の組み合わせから選択されるアミノ酸配列を更に含む。他の実施形態において、上記リ
ンカーはＦＸＩａ切断部位ＬＤＰＲを含む。
１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質はＦＩＸポリペプチド及びＸ
ＴＥＮを含む異種部分を含み、該ＸＴＥＮは、開裂性であっても開裂性でなくてもよいリ
ンカーによってまたはリンカーなしで当該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合しており、
且つ長さが４２のアミノ酸よりも長く８６４のアミノ酸よりも短い、好ましくは長さが１
４４のアミノ酸よりも短いアミノ酸配列を含む。上記ＸＴＥＮは、４２、４３、４４、４
５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８
、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、もしく
は７１のアミノ酸よりも長く、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３
４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、１２７、１２６、１２５、１２
４、１２３、１２２、１２１、１２０、１１９、１１８、１１７、１１６、１１５、１１
４、１１３、１１２、１１１、１１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０
４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９
２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９
、７８、７６、７５、７４、または７３などのアミノ酸よりも短い、またはそれらの任意
の組み合わせであるアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上
記ＸＴＥＮは長さが７２のアミノ酸である。１つの特定の実施形態において、上記ＸＴＥ
ＮはＡＥ７２である。別の実施形態において、上記ＸＴＥＮは、配列番号３５と少なくと
も約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくと
も約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１
００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、少なくとも１の挿入された
ＸＴＥＮ配列及び、開裂性であっても開裂性でなくてもよいリンカーによってまたはリン
カーなしで当該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合しているＸＴＥＮを含む異種部分を含
む。いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは長さが８６４のアミノ酸よりも短く、
好ましくは長さが１４４のアミノ酸より短い。他の実施形態において、上記ＸＴＥＮは、
長さが２４４、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、または７５のア
ミノ酸より短いアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、
（ｉ） ＦＩＸ−Ｘ
（ｉｉ） ＦＩＸ−Ｌ１−Ｘ
（ｉｉｉ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｘ
（ｉｖ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｘ
（ｖ） ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１：Ｘ
（ｖｉ） それらの任意の組み合わせ
からなる群より選択される式を含み、式中、ＦＩＸはＦＩＸポリペプチドであり、ＦＩＸ
（Ｘ）は１または複数の本明細書に記載の挿入部位中に挿入された少なくとも１のＸＴＥ
Ｎを有するＦＩＸポリペプチドであり、（Ｘ）は４２のアミノ酸よりも長く、１４４のア
ミノ酸よりも短いＸＴＥＮあり、Ｘは４２のアミノ酸よりも長く、８６４のアミノ酸より
も短い２８８のアミノ酸など、好ましくは１４４のアミノ酸よりも短いＸＴＥＮ（例えば
、７２のアミノ酸を有するＸＴＥＮ）であり、Ｌ１はリンカーであり；（−）はペプチド
結合または１もしくは複数のアミノ酸であり、（：）は共有結合、例えばジスルフィド結
合である。
上記リンカー（Ｌ１）は同一であってもまたは異なっていてもよい。上記リンカーは、
必要に応じて開裂性であってもまたは非開裂性であってもよく、該リンカーは１または複
数の細胞内プロセシング部位を含んでいてもよい。上記リンカーの非限定的な例は本明細
書の他の箇所に記載される。任意の上記リンカーを用いて、ＦＩＸを異種部分（例えばＸ
ＴＥＮもしくはＦｃ）と結合させてもよい。以下は多くの発明の実施形態に好適なリンカ
ーの非限定的な例である。
Figure 2021078526
ある特定の他の実施形態において、上記リンカーはトロンビン切断部位を含む。１つの
特定の実施形態において、上記トロンビン切断部位はＸＶＰＲを含み、但し、Ｘは、任意
の脂肪族アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシ
ン）である。１つの特定の実施形態において、上記トロンビン切断部位はＬＶＰＲを含む
。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、ＳＦＬＬＲＮ（配列番号１９０）を含
むＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフを含む。いくつかの実施形態において、上記ＰＡ
Ｒ１非活性部位相互作用モチーフは、Ｐ、ＰＮ、ＰＮＤ、ＰＮＤＫ（配列番号１９１）、
ＰＮＤＫＹ（配列番号１９２）、ＰＮＤＫＹＥ（配列番号１９３）：ＰＮＤＫＹＥＰ（配
列番号１９４）、ＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９５）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号
１９６）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号１９７）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ（配列番
号１９８）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ（配列番号１９９）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ
Ｅ（配列番号２００）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＳ（配列番号２０１）、またはそれ
らの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸配列を更に含む。ある特定の他の実施形態
において、上記リンカーは、上記ＰＡＲ１非活性部位相互作用モチーフに結合することが
できるＬＤＰＲを含むＦＸＩａ切断部位を含む。
ある特定の実施形態において、Ｃ末端でＸＴＥＮに融合されたＦＩＸポリペプチドは、
第２のＸＴＥＮを更に含んでいてもよい。第２のＸＴＥＮは、本明細書に開示の挿入部位
を始めとする、但しこれらに限定されない、本ＦＩＸ融合タンパク質の任意の部分に融合
または挿入されていてもよい。本ＦＩＸ融合タンパク質は、第３のＸＴＥＮ、第４のＸＴ
ＥＮ、第５のＸＴＥＮ、または第６のＸＴＥＮを更に含んでいてもよい。
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は天然ＦＩＸと比較して活性のレベルを維持している。
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、天然ＦＩＸの凝血促進活性の
少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、
少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、
少なくとも約９０％または１００％を有する。凝血促進活性は、発色基質アッセイ、１段
階凝固アッセイ、またはそれらの両方を含む、但しこれらに限定されない、本技術分野で
公知の任意の方法によって測定することができる。
ＩＩ．Ａ．第ＩＸ因子
ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、血液凝固カスケードの内因系経路の重要な構成要素である
セリンプロテアーゼである。本明細書では、「第ＩＸ因子」すなわち「ＦＩＸ」は、凝固
因子タンパク質ならびにその種変異体及び配列変異体を指し、ヒトＦＩＸ前駆体ポリペプ
チド（「プレプロ」）の４６１の単鎖アミノ酸配列、成熟ヒトＦＩＸの４１５の単鎖アミ
ノ酸配列（配列番号１）、及びＲ３３８Ｌ ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配列番号２）を
包含するが、これらに限定はされない。ＦＩＸは、血液凝固ＦＩＸの一般的な特性を有す
る任意の形態のＦＩＸ分子を包含する。本明細書では、「第ＩＸ因子」及び「ＦＩＸ」は
、ドメインＧｌａ（γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有する領域）、ＥＧＦ１及びＥ
ＧＦ２（ヒト上皮増殖因子に相同な配列を含有する領域）、活性化ペプチド（「ＡＰ」、
成熟ＦＩＸのＲ１３６−Ｒ１８０残基によって形成される）、及びＣ末端プロテアーゼド
メイン（「プロ」）、または本技術分野で公知のこれらのドメインの同義語を含むポリペ
プチドを包含することを意図し、または当該の天然タンパク質の生物学的活性の少なくと
も一部を保持するトランケートされた断片または配列変異体であってもよい。ＦＩＸまた
は配列変異体は、米国特許第４，７７０，９９９号及び第７，７００，７３４号に記載さ
れるようにクローニングされており、また、ヒト第ＩＸ因子をコードするｃＤＮＡは、単
離、特徴づけられ、発現ベクター中にクローニングされている（例えば、Ｃｈｏｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９９：１７８−１８０（１９８２）；Ｆａｉｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｂｌｏｏｄ ６４：１９４−２０４（１９８４）；及びＫｕｒａｃｈｉ ｅｔ ａｌ
．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：６４６１−６４６４
（１９８２）を参照のこと）。Ｓｉｍｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ，２００９によって特徴づけ
られたＦＩＸの１つの特定の変異体であるＲ３３８Ｌ ＦＩＸ（パドゥバ）変異体（配列
番号２）は機能獲得型突然変異を含み、該突然変異はパドゥバ変異体が天然ＦＩＸと比較
して活性が８倍近く増加することと関係がある（表１）。ＦＩＸ変異体はまた、当該ＦＩ
ＸポリペプチドのＦＩＸ活性に影響を及ぼさない１または複数の保存的アミノ酸置換を有
する任意のＦＩＸポリペプチドを包含してもよい。
Figure 2021078526
上記ＦＩＸポリペプチドは、３の領域、すなわち、２８のアミノ酸（配列番号３のアミ
ノ酸１〜２８）のシグナルペプチド、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化に必要
な１８のアミノ酸（アミノ酸２９〜４６）のプロペプチド、及び４１５のアミノ酸の成熟
第ＩＸ因子（配列番号１または２）からなるプレプロポリペプチド鎖（配列番号１）とし
て合成された５５ｋＤａのポリペプチドである。上記プロペプチドは、上記ガンマ−カル
ボキシグルタミン酸ドメインに対してＮ末端側の１８のアミノ酸残基の配列である。上記
プロペプチドはビタミンＫ依存性ガンマカルボキシラーゼと結合し、次いで内因性プロテ
アーゼ、最も可能性が高いのはフューリンまたはＰＣＳＫ３としても知られるＰＡＣＥ（
Ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）
によってＦＩＸの前駆体ポリペプチドから切断される。ガンマカルボキシル化が起こらな
ければ、Ｇｌａドメインがカルシウムに結合して、当該タンパク質を負に荷電したリン脂
質表面に固定するのに必要な正しい立体構造をとることができず、それによって第ＩＸ因
子の機能が損なわれる。カルボキシル化が行われたとしても、保持されたプロペプチドは
カルシウム及びリン脂質への最適な結合に必要なＧｌａドメインの立体構造の変化を妨害
することから、Ｇｌａドメインは、適正な機能を果たすためには上記プロペプチドの切断
にも依存している。ヒトにおいては、肝細胞によって、生成した成熟第ＩＸ因子が概略１
７重量％の炭水化物を含有する４１５のアミノ酸残基の単鎖タンパク質である不活性な酵
素前駆体として血流中に分泌される（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００
３） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ，１３：３９）。
上記成熟ＦＩＸは、Ｎ末端からＣ末端への構成で、ＧＬＡドメイン、ＥＧＦ１ドメイン
、ＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメイン、及びプロテアーゼ（または触媒
）ドメインである数種のドメインからなる。短いリンカーがＥＧＦ２ドメインをＡＰドメ
インに結合している。ＦＩＸは、それぞれＲ１４５〜Ａ１４６及びＲ１８０〜Ｖ１８１に
よって形成される２の活性化ペプチドを含有する。活性化に続いて、上記単鎖ＦＩＸは２
の連鎖がジスルフィド結合によって連結された二本鎖分子となる。凝固因子を、該因子の
活性化ペプチドを置換することによって操作してもよく、その結果活性化特異性が変化す
る。哺乳類動物において、第ＩＸａ因子を産生するためには、成熟したＦＩＸが活性化さ
れた第ＸＩ因子によって活性化される必要がある。ＦＩＸのＦＩＸａへの活性化に際して
、上記プロテアーゼドメインがＦＩＸの触媒活性を提供する。活性化された第ＶＩＩＩ因
子（ＦＶＩＩＩａ）が第ＦＩＸａ因子の活性を完全に発現させるための特異的な補因子で
ある。
他の実施形態において、ＦＩＸポリペプチドは、Ｔｈｒ１４８対立遺伝子形態の血漿由
来の第ＩＸ因子を含み、内因性第ＩＸ因子と同様の構造的及び機能的特徴を有する。
機能を有する非常に多くのＦＩＸ変異体が公知である。国際公開第ＷＯ０２／０４０５
４４Ａ３号は、４ページ、９〜３０行及び１５ページ、６〜３１行に、ヘパリンによる阻
害に対する向上した抵抗性を示す変異体を開示する。国際公開第ＷＯ０３／０２０７６４
Ａ２号は、表２及び表３（１４〜２４ページ）及び１２ページ、１〜２７行に、低下した
Ｔ細胞免疫原性のＦＩＸ変異体を開示する。国際公開第ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２
号は、４ページ、１行〜１９ページ、１１行に、増加したタンパク質安定性、増加したイ
ンビボ及びインビトロ半減期、及びプロテアーゼに対する増加した耐性を示す、機能を有
する変異ＦＩＸ分子を開示する。ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２も、１９ページ、１２
行〜２０ページ、９行に、キメラ及び他の変異体ＦＩＸ分子を開示する。国際公開第ＷＯ
０８／１１８５０７Ａ２号は、５ページ、１４行〜６ページ、５行に、増加した凝固活性
を示すＦＩＸ変異体を開示する。国際公開第ＷＯ０９／０５１７１７Ａ２号は、９ページ
、１１行〜２０ページ、２行に、Ｎ結合及び／またはＯ結合グリコシル化部位の数が増加
し、その結果増加した半減期及び／または回収率を有するＦＩＸ変異体を開示する。国際
公開第ＷＯ０９／１３７２５４Ａ２号も、２ページ、段落［００６］〜５ページ、段落［
０１１］及び１６ページ、段落［０４４］〜２４ページ、段落［０５７］に、グリコシル
化部位の数が増加した第ＩＸ因子変異体を開示する。国際公開第ＷＯ０９／１３０１９８
Ａ２号は、４ページ、２６行〜１２ページ、６行に、グリコシル化部位の数が増加し、そ
の結果半減期が増加した機能性変異体ＦＩＸ分子を開示する。国際公開第ＷＯ０９／１４
００１５Ａ２号は、１１ページ、段落［００４３］〜１３ページ、段落［００５３］に、
ポリマー（例えばＰＥＧ）の複合化に用いることができるＣｙｓ残基の数が増加した、機
能性ＦＩＸ変異体を開示する。２０１１年７月１１日に出願され、２０１２年１月１２日
にＷＯ２０１２／００６６２４として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４
３５６９号に記載のＦＩＸポリペプチドも、その全体が参照により本明細書に援用される
。
また、血友病患者において、機能しない数百種のＦＩＸにおける突然変異体が特定され
ており、それらの多くが国際公開第ＷＯ０９／１３７２５４Ａ２号の１１〜１４ページ、
表５に開示される。かかる機能しない突然変異体は本発明には含まれないが、如何なる突
然変異体によって、機能性ＦＩＸポリペプチドが生じる可能性がより高いかまたはより低
いかに関する更なる指針を提供する。
一実施形態において、上記ＦＩＸポリペプチド（または融合ポリペプチドの第ＩＸ因子
部分）は、配列番号１または２に示される配列（配列番号１または２のアミノ酸１〜４１
５）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少
なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも
９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を、あるいはプロペプチド配列と共に、
またはプロペプチド配列及びシグナル配列と共に（全長ＦＩＸ）含む。別の実施形態にお
いて、上記ＦＩＸポリペプチドは、配列番号２に示される配列と少なくとも７０％、少な
くとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９
６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一で
あるアミノ酸配列を含む。
第ＩＸ因子の凝固活性は国際単位（複数可）（ＩＵ）として表される。１ＩＵのＦＩＸ
活性は、１ミリリットルの正常なヒト血漿中のＦＩＸの量にほぼ相当する。第ＩＸ因子活
性の測定には、１段階凝固アッセイ（活性化部分トロンボプラスチン時間、ａＰＴＴ）、
トロンビン生成時間（ＴＧＡ）及び回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（登録商
標））を含むいくつかのアッセイが利用可能である。本発明は、ヒト、非ヒト霊長動物、
（家畜を含む）哺乳動物由来などの天然の、及びＦＩＸの生物学的活性または生物学的機
能の少なくとも一部を保持している非天然配列変異体である、及び／または凝固因子関連
の疾患、欠乏、障害または疾病（例えば、外傷、外科手術に関連した凝固因子の欠乏の出
血症状の発現）の予防、治療、調節、または改善に有用な、ＦＩＸ配列、配列断片に対す
る相同性を有する配列を企図する。ヒトＦＩＸに対する相同性を有する配列は、ＮＣＢＩ
ＢＬＡＳＴなどの標準的な相同性検索技法によって見出すことができる。
ＩＩ．Ｂ．異種部分
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸポリペプチド内の１または複数の部位に
挿入された、Ｃ末端に融合された、またはそれらの両方である少なくとも１の異種部分を
有していてもよく、凝血促進活性を有し、且つ宿主細胞中、インビボまたはインビトロで
発現させることができる。「異種部分」は異種ポリペプチド部分、もしくは非ポリペプチ
ド部分、またはそれらの両方を含んでいてもよい。ある特定の態様において、上記異種部
分はＸＴＥＮである。いくつかの態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記
ＦＩＸポリペプチド内の１または複数の部位に挿入された少なくとも１のＸＴＥＮを含む
。他の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸポリペプチド内の１または複
数の部位に挿入された少なくとも１の異種部分を含み、該異種部分は半減期を延長する部
分（例えば、インビボで半減期を延長する部分）である。
当該ＦＩＸがその凝血促進活性の少なくとも一部を保持する挿入部位を見出すことによ
って、１または複数のこれらの同一の部位においてＦＩＸタンパク質に融合される場合に
、半減期の延長を伴う体系化されていないまたは体系化された特性のいずれかを有する他
のペプチド及びポリペプチドを挿入することが可能になると考えられる。異種部分（例え
ば半減期を延長する部分）の非限定的な例としては、アルブミン、アルブミン断片、免疫
グロブリンのＦｃ断片、ＦｃＲｎ結合パートナー、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユ
ニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、米国特許出願第２
０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリン
カー、ペプチドが挙げられ、５０％未満〜５０％超の異なる程度の二次構造を有する、グ
リシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）
及びプロリン（Ｐ）から選択される２種のアミノ酸の、６〜４０のアミノ酸の短いポリペ
プチドがとりわけ、ＦＩＸの上記特定された活性な挿入部位に挿入するのに適していると
思われる。
ある特定の態様において、異種部分は本ＦＩＸ融合タンパク質のインビボまたはインビ
トロ半減期を増加させる。他の態様において、異種部分は本ＦＩＸ融合タンパク質の可視
化及び位置の特定を容易にする。ＦＩＸ融合タンパク質の可視化及び／または位置の特定
は、インビトロ、インビボ、エクスビボ、またはそれらの組み合わせとすることができる
。他の態様において、異種部分は本ＦＩＸ融合タンパク質の安定性を増加させる。本明細
書では、「安定性」という用語は、本技術分野で認知された、環境条件（例えば、高いま
たは低い温度）に対して、本ＦＩＸ融合タンパク質の１または複数の物理的特性が維持さ
れることの尺度を指す。ある特定の態様において、上記物理的特性は本ＦＩＸ融合タンパ
ク質の共有結合構造の維持（例えば、タンパク質分解切断、不要な酸化または脱アミド化
がないこと）である。他の態様において、上記物理的特性は、本ＦＩＸ融合タンパク質が
適切に折り畳まれた状態で存在していること（例えば、可溶性または不溶性の凝集体また
は沈殿物がないこと）である場合もある。一態様において、上記本ＦＩＸ融合タンパク質
の安定性は、当該ＦＩＸ融合タンパク質の生物物理学的特性、例えば、熱安定性、ｐＨ−
アンフォールディングプロファイル、グリカンの安定な除去、溶解性、生化学的機能（例
えば、他のタンパク質に結合する能力）など、及び／またはそれらの組み合わせをアッセ
イすることによって測定される。別の態様において、生化学的機能は相互作用の結合親和
性によって実証される。一態様において、タンパク質の安定性の1つの尺度は熱安定性、
すなわち熱負荷に対する耐性である。安定性は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー
）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱）等の当該分野で公
知の方法を用いて測定することができる。熱安定性の測定方法としては、示差走査熱量測
定法（ＤＳＣ）、示差走査蛍光光度法（ＤＳＦ）、円偏光二色性（ＣＤ）、及び熱負荷ア
ッセイが挙げられるが、これらに限定はされない。
特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質中の１または複数の挿入部位に挿入された
異種部分は当該ＦＩＸ融合タンパク質の生化学的活性を保持する。特定の実施形態におい
て、上記異種部分はＸＴＥＮである。一実施形態において、上記生化学的活性はＦＩＸ活
性であり、該活性は発色アッセイによって測定することができる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１の異種部分は、該異種部分のＮ末端、Ｃ末
端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に位置するリンカーを介して挿入部位に間接的に挿入
されている。上記異種部分のＮ末端及びＣ末端のリンカーは同一であるかまたは異なって
いてもよい。いくつかの実施形態において、いくつかのリンカーが、上記異種部分の一方
または両方の末端にタンデムで隣接していてもよい。いくつかの実施形態において、上記
リンカーは「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー」である。「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリン
カー」とという用語はグリシン及びセリン残基を含むペプチドを指す。
例示的なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーとしては、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）
ｎ（配列番号１６１）（但し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、
２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１
００に等しいかそれ以上の整数）が挙げられるが、これに限定はされない。一実施形態に
おいて、ｎ＝１、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号１６１）であ
る。一実施形態において、ｎ＝２、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配
列番号１６２）である。別の実施形態において、ｎ＝３、すなわち、上記リンカーは（Ｇ
ｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１７２）である。別の実施形態において、ｎ＝４、すなわち
、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１７３）である。別の実施形態におい
て、ｎ＝５、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１７４）である
。更に別の実施形態において、ｎ＝６、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６
（配列番号１７５）である。別の実施形態において、ｎ＝７、すなわち、上記リンカーは
（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号１７６）である。更に別の実施形態において、ｎ＝８、
すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号１７７）である。別の実施形
態において、ｎ＝９、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号１７８
）である。更に別の実施形態において、ｎ＝１０、すなわち、上記リンカーは（Ｇｌｙ４
Ｓｅｒ）１０（配列番号１７９）である。
別の例示的なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅ
ｒ）ｎ（配列番号１８０）（但し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０、また
は１００に等しいかそれ以上の整数）を含む。一実施形態において、ｎ＝１、すなわち、
上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号１８０）である。一実施形態におい
て、ｎ＝２、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１８１）
である。別の実施形態において、ｎ＝３、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓ
ｅｒ）３（配列番号１８２）である。別の実施形態において、ｎ＝４、すなわち、上記リ
ンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１８３）である。別の実施形態において
、ｎ＝５、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）で
ある。更に別の実施形態において、ｎ＝６、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４
Ｓｅｒ）６（配列番号１８５）である。更に別の実施形態において、ｎ＝７、すなわち、
上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号１８６）である。更に別の実施形
態において、ｎ＝８、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号
１８７）である。更に別の実施形態において、ｎ＝９、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ
（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号１８８）である。更に別の実施形態において、ｎ＝１０
、すなわち、上記リンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号１８９）である。
ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された挿入部位に挿入
された１の異種部分を含む。他の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙さ
れた２の挿入部位に挿入された２の異種部分を含む。ある特定の実施形態において、上記
２の異種部分は、表８に列挙された２の挿入部位に挿入される。ある特定の態様において
、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された３の挿入部位に挿入された３の異種部分を
含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された４の挿入部
位に挿入された４の異種部分を含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は
、表７に列挙された５の挿入部位に挿入された５の異種部分を含む。ある特定の態様にお
いて、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙された６の挿入部位に挿入された６の異種部
分を含む。いくつかの態様において、上記全ての挿入された異種部分は同一である。他の
態様において、上記挿入された異種部分の少なくとも１は、残余の挿入された異種部分と
異なる。
上記少なくとも１の異種部分、例えばＸＴＥＮへの上記ＦＩＸポリペプチドの融合は、
本発明の融合タンパク質の物理的または化学的特性、例えば薬物動態に影響を与えること
ができる。特定の実施形態において、ＦＩＸタンパク質に連結した上記異種部分は、少な
くとも1種の薬物動態学的特性増加させ、例えば、増加した終末相半減期または増加した
曲線下面積（ＡＵＣ）とし、その結果、本明細書に記載の融合タンパク質は、野生型ＦＩ
Ｘまたは当該異種部分をもたない対応するＦＩＸと比較して、長い期間インビボに留まる
。更なる実施形態において、本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は、少なくとも1種の薬物
動態学的特性、例えば、終末相半減期の増加、皮下投与に対する回収率の増加及び／また
は生物学的利用能の増加、曲線下面積（ＡＵＣ）の増加を増加させ、その結果、本明細書
に記載の融合タンパク質は、野生型ＦＩＸまたは当該異種部分をもたない対応するＦＩＸ
と比較して、長い期間インビボに留まる。
ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質の半減期を増加させる異種部
分は、限定はされないが、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ＸＴＥＮ配列、ヒト絨
毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ
配列、トランスフェリン、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドの任意の断
片、誘導体、変異体、もしくは組み合わせを含む。ある特定の態様において、本発明のＦ
ＩＸ融合タンパク質は半減期を増加させる異種ポリペプチドを含み、該異種ポリペプチド
はＸＴＥＮ配列である。他の関連する態様において、異種部分は、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらの部
分の任意の誘導体、変異体、もしくは組み合わせなどの非ポリペプチド部分のための結合
部位を含んでいてもよい。
他の実施形態において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は１または複数のポリマーに複
合化している。上記ポリマーは水溶性または非水溶性であってよい。該ポリマーは、共有
結合もしくは非共有結合でＦＩＸまたはＦＩＸに複合化した他の部分に結合していてもよ
い。上記ポリマーの非限定的な例としては、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニル
ピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、またはポリ（アクリロイ
ルモルホリン）であってよい。
ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、１、２、３またはそれ以
上の異種部分を含み、該異種部分は、それぞれ同一または異なる分子であってよい。いく
つかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は１または複数のＸＴＥＮを含む。他
の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は１または複数のＸＴＥＮ及び１または複
数のＦｃドメインを含む。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、
上記ＦＩＸ内に挿入されたＸＴＥＮ及び該ＦＩＸのＣ末端に融合されたＦｃを含んでいて
もよい。
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、天然ＦＩＸ、ｒＦＩＸＦｃ、またはＦＩＸ Ｒ３３
８Ｌと比較して増加したインビボ半減期を有し得る。いくつかの実施形態において、本Ｆ
ＩＸ融合タンパク質は、上記異種部分をもたない天然ＦＩＸと比較して、または上記異種
部分をもたないＦＩＸ Ｒ３３８Ｌと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２
倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍長いインビボ半減期を有することができ
る。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上記異種部分をもたな
い上記ＦＩＸポリペプチドよりも２倍を超える長さのインビボ半減期を有する。
他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質のインビボ半減期は、異種部分をもた
ないＦＩＸポリペプチドのインビボ半減期よりも、少なくとも約５時間、少なくとも約６
時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１
０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なく
とも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間
、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約
２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少な
くとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時
間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも
約３２時間、少なくとも約３３時間、または少なくとも約３４時間長くてもよい。
ＩＩ．Ｂ．１．ＸＴＥＮ
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分はＸＴＥＮである。本明細
書では、「ＸＴＥＮ配列」とは、生理学的条件下で二次または三次構造をとることがない
またはその程度が小さい配列を有する、主として小さな親水性アミノ酸からなる、非天然
起源の、実質的に非反復配列を有する、長尺のポリペプチドを指す。ＸＴＥＮは、融合タ
ンパク質のパートナーとして、本発明のＦＩＸ配列に連結されて融合タンパク質を創生し
た場合に、ある特定の所望の薬物動態学的、物理化学的及び薬学的特性を与える運搬体と
して作用することができる。かかる望ましい特性としては向上した薬物動態学的パラメー
タ及び溶解特性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書では、「Ｘ
ＴＥＮ」には、詳細には、単鎖抗体または軽鎖もしくは重鎖のＦｃ断片などの抗体あるい
は抗体断片は含まれない。
ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に挿入され
た少なくとも１のＸＴＥＮまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、本ＦＩＸ融
合タンパク質は凝血促進活性を有し、且つ宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現
させることができる。ある特定の態様において、２の上記異種部分がＸＴＥＮ配列である
。いくつかの態様において、３の上記異種部分がＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様に
おいて、４の上記異種部分がＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、５の上記異
種部分がＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、６の上記異種部分がＸＴＥＮ配
列である。
いくつかの実施形態において、本発明にとって有用なＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、
４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５
０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５
０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０
００よりも多いアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実
施形態において、ＸＴＥＮは、約２０を超えて約３０００までのアミノ酸残基、３０を超
えて約２５００までの残基、４０を超えて約２０００までの残基、５０を超えて約１５０
０までの残基、６０を超えて約１０００までの残基、７０を超えて約９００までの残基、
８０を超えて約８００までの残基、９０を超えて約７００までの残基、１００を超えて約
６００までの残基、１１０を超えて約５００までの残基、または１２０を超えて約４００
までの残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。１つの特定の実施形態において
、上記ＸＴＥＮは、長さが４２のアミノ酸よりも長く且つ１４４のアミノ酸よりも短いア
ミノ酸配列を含む。
本発明のＸＴＥＮ配列は、５〜１４（例えば９〜１４）のアミノ酸残基の配列モチーフ
または該配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいても
よく、上記モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（
Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）からなる群より選択される４〜６種のアミ
ノ酸（例えば５種のアミノ酸）を含む、上記アミノ酸から本質的に構成される、または上
記アミノ酸から構成される。ＵＳ２０１０−０２３９５５４Ａ１を参照されたい。
いくつかの実施形態において、上記ＸＴＥＮは、非オーバーラッピング配列モチーフで
あって、該配列の約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、ま
たは約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、ま
たは約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％または約１００％が、
表２Ａから選択される単一モチーフファミリーから選択される非オーバーラッピング配列
の複数のユニットからなり、その結果ファミリーモチーフとなる上記非オーバーラッピン
グ配列モチーフを含む。本明細書では、「ファミリー」とは、上記ＸＴＥＮが、表２Ａの
単一モチーフカテゴリー、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、また
はＢＤ ＸＴＥＮのみから選択されるモチーフを有すること、及びファミリーモチーフに
属さない当該ＸＴＥＮ中の他のアミノ酸が、コード化ヌクレオチドによる制限部位の組み
込み、切断部位の組み込みを可能にするなどの必要な特性を実現するように、またはＦＩ
Ｘへのより良好な連結を実現するように選択されることを意味する。ＸＴＥＮファミリー
のいくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリーの、またはＡ
Ｅモチーフファミリーの、またはＡＦモチーフファミリーの、またはＡＧモチーフファミ
リーの、またはＡＭモチーフファミリーの、またはＡＱモチーフファミリーの、またはＢ
Ｃファミリーの、またはＢＤファミリーのモチーフファミリーの非オーバーラッピング配
列モチーフの複数のユニットを含み、得られるＸＴＥＮは上記の範囲の相同性を示す。他
の実施形態において、上記ＸＴＥＮは表２Ａのモチーフファミリーの２つ以上のモチーフ
配列の複数のユニットを含む。これらの配列を選択して、以下により詳細に説明する、当
該モチーフのアミノ酸組成によって付与される、正味電荷、親水性、二次構造をとらない
こと、または反復性がないことなどの特性を含む、所望の物理的／化学的特性を実現する
ことができる。本段落に上述の実施形態において、上記ＸＴＥＮに組み込まれるモチーフ
を、本明細書に記載の方法を用いて選択し且つ組み立てて、約３６〜約３０００のアミノ
酸残基のＸＴＥＮを得ることができる。
Figure 2021078526
Figure 2021078526
ＦＩＸ中への挿入またはＦＩＸへの連結のためのＸＴＥＮは様々な長さを有していてよ
い。一実施形態において、上記ＸＴＥＮ配列（複数可）の長さは本融合タンパク質におい
て達成されるべき特性または機能に基づいて選択される。ＸＴＥＮは、意図する特性また
は機能に応じて、短いもしくは中間の長さの配列または、運搬体としての役割を果たすこ
とができるより長い配列であってもよい。ある特定の実施形態において、上記ＸＴＥＮは
、約６〜約９９アミノ酸残基の短いセグメント、約１００〜約３９９のアミノ酸残基の中
間の長さ、ならびに約４００〜約１０００の及び最大で約３０００のアミノ酸残基のより
長い長さを含む。したがって、ＦＩＸ中に挿入されたまたはＦＩＸに連結された上記ＸＴ
ＥＮは、長さが、約６、約１２、約３６、約４０、約４２、約７２、約９６、約１４４、
約２８８、約４００、約５００、約５７６、約６００、約７００、約８００、約８６４、
約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、または最大で３０００の
アミノ酸残基の長さであってよい。他の実施形態において、上記ＸＴＥＮ配列は、長さが
、約６〜約５０、約５０から約１００、約１００〜１５０、約１５０〜２５０、約２５０
〜４００、約４００〜約５００、約５００〜約９００、約９００〜１５００、約１５００
〜２０００、または約２０００〜約３０００のアミノ酸残基である。ＦＩＸ中に挿入され
たまたはＦＩＸに連結されたＸＴＥＮの正確な長さは、上記ＦＩＸの活性に悪影響を与え
ることなく変化し得る。一実施形態において、本明細書で用いられる１または複数のＸＴ
ＥＮは、４２のアミノ酸、７２のアミノ酸、１４４のアミノ酸、２８８のアミノ酸、５７
６のアミノ酸、または８６４のアミノ酸の長さを有し、且つ上記ＸＴＥＮファミリー配列
、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣまたはＢＤの１または複数から
選択することができる。
いくつかの実施形態において、本発明で用いられるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４
２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、
ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５
２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ
３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、
ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７
６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ
６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、
ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６
４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、Ｂ
Ｄ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、Ａ
Ｅ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８
、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３
３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ
１９０８、ＡＧ２００４、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される配列
と、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ＵＳ２０
１０−０２３９５５４Ａ１を参照されたい。１つの特定の実施形態において、上記ＸＴＥ
Ｎは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＧ４
２、ＡＧ７２、ＡＧ１４４、ＡＧ２８８、ＡＧ５７６、ＡＧ８６４、またはそれらの任意
の組み合わせを含む。
一実施形態において、上記ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ３６（配列番号２１７）、ＡＥ４２（
配列番号３４）、ＡＥ７２（配列番号３５）、ＡＥ７８（配列番号２１８）、ＡＥ１４４
（配列番号３６）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号３７）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号３
８）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号３９）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号４０）、ＡＥ１
４４＿６Ｂ（配列番号４１）、ＡＧ１４４（配列番号４２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号
４３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号４４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号４５）、ＡＧ１４
４＿Ｆ（配列番号４６）、ＡＥ２８８（配列番号４７）、ＡＥ２８８＿２（配列番号４８
）、ＡＧ２８８（配列番号４９）、ＡＥ５７６（配列番号５０）、ＡＧ５７６（配列番号
５１）、ＡＥ８６４（配列番号５２）、ＡＧ８６４（配列番号５３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７
２＿２Ａ＿１（配列番号２０２）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿２（配列番号２０３）、
ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿１（配列番号２０４）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿２（配
列番号２０５）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿４Ａ＿２（配列番号２０６）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７
２＿５Ａ＿２（配列番号２０７）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿１（配列番号２０８）、
ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿２（配列番号２０９）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿１（配
列番号２１０）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿２（配列番号２１１）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１
４４＿１Ａ（配列番号２１２）、ＡＥ１５０（配列番号２１３）、ＡＧ１５０（配列番号
２１４）、ＡＥ２９４（配列番号２１５）、ＡＧ２９４（配列番号２１６）、及びそれら
の任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％
、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である
。
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮの１００％未満のアミノ酸が、グリシン（Ｇ）
、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン
（Ｐ）から選択され、または該配列の１００％未満が、表２Ａの配列モチーフまたは表２
ＢのＸＴＥＮ配列からなる。かかる実施形態において、上記ＸＴＥＮの残余のアミノ酸残
基は、その他の１４種の天然Ｌ−アミノ酸のいずれかから選択されるが、上記ＸＴＥＮ配
列が少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％、または少なくとも約９９％の親水性アミノ酸を含有するように、親水性アミノ酸
から優先的に選択されてもよい。上記複合化構築物において利用される上記ＸＴＥＮ中の
疎水性アミノ酸の含有量は、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ
酸含有量であってよい。ＸＴＥＮの構築においてあまり好ましくない疎水性残基としては
、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及
びメチオニンが挙げられる。また、ＸＴＥＮ配列中の以下のアミノ酸、すなわち、メチオ
ニン（例えば、酸化を回避するため）、またはアスパラギン及びグルタミン（脱アミド化
を回避するため）の含有量は、５％未満もしくは４％未満もしくは３％未満もしくは２％
未満もしくは１％未満であってもよく、またはＸＴＥＮは上記アミノ酸を含まなくてもよ
い。
別の実施形態において、上記ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ３６（配列番号２１７）、ＡＥ４２
（配列番号３４）、ＡＥ７２（配列番号３５）、ＡＥ７８（配列番号２１８）、ＡＥ１４
４（配列番号３６）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号３７）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号
３８）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号３９）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号４０）、Ａ１
４４＿６Ｂ（配列番号４１）、ＡＧ１４４（配列番号４２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号
４３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号４４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号４５）、ＡＧ１４
４＿Ｆ（配列番号４６）、ＡＥ２８８（配列番号４７）、ＡＥ２８８＿２（配列番号４８
）、ＡＧ２８８（配列番号４９）、ＡＥ５７６（配列番号５０）、ＡＧ５７６（配列番号
５１）、ＡＥ８６４（配列番号５２）、ＡＧ８６４（配列番号５３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７
２＿２Ａ＿１（配列番号２０２）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿２（配列番号２０３）、
ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿１（配列番号２０４）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿２(配
列番号２０５）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿４Ａ＿２（配列番号２０６）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７
２＿５Ａ＿２（配列番号２０７）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿１（配列番号２０８）、
ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿２（配列番号２０９）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿１（配
列番号２１０）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿２（配列番号２１１）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１
４４＿１Ａ（配列番号２１２）、ＡＥ１５０（配列番号２１３）、ＡＧ１５０（配列番号
２１４）、ＡＥ２９４（配列番号２１５）、ＡＧ２９４（配列番号２１６）、及びそれら
の任意の組み合わせからなる群より選択される。特定の実施形態において、上記ＸＴＥＮ
配列は、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、及びＡＥ２８８からなる群より選択される。本発明の特
定のＸＴＥＮ配列のアミノ酸配列を表２Ｂに示す。
Figure 2021078526
Figure 2021078526
Figure 2021078526
Figure 2021078526
Figure 2021078526
更なる実施形態において、本発明で用いられるＸＴＥＮ配列は、本発明の融合タンパク
質の物理的または化学的特性、例えば薬物動態に影響を及ぼす。本発明で用いられるＸＴ
ＥＮ配列は、以下の有利な特性、すなわち、立体構造の柔軟性、水に対する高い溶解性、
高いプロテアーゼ耐性、低免疫原性、哺乳動物の受容体への低結合性、または流体力学的
（またはストークス）半径の増加の1種または複数種を示すことができる。特定の実施形
態において、本発明におけるＦＩＸタンパク質に連結されたＸＴＥＮ配列は、より長い終
末相半減期、増加した生物学的利用能または曲線下面積（ＡＵＣ）など、薬物動態学的特
性を増加させ、その結果、本明細書に記載のタンパク質は、野生型ＦＩＸと比較して、長
い期間インビボに留まる。更なる実施形態において、本発明に用いられるＸＴＥＮ配列は
、より長い終末相半減期または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加などの薬物動態学的特性を増
加させ、その結果、ＦＩＸタンパク質は、野生型ＦＩＸと比較して、長い期間インビボに
留まる。
いくつかの実施形態において、上記ＦＩＸタンパク質は、天然のＦＩＸ、ｒＦＩＸＦｃ
、ＦＩＸ Ｒ３３８Ｌ、もしくは上記ＸＴＥＮをもたない対応するＦＩＸタンパク質より
も少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約４
倍長いインビボ半減期を示す。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質
のインビボ半減期は、異種部分をもたないＦＩＸポリペプチドよりも２倍を超えて長い場
合がある。
他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、異種部分をもたないＦＩＸポリペ
プチドのインビボ半減期よりも、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも
約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくと
も約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、
少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１
８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なく
とも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間
、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約
２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少な
くとも約３３時間、または少なくとも約３４時間長いインビボ半減期を示す。
上記ＸＴＥＮ配列を含むタンパク質の物理的／化学的特性を決定するために、様々な方
法及びアッセイを用いることができる。かかる方法としては、分析用遠心法、ＥＰＲ、Ｈ
ＰＬＣ−イオン交換、サイズ排除ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、光散乱、キャピラリー電気泳
動、円二色性、示差走査熱量測定、蛍光分析、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ
、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈折率測定、及びＵＶ／可視分光法が挙げられるが、こ
れらに限定はされない。更なる方法がＡｍａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ ａ
ｎｄ Ｐｕｒｉｆ ４８，１−１３（２００６）に開示される。
本発明に従って用いることができるＸＴＥＮの更なる例が米国特許公開第２０１０／０
２３９５５４Ａ１号、第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、第２０１１／００４６０６０
Ａ１号、第２０１１／００４６０６１Ａ１号、第２０１１／００７７１９９Ａ１号、もし
くは第２０１１／１７２１４６Ａ１号、または国際特許公開第ＷＯ２０１００９１１２２
Ａ１号、第ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２号、第ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１号、第Ｗ
Ｏ２０１１０２８２２８Ａ１号、第ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１号、第ＷＯ２０１１０
２８３４４Ａ２号、第ＷＯ２０１４／０１１８１９Ａ２号、または第２０１５／０２３８
９１号に記載される。
いくつかの態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内に挿入されているか、Ｆ
ＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である１または複数のＸＴＥＮ配
列を含む。一実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ配列はＧＬＡドメイン内に
挿入されている。別の実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ配列はＥＧＦ１ド
メイン内に挿入されている。他の実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ配列は
ＥＧＦ２内に挿入されている。更に他の実施形態において、上記１または複数のＸＴＥＮ
配列はＡＰ内に挿入されている。更に他の実施形態において、上記１または複数のＸＴＥ
Ｎ配列は触媒ドメイン内に挿入されている。いくつかの実施形態において、上記１または
複数のＸＴＥＮ配列は上記ＦＩＸのＣ末端に融合されている。
特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される挿入部位に挿入され
た１または複数のＸＴＥＮ配列を含む。他の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表
７に列挙される２の挿入部位に挿入された２のＸＴＥＮ配列を含む。ある特定の態様にお
いて、上記２のＸＴＥＮ配列は表８に列挙される２の挿入部位に挿入されている。ある特
定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される３の挿入部位に挿入され
た３のＸＴＥＮ配列を含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に
列挙される４の挿入部位に挿入された４のＸＴＥＮ配列を含む。ある特定の態様において
、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される５の挿入部位に挿入された５のＸＴＥＮ配
列を含む。ある特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される６の挿
入部位に挿入された６のＸＴＥＮ配列を含む。いくつかの態様において、全ての上記挿入
されたＸＴＥＮ配列は同一である。他の態様において、少なくとも１の上記挿入されたＸ
ＴＥＮ配列は残余の挿入されたＸＴＥＮ配列と異なる。
いくつかの態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１０３、配
列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９
、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１
７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ
酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より
選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で当該ＦＩＸポリペプチド内に挿入された１のＸ
ＴＥＮを含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を示す。いくつかの態様におい
て、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０
５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸
１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミ
ノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２の
アミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に対
応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に第２のＸＴＥＮを含むか、または第２のＸ
ＴＥＮは上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合され、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血
促進活性を示す。１つの特定の態様において、ＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸのＣ
末端に融合された１のＸＴＥＮ配列を含み、該ＸＴＥＮは、長さが４２のアミノ酸よりも
長く且つ１４４のアミノ酸よりも短いアミノ酸配列を含む。
ＩＩ．Ｂ．２．Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、Ｆｃ領域（例えば、Ｆ
ｃＲｎ結合パートナー）またはその断片である。ある特定の態様において、本発明のＦＩ
Ｘ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ内に挿入された、該ＦＩＸのＣ末端に融合された、また
はそれらの両方である少なくとも１のＦｃ領域（例えば、ＦｃＲｎ結合パートナー）を含
み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、且つ宿主細胞中、インビボまたは
インビトロで発現させることができる。本明細書では、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」とは
、別段の明示がない限り、Ｆｃドメイン、その変異体、または断片を含む機能性胎児性Ｆ
ｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合パートナーであってもよい。ＦｃＲｎ結合パートナーは、Ｆｃ
Ｒｎ受容体が特異的に結合することができ、その結果として生じる、アルブミンを始めと
する、但しそれには限定されない、当該ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎ受容体による
能動輸送を伴う任意の分子である。したがって、Ｆｃという用語は、機能性である、Ｉｇ
Ｇ Ｆｃの任意の変異体を包含する。上記ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の
領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込
まれる、Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９（１９９
４））。上記Ｆｃの上記ＦｃＲｎとの主要な接触領域はＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメイン
との接合部の近傍である。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触部は全て単一のＩｇ重鎖内である。Ｆｃ
Ｒｎ結合パートナーとしては、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、及びＦｃＲｎの完全な結合
領域を含むＩｇＧの他の断片が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｆｃは、免疫グ
ロブリンのヒンジ領域を伴なってまたは伴わずに免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン及びＣ
Ｈ３ドメインを含んでいてもよい。融合タンパク質中でＦｃ領域の所望の特性、例えば、
半減期、例えばインビボ半減期の増加を維持するＦｃ断片、変異体、または誘導体も含ま
れる。無数の突然変異体、断片、変異体及び誘導体が、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１
１／０６９１６４Ａ２号、第ＷＯ２０１２／００６６２３Ａ２号、第ＷＯ２０１２／００
６６３５Ａ２号、または第ＷＯ２０１２／００６６３３Ａ２号等に記載されており、これ
らは全て、それらの全体が本明細書に参照により援用される。
上記１または複数のＦｃドメインは、上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入されているか、
該ポリペプチドのＣ末端に融合されているか、またはその両方であってよい。いくつかの
実施形態において、上記Ｆｃドメインは上記ＦＩＸポリペプチドに融合されている。いく
つかの実施形態において、上記Ｆｃドメインは、ＸＴＥＮなどの、上記ＦＩＸ内に挿入さ
れているかまたは上記ＸＴＥＮのＣ末端に融合されている別の異種部分に融合されている
。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は第２のＦｃドメインを含む。
第２のＦｃドメインは、例えば、１または複数の共有結合を介して第１のＦｃドメインと
会合していてもよい。
ＩＩ．Ｂ．３．アルブミン
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、アルブミン、アルブミ
ン結合ドメイン、もしくはアルブミン結合低分子、またはそれらの変異体、誘導体もしく
は断片である。特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸ内に
挿入された、上記ＦＩＸのＣ末端に融合された、またはそれらの両方である少なくとも１
のアルブミンポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、当該ＦＩＸ
融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現さ
せることができる。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、その完全長の形態で６
０９のアミノ酸のタンパク質であり、血清の浸透圧の相当部分を担い、且つ内因性及び外
因性リガンドの運搬体としても作用する。本明細書では、「アルブミン」という用語は、
完全長アルブミンまたはその機能を有する断片、変異体、誘導体、または類似体を包含す
る。アルブミンまたはその断片もしくは変異体の例は、米国特許公開第２００８／０１９
４４８１Ａ１号、第２００８／０００４２０６Ａ１号、第２００８／０１６１２４３Ａ１
号、第２００８／０２６１８７７Ａ１号、もしくは第２００８／０１５３７５１Ａ１号、
またはＰＣＴ出願公開第２００８／０３３４１３Ａ２号、第２００９／０５８３２２Ａ１
号、または第２００７／０２１４９４Ａ２号に開示され、これらは参照によりそれらの全
体が本明細書に援用される。
アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ）は、限定されるものではないが、細菌アルブミ
ン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミンに結合することができるア
ルブミン結合抗体断片を損なう場合がある。Ｋｒａｕｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．３７８：１９０−１９４（１９９６）及びＬｉｎｈｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１：２０６−２１３（２００２）によって開示されたレンサ球
菌タンパク質Ｇ由来のドメイン３が細菌アルブミン結合ドメインの例である。アルブミン
結合ペプチドの例としては、核となる配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１６３）を
有する一連のペプチドが挙げられる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）を参照されたい
。アルブミン結合抗体断片の例は、Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９−３２６（２００７）；Ｒｏｏｖｅｒｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３
−３１７（２００７），及びＨｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ
Ｓｃｉ．，２１：２８３−２８８（２００８）に開示され、これらは参照によりそれら
の全体が本明細書に援用される。
ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に挿入され
た、該ＦＩＸのＣ末端に融合された、またはそれらの両方であるアルブミンに結合するこ
とができる非ポリペプチド低分子、その変異体、または誘導体（例えばアルブミン結合低
分子）のための少なくとも１の結合部位を含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活
性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる。例えば、
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、１または複数の挿入部位で上記ＦＩＸ内に結合された
、または該ＦＩＸのＣ末端に融合された１または複数の有機アルブミン結合部分を含んで
いてもよく、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボま
たはインビトロで発現させることができる。かかるアルブミン結合部分の一例には、Ｔｒ
ｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０：２２８６−２
２９２（２００９）によって開示される２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（
４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）がある
。
いくつかの実施形態において、上記アルブミン結合ポリペプチド配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒペプチドリンカー配列によって、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端に隣接している。
いくつかの実施形態において、上記Ｇｌｙ−ＳｅｒペプチドリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒ（
配列番号１６１）である。他の実施形態において、上記Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー
は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。
ＩＩ．Ｂ．４．ＣＴＰ
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）またはその断片、変異体もしくは誘導
体である。ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に
挿入されているか、該ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である少
なくとも１のＣＴＰまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、当該ＦＩＸ融合タ
ンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させるこ
とができる。組換えタンパク質中に挿入された１または複数のＣＴＰペプチドは、当該の
タンパク質の半減期を増加させることが知られている。例えば、参照によりその全体が本
明細書に援用される、米国特許第５，７１２，１２２号を参照されたい。例示的なＣＴＰ
ペプチドとしては、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩ
Ｌ（配列番号１６４）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰ
Ｑ（配列番号１６５）が挙げられる。例えば、参照により援用される、米国特許出願公開
第２００９／００８７４１１Ａ１号を参照されたい。いくつかの実施形態において、上記
ＣＴＰ配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列によって、Ｃ末端、Ｎ末端、または
両方の末端に隣接する。いくつかの実施形態において、上記Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリン
カーはＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１６１）である。他の実施形態において、上記Ｇｌｙ−
Ｓｅｒペプチドリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。
ＩＩ．Ｂ．５．ＰＡＳ
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分はＰＡＳペプチドである。
ある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に挿入されて
いるか、該ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である少なくとも１
つのＰＡＳペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、当該ＦＩＸ融合タ
ンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させるこ
とができる。本明細書では、「ＰＡＳペプチド」または「ＰＡＳ配列」とは、主としてア
ラニン及びセリン残基を含む、または主としてアラニン、セリン及びプロリン残基を含み
、生理学的条件下でランダムコイルの立体構造を形成するアミノ酸配列を意味する。した
がって、上記ＰＡＳ配列は、本融合タンパク質中において上記異種部分の一部として用い
ることができる、アラニン、セリン、及びプロリンを含む、それらから本質的になる、も
しくはそれらからなる、ビルディングブロック、アミノ酸ポリマー、または配列カセット
である。アミノ酸ポリマーは、アラニン、セリン、及びプロリン以外の残基がＰＡＳ配列
中の微量成分として添加される場合、ランダムコイル立体構造を形成することもできる。
「微量成分」とは、アラニン、セリン、及びプロリン以外のアミノ酸が、ある程度まで、
例えば、アミノ酸の約１２％、すなわち上記ＰＡＳ配列の１００のアミノ酸の約１２まで
、約１０％まで、約９％まで、約８％まで、約６％、約５％、約４％、約３％、すなわち
約２％、または約１％、上記ＰＡＳ配列中に添加されていてもよいことを意味する。上記
アラニン、セリン、及びプロリン以外のアミノ酸は、Ａｌｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、
Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、
Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌからなる群より選択することができる。生理学的条件下では
、ＰＡＳペプチドはランダムコイル立体構造を形成し、それにより本発明の組換えタンパ
ク質に対してインビボ及び／またはインビトロ安定性の増加を媒介することができ、凝血
促進活性を有する。
上記ＰＡＳペプチドの非限定的な例としては、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡ
ＰＡ（配列番号１５４）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号１５５
）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号１５６）、ＡＰＳＳＰＳＰＳ
ＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号１５７）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰ
Ａ（配列番号１５８）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号
１５９）、ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号１６０）またはそれら
の任意の変異体、誘導体、断片、もしくは組み合わせが挙げられる。ＰＡＳ配列の更なる
例は、例えば、米国特許公開第２０１０／０２９２１３０Ａ１号及びＰＣＴ出願公開第Ｗ
Ｏ２００８／１５５１３４Ａ１号から公知である。欧州交付特許第２１７３８９０号。
いくつかの実施形態において、上記ＰＡＳ配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配
列によって、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端に隣接する。いくつかの実施形態におい
て、上記Ｇｌｙ−ＳｅｒペプチドリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１６１）である。
他の実施形態において、上記Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（
配列番号１６２）である。
ＩＩ．Ｂ．６．ＨＡＰ
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、ホモ−アミノ酸ポリマ
ー（ＨＡＰ）ペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体である。ある特定の態様に
おいて、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩＸ内に挿入されているか、該ＦＩＸ
のＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である少なくとも１のホモ−アミノ酸
ポリマー（ＨＡＰ）ペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、当該ＦＩ
Ｘ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現
させることができる。ＨＡＰペプチドは、少なくとも５０のアミノ酸、少なくとも１００
のアミノ酸、１２０のアミノ酸、１４０のアミノ酸、１６０のアミノ酸、１８０のアミノ
酸、２００のアミノ酸、２５０のアミノ酸、３００のアミノ酸、３５０のアミノ酸、４０
０のアミノ酸、４５０のアミノ酸、または５００のアミノ酸の長さであるグリシンの反復
配列を含んでいてよい。ＨＡＰ配列は、当該ＨＡＰ配列に融合または連結された部分の半
減期を延長することができる。上記ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、それらに限定は
されないが、（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが
挙げられ、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。一実施形態において、ｎは、２
０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３
、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態において、ｎ
は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０
、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈ
ｙ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，
２０：２７３−２８４（２００７）を参照されたい。
ＩＩ．Ｂ．７．有機ポリマー
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１の異種部分は、有機ポリマー、例えば
、ポリエチレングリコール、ポリシアル酸、またはヒドロキシエチルデンプンである。あ
る特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、当該ＦＩＸ中に挿入されてい
るか、該ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、またはそれらの両方である非ポリペプチド
異種部分またはその断片、変異体、もしくは誘導体のための少なくとも１の結合部位を含
み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはイン
ビトロで発現させることができる。例えば、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、上記ＦＩ
Ｘ配列内に結合されているか、該ＦＩＸのＣ末端に結合されているか、またはそれらの両
方である１または複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含んでいてもよく、当
該ＦＩＸ融合タンパク質は凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロ
で発現させることができる。
ペグ化ＦＩＸは、ＦＩＸと少なくとも１のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子との
間で形成される複合体を指すことができる。多種多様な分子量及び平均分子量範囲のＰＥ
Ｇが市販されている。ＰＥＧの平均分子量範囲の一般的な例としては、約２００、約３０
０、約４００、約６００、約１０００、約１３００〜１６００、約１４５０、約２０００
、約３０００、約３０００〜３７５０、約３３５０、約３０００〜７０００、約３５００
〜４５００、約５０００〜７０００、約７０００〜９０００、約８０００、約１００００
、約８５００〜１１５００、約１６０００〜２４０００、約３５０００、約４００００、
約６００００、及び約８００００ダルトンが挙げられるが、これらに限定はされない。こ
れらの平均分子量は単なる例として記載されており、何ら限定することを意味するもので
はない。
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、ペグ化してモノまたはポリ（例えば、２〜４）ＰＥ
Ｇ部分を含んでいてもよい。ペグ化は本技術分野で公知のペグ化反応のいずれかによって
行うことができる。ペグ化タンパク質生成物の調製方法は、概括的には、（ｉ）ポリペプ
チドをポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）
と、本発明のペプチドが１または複数のＰＥＧ基に結合した状態となる条件下で反応させ
ること、及び（ｉｉ）反応生成物を得ることを含むこととなる。一般に、当該反応の最適
反応条件は、既知のパラメータ及び所望の結果に基づいて個々の場合に応じて決定される
。
当業者に利用可能ないくつかのＰＥＧ結合方法、例えば、Ｍａｌｉｋ Ｆ ｅｔ ａｌ
．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−３５（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆ
ｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３（２）：４−１０（１９９２）；欧
州特許公開第ＥＰ０４０１３８４号、第ＥＰ０１５４３１６号、及び第ＥＰ０４０１３８
４号；及び国際特許出願公開第Ｗ０９２／１６２２１号及び第ＷＯ９５／３４３２６号が
ある。非限定的な例として、ＦＩＸ変異体は、本明細書に記載の１または複数の挿入部位
またはその付近でのシステイン置換を含んでいてもよく、該システインはＰＥＧポリマー
に更に複合化されていてもよい。参照によりその全体が本明細書に援用される、Ｍｅｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０−２７９（２０１０）及び米国特許第７，６
３２，９２１号を参照されたい。
他の実施形態において、上記有機ポリマーはポリシアル酸（ＰＳＡ）である。ＰＳＡは
、特定の細菌株によって及びある特定の細胞中の哺乳動物中で産生される、天然起源のシ
アル酸の非分枝ポリマーである。例えば、Ｒｏｔｈ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９３） ｉ
ｎ Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ：Ｆｒｏｍ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｔｏ Ｍａｎ，ｅ
ｄｓ．Ｒｏｔｈ Ｊ．，Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ Ｕ．，Ｔｒｏｙ Ｆ．Ａ．（Ｂｉｒｋ
ｈａｕｓｅｒＶｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），ｐｐ．３３５−４
８を参照されたい。ＰＳＡは、限定された酸加水分解またはノイラミニダーゼによる消化
、または天然の、細菌由来の形態のポリマーの分画によって、ｎ＝約８０以上のシアル酸
残基からｎ＝２までの様々な重合度で産生することができる。当業者に利用可能な多数の
ＰＳＡ結合方法、例えば上記の同一のＰＥＧ結合方法がある。ある特定の態様において、
活性化したＰＳＡをＦＩＸ上のシステインアミノ酸残基に結合することもできる。例えば
、米国特許第５８４６９５１号を参照されたい。
他の実施形態において、上記有機ポリマーはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）ポリ
マーである。特定の態様において、本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、１または複数の部
位で上記ＦＩＸ内に複合化されているか、該ＦＩＸのＣ末端に融合されているか、または
それらの両方である少なくとも１のＨＥＳポリマーを含み、当該ＦＩＸ融合タンパク質は
凝血促進活性を有し、宿主細胞中、インビボまたはインビトロで発現させることができる
。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び製造方法
本発明は、更に、本明細書に記載のＦＩＸ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ド、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、上記ポリヌクレオチドもしくは上記ベク
ターを含む宿主細胞、または上記ＦＩＸ融合タンパク質の製造方法を提供する。
ＦＩＸ融合タンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、単一のヌクレオチド配列
、２のヌクレオチド配列、３のヌクレオチド配列、またはそれ以上であってよい。一実施
形態において、単一のヌクレオチド配列は、ＦＩＸポリペプチド及び異種部分（例えばＸ
ＴＥＮ）を含むＦＩＸ融合タンパク質、例えば、ＦＩＸポリペプチド及び、該ＦＩＸポリ
ペプチド内に挿入されたＸＴＥＮ、該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されたＦｃドメ
イン、及び任意選択のリンカーによって上記ＦＩＸポリペプチドに融合された第２のＦｃ
ドメインを含むＦＩＸ融合タンパク質をコードする。別の実施形態において、上記ポリヌ
クレオチドは２のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列はＦＩＸポリペプチ
ド及び該ＦＩＸポリペプチド内に挿入されたＸＴＥＮをコードし、第２のヌクレオチド配
列は異種部分、例えばＦｃをコードする。他の実施形態において、上記ポリヌクレオチド
は２のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列は、ＦＩＸポリペプチド、該Ｆ
ＩＸポリペプチド内に挿入されたＸＴＥＮ、及び該ＦＩＸポリペプチドに融合されたＦｃ
ドメインをコードし、第２のヌクレオチド配列は第２のＦｃドメインをコードする。上記
コードされたＦｃドメインは発現後に共有結合を形成してもよい。
いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質をコードする上記ポリヌクレオ
チドはコドン最適化されている。
本明細書では、発現ベクターとは、適宜の宿主細胞に導入されたときに、挿入されたコ
ード配列を転写及び翻訳するために必要な要素を含む任意の核酸構築物、またはＲＮＡウ
イルスベクターの場合、複製及び翻訳するために必要な要素を指す。発現ベクターは、プ
ラスミド、ファージミド、ウイルス、及びそれらの誘導体を包含することができる。
本明細書では、遺伝子発現制御配列とは、プロモーター配列またはプロモーター−エン
ハンサーの組み合わせなどの、当該遺伝子発現制御配列が作動可能に連結されたコード核
酸の効率的な転写及び翻訳を促進する、任意の調節ヌクレオチド配列である。上記遺伝子
発現制御配列は、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの、哺乳動
物またはウイルスのプロモーターであってよい。構成的哺乳動物プロモーターとしては、
以下の遺伝子、すなわち、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ
）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチンプロモーター、及び他
の構成的プロモーターの遺伝子のためのプロモーターが挙げられるが、これらに限定はさ
れない。真核細胞において構成的に作用するウイルスプロモーターとしては、例えば、サ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えばＳＶ４０）、パピローマウイ
ルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイト
メガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、及び他のレトロウ
イルス由来のプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモー
ターが挙げられる。他の構成的プロモーターは当業者に公知である。本発明の遺伝子発現
配列として有用なプロモーターとしては、誘導性プロモーターも挙げられる。誘導性プロ
モーターは誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、あ
る特定の金属イオンの存在下で誘導され、転写及び翻訳を促進する。他の誘導性プロモー
ターは当業者に公知である。
本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を用いることができる。これらの発現ベ
クターは、一般的には、宿主生物中でエピソームとしてまたは宿主の染色体ＤＮＡの不可
欠な部分として複製可能である。発現ベクターは、プロモーター（例えば、天然に会合し
ているプロモーターまたは異種プロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライ
スシグナル、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列を含む、但しこれらに限定され
ない発現制御配列を含んでいてもよい。上記発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換ま
たはトランスフェクトすることができるベクター中の真核生物プロモーター系であること
が好ましい。発現ベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウ
イルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶま
たはＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動
物ウイルス由来のＤＮＡエレメントを利用することもできる。他の発現ベクターは内部リ
ボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を含む。
一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする
選別マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐
性またはネオマイシン耐性）を含む（例えば、Ｉｔａｋｕｒａｅｔａｌ、米国特許第４，
７０４，３６２号を参照のこと）。当該ＤＮＡをその染色体中に組み込んだ細胞を、トラ
ンスフェクトされた宿主細胞の選別を可能にする１種または複数種のマーカーを導入する
ことによって選別することができる。上記マーカーは、栄養要求性宿主に原栄養性、殺生
剤耐性（例えば抗生物質）または銅などの重金属に対する耐性を付与することができる。
上記選別可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接連結するか、または
同時形質転換によって同一細胞中に導入するかのいずれかとすることができる。
最適化されたＦＩＸ配列を発現するのに有用なベクターの例としてはＮＥＯＳＰＬＡ（
米国特許第６，１５９，７３０号）がある。このベクターは、サイトメガロウイルスプロ
モーター／エンハンサー、マウスβ−グロビンの主要なプロモーター、ＳＶ４０複製起点
、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソ
ン１及びエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及びリーダー配列を含む。このベ
クターは、可変領域及び定常領域遺伝子を組み込み、細胞中にトランスフェクトし、続い
てＧ４１８含有培地中において選別し、且つメトトレキセート増幅を行うと、抗体を非常
に高レベルで発現することが見出されている。ベクター系は米国特許第５，７３６，１３
７号及び第５，６５８，５７０号においても教示され、それらのそれぞれは参照によりそ
の全体が本明細書に援用される。この系は高発現レベル、例えば３０ｐｇ超／細胞／日を
与える。他の例示的なベクター系が、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示さ
れる。
他の実施形態において、本発明のポリペプチドは多シストロン性構築物を用いて発現さ
れる。これらの発現系においては、多量体結合タンパク質の複数のポリペプチドなどの複
数の目的とする遺伝子産物を、単一の多シストロン性構築物から産生させることができる
。これらのシステムは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有利に用いて、真核生物
宿主細胞において比較的高レベルのポリペプチドを与える。適合性のあるＩＲＥＳ配列が
、これも本明細書に援用される、米国特許第６，１９３，９８０号に開示される。
より概括的には、ポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されれば
、当該発現ベクターを適宜の宿主細胞に導入することができる。すなわち、上記宿主細胞
を形質転換することができる。上記宿主細胞への上記プラスミドの導入は、上記に議論し
た、当業者に周知の様々な技法によって実現することができる。上記形質転換された細胞
を、当該ＦＩＸポリペプチドの産生に適した条件下で増殖させて、ＦＩＸポリペプチドの
合成に関してアッセイを行う。例示的なアッセイ技法としては、酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞ソーター分
析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
組換え宿主からポリペプチドを単離する方法の説明において、「細胞」及び「細胞培養
物」という用語は、別段の明確な明示がない限り、ポリペプチドの供給源を表わすために
同義で用いられる。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収とは、遠沈した細胞
全体から、または培地と懸濁した細胞の両方を含む細胞培養物からのいずれかを意味する
場合がある。
タンパク質発現のために用いられる宿主細胞株は、好ましくは哺乳動物起源、最も好ま
しくはヒトまたはマウス起源の細胞株である。例示的な宿主細胞株は上述されている。Ｆ
ＩＸ活性を有するポリペプチドの製造方法の一実施形態において、上記宿主細胞はＨＥＫ
２９３細胞である。ＦＩＸ活性を有するポリペプチドの製造方法の別の実施形態において
、上記宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子はまた、細菌または酵母または植物細胞など
の非哺乳動物細胞においても発現させることができる。この点に関して、細菌などの種々
の単細胞非哺乳動物微生物、すなわち、培養または発酵で増殖させることができる微生物
も形質転換させることができることが理解されよう。形質転換しやすい細菌としては、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株などの腸内細菌科に属
する細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐｎｅ
ｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎ
ｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる。上記ポリペプチドは、細菌中で発現される場合、一般的
には封入体の一部となることが更に理解されよう。上記ポリペプチドを単離し、精製し、
次いで機能をもつ分子へと組み立てるする必要がある。
あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列は、遺伝子導入動物のゲノムへの導入及びそ
の後の該遺伝子導入動物の乳における発現のための導入遺伝子中に組み込まれてもよい（
例えば、Ｄｅｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ５，７４１，９５７，Ｒｏｓｅｎ，ＵＳ５，
３０４，４８９，及びＭｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ５，８４９，９９２を参照のこと
）。好適な導入遺伝子としては、カゼインまたはβ−ラクトグロブリンなどの乳腺特異的
遺伝子由来のプロモーター及びエンハンサーと作動可能に連結したポリペプチドのための
コード配列が挙げられる。
インビトロでの産生により、大量の所望のポリペプチドを得るためのスケールアップが
可能となる。組織培養条件下での哺乳動物細胞の培養技法は本技術分野で公知であり、例
えば、エアリフト型反応器もしくは連続撹拌反応器中での均一浮遊培養、または例えば中
空繊維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリ
ッジ上での固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）または封入（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）細胞培
養が挙げられる。必要及び／または所望であれば、ポリペプチドの溶液を、例えば、合成
ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後に、または本明細書に記載のＨＩＣクロマ
トグラフィーステップの前もしくはその後に、慣用的なクロマトグラフィー法、例えばゲ
ルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィ
ーまたは（免疫）アフィニティークロマトグラフィーによって精製してもよい。任意選択
で、下流での精製を容易にするために、親和性タグ配列（例えば、Ｈｉｓ（６）タグ）を
当該ポリペプチド配列内に結合させてもまたは含ませてもよい。
発現後、本ＦＩＸタンパク質を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマ
トグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含む、本技術分野の標準的な手順に従
って精製してもよい（概括的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。医薬
用途には、少なくとも約９０％〜９５％の均一性の実質的に純粋なタンパク質が好ましく
、９８％〜９９％またはそれ以上の均一性の上記タンパク質が最も好ましい。
一実施形態において、上記宿主細胞は真核細胞である。本明細書では、真核細胞とは明
確な核を有する任意の動物または植物細胞を指す。動物の真核細胞としては、脊椎動物、
例えば哺乳動物の細胞、及び無脊椎動物、例えば昆虫の細胞が挙げられる。植物の真核細
胞としては、詳細には酵母細胞を挙げることができるが限定はされない。真核細胞は原核
細胞、例えば細菌とは異なる。
特定の実施形態において、上記真核細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は哺乳動
物に由来する任意の細胞である。哺乳動物細胞としては、詳細には哺乳動物細胞株が挙げ
られるがこれらに限定はされない。一実施形態において、上記哺乳動物細胞はヒト細胞で
ある。別の実施形態において、上記哺乳動物細胞はヒト胚性腎臓細胞株であるＨＥＫ２９
３細胞である。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＲＬ−１５３３として、バージニア州マナサスの
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより、及び２９３
−Ｈ細胞、カタログ番号１１６３１−０１７または２９３−Ｆ細胞、カタログ番号１１６
２５−０１９として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）より入
手可能である。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物細胞は、網膜由来のヒト細胞
株であるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞はＣｒｕ
ｃｅｌｌ（オランダ国ライデン）より入手可能である。他の実施形態において、上記哺乳
動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞はバージニア
州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより
入手可能である。（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＣＣＬ−６）。更に他の実施形態において、
上記哺乳動物細胞はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。ＢＨＫ細胞はバージニ
ア州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎよ
り入手可能である。（例えば、ＣＲＬ−１６３２）。いくつかの実施形態において、上記
哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞とヒトＢ細胞株のハイブリッド細胞株であるＨＫＢ１
１細胞である。Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（２）：１
６５−７８（２００６）。
更に他の実施形態において、トランスフェクトされた細胞は安定にトランスフェクトさ
れている。これらの細胞は、当業者に公知の従来の技法を用いて、安定な細胞株として選
別し且つ維持することができる。
本タンパク質のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞を適宜の増殖培地中で増殖させる。本
明細書では、「適宜の増殖培地」という用語は、細胞の増殖に必要な栄養素を含む培地を
意味する。細胞増殖に必要な栄養素としては、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン
、ミネラル、及び成長因子を挙げることができる。任意選択で、上記培地は１種または複
数種の選別因子を含有していてもよい。任意選択で、上記培地は仔ウシ血清またはウシ胎
仔血清（ＦＣＳ）を含有していてもよい。一実施形態において、上記培地は実質的にＩｇ
Ｇを含有しない。上記増殖培地は、一般に、例えば、薬物選別、または上記ＤＮＡ構築物
上のもしくは該ＤＮＡ構築物と共に同時トランスフェクトされた選別可能なマーカーによ
って補完される必須栄養素の欠乏によって、上記ＤＮＡ構築物を含有する細胞を選別する
。培養された哺乳動物細胞は、一般に、市販の血清含有培地または無血清培地（例えば、
ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で増殖させる。一実施形態において、上記培地
はＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）である。別の
実施形態において、上記培地はＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カー
ルスバッド）である。用いられる特定の細胞株に適した培地の選択は当業者のレベル内で
ある。
いくつかの実施形態において、上記核酸、ベクター、または宿主細胞は、タンパク質転
換酵素をコードする更なるヌクレオチドを更に含む。上記タンパク質転換酵素は、プロタ
ンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン５型（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、プロタンパ
ク質転換酵素サブチリシン／ケキシン７型（ＰＣＳＫ７またはＰＣ５）、酵母Ｋｅｘ２、
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン３型（ＰＡＣＥまたはＰＣＳＫ３）、及
びそれらの２種以上の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態におい
て、上記タンパク質転換酵素はＰＡＣＥ、ＰＣ５またはＰＣ７である。特定の実施形態に
おいて、上記タンパク質転換酵素はＰＣ５またはＰＣ７である。参照により本明細書に援
用される、国際出願公開第ＷＯ２０１２／００６６２３号を参照されたい。別の実施形態
において、上記タンパク質転換酵素はＰＡＣＥ／フューリンである。
特定の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって製造されるＦＩＸ融合
タンパク質に関する。
ある特定の態様において、本発明の宿主細胞は、インビボまたはインビトロで本ＦＩＸ
融合タンパク質を発現することができる。インビトロでの産生により、大量の所望の本発
明の改変ポリペプチドを得るためのスケールアップが可能となる。ＦＩＸ融合タンパク質
は、本ＦＩＸ融合タンパク質が発現される条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養す
ることによって産生することができる。組織培養条件下での哺乳動物細胞の培養技法は本
技術分野で公知であり、例えば、エアリフト型反応器もしくは連続撹拌反応器中での均一
浮遊培養、または例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズも
しくはセラミックカートリッジ上での固定化または封入細胞培養が挙げられる。必要及び
／または所望であれば、ポリペプチドの溶液を、慣用的なクロマトグラフィー法、例えば
ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ
、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製してもよい。他の態様において、上記宿主細胞はインビボで本ＦＩＸ融
合タンパク質を発現する。
一実施形態において、本発明は、ＦＩＸ融合タンパク質の製造方法であって、本明細書
に記載されるように、異種部分を挿入部位に挿入すること、上記ＦＩＸのＣ末端に異種部
分を融合すること、またはそれらの両方を含み、上記ＦＩＸ融合タンパク質が凝血促進活
性を示す上記方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、ＦＩＸタンパク質の半減期を、該ＦＩＸタンパク質
の凝血促進活性を失うまたは低下させることなく増加させる方法であって、本明細書に記
載されるように、異種部分を挿入部位に挿入すること、上記ＦＩＸのＣ末端に異種部分を
融合すること、またはそれらの両方を含み、上記ＦＩＸ融合タンパク質が、凝血促進活性
、及び上記異種部分をもたない上記ＦＩＸタンパク質と比較して半減期の増加を示す上記
方法を含む。
他の実施形態において、本発明は、ＦＩＸ融合タンパク質の構築方法であって、本明細
書に記載の、挿入部位中の、上記ＦＩＸのＣ末端に融合した、またはそれらの両方の少な
くとも１の異種部分を含む上記ＦＩＸ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を設
計することを含む上記方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、ＦＩＸ融合タンパク質の発現の増加方法であ
って、本明細書に記載されるように、異種部分を挿入部位に挿入すること、上記ＦＩＸの
Ｃ末端に融合すること、またはそれらの両方を含み、上記ＦＩＸ融合タンパク質が凝血促
進活性を示す上記方法を含む。
更に他の実施形態において、本発明は、ＦＩＸ融合タンパク質の凝血促進活性の保持方
法であって、本明細書に記載されるように、異種部分を挿入部位に挿入すること、上記Ｆ
ＩＸのＣ末端に異種部分を融合すること、またはそれらの両方を含み、上記ＦＩＸ融合タ
ンパク質が凝血促進活性を示す上記方法を提供する。
ＩＶ．医薬組成物及び治療方法
本発明は、本発明のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物を用いて、本方法を必要と
するヒトの対象における凝固疾患もしくは疾病または出血性疾病の予防、治療、改善、ま
たは管理方法を更に提供する。例示的な方法は、治療上有効な量の本発明のＦＩＸ融合タ
ンパク質を含む医薬組成物／製剤を、本方法を必要とする対象に投与することを含む。他
の態様において、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組成物が、それを必
要とする対象に投与されてもよい。本発明のある特定の態様において、本発明のＦＩＸ融
合タンパク質を発現する細胞が、それを必要とする対象に投与されてもよい。本発明のあ
る特定の態様において、上記医薬組成物は、（ｉ）ＦＩＸ融合タンパク質、（ｉｉ）ＦＩ
Ｘ融合タンパク質をコードする単離された核酸、（ｉｉｉ）ＦＩＸ融合タンパク質をコー
ドする核酸を含むベクター、（ｉｖ）ＦＩＸ融合タンパク質をコードする単離された核酸
及び／またはＦＩＸ融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む細胞、または
（ｖ）それらの組み合わせを含み、当該医薬組成物は許容される賦形剤または担体を更に
含む。
本発明のＦＩＸ融合タンパク質は、患者に静脈内投与、皮下投与、または経口投与する
ことができる。ある特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は静脈内注射によ
って対象に投与される。他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、皮下注射に
よって対象に投与される。上記注射は単回ボーラスから構成されてもよい。対象は複数回
の注射を受けてもよい。
本発明の融合タンパク質は予防的に用いることができる。本明細書では、「予防的処置
」という用語は、出血症状の発現の前に分子を投与することを指す。一実施形態において
、一般的な止血剤を必要とする上記対象は、外科手術を受けているか、または受けようと
している。本発明の融合タンパク質を予防薬として術前または術後に投与してもよい。本
発明の融合タンパク質を、急性出血症状の発現を制御するために、術中または術後に投与
してもよい。上記外科手術としては、肝移植、肝切除、歯科処置、または幹細胞移植が挙
げられるが、これらに限定はされない。
本発明の融合タンパク質はオンデマンド処置にも用いられる。「オンデマンド処置」と
いう用語は、出血症状の発現の徴候に応じて、または出血を起こす場合がある活動の前に
融合タンパク質を投与することを指す。一態様において、上記オンデマンド処置は、受傷
後などの出血が始まったとき、または外科手術の前などの出血が予期される場合に対象に
施される。別の態様において、上記オンデマンド処置は、接触を伴うスポーツなどの出血
の危険性を高める活動の前に施される。
他の実施形態において、本融合タンパク質は、急性の出血症状の発現を制御、改善、ま
たは治療するために用いられる。他の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は、上
記異種部分をもたない対応するＦＩＸタンパク質と比較して、１種または複数種の薬物動
態学的パラメータを示す。ＰＫパラメータは、ＦＩＸ抗原レベル（本明細書中では、多く
の場合、「抗原」として挿入句的に表記される。）またはＦＩＸ活性レベル（本明細書中
では、多くの場合、「活性」として挿入句的に表記される。）を基にする場合がある。文
献においては、多くの場合、一部の対象の血漿中に、投与された（すなわち外因性の）Ｆ
ＩＸを、ＦＩＸに対する抗体を用いて測定することができることに支障をきたす内因性の
不活性なＦＩＸが存在するために、ＰＫパラメータはＦＩＸ活性レベルを基にしている。
しかしながら、本明細書において提供されるＦｃ融合タンパク質の一部としてＦＩＸが投
与される場合には、上記異種ポリペプチドに対する抗体を用いて、投与された（すなわち
外因性の）ＦＩＸ抗原を正確に測定することができる。また、ある特定のＰＫパラメータ
はモデル予測データ（本明細書中では、多くの場合、「モデル予測」として挿入句的に表
記される）または観察データ（本明細書中では、多くの場合、「観察」として挿入句的に
表記される）を基にすることができ、好ましくは観察データを基にする。
本ＦＩＸ融合タンパク質は、本技術分野で公知の任意の手段によって対象に投与するこ
とができる。例えば、本ＦＩＸ融合タンパク質は、局所（例えば、経皮または眼）、経口
、頬側、鼻腔、膣、直腸、または非経口（例えば、皮下、皮内、血管内／静脈内、筋内、
脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼周囲、眼窩内、滑液包内、及び腹腔内注入）投与によっ
て投与することができる。１つの特定の実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質は皮
下注射によって投与される。上記皮下注射としては、例えば、本ＦＩＸ融合タンパク質の
単回ボーラスを始めとする１回または複数回のボーラスを挙げることができる。あるいは
、本ＦＩＸ融合タンパク質は、静脈内注射によって投与することができる。
本ＦＩＸ融合タンパク質の用量は、特定の融合タンパク質の性質及び対象の疾病の性質
に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、本ＦＩＸ融合タンパク質の用量は、
１〜１０００ＩＵ／ｋｇの間の本ＦＩＸ融合タンパク質を含んでいてもよい。
出血性疾病は血液凝固障害により起こる場合がある。血液凝固障害は凝血異常と呼ばれ
る場合もある。一例において、本開示の医薬組成物によって治療することができる血液凝
固障害は血友病である。別の例において、本開示の医薬組成物によって治療することがで
きる血液凝固障害は血友病Ｂである。
いくつかの実施形態において、出血性疾病に関連する出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）の種類
は、関節内出血、筋肉出血（ｂｌｅｅｄ）、口腔出血（ｂｌｅｅｄ）、出血（ｈｅｍｏｒ
ｒｈａｇｅ）、筋肉中への出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、口腔出血（ｈｅｍｏｒｒｈａ
ｇｅ）、外傷、頭部外傷、消化管出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、頭蓋内出血（ｈｅｍｏｒｒ
ｈａｇｅ）、腹腔内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、胸腔内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ
）、骨折、中枢神経系での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、後腹膜臓器での出血（ｂｌｅｅｄ
ｉｎｇ）、咽頭後空間での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、及び腸腰筋鞘での出血（ｂｌｅｅ
ｄｉｎｇ）から選択される。
他の実施形態において、出血性疾病に罹患している上記対象は、例えば、外科手術上の
予防または周術期管理を含む外科手術に対する処置を必要とする。一例において、上記外
科手術は小手術及び大手術から選択される。例示的な外科手技としては、抜歯、扁桃摘出
術、鼠径ヘルニア切除術、滑膜切除術、開頭術、骨接合術、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔
内手術、胸腔内手術、関節置換術（例えば、膝関節全置換、股関節置換等）、心臓手術、
及び帝王切開術が挙げられる。
別の例において、上記対象は同時に第ＶＩＩＩ因子による治療を受ける。本発明の化合
物はＦＩＸａを活性化することができることから、上記対象へＦＩＸａを投与する前に、
ＦＩＸａポリペプチドを予備活性化するために該化合物を用いてもよい。
本発明の方法は、予防的処置またはオンデマンド処置を必要とする対象に実施してもよ
い。
本発明のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物は、例えば、局所（例えば、経皮また
は眼）、経口、頬側、鼻腔、膣、直腸または非経口投与を含む任意且つ適宜の投与形態用
に製剤化されてもよい。
本明細書では、非経口という用語は、皮下、皮内、血管内（例えば静脈内）、筋内、脊
髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼周囲、眼窩内、滑液包内及び腹腔内注射、ならびに任意の
同様の注射または注入技法を包含する。特に、本発明のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬
組成物は、皮下投与用に処方されてもよい。本組成物はまた、例えば、懸濁液剤、乳化液
剤、持続放出製剤、クリーム剤、ジェル剤または散剤であってもよい。本組成物は、トリ
グリセリドなどの従来の結合剤及び担体と共に、座薬として製剤化されてもよい。
一例において、上記医薬製剤は液体製剤、例えば、緩衝、等張性水溶液である。別の例
において、本医薬組成物は、生理学的ｐＨ、または略生理学的ｐＨを有する。他の例にお
いて、上記水性製剤は生理学的または略生理学的浸透圧及び塩分を有する。上記水性製剤
は塩化ナトリウム及び／または酢酸ナトリウムを含んでいてもよい。いくつかの例におい
て、本発明の組成物は凍結乾燥されている。
本発明の融合タンパク質は、出血性凝固障害、関節内出血、筋肉出血（ｂｌｅｅｄ）、
口腔出血（ｂｌｅｅｄ）、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、筋肉中への出血（ｈｅｍｏｒ
ｒｈａｇｅ）、口腔出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、外傷、頭部外傷、消化管出血（ｂｌ
ｅｅｄｉｎｇ）、頭蓋内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、腹腔内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａ
ｇｅ）、胸腔内出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、骨折、中枢神経系での出血（ｂｌｅｅｄ
ｉｎｇ）、後腹膜臓器での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、咽頭後空間での出血（ｂｌｅｅｄ
ｉｎｇ）、及び腸腰筋鞘での出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）からなる群より選択される出血性
疾患または障害の治療に対する遺伝子治療手法を用いて、哺乳動物、例えば、ヒトの患者
においてインビボで産生させることができ、このことは治療上有益となろう。一実施形態
において、上記出血性疾患または障害は血友病である。別の実施形態において、上記出血
性疾患または障害は血友病Ｂである。これは、適宜の発現制御配列に作動可能に連結した
、融合タンパク質をコードする適宜の核酸の投与を含む。ある特定の実施形態において、
これらの配列はウイルスベクター中に組み込まれる。かかる遺伝子治療に適したウイルス
ベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイル
スベクター、エプスタイン・バールウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシ
ニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）ベクターが挙げられる。上記ウイルスベクターは複製欠損ウイルスベクターであって
よい。他の実施形態において、アデノウイルスベクターはそのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝
子に欠失を有する。アデノウイルスベクターが用いられる場合、上記哺乳動物は選別可能
なマーカー遺伝子をコードする核酸に曝露させなくてもよい。他の実施形態において、上
記配列は、当業者に公知の非ウイルスベクター中に組み込まれる。
本発明の実施は、別段の表示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子
導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を用いることとなり、そ
れらは本技術分野の範囲内である。かかる技法は文献において詳細に説明される。例えば
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２
ｎｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．
，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ
ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ：４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（
１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．
Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏ
ｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，
Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ
ｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅ
ａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍ
ａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ
ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）
；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（
Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ
Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａ
ｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ
ｓ Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（
１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９
８９）を参照されたい。
免疫学の全般的な原理を記載する標準的な参考資料としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｔｏｆ
ｆ，Ｊ．ａｎｄ Ｍａｌｅ Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ
：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａ
ｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅ
ｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０
０５）；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８８）が挙げられる。
ここまで本発明を詳細に説明してきたが、以下の実施例を参照することによって本発明
がより明確に理解されよう。これらの実施例は例証のみを目的として本明細書に付随する
ものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１：活性なＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体の識別
ＦＩＸ融合タンパク質であって、ＦＩＸポリペプチドを、上記ＦＩＸタンパク質の特性
を向上させるための１または複数のＸＴＥＮ挿入物と共に含む上記ＦＩＸ融合タンパク質
を構築した。但し、ＸＴＥＮ修飾物の位置、長さ、組成及び数は容易に変えることができ
、ＦＩＸの活性及びクリアランスに対するこれら修飾物の影響を評価することができる。
本実施例は、ＦＩＸ活性を損なうことなくＸＴＥＮの導入を受け入れることができ、且
つ他の面では修飾されていないＦＩＸの融合タンパク質及び組換えＦＩＸ−Ｆｃ融合タン
パク質の両方に対してこの手法を適用することができる、ＦＩＸ中の部位を特定すること
を目的とする。
方法
開始Ｍｅｔ残基をコードするＡＴＧコドンに隣接する５’側にコザック翻訳開始配列（
ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）を導入した後に、ＦＩＸポリペプチドコード配列を発現ベクターｐ
ｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、カリフォルニア州カ
ールスバッド）中、ＢｓｉＷＩ部位とＰｍｅＩ部位との間に結合させた。
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、ペンシルベニア州ウォリント
ン）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、カリフォルニア州
カールスバッド）をプラスミドでトランスフェクトした。上記一過性にトランスフェクト
された細胞を、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３培地またはＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標
）２９３培地とＣＤ ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、カ
リフォルニア州カールスバッド）との混合培地中で増殖させた。トランスフェクションの
５日後に上記細胞培養培地を回収し、発色ＦＩＸ活性アッセイまたはａＰＴＴ ＦＩＸ活
性アッセイによってＦＩＸ活性を分析した。
ＡｎｉａｒａのＢＩＯＰＨＥＮ第ＩＸ因子キットを用いて発色によるＦＩＸ活性を測定
し、全てのインキュベーションを３７℃のプレートヒーター上で振とうしながら実施した
。６ウェルプレートからのＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体の一過性トランスフェクション培地か
らの細胞培養回収物を、トリスＢＳＡ希釈緩衝液（Ｒ４）を用いて所望のＦＩＸ活性範囲
に希釈した。ＦＩＸ標準液もトリスＢＳＡ希釈緩衝液中で調製した。上記標準液、希釈し
た細胞培養物試料、及びプールした正常なヒト血漿アッセイ対照（５０μＬ／ウェル）を
、２つの同一組成の試料による繰返しでＬＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ ９６ウェル
プレートに添加した。ヒト第Ｘ因子、ＦＶＩＩＩ：Ｃ及びフィブリン重合禁止剤（５０μ
Ｌ）、５０μＬの第ＸＩａ因子のトロンビン、リン脂質及びカルシウムとの混合液、及び
５０μＬの第Ｘａ因子特異的発色基質（ＳＸａ−１１）を、それぞれの添加の間に２分間
のインキュベーションを行いながら、各ウェル中に逐次添加した。基質と共にインキュベ
ートした後、５０μＬの２０％酢酸を添加して呈色反応を停止させ、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡ
Ｘ（登録商標）ｐｌｕｓ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＤＥＶＩＣＥＳ（登録商標））装置を用
いて４０５ｎｍでの吸光度を測定した。データ解析はＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏ
ソフトウェア（バージョン５．２）を用いて行った。
１段階での活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固アッセイを用いてＦＩ
Ｘ活性を評価した。ＳＹＳＭＥＸ（登録商標）ＣＡ−１５００装置（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州タリータウン
）を用いてＦＩＸ−ＸＴＥＮ ａＰＴＴ活性を測定した。アッセイ用の標準曲線を作成す
るために、ＷＨＯ第ＩＸ因子標準液を、培養培地の濃度を試験試料に一致させて偽トラン
スフェクション培地で希釈した。６ウェルプレートからのＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体の一過
性トランスフェクション培地からの細胞培養回収物を、偽トランスフェクション培地を用
いて所望のＦＩＸ活性範囲に希釈した。希釈後に、Ｓｙｓｍｅｘ装置を用い、以下のよう
にして、上記ａＰＴＴアッセイを実施した。すなわち、５０μＬの希釈した標準液及び試
料を、５０μＬのＳｉｅｍｅｎｓのＦＩＸを枯渇させたヒト血漿と、次いで５０μＬのＳ
ｉｅｍｅｎｓのＡｃｔｉｎ ＦＳＬ（エラグ酸）活性化剤と混合した。この混合物を１分
間インキュベートした。続いて５０μＬのＳｉｅｍｅｎｓのＣａＣｌ２を上記混合物に添
加し、この混合物を２４０秒間インキュベートした。このインキュベーション直後の凝固
時間を測定した。試験試料のＦＩＸ活性を測定するために、ログスケールを用いて上記標
準液の凝固時間をプロットし、凝固時間とＦＩＸ活性との間の式を外挿し、次いでＦＩＸ
−ＸＴＥＮの活性を上記標準曲線に対して算出した。
挿入部位の選択
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋのＦＩＸ構造、１ＰＦＸ、１ＩＸＡ、１ＣＦＩ、
１ＣＦＨ、１ＥＤＭ、３ＬＣ３、３ＬＣ５、１ＲＦＮ、１Ｘ７Ａ及び３ＫＣＧを解析して
、ＦＩＸ中のＸＴＥＮ挿入のための部位を選択した。ＧＬＡドメイン内へのＸＴＥＮ挿入
は、リン脂質表面と内皮下ＩＶ型コラーゲンへのＦＩＸの固定化におけるＧＬＡドメイン
の重要な役割により回避した。ＸＴＥＮ挿入部位は、以下の選択基準、すなわち、１）ア
ルゴリズムソフトウェアＡＳＡ Ｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｒｅｎ．ｎｅｔ
／ａｓａｖｉｅｗ／）及びＧｅｔ Ａｒｅａ（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅ
ｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌ）によって計算した到達可能な表面積、２）水素／重水
素交換質量分析（Ｈ／ＤＸ−ＭＳ）によって評価した溶媒の到達可能性、３）限定された
二次構造エレメント内の部位の除外、４）顕著な種間でのタンパク質配列の可変性による
位置の優先性、及び５）既知の血友病Ｂの突然変異に近位の部位の除外と共に、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋにおける利用可能なＦＩＸの構造の解析によって選択した。
ＥＧＦ１ドメイン中の４の部位、ＥＧＦ２ドメイン中の５の部位、ＡＰドメインとＥＧ
Ｆ２ドメインとの間のリンカー領域中の２の部位、ＡＰ（活性化ペプチド）ドメイン中の
４の部位及び触媒ドメイン中の１８の部位がＸＴＥＮの挿入に対して選択された（表６）
。
Figure 2021078526
４２アミノ酸ＸＴＥＮの挿入及びＣ末端融合の活性スクリーニング
ＸＴＥＮの導入によって生じる活性低下に起因する潜在的なＦＩＸ活性の減損を打ち消
すためのスキャフォールドとして、高活性ＦＩＸパドゥバ変異体（Ｒ３３８Ｌ）を用いた
。４２残基のＸＴＥＮエレメント（ＡＥ４２）を、上記の選択基準を用いて選択した部位
に挿入するかまたはＦＩＸのＣ末端に融合した。これらの変異体のＦＩＸ活性を、上述の
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の馴化培地中で評価した。ＦＩＸ−ＡＥ４２の
ＦＩＸ活性を、ＸＴＥＮをもたないベース構築物、ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌの百分率として示
す（図１）。
ＦＩＸ発色アッセイによって判定されるように、ＸＴＥＮ挿入は限られた部位で許容さ
れた（図１及び表７）。ＦＩＸ中の合計３３の部位を選択し、ＡＥ−４２の挿入によって
評価を行った。これらのうち、ＥＧＦ２ドメイン中の２、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメイ
ンとの間のリンカー領域中の１、ＡＰドメイン中の４、及び触媒ドメイン中の４が、Ｃ末
端を含めて、ＦＩＸ活性アッセイによって許容される部位として特定された（図１及び表
７）。
Figure 2021078526
Figure 2021078526
より長いＸＴＥＮ挿入物及びＣ末端融合物の活性
次に、より長いＸＴＥＮ（ＡＥ７２、１４４、及び２８８）を、ＡＥ４２の挿入に対し
て許容されることが示された部位で同様に試験した。ＦＩＸ活性を上述のようにして測定
し、ＸＴＥＮをもたないベース構築物であるＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌのパーセンテージとして
示す（図２）。
ＡＰ中の部位及びＦＩＸのＣ末端のまたはＣ末端近傍の部位のみにおいて、より長いＸ
ＴＥＮ（ＡＥ１４４、ＡＥ２８８またはＡＥ８６４）が許容された（図２）。馴化培地に
おいて検出されたＦＩＸ活性は導入されたＸＴＥＮの長さと逆の相関を示した（図２、表
７）。ＦＩＸの異なるドメイン中の４の挿入が許容される部位を、コンビナトリアルライ
ブラリをつくるために選択した。
複数のＸＴＥＮ挿入物
単一のＸＴＥＮの変異体を用いて得られた結果に基づいて、種々の長さの且つ４の異な
る位置の複数のＸＴＥＮ挿入物を有するＦＩＸ変異体（図４及び表８を参照のこと）のＦ
ＩＸ活性を、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の馴化培地中で、ａＰＴＴアッセ
イにより評価した（表８〜１０）。ＦＩＸ活性を、ＸＴＥＮをもたないベース構築物であ
るＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌのパーセンテージとして示す（図４）。
Figure 2021078526
Figure 2021078526
Figure 2021078526
Figure 2021078526
Figure 2021078526
３の群、単一のＸＴＥＮを有するＦＩＸ、二元のＸＴＥＮ挿入物を有するＦＩＸ及び単
一のＸＴＥＮ挿入物を有するＦＩＸ−Ｆｃが検出可能な活性を示した一方、３以上の部位
での挿入／融合の組み合わせはＦＩＸ活性が消失した（図４）。
結論として、ＦＩＸ中にはいくつかのＸＴＥＮ挿入が許容される部位が存在し、選ばれ
た組み合わせのＸＴＥＮ挿入物変異体はＦＩＸ活性を保持する。ここで特定された活性な
ＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体は、血友病Ｂマウスにおける薬物動態学的特性の特徴づけの候補
である。
実施例２：ＦＩＸ融合タンパク質ならびにその血漿回収率及びＡＵＣ／Ｄ
第ＩＸ因子欠損（ＨｅｍＢ，Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｆ９ｔｍ１Ｄｗｓ／Ｊ，ＭＧＩ：１９
３２２９７）マウス（Ｌｉｎ．ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、当初Ｄａｒｒｅｌ Ｓｔａ
ｆｆｏｒｄ博士（ノースカロライナ大学、チャペルヒル）より入手した。オス／メスのＨ
ｅｍＢマウスに、それぞれ５０または２００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸ融合タンパク質（例えば
、ＦＩＸ−ＣＴ．２８８（ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合されたＡＥ２８８ ＸＴＥ
Ｎ）、ＦＩＸ−ＣＴ．８６４（ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合したＡＥ８６４ ＸＴ
ＥＮ）、ＦＩＸ−ＡＰ．１４４（ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内のＤ１６６の後に
挿入されたＡＥ１４４ ＸＴＥＮ）、ＦＩＸ−ＡＰ．７２（ＦＩＸポリペプチドのＡＰド
メイン内のＤ１６６の後に挿入されたＡＥ７２ ＸＴＥＮ）、ＦＩＸ−ＡＰ．４２（ＦＩ
ＸポリペプチドのＡＰドメイン内のＤ１６６の後に挿入されたＡＥ４２ ＸＴＥＮ）、Ｆ
ＩＸＦｃ、及びＦＩＸ）の単回静脈内ボーラス注射を、ｔ＝０時間において、１０ｍＬ／
ｋｇの投与容量で静脈内注射した。投与の５分後から投与の１６８時間（７日）後まで血
液を採取した。表示した各時点について、約１００μＬのクエン酸塩添加血液を、時点当
たり３〜４頭のマウスから、後眼窩または端末大静脈での採血によって採取した。マウス
当たり最大３回の時点で採血を行った。５０００ｒｐｍで８分間の遠心分離によって血漿
を単離し、血漿試料をドライアイス−エタノール浴中で瞬間凍結し、分析を行うまで−８
０℃で保存し、分析は、活性化剤としてデイドベーリング試薬及びアクチンＦＳＬを、そ
して活性の標準として投与物質を用いた、Ｓｙｓｍｅｘ−ＣＡ１５００凝固分析装置上で
の１段階での活性化トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイによって行った。図５
の５Ａ〜５Ｂに、注射した用量の％として血漿活性をプロットする。平均滞留時間（ＭＲ
Ｔ）及び他の薬物動態学的（ＰＫ）パラメータをＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ
６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ＮＣＡ解析によるＣｅｒｔｅｒａ）により、ノンコン
パートメント解析を用いて計算した。図５ＣはＭＲＴ（Ｘ軸）に対する相対的血漿回収率
（Ｙ軸）を示す。円の面積は用量当たりの曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／
ｍＬ）を表し、ＸＴＥＮの長さが増加すると共に、ＦＩＸ血漿活性回収率及びＡＵＣ／Ｄ
が増加することを示している（図５の５Ｃ）。これらの図は、大きなＸＴＥＮ長（Ｃ末端
における２８８及び８６４またはＡＰドメイン中の１４４、７２、及び４２）を有するＦ
ＩＸ融合タンパク質は、静脈内ボーラス投与後に、血漿回収率の６０％に及ぶ長さ依存性
の増加及びＡＵＣ／Ｄの増加を示す。
実施例３：ＦＩＸ融合タンパク質及びそれらの半減期
ＦＩＸ欠損マウスに、５０または２００ＩＵ／ｋｇの本ＦＩＸ融合タンパク質、すなわ
ち、２８８のアミノ酸を有するＸＴＥＮ（例えばＡＥ２８８）に融合されたＦＩＸ、７２
のアミノ酸を有するＸＴＥＮ（例えばＡＥ７２）がＡＰドメイン中、Ｄ１６６の後に挿入
されたＦＩＸ−Ｆｃ、４２のアミノ酸を有するＸＴＥＮ（例えばＡＥ４２）がＡＰドメイ
ン中、Ｄ１６６の後に挿入されたＦＩＸ−Ｆｃ、及び対照（例えばＦＩＸＦｃ及びＦＩＸ
）を静脈内投与した。血漿を採取し、ＦＩＸ活性の分析及びＰＫ分析を実施例５に記載の
方法と同様にして実施した。図６の６Ａは注射した用量の％として血漿活性をプロットす
る。薬物動態学的（ＰＫ）パラメータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉ
ｇｈｔ、ＮＣＡ解析によるＣｅｒｔｅｒａを用いて計算し、図６の６ＢはＭＲＴ（Ｘ軸）
に対する相対的血漿回収率（Ｙ軸）を示す。円の面積は用量当たりの曲線下面積（ＡＵＣ
／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表し、ＦＩＸＦｃの活性化ペプチド（ＡＰ）ドメイン
へのＸＴＥＮ配列の挿入によって、ｒＦＩＸＦｃ単独の平均滞留時間よりも長い平均滞留
時間が、ＦＩＸに比較して延長されることを示す（図６の６Ｂ）。また、血漿活性回収率
及びＡＵＣ／ＤがＸＴＥＮ長の増加に伴って向上する（図６の６Ａ〜６Ｂ）。ｒＦＩＸ−
ＣＴ．２８８（配列番号２２６）及びｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（配列番号１５１）のＡ
ＵＣ／Ｄは、ｒＦＩＸＦｃと比較してそれぞれ３．４倍及び４．５倍向上した（図６の６
Ａ〜６Ｂ）。これは、静脈内投与したｒＦＩＸと比較した場合、それぞれ８．５倍及び１
４．５倍に相当する（図６の６Ａ〜６Ｂ）。したがって、ＡＰドメイン中へのＸＴＥＮの
挿入をｒＦＩＸＦｃ−Ｒ３３８ＬにおけるＦｃに媒介される半減期の延長と組み合わせる
ことによって、半減期ならびに血漿回収率及びＡＵＣ／用量の増加の両方が、ｒＦＩＸ及
びｒＦＩＸＦｃのそれに比較して拡大される。
実施例４：皮下送達によるＦＩＸ融合タンパク質の薬物動態の向上
ＦＩＸ欠損マウスに、ｔ＝０において、５０または２００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸ融合タン
パク質、すなわち、２８８のアミノ酸のＸＴＥＮ（例えばＡＥ２８８）にＣ末端で融合さ
れたＦＩＸ（ＦＩＸ−ＣＴ．２８８）、７２のアミノ酸のＸＴＥＮ（例えばＡＥ７２）を
ＡＰドメイン中に有するＦＩＸＦｃ（ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）、４２のアミノ酸のＸＴ
ＥＮ（例えばＡＥ４２）をＥＧＦ２ドメイン中に有するＦＩＸＦｃ（例えばＦＩＸＦｃ−
ＥＧＦ．４２）、及び対照（ＦＩＸＦｃ及びＦＩＸ）を皮下投与した。血漿を採取し、Ｆ
ＩＸ活性の分析及びＰＫ分析を実施例１に記載の方法と同様にして実施した。図７の７Ａ
は注射した用量の％として血漿活性をプロットする。薬物動態学的（ＰＫ）パラメータを
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ＮＣＡ解析によるＣｅｒｔｅｒ
ａを用いて計算し、図７の７ＢはＭＲＴ（Ｘ軸）に対する相対的血漿回収率（Ｙ軸）を示
す。円の面積は用量当たりの曲線下面積（ＡＵＣ／Ｄ、単位：時間／ｋｇ／ｍＬ）を表し
、ｒＦＩＸのカルボキシ末端におけるＸＴＥＮポリペプチドの融合またはＦＩＸＦｃの活
性化ペプチド（ＡＰ）ドメインもしくはＥＧＦ２ドメインへのＸＴＥＮ配列の挿入によっ
て、上記ＦＩＸ融合タンパク質の皮下投与プロファイルが大幅に向上することを示す（図
７の７Ｂ）。ＨｅｍＢマウスにおいて皮下投与に関し、ｒＦＩＸＦｃと比較して、ｒＦＩ
ＸＦｃ−ＡＰ．７２及びｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８のＡＵＣ／Ｄは６〜９倍向上し、生物学
的利用能は１．５〜２倍向上し、且つＣｍａｘ／Ｄは３〜１０倍向上している。ｒＦＩＸ
と比較した場合、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２及びｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８の薬物動態学的パ
ラメータの向上は、ｒＦＩＸと比較して、それぞれ、２８〜４０倍のＡＵＣ／Ｄの向上、
３倍の生物学的利用能の増加及び１５〜３０倍のＣｍａｘ／Ｄの向上である（図７の７Ａ
〜７Ｂ）。
まとめると、皮下投与に関して、上記ＦＩＸ融合タンパク質（例えば、ｒＦＩＸ−ＣＴ
．２８８及びｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）は、ｒＦＩＸＦｃの静脈内投与と比較した場合
、２．６倍及び１．９倍のＡＵＣ／Ｄの向上を示し、後者は、ヒトにおける予防のための
週１回またはそれよりも低頻度での静脈内投与を支持する。
実施例５：ＦＩＸ融合タンパク質のインビトロでの有効性
ヒト血友病Ｂの血液に、３、１０、及び３０ＩＵ／ｄＬの表示した用量のｒＦＩＸＦｃ
（白丸、点線）またはＦＩＸ融合タンパク質（例えばｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）（黒丸
、実線）またはビヒクル（白三角）を添加した（図８の８Ａ〜８Ｃ）。回転トロンボエラ
ストメトリー（ＲＯＴＥＭ）を用いて全血凝固特性を測定し、当該血液の再石灰化（ＮＡ
ＴＥＭ）によって凝固を開始させた。ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２は、血友病Ｂの血液中に
おいて、凝固時間（ＣＴ、単位：秒）、アルファ角（単位：度）及び最大血餅硬度（ＭＣ
Ｆ、単位：ｍｍ）に関して、ｒＦＩＸＦｃと比較して同様の活性を示した（図８の８Ａ〜
８Ｃ）。各時点におけるデータは４〜５の同一組成の試料による繰返しの平均値＋／−標
準偏差である（図８の８Ａ〜８Ｃ）。
ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２及びｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８は、ＨｅｍＢマウスにおいて、
ｒＦＩＸ及びｒＦＩＸＦｃの両方と比較して、皮下投与での薬物動態の大幅な向上を示し
ている。有効性及び相対成長率に対処するための更なる検討が、前臨床動物モデルにおい
て進行中である。
実施例６：急性マウス尾切断出血モデルにおけるｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２のインビトロ
での有効性
既報（Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１９（１３）：３０２４−３０３
０，２０１２）のとおりに、尾の先端を切断した後に、投与したマウスにおける全失血量
を測定する、盲検化マウス尾切断出血モデルにおいて急性の有効性を検討した。簡単に説
明すると、８〜１５週齢のオスの血友病Ｂマウス（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（
１９９７） ９０：３９６２−３９６６）を、５０ｍｇ／ｋｇのケタミンと０．５ｍｇ／
ｋｇのデクスメデトミジンとの混合物で麻酔した。尾を３７℃の生理的食塩水に１０分間
浸漬して側脈を拡張させ、続いてビヒクル（３．８８ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、２３．８
ｇ／Ｌのマンニトール、１１．９ｇ／Ｌのスクロース、３．２５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム
、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０（ｐＨ ７．１）、３％のヒト血清アルブ
ミン）、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２、またはｒＦＩＸＦｃのいずれかを、５０、１００、
及び２００ＩＵ／ｋｇで静脈内尾部静脈注射した。投与の５分後に尾の遠位先端部の５ｍ
ｍを切断し、事前に重量を測定した、１３ｍＬの生理的食塩水が入った管の中に３０分間
浸漬した。失血量を重量で定量した。統計的有意性をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６
において、対応のない両側ｔ検定を用いて算出した。かかる両側ｔ検定は、上記５０、１
００、及び２００ＩＵ／ｋｇの用量のｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２はビヒクルと有意に異な
ることを示した（Ｐ値＜０．０００１）。また、データは、低用量、例えば５０ＩＵ／ｋ
ｇのｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２によって、同一の低用量、すなわち５０ＩＵ／ｋｇのｒＦ
ＩＸＦｃと比較して、失血量が有意に低くなることを示している。これらの結果から、こ
の出血モデルにおいては、ｒＦＩＸＦｃに比較して、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の同等ま
たは向上した急性の有効性が実証される。
実施例７：予防的なマウス尾静脈切断出血モデルにおけるＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２のイン
ビボでの有効性
既報（Ｔｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕ
ｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４８２５５，２０１６；Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ
１１４：２８０２−２８２２（２００９））のとおりに、外側尾静脈の切断後の、投与し
た血友病Ｂマウスの生存時間を測定する盲検化マウス尾静脈切断（ＴＶＴ）出血モデルに
おいて、長期の有効性を検討した。簡単に説明すると、８〜１５週齢のオスの血友病Ｂマ
ウス（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９０：３９６２−３９６６（１９９７））に
、１５、５０、１００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸ活性のｒＦＩＸＦｃまたはこれに対応する皮下
用量のＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を静脈内投与し、ビヒクルをボーラス投与したマウスと比
較した。投与の７２時間後に、全てのマウスを麻酔し、尾の径が２．７ｍｍの部分で一方
の外側尾静脈を切断した。ＴＶＴの直後から９〜１１時間の間、次いで２４時間の一昼夜
の時点で、再出血及び（マウスが瀕死であった場合に決定された安楽死までの時間として
定義される）死亡時刻を含む定性的な終点を監視し、毎時間記録した。２４時間の検討の
終了時に全てのマウスを安楽死させ、死亡または瀕死ではないマウスを２４時間生存して
いたと判定した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて、データをＴＶＴ後のパーセント表記の生
存率としてプロットした。ビヒクルを皮下投与したマウス（点線）、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．
７２を皮下投与したマウス（実線、閉じた記号）またはＦＩＸＦｃを静脈内投与したマウ
ス（破線、白抜きの記号）（１５ＩＵ／ｋｇ、５０ＩＵ／ｋｇ、１００ＩＵ／ｋｇ ｎ＝
３０であるビヒクル投与以外はｎ＝２０／用量）（図１０）。対応するＩＵ／ｋｇ表記の
用量で皮下投与したＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２対静脈内投与したｒＦＩＸＦｃで処置したマ
ウスの生存率曲線は、試験した全ての用量において、等価の静脈内投与したｒＦＩＸＦｃ
と比較して、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を皮下投与したＨｅｍＢマウスの生存率が向上した
ことを示した（図１０）。
実施例８：ＨｅｍＢマウスにおけるｒＦＩＸと比較したＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ＦＩＸ
−２１６、二重鎖Ｆｃ）の静脈内及び皮下投与での薬物動態学的パラメータの向上
血友病−Ｂマウスに、２００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ＦＩＸ−２１６、
二重鎖Ｆｃ）またはｒＦＩＸのいずれかを投与した。表示した時点で、血液を後眼窩での
採血によって採取した。活性の標準として投与物質を用いた１段階凝固アッセイ活性によ
って、ＦＩＸの血漿レベルを測定した。図１１の１１Ａにおいて、血漿活性を注射した用
量の％としてプロットする。図１１の１１Ｂは、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ
６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｃｅｒｔａｒａ）を用い、ＮＣＡ（ノンコンパートメ
ント）解析によって計算した薬物動態学的パラメータの表を示す。ｒＦＩＸに対するＦＩ
Ｘ−２１６について示された薬物動態学的パラメータの向上には、平均滞留時間（ＭＲＴ
）、ＡＵＣ／用量及び他のパラメータが含まれる。
ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の皮下投与において、マウスにおける投与後概略２０時間のｔ
ｍａｘ、及び同様（ＩＵ／ｋｇ）の静脈内投与したｒＦＩＸまたはｒＦＩＸＦｃと比較し
た場合の血漿活性レベルの向上が示されている。本発明者らは、ＨｅｍＢマウスにおける
上記ＴＶＴ出血モデルを用いて、投与後７２時間において、皮下投与したＦＩＸＦｃ−Ａ
Ｐ．７２が、試験した全ての用量において静脈内投与したｒＦＩＸＦｃと比較して、イン
ビボでの有効性が向上したことを示している。同様に、ＨｅｍＢマウス尾切断出血モデル
における急性の有効性試験によって、静脈内投与したＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２がｒＦＩＸ
Ｆｃと比較して有効性が向上することが示された。これらのデータは、ヒトにおけるＦＩ
ＸＦｃ−ＡＰ．７２の週１回またはそれよりも低頻度での予防的皮下投与の可能性を支持
する。
詳細な実施形態の上述の説明は本発明の概括的な特徴を十分に明らかにすることとなる
ので、他の者は当業者の範囲内の知識を適用することにより、過度の実験をすることなく
、発明の概括的な概念から逸脱することなく、かかる詳細な実施形態を種々の用途に対し
て容易に改変及び／または適合させることができる。したがって、かかる適合及び改変は
、本明細書に提示される教示及び指針に基づけば、上記開示された実施形態の均等物の意
味及び範囲の内であることが意図される。本明細書における語法または用語は説明を目的
とするものであって限定を目的とするものではなく、本明細書の用語または語法は、本明
細書の教示及び指針に照らして当業者によって解釈されるべきものであることを理解する
必要がある。
本発明の他の実施形態は、本明細書に開示された本発明の詳述及び実施を考慮すれば当
業者には明らかとなろう。上記詳述及び実施例は単に例示的と見なされるべきものであり
、本発明の真の範囲及び趣旨は後述の特許請求の範囲によって示されることを意図する。
本出願は、２０１５年８月３日出願の米国仮出願第６２／２００，５９０号及び２０１
６年１月２２日出願の同第６２／２８１，９９３号の優先権を主張し、上記出願はそれら
の全体が参照により本明細書に援用される。
実施形態
Ｅ１． 第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番
号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配
列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４
、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２
２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択
されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入された少なくとも
１のＸＴＥＮとを含み、凝血促進活性を示すＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ２． 上記挿入部位が、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２
、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４及びそれらの任意の組み合
わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する、Ｅ１に記載のＦＩＸ融合タンパク質
。
Ｅ３． 上記挿入部位が、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６
、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３及びそれらの任意の組み合
わせからなる群より選択されるアミノ酸に対応する、Ｅ１またはＥ２に記載のＦＩＸ融合
タンパク質。
Ｅ４． 上記挿入部位が、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５
、及び両方からなる群より選択されるアミノ酸に対応する、Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１に記
載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ５． 上記挿入部位が配列番号２のアミノ酸１４２に対応する、Ｅ１〜Ｅ４のいずれ
か１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ６． 上記ＸＴＥＮが、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、
少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、約７２のアミノ酸、少なく
とも約１４４のアミノ酸、または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む、Ｅ１〜Ｅ５のい
ずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ７． 上記ＸＴＥＮが、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８
、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、またはそれらの任意
の組み合わせを含む、Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ８． 上記ＸＴＥＮが、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１
、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、及びそ
れらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、
少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、
少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一
であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ９． 上記ＸＴＥＮがＡＥ７２またはＡＥ１４４を含む、Ｅ７またはＥ８に記載のＦ
ＩＸ融合タンパク質。
Ｅ１０． 第２のＸＴＥＮを更に含む、Ｅ１〜Ｅ９のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タ
ンパク質。
Ｅ１１． 第２のＸＴＥＮが、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１
０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ
酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のア
ミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２
のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸に
対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿入されているか、または第２のＸＴＥ
Ｎが、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端もしくは該ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合さ
れているリンカーのいずれかに融合されている、Ｅ１０に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ１２． 上記ＸＴＥＮ及び第２のＸＴＥＮが、それぞれ、
ｉ．配列番号２のアミノ酸１０５及び配列番号２のアミノ酸１６６、
ｉｉ．配列番号２のアミノ酸１０５及び配列番号２のアミノ酸２２４、
ｉｉｉ．配列番号２のアミノ酸１０５及びＣ末端に融合された、
ｉｖ．配列番号２のアミノ酸１６６及び配列番号２のアミノ酸２２４、
ｖ．配列番号２のアミノ酸１６６及びＣ末端に融合された、ならびに
ｖｉ．配列番号２のアミノ酸２２４及びＣ末端に融合された
からなる群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に挿
入され及び／または上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合される、Ｅ１０またはＥ１１
に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ１３． 上記ＸＴＥＮが、配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で上記Ｆ
ＩＸポリペプチド内に挿入され、第２のＸＴＥＮが上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融
合された、Ｅ１０またはＥ１１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ１４． 第２のＸＴＥＮが、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ
酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のア
ミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む、
Ｅ１０〜Ｅ１３のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ１５． 第２のＸＴＥＮが、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２
８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、及びそれらの任
意の組み合わせからなる群より選択される、Ｅ１０〜Ｅ１４のいずれか１に記載のＦＩＸ
融合タンパク質。
Ｅ１６． 第２のＸＴＥＮがＡＥ７２またはＡＥ１４４である、Ｅ１５に記載のＦＩＸ
融合タンパク質。
Ｅ１７． 第２のＸＴＥＮが、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、
４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、及
びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０
％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６
％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％
同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ１０〜Ｅ１６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパ
ク質。
Ｅ１８． 第３、第４、第５、または第６のＸＴＥＮを更に含む、Ｅ１０〜Ｅ１７のい
ずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ１９． ＦＩＸポリペプチドと、上記ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合され、長さ
が４２のアミノ酸より長く且つ１４４のアミノ酸より短いアミノ酸配列を含むＸＴＥＮと
を含むＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ２０． 上記ＸＴＥＮが、５０、５５、６０、６５、もしくは７０のアミノ酸より長
く且つ１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０もしくは８０のアミノ酸より短い
、またはそれらの任意の組み合わせのアミノ酸配列を含む、Ｅ１９に記載のＦＩＸ融合タ
ンパク質。
Ｅ２１． 上記ＸＴＥＮの長さが７２のアミノ酸である、Ｅ２０に記載のＦＩＸ融合タ
ンパク質。
Ｅ２２． 上記ＸＴＥＮがＡＥ７２である、Ｅ２１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ２３． 上記ＸＴＥＮが、配列番号３５と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％
、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％
、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を
含む、Ｅ１９に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ２４． Ｆｃドメインを更に含む、Ｅ１〜Ｅ２３のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タ
ンパク質。
Ｅ２５． 上記Ｆｃドメインが上記ＦＩＸポリペプチドまたは上記ＸＴＥＮに融合され
ている、Ｅ２４に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ２６． 第２のＦｃドメインを含む、Ｅ２４またはＥ２５に記載のＦＩＸ融合タンパ
ク質。
Ｅ２７． 第２のＦｃドメインが第１のＦｃドメインと会合している、Ｅ２６に記載の
ＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ２８． ２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が上記Ｆｃドメインに融
合された上記ＦＩＸポリペプチドを含み、第２のポリペプチド鎖が第２のＦｃドメインを
含み、第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインとが共有結合によって会合している、Ｅ
２６またはＥ２７に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ２９． 上記ＦＩＸポリペプチドと、上記Ｆｃドメインと、第２のＦｃドメインと、
上記Ｆｃドメインと第２のＦｃドメインとを連結するリンカーとを含む単一のポリペプチ
ド鎖である、Ｅ２６またはＥ２７に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ３０． 上記リンカーが１または複数の細胞内プロセッシング部位を更に含む、Ｅ２
９に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ３１． 上記リンカーが（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、但しｎは１〜１００の整数で
ある、Ｅ２９またはＥ３０に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ３２． 上記シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含まない、配列番号５４〜配
列番号１５３からなる群より選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％
、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％
、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列
を含む、Ｅ１〜Ｅ３１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ３３． 天然ＦＩＸの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０
％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０
％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または１００％の凝血促進活性を有する、
Ｅ１〜Ｅ３２のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ３４． 上記凝血促進活性が発色基質アッセイ、１段階凝固アッセイ、またはそれら
の両方によって測定される、Ｅ３３に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ３５． 上記ＦＩＸポリペプチドがＲ３３８Ｌ ＦＩＸ変異体である、Ｅ１〜Ｅ３４
のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ３６． 上記Ｒ３３８Ｌ ＦＩＸ変異体が、配列番号２と少なくとも約８０％、少な
くとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少な
くとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である
アミノ酸配列を含む、Ｅ３５に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ３７． Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質をコードする配列
を含む単離されたポリヌクレオチド。
Ｅ３８． Ｅ３７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
Ｅ３９． Ｅ３７に記載のポリヌクレオチドまたはＥ３８に記載のベクターを含む宿主
細胞。
Ｅ４０． 上記ＦＩＸ融合タンパク質がインビボで発現される、Ｅ３９に記載の宿主細
胞。
Ｅ４１． 上記ＦＩＸ融合タンパク質がインビトロで発現される、Ｅ３９に記載の宿主
細胞。
Ｅ４２． ＦＩＸ融合タンパク質の製造方法であって、Ｅ３９に記載の宿主細胞を上記
ＦＩＸ融合タンパク質が発現される条件下で培養することを含む、上記方法。
Ｅ４３． Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質、Ｅ３７に記載の
ポリヌクレオチド、Ｅ３８に記載の発現ベクター、またはＥ３９〜Ｅ４１のいずれか１に
記載の宿主細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
Ｅ４４． 有効量のＥ１〜Ｅ３６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質、Ｅ３７
に記載のポリヌクレオチド、Ｅ３８に記載の発現ベクター、Ｅ３９〜Ｅ４１のいずれか１
に記載の宿主細胞、Ｅ４３に記載の組成物を投与することを含む、それを必要とする患者
における凝固疾患もしくは疾病の予防、治療、改善、または管理方法。
Ｅ４５． 上記投与することが上記患者への皮下投与を含む、Ｅ４４に記載の方法。
Ｅ４６． 患者における凝固疾患もしくは疾病の診断または画像診断方法であって、Ｅ
１〜Ｅ３６のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質、Ｅ３７に記載のポリヌクレオチ
ド、Ｅ３８に記載の発現ベクター、Ｅ３９〜Ｅ４１のいずれか１に記載の宿主細胞を上記
対象の試料と接触させることを含む上記方法。
Ｅ４７． ＦＩＸポリペプチドの半減期の延長方法であって、配列番号２のアミノ酸１
０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ
酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のア
ミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２
のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、及びそれらの任意の組み合わせからな
る群より選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内にＸＴＥＮ
を挿入し、それによってＦＩＸ融合タンパク質を構築することを含み、上記ＦＩＸタンパ
ク質が凝血促進活性を示す、上記ＦＩＸポリペプチドの半減期の延長方法。
Ｅ４８． 第１の連鎖及び第２の連鎖を含む第ＩＸ因子（ＦＩＸ）融合タンパク質であ
って、
ａ．第１の連鎖が、
ｉ．ＦＩＸポリペプチドと、
ｉｉ．配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で上記ＦＩＸポリペプチド内に
挿入され、少なくとも約７２のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１のＸＴ
ＥＮと、
ｉｉｉ．上記少なくとも１のＸＴＥＮの上記ＦＩＸポリペプチドに融合された第１のＦ
ｃドメインと
を含み、
ｂ．第２の連鎖が第２のＦｃドメインを含み、
第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインとが共有結合によって会合しており、凝血促進
活性を示す、上記ＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ４９． 上記少なくとも１のＸＴＥＮが、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも
約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも
約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１
００％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ４８に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ５０． 上記ＦＩＸ融合タンパク質の第１の連鎖が、配列番号２２７のアミノ酸配列
と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％
、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約
９９％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ上記ＦＩＸ融合タンパク質の第２の連鎖が、
配列番号２２８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも
約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも
約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｅ４８またはＥ４
９に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
Ｅ５１． 上記ＦＩＸ融合タンパク質の第１の連鎖が配列番号２２７のアミノ酸配列を
含み、且つ上記ＦＩＸ融合タンパク質の第２の連鎖が配列番号２２８のアミノ酸配列を含
む、Ｅ４８〜Ｅ５０のいずれか１に記載のＦＩＸ融合タンパク質。
以下のベクター配列は、上述の実施例及び本出願中の他所において参照される。以下の
記号の説明は当該情報の理解の助けになろう。
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Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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