TW201536811A - 嵌合ｆｖｉｉ－ｘｔｅｎ分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供嵌合FVII分子，其包含FVII、XTEN多肽及特異地結合GPIIb/IIIIa受體之非活性形式之α及/或β子單元的抗體及其抗原結合分子。可將該等抗體及抗原結合分子基因融合及/或接合至異源性部分，例如半衰期延長部分。本發明亦包括產生及使用該等嵌合分子的方法。

Description

嵌合FVII-XTEN分子及其用途
本發明關於嵌合FVII-XTEN分子及其用途。
已向患者投與凝結因子來在一段時間內改善止血。重組DNA技術之出現已顯著地改善對患有凝結障礙之患者的治療，從而使得安全及一致的蛋白質治療得以發展。舉例而言，重組活化因子VII(「FVII」)已廣泛地用於治療重度出血，諸如發生於患有A型或B型血友病，凝血因子XI、FVII缺乏，血小板功能不全，血小板減少症或馮威里氏病(von Willebrand's disease)之患者中的重度出血。
儘管此類重組分子為有效的，然而需要將治療定位至凝血位點、具有改良的藥物動力學性質、具有改良的可製造性、具有降低的血栓形成能力或具有增強的活性、或此等特徵中一種以上者的改良形式。
藉由替代療法治療血友病係以使凝結活性恢復為目標。存在可用於按需治療出血事件或藉由防治性治 療來預防出血事件發生的血漿源性及重組凝結因子產品。基於此等產品之半衰期，治療方案需要頻繁的靜脈內投藥。此頻繁投藥為疼痛且不便的。用以延長凝結因子半衰期的策略包括聚乙二醇化(Rostin J等人，Bioconj.Chem.2000；11：387-96)、醣聚乙二醇化(Stennicke HR等人，Thromb.Haemost.2008；100：920-8)、用聚乙二醇化脂質體進行調配(Spira J等人，Blood 2006；108：3668-3673、Pan J等人，Blood 2009；114：2802-2811)及與白蛋白接合(Schulte S.,Thromb.Res.2008；122增刊4：S14-9)。
重組活化FVII(rFVIIa；NOVOSEVEN®)係用於治療以下中的出血事件(i)具有抵抗FVIII或FIX之中和抗體(抑制劑)的血友病患者，(ii)缺乏FVII之患者，或(iii)經歷手術程序的具有抑制劑之A型或B型血友病患者。然而，NOVOSEVEN®顯示不良的功效。通常需要在高濃度下FVIIa之重複劑量來控制出血，因為其對活化血小板之親和力低、半衰期短且在不存在組織因子的情況下酶活性不良。因此，對用於具有FVIII及FIX抑制劑及/或缺乏FVII之血友病患者的更好治療及預防選擇存在尚未滿足的醫學需要。
本發明揭示一種嵌合FVII分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子顯示以下特 徵中之一或多者：(a)抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與選自由以下組成之群的抗體特異地結合至相同GPIIb/IIIa抗原決定基：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；(b)抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子競爭地抑制GPIIb/IIIa結合至選自由以下組成之群的抗體：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；或(c)抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含選自以下者之互補決定區(CDR)的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個CDR或其變異體：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4。
舉例而言，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子可包含選自由以下組成之群的抗體之六個CDR或其變異體：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4。
在一個態樣中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗 GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：25、31、37、43或111中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：26、32、38、44或112中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：27、33、39、45或113中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：28、34、40、117或114中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：29、35、41、118或115中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：30、36、42、119或116中之任一者至少約60%、70%、80%、90%或95%一致。
在另一態樣中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1，其包含一致序列X1YAMS，其中X1表示胺基酸殘基Thr(T)、Ser(S)或Ala(A)； (ii)VH-CDR2，其包含一致序列SIX2X3GX4X5TYX6X7DSVKX8，其中X2表示胺基酸殘基Ser(S)或Asn(N)，X3表示胺基酸殘基Ser(S)或Gly(G)，X4表示胺基酸殘基Ser(S)或Gly(G)，X5表示胺基酸殘基Ser(S)、Asn(N)或Thr(T)，X6表示胺基酸殘基Tyr(Y)或Phe(F)，X7表示胺基酸殘基Leu(L)或Pro(P)且X8表示胺基酸殘基Gly(G)或Arg(R)；(iii)VH-CDR3，其包含一致序列GGDYGYAX9DY，其中X9表示胺基酸殘基Leu(L)或Met(M)；(iv)VL-CDR1，其包含序列RASSSVNYMY(SEQ ID NO：28)；(v)VL-CDR2，其包含序列YTSNLAP(SEQ ID NO：29)；及，(vi)VL-CDR3，其包含序列QQFSSSPWT(SEQ ID NO：30)。
在一個實施例中，適用於嵌合分子的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：25、31、37、43及111組成之群；(ii)VH-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：26、32、38、44及112組成之群；(iii)VH-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：27、33、39、45及113組成之群；(iv)VL-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：28、34、 40、117及114組成之群；(v)VL-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：29、35、41、118及115組成之群；及，(vi)VL-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：30、36、42、119及116組成之群。
在另一實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：1、3、5、7或97中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：2、4、6、99或98中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列(34D10抗體)。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列(2A2抗體)。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列(36A8抗體)。在某些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列(4B11抗體)。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或 其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列(35D1抗體)。抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子可結合至位於GPIIb/IIIa之α子單元之細胞外域或GPIIb/IIIa複合物之細胞外域中的抗原決定基。在某些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子不與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
在一些態樣中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：46、52、120或126中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：47、53、121或127中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：48、54、122或128中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：49、55、123或129中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：50、56、124或130中之任一者至少約60%、70%、 80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：51、57、125或131中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在其他態樣中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：8、10、100或102中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：9、11、101或103中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在一個實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列(1H6抗體)。在另一實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列(38A8抗體)。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列(38G8抗體)。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列(21F10抗體)。在某些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa 之α子單元之細胞外域中的抗原決定基。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
在某些態樣中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：58至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：59至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：60至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：61至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：62至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：63至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在一個實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：12至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：13至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列(18F7抗體)。在另一實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之α子單元之細胞外域中的抗原決定基。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
亦提供一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：64、70或135中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：65、71或136中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：66、72或137中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：67、132或138中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致； (v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：68、133或139中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：69、134或140中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在其他態樣中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1，其包含序列SYWIE(SEQ ID NO：64)；(ii)VH-CDR2，其包含一致序列EILPGX14GX15TKYNX16KFKG(SEQ ID NO：__)，其中X14表示胺基酸殘基Ser(S)或Thr(T)，X15表示胺基酸殘基Ile(I)或Tyr(Y)，且X16表示胺基酸殘基Asp(D)或Glu(E)；(iii)VH-CDR3，其包含序列LISYYYAMDY(SEQ ID NO：66)；(iv)VL-CDR1，其包含序列RASQDISNYLN(SEQ ID NO：67)；(v)VL-CDR2，其包含序列YTSRLHS(SEQ ID NO：68)；及，(vi)VL-CDR3，其包含序列QQGNTLPPT(SEQ ID NO：69)。
在一個實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：14、16或105中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：15、104或106中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在另一實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列(12B2抗體)。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列(38F6抗體)。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列(13C1抗體)。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之β子單元之細胞外域中的抗原決定基。在其他實施例中，GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子不與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
在其他態樣中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：73、76、79、85或147中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致； (ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：74、77、80、86或148中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：75、78、81、87或149中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：141、144、82、88或150中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：142、145、83、89或151中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：143、146、84、90或152中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在一個實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：17、18、19、21或109中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：107、108、20、22或110中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在另一實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列(5C4抗體)。在其他實施例中，抗 GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列(23C10抗體)。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列(37C7抗體)。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列(28C2抗體)。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列(9D6抗體)。在某些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之β子單元之細胞外域中的抗原決定基。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
在一些態樣中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：91至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：92至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一 致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：93至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：94至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：95至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：96至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在一個實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：23至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：24至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列(28F4抗體)。在另一實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之β子單元之細胞外域中的抗原決定基。
在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(a)單鏈Fv(「scFv」)；(b)雙功能抗體(diabody)；(c)微型抗體；(d)抗體之多肽鏈；(e)F(ab’)2；或(f)F(ab)。
在本發明之一些態樣中，嵌合分子進一步包含在FVII與XTEN多肽之間、在FVII與抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子之間、或在XTEN多肽與抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子之間的可選連接子。
在一個實施例中，嵌合分子包含選自由以下組成之群的式：(i)FVII-(L1)-X-(L2)-Tm；(ii)FVII-(L1)-Tm-(L2)-X；(iii)Tm-(L1)-X-(L2)-FVII；(iv)Tm-(L1)-FVII-(L2)-X；(v)X-(L1)-Tm-(L2)-FVII；及(vi)X-(L1)-FVII-(L2)-Tm；其中FVII包含活化FVII(「FVIIa」)；X為XTEN多肽；Tm為抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；L1為第一可選連接子，且L2為第二可選連接子。
在另一實施例中，嵌合分子包含彼此締合的第一多肽鏈及第二多肽鏈，(a)其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及XTEN多肽，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；(b)其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈及XTEN多肽；(c)其中第一多肽鏈包含呈任何次序的FVII之輕鏈、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈；或(d)其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈，且第二多肽鏈包含呈任何次序的FVII之重鏈、XTEN多肽及抗 GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。
在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合的第一多肽鏈及第二多肽鏈，(a)其中第一多肽鏈包含式FVIIL-X或X-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm或Tm-FVIIH，(b)其中第一多肽鏈包含式FVIIL-Tm或Tm-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-X或X-FVIIH；(c)其中第一多肽鏈包含式FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH；(d)其中第一多肽鏈包含式FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm-X或X-Tm-FVIIH；(e)其中第一多肽鏈包含式FVIIL-Tm-X或X-Tm-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH；或(f)其中第一多肽鏈包含式FVIIL-X-Tm或Tm-X-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH，其中FVIIH為FVII之重鏈；Tm為抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；FVIIL為FVII之輕鏈；且X為XTEN多肽。
在一些實施例中，嵌合分子包含選自由以下組成之群的式：(a)X-FVIIL：FVIIH-Tm；(b)Tm-FVIIL：FVIIH-X；(c)FVIIL：FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH：FVIIL；(d)FVIIL：FVIIH-Tm-X或X-Tm-FVIIH：FVIIL； (e)FVIIL-X-Tm：FVIIH或FVIIH：Tm-X-FVIIL；及FVIIL-Tm-X：FVIIH或FVIIH：Tm-X-FVIIL，其中FVIIH為FVII重鏈；Tm為抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；FVIIL為FVII之輕鏈；X為XTEN多肽；且(：)為兩條多肽鏈之間的締合。
第一多肽鏈與第二多肽鏈之間的締合可為例如雙硫鍵之共價鍵，或非共價鍵。
在本發明之某些態樣中，嵌合分子包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含：(a)FVII之輕鏈、XTEN多肽、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；或(b)FVII之輕鏈、抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及XTEN多肽。蛋白酶裂解位點可為細胞內加工位點，其可由前蛋白轉化酶加工。
在一些態樣中，嵌合分子包含彼此締合的第一多肽鏈及第二多肽鏈，(a)其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及XTEN多肽，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈及結合至血小板之靶向部分；(b)其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及結合至血小板之靶向部分，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈及XTEN多肽；(c)其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈、XTEN多肽及結合至血小板之靶向 部分；或(d)其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈、結合至血小板之靶向部分或XTEN多肽。
在其他態樣中，嵌合分子包含彼此締合的第一多肽鏈及第二多肽鏈，(a)其中第一多肽鏈包含式FVIIL-Tm或Tm-FVIIL且第二多肽鏈包含FVIIH-X或X-FVIIH；(b)其中第一多肽鏈包含式FVIIL-X或X-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm或Tm-FVIIH；(c)其中第一多肽鏈包含式FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH；或(d)其中第一多肽鏈包含式FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm-X或X-Tm-FVIIH，其中FVIIH為FVII之重鏈；Tm為結合至血小板之靶向部分；FVIIL為FVII之輕鏈；且X為XTEN多肽。
亦提供一種嵌合分子，其包含選自由以下組成之群的式：(a)X-FVIIL：FVIIH-Tm或Tm-FVIIH：FVIIL-X；(b)Tm-FVIIL：FVIIH-X或X-FVIIH：FVIIL-Tm；(c)FVIIL：FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH：FVIIL；及(d)FVIIL：FVIIH-Tm-X或X-Tm-FVIIH：FVIIL；其中FVIIH為FVII之重鏈；Tm為結合至血小板之靶向部分；FVIIL為FVII之輕鏈；X為XTEN多肽；且(：)為兩條多肽 鏈之間的締合。第一多肽鏈與第二多肽鏈之間的締合可為例如雙硫鍵之共價鍵，或非共價鍵。
在某些態樣中，嵌合分子包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含，(a)FVII之輕鏈、XTEN多肽、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及結合至血小板之靶向部分；(b)FVII之輕鏈、結合至血小板之靶向部分、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及XTEN多肽；(c)FVII之輕鏈、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈、XTEN多肽及結合至血小板之靶向部分；或(d)FVII之輕鏈、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈、結合至血小板之靶向部分及XTEN多肽。蛋白酶裂解位點可為藉由前蛋白轉化酶加工之細胞內加工位點。
適用於嵌合分子之靶向部分係選自由以下組成之群：抗體或其抗原結合分子、受體之受體結合部分及結合至血小板之肽。舉例而言，靶向部分可選擇性地結合至靜止血小板或活化血小板。在一些實施例中，靶向部分選擇性地結合至選自由以下組成之群的標靶：GPIba、GPVI、GPIX、醣蛋白IIb/IIIa(「GPIIb/IIIa」)之非活性形式、GPIIb/IIIa之活性形式、P選擇蛋白(selectin)、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L、LOX-1及其任何組合。
在一些實施例中，相較於由重鏈及輕鏈組成之FVIIa，嵌合分子中FVII之半衰期增加。在其他實施例 中，嵌合分子中FVII之凝結活性等於或大於由重鏈及輕鏈組成之FVIIa。凝結活性可藉由ROTEM分析、aPTT分析或任何已知分析量測而得。
在某些實施例中，XTEN多肽包含AE基序(motif)、AG基序、AD基序、AM基序、AQ基序、AF基序、BC基序、BD基序或其任何組合。舉例而言，嵌合分子之XTEN多肽可包含約42個胺基酸、約72個胺基酸、約108個胺基酸、約144個胺基酸、約180個胺基酸、約216個胺基酸、約252個胺基酸、約288個胺基酸、約324個胺基酸、約360個胺基酸、約396個胺基酸、約432個胺基酸、約468個胺基酸、約504個胺基酸、約540個胺基酸、約576個胺基酸、約612個胺基酸、約624個胺基酸、約648個胺基酸、約684個胺基酸、約720個胺基酸、約756個胺基酸、約792個胺基酸、約828個胺基酸、約836個胺基酸、約864個胺基酸、約875個胺基酸、約912個胺基酸、約923個胺基酸、約948個胺基酸、約1044個胺基酸、約1140個胺基酸、約1236個胺基酸、約1318個胺基酸、約1332個胺基酸、約1428個胺基酸、約1524個胺基酸、約1620個胺基酸、約1716個胺基酸、約1812個胺基酸、約1908個胺基酸、約2004個胺基酸或其任何組合。在特定實施例中，XTEN多肽係選自由以下組成之群：AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何組合。
在一些實施例中，嵌合分子進一步包含連接子，其中連接子連接嵌合分子之任何組分，例如連接FVII之輕鏈與XTEN多肽、連接FVII之重鏈與靶向部分或兩者皆有，或連接FVII之輕鏈與靶向部分、連接FVII之輕鏈與XTEN多肽或兩者皆有。在其他實施例中，連接子包含具有式[(Gly)x-Sery]z之肽，其中x為1至4，y為0或1，且z為1至50。
在某些實施例中，嵌合分子進一步包含融合至FVII之重鏈、FVII之輕鏈、XTEN多肽、靶向部分或其任何組合的異源性部分。異源性部分可為多肽部分或非多肽部分且進一步延長FVII之半衰期。在一些實施例中，相較於不包含異源性部分之FVII，當向受試者投與時，異源性部分延長嵌合分子之半衰期。在特定實施例中，異源性部分可選自由以下組成之群：白蛋白、白蛋白結合多肽或脂肪酸、Fc、運鐵蛋白、PAS、人類絨毛膜促性腺激素之β子單元之C端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合小分子、vWF、另一XTEN多肽及其任何組合。
亦提供一種醫藥組合物，其包含嵌合分子、編碼嵌合分子之多核苷酸或多核苷酸組、包含多核苷酸或多核苷酸組之載體、包含多核苷酸組之載體組、包含載體或載體組之寄主細胞，或製造嵌合分子的方法，其包括用載體或載體組轉染寄主細胞，及在用於表現嵌合分子之適合條件下於培養基中培養細胞。
進一步提供一種在有需要的受試者中降低出血事件之頻率或程度或預防出血事件之發生的方法，其包括投與嵌合分子、多核苷酸、多核苷酸組、載體、載體組或寄主細胞。在一些實施例中，受試者已發展或有能力發展抵抗FVII、FIX或兩者之抑制劑，例如抵抗FVII、FIX或兩者之中和抗體。
圖1為嵌合分子之示意圖，其包含FVII、XTEN多肽(X)、及來源於抗GPIIb/IIIa抗體之scFv，例如34D10。FVII可為活化FVII。XTEN多肽、FVII及scFv可由一或多個可選連接子聯結。嵌合分子中之scFv可含有呈任何次序的VH及VL，亦即VH-VL或VL-VH。
圖2A至圖2D展示包含兩條多肽鏈之嵌合分子之圖。圖2A展示嵌合分子(例如FVII-211)之示意圖，該嵌合分子包含彼此締合之兩條多肽鏈，第一條鏈包含FVII之輕鏈及XTEN多肽，其視情況由連接子融合，且第二條鏈包含FVII之重鏈及來源於抗GPIIb/IIIa抗體之scFv，其由另一連接子融合。圖2B展示嵌合分子之示意圖，該嵌合分子包含彼此締合之兩條多肽鏈，第一條鏈包含FVII之輕鏈及來源於抗GPIIb/IIIa抗體之scFv，且第二條鏈包含FVII之重鏈及XTEN多肽，其中FVII之輕鏈由第一可選連接子融合至scFv且FVII之重鏈由第二可選連接子融合至XTEN多肽。圖2C為嵌合分子(例如FVII- 200)之示意圖，該嵌合分子包含兩條多肽鏈，第一條鏈包含FVII之輕鏈且第二條鏈包含FVII之重鏈、XTEN多肽及來源於抗GPIIb/IIIa抗體的scFv，其中重鏈由第一可選連接子融合至XTEN多肽，且XTEN多肽由第二可選連接子融合至scFv。圖2D為嵌合分子之示意圖，該嵌合分子包含彼此締合之兩條多肽鏈，第一條鏈包含FVII之輕鏈且第二條鏈包含FVII之重鏈、來源於抗GPIIb/IIIa抗體之scFv及XTEN多肽，其中重鏈由第一可選連接子融合至scFv且scFv由第二可選連接子融合至XTEN多肽。嵌合分子中之scFv可含有呈任何次序的VH及VL，亦即VH-VL或VL-VH。
圖3A及圖3B展示對應於抵抗GPIIb/IIIa之抗體之重鏈可變域(VH)序列(圖3A)及輕鏈可變域(VL)序列(圖3B)之一致性矩陣(identity matrix)，其中陰影小格指示哪些抗體共用同一VL或VH序列。
圖4展示1H6、38A8、12B2、38F6、2A2、36A8、4B11、34D10、28F4、23C10、28C2、5C4、9D6及18F7抗體之VH序列之ClustalX多重序列比對，其指示互補決定區(CDR)之位置。指示各CDR(CDR1、CDR2及CDR3)根據EU索引之位置。將一致、保守及部分保守胺基酸殘基之位置在比對下方指出。
圖5展示28C2、9D6、1H6、38A8、12B2、18F7、28F4、34D10、36A8及2A2抗體之VL序列的ClustalX多重序列比對，其指示CDR1、CDR2及CDR3 根據EU索引之位置。將一致、保守及部分保守胺基酸殘基之位置在比對下方指出。
圖6展示一致性百分比矩陣，其對應於包括在圖5(頂部矩陣)及圖4(底部矩陣)中所展示的ClustalX多重序列比對中的序列。
圖7展示ClustalX多重序列比對，其對應於根據圖4中之VH序列對GPIIb/IIIa之α或β子單元的特異性所聚集的序列。
圖8展示ClustalX多重序列比對，其對應於根據圖5中之VL序列對GPIIb/IIIa之α或β子單元的特異性所聚集的序列。
圖9展示ClustalX多重序列比對，其對應於根據圖4中之VH序列與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa的能力所聚集的序列。
圖10展示ClustalX多重序列比對，其對應於根據圖5中之VL序列與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa的能力所聚集的序列。
圖11A展示藉由可溶性組織因子依賴性凝血酶原時間(sTF-PT)分析(圖11A)量測的rFVIIa及rFVII-XTEN之FVIIa活性。rFVIIa為重組產生的活化FVII，且rFVIIa-XTEN為FVII之重鏈融合至XTEN多肽的活化FVII。x軸為以小時計的時間，且y軸為經給藥HemA小鼠中自血漿的FVIIa活性恢復率(%)。圖11B展示藉由ROTEM分析所量測的rFVIIa及rFVIIa-XTEN之凝結時間 (CT)。x軸展示檸檬酸化人類A型血友病血液中所摻入指定蛋白質之以nM計的濃度，且y軸展示藉由ROTEM所記錄的凝結時間；凝結係由鈣起始。
圖12A展示人類全血中的血小板結合。將蛋白質摻入稀釋(1：50)全血中，用FITC-抗-FVII及APC-CD42b染色，且藉由流式細胞測量分析對血小板上的FVII螢光中值(FVII MPV)進行量測。測試三種構築體(上文所述的FVII-200(圓圈)、FVII-189(三角)及FVII-211(x))的血小板結合。x軸展示人類血液中所摻入蛋白質之濃度，且y軸展示表示結合至血小板的蛋白質相對量的FVII螢光中值(FVII MFV)。圖12B展示藉由ROTEM分析所量測的rFVIIa(圓圈)及FVII-200(三角)之凝結活性。x軸展示以nM計的濃度且y軸為凝結時間。
圖13A展示αIIb基因轉殖小鼠之血液中FVII-200(圓圈)、FVII-189(三角)及FVII-211(x)之血小板結合。x軸展示以nM計的濃度，且y軸展示血小板上FVII螢光中值(FVII MFV)。圖13B展示隨投與蛋白質後之時間變化的來自人類αIIb基因轉殖小鼠之血小板上rFVII-200(圓圈)、FVII-211(x)及FVII-179(三角)的FVII恢復率。以5nmol/kg指定蛋白質對小鼠給藥，且藉由流式細胞測量術分析產生的血小板上FVII螢光中值。FVII恢復率百分比(%)係指血小板上剩餘FVII MFV相對給藥後5分鐘的值之百分比。
圖14A至圖14F展示嵌合分子之示意圖，該 等嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及血小板靶向分子。圖14A展示一種嵌合蛋白，其包含與FVII之重鏈共價締合的FVII之輕鏈，該重鏈進一步融合至來源於PDG13抗體之scFv(亦即血小板靶向抗體)。圖14B展示一種嵌合蛋白，其包含與FVII之重鏈共價締合的FVII之輕鏈，該重鏈進一步融合至XTEN多肽。圖14C及圖14D展示與FVII之重鏈共價締合的輕鏈，該重鏈進一步聯結至來源於PDG13抗體之scFv及XTEN(圖14C)，以及聯結至XTEN多肽及來源於PDG13抗體之scFv(圖14D)。圖14E展示一種嵌合分子，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含融合至來源於PDG13抗體之scFv的FVII輕鏈，且第二多肽鏈包含融合至XTEN多肽的FVII重鏈。圖14F展示一種嵌合分子，其包含兩條多肽鏈，第一條鏈包含融合至XTEN多肽的FVII輕鏈，且第二條鏈包含融合至來源於PDG13抗體之scFv的FVII重鏈。
圖15A至圖15D展示ROTEM分析，其比較rFVIIa與嵌合FVII分子之凝結時間。圖15A展示用抗FVIII抗體模擬的人類血友病血液中rFVIIa、FVII-165及FVII-178之凝結時間。將來自正常人類供體之檸檬酸化血液用抗FVIII抗體及指定蛋白質處理。藉由鈣起始凝結且藉由ROTEM機記錄凝結時間。BL，天然血液之基線；BL+Ab，在抗FVIII抗體處理情況下的基線位準。圖15B展示藉由ROTEM的檸檬酸化人類A型血友病血液中rFVIIa及FVII-179之凝結時間；凝結係藉由鈣起始。圖 15C及圖15D展示藉由ROTEM的檸檬酸化人類A型血友病血液中rFVIIa、FVII-175、FVII-177、FVII-178之凝結時間，且凝結係藉由組織因子及鈣起始。
圖16展示血小板/NSG小鼠中的血小板結合FVIIa清除。FVII-211及FVII-179構築體均在上文所述。在人類血小板轉輸之後30分鐘以25nmol/kg FVII-211或FVII-179對NSG小鼠給藥。將各時間點人類血小板結合FVII之螢光中值正規化為蛋白質投與後5分鐘之體積。x軸展示用FVII-211或FVII-179給藥之後的時間(小時)，且y軸展示轉輸人類血小板上之FVII恢復率(%)。
圖17A展示XTEN AE288的序列。圖17B展示藉由抗GFP抗體偵測之活體外猴子血漿(上列)、活體內猴子樣品(中間)及活體外小鼠腎均質物(下列)中GFP-XTEN之穩定性。rFVIIa及rFVIIa-XTEN之示意圖展示在底部。
圖18展示rFVIIa及rFVII-XTEN之FVIIa血漿活性。rFVIIa為重組產生的活化FVII，且rFVIIa-XTEN為FVII之重鏈融合至XTEN多肽的活化FVII。x軸為以小時計的時間，且y軸為劑量正規化的FVIIa血漿活性(%)。
圖19展示rFVIIa及FVII-200之FVIIa血漿活性。FVII-200含有活化FVII(亦即重鏈及輕鏈)，活化FVII的融合至XTEN序列(例如AE288)之重鏈，其進一步融合至來自抗GPIIb/IIIa抗體之scFv。x軸為以小時計的 時間，且y軸為劑量正規化的FVIIa血漿活性(%)。
圖20A至圖20C展示藉由sTF-PT方法所測定之血小板靶向rFVIIa-XTEN變異體之活性。圖20A展示構型A之示意圖，該構型包含融合至XTEN(亦即72個胺基酸、144個胺基酸或288個胺基酸)之FVII輕鏈及藉由連接子融合至34D10 scFv之FVII重鏈，展示三種構築體(亦即FVII-227、FVII-228及FVII-211)之表及構築體與rFVIIa及FVII-189之sTF-PT分析。構築體FVII-189在上文所述。圖20B展示構型B之示意圖，該構型包含FVII輕鏈及藉由XTEN(亦即72個胺基酸、144個胺基酸或288個胺基酸)融合至34D10 scFv之FVII重鏈，展示三種構築體(亦即FVII-231、FVII-232及FVII-200)之表及構築體與rFVIIa之sTF-PT分析。圖20C展示構型C之示意圖，該構型包含融合至XTEN(亦即42個胺基酸、72個胺基酸或72個胺基酸)之FVII輕鏈及藉由XTEN(亦即72個胺基酸、42個胺基酸或72個胺基酸)融合至34D10 scFv之FVII重鏈，展示三種構築體(亦即FVII-242、FVII-243及FVII-238)之表及構築體與rFVIIa之sTF-PT分析。
圖21A至圖21D展示藉由ROTEM方法所測定之血小板靶向rFVIIa-XTEN變異體之活性。圖21A展示示意圖及XTEN鍵聯及FVII-227、FVII-228與FVII-211之長度，以及FVII-227、FVII-228及FVII-211之FVII活性。圖21B展示示意圖及XTEN鍵聯及FVII- 231、FVII-232與FVII-200之長度，以及FVII-231、FVII-232及FVII-200之FVII活性。圖21C展示示意圖及XTEN鍵聯及FVII-242、FVII-243與FVII-238之長度，以及FVII-242、FVII-243及FVII-238之FVII活性。FVII活性係藉由相較於rFVIIa之FVII活性的倍數差異來展示。圖21D展示FVII-200之示意圖及FVII-189(FVII輕鏈：FVII重鏈-靶向分子)，FVII-165(FVII輕鏈：FVII重鏈-XTEN)及FVII-200(FVII輕鏈：FVII重鏈-XTEN-靶向分子)中FVII活性之比較。FVII活性係藉由相較於rFVIIa之FVII活性的倍數差異來展示。構築體中之scFv可含有呈任何次序的VH及VL，亦即VH-VL或VL-VH。
圖22展示具有288個胺基酸之單一XTEN足以用於PK改良。向HemA小鼠投與各種FVIIa-XTEN構築體，亦即FVIIaXTEN864、FVIIaXTEN288及rFVIIa。藉由sTF-PT分析量測來自經給藥動物之血漿中的FVII活性。x軸展示以小時計的時間，且y軸展示正規化的活性恢復率(%)。
圖23展示將XTEN長度減小至144或72增加清除率。藉由sTF-PT分析量測來自經給藥動物之血漿的三種構築體(亦即FVII-200/Hc-XTEN288、FVII-232/Hc-XTEN144及FVII-231/Hc-XTEN72)之FVII活性。。x軸展示以小時計的時間，且y軸展示正規化的活性恢復率(%)。
圖24展示兩個各為72的XTEN對比單一 XTEN 288之比較資料。將FVII-238/Hc-XTEN72/Lc-XTEN72之FVII活性與FVII-200/Hc-XTEN288及rFVIIa之FVII活性進行比較。y軸展示正規化的活性恢復率(%)。
圖25展示兩個各為72的XTEN對比單一XTEN 288之比較資料。將蛋白質經由尾靜脈注射投與於αIIb基因轉殖小鼠中。收集全血且用螢光標記抗體染色以便藉由流式細胞測量術可觀測血小板及FVII。藉由定量血小板上螢光強度中值(MFI)來量測血小板結合蛋白質濃度，且將其表示為相對於給藥後5分鐘時MFI之恢復率百分比。將FVII-238/Hc-XTEN72/Lc-XTEN72之恢復率(%)與FVII-200/Hc-XTEN288及FVII-189(無任何XTEN)之恢復率(%)進行比較。
圖26展示重鏈及輕鏈上的XTEN長度之比較資料：aIIb基因轉殖小鼠中的血小板PK，且與圖25相似地計算恢復率。將FVII-238/Hc-XTEN72/Lc-XTEN72之恢復率(%)與FVII-243/Hc-XTEN42/Lc-XTEN72及FVII-242/Hc-XTEN72/Lc-XTEN42之恢復率(%)進行比較。
本發明係關於嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及結合至血小板之靶向部分(例如第II.A.1部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)。本發明係至少部分地基於對用以增強凝結因子之功效、藥物動力學 性質及/或可製造性之新穎方式的開發。嵌合分子係以使凝血位點處之促凝血活性提高且使藥物動力學性質改良之方式加以開發。為用於繞道療法(bypass therapy)中，外源性凝結因子僅在以活化形式給予時為有效的。然而，該等活化凝結因子藉由內源性途徑(例如抗凝血酶III，TFPI)迅速失活，導致活性形式之清除及短的有效半衰期。給予較高劑量並未解決此問題，因為其可造成血栓形成效應。由此，在一個實施例中，本發明係關於活性增強的嵌合FVII分子構築體，其包含融合至在受傷部位提供凝結因子之靶向部分的FVII。該等分子亦含有PK增強部分，亦即XTEN多肽，其可改良多個藥物動力學性質，例如半衰期。
本發明之示範性構築體在隨附圖式及序列表中示出。在一個實施例中，本發明係關於具有如圖中所闡述之結構的多肽。在另一實施例中，本發明係關於具有如隨附序列表中所闡述之序列的多肽或編碼此等多肽之核酸分子。在一個實施例中，本發明係關於一種具有隨附序列表所闡述之序列的多肽之成熟形式。應理解，該等構築體及編碼其之核酸分子可用於改善受試者之止血。
為對說明書及申請專利範圍提供清楚的理解，下文提供以下定義。
定義
應注意，術語「一(個/種)」實體係指一或多 個(種)該實體；例如，「一個核苷酸序列」應理解為表示一或多個核苷酸序列。因此，術語「一(個/種)」、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
此外，在本文中使用時將「及/或」視為對兩個指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者的具體揭示內容。因此，如本文中諸如「A及/或B」之片語中所使用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如諸如「A、B及/或C」之片語中所使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
應理解，無論在本文中將實施例用語言「包含」來描述的情況如何，亦提供以「由...組成」及/或「基本上由...組成」之術語描述的另外相似實施例。
除非另外明確指示，否則本申請案中所指定的各個範圍中數值的使用皆描述為近似值，儘管所述範圍內的最小值及最大值之前均冠有詞「約」。以此方式，所述範圍之上及之下的輕微變化值可用於實質上達成與範圍內的值相同的結果。當如本文所用之術語「約」及「近似」提及數值時，該等術語對於熟習此項技術者而言應具有其與所論述的範圍或要素相關的平常及一般的含義。
自嚴格數值邊界擴展之量視許多因素而定。舉例而言，欲考慮的一些因素可包括要素之臨界值及/或 給定變化量將對所請求標之實施的影響，以及熟習此項技術者已知的其他考慮。因此，一般而言，「約」或「近似」將數值擴展。舉例而言，在一些情況中，「約」或「近似」可視相關技術而定意謂±5%或±10%。此外，範圍之揭示內容意欲作為包括所列出最小值與最大值之間每一值的連續範圍。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與本揭露內容所屬技術之一般技藝人士通常所理解相同的含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC出版社；The Dictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999,Academic出版社；及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000，牛津大學出版社，為技藝人士提供本揭露內容中所使用的許多術語之一般解釋。
單位、前綴及符號皆以其國際單位制(Système International de Unites,(SI))可接受之形式表示。數字範圍包括定義該範圍之數字。除非另外指明，否則胺基酸序列係以胺基至羧基定向自左至右書寫。本文提供之標題不限制本揭露內容之各種態樣或實施例，其可藉由參考整個說明書得出。因此，即將在下文定義之術語藉由參考說明書全文而得到更充分地定義。胺基酸在本文中藉由其通常已知的三個字母符號或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會所推薦之單字母符號來參考。同樣，核苷酸藉由其通 常接受的單字母代碼來參考。
如本文所用之術語「多肽」意欲涵蓋單數「多肽」以及複數「多肽」，且係指由醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性聯結之單體(胺基酸)所組成的分子。術語「多肽」係指具有兩個或兩個以上胺基酸之任何一或多條鏈，且不指代特定長度的產物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「胺基酸鏈」或用於指代具有兩個或兩個以上胺基酸之一或多條鏈的任何其他術語皆包括在「多肽」之定義內，且可使用術語「多肽」替代任何此等術語或可與任何此等術語互換使用。
如本文所用之術語「蛋白質」意欲涵蓋由一或多個多肽組成的分子，該等多肽可在一些情況下藉由不同於醯胺鍵的鍵來締合。
多肽可為單體或多聚體(multimer)。舉例而言，在一個實施例中，本發明之抗體、其抗原結合分子或嵌合分子可為二聚多肽。二聚抗體、其抗原結合分子可包含兩條多肽鏈或可由一條多肽鏈(例如在scFc分子的狀況下)組成。在一個實施例中，二聚體可為同二聚體，其包含兩個相同的單體子單元或多肽(例如兩個相同的Fc部分或兩個相同的生物活性部分)。在另一實施例中，二聚體為異二聚體，其包含兩個不相同的單體子單元或多肽(例如包含兩個不同的凝結因子或其部分或僅一個凝結因子)。參見例如美國專利7,404,956，其以引用的方式併入本文中。
術語「多肽」及「蛋白質」亦意欲指代表現後修飾之產物，其包括但不限於醣化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基/阻隔基之衍生化、蛋白水解裂解或藉由非天然存在胺基酸之修飾。多肽或蛋白質可來源於天然生物來源，或藉由重組技術產生，但不必要自指定核酸序列轉譯。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成產生。
「經分離之」多肽為呈自然界中未發現之形式的多肽。經分離之多肽包括已純化至其不再呈其在自然界所中發現形式之程度的多肽。在一些實施例中，經分離之多肽為實質上純的。
本發明之GPIIb/IIIa抗體、其抗原結合分子或嵌合分子之「衍生物」為已獲改變以便顯示在天然多肽或蛋白質上未發現的其他特性的多肽或蛋白質。「衍生物」亦包括含有二十種標準胺基酸之一或多個天然存在胺基酸衍生物的彼等肽。「來源於」指定多肽或蛋白質之多肽或胺基酸序列涉及多肽之起源。在一個實施例中，來源於特定序列的多肽或胺基酸序列具有的胺基酸序列與該序列或其部分基本上一致，其中該部分由至少約10至約20個胺基酸、至少約20至約30個胺基酸或至少約30至約50個胺基酸組成，或一般技藝人士可以其他方式識別該多肽或胺基酸序列之序列起源。
為另一多肽之「變異體」的多肽可具有一或多個相對於起始多肽之突變，例如已由另一胺基酸殘基取 代或具有一或多個胺基酸殘基插入或缺失之一或多個胺基酸殘基。在一個實施例中，多肽包含非天然存在的胺基酸序列。該等變異體必要地與起始多肽具有小於100%序列一致性或相似性。在另一實施例中，變異體具有的胺基酸序列將與起始多肽之胺基酸序列具有約75%至小於100%胺基酸序列一致性或相似性，例如約80%至小於100%、約85%至小於100%、約90%至小於100%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)及約95%至小於100%，例如在變異體分子之長度範圍內。在一個實施例中，在起始多肽序列與自其衍生之序列之間存在一個胺基酸差異。
當提及本發明之GPIIb/IIIa抗體、其抗原結合分子、嵌合分子，或凝結因子時，術語「片段」係指保留參考多肽或蛋白質之至少一些性質的任何多肽或蛋白質。多肽之片段包括蛋白水解片段，以及缺失片段。舉例而言，抗GPIIb/IIIa抗體之片段可與抗GPIIb/IIIa抗體特異地結合至相同抗原決定基。另一實例為FVII之片段，其具有FVII之凝結活性，例如與rFVIIa相當的FVII凝結活性。
如提及蛋白質序列、肽序列、多肽序列或胺基酸序列所用之術語「序列」意謂多肽中在胺基端至羧基端方向上胺基酸成分的線性表示，其中在該表示中彼此相鄰的殘基在多肽的一級結構中為鄰接的。
術語「胺基酸」包括丙胺酸(Ala或A)；精胺 酸(Arg或R)；天冬醯胺(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺(Gln或Q)；麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(Ile或I)；白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(Val或V)。
非傳統胺基酸亦在本發明之範疇內且包括正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸及諸如Ellman等人Meth.Enzym.202：301-336(1991)中所述之彼等者的其他胺基酸殘基類似物。為產生此等非天然存在胺基酸殘基，可使用Noren等人Science 244：182(1989)及Ellman等人(如上)之程序。簡言之，該等程序涉及用非天然存在胺基酸殘基化學活化抑制因子tRNA，接著活體外轉錄及轉譯RNA。非傳統胺基酸之引入亦可使用此項技術中已知的肽化學方法達成。如本文所用之術語「極性胺基酸」包括淨電荷為零但在其側鏈之不同部分中具有部分非零電荷的胺基酸(例如M、F、W、S、Y、N、Q及C)。該等胺基酸可參與疏水性相互作用及靜電相互作用。如本文所用之術語「帶電胺基酸」包括側鏈上具有非零淨電荷的胺基酸(例如R、K、H、E及D)。該等胺基酸可參與疏水性相互作用及靜電相互作用。
「胺基酸取代」係指將預先確定的胺基酸序列(起始多肽之胺基酸序列)中至少一個現存胺基酸殘基用 第二個不同的「置換」胺基酸殘基置換。「胺基酸插入」係指將至少一個其他胺基酸併入至預先確定的胺基酸序列中。儘管插入通常由一個或兩個胺基酸殘基的插入組成，然而可進行本發明較大「肽插入」，例如約三個至約五個或甚至高達約十個、十五個或二十個胺基酸殘基的插入。如上文所揭示，經插入之一或多個殘基可為天然存在或非天然存在的。「胺基酸缺失」係指將至少一個胺基酸殘基自預先確定的胺基酸序列移除。
「保守胺基酸取代」為用具有相似側鏈之胺基酸殘基置換胺基酸殘基的取代。具有相似側鏈之胺基酸殘基家族已於此項技術中加以定義，包括鹼性側鏈(例如Lys、Arg及His)、酸性側鏈(例如Asp及Glu)、不帶電極性側鏈(例如Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr及Cys)、非極性側鏈(例如Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met及Trp)、β-分支側鏈(例如Thr、Val及Ile)及芳族側鏈(例如Tyr、Phe、Trp及His)。因此，若多肽中之胺基酸用來自同一側鏈家族之另一胺基酸置換，則將取代視為保守的。在另一實施例中，可將一連串胺基酸用側鏈家族成員之順序及/或組成不同的結構上相似的胺基酸串保守地置換。
非保守取代包括以下取代，其中：(i)具有正電性側鏈之殘基(例如Arg、His或Lys)取代負電性殘基(例如Glu或Asp)或由其取代，(ii)親水性殘基(例如Ser或Thr)取代疏水性殘基(例如Ala、Leu、He、Phe或Val)或由其取代，(iii)半胱胺酸或脯胺酸取代任何其他殘基或 由其取代，或(iv)具有大型疏水性或芳族側鏈之殘基(例如VaI、He、Phe或Trp)取代具有較小側鏈(例如Ala或Ser)或無側鏈(例如Gly)之殘基或由其取代。
兩個多核苷酸或多肽序列之間使用的術語「序列一致性百分比」係指在比較窗口上由該等序列共用的一致匹配位置數，其考慮到為進行兩個序列之最佳比對必須引入的添加或缺失(亦即間隙)。匹配位置為靶序列及參考序列二者中存在相同核苷酸或胺基酸的任何位置。靶序列中存在的間隙不做計數，因為間隙不為核苷酸或胺基酸。同樣，參考序列中存在的間隙不做計數，因為對靶序列核苷酸或胺基酸計數，而不對來自參考序列之核苷酸或胺基酸計數。
序列一致性百分比係藉由以下進行計算：判定兩個序列中出現一致胺基酸殘基或核酸鹼基的位置數以得到匹配位置數，用匹配位置數除以比較窗口中之位置總數，且將結果乘以100而得到序列一致性百分比。比較序列及判定兩個序列之間的序列一致性百分比可使用供在線使用及供下載的易於獲得的軟體完成。適合軟體程式可自各種來源獲得，且可用於比對蛋白質及核苷酸序列。
用以判定序列一致性百分比的一個適合程式為bl2seq，其為可獲自美國政府國家生物技術資訊中心BLAST網址(blast.ncbi.nlm.nih.gov)之BLAST程式套件之部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法進行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP 用於比較胺基酸序列。其他適合程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其為生物資訊程式之EMBOSS套件之部分，且亦可獲自歐洲生物資訊研究所(EBI)之www.ebi.ac.uk/Tools/psa。
與多核苷酸或多肽參考序列比對的單個多核苷酸或多肽靶序列內的不同區可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意，將序列一致性百分比值捨入至最接近的十分位。舉例而言，將80.11、80.12、80.13及80.14向下捨入至80.1，而將80.15、80.16、80.17、80.18及80.19向上捨入至80.2。亦注意，長度值將始終為整數。
在某些實施例中，將第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之一致性百分比「X」計算為100 x(Y/Z)，其中Y為第一序列及第二序列之比對(如藉由目測檢查或特定序列比對程式來比對)中評分為一致匹配的胺基酸殘基數且Z為第二序列之殘基總數。若第一序列之長度比第二序列長，則第一序列與第二序列之一致性百分比將高於第二序列與第一序列之一致性百分比。
熟習此項技術者將理解，產生用於計算序列一致性百分比的序列比對不限於唯一地由原始序列資料驅動之二進制序列-序列比較。序列比對可來源於多重序列比對。用以產生多重序列比對的一個適合程式為ClustalW2，其獲自www.clustal.org(ClustalX為ClustalW2程式埠接至Windows環境之版本)。另一適合程式為MUSCLE，其獲自www.drive5.com/muscle。 ClustalW2及MUSCLE可替代地獲自例如EBI。
亦應理解，序列比對可藉由序列資料與異質來源之資料的整合產生，該等異質來源之資料諸如結構資料(例如結晶蛋白結構)、功能資料(例如突變位置)或譜系學資料。整合異質資料以產生多重序列比對的適合程式為T-Coffee，其獲自www.tcoffee.org且可替代地獲自例如EBI。亦應理解，用於計算序列一致性百分比之最終比對可自動地或人工地加以驗證。
在一個實施例中，本發明之抗體及其抗原結合分子以及嵌合分子可包含來源於人類蛋白質序列之胺基酸序列。然而，本發明之抗體及其抗原結合分子以及嵌合分子可包含一或多個來自其他哺乳動物物種之胺基酸序列。在特定實施例中，本發明之抗體及其抗原結合分子以及嵌合分子不為免疫性的。
如本文所用之術語「經聯結」、「經融合」或「融合」係指經由肽鍵(例如基因融合)、化學接合或此項技術已知的其他方式的鍵聯。舉例而言，可將分子或部分加以聯結的一種方式採用肽連接子，其經由肽鍵將分子或部分連接。術語「經基因融合」、「經基因聯結」或「基因融合」可互換使用，且係指兩個或兩個以上蛋白質、多肽或其片段經由其個別肽主鏈、經由編碼該等蛋白質、多肽或片段之單一多核苷酸分子之基因表現的共線、共價鍵聯或連接。此基因融合導致單一鄰接基因序列之表現。
較佳基因融合為同框(in frame)融合，亦即以維持原始開放閱讀框架(ORF)之正確閱讀框架的方式融合兩個或兩個以上ORF以形成連續較長ORF。因此，所得重組融合蛋白為含有兩個或兩個以上蛋白質片段的單一多肽，該等片段對應於由原始ORF編碼的多肽(該等片段本質上在正常情況下並非如此連結)。在此狀況下，單一多肽於加工期間裂解，產生包含兩條多肽鏈之二聚分子。
如本文所用之術語「與...締合」係指第一條胺基酸鏈與第二條胺基酸鏈之間形成的共價鍵或非共價鍵。在一個實施例中，術語「與...締合」意謂共價非肽鍵或非共價鍵。在另一實施例中，術語「與...締合」係指非化學交聯的共價非肽鍵或非共價鍵。在另一實施例中，其意謂除肽鍵之外的共價鍵。在一些實施例中，該締合由冒號亦即(：)來指示。舉例而言，當表示FVII之結構時，「FVIIH：FVIIL」係指在N-端至C-端定向上包含FVIIH之重鏈與FVIIL之輕鏈雙硫鍵鍵合的二聚體。
共價鍵之實例包括但不限於肽鍵、金屬鍵、氫鍵、雙硫鍵、σ鍵、π鍵、δ鍵、醣苷鍵、抓氫鍵(agnostic bond)、彎鍵、偶極鍵、π背鍵(Pi backbond)、雙鍵、三鍵、四鍵、五鍵、六鍵、共軛、超共軛、芳族性、哈普托數(hapticity)或反鍵合。非共價鍵之非限制性實例包括離子鍵(例如陽離子π鍵或鹽鍵)、金屬鍵、氫鍵(例如二氫鍵、二氫複合物、低障壁氫鍵或對稱氫鍵)、凡得瓦力(van der Walls force)、倫敦分散力(London dispersion force)、機械鍵(mechanical bond)、鹵素鍵、親金作用(aurophilicity)、嵌入、堆積作用、熵力(entropic force)或化學極性。
如本文所用之術語「化學交聯」及「接合」可互換使用且係指由胺基酸之酸側鏈之間的共價鍵直接或經由例如肽連接子之連接子來化學聯結。化學交聯不包括二聚Fc區之Fc部分之間的分子內或分子間雙硫鍵、或活化凝結因子之胺基酸與增強子部分之胺基酸之間的未經工程化之雙硫鍵。化學交聯通常藉由添加例如異雙官能交聯劑之交聯劑而發生。化學交聯之實例包括一或多個藉由化學連接光-Ile、光-Met及光-Leu的光活性鍵(參見Suchanek等人，(2005)Nature Methods,2：261-267)。
術語「抗體」意謂經由免疫球蛋白分子可變區內之至少一個抗原識別位點來識別且特異地結合至標靶的免疫球蛋白分子，該等標靶諸如蛋白質(例如GPIIb/IIIa受體、其子單元或受體複合物)、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或前述者之組合。
典型抗體包含由雙硫鍵互連的至少兩條重(HC)鏈及兩條輕(LC)鏈。各重鏈由「重鏈可變區」或「重鏈可變域」(本文縮寫為VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個域CH1、CH2及CH3組成。各輕鏈由「輕鏈可變區」或「輕鏈可變域」(本文縮寫為VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個域Cl組成。可將VH及VL區進一步細分成稱作互補決定區(CDR)之超變區，其中散佈有稱 作框架區(FW)之更保守區。
各VH及VL區由按以下次序自胺基端至羧基端排列的三個CDR及四個FW組成：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重鏈及輕鏈可變區含有與抗原相互作用之結合域。如本文所用之術語「抗體」涵蓋完整多株抗體、完整單株抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、單鏈Fv(scFv)、微型抗體、多特異性抗體(諸如產生自至少兩個完整抗體之雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、包含抗體之抗原決定部分之融合蛋白及包含抗原識別位點之任何其他經修飾免疫球蛋白分子，只要該等抗體顯示所要生物活性即可。因此，術語「抗體」包括全體抗體及其任何抗原結合片段或單鏈。抗體可為裸露的或接合至諸如毒素、放射性同位素等的其他分子。
存在至少兩種用於判定CDR位置之技術：(1)基於交叉物種序列可變性之方法(亦即Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。此外，在此項技術中有時使用此等兩種方法的組合來判定CDR。
如Kabat中之胺基酸位置編號係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda,Md.(1991)中用於編輯抗體的重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有較少或其他胺基酸，其對應於可變域之FW或CDR之縮短或對其進行的插入。舉例而言，重鏈可變域可包括H2之殘基52之後的單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及重鏈FW殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。
可藉由將抗體序列中具有同源性之區與「標準」Kabat編號序列比對來判定給定抗體中殘基之Kabat編號。Chothia替代地提及結構化環(structural loop)之位置(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。當使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-H1環之末端視環之長度而在H32與H34之間變化(此係由於Kabat編號方案將插入置放於H35A及H35B處；若35A或35B不存在，則環結束於32處；若僅35A存在，則環結束於33處；若35A及35B均存在，則環結束於34處)。AbM超變區表示Kabat CDR與Chothia結構化環之間的折衷，且係藉由Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體來使用。
IMGT(ImMunoGeneTics)亦提供一種用於免疫球蛋白可變區(包括CDR)之編號系統。參見例如Lefranc,M.P.等人，Dev.Comp.Immunol.27：55-77(2003)。IMGT編號系統係基於大於5,000個序列之比對、結構資料及超變環之特徵且使得易於比較所有物種之可變區及CDR區。根據IMGT編號系統，VH-CDR1位於位置26至35 處，VH-CDR2位於位置51至57處，VH-CDR3位於位置93至102處，VL-CDR1位於位置27至32處，VL-CDR2位於位置50至52處且VL-CDR3位於位置89至97處。
如本說明書通篇所使用，本文所述之VH CDR序列對應於經典Kabat編號位置，即Kabat VH-CDR1位於位置31-35處，VH-CDR2位於位置50-65處，且VH-CDR3位於位置95-102處。VL-CDR1、VL-CDR2及VL-CDR3亦對應於經典Kabat編號位置，即分別為位置14-24、50-56及89-97。
如本文關於輕鏈(VL)可變區或重鏈(VH)可變區之CDR所用之術語「一致序列」係指基於關於根據多重序列比對存在於給定位置處的胺基酸殘基之資訊所定義之複合或通用胺基酸序列。因此，在VL或VH鏈CDR1、CDR2或CDR3之「一致序列」中，某些胺基酸位置由位於該位置處的多種可能胺基酸殘基之一佔據。舉例而言，若精胺酸(R)或絲胺酸(S)出現於特定位置X處，則一致序列內之該特定位置可為精胺酸或絲胺酸(R或S)。可將此出現情況表示為例如N-Z1Z2XnZt-1Zt-C，其中Z1>t為多重序列比對中不變的胺基酸，X表示由可變胺基酸(例如R或S)佔據之位置，且子指數n為序數。如本文所使用，多肽序列提及為由一致序列組成或包含一致序列意謂該多肽序列由一致序列所表示的多種可能胺基酸序列之一組成或包含該等胺基酸序列之一。
術語「抗原結合片段」係指完整抗體之一部 分且係指完整抗體之抗原決定可變區。此項技術中已知的是，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「Fab」係指基本上等效於用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(通常為IgG)所獲得片段的抗體片段。Fab片段之重鏈區段為Fd段。此等片段可藉由完整抗體之分裂以酶促方式或化學方式產生、自編碼部分抗體序列之基因以重組方式產生，或其可整體地或部分地以合成方式產生。
術語「Fab」係指基本上等效於藉由減少連結F(ab')2片段中兩條重鏈段的一或多個雙硫鍵所獲得片段的抗體片段。此等片段可藉由完整抗體之分裂以酶促方式或化學方式產生、自編碼部分抗體序列之基因以重組方式產生，或其可整體地或部分地以合成方式產生。
術語「F(ab')2」係指基本上等效於用胃蛋白酶在pH 4.0-4.5下消化免疫球蛋白(通常為IgG)所獲得片段的抗體片段。此等片段可藉由完整抗體之分裂以酶促方式或化學方式產生、自編碼部分抗體序列之基因以重組方式產生，或其可整體地或部分地以合成方式產生。
術語「Fv」係指由經非共價相互作用保持在一起的一個NH及一個N域組成之抗體片段。
術語「單株抗體」係指涉及單一抗原決定子 或抗原決定基之高特異性識別及結合的同源抗體種群。此與通常包括針對不同抗原決定子之不同抗體的多株抗體形成對比。術語「單株抗體」涵蓋完整及全長單株抗體以及抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2或Fv)、單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分之融合蛋白及包含抗原識別位點之任何其他經修飾免疫球蛋白分子。此外，「單株抗體」係指以各種任何方式得到的此等抗體，該等方式包括但不限於融合瘤、噬菌體選擇、重組表現及基因轉殖動物。
術語「人類抗體」係指由人類產生之抗體或具有對應於由人類使用此項技術中已知的任何技術所產生的抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義包括完整或全長抗體、其片段及/或包含至少一個人類重鏈及/或輕鏈多肽之抗體，諸如例如包含鼠輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。術語「人源化抗體」係指來源於非人類(例如鼠)免疫球蛋白之抗體，其已工程化來含有最小限度的非人類(例如鼠)序列。術語「嵌合抗體」係指免疫球蛋白之胺基酸序列來源於兩個或兩個以上物種之抗體。通常，輕鏈及重鏈之可變區對應於來源於一個哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所要特異性、親和力及能力的抗體之可變區，而恆定區與來源於另一物種(通常為人類)之抗體中之序列同源，以便避免於該物種中引出免疫反應。
在一個實施例中，本發明之抗GPIIb/IIIa抗體包含抗體變異體。術語「抗體變異體」或「經修飾抗體」包括自然界中不存在且其具有的胺基酸序列或胺基酸 側鏈化學結構與天然來源抗體之胺基酸序列或胺基酸側鏈化學結構相差如本文所述的至少一個胺基酸或胺基酸修飾之抗體。如本文所用之術語「抗體變異體」包括抗體之合成形式，其經改變以使得其不為天然存在的，例如，包含至少兩個重鏈部分但不為兩條完整重鏈之抗體(諸如域缺失抗體或微型抗體)；經改變以結合至兩個或兩個以上不同抗原或單一抗原上之不同抗原決定基的抗體之多特異性形式(例如雙特異性、三特異性等)；連結至scFv分子之重鏈分子；單鏈抗體；雙功能抗體；及具有經改變之效應物功能及類似功能之抗體。
如本文所用之術語「scFv」或「scFv分子」包括結合分子，其由一個輕鏈可變域(VL)或其部分及一個重鏈可變域(VH)或其部分組成，其中各可變區(或其部分)來源於相同或不同抗體。單鏈Fv分子較佳包含插入VH域與VL域之間的scFv連接子。在一個實施例中，scFv包含(N-端)VH-可選scFv連接子-VL(C-端)。在另一實施例中，scFv包含(N-端)VL-可選scFv連接子-VH(C-端)。示範性scFv分子為此項技術中為已知的且描述於例如美國專利第5,892,019號；Ho等人，Gene 77：51(1989)；Bird等人，Science 242：423(1988)；Pantoliano等人，Biochemistry 30：10117(1991)；Milenic等人，Cancer Research 51：6363(1991)；Takkinen等人，Protein Engineering 4：837(1991)中。
如本文所用之術語「scFv連接子」係指插入 scFv之VL域與VH域之間的部分。scFv連接子較佳使scFv分子維持抗原結合構形。在一個實施例中，scFv連接子包含scFv連接子肽或由其組成。在某些實施例中，scFv連接子肽包含gly-ser肽連接子或由其組成。在其他實施例中，scFv連接子包含雙硫鍵。
如本文所用之術語「抗原結合分子」係指包含抗GPIIb/IIIa抗體片段、其變異體或衍生物之分子，其包含來自本文所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體中一或多者之至少一個CDR。在一些實施例中，抗原結合分子為蛋白質。在其他實施例中，抗原結合分子為蛋白支架(protein scaffold)(例如纖網蛋白III型域)，或非蛋白支架，其包含來自本文所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體之一的至少一個CDR。在一些實施例中，抗原結合分子為根據本文所揭示的方法識別之抗GPIIb/IIIa抗體，其包含與本文所揭示的CDR序列之一一致的至少一個CDR。術語「抗原結合分子」亦涵蓋包含來自本文所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體中一或多者之VH區及/或VL區的任何分子。
術語「多核苷酸」或「核苷酸」意欲涵蓋單數個核苷酸以及複數個核苷酸且係指經分離之核苷酸分子或構築體，例如傳訊RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA)。在某些實施例中，多核苷酸包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現的醯胺鍵)。
術語「核酸」係指多核苷酸中存在的任何一或多個核酸片段，例如DNA或RNA片段。「經分離之」 核酸或多核苷酸意指已自其天然環境移除之核酸分子，DNA或RNA。經分離之多核苷酸之實例包括維持在異源性寄主細胞中或以溶液形式自其他多核苷酸純化(部分純化或實質上純化)之重組多核苷酸。經分離之RNA分子包括本發明之多核苷酸之活體內或活體外RNA轉錄本。根據本發明之經分離之多核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此等分子。此外，多核苷酸或核酸可包括調節元件，諸如啟動子、增強子、核糖體結合位點或轉錄終止訊號。
如本文所用之「編碼區」或「編碼序列」為由可轉譯成胺基酸之密碼子組成的多核苷酸之一部分。儘管通常不將「終止密碼子」(tag、tga或taa)轉譯成胺基酸，但可將其視為編碼區之部分，然而任何側接序列(flanking sequence)，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及類似者皆不為編碼區之部分。編碼區之邊界通常藉由位於5’端處編碼所得多肽之胺基端的起始密碼子及位於3’端處編碼所得多肽之羧基端的轉譯終止密碼子決定。
本發明之兩個或兩個以上編碼區可存在於例如單個載體上之單個多核苷酸構築體中，或存在於例如獨立(不同)載體上之獨立多核苷酸構築體中。隨即，單個載體可只含有單個編碼區，或包含兩個或兩個以上編碼區，例如單個載體可獨立地編碼如下文所述之結合域A及結合域B。此外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼融合 或未融合至編碼本發明結合域之核酸的異源性編碼區。異源性編碼區包括但不限於特殊元件或基序，諸如分泌訊號肽或異源性功能域。
本文所用之術語「載體」或「表現載體」意謂根據本發明用作用於引入細胞中且在該細胞中表現所要多核苷酸之媒介物的載體。如一般技藝人士所已知，此等載體可易於選自由質體、噬菌體、病毒及反轉錄病毒組成之群。一般而言，與本發明相容之載體將包含選擇標記、適當限制位點，以便有助於對所要基因之選殖及進入真核細胞或原核細胞中及/或在其中進行複製之能力。
可採用許多表現載體系統來產生本發明之抗體、其抗原結合分子或嵌合分子。舉例而言，一類載體利用DNA元件，其來源於動物病毒，諸如牛乳突瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。此外，將DNA整合至其染色體中之細胞可藉由引入一或多個標記進行選擇，該等標記允許對經轉染寄主細胞之選擇。標記可為營養缺陷型寄主提供原養、除生物劑抗性(例如抗生素)或對諸如銅之重金屬的抗性。可將選擇標記基因直接聯結至欲表現之DNA序列或藉由共轉形引入同一細胞中。在一個實施例中，可採用可誘導表現系統。mRNA之最佳合成亦可需要其他元件。此等元件可包括訊號序列、剪接訊號以及轉錄啟動子、增強子及終止訊號。在一個實施例中，分泌訊號，例如若干良好表徵的細菌前導肽(例如pelB、 phoA或ompA)中之任一者可同框融合至本發明多肽之N端以獲得多肽之最佳分泌。(Lei等人(1988),Nature,331：543；Better等人(1988)Science,240：1041；Mullinax等人，(1990).PNAS,87：8095)。
一旦生長中之蛋白質鏈跨粗糙內質網之輸出已起始時，哺乳動物細胞所分泌的某些蛋白質即與自成熟蛋白質裂解之分泌訊號肽締合。一般技藝人士應明白，訊號肽通常係融合至多肽之N端，且自完整或「全長」多肽裂解以產生多肽之經分泌或「成熟」形式。在某些實施例中，使用天然訊號序列，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈訊號肽，或使用該序列之功能性衍生物，其保留引導可與其可操作地締合的多肽之分泌的能力。或者，可使用異源性哺乳動物訊號肽，例如人類組織纖維蛋白溶酶原活化物(TPA)或小鼠β-葡萄醣醛酸酶訊號肽，或其功能性衍生物。
「重組」多肽或蛋白質係指經由重組DNA技術產生之多肽或蛋白質。出於本發明之目的，在寄主細胞中表現的重組產生之多肽及蛋白質視為分離的，已藉由任何適合技術分離、分餾或部分地或實質上純化之天然或重組多肽亦視為分離的。
術語「寄主細胞」係指已用載體轉形之細胞，該載體係使用DNA重組技術構建並編碼至少一個異源性基因。除非另外清楚地指明，否則在用於自重組寄主分離蛋白質之方法的描述中，術語「細胞」及「細胞培養物」可互換使用以指示蛋白質之來源。換言之，自「細 胞」回收蛋白質可意謂自離心分離之完整細胞或自含有培養基及懸浮細胞之細胞培養物中回收。用於蛋白質表現之寄主細胞株最佳為哺乳動物起源；咸信熟習此項技術者有能力優先判定最適於在其中表現所要基因產物之特定寄主細胞株。示範性寄主細胞株包括但不限於CHO細胞株、BHK細胞株、HEK細胞株、DG44及DUXB11(中國倉鼠卵巢細胞株，DHFR-)、HELA(人類子宮頸癌)、CVI(猴腎細胞株)、COS(CVI與SV40 T抗原之衍生物)、R1610(中國倉鼠成纖維細胞)、BALBC/3T3(小鼠成纖維細胞)、PerC6細胞)、HAK(倉鼠腎細胞株)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛內皮細胞)及RAJI(人類淋巴細胞)。寄主細胞株通常可自商業服務、美國組織培養收藏中心(American Tissue Culture Collection)或自公開文獻得到。
II. 嵌合FVII分子
II.A. 包含抗GPIIb/IIIa抗體及XTEN之嵌合分子
本發明提供一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及特異地結合至位於血小板表面上之GPIIb/IIIa受體的抗GPIIb/IIIa抗體及其抗原結合分子。嵌合分子經構建以延長FVII之循環半衰期且提高對活化血小板之結合親和力，由此降低給藥頻率。因此，本發明之嵌合分子為半衰期延長與活性改良相結合的FVII變異體之長效及更有效形式。為延長循環半衰期，將rFVIIa融合至XTEN多肽，其為增大酬載蛋白質之流體動力學半 徑的親水性及未結構化的多肽。此外，凝血活性係藉由用以高親和力結合至血小板受體αIIβ3之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子將rFVIIa靶向血小板來增強。
嵌合分子可包含呈任何次序的FVII、XTEN多肽或如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。在一個實施例中，嵌合分子自N端至C端包含FVII、XTEN多肽及如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。在另一實施例中，嵌合分子自N端至C端包含FVII、如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子及XTEN多肽。在其他實施例中，嵌合分子自N端至C端包含XTEN多肽、FVII及如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。在其他實施例中，嵌合分子自N端至C端包含如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子、FVII及XTEN多肽。在其他實施例中，嵌合分子自N端至C端包含XTEN多肽、如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子及FVII。在一些實施例中，嵌合分子自N端至C端包含如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子、XTEN多肽及FVII。
在某些實施例中，嵌合分子包含選自由以下組成之群的式：(a)FVII-(L1)-X-(L2)-Tm；(b)FVII-(L1)-Tm-(L2)-X；(c)Tm-(L1)-X-(L2)-FVII；(d)Tm-(L1)-FVII-(L2)-X；(e)X-(L1)-Tm-(L2)-FVII；及(f)X-(L1)-FVII- (L2)-Tm；其中FVII包含FVIIa；X為XTEN多肽；Tm為如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；L1為第一可選連接子，及L2為第二可選連接子。在一些實施例中，嵌合分子為單個多肽鏈或包含第一多肽鏈及第二多肽鏈之兩條多肽鏈。
在一個實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及XTEN多肽，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈及如第II.A.1部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。在另一實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及如第II.A.1部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈及XTEN多肽。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含呈任何次序的FVII之輕鏈、XTEN多肽及如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈，且第二多肽鏈包含呈任何次序的FVII之重鏈、XTEN多肽及如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。
在某些實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL- X或X-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm或Tm-FVIIH。在一些實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL-Tm或Tm-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-X或X-FVIIH。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL-Tm-X或X-Tm-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL-X-Tm或Tm-X-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH。將嵌合分子之各組分表述如下：FVIIH為FVII之重鏈；Tm為如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；FVIIL為FVII之輕鏈；及X為XTEN多肽。
在一些實施例中，嵌合分子包含式X-FVIIL：FVIIH-Tm、X-FVIIL：Tm-FVIIH、FVIIL-X：FVIIH-Tm、FVIIL-X：Tm-FVIIH、Tm-FVIIH：X-FVIIL、Tm-FVIIH：FVIIL-X、FVIIH-Tm：FVIIL-X或FVIIH-Tm：X-FVIIL，其中FVIIH為FVII之重鏈；Tm為如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；FVIIL 為FVII之輕鏈；X為XTEN多肽；且(：)為兩條多肽鏈之間的締合。在其他實施例中，嵌合分子包含式FVIIL：FVIIH-X-Tm；Tm-X-FVIIH：FVIIL；FVIIL：FVIIH-Tm-X；或X-Tm-FVIIH：FVIIL，其中FVIIH為FVII之重鏈；Tm為如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；FVIIL為FVII之輕鏈；X為XTEN多肽；且(：)為兩條多肽鏈之間的締合。
在一些實施例中，第一多肽鏈及第二多肽鏈經由例如共價鍵或非共價鍵來締合。在其他實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈之間的締合為凝結因子之重鏈與輕鏈之間的共價鍵。在特定實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈之間的締合為雙硫鍵。
本發明之嵌合分子可藉由編碼單個多肽鏈之單個多核苷酸鏈或編碼兩條或兩條以上多肽鏈之兩條或兩條以上多核苷酸鏈來產生。在一個實施例中，可將單個核苷酸鏈編碼之單個多肽鏈加工成兩條或兩條以上多肽鏈。在另一實施例中，嵌合分子包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含FVII之輕鏈、XTEN多肽、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。在另一實施例中，嵌合分子包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含FVII之輕鏈、如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及XTEN多肽。在其他實施例中，嵌合分子包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含 FVII之輕鏈、可選蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈、XTEN多肽及如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。在其他實施例中，嵌合分子包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含FVII之輕鏈、可選蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈、如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子及XTEN多肽。在其他實施例中，嵌合分子包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含FVII之輕鏈、XTEN多肽、如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子、可選蛋白酶裂解位點及FVII之重鏈。在一些實施例中，嵌合分子包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含FVII之輕鏈、如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子、XTEN多肽、可選蛋白酶裂解位點及FVII之重鏈。在其他實施例中，蛋白酶裂解位點為細胞內加工位點。細胞內加工位點可由任何蛋白酶來加工，該蛋白酶例如前蛋白轉化酶，例如PC5、PACE、PC7及其任何組合。
在一些實施例中，嵌合分子包含與由SEQ ID NO：192或SEQ ID NO：193編碼之胺基酸序列至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在特定實施例中，嵌合分子包含由SEQ ID NO：192或SEQ ID NO：193編碼之胺基酸序列。
II.A.1 抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子
術語「GPIIb/IIIa抗體」、「抗GPIIb/IIIa抗體」、「抗GPIIb/IIIa」、「結合至GPIIb/IIIa之抗體」 及其任何語法變化形式係指能夠特異地結合至GPIIb/IIIa受體之抗體，其親和力足以使得該抗體適於用作靶向GPIIb/IIIa之治療劑或診斷劑之部分。如藉由例如放射免疫分析(RIA)、BIACORETM(重組GPIIb/IIIa用作分析物且抗體用作配位體，或反之亦然)或此項技術中已知之其他結合分析所量測，本文所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體與無關非GPIIb/IIIa蛋白質之結合程度小於抗體與GPIIb/IIIa之結合約10%。在某些實施例中，結合至GPIIb/IIIa之抗體具有1μM、100nM、50nM、10nM、1nM、0.1nM、10pM、1pM或0.1pM之離解常數(KD)。
如本文所用之術語「GPIIb/IIIa」及「GPIIb/IIIa受體」係指醣蛋白IIb/IIIa(亦稱為整聯蛋白αIIbβ3)，其為在血小板上發現的整聯蛋白複合物。整聯蛋白由兩條鏈即α子單元及β子單元組成，其以鈣依賴方式由非共價鍵保持在一起。GPIIb構成α子單元，其包含二價陽離子結合域，而GPIIIa為pro典型β子單元(β3)。在各循環血小板上存在35,000至100,000種GPIIb/IIIa複合物；大部分分佈在血小板表面上，而少數彙集在內部儲體(internal reserve)中。GPIIb/IIIa複合物不與其血漿配位體相互作用，直至血小板已由諸如ADP或凝血酶之外源性促效劑活化。當此情況發生時，產生自內而外之訊號，其導致複合物之細胞外部分的構形改變，從而使得分子能夠結合血纖維蛋白原及其他配位體。參見如通用蛋白質資源(Universal Protein Resource)(Uniprot)資料庫發行版 2013_05(2013年5月1日)中所公開之Uniprot條目P05106(ITB3_HUMAN；GPIIIa：CD61；整聯蛋白β-3；整聯蛋白β3)及P08514(ITA2B_HUMAN；GPIIb；CD41；整聯蛋白α-2b；整聯蛋白αII)，其以全文引用之方式併入本文中。
本發明之嵌合分子可包含FVII、XTEN多肽及特異地結合至GPIIb/IIIa抗原決定基之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗原決定基包含選自由以下組成之群的抗體之GPIIb/IIIa結合抗原決定基或與其重疊：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4(參見表3)。在一個實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及特異地結合至GPIIb/IIIa抗原決定基之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗原決定基為選自由以下組成之群的抗體之相同GPIIb/IIIa結合抗原決定基：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4(參見表3)。如本文所用之術語「抗原決定基」表示由抗體特異地識別的特定胺基酸序列、經修飾之胺基酸序列或蛋白質二級或三級結構。術語「特異地識別」及任何語法變體意謂抗體或其抗原結合分子能夠與抗原決定基(例如GPIIb/IIIa抗原決定基)之至少兩個、至少三個或至少四個胺基酸特異地相互作用或結合。此結合可藉由「鎖鑰原 理」之特異性來例證。因此，GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子之抗原結合域的胺基酸序列中之特定基序與抗原決定基彼此結合，該結合係由於該等基序之一級、二級或三級結構以及該結構之二次修飾之結果。
在另一實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子競爭地抑制GPIIb/IIIa結合至選自以下組成之群的抗體：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4(參見表1)。在其他實施例中，特異地結合至GPIIb/IIIa抗原決定基之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含選自由以下一或多者組成之群的抗體之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或至少五個互補決定區(CDR)或其變異體：表1中所揭示的34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4抗體。在其他實施例中，特異地結合至GPIIb/IIIa抗原決定基之抗體或其抗原結合分子包含選自由以下一或多者組成之群的抗體之六個CDR或其變異體：本文所揭示的34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4。在一些實施例中，CDR係獨立地選自來源於一個、兩個、三個、四個或六個抗體之VN區及/或VL 區之CDR或其變異體，該等抗體選自由以下組成之群：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4。
在某些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR1至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR2至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4：(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR3至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR1至少約60%、70%、 80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR2至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4，及/或(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR3至少約60%、70%、80%、90%或95%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4。
在某些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR1至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR2至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、 35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；及(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR3至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4。
在其他實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR1至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；(ii)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR2至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4，及(iii)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR3至少約60%、70%、80%、90%或95%一致：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、 4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR1至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8及18F7；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR2至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8及18F7；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR3至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8及18F7；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR1至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8及18F7；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR2至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：34D10、2A2、35D1、36A8、 4B11、1H6、38G8、21F10、38A8及18F7，及/或(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR3至少約60%、70%、80%、90%或95%一致：34D10、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8及18F7。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR1至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：12B2、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4：(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR2至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：12B2、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VH-CDR3至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：12B2、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR1至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：12B2、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4； (v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR2至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致：12B2、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4，及/或(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與選自由以下組成之群的抗體之VL-CDR3至少約60%、70%、80%、90%或95%一致：12B2、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：25、31、37、43或111中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：26、32、38、44或112中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：27、33、39、45或113中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：28、34、40、117或114中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：29、35、41、118或115中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：30、36、42、119或116中之任一者至少約60%、70%、80%、90%或95%一致。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1，其包含一致序列X1YAMS，其中X1表示任何胺基酸殘基，例如具有不帶電極性側鏈或非極性側鏈之胺基酸殘基，例如Thr(T)、Ser(S)或Ala(A)；(ii)VH-CDR2，其包含一致序列SIX2X3GX4X5TYX6X7DSVKX8，其中X2表示任何胺基酸殘基，例如具有不帶電極性側鏈之胺基酸殘基，例如Ser(S)或Asn(N)，X3表示任何胺基酸殘基，例如具有不帶電極性側鏈之胺基酸殘基，例如Ser(S)或Gly(G)，X4表示任何胺基酸殘基，例如具有不帶電極性側鏈之胺基酸殘基，例如Ser(S)或Gly(G)，X5表示任何胺基酸殘基，例如具有不帶電極性側鏈之胺基酸殘基，例如Ser(S)、Asn(N)或Thr(T)，X6表示任何胺基酸殘基，例如具有芳族側鏈之胺基酸殘基，例如Tyr(Y)或Phe(F)，X7表示任何胺基酸殘基，例如具有非極性側鏈之胺基酸殘基，例如Leu(L)或Pro(P)，且X8表示任何胺基酸殘基，例如具有鹼性側鏈或不帶電極性側鏈之胺基酸殘基，例如Gly(G)或Arg(R)。
(iii)VH-CDR3，其包含一致序列GGDYGYAX9DY，其中X9表示任何胺基酸殘基，例如具有非極性側鏈之胺基酸殘基，例如Leu(L)或Met(M)；(iv)VL-CDR1，其包含序列RASSSVNYMY(SEQ ID NO：28)；(v)VL-CDR2，其包含序列YTSNLAP(SEQ ID NO：29)；及，(vi)VL-CDR3，其包含序列QQFSSSPWT(SEQ ID NO：30)。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：25、31、37、43及111組成之群；(ii)VH-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：26、32、38、44及112組成之群；(iii)VH-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：27、33、39、45及113組成之群；(iv)VL-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：28、34、40、117及114組成之群；(v)VL-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：29、35、41、118及115組成之群；及，(vi)VL-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：30、36、42、119及116組成之群。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含與SEQ ID NO：1、3、5、7或97中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL區，其包含與SEQ ID NO：2、4、6、99或98中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。在其他實施例中，抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列。在某一實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之α子單元之細胞外域中的GPIIb/IIIa抗原決定基或結合至由GPIIb/IIIa複合物之細胞外域形成之結合位點。在一些實施例中，GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子不與血纖維蛋白原競爭結合至 GPIIb/IIIa。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：46、52、120或126中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：47、53、121或127中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：48、54、122或128中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：49、55、123或129中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：50、56、124或130中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：51、57、125或131中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或 其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1，其包含序列NYLIE(SEQ ID NO：46)；(ii)VH-CDR2，其包含序列VINPGSGGTNYNEKFKG(SEQ ID NO：47)；(iii)VH-CDR3，其包含序列GRYEWYFDV(SEQ ID NO：48)；(iv)VL-CDR1，其包含一致序列RASQDIX10NYLN，其中X10表示任何胺基酸殘基，例如具有不帶電極性側鏈之胺基酸殘基，例如Ser(S)或Thr(T)；(v)VL-CDR2，其包含序列YTSRLHS(SEQ ID NO：50)；及，(vi)VL-CDR3，其包含序列QQGYTLPYT(SEQ ID NO：51)。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：46、52、120及126組成之群；(ii)VH-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：47、53、121及127組成之群；(iii)VH-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：48、54、122及128組成之群；(iv)VL-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：49、55、123及129組成之群； (v)VL-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：50、56、124及130組成之群；及，(vi)VL-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：51、57、125及131組成之群。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含與SEQ ID NO：8、10、100或102中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL區，其包含與SEQ ID NO：9、11、101或103中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列。在一些實施例中， 嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之α子單元之細胞外域中的GPIIb/IIIa抗原決定基或結合至由GPIIb/IIIa複合物之細胞外域形成之結合位點。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：58至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：59至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：60至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：61至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致； (v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：62至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：63至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1序列，其包含SEQ ID NO：58；(ii)VH-CDR2序列，其包含SEQ ID NO：59；(iii)VH-CDR3序列，其包含SEQ ID NO：60；(iv)VL-CDR1序列，其包含SEQ ID NO：61；(v)VL-CDR2序列，其包含SEQ ID NO：62；及，(vi)VL-CDR3序列，其包含SEQ ID NO：63。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含與SEQ ID NO：12至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL區，其包含與SEQ ID NO：13至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在其他實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO： 12之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子之抗原決定基係位於GPIIb/IIIa之α子單元之細胞外域中。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：64、70或135中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：65、71或136中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：66、72或137中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：67、132或138中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：68、133或139中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：69、134或140中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在其他實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1，其包含序列SYWIE(SEQ ID NO：64)；(ii)VH-CDR2，其包含一致序列EILPGX14GX15TKYNX16KFKG(SEQ ID NO：__)，其中X14表示任何胺基酸，例如具有不帶電極性側鏈之胺基酸殘基，例如Ser(S)或Thr(T)，X15表示任何胺基酸，例如具有不帶電極性側鏈或β-分支側鏈之胺基酸殘基，例如Ile(I)或Tyr(Y)，且X16表示任何胺基酸，例如具有酸性側鏈之胺基酸殘基，例如Asp(D)或Glu(E)；(iii)VH-CDR3，其包含序列LISYYYAMDY(SEQ ID NO：66)；(iv)VL-CDR1，其包含序列RASQDISNYLN(SEQ ID NO：67)；(v)VL-CDR2，其包含序列YTSRLHS(SEQ ID NO：68)；及，(vi)VL-CDR3其包含序列QQGNTLPPT(SEQ ID NO：69)。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：64、70及135組成之群；(ii)VH-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：65、71及136組成之群； (iii)VH-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：66、72及137組成之群；(iv)VL-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：67、132及138組成之群；(v)VL-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：68、133及139組成之群；及，(vi)VL-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：69、134及140組成之群。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含與SEQ ID NO：14、16或105中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL區，其包含與SEQ ID NO：15、104或106中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結 合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之β子單元之細胞外域中的GPIIb/IIIa抗原決定基。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子不與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：73、76、79、85或147中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：74、77、80、86或148中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：75、78、81、87或149中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：141、144、82、88或150中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：142、145、83、89或151中之任一者至少約60%、 70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變的輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：143、146、84、90或152中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1，其包含一致序列TSGX11GVG，其中X11表示任何胺基酸殘基，例如具有非極性側鏈之胺基酸殘基，例如Met(M)或Leu(L)；(ii)VH-CDR2，其包含一致序列HIWWDDDKRYNPX12LKS，其中X12表示任何胺基酸殘基，例如具有非極性側鏈或β-分支側鏈之胺基酸，例如Ala(A)或Thr(T)；(iii)VH-CDR3，其包含一致序列SHYX13GTFYFDX14，其中X13表示任何胺基酸殘基，例如具有不帶電極性側鏈之胺基酸殘基，例如Tyr(Y)或Asn(N)，且X14表示任何胺基酸殘基，例如具有芳族側鏈之胺基酸殘基，例如Tyr(Y)或Phe(F)；(iv)VL-CDR1，其包含序列RASKSISKYLA(SEQ ID NO：82)；(v)VL-CDR2，其包含序列SGSTLQS(SEQ ID NO：83)；及，(vi)VL-CDR3，其包含序列QQHIEYPWT(SEQ ID NO：84)。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：73、76、79、85及147組成之群；(ii)VH-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：74、77、80、86及148組成之群；(iii)VH-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：75、78、81、87及149組成之群；(iv)VL-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：141、144、82、88及150組成之群；(v)VL-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：142、145、83、89及151組成之群；及，(vi)VL-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：143、146、84、90及152組成之群。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或抗原結合分子包含：VH區，其包含與SEQ ID NO：17、18、19、21或109中之任一者至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL區，其包含與SEQ ID NO：107、108、20、22或110中之任一者至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN 多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列。在其他實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，及VL區，其包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列。在其他實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。在其他實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或抗原結合分子包含：VH區，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；及VL區，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之β子單元之細胞外域中的GPIIb/IIIa抗原決定基。在其他實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN 多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：91至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：92至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：93至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：94至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：95至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：96至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1序列，其包含SEQ ID NO：91； (ii)VH-CDR2序列，其包含SEQ ID NO：92；(iii)VH-CDR3序列，其包含SEQ ID NO：93；(iv)VL-CDR1序列，其包含SEQ ID NO：94；(v)VL-CDR2序列，其包含SEQ ID NO：95；及，(vi)VL-CDR3序列，其包含SEQ ID NO：96。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中抗體或其抗原結合分子包含：VH區，其包含與SEQ ID NO：23至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL區，其包含與SEQ ID NO：24至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於其分子細胞外域中之GPIIb/IIIa抗原決定基，與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
在一些實施例中，抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含(a)單鏈Fv(「scFv」)；(b)雙功能抗體；(c)微型抗體；(d)抗體之多肽鏈；(e)F(ab’)2；或(f)F(ab)或由其組成。在某些實施例中，適合的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包括例如特異結合對、抗體、單株抗體或來源於本文所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體之衍生物或類似物中之任何成員，其包括但不限於：Fv片段、單鏈Fv(scFv)片段、Fab'片段、F(ab')2片段、單域抗體、駱駝化抗體(camelized antibody)及抗體片段、人源化抗體及抗體片段，及前述各者之多價型式；多價結合反應物包括但不 限於：單特異性或雙特異性抗體，諸如雙硫化穩定的Fv片段、scFv串聯((scFv)片段)、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體，其通常為經共價聯結或以其他方式穩定化(亦即白胺酸拉鍊或螺旋穩定化)的scFv片段。
II.B. 包含靶向部分及XTEN之嵌合分子
本發明亦提供一種嵌合分子，其包含FVII之輕鏈、FVII之重鏈、XTEN多肽及結合至血小板的靶向部分之組合。為提高凝結活性及改良藥物動力學性質，嵌合分子可含有半衰期延長部分，亦即XTEN多肽，及血小板靶向部分。
在一個實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及XTEN多肽，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈及結合至血小板之靶向部分。在另一實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及結合至血小板之靶向部分，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈及XTEN多肽。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈、XTEN多肽及結合至血小板之靶向部分。在一些實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含FVII之輕鏈，且第二多肽鏈包含FVII之重鏈、結合至血小板之靶向部分或XTEN多肽。
在某些實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL-Tm或Tm-FVIIL且第二多肽鏈包含FVIIH-X或X-FVIIH。在一些實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL-X或X-FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm或Tm-FVIIH。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽鏈包含式FVIIL且第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm-X或X-Tm-FVIIH。將嵌合分子之各組分表述如下：FVIIH為FVII之重鏈；Tm為結合至血小板之靶向部分；FVIIL為FVII之輕鏈；且X為XTEN多肽。
在其他實施例中，嵌合分子包含式X-FVIIL：FVIIH-Tm、X-FVIIL：Tm-FVIIH、FVIIL-X：FVIIH-Tm、FVIIL-X：Tm-FVIIH、Tm-FVIIH：X-FVIIL、Tm-FVIIH：FVIIL-X、FVIIH-Tm：FVIIL-X或FVIIH-Tm：X-FVIIL，其中FVIIH為FVII之重鏈；Tm為結合至血小板之靶向部分；FVIIL為FVII之輕鏈；X為XTEN多肽；且(：)為兩條多肽鏈之間的締合。在其他實施例中，嵌合分子包含式FVIIL：FVIIH-X-Tm；Tm-X-FVIIH：FVIIL；FVIIL：FVIIH-Tm-X；或X-Tm-FVIIH：FVIIL；其中FVIIH為FVII之重鏈；Tm為結合至血小板之靶向部分；FVIIL為 FVII之輕鏈；X為XTEN多肽；且(：)為兩條多肽鏈之間的締合。
在某些實施例中，嵌合分子之第一多肽鏈及第二多肽鏈彼此締合。第一多肽鏈與第二多肽鏈之間的締合可為共價鍵或非共價鍵。在一些實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈之間的締合為FVII之重鏈與輕鏈之間的共價鍵。在其他實施例中，第一多肽鏈與第二多肽鏈之間的締合為共價鍵，亦即雙硫鍵。
在一些態樣中，嵌合分子包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含，(a)FVII之輕鏈、XTEN多肽、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及結合至血小板之靶向部分；(b)FVII之輕鏈、結合至血小板之靶向部分、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及XTEN多肽；(c)FVII之輕鏈、可選蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈、XTEN多肽及結合至血小板之靶向部分；或(d)FVII之輕鏈、可選蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈、結合至血小板之靶向部分及XTEN多肽。在一個實施例中，蛋白酶裂解位點包含細胞內加工位點。在另一實施例中，細胞內加工位點可由前蛋白轉化酶加工，該前蛋白轉化酶例如PC5、PACE、PC7及其任何組合。
在一些實施例中，嵌合分子包含與SEQ ID NO：191或SEQ ID NO：192編碼之胺基酸序列至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，嵌合分子包含與SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：190編碼之胺基酸序列至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明之嵌合分子包含融合至具有72個胺基酸之XTEN多肽(例如AE72、AE72_2或AE72_3)之FVII輕鏈及融合至抗GPIIb/IIIa抗體(例如34D10)之scFv的FVII重鏈。在另一實施例中，本發明之嵌合分子包含融合至具有144個胺基酸之XTEN多肽(例如AE144、AE144_2、AE144_3或AG144)之FVII輕鏈及融合至抗GPIIb/IIIa抗體(例如34D10)之scFv的FVII重鏈。在其他實施例中，嵌合分子包含FVII輕鏈及FVII重鏈，其中FVII重鏈藉由具有72個胺基酸之XTEN多肽(例如AE72、AE72_2或AE72_3)融合至抗GPIIb/IIIa抗體(例如34D10)之scFv。在一些實施例中，嵌合分子包含FVII輕鏈及FVII重鏈，其中FVII重鏈藉由具有144個胺基酸之XTEN多肽(例如AE144、AE144_2、AE144_3或AG144)融合至抗GPIIb/IIIa抗體(例如34D10)之scFv。在某些實施例中，嵌合分子包含融合至具有42個胺基酸之XTEN多肽(例如AE42、AE42_2或AE42_3)的FVII輕鏈及藉由具有72個胺基酸之XTEN多肽(例如AE72、AE72_2或AE72_3)融合至抗GPIIb/IIIa抗體之scFv的FVII重鏈。在其他實施例中，嵌合分子包含融合至具有 72個胺基酸之XTEN多肽(例如AE72、AE72_2或AE72_3)的FVII輕鏈及藉由具有42個胺基酸之XTEN多肽(例如AE42、AE42_2或AE42_3).)融合至抗GPIIb/IIIa抗體之scFv的FVII重鏈。在其他實施例中，嵌合分子包含融合至具有72個胺基酸之XTEN多肽(例如AE72、AE72_2或AE72_3)的FVII輕鏈及藉由具有72個胺基酸之XTEN多肽(例如AE72、AE72_2或AE72_3)融合至抗GPIIb/IIIa抗體之scFv的FVII重鏈。
在某些實施例中，結合至血小板的靶向部分係選自由以下組成之群：抗體或其抗原結合分子、受體之受體結合部分及肽。在一些實施例中，靶向部分選擇性地結合至靜止血小板或活化血小板。在其他實施例中，靶向部分選擇性地結合至選自由以下組成之群的標靶：GPIba、GPVI、GPIX、醣蛋白IIb/IIIa(「GPIIb/IIIa」)之非活性形式、GPIIb/IIIa之活性形式、P選擇蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L、LOX-1及其任何組合。在特定實施例中，靶向部分為結合至GPIIb/IIIa抗原決定基之抗體或其抗原結合分子(「抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子」)。
如本文所用之片語「結合至血小板」及其變體通常係指將(i)GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子或(ii)本揭示內容之嵌合分子特異地結合至血小板表面上之抗原位點，例如GPIIb/IIIa受體之α及/或β子單元之細胞外域上的抗原決定基。熟習此項技術者應瞭解，GPIIb/IIIa 存在於兩個池中，即血小板靜止狀態中存在的漿膜池及在血小板活化後表現的GPIIb/IIIa內部池(internal pool)。參見例如Quinn等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.297：496-500(2001)。因此，在一些特定實施例中，且尤其對於可將血小板之質漿膜透化的診斷用途而言，使GPIIb/IIIa抗體或其抗原分子結合至血小板，或使本揭示內容之嵌合分子結合至血小板可指代結合至漿膜池及/或GPIIb/IIIa內部池。
在一些實施例中，嵌合分子之靶向部分係選自由以下組成之群：抗體或其抗原結合分子、受體之受體結合部分及肽。在一些實施例中，靶向部分選擇性地結合至靜止血小板或活化血小板。在其他實施例中，靶向部分選擇性地結合至選自由以下組成之群的標靶：GP1ba(Uniprot：E7ES66；E7ES66_HUMAN)、GPVI(Uniprot：Q9HCN6；GPVI_HUMAN)、GPIX(Uniprot：P14770；GPIX_HUMAN)、醣蛋白IIb/IIIa(「GPIIb/IIIa」)之非活性形式、GPIIb/IIIa之活性形式、P選擇蛋白(Uniprot：Q14242；SELPL_HUMAN)、GMP-33(參見例如Damas等人，Thromb.Haemost.86：887-93(2001))、LAMP-1(Uniprot：P11279；LAMP1_HUMAN)、LAMP-2(Uniprot：P13473；LAMP2_HUMAN)、CD40L(Uniprot：P29965；CD40L_HUMAN)、LOX-1(Uniprot：P78380；OLR1_HUMAN)及其任何組合。以上提及的Uniprot識別符對應於通用蛋白質資源(Uniprot)資料庫發行版2013_05(2013年5月1日)中所公開之條目，且以全文引用之方式 併入。在某些實施例中，靶向部分包含GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。在特定實施例中，GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子為如第II.A.1部分中所揭示的GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。
II.C. XTEN多肽
如本文所用之「XTEN序列」係指具有非天然存在、實質上非重複、主要由小親水性胺基酸組成的序列的長度延長多肽，該序列在生理條件下具有低程度二級或三級結構或無二級或三級結構。作為嵌合分子搭配物，XTEN可用作載劑，當其聯結至凝結因子、凝結因子之重鏈、凝結因子之輕鏈、靶向部分或嵌合分子上之任何其他序列或分子時賦予某些理想藥物動力學、物理化學及醫藥學性質。該等理想性質包括但不限於增強的藥物動力學參數及可溶性特徵。如本文所用之「XTEN」明確地排除諸如單鏈抗體或輕鏈或重鏈之Fc片段的抗體或抗體片段。
本發明嵌合分子可包括單個XTEN多肽或兩個或兩個以上XTEN多肽。在一個實施例中，嵌合分子包含FVII、第一XTEN多肽、第二XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。因此嵌合分子可包含式FVII-(L1)-X1-(L2)-Tm-(L3)-X2、X2-(L1)-Tm-(L2)-X1-(L3)-FVII、FVII-(L1)-X1-(L2)-X2-(L3)-Tm或Tm-(L3)-X2-(L2)-X1-(L1)-FVII，其中FVII包含FVIIa，X1為第一XTEN多肽，X2為第二XTEN多肽，Tm為如第II.A.1.部分中所述之抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，L1為第 一可選連接子，L2為第二可選連接子，及L3為第三可選連接子。在另一實施例中，嵌合分子包含彼此締合之兩條多肽鏈，第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及第一XTEN多肽，且第二多肽鏈包含呈任何次序的FVII之重鏈、第二XTEN多肽及結合至血小板之靶向部分。在其他實施例中，嵌合分子包含彼此締合之兩條多肽鏈，第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及第一XTEN多肽，第二多肽鏈自N-端至C-端包含FVII之重鏈、第二XTEN多肽及結合至血小板之靶向部分，或FVII之重鏈、結合至血小板之靶向部分及第二XTEN多肽。
在一些實施例中，本發明之XTEN序列為具有大於約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸殘基之肽或多肽。在某些實施例中，XTEN為具有大於約20至約3000個胺基酸殘基、大於30至約2500個殘基、大於40至約2000個殘基、大於50至約1500個殘基、大於60至約1000個殘基、大於70至約900個殘基、大於80至約800個殘基、大於90至約700個殘基、大於100至約600個殘基、大於110至約500個殘基或大於120至約400個殘基之肽或多肽。
本發明之XTEN序列可包含9至14個胺基酸殘基之一或多個序列基序，或與該序列基序至少80%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，其中基序包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：選自由甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)組成之群的4至6種胺基酸。參見US 2010-0239554 A1。
在一些實施例中，XTEN包含非重疊序列基序，其中約80%或至少約85%、或至少90%、或約91%、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%或約100%之序列由自選自表1的單個基序家族選出的非重疊序列之多個單元組成，從而得到家族序列。如本文所用之「家族」意謂XTEN之基序僅選自表1之單個基序類別；亦即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN，且選擇並非來自家族基序的XTEN中任何其他胺基酸以達成所需性質，諸如允許藉由編碼核苷酸併入限制位點、併入裂解序列或以達成對FVII的更好鍵聯。在XTEN家族之一些實施例中，XTEN序列包含以下者之非重疊序列基序之多個單元：AD基序家族、或AE基序家族、或AF基序家族、或AG基序家族、或AM基序家族、或AQ基序家族、或BC家族、或BD家族，所得XTEN顯示上文所述之同源性範圍。在其他實施例中，XTEN包含來自表1中兩個或兩個以上基序家族之基序序列的多個單元。此等序列可經選擇以達成所要物理學/化學特徵，包括諸如淨電荷、親水性、缺乏二級結構或缺乏重複性之性質，該等特徵係藉 由基序之胺基酸組合物賦予，下文將更全面地描述。在本段以上描述之實施例中，併入至XTEN中之基序可經選擇且使用本文所述之方法裝配以達成具有約36至約3000個胺基酸殘基之XTEN。此外，聯結至FVII之XTEN的非限制性實例揭示與美國專利公開案第2012/0263701號中，該案以全文引用的方式併入本文中。
‧表示當以各種排列一起使用時得到「家族序列」之個別基序序列
XTEN可具有不同長度。在一個實施例中，基於欲在融合蛋白中達成的性質或功能來選擇一或多個XTEN多肽的長度。視預期性質或功能而定，XTEN可為可充當載劑的短或中等長度序列或較長序列。在某些實施例中，XTEN包括約6至約99個胺基酸殘基的短區段，約100至約399個胺基酸殘基的中等長度區段及約400至約1000及高達約3000個胺基酸殘基的長度較長區段。因此，聯結至FVII(例如重鏈或輕鏈)或靶向部分的XTEN可具有長約6、約12、約36、約40、約42、約72、約96、約144、約288、約400、約500、約576、約600、約700、約800、約864、約900、約1000、約1500、約2000、約2500或高達約3000個胺基酸殘基之長度。在其他實施例中，XTEN序列長約6至約50、約50至約100、約100至150、約150至250、約250至400、約400至約500、約500至約900、約900至1500、約1500至2000或約2000至約3000個胺基酸殘基。可聯結至FVII(例如輕鏈或重鏈)或靶向部分(Tm)的XTEN多肽之精確長度可變化而不會不利地影響FVII之活性。在一個實施例中，本文所用的一或多個XTEN長約42個胺基酸、約72個胺基酸、約108個胺基酸、約144個胺基酸、約180個胺基酸、約216個胺基酸、約252個胺基酸、約288個胺基酸、約324個胺基酸、約360個胺基酸、約396個胺基酸、約432個胺基酸、約468個胺基酸、約504個胺基酸、約540個胺基酸、約576個胺基酸、約 612個胺基酸、約624個胺基酸、約648個胺基酸、約684個胺基酸、約720個胺基酸、約756個胺基酸、約792個胺基酸、約828個胺基酸、約836個胺基酸、約864個胺基酸、約875個胺基酸、約912個胺基酸、約923個胺基酸、約948個胺基酸、約1044個胺基酸、約1140個胺基酸、約1236個胺基酸、約1318個胺基酸、約1332個胺基酸、約1428個胺基酸、約1524個胺基酸、約1620個胺基酸、約1716個胺基酸、約1812個胺基酸、約1908個胺基酸、約2004個胺基酸，且可選自XTEN家族序列中之一或多者；亦即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC、BD或其任何組合。
在一些實施例中，本發明所用之XTEN多肽與選自由以下組成之群的序列至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致：AE42、AG42、AE42_2、AE42_3、AE48、AM48、AE72、AE72_2、AE72_3、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AE144_2、AE144_3、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE295、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、 AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AE872、AE884、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908、AG2004及其任何組合。參見US 2010-0239554 A1。
在一個實施例中，XTEN序列與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致：AE42、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何組合。在另一實施例中，XTEN序列係選自由以下組成之群：AE42、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何組合。在一特定實施例中，XTEN序列為AE288。本發明之某些XTEN序列之胺基酸序列展示於表2中。
在XTEN中小於100%之胺基酸由選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)的4、5或6種胺基酸組成，或小於100%之序列由表1之序列基序或表2之XTEN序列組成的一些實施例中，XTEN之其他胺基酸殘基選自其他14種天然L胺基酸中的任何胺基酸，但優先選自親水性胺基酸，以使得XTEN序列含有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少約99%的親水性胺基酸。可將個別胺基酸或不同於甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)的短序列胺基酸併入至XTEN中以達成所需性質，諸如允許藉由編碼核苷酸併入限制位點，或有助於聯結至酬載組分，或併入裂解序列。不為甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)的XTEN胺基酸遍佈於XTEN序列，位於序列基序內或序列基序之間，或集中於一或多個短XTEN伸展序列，諸如位於或接近N端或C端。由於疏水性胺基酸向多肽賦予結構，本發明提供的是：用於接合構築體中的XTEN之疏水性胺基酸含量通常小於5%、或小於2%、或小於1%疏水性胺基酸含量。較少用於XTEN之構造的疏水性殘基包括色胺酸、苯丙胺酸、酪 胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸及甲硫胺酸。此外，可設計XTEN序列含有少於5%或少於4%或少於3%或少於2%或少於1%或無下列胺基酸：甲硫胺酸(避免氧化)、天冬醯胺及麩醯胺(避免脫醯胺)。在其他實施例中，用於接合構築體中的XTEN組分之甲硫胺酸及色胺酸之胺基酸含量通常小於5%、或小於2%且最佳小於1%。在其他實施例中，XTEN之序列具有小於10%的帶正電胺基酸殘基、或小於約7%、或小於約5%、或小於約2%的帶正電胺基酸殘基，甲硫胺酸及色胺酸殘基的總和小於2%，且天冬醯胺及麩醯胺殘基的總和小於總XTEN序列的5%。
在另外實施例中，用於本發明中的XTEN多肽影響本發明之嵌合分子的物理或化學性質，例如藥物動力學。用於本發明中的XTEN序列可顯示一或多個下列有利性質：構形可撓性、增強的水溶解性、高程度的蛋白酶抗性、低免疫原性、對哺乳動物受體的較低結合或增加的流體動力學(或Stokes)半徑。在一特定實施例中，本發明中聯結至FVII或靶向部分(例如抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)的XTEN多肽增加藥物動力學性質，諸如較長終末半衰期或增大的曲線下面積(AUC)，使得相較於野生型凝結因子，本文所述的嵌合分子在活體內保留的時間增加。在另外實施例中，本發明所用之XTEN多肽增加藥物動力學性質，諸如較長終末半衰期或增大的曲線下面積(AUC)，以便相較於野生型FVIIa，凝結因子在活體內保留的時間增加。
可採用各種方法及分析以測定包含XTEN多肽的蛋白質之物理/化學性質。該等方法包括但不限於分析離心分離、EPR、HPLC-離子交換、HPLC-粒徑篩析、HPLC-反相、光散射、毛細管電泳、圓偏光二色性、示差掃描量熱法、螢光、HPLC-離子交換、HPLC-粒徑篩析、IR、NMR、拉曼光譜、折射量測法及UV/可見光譜學。其他方法揭示於Amau等人，Prot Expr and Purif 48,1-13(2006)中。
可根據本發明使用的XTEN多肽之其他實例揭示於美國專利第7,855,279號及第7,846,445號、美國專利公開案第2009/0092582 A1號、第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/0046061 A1號、第2011/0077199 A1號、第2011/0172146 A1號、第2013/0017997 A1號或第2012/0263701 A1號、國際專利公開案第WO 2010091122 A1號、第WO 2010144502 A2號、第WO 2010144508 A1號、第WO 2011028228 A1號、第WO 2011028229 A1號、第WO 2011028344 A2號；或2011年8月19日申請的國際申請案第PCT/US2011/48517號中。
II.D. 進一步包含異源性部分的嵌合分子
本揭示內容亦提供「嵌合分子」，其進一步與至少一個異源性部分融合及/或接合及/或以其他方式締合。因此，本文所揭示的嵌合分子(例如，包含FVII、XTEN多肽及如第II.A.部分中所揭示的GPIIb/IIIa抗體或 其抗原結合分子中的至少一者的嵌合分子，或包含FVIIH、FVIIL、XTEN多肽及如第II.B.部分中所揭示的結合至血小板之靶向部分的嵌合分子)涵蓋進一步包含至少一個異源性部分(例如半衰期延長部分)的任何分子。在一些實施例中，嵌合分子為嵌合蛋白，亦即所有組分(異源性部分及/或連接子)皆為多肽的嵌合分子。其他嵌合分子可包含非多肽異源性部分(例如PEG、脂質、碳水化合物、核酸、小分子治療劑、放射性核種、螢光探針等)及/或非多肽連接子。
如本文所用之術語「部分」係指本發明之嵌合分子之組成部分或成分。如本文所用之術語「異源性部分」係指基因融合、接合及/或以其他方式締合至嵌合分子之任何組分的部分。在某些實施例中，嵌合分子可包含一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上異源性部分。
本文所揭示的嵌合分子之一或多個異源性部分可包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：預防及/或治療劑(例如凝結因子)、能夠改良藥物動力學(PK)性質的分子(例如血漿半衰期延長部分)、可偵測部分(例如螢光分子或放射性核種)等。
在一些實施例中，異源性部分可改變缺少此異源性部分的嵌合分子之物理化學性質，例如其可增大嵌合分子之流體動力學半徑。在其他實施例中，將異源性部分併入至嵌合分子中可改良一或多個藥物動力學性質而不顯著影響其生物活性或功能(例如包含FVII的嵌合分子之 促凝血活性)。
在一些實施例中，異源性部分為包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的多肽：至少約10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000或4000個胺基酸。在其他實施例中，異源性部分為包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的多肽：約100至約200個胺基酸、約200至約300個胺基酸、約300至約400個胺基酸、約400至約500個胺基酸、約500至約600個胺基酸、約600至約700個胺基酸、約700至約800個胺基酸、約800至約900個胺基酸或約900至約1000個胺基酸。
在其他實施例中，異源性部分提高本發明之嵌合分子或其片段的穩定性。如本文所用之術語「穩定性」係指維持嵌合分子響應於環境條件(例如升高或降低的溫度)之一或多個物理性質的技術認定量度。在某些實施例中，物理性質可為嵌合分子之共價結構的維持(例如不存在蛋白水解裂解、非所要的氧化或脫醯胺的情況)。在其他實施例中，物理性質亦可為處於適當折疊狀態下的嵌合分子之存在(例如不存在可溶性或不溶性聚集體或沈澱物的情況)。在一個實施例中，嵌合分子的穩定性藉由分析嵌合分子的生物物理性質來量測，例如熱穩定性、pH解折疊曲線、穩定移除醣化、溶解性、生物化學功能(例如結合至蛋白質、受體或配位體的能力)等及/或其組合。 在另一實施例中，生物化學功能由相互作用之結合親和力表明。在一個實施例中，蛋白質穩定性的量度為熱穩定性，亦即對熱激發的抗性。穩定性可使用此項技術中已知的方法量測，諸如HPLC(高效液相層析)、SEC(粒徑篩析層析)、DLS(動態光散射)等。量測熱穩定性的方法包括但不限於示差掃描量熱法(DSC)、示差掃描螢光法(DSF)、圓偏光二色性(CD)及熱激發分析。
在一些實施例中，嵌合分子包含至少一個為「半衰期延長部分」的異源性部分。如本文所用之術語「半衰期延長部分」係指增大蛋白質(例如嵌合分子)之活體內半衰期的異源性部分。術語「半衰期」係指特定蛋白質或多肽(例如本文所揭示的凝結因子或嵌合分子)於活體內之生物半衰期。半衰期可由自動物之循環及/或其他組織中清除向受試者投與量的一半所需的時間來表示。當隨時間變化來構建本發明之給定多肽或嵌合分子的清除曲線時，曲線通常為雙相的，即快速α-相及較長β-相。α-相通常表示所投與Fc多肽於血管內與血管外空間之間的平衡，且部分地藉由多肽的大小來決定。β-相通常表示多肽於血管內空間中的分解代謝。在一些實施例中，本發明促凝血化合物為單相的，且因此不具有α相，但僅具有單個β相。在某些實施例中，如本文所用之術語半衰期係指呈β-相的促凝血化合物之半衰期。人類的人類抗體之典型β相半衰期為21日。嵌合分子之活體內半衰期可藉由熟習此項技術者已知的任何方法測定。在某些實施例中，半衰 期延長部分可包含非多肽部分(例如PEG)的連接位點。
如下文詳細論述的半衰期延長部分可包含例如(i)另一XTEN多肽，(ii)白蛋白，(iii)白蛋白結合多肽或脂肪酸，(iv)Fc，(v)運鐵蛋白，(vi)PAS，(vii)人類絨毛膜促性腺激素之β子單元之C-端肽(CTP)，(viii)聚乙二醇(PEG)，(ix)羥乙基澱粉(HES)，(x)白蛋白結合小分子，(xi)vWF，(xii)清除受體或其片段，其阻斷嵌合分子結合至清除受體，或(xiii)其任何組合。在一些實施例中，半衰期延長部分包含Fc區。在其他實施例中，半衰期延長部分包含由連接子融合的兩個Fc區。示範性異源性部分亦包括例如FcRn結合部分(例如結合至FcRn的完整Fc區或其部分)、單鏈Fc區(scFc區，例如，如美國公開案第2008-0260738號及國際公開案第WO 2008-012543號及第WO 2008-1439545號中所述)或可加工scFc區。在一些實施例中，異源性部分可包括非多肽部分的連接位點，該非多肽部分諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸或此等部分的任何衍生物、變異體或組合。
在某些實施例中，本發明之嵌合分子包含至少一個半衰期延長部分，相對於缺乏此異源性部分的對應嵌合分子之循環半衰期而言，其增加嵌合分子之循環半衰期。嵌合分子之循環半衰期可藉由熟習此項技術者已知的任何方法測定，該方法例如活性分析(顯色分析或一級凝結aPTT分析)、ELISA等。
在一些實施例中，一或多個半衰期延長部分 的存在致使嵌合分子之半衰期相較於缺乏此等一或多個半衰期延長部分的對應嵌合分子的半衰期而言增加。包含半衰期延長部分的嵌合分子之半衰期比缺乏此半衰期延長部分的對應嵌合分子之循環半衰期長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。
在一個實施例中，包含半衰期延長部分的嵌合分子之半衰期比缺乏此半衰期延長部分的對應嵌合分子之活體內半衰期長約1.5倍至約20倍、約1.5倍至約15倍或約1.5倍至約10倍。在另一實施例中，包含半衰期延長部分的嵌合分子之半衰期比缺乏此半衰期延長部分的對應嵌合分子之活體內半衰期長約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、約2倍至約5倍、約2倍至約4倍、約2倍至約3倍、約2.5倍至約10倍、約2.5倍至約9倍、約2.5倍至約8倍、約2.5倍至約7倍、約2.5倍至約6倍、約2.5倍至約5倍、約2.5倍至約4倍、約2.5倍至約3倍、約3倍至約10倍、約3倍至約9倍、約3倍至約8倍、約3倍至約7倍、約3倍至約6倍、約3倍至約5倍、約3倍至約4倍、約4倍至約6倍、約5倍至約7倍或約6倍至約8倍。
II.D.1. Fc區
在某些實施例中，嵌合分子包含至少一個包 含Fc區的異源性部分。除非另外指明，否則如本文所用之「Fc」或「Fc區」意謂功能性新生Fc受體(FcRn)結合搭配物，其包含Fc域、其變異體或片段。FcRn結合搭配物為可藉由FcRn受體特異地結合，從而藉由FcRn結合搭配物之FcRn受體有效運輸之任何分子。因此，術語Fc包括IgG Fc之任何功能性變異體。結合至FcRn受體的IgG之Fc部分之區已基於X-射線結晶學得以描述(Burmeister等人，Nature 372：379(1994)，其以全文引用之方式併入本文中)。Fc與FcRn之主要接觸區域接近CH2域與CH3域之接合點。Fc-FcRn接觸區全部在單一Ig重鏈內。結合搭配物的FcRn包括但不限於完整IgG、IgG之Fc片段及IgG中包括FcRn之完整結合區之其他片段。Fc可包含免疫球蛋白中具有或不具有免疫球蛋白鉸鏈區之CH2域及CH3域。亦包括Fc片段、變異體或衍生物，其在嵌合分子中維持Fc區的理想性質，例如增加的半衰期，例如活體內半衰期。各種突變體、片段、變異體及衍生物描述於例如PCT申請案第WO2011/069164號、第WO2012/006623號、第WO2012/006635號或第WO 2012/006633號中，所有該等公開案皆以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及Fc區。
II.D.2. scFc(單鏈Fc)區
在一個實施例中，嵌合分子包含異源性部分，其在單個多肽鏈內包含一個基因融合Fc區或其部分(亦即單鏈Fc(scFc)區)。未加工多肽在相同線性多肽鏈內包含至少兩個免疫球蛋白恆定區或其部分(例如Fc部分或Fc域(例如2、3、4、5、6或6個以上Fc部分或Fc域))，其能夠折疊(例如分子內折疊或分子間折疊)以形成一個由Fc肽連接子聯結的功能性scFc區。舉例而言，在一個實施例中，本發明之多肽能夠經由其scFc區結合至至少一個Fc受體(例如FcRn、FcγR受體(例如FcγRIII))或補體蛋白質(例如C1q))以延長半衰期或觸發免疫效應物功能(例如抗體依賴細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴細胞毒性(CDCC)及/或改良可製造性)。
在一些實施例中，嵌合分子包含凝結因子(例如FVII)、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及scFc區。
II.D.3. 白蛋白
在某些實施例中，嵌合分子包含異源性部分，其包含白蛋白或其功能性片段。人類血清白蛋白(HAS或HA)為呈全長形式時具有609個胺基酸之蛋白，其引起顯著比例的血清滲透壓且亦充當內源性及外源性配位體之載劑。如本文所用之術語「白蛋白」包括全長白蛋白或其功能性片段、變異體、衍生物或類似物。白蛋白或其片段或變異體之實例揭示於美國專利公開案第US2008/0194481號、第US2008/0004206號、第 US2008/0161243號、第US2008/0261877號或第US2008/0153751號或PCT申請公開案第WO2008/033413號、第WO2009/058322號或第WO2007/021494號，該等公開案以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及白蛋白。
II.D.4. 白蛋白結合多肽及脂質
在某些實施例中，異源性部分可包含白蛋白結合部分，其包含白蛋白結合肽、細菌白蛋白結合域、白蛋白結合抗體片段或其任何組合。舉例而言，白蛋白結合蛋白質可為細菌白蛋白結合蛋白質、抗體或抗體片段，其包括域抗體(參見例如美國專利第6,696,245號)。舉例而言，白蛋白結合蛋白質可為細菌白蛋白結合域，諸如鏈球菌蛋白G之白蛋白結合域(Konig及Skerra(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。可用作接合搭配物的白蛋白結合肽之其他實例為例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys一致序列的彼等肽，其中Xaa1為Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2為Asn、Gln、H is、Ile、Leu或Lys；Xaa3為Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；且Xaa4為Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr，如美國公開案第US2003/0069395號或Dennis等人(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043中所述。
如Kraulis等人，FEBS Lett.378：190-194 (1996)及Linhult等人，Protein Sci.11：206-213(2002)所揭示，來自鏈球菌蛋白G之域3為細菌白蛋白結合域之實例。白蛋白結合肽之實例包括一系列具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：__)之肽。參見例如Dennis等人，J.Biol.Chem.2002,277：35035-35043(2002)。白蛋白結合抗體片段之實例揭示於Muller及Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.9：319-326(2007)；Roovers等人，Cancer Immunol.Immunother.56：303-317(2007)，及Holt等人，Prot.Eng.Design Sci.,21：283-288(2008)中，該等參考文獻以全文引用的方式併入本文中。此白蛋白結合部分之實例為如由Trussel等人，Bioconjugate Chem.20：2286-2292(2009)所揭示的2-(3-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯(「Albu」標籤)。可使用脂肪酸，尤其長鏈脂肪酸(LCFA)及類長鏈脂肪酸白蛋白結合化合物來延長本發明之嵌合分子之活體內半衰期。類LCFA白蛋白結合化合物之實例為16-(1-(3-(9-(((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)羰基氧基)-甲基)-7-磺基-9H-茀-2-基胺基)-3-側氧基丙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基硫基)十六酸(參見例如WO 2010/140148)。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及白蛋白結合多肽或脂質。
II.D.5. CTP
在某些實施例中，本文所揭示的嵌合分子包 含至少一個異源性部分，其包含人類絨毛膜促性腺激素之C端肽(CTP)的一個β子單元或其片段、變異體或衍生物。已知將一或多個CTP肽插入重組蛋白中來增加該蛋白之活體內半衰期。參見例如美國專利第5,712,122號，其以全文引用之方式併入本文中。
示範性CTP肽包括 DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO：_)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：_)。參見例如美國專利申請公開案第US 2009/0087411號，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，嵌合分子包含為CTP序列的兩個異源性部分。在一些實施例中，三個異源性部分為CTP序列。在一些實施例中，四個異源性部分為CTP序列。在一些實施例中，五個異源性部分為CTP序列。在一些實施例中，六個或六個以上異源性部分為CTP序列。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及CTP。
II.D.6. PAS
在其他實施例中，至少一個異源性部分為PAS序列。如本文所用之PAS序列意謂主要包含丙胺酸及絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸殘基的胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下形成隨即捲曲構形。因此，PAS序列為包含以下、基本上由以下組成或由 以下組成的可用作嵌合分子中異源性部分之一部分的建構基元、胺基酸聚合物或序列基因盒：丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸。然而，熟習此項技術者應明白，當將不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之殘基作為次要成分添加於PAS序列中時，胺基酸聚合物亦可形成隨機捲曲構形。
本文所用之術語「次要成分」意謂，可將不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之胺基酸在一定程度上添加於PAS序列中，例如高達約12%(亦即PAS序列之100個胺基酸中有約12個胺基酸)、高達約10%(亦即PAS序列之100個胺基酸中有約10個胺基酸)、高達約9%(亦即100個胺基酸中有約9個胺基酸)、高達約8%(亦即100個胺基酸中有約8個胺基酸)、約6%(亦即100個胺基酸中有約6個胺基酸)、約5%(亦即100個胺基酸中有約5個胺基酸)、約4%(亦即100個胺基酸中有約4個胺基酸)、約3%(亦即100個胺基酸中有約3個胺基酸)、約2%(亦即100個胺基酸中有約2個胺基酸)、約1%(亦即100個胺基酸中有約1個胺基酸)。
不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之胺基酸可選自由以下組成之群：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr及Val。
在生理條件下，PAS序列伸展段形成隨機捲曲構形且由此可介導嵌合分子之提高的活體內及/或活體外穩定性。由於隨機捲曲域不採用穩定結構或藉由自身起 作用，因而由嵌合分子中之活化凝結因子介導的生物活性基本上得以保存。在其他實施例中，形成隨機捲曲域的PAS序列為生物學插入物，尤其相對於血漿之蛋白水解、免疫原性、等電點/靜電行為、結合至細胞表面受體或內化而言，然而其仍為生物可降解的，其提供超過諸如PEG之合成聚合物的優勢。
形成隨機捲曲構形的PAS序列之非限制性實例包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO：155)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO：156)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO：157)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO：158)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO：159)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO：160)及ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO：161)或其任何組合。PAS序列之其他實例自例如美國專利公開案第2010/0292130號及PCT申請公開案第WO2008/155134 A1號已知。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及PAS。
II.D.7. HAP
在某些實施例中，至少一個異源性部分為富含甘胺酸的均聚胺基酸(homo-amino-acid)聚合物(HAP)。 HAP序列可包含甘胺酸的重複序列，其具有之長度為至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、120個胺基酸、140個胺基酸、160個胺基酸、180個胺基酸、200個胺基酸、250個胺基酸、300個胺基酸、350個胺基酸、400個胺基酸、450個胺基酸或500個胺基酸。在一個實施例中，HAP序列能夠延長融合或聯結至HAP序列的部分之半衰期。HAP序列之非限制性實例包括但不限於(Gly)n、(Gly4Ser)n或S(Gly4Ser)n，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一個實施例中，n為20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在一個實施例中，n為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。參見例如Schlapschy M等人，Protein Eng.Design Selection,20：273-284(2007)。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及HAP。
II.D.8. 運鐵蛋白
在某些實施例中，至少一個異源性部分為運鐵蛋白或肽或其片段、變異體或衍生物。可使用任何運鐵蛋白以製得本發明之嵌合分子。舉例而言，野生型人類TF(TF)為一種679胺基酸蛋白質(近似75KDa(未考慮糖基化)，其具有似乎起源於基因複製之兩個主要域，即N 域(約330個胺基酸)及C域(約340個胺基酸)。N域包含兩個子域，即N1域及N2域，且C域包含兩個子域，即C1域及C2域。參見基因庫(GenBank)登錄號NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847及S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)，其全部以全文引用的方式併入本文中。在一個實施例中，運鐵蛋白異源性部分包括運鐵蛋白剪接變異體。在一個實例中，運鐵蛋白剪接變異體可為人類運鐵蛋白之剪接變體，例如基因庫登錄AAA61140。在另一實施例中，嵌合分子之運鐵蛋白部分包括運鐵蛋白序列之一或多個域，例如N域、C域、N1域、N2域、C1域、C2域或其任何組合。
運鐵蛋白經由運鐵蛋白質受體(TfR)介導之胞吞作用來轉運鐵。在鐵釋放至內體區隔(endosomal compartment)中且Tf-TfR複合物再循環至細胞表面之後，Tf釋放回細胞外空間以進行下一鐵轉運循環。Tf擁有超過14-17天的長半衰期(Li等人，Trends Pharmacol.Sci.23：206-209(2002))。已對運鐵融合蛋白之半衰期延長進行研究，目標為用於癌症治療之遞送、經口遞送及胰島素原之持續活化(Brandsma等人，Biotechnol.Adv.,29：230-238(2011)；Bai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：7292-7296(2005)；Kim等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,334：682-692(2010)；Wang等人，J.Controlled Release 155：386-392(2011))。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向 部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及運鐵蛋白。
II.D.9. PEG
在一些實施例中，至少一個異源性部分為此項技術中已知的可溶聚合物，其包括但不限於聚乙二醇、乙二醇/聚乙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖或聚乙烯醇。在一些實施例中，包含PEG異源性部分的嵌合分子進一步包含選自由以下組成之群的異源性部分：免疫球蛋白恆定區或其部分(例如Fc區)、PAS序列、HES及白蛋白、其片段或變異體。在其他實施例中，嵌合分子包含活化凝結因子或其片段及PEG異源性部分，其中嵌合分子進一步包含選自由以下組成之群的異源性部分：免疫球蛋白恆定區或其部分(例如Fc部分)、PAS序列、HES及白蛋白、其片段或變異體。在其他實施例中，嵌合分子包含凝結因子或其片段、第二凝結因子或其片段及PEG異源性部分，其中嵌合分子進一步包含選自由以下組成之群的異源性部分：免疫球蛋白恆定區或其部分(例如Fc部分)、PAS序列、HES及白蛋白、其片段或變異體。
在其他實施例中，嵌合分子包含凝結因子或其片段、合成促凝血多肽及PEG異源性部分，其中嵌合分子進一步包含選自由以下組成之群的異源性部分：免疫球蛋白恆定區或其部分(例如Fc區)、PAS序列、HES及白蛋白、其片段或變異體。在其他實施例中，嵌合分子包含兩個合成促凝血肽及PEG異源性部分，其中嵌合分子 進一步包含選自由以下組成之群的異源性部分：免疫球蛋白恆定區或其部分(例如Fc區)、PAS序列、HES及白蛋白、其片段或變體。在另一實施例中，嵌合分子包含凝結因子或其片段、凝結因子輔因子(例如若凝結因子為因子VII則為組織因子)及PEG異源性部分，其中嵌合分子進一步包含選自由以下組成之群的異源性部分：免疫球蛋白恆定區或其部分(例如Fc區)、PAS序列、HES及白蛋白、其片段或變異體。
聚合物可為任何分子量，且可為分支的或未分支的。在一個實施例中，為易於處理及製造，聚乙二醇之分子量在約1kDa與約100kDa之間。可使用其他大小，其視所要特性而定(例如所要持續釋放的持續時間、對生物活性的作用(若存在)、易於處理、抗原性的程度或缺乏抗原性及聚乙二醇對蛋白質或類似物的其他已知作用)。舉例而言，聚乙二醇之平均分子量可為約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa。
在一些實施例中，聚乙二醇可具有分支結構。分支聚乙二醇描述於例如美國專利第5,643,575號；Morpurgo等人，Appl.Biochem.Biotechnol.56：59-72(1996)；Vorobjev等人，Nucleosides Nucleotides 18：2745-2750(1999)；及Caliceti等人，Bioconjug.Chem.10：638-646(1999)中，該等參考文獻中的每一者以全文引用的方式併入本文中。
連接至本發明之各嵌合分子的聚乙二醇部分的數目(亦即取代度)亦可變化。舉例而言，可將PEG化嵌合分子聯結至平均1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20個或20個以上聚乙二醇分子。同樣，平均取代度之範圍為諸如每個蛋白質分子1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19或18-20個聚乙二醇部分。測定取代度之方法論述於例如Delgado等人，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9：249-304(1992)中。
在一些實施例中，可將嵌合分子PEG化。PEG化嵌合分子包含至少一個聚乙二醇(PEG)分子。在其他實施例中，聚合物可為水溶性的。聚合物之非限制性實例可為聚(伸烷基氧化物)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(丙烯醯基嗎啉)。凝結因子之聚合物接合的其他類型揭示於美國專利案第7,199,223中。亦參見Singh等人Curr.Med.Chem.15：1802-1826(2008)。
存在許多可為熟習此項技術者可利用的PEG 連接方法，例如Malik F等人，Exp.Hematol.20：1028-35(1992)；Francis,Focus on Growth Factors 3(2)：4-10(1992)；歐洲專利公開案第EP0401384號、第EP0154316號及第EP0401384號；及國際專利申請公開案第WO92/16221號及第WO95/34326號。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及PEG。
II.D.10 HES
在某些實施例中，至少一個異源性部分為聚合物，例如羥乙基澱粉(HES)或其衍生物。羥乙基澱粉(HES)為天然存在的支鏈澱粉之衍生物並由體內之α-澱粉酶降解。HES為碳水化合物聚合物支鏈澱粉之經取代衍生物，其以高達95重量%的濃度存在於玉米澱粉中。HES顯示有利的生物性質，且用作血液容量置換劑且在臨床上用於血液稀釋療法(Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)；及Weidler等人，Arzneim.-Forschung/Drug Res.,41,494-498(1991))。
支鏈澱粉含有葡萄糖部分，其中存在主鏈α-1,4-醣苷鍵且在分支位點發現α-1,6-醣苷鍵。此分子之物理-化學性質主要藉由醣苷鍵之類型來決定。歸因於鏈裂的α-1,4-醣苷鍵，產生具有每圈約六個葡萄糖單體之螺旋結構。聚合物之物理-化學以及生物化學性質可經由取代 來改變。羥乙基之引入可經由鹼性羥乙基化達成。藉由改變反應條件，有可能相對於羥乙基化在未取代的葡萄糖單體中利用各別羥基之不同反應性。由於此事實，熟習此項技術者能夠在有限程度上影響取代模式。
HES主要藉由分子量分佈及取代度來表徵。表示為DS的取代度係關於莫耳取代，其為熟習此項技術者已知的。參見Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie,8(8),271-278(1987)，如上文所述，尤其第273頁。
在一個實施例中，羥乙基澱粉之平均分子量(重量平均分子量)為1至300kD、2至200kD、3至100kD或4至70kD。就羥乙基而言，羥乙基澱粉可進一步顯示0.1至3、較佳0.1至2、更佳0.1至0.9，較佳0.1至0.8之莫耳取代度，及在2至20之範圍內的C2：C6取代比率。平均分子量為約130kD之HES的非限制性實例為取代度為以下的HES：0.2至0.8，諸如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，較佳0.4至0.7，諸如0.4、0.5、0.6或0.7。在特定實施例中，平均分子量為約130kD之HES為來自Fresenius之VOLUVEN®。VOLUVEN®為一種例如用於容量置換之人工膠體，其用於治療適應症中以治療及預防低血容量症。VOLUVEN®之特徵為平均分子量130,000+/-20,000 D、莫耳取代0.4及C2：C6比率約9：1。在其他實施例中，羥乙基澱粉之平均分子量的範圍為例如4至70kD，或10至70kD，或12至70kD，或18至70kD，或50至70kD，或4至50kD，或10至50kD，或 12至50kD，或18至50kD，或4至18kD，或10至18kD，或12至18kD，或4至12kD，或10至12kD，或4至10kD。在其他實施例中，所採用的羥乙基澱粉之平均分子量在大於4kD及小於70kD的範圍內，諸如約10kD，或在9至10kD，或10至11kD，或9至11kD的範圍內，或約12kD，或在11至12kD)，或12至13kD，或11至13kD的範圍內，或約18kD，或在17至18kD，或18至19kD，或17至19kD的範圍內，或約30kD，或在29至30，或30至31kD的範圍內，或約50kD，或在49至50kD或50至51kD或49至51kD的範圍內。
在某些實施例中，異源性部分可為具有不同平均分子量及/或不同取代度及/或不同C2：C6取代比率的羥乙基澱粉之混合物。因此，可採用以下羥乙基澱粉之混合物：具有不同平均分子量及不同取代度及不同C2：C6取代比率，或具有不同平均分子量及不同取代度及相同或大約相同的C2：C6取代比率，或具有不同平均分子量及相同或大約相同的取代度及不同C2：C6取代比率，或具有相同或大約相同的平均分子量及不同取代度及不同C2：C6取代比率，或具有不同平均分子量及相同或大約相同的取代度及相同或大約相同的C2：C6取代比率，或具有相同或大約相同的平均分子量及不同取代度及相同或大約相同的C2：C6取代比率，或具有相同或大約相同的平均分子量及相同或大約相同的取代度及不同C2：C6取代比率，或具 有大約相同的平均分子量及大約相同的取代度及大約相同的C2：C6取代比率。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及HES。
II.D.11 PSA
在某些實施例中，至少一個異源性部分為聚合物，例如聚唾液酸(PSA)或其衍生物。聚唾液酸(PSA)為天然存在的未分支唾液酸聚合物，其由某些細菌菌株或在哺乳動物中在某些細胞中產生，Roth J.，等人(1993)於Polysialic Acid：From Microbes to Man,Roth J.,Rutishauser U.,Troy F.A.編(Birkhäuser Verlag,Basel,Switzerland)，第335-348頁中。聚唾液酸可藉由限定酸水解或藉由用神經胺糖酸酶消化，或藉由聚合物的天然細菌來源形式的分餾以n=約80個或80個以上唾液酸殘基至n=2的不同聚合度來產生。不同聚唾液酸的組成亦變化，以使得存在均聚形式，亦即α-2,8-聯結的聚唾液酸，其包含大腸桿菌(E.coli)菌株K1及B組腦膜炎球菌的莢膜多醣，該多醣亦發現於新生細胞黏著分子(N-CAM)之胚胎形式上。亦存在異聚形式-諸如大腸桿菌菌株K92及腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)之C組多醣的交替α-2,8 α-2,9聚唾液酸。唾液酸亦可發現於具有不同於唾液酸的單體(諸如腦膜炎奈瑟氏球菌的W135組或Y組)之交替共聚物中。唾液酸具有重要的生物功能，包括藉由病原菌逃避 免疫及補體系統及在胎兒發育期間調節不成熟神經元之神經膠質黏著力(其中聚合物具有抗黏著功能)Cho及Troy,P.N.A.S.,USA,91(1994)11427-11431，儘管在哺乳動物中不存在已知的聚唾液酸受體。大腸桿菌菌株K1之α-2,8-聯結聚唾液酸亦稱為『多聚乙醯神經胺糖酸(colominic acid)』且用於(以各種長度)例證本發明。已描述將聚唾液酸連接或接合至多肽的各種方法，(例如參見美國專利第5,846,951號；WO-A-0187922及US 2007/0191597 A1，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及PSA。
II.D.12 清除受體
在某些實施例中，可延長本發明之嵌合分子之活體內半衰期，其中嵌合分子包含至少一個異源性分子，該異源性分子包含清除受體、其片段、變異體或衍生物。在嵌合分子包含因子X的特定實施例中，清除分子之可溶形式，諸如低密度脂蛋白相關蛋白質受體LRP1或其片段可阻斷因子X結合至清除受體，且由此延長其活體內半衰期。
LRP1為600kDa膜主體蛋白，其牽連諸如FVII或X之各種蛋白質的受體介導清除。參見例如Narita等人，Blood 91：555-560(1998)；Lenting等人，Haemophilia 16：6-16(2010)。其他適合的清除受體為例如 LDLR(低密度脂蛋白質受體)、VLDLR(極低密度脂蛋白質受體)及巨蛋白(megalin)(LRP-2)或其片段。參見例如Bovenschen等人，Blood 106：906-912(2005)；Bovenschen,Blood 116：5439-5440(2010),Martinelli等人，Blood 116：5688-5697(2010)。
在一些實施例中，嵌合分子包含FVII、靶向部分(例如GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、XTEN多肽及清除受體、其片段、變異體或衍生物。
II.E. 因子VII
嵌合分子包含FVII，其為因子VII之成熟形式或其變異體。因子VII(FVII、F7；亦稱為因子7、凝血因子VII、血清因子VII、血清凝血酶原轉化促進劑、SPCA、前轉化素(proconvertin)及依他凝血素α(eptacog alpha))為一種絲胺酸蛋白酶，其為凝血級聯之部分。FVII包括Gla域、兩個EGF域(EGF-1及EGF-2)及絲胺酸蛋白酶域(或肽酶S1域)，絲胺酸蛋白酶域在絲胺酸蛋白酶之肽酶S1家族的所有成員中為高度保守的，諸如例如胰凝乳蛋白酶的情況。FVII以單鏈酶原、活化類酶原雙鏈多肽(例如可活化FVII)及完全活化的雙鏈形式的形式存在。
如本文所用之「類酶原」蛋白質或多肽係指已藉由蛋白水解裂解活化，但仍顯示與酶原相關聯之性質，諸如例如低活性或無活性，或類似蛋白質酶原形式之構形的構形。舉例而言，當不結合至組織因子時，FVII的雙鏈活化形式為類酶原蛋白；其保留相似於未裂解 FVII酶原之構形，且因此顯示極低活性。在結合至組織因子之後，FVII之雙鏈活化形式經歷構形改變且獲得其作為凝血因子的完全活性。
示範性FVII變異體包括特異性活性提高的彼等變異體，例如藉由提高其酶促活性(Kcat或Km)來提高FVII之活性的突變。該等變異體已在此項技術中有所描述且包括例如分子之突變體形式，如例如以下中所述：Persson等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 98：13583(2001)；Petrovan及Ruf,J.Biol.Chem.276：6616(2001)；Persson等人，J.Biol.Chem.276：29195(2001)；Soejima等人，J.Biol.Chem.276：17229(2001)；Soejima等人，J.Biol.Chem.247：49027(2002)。
在一個實施例中，FVII之變異體形式包括突變，例如V158D-E296V-M298Q。在另一實施例中，FVII之變異體形式包括FVII成熟序列之胺基酸608-619(LQQSRKVGDSPN，對應於170-環)由胰蛋白酶170-環之胺基酸EASYPGK(SEQ ID NO：_)的置換。FVII之高特異性活性變異體亦為此項技術中已知的。舉例而言，Simioni等人(N.E.Journal of Medicine 361：1671,2009)描述R338L突變。Chang等人(J.Biol.Chem.273：12089,1988)及Pierri等人(Human Gene Therapy 20：479,2009)描述R338A突變。其他突變為此項技術中已知的且包括例如描述於以下中的突變：Zogg及Brandstetter,Structure17：1669(2009)；Sichler等人，J.Biol.Chem.278：4121 (2003)；及Sturzebecher等人，FEBS Lett.412：295(1997)。此等參考文獻的內容以引用的方式併入本文中。
發生在類酶原形式的構形改變之後的完全活化發生在結合至其輔因子亦即組織因子之後。此外，可引入突變，該等突變在不存在組織因子的情況下導致構形改變。因此，對FVIIa的提及包括其雙鏈形式：類酶原形式及完全活化的雙鏈形式。
在一個實施例中，FVII之重鏈包含與SEQ ID NO：178至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約100%一致的胺基酸序列，其中包含重鏈的FVII具有FVII凝結活性。在另一實施例中，FVII之輕鏈包含與SEQ ID NO：179至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約100%一致的胺基酸序列，其中包含輕鏈的FVII具有FVII凝結活性。
II.F. 連接子
如本文所用之術語「連接子」或「連接子部分」(在本文所揭示的式中表示為L、L1或L2)係指肽或多肽序列(例如合成肽或多肽序列)或非肽連接子，其主要功能為連接多肽鏈之線性胺基酸序列中的兩個域，例如本發明之嵌合分子中的兩個異源性部分。因此，在一些實施例中，將連接子插入兩個異源性部分之間、異源性部分與 結合至血小板的靶向部分(例如第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)之間、FVII(重鏈或輕鏈)與結合至血小板的靶向部分(例如第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)之間、或FVII(重鏈或輕鏈)與異源性部分之間。
當本發明之嵌合分子中存在多個連接子時，各連接子可為相同或不同的。一般而言，連接子向嵌合分子提供可撓性。連接子通常不經裂解；然而在某些實施例中，此裂解可為理想的。因此，在一些實施例中，連接子可包含一或多個蛋白酶可裂解位點，其可位於連接子序列內或在連接子序列的任一末端處側接該連接子。
在一些實施例中，嵌合分子包含一或多個連接子，其中連接子中之一或多者包含肽連接子。在其他實施例中，連接子中之一或多者包含非肽連接子。在一些實施例中，肽連接子可包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸。在其他實施例中，肽連接子可包含至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個或至少1,000個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子可包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、 1500、1600、1700、1800、1900或2000個胺基酸。
肽連接子可包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900或1900-2000個胺基酸。
肽連接子之實例為此項技術中所熟知的，例如根據式[(Gly)x-Sery]z之肽連接子，其中x為1至4，y為0或1，且z為1至50。在一個實施例中，肽連接子包含序列Gn，其中n可為1至100的整數。在一特定實施例中，該特定實施例，肽連接子之序列為GGGG。肽連接子可包含序列(GA)n。肽連接子可包含序列(GGS)n。在其他實施例中，肽連接子包含序列(GGGS)n(SEQ ID NO：240)。在其他實施例中，肽連接子包含序列(GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO：241)。在此等情況下，n可為1-100的整數。在其他情況下，n可為1-20的整數，亦即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。連接子之實例包括但不限於GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO：242)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO：243)、GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：244)、 GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：245)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：246)。在其他實施例中，連接子為聚-G序列(GGGG)n，其中n可為1-100的整數(SEQ ID NO：247)。
示範性Gly/Ser肽連接子包含胺基酸序列(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：248)，其中n為與以下相同或高於以下的整數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、46、50、55、60、70、80、90或100。在一個實施例中，n=1，亦即連接子為(Gly4Ser)(SEQ ID NO：249)。在一個實施例中，n=2，亦即連接子為(Gly4Ser)2(SEQ ID NO：250)。在另一實施例中，n=3，亦即連接子為(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：251)。在另一實施例中，n=4，亦即連接子為(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：252)。在另一實施例中，n=5，亦即連接子為(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：253)。在另一實施例中，n=6，亦即連接子為(Gly4Ser)6(SEQ ID NO：254)。在另一實施例中，n=7，亦即連接子為(Gly4Ser)7(SEQ ID NO：255)。在另一實施例中，n=8，亦即連接子為(Gly4Ser)8(SEQ ID NO：256)。在另一實施例中，n=9，亦即連接子為(Gly4Ser)9(SEQ ID NO：257)。在另一實施例中，n=10，亦即連接子為(Gly4Ser)10(SEQ ID NO：258)。
另一示範性Gly/Ser肽連接子包含胺基酸序列Ser(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：248)，其中n為與以下相同或高於以下的整數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25、30、35、40、46、50、55、60、70、80、90或100。在一個實施例中，n=1，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)(SEQ ID NO：259)。在一個實施例中，n=2，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)2(SEQ ID NO：260)。在另一實施例中，n=3，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：261)。在另一實施例中，n=4，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：262)。在另一實施例中，n=5，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：263)。在另一實施例中，n=6，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)6(SEQ ID NO：264)。在另一實施例中，n=7，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)7(SEQ ID NO：265)。在另一實施例中，n=8，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)8(SEQ ID NO：266)。在另一實施例中，n=9，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)9(SEQ ID NO：267)。在另一實施例中，n=10，亦即連接子為Ser(Gly4Ser)10(SEQ ID NO：268)。
在某些實施例中，該Gly/Ser肽連接子可插入兩個其他肽連接子序列之間(例如本文所述之任何肽連接子序列)。在其他實施例中，Gly/Ser肽連接子係連接在另一肽連接子序列(例如本文所述之任何肽連接子序列)的一個末端或兩個末端處。在其他實施例中，將兩個或兩個以上Gly/Ser連接子以串聯形式併入於肽連接子中。在一個實施例中，本發明之肽連接子包含上鉸鏈區之至少一部分(例如來源於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)、中鉸鏈區之至少一部分(例如來源於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分 子)及一系列Gly/Ser胺基酸殘基(例如Gly/Ser連接子，諸如(Gly4Ser)n)。
可使用此項技術中已知的技術將肽連接子引入多肽序列中。可藉由DNA序列分析確認修飾。可使用質體DNA來轉形寄主細胞以便穩定地產生多肽產物。
II.G. 蛋白酶裂解位點
在一些實施例中，嵌合分子包含蛋白酶裂解位點，其連接嵌合分子之任何兩個組分，例如FVII之輕鏈及FVII之重鏈。蛋白酶裂解位點可為用於有效裂解及活化的細胞內加工位點。舉例而言，嵌合分子可包含單個多肽鏈，其包含FVII之輕鏈、抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及XTEN多肽，或FVII之輕鏈、XTEN多肽、蛋白酶裂解位點及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。蛋白酶裂解位點可藉由寄主細胞中的細胞內加工酶或藉由凝血位點處的蛋白酶來裂解。
細胞內加工酶之實例包括弗林蛋白酶(furin)、酵母Kex2、PCSK1(亦稱為PC1/Pc3)、PCSK2(亦稱為PC2)、PCSK3(亦稱為弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(亦稱為PC4)、PCSK5(亦稱為PC5或PC6)、PCSK6(亦稱為PACE4)或PCSK7(亦稱為PC7/LPC、PC8或SPC7)。其他加工位點為此項技術中已知的。在包括一個以上加工或裂解位點之構築體中，應理解此等位點可為相同或不同的。
在一些實施例中，嵌合分子可包含例如聯結 FVII酶原之輕鏈及FVII酶原之重鏈的蛋白酶裂解位點。聯結FVII酶原之輕鏈及FVII酶原之重鏈的蛋白酶裂解位點可選自此項技術中已知的任何蛋白酶裂解位點。
III. 製備方法
本發明亦提供一種核酸分子或核酸分子組，其編碼本文所揭示的任何嵌合分子或其補體。
在一個實施例中，本發明包括一種編碼多肽鏈的核酸分子，其包含FVII之輕鏈、XTEN多肽、細胞內加工位點、FVII之重鏈及結合至血小板的靶向部分(例如第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)。在另一實施例中，本發明之核酸分子編碼包含以下的多肽鏈：FVII之輕鏈、結合至血小板的靶向部分(例如第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)、細胞內加工位點、FVII之重鏈及XTEN多肽。在其他實施例中，核酸分子編碼包含以下的多肽鏈：FVII之輕鏈、細胞內加工位點、FVII之重鏈、XTEN多肽及結合至血小板的靶向部分(例如第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)。在一些實施例中，核酸分子編碼包含以下的多肽鏈：FVII之輕鏈、細胞內加工位點、FVII之重鏈、結合至血小板的靶向部分(例如第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)及XTEN多肽。
在一些實施例中，核酸分子包含核苷酸序列組，第一核苷酸序列編碼包含FVII之輕鏈及XTEN多肽 的第一多肽鏈，且第二核苷酸序列編碼包含FVII之重鏈及結合至血小板的靶向部分(例如第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)的第二多肽鏈。在其他實施例中，核酸分子包含核苷酸序列組，第一核苷酸序列編碼包含FVII之輕鏈及結合至血小板的靶向部分(例如第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)的第一多肽鏈，且第二核苷酸序列編碼包含FVII之重鏈及XTEN多肽的第二多肽鏈。在其他實施例中，核酸分子包含核苷酸序列組，第一核苷酸序列編碼FVII之輕鏈，且第二核苷酸序列編碼FVII之重鏈、XTEN多肽及結合至血小板的靶向部分(例如第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)。在一些實施例中，核酸分子包含核苷酸序列組，第一核苷酸序列編碼FVII之輕鏈，且第二核苷酸序列編碼FVII之重鏈、結合至血小板的靶向部分(例如抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子)及XTEN多肽。
在一些實施例中，編碼嵌合分子的核苷酸序列包含與SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191或SEQ ID NO：192之核苷酸序列至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
亦提供一種載體或載體組，其包含此核酸分子或核酸分子組或其補體，以及提供包含該載體的寄主細胞。
本發明亦提供一種用於產生本文所揭示的嵌 合分子的方法，此方法包含培養本文所揭示的寄主細胞及自培養基回收嵌合分子。
在一些實施例中，嵌合分子包含來源於第一來源的第一胺基酸序列，其共價地或非共價地鍵合至來源於第二來源的第二胺基酸序列，其中第一來源及第二來源不相同。不相同的第一來源及第二來源可包括兩種不同生物實體，或同一生物實體的兩種不同蛋白質，或生物實體及非生物實體。嵌合分子可包括例如來源於至少2個不同生物來源的蛋白質。生物來源可包括任何非合成產生的核酸或胺基酸序列(例如基因體或cDNA序列、質體或病毒載體、天然病毒體或上文中任一者的突變體或類似物，如本文進一步所述)。合成來源可包括以化學方式但不藉由生物系統產生(例如胺基酸序列之固相合成)的蛋白質或核酸序列。嵌合分子亦可包括來源於至少2個不同合成來源的蛋白質或來源於至少一個生物來源及至少一個合成來源的蛋白質。嵌合分子亦可包含來源於第一來源的第一胺基酸序列，其共價地或非共價地聯結至來源於任何來源的核酸或來源於任何來源的小有機分子或無機分子。嵌合分子亦可包含連接子分子，其在第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之間，或在第一胺基酸序列與核酸之間，或在第一胺基酸序列與小有機分子或無極分子之間。
多種方法可用於重組產生本文所揭示的嵌合分子。應理解，由於密碼子的簡併，各種核酸序列將編碼多肽之胺基酸序列。所要多核苷酸可藉由重新固相DNA 合成或藉由早期製備的多核苷酸之PCR誘變產生。
寡核苷酸介導誘變為一種用於製備取代、同框插入或改變(例如密碼子改變)以引入編碼胺基酸取代的密碼子(例如引入嵌合分子中)的方法。舉例而言，藉由將編碼所要突變的寡核苷酸雜交至單鏈DNA模板來改變起始多肽DNA。在雜交之後，使用DNA聚合酶合成模板的完整第二互補鏈，其併入寡核苷酸引子。在一個實施例中，基因工程，例如基於引子之PCR誘變足以併入如本文所定義之改變，用於產生編碼本文所揭示的任何嵌合分子之多核苷酸。
對於重組產生而言，將編碼多肽(例如本文所揭示的任何嵌合分子)的多核苷酸序列插入適當表現媒介物中，亦即含有用於轉錄及轉譯所插入編碼序列之必需元件，或在RNA病毒載體的狀況下，用於複製及轉譯之必需元件的載體。
將編碼本文所揭示的任何嵌合分子的核酸插入適當閱讀框架中的載體中。隨後將表現載體轉染至將表現多肽的適合靶細胞中。此項技術中已知的轉染技術包括但不限於磷酸鈣沈澱(Wigler等人1978,Cell 14：725)及電穿孔(Neumann等人1982,EMBO J.1：841)。各種寄主表現載體系統可用於在真核細胞中表現本文所揭示的任何嵌合分子。在一個實施例中，真核細胞為動物細胞，包括哺乳動物細胞(例如293細胞、PerC6、CHO、BHK、Cos、HeLa細胞)。當在真核細胞中表現多肽時，編碼本文所揭 示的任何嵌合分子之DNA亦可編碼允許多肽分泌之訊號序列。熟習此項技術者應理解，當轉譯多肽時，訊號序列由細胞裂解以形成成熟嵌合分子。此項技術中已知各種訊號序列，例如天然FVII訊號序列、天然FIX訊號序列、天然FX訊號序列、天然GPIIb訊號序列、天然GPIIIa訊號序列及小鼠IgK輕鏈訊號序列。或者，在不包括訊號序列時，本文所揭示的嵌合分子可藉由溶解細胞來回收。
本文所揭示的嵌合分子可在基因轉殖動物中合成，諸如齧齒動物、山羊、綿羊、豬或牛。術語「基因轉殖動物」係指將外來基因併入其基因組中的非人類動物。因為此基因存在於生殖系組織中，所以其自親代傳遞至子代。將外源性基因引入單細胞胚胎中(Brinster等人1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4438)。產生基因轉殖動物之方法為此項技術中已知的，其包括產生免疫球蛋白分子的基因轉殖方法(Wagner等人1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6376：McKnight等人1983,Cell 34：335；Brinster等人1983,Nature 306：332；Ritchie等人1984,Nature 312：517；Baldassarre等人2003,Theriogenology 59：831；Robl等人2003,Theriogenology 59：107；Malassagne等人2003,Xenotransplantation 10：267)。
表現載體可編碼允許易於純化或識別重組產生多肽之標籤。實例包括但不限於載體pUR278(Ruther等人1983,EMBO J.2：1791)，其中編碼序列的本文所揭示的嵌合分子可與lac z編碼區同框連接至載體中，以便 產生雜交多肽；pGEX載體可用於表現具有麩胱甘肽S-轉移酶(GST)標籤的蛋白質。此等蛋白質通常具可溶性且可易於藉由吸收至麩醯胺-瓊脂糖珠粒接著藉由在游離麩胱甘肽存在下溶離而自細胞純化。載體包括例如用於PreCission蛋白酶(Pharmacia,Peapack,N.J.)之裂解位點，以用於在純化之後易於移除標籤。
出於本發明之目的，可採用多種表現載體系統。此等表現載體通常可在寄主有機體中作為游離基因體或寄主染色體DNA之整體部分複製。表現載體可包括表現控制序列，其包括但不限於啟動子(例如天然關聯或異源性啟動子)、增強子、訊號序列、剪接訊號、增強子元件及轉錄終止序列。較佳地，表現控制序列為能夠轉形或轉染真核寄主細胞之載體中的真核啟動子系統。表現載體亦可利用來源於動物病毒之DNA元件，該等動物病毒諸如牛乳突瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、細胞巨大病毒(CMV)或SV40病毒。其他表現載體涉及使用具有內部核糖體結合位點的多順反子系統。
一般而言，表現載體含有選擇標記(例如安比西林-抗性、濕黴素-抗性、四環素抗性或新黴素抗性)以允許偵測由所要DNA序列轉形的彼等細胞(參見例如Itakura等人，美國專利第4,704,362號)。將DNA整合至其染色體之細胞可藉由引入一或多個標記來選擇，該等標記允許選擇經轉染之寄主細胞。標記可為營養缺陷型寄主提供原 養、除生物劑抗性(例如抗生素)或對諸如銅之重金屬的抗性。可將可選擇標記基因直接聯結至欲表現的DNA序列或藉由共轉形引入至同一細胞中。
示範性表現載體為NEOSPLA(美國專利第6,159,730號)。此載體含有細胞巨大病毒啟動子/增強子、小鼠β球蛋白主要啟動子、SV40複製起點、牛生長激素多腺苷酸化序列、新黴素磷酸轉移酶外顯子1及外顯子2、二氫葉酸還原酶基因及前導序列。已發現此載體在併入可變區及恆定區基因、於細胞中轉染，接著藉由於含有培養基的G418中選擇及胺甲喋呤擴增之後產生極高程度的抗體表現。載體系統亦教示於美國專利第5,736,137號及第5,658,570號中，該等案中每一者均以全文引用的方式併入。此系統提供高的表現程度，例如>30 pg/細胞/天。其他示範性表現載體系統揭示於例如美國專利第6,413,777號中。
在其他實施例中，本發明之嵌合分子可使用多順反子構築體表現。在此等表現系統中，可自單個多順反子構築體產生多個所關注基因產物，諸如多聚體結合蛋白質之多個多肽。此等系統有利地使用內部核糖體進入位點(IRES)以在真核寄主細胞中提供相對高含量的本發明之多肽。適用IRES序列揭示於美國專利第6,193,980號，該案亦併入本文中。熟習此項技術者應理解，此等表現系統可用於有效地產生本申請案中所揭示的所有多肽。
更一般而言，一旦編碼多肽的載體或DNA序 列已獲製備，即可將表現載體引入適當寄主細胞中。亦即，寄主細胞可轉形。將質體引入寄主細胞中可藉由熟習此項技術者所熟知的各種技術來實現。此等技術包括但不限於轉染(包括電泳及電穿孔)、原生質體融合、磷酸鈣沈澱、細胞與包膜DNA之融合、微注射及完整病毒感染。 參見Ridgway,A.A.G.「Mammalian Expression Vectors」第24.2章，第470-472頁Vectors,Rodriguez及Denhardt編(Butterworths,Boston,Mass.1988)。最佳地，經由電穿孔將質體引入寄主中。轉形細胞在適於產生輕鏈及重鏈的條件下生長，並對該等轉形細胞分析重鏈及/或輕鏈蛋白合成。示範性分析技術包括酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、流式細胞測量術、免疫組織化學及類似技術。
如本文所用之術語「轉形」在廣義上係指將DNA向受體寄主細胞中的引入，其改變基因型且因此導致受體細胞的改變。
以此類推，「寄主細胞」係指已由載體轉形的細胞，該等載體使用重組DNA技術構建且編碼至少一個異源性基因。在對用於自重組寄主分離多肽之方法的描述中，除非另外清楚地指明，否則術語「細胞」及「細胞培養物」可互換使用以指示多肽之來源。換言之，自「細胞」回收多肽可意謂自離心分離之完整細胞或自含有培養基及懸浮細胞之細胞培養物中回收。
在一個實施例中，寄主細胞內源性地表現在 加工期間裂解scFc連接子(例如若此連接子存在且含有一或多個細胞內加工位點)所必需的一(或多)種酶以形成成熟多肽。在此加工期間，可實質上移除scFc連接子以減少外來胺基酸之存在。在本發明之另一實施例中，寄主細胞經轉形以表現一或多種酶，該等酶對於細胞而言為外源性的以便對scFc連接子的加工發生或得以改良。
在一個實施例中，可由細胞內源性或外源性表現的酶為弗林蛋白酶家族之成員。人類弗林蛋白酶(亦即PACE)之完整cDNA及胺基酸序列公開於1990年。Van den Ouweland A M等人(1990)Nucleic Acids Res.18：664；Erratum於：Nucleic Acids Res.18：1332(1990)中。頒與Barr等人之美國專利第5,460,950號描述重組PACE及將PACE與異源性蛋白質的基質前驅體多肽共表現以改良活性成熟異源性蛋白質的表現。美國專利第5,935,815號同樣描述重組人類福林蛋白酶(亦即PACE)及將弗林蛋白酶與異源性蛋白質的基質前驅體多肽共表現以改良活性成熟異源性蛋白質的表現。本專利所揭示的可能基質前驅體包括因子IX的前驅體。除PACE之外，哺乳動物弗林蛋白酶/枯草桿菌蛋白酶/類Kex2p前蛋白轉化酶(PC)家族的其他家族成員據報導包括PCSK1(亦稱為PC1/Pc3)、PCSK2(亦稱為PC2)、PCSK3(亦稱為弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(亦稱為PC4)、PCSK5(亦稱為PC5或PC6)、PCSK6(亦稱為PACE4)或PCSK7(亦稱為PC7/IPC、PC8或SPC7)。儘管此等各種成員共用某些保 守的總體結構特徵，然而該等成員在其組織分佈、次細胞定位、裂解特異性及較佳基質方面有所不同。關於綜述，參見Nakayama K(1997)Biochem J.327：625-35。類似於PACE，此等前蛋白轉化酶自胺基端開始通常包括訊號肽、前肽(其可自動催化裂解)、特徵為Asp、His、Ser及Asn/Asp殘基的類枯草桿菌蛋白酶催化域及均聚B域，該均聚B域亦為催化活性所必須的且特徵為Arg-Gly-Asp(RGD)序列。PACE、PACE4及PC5亦包括Cys富集域，其功能為未知的。此外，PC5具有同工型，該等同工型具有或不具有跨膜域；此等不同同工型分別稱為PC5B及PC5A。PACE催化域之胺基酸序列與前蛋白轉化酶之此家族的其他成員之催化域胺基酸序列之間的比較揭露下列一致性程度：PC4為70%；PACE4及PC5為65%；PC1/PC3為61%；PC2為54%；及LPC/PC7/PC8/SPC7為51%。Nakayama K(1997)Biochem J.327：625-35。
PACE及PACE4已報導具有部分重疊但相異的基質。詳言之，與PACE形成明顯對比，PACE4已報導能夠加工FIX之前驅體多肽。Wasley等人(1993)J.Biol.Chem.268：8458-65；Rehemtulla等人(1993)Biochemistry.32：11586-90。美國專利第5,840,529揭示人類PC7之核苷酸及胺基酸序列及PC7與其他PC家族成員相比將HIVgp160裂解成gp120及gp41之顯著能力。
齧齒動物PC5之核苷酸及胺基酸序列首先由Lusson等人(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90：6691-5描述 為PC5及由Nakagawa等人(1993)J Biochem(Tokyo)113：132-5描述為PC6。美國專利第6,380,171號揭示人類PC5A之核苷酸及胺基酸序列，該人類PC5A為不具有跨膜域之同工型。此等酶之序列及其選殖方法為此項技術中已知的。
編碼本發明之多肽的基因亦可在諸如細菌或酵母或植物細胞之非哺乳動物細胞中表現。就此點而言應理解，亦可轉形各種單細胞非哺乳動物微生物，諸如細菌；亦即能夠在培養物或發酵中生長的微生物。易受轉形的細菌包括以下的成員：腸內桿菌科，諸如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙氏桿菌(Salmonella)之菌株；芽孢桿菌科，諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎雙球菌(Pneumococcus)；鏈球菌屬(Streptococcus)，及流行性感冒桿菌(Haemophilus influenzae)。應進一步理解，當在細菌中表現時，多肽通常成為包涵體之部分。該等多肽必須加以分離、純化且隨後裝配成功能性分子。
除原核生物之外，亦可使用真核微生物。釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或普通焙用酵母為真核微生物中最常用的，儘管許多其他菌株為普遍可利用的。
對於酵母屬(Saccharomyces)中的表現，普遍使用例如質體YRp7(Stinchcomb等人，Nature,282：39(1979)；Kingsman等人，Gene,7：141(1979)；Tschemper等人，Gene,10：157(1980))。此質體已含有TRP1基因， 其提供用於缺乏在色胺酸中之生長能力的酵母突變體菌株的選擇標記，例如ATCC第44076號或第PEP4-1號(Jones,Genetics,85：12(1977))。作為酵母寄主細胞基因組之一特徵的trpl損傷之存在則提供用於偵測藉由在色胺酸不存在下的生長來轉形的有效環境。
亦可採用其他酵母寄主，如畢赤酵母菌屬(Pichia)。需要時，酵母表現載體具有表現控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列及類似者。典型啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶及其他解糖酶。可誘導酵母啟動子尤其包括來自乙醇脫氫酶、異細胞色素C及負責甲醇、麥芽糖及半乳糖利用之酶的啟動子。
或者，可將多肽編碼核苷酸序列併入轉殖基因中以供引入基因轉殖動物之基因組中且隨後於基因轉殖動物之乳汁中表現(參見例如美國專利第5,741,957號；第5,304,489號；及第5,849,992號)。適合的基因轉殖包括與來自乳腺特異基因(諸如酪蛋白或β乳球蛋白)之啟動子及增強子可操作地聯結的多肽編碼序列。
活體外生產可允許按比例擴大以得到大量的所要多肽。在組織培養條件下用於哺乳動物培養之技術在此項技術中為已知的，且包括均勻懸浮培養，例如在氣升式反應器中或在連續攪拌反應器中的均勻懸浮培養；或固定或截留細胞培養，例如在中空纖維、微囊中，在瓊脂糖微珠或陶瓷匣筒上的培養。若必要及/或需要時，多肽之溶液可藉由慣用層析方法來純化，例如凝膠過濾、離子交 換層析、經由DEAE纖維素層析或(免疫)親和力層析的層析法，例如在合成鉸鏈區多肽之較佳生物合成之後或在本文所述的HIC層析步驟之前或之後來純化。親和標籤序列(例如His(6)標籤)可視情況連接或包括在多肽序列內以促進下游純化。
一旦得以表現，嵌合分子可根據此項技術之標準程序來純化，該等程序包括硫酸銨沈澱、親和力管柱層析、HPLC純化、凝膠電泳及類似程序(一般參見Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))且特別參見本發明實例中所用的方法。為用於醫藥學用途，具有至少約90至95%均勻性的實質上純的蛋白質為較佳的，且98至99%或99%以上均勻性為最佳的。
IV. 使用方法
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含(i)本文所揭示的嵌合分子；(ii)本文所揭示的核酸分子或核酸分子組；(iii)本文所揭示的載體或載體組；或(iv)其任何組合，及醫藥學上可接受的載劑。
在一些實施例中，投與(i)本文所揭示的嵌合分子，(ii)本文所揭示的核酸分子或核酸分子組，(iii)本文所揭示的載體或載體組，或(iii)本文所揭示的醫藥組合物可用於例如降低有需要之受試者的出血事件的頻率或程度，及/或降低或預防有需要之受試者的出血事件的發 生。在一些實施例中，受試者已發展或有能力發展抵抗用FVIII、FIX或兩者治療的抑制劑。在一些實施例中，抵抗FVIII或FIX的抑制劑為抵抗FVIII、FIX或兩者的中和抗體。
在一些實施例中，出血事件可藉由凝血病症引起，例如A型血友病或B型血友病。在一些實施例中，出血事件可來源於關節積血、肌肉出血、口腔出血、失血、向肌肉中失血、口腔失血、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內失血、腹內失血、胸內失血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙中出血、腹膜後隙中出血、髂腰肌鞘中出血或其任何組合。在某些實施例中，受試者為人類受試者。在其他實施例中，受試者為小鼠受試者。
本發明亦提供：(a)一種將FVII靶向至血小板表面的方法，其中該方法包含將藥劑融合至XTEN多肽及第II.A.1.部分中所揭示的GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子中之一者或結合至血小板的靶向部分；(b)一種提高FVII之活性的方法，其包含將FVII融合至XTEN多肽及第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子或結合至血小板的靶向部分；或，(c)一種改良FVII之藥物動力學性質的方法，其包含將FVII融合至XTEN多肽及第II.A.1.部分中所揭示的抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子或結合至血小板的靶向部分。
本發明亦係關於一種治療、減輕或預防受試者之止血病症的方法，其包含投與治療有效量的本發明之嵌合分子。藉由嵌合分子的治療、減輕及預防可為繞道療法。繞道療法中的受試者可已經發展凝結因子(例如FVIII或FIX)之抑制劑，或受試者傾向於發展凝結因子抑制劑。用於向受試者投與的組合物包括核酸分子，其包含編碼本發明之嵌合分子的核苷酸序列。
在一個實施例中，將本發明之嵌合分子組合物與至少一種促進止血的其他藥劑組合投與。作為實例而不作為限制，止血藥劑可包括FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII、凝血酶原，或血纖維蛋白原或前述任何者之活化形式。凝結因子或止血藥劑亦可包括抗血纖維蛋白分解藥，例如ε-胺基-己酸、胺甲環酸(tranexamic acid)。
本發明之嵌合分子可靜脈內、皮下、肌肉內或經由任何黏膜表面，例如經口、舌下、經頰、舌下、經鼻、經直腸、經陰道或經由肺途徑投與。可將嵌合分子植入生物聚合物固體支撐物內或聯結至生物聚合物固體支撐物，從而允許嵌合分子緩慢釋放至所要位點。
對於經口投與，醫藥組合物可採取藉由習知方式製備的錠劑或膠囊形式。亦可將組合物製備成液體，例如糖漿或懸浮液。液體可包括懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)、乳化劑(卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性媒介物(例如杏仁油、油脂、乙醇或分 餾植物油)及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。製劑亦可包括調味劑、著色劑及甜味劑。或者，組合物可提供為乾燥產品，以供用水或其他適合媒介物來復原。對於經頰及舌下投與，組合物可根據習知方案採取錠劑、糖錠或速溶膜形式。對於經由吸入投與，用於根據本發明之嵌合分子宜以氣溶膠噴霧形式用適合的推進劑自加壓包裝或噴霧器中(例如於PBS中)加以遞送。
在一個實施例中，投與本發明之多肽的途徑為非經腸途徑。如本文所用之術語非經腸包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、經直腸或經陰道投與。非經腸投與之靜脈內形式較佳。儘管所有此等投與形式皆明確涵蓋於本發明之範疇內，但用於投與之形式將為注射用溶液，尤其靜脈內或動脈內注射或滴注用溶液。通常，適合的注射用醫藥組合物可包含緩衝液(例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液)、界面活性劑(例如聚山梨醇酯)、視情況選用之穩定劑(例如人類白蛋白)等。然而，在其他與本文教示相容的方法中，可將多肽直接遞送至不良細胞群體位點，從而增加患病組織向治療劑之暴露。
用於非經腸投與的製劑包括無菌水溶液或非水溶液，懸浮液及乳液。非水溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。在本發明中，醫藥學上可接受之載劑包 括但不限於0.01-0.1M及較佳0.05M磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。其他常用非經腸媒介物包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏液或不揮發油。靜脈內媒介物包括流體及營養補充液、電解質補充液，諸如基於林格氏右旋糖之彼等補充液及類似者。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體及類似者。
更特定而言，適合於注射用途的醫藥組合物包括無菌水溶液(水溶性的情況)或分散液及用於臨時製備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。在該等狀況下，組合物必須為無菌的且流動性應達到易於注射之程度。其在製造及儲存條件下應為穩定的，且較佳獲保存而抵抗諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。載劑可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液態聚乙二醇及類似者)及其適合混合物。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散狀況下維持所需粒子大小且藉由使用界面活性劑來維持。
對微生物作用的預防可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及類似者。在許多狀況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。藉由在組合物中包括延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鋁及明膠，可使注射組合物吸收延長。
在任何狀況下，藉由將所需量的活性化合物 (例如多肽自身或與其他活性劑組合)與本文中所列舉的一種成分或成分之組合按需要併入適當溶劑中，接著過濾滅菌。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入無菌媒介物中來製備，該媒介物含有鹼性分散介質及來自上文列舉彼等成分的所需其他成分。在用於製備無菌注射溶液的無菌粉末狀況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加上來自先前無菌過濾溶液的任何其他所要成分的粉末。根據此項技術中已知的方法，處理注射液製劑，將其填入諸如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶之容器中，且在無菌條件下加以密封。另外，製劑可經包裝且以套組形式出售。此等製品較佳具有標籤或藥品插頁，其指示相關組合物適用於治療罹患或易患凝結病症的受試者。
醫藥組合物亦可經調配以栓劑或保留灌腸形式用於經腸投與，例如其含有習知栓劑基質，諸如可可脂或其他甘油酯。
用於治療病狀的本發明之組合物的有效劑量視許多不同因素而變化，包括投與方式、靶位點、患者的生理狀態、患者為人類還是動物、所投與的其他藥劑及治療為預防性還是治療性。通常，患者為人類，然而亦可治療包括基因轉殖哺乳動物的非人類哺乳動物。治療劑量可使用此項技術者已知的常規方法滴定以優化安全性及效力。
在一個實施例中，生物活性部分(例如包含 FVII)的劑量可在約90至270μg/kg或0.090至0.270mg/kg的範圍內。在另一實施例中，生物活性部分(例如包含FX)的劑量在約1μg/kg至400mg/kg的範圍內。
劑量可在1000μg/kg至0.1ng/kg體重範圍內。在一個實施例中，給藥範圍為1ug/kg至100μg/kg。可將蛋白質連續投與或以特定定時間隔來投與。可採用活體外分析以測定用於投與的最佳劑量範圍及/或時程。量測凝結因子活性的活體外分析為此項技術中已知的，例如STA-CLOT Vlla-rTF凝結分析。此外，可自由動物模型(例如患血友病的狗)獲得的劑量-反應曲線外推有效劑量(Mount等人2002,Blood 99：2670)。
以上範圍的中間劑量亦意欲在本發明之範疇內。受試者可每天、按天交替地、每週或根據由經驗分析決定的其他時程來投與該等劑量。示範性治療需要以多劑量形式經延長的時間(例如至少六個月)進行投與。在一些方法中，可同時投與兩種或兩種以上多肽，在該種狀況下，所投與各種多肽之劑量在所指示的範圍內。
可在多種情況下投與本發明之多肽。單個劑量之間的間隔可為每天、每週、每月或每年。如藉由量測患者中經修飾多肽或抗原之血液含量所指示，該等間隔亦可為不規律的。或者，可將多肽以持續釋放調配物形式投與，在該種狀況下，需要較低的投藥頻率。劑量及頻率視患者中多肽之半衰期而變化。
投與的劑量及頻率可視治療為預防性還是治 療性而變化。在預防性應用中，向尚未出現疾病狀態的患者投與含有本發明之多肽或其混合物(cocktail)的組合物以增強該患者抵抗力或將疾病之效應降至最小。將此量定義為「預防有效劑量」。以相對不頻繁的間隔經一段長的時間段投與相對低的劑量。一些患者在其餘生繼續接受治療。
可視情況將本發明之多肽與在治療需要治療(例如預防性或治療性)的病症或病狀中有效的其他藥劑組合投與。
如本文所用，將本發明之多肽與輔助治療結合或組合投與意謂順序、同時、同時擴展、並行、相伴或同時期投與或應用療法及所揭示的多肽。熟習此項技術者應理解，可對投與或應用組合治療方案的各種組分進行定時，以增強治療之總體有效性。技藝人士(例如醫師)將能夠基於所選擇輔助治療及本說明書之教示，在沒有不當實驗的情況下輕易鑑別有效的組合治療方案。
應進一步理解，本發明之多肽可與一或多種藥劑結合或組合使用(例如以提供組合治療方案)。可與本發明之多肽組合的示範性藥劑包括代表目前用於所治療特定病症之護理標準的藥劑。該等藥劑本質上可具化學性或生物性。術語「生物的」或「生物藥劑」係指自活有機體及/或其產物製得的意欲用作治療劑的任何醫藥活性劑。
待與本發明之多肽組合使用的藥劑的量可隨受試者而變化或可根據此項技術中所知來投與。參見例 如，Bruce A Chabner等人，Antineoplastic Agents，Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287((Hardman等人編，第9版1996)中的。在另一實施例中，投與符合護理標準之量的此藥劑。
如先前所論述，本發明之多肽可以醫藥學上有效的量投與來用於活體內治療凝結病症。就此點而言應理解，可調配本發明之多肽以有助於投與及促進活藥劑之穩定性。較佳地，根據本發明之醫藥組合物包含醫藥學上可接受的、無毒的、無菌載劑，諸如生理鹽水、無毒緩衝液、防腐劑及類似者。當然，本發明之醫藥組合物可以單一劑量或多劑量來投與以提供醫藥學上有效量的多肽。
在一個實施例中，將本發明之嵌合分子以核酸分子形式投與。可使用此項技術中已知的技術投與核酸分子，包括經由載體、質體、脂質體、DNA注射、電穿孔、基因槍、靜脈內注射或肝動脈輸注。用於基因治療實施例的載體為此項技術中已知的。
根據本發明之範疇，本發明之嵌合分子可根據上述治療方法以足以產生治療或預防效果的量向人類或其他動物投與。
如熟習此項技術者將認識到，本發明之嵌合分子具有許多用途，包括但不限於治療患有疾病或病狀的受試者的方法。疾病或病狀可包括但不限於止血病症。
在一個實施例中，本發明係關於一種治療患 有止血病症之受試者的方法，其包含投與治療有效量的本發明之至少一種嵌合分子。
本發明之嵌合分子藉由促進纖維蛋白血塊的形成來治療或預防止血病症。本發明之嵌合分子可活化凝血級聯之任何成員。凝結因子可參與外在途徑、內在途徑或兩者中。本發明之嵌合分子可用於治療止血病症，例如已知可用嵌合分子中存在的特定凝結因子治療的止血病症。可藉由投與本發明之嵌合分子來治療的止血病症包括但不限於A型血友病、B型血友病、馮威里氏病、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏，以及血纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或結構異常。
在一個實施例中，止血病症為遺傳性病症。在一個實施例中，受試者患有A型血友病，且嵌合分子包含與GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子及XTEN多肽聯結或締合的活化FVII。在另一實施例中，受試者患有B型血友病，且嵌合分子包含與GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子及XTEN多肽鍵聯或關聯的活化FVII。在一些實施例中，受試者具有FVIII或FVIIIa的抑制抗體，且嵌合分子包含與GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子及XTEN多肽聯結或締合的活化FVII。在其他實施例中，受試者具有抵抗FIX或FIXa的抑制抗體，且嵌合分子包含與GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子及XTEN多肽聯結或締合的活化FVII。
包含FVII的本發明之嵌合分子可用於預防性治療患有止血病症的受試者。包含FVII的本發明之嵌合分子可用於治療患有止血病症的受試者的急性出血事件。
在一個實施例中，止血病症為凝結因子(例如FVII、FIX或FVIII)缺乏之結果。在另一實施例中，止血病症可為缺陷型凝結因子之結果。在另一實施例中，止血病症可為後天病症。後天病症可由潛在繼發性疾病或病狀導致。舉例而言，無關病狀可為但不限於癌症、自體免疫疾病或妊娠。後天病症可由高齡或由治療潛在繼發性病症之藥劑(例如癌症化療)導致。
本發明亦係關於治療未患有止血病症或導致獲得止血病症的繼發性疾病或病狀的受試者的方法。因此，本發明係關於一種治療需要一般止血藥劑的受試者的方法，其包含投與治療有效量的本發明之至少一種嵌合分子。舉例而言，在一個實施例中，需要一般止血藥劑的受試者正經歷或將經歷手術。可在手術之前或之後投與本發明之嵌合分子作為預防。可在手術期間或之後投與本發明之嵌合分子以控制急性出血事件。手術可包括但不限於肝移植、肝切除或幹細胞移植。在另一實施例中，本發明之嵌合分子可用於治療患有急性出血事件而未患有止血病症的受試者。急性出血事件可由嚴重外傷導致，例如手術、車禍、創傷、槍擊裂傷(laceration gun shot)或導致不受控制之出血的任何其他創傷性事件。
現已詳細描述本發明，藉由參考以下實例將 更明確地瞭解本發明，該等實例係僅出於說明目的包括於此且不意欲限制本發明。本文中提及之所有專利及公開案皆以全文引用的方式明確併入本文中。
實例 一般材料及方法
一般而言，除非另外指示，否則本發明之實踐係採用以下習知技術：化學、生物物理學、分子生物學、重組DNA技術、免疫學(尤其例如抗體技術)及標準電泳技術。參見例如，Sambrook,Fritsch及Maniatis,Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series,169),McCafferty編，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow等人，CS.H.L.Press,Pub.(1999)；及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人編，John Wiley & Sons(1992)。
實例1 血小板靶向抗體之識別及表徵
根據此項技術中已知的方法，自用含有編碼GPIIb/IIIa之DNA序列(SEQ ID NO：183及184)之質體免疫的BALB/C小鼠產生融合瘤。隨後，使用流式細胞測量 術針對結合至人類及石蟹獼猴血小板或使用酶聯免疫吸附分析法(ELISA)針對結合至GPIIb/IIIa對融合瘤進行篩選。為測定與人類及猴血小板的結合，用融合瘤上清液培育Tyrode氏緩衝液中經凝膠純化的人類或猴(石蟹獼猴)血小板。在30分鐘培育之後，將細胞於1%甲醛中固定。在固定之後，將細胞於Tyrode氏緩衝液中洗滌，且添加偵測抗體(Jackson Immunoresearch的經接合山羊抗小鼠IgG-PE)。抗體結合藉由流式細胞測量術偵測。
融合瘤之上清液與人類GPIIb/IIIa(αIIbβ)的結合如下藉由使用ELISA測定。，將Costar培養板(目錄號3590)用量測緩衝液(20mM Tris，pH 7.4、150mM NaCl、1mM MgCl2及1mM MnCl2)中之100μl/孔的5μg/mL人類GPIIb/IIIa(Calbiochem目錄號528240)塗佈且在37℃下振盪培育持續1小時。使用培養板洗滌器用TBST洗滌孔三次。使用200μl含有每孔5% BSA(牛血清白蛋白，Jackson目錄號001 000 173)的量測緩衝液進行阻斷，且在37℃下振盪培育1小時。將100μL融合瘤上清液添加於分析孔中，在37℃下振盪培育1小時，且用TBST洗滌三次。添加於量測緩衝液中之山羊抗小鼠IgGHRP(Southern Biotech(目錄號101005)之1：10,000稀釋液，在37℃下振盪培育1小時，且用TBST洗滌三次。使用TMB對HRP存在進行顯影，且使用Molecular Devices培養板讀取器在450nm下讀取O.D.。
將在ELISA分析中測試呈陽性的融合瘤的上 清液與血小板混合，且如下使用流式細胞測量術針對血小板活化進行篩選。
(a)試劑：檸檬酸化人類全血；瓊脂糖2B珠粒(GE Healthcare)；具有1mg/mL BSA的Tyrode氏緩衝液(無鈣)；具有5mM CaCl2及1mg/mL BSA的Tyrode氏緩衝液；32%聚甲醛(paraformaldehyde)(PFA)(EM Sciences)；PAC1 FITC抗體(BD目錄號340507)；CD62 PE抗體(BD目錄號555524)；ADP；SFFLRN肽(Anaspec，目錄號24191)；IV.3Fabb抗CD32(StemCell，目錄號01470)。
(b)血小板純化：裝填10mL瓊脂糖2B珠粒管柱且用30mL含有1mg/mL BSA的Tyrode氏緩衝液加以平衡。將體積為1至1.5mL的富含血小板的血漿(PRP)裝載至平衡瓊脂糖管柱上，且使其藉由重力進入裝填珠粒中，接著裝載近似5mL的Tyrode氏緩衝液。收集含有血小板之渾濁液滴。
(c)分析：首先，將融合瘤上清液之50μL等分試樣添加至96孔圓底培養板之分析孔中。將10μL PAC1 FITC及10μL CD62PE添加至所有對照及分析孔中。將10μL ADP及10μL SFFLRN添加至所有對照孔中(無融合瘤上清液)。將10μL IV.3抑制劑(FcγRIIA之抗體)添加至孔中以觀察活化為Fc介導還是抗體介導。接著，將濃縮靜止血小板之50μL等分試樣添加至所有孔中，該等分試樣係如上文所述來純化。在黑暗中且在室溫下培育培養板30分鐘。在室溫下，將細胞用1% PFA(最終濃度)固定10 分鐘(添加與各孔之內容物體積相同的2% PFA)。固定之後，藉由流式細胞測量術分析樣品。
選擇在結合至GPIIb/IIIa之後未活化血小板的抗體作為凝結因子靶向部分之候選者。將在結合至GPIIb/IIIa之後活化血小板的抗體排除在選擇之外。
抗體亦可藉由經由Fc區結合至FcγRIIA受體而活化血小板，不將其排除在選擇之外，因為其抗原結合部分不含有Fc區且因此不結合至FcγRIIA受體。此等抗體可藉由用抑制劑阻斷FcγRIIA受體來識別。
對非活化融合瘤的上清液進行其他表徵分析(i)以確認抗體結合至人類及石蟹獼猴血小板，(ii)以測定抗體對GPIIb/IIIa之α及/或β子單元的結合特異性，及(iii)以判定抗體是否可與血纖維蛋白原競爭結合至血小板。血纖維蛋白原為GPIIb/IIIa之天然配位體，且其對GPIIbIIIa的結合對於介導血小板聚集而言為重要的。因此，將與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa的抗體排除在選擇之外。
使用ELISA評估結合至GPIIb/IIIa之α及/或β子單元之抗體，而使用流式細胞測量術評估抗體與血纖維蛋白原的競爭。根據VH域序列相似性、α或β子單元特異性、與血纖維蛋白原競爭的能力及經由ELISA及流式細胞測量術量測的訊號之相對強度，將測定為非活化的抗體(例如純系34D10、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、12B2、38F6、13C1、5C4、 23C10、37C7、28C2、9D6、13A1)聚集成6個不同組(參見表3)。
*=未測序。
HC=重鏈(亦即VH)。LC=輕鏈(亦即VL)
#：α子單元或複合物特異性
$：β子單元特異性
使用上文所述的篩選方法識別的若干非活化抗體共用相同VH或VL域，如表3中所展示。舉例而言，35D1及34D10共用相同VH域。
對應於上文識別的抗體之VH及VL域的多重序列比對分別展示於表4及表5中。多重序列比對展示VH及VL域中互補決定區CDR1、CDR2及CDR3之位置及其根據EU編號系統之位置(Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.，及Foeller,C.(1991)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」第4版，美國政府印刷局(U.S.Govt.Printing Off).第165-492號，Nethesda,MD)。
圖6展示一致性百分比矩陣，其展示圖4及圖5中多重序列比對中所展示的各對VH及VL序列中的序列一致性百分比。行符號對應於應用於矩陣中各列的符號。舉例而言，行2對應於「2：SEQ 22-9D6LC」。根據抗體對GPIIb/IIIa之α或β子單元的特異性(參見圖7及圖8)及根據其與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa的能力(參見圖9及圖10)，將圖4及圖5中所比對的序列聚集。
實例2 包含抗GPIIb/IIIa抗體、XTEN及FVIIa的血小板靶向嵌合分子的構建
抗GPIIb/IIIa的單株抗體用於將FVIIa凝結因 子靶向血小板表面。因此，使用此項技術中已知的分子生物學方法將來源於第II.A.1.部分中所識別的血小板特異性單株抗體之scFv融合至FVIIa。將構築體於HEK 293細胞中瞬時表現且藉由此項技術中可利用的標準方法純化。在所得嵌合分子中，將FVIIa之重鏈之C端融合至包含來源於非活化血小板靶向抗體之VH及VL域的scFv之N端，且將FVII之輕鏈之C端融合至XTEN多肽之N端(參見表2A)。將包含融合至FVII之重鏈的來源於GPIIb/IIIa α子單元特異性34D10抗體之scFv及融合至FVII之輕鏈的XTEN多肽的嵌合分子表示為「FVII-211」。將包含FVII之輕鏈及融合肽的第二嵌合分子表示為「FVII-200」，該融合肽由FVII之重鏈、XTEN多肽(亦即AE288)及來源於GPIIb/IIIa α子單元特異性34D10抗體之scFv組成。將包含FVII及來源於GPIIb/IIIa α子單元特異性34D10抗體之scFv的嵌合分子表示為「FVII-189」，該scFv融合至FVII之重鏈之C端。表徵此等血小板靶向FVIIa變異體結合至血小板之能力、其促凝血活性及其在動物中的藥物動力學性質。
實例3 XTEN改良rFVIIa之藥物動力學性質但降低其活性
為評估藥物動力學性質，向HemA小鼠投與20nmol/kg的rFVIIa或FVIIa-XTEN之單次靜脈內劑量。在給藥之後各種時間收集血漿樣品，且藉由FVIIa特異 性、可溶性組織因子依賴性凝血酶原時間(sTF-PT)分析測定FVIIa活性(圖11A)。藉由使用Phoenix 6程式(Pharsight)得到PK參數。
如圖11A及表4中所展示，聯結至rFVIIa之C端的XTEN在HemA小鼠中使FVIIa之循環半衰期延長約8倍。其他PK參數同樣得以改良，如在血漿活性對比時間圖表(圖11A)中，由平均滯留時間(MRT)自0.82小時增加至11小時及劑量正規化的曲線下面積(AUC)粗略增加5倍所指示。
- 藉由Phoenix 6(Pharsight)產生之PK參數。
儘管XTEN改良rFVIIa之藥物動力學，然而如藉由ROTEM在人類A型血友病血液中所量測，rFVIIa-XTEN之凝結活性降低至rFVIIa的約25%(圖11B)。
實例4 將血小板靶向與XTEN組合增大其活性且改良PK
將rFVIIa或rFVIIa-XTEN靶向至血小板可導致位於凝血位點(血小板)處蛋白質之局部濃度升高，由此增強凝結活性。構建血小板靶向嵌合分子FVII-200、FVII-211及FVII-189以含有作為靶向部分的來自單株抗 體34D10之scFv。構築體之結構在上文所述。所有三種分子皆能夠以劑量依賴性方式結合至人類血小板(圖12A)，且此結合依賴於34D10。然而，在此分析中rFVIIa自身不具有可偵測的血小板結合活性。因此，34D10之scFv可將rFVIIa(FVII-189)或rFVIIa-XTEN(FVII-200及FVII-211)引導至血小板。
由於血小板結合能力，當藉由ROTEM在人類A型血友病血液中分析時，34D10靶向rFVIIa-XTEN嵌合分子顯示凝結活性增強(圖12B)。基於由ROTEM記錄的凝結時間，估算FVII-200之活性比rFVIIa之活性大2至5倍。相較而言，rFVII-XTEN之活性僅為rFVIIa之活性的25%(圖11B)。因此，藉由34D10將rFVIIa-XTEN靶向至血小板產生活性之實質改良。
儘管單株抗體34D10未結合至小鼠血小板，然而其結合至人類αIIb基因轉殖(Tg)小鼠(hallb+/mallb-)之血液中的血小板。此外，34D10靶向FVIIa(FVII-189)及FVIIa-XTEN(FVII-200及FVII-211)保留其結合至人類αIIb Tg小鼠之血小板的能力(圖13A)，因此證明使用此等Tg小鼠以評估含有34D10的rFVIIa嵌合分子的藥物動力學性質。
如圖13B中所展示，αIIb Tg小鼠中血小板結合FVIIa嵌合分子之清除率用兩相衰減模型來擬合。相較於34D10靶向rFVIIa(FVII-189)，添加XTEN(FVII-200及FVII-211)延長其終末半衰期，但亦減緩初始α相衰 減。應注意，PK改良受XTEN置放位置之影響，由於FVII-200之PK概況顯著好於FVII-211之PK概況。改良的PK性質與凝結活性比rFVIIa好2至5倍證實此嵌合分子有可能延長治療效力。
實例5 XTEN及靶向部分交替置放的血小板靶向FVIIa XTEN嵌合分子
使用來自單株抗體PDG13之scFv，構建包含FVIIa、PDG13及XTEN的一類嵌合分子(圖14)，將其於HEK 293細胞中表現且加以純化。在所測試的PDG13及XTEN構築體之交替置放(圖14C、14D、14E、14F)中，在輕鏈含有XTEN且在rFVIIa之重鏈含有PDG13(圖14F)的FVII-179最具活性。當與rFVIIa之凝結活性比較時，FVII-179顯示在人類A型血友病血液中凝結活性增大5倍(圖15B)。所有其他嵌合分子，亦即FVII-175(圖14C、15C)、FVII-178(圖14D、15A、15D)、FVII-177(圖14D、15D)展示與rFVIIa之凝結活性相當的凝結活性，其表示超過FVII-165之數倍改良(圖14B)，該FVII-165為包含rFVIIa及XTEN融合物而不具有血小板靶向部分之嵌合分子。
研究靶向部分對PK的影響。如圖16中所展示，當在NSG小鼠中分析所投與蛋白質在所轉輸的人類血小板上隨時間的恢復率時，FVII-211展示在蛋白質投與 之後5分鐘的所有時間恢復率高於FVII-179，從而指示FVII-211之血小板的清除率比FVII-179之血小板的清除率慢，儘管該等兩種蛋白質除血小板靶向部分之外在結構上一致，其中FVII-211為34D10及FVII-179為PDG13。結果指示，靶向部分可有助於PK改良。
實例6 活體外活性增強且小鼠中半衰期延長的重組因子FVIIa融合蛋白質
為達成半衰期延長以潛在地實現預防，研究XTEN技術之用途。XTEN序列為非結構性蛋白質序列，其包含六種不同胺基酸(G、S、E、T、A、P)之重複序列，當將其添附加至治療肽及蛋白質時賦予改良的藥物動力學性質(圖17)。XTEN技術增大融合蛋白質之流體動力學半徑，預防腎清除，且可防護以免清除受體及/或蛋白酶裂解。重組體本質上允許在無化學修飾的情況下精確控制組成、長度及置放，包括多重插入物。XTEN含有天然胺基酸，其可在活體內產生代謝，如活體外以腎均質物的情況下所證明。(圖17B)將XTEN AE 288序列重組融合至rFVIIa之C端且進行活體外及活體內表徵。目標為利用XTEN技術延長FVIIa之半衰期以潛在地在具有抑制劑的患血友病人中實現預防。
將XTEN聯結至rFVIIa之C端在A型血友病小鼠中延長其循環半衰期8倍(圖18)，且產生總體藥物暴 露(AUC)增大5倍。然而，rFVIIa-XTEN之活性基於ROTEM分析降低至rFVIIa的近似25%。在A型血友病小鼠中測試scFv及XTEN與rFVIIa之融合物的許多構型之藥物動力學，且在ROTEM分析測試活性。最佳構型引起半衰期及對rFVIIa之總體暴露(AUC)顯著增加(圖19)，以及如藉由ROTEM所量測，使活性增大超過rFVIIa 2倍至5倍。
總之，血小板靶向rFVIIa分子藉由ROTEM顯示比rFVIIa活性增大25倍至50倍，不活化或抑制血小板功能，及/或不影響血小板活體內清除。對血小板靶向rFVIIa應用XTEN技術實現半衰期延長超過rFVIIa 8倍，但ROTEM活性下降4倍。血小板靶向及XTEN技術之組合證明：XTEN及scFv部分之最佳構型產生AUC之6倍增加，以及使ROTEM活性之2倍至5倍增大。該技術組合可引起利用野生型FVII序列之繞道療法改良。
實例7 血小板靶向構築體FVII-227、FVII-228、FVII-231、FVII-232、FVII-242、FVII-243及FVII-238的構建及表現
產生血小板靶向rFVIIa-XTEN變異體之三種(3)構型：構型A(FVII-227、FVII-228、FVII-211)，將XTEN及靶向部分分別融合至FVIIa之輕鏈及重鏈之C端；構型B(FVII-231、FVII-232、FVII-200)，將XTEN及血小板靶向部分均融合至rFVIIa之重鏈之C端；及構 型C(FVII-242、FVII-243及FVII-238)，將XTEN融合至重鏈及輕鏈之C端，靶向部分位於重鏈XTEN之C端。對於各種構型而言，測試72至288個胺基酸之範圍內的多個XTEN長度。使用此項技術中已知的分子生物學方法產生編碼該等蛋白質之DNA。將構築體於HEK 293細胞中瞬時表現且藉由標準方法進行純化。
實例8 蛋白質FVII-165、FVII-189、FVII-200、FVII-227、FVII-228、FVII-231、FVII-232、FVII-242、FVII-243及FVII-238之活性的表徵
該等變異體之活性係藉由血小板非依賴性(sTF-PT)及血小板依賴性(ROTEM)方法進行表徵。基於sTF-PT方法，所有構型中血小板靶向rFVIIa-XTEN變異體之特異性活性以莫耳計小於rFVIIa(圖20A-C)。構型A變異體顯示最高特異性活性，其在rFVIIa之44%至15%的範圍內，且活性具高度依賴性且與XTEN長度反向關聯。構型B變異體之活性較低，且對XTEN長度的依賴性較小。構型C構築體藉由該方法展示最低活性。當在來自於A型血友病供體之人類全血中以血小板依賴性方法(ROTEM)測試時，所有構型皆顯示等於或大於rFVIIa之活性的活性(圖21A-C)。構型A變異體藉由該方法顯示最大活性，達到比rFVIIa高15倍之活性，且活性與XTEN長度反向關聯。構型B及C變異體之活性對XTEN 長度的依賴性較小。圖21D展示藉由ROTEM分析，FVII-200(LC：HC-XTEN-靶向部分)證明其FVII活性比FVII-165(LC：HC-XTEN)高。該結果指示，添加血小板靶向部分部分地補償XTEN部分所導致的活性損失。
實例9 XTEN長度對PK之影響
發現具有288個胺基酸之單一XTEN足以達成PK改良。將具有288或864個胺基酸之XTEN分別融合至FVIIa之C端以產生FVIIa-XTEN288及FVIIa-XTEN864。產生蛋白質且自瞬時轉染的HEK293細胞之條件培養基純化。為評估PK，將蛋白質注射至HemA小鼠中，且在給藥後藉由FVIIa依賴性可溶組織因子-凝血酶原時間(sTF-PT)分析來量測各種時間的血漿活性。如圖22中所展示，將XTEN288融合至FVIIa產生較慢的清除，但比288長的XTEN未提供額外的PK益處，指示在單一XTEN的情況下，288個胺基酸的長度對於PK改良而言足夠長。
接著，評估小於具有288個胺基酸之XTEN。在圖23之實驗中，將具有288、144或72個胺基酸之XTEN融合至FVIIa之重鏈之C端，接著單株抗體34D10之單鏈可變區。將蛋白質投與hemA小鼠，且藉由sTF-PT分析量測經給藥小鼠之血漿活性。如圖23所展示，活性恢復率對比時間圖表指示，分別含有具有144及72個胺 基酸之XTEN的FVII232及231之清除比FVII200之清除快，指示將XTEN長度自288個胺基酸減小至144個胺基酸增加小鼠中的清除率。
因為長度少於288個胺基酸之單一XTEN長度不足以提供完全PK益處，所以研究雙XTEN之作用。在圖24之實驗中，將兩個具有72個胺基酸之XTEN融合至FVIIa；將一個插入於FVIIa之重鏈之C端與34D10之N端之間，且將一個聯結至FVIIa之輕鏈之C端。分析所得蛋白質FVII238在HemA小鼠中的血漿活性PK。如圖24中所展示，具有僅72個胺基酸之雙XTEN各自將清除率自109ml/h/kg降低至約15ml/h/kg，使得HemA小鼠中總蛋白質暴露增加7倍。此PK改良與具有288個胺基酸之單一XTEN(FVII-200，圖24)之PK改良相當或更好。
亦評估人源化αIIb基因轉殖小鼠中FVII-238之PK。在圖25之實驗中，將FVII-238注射至αIIb小鼠中，且在給藥後各種時間經由尾靜脈收集全血。使用抗人類FVII之螢光標記抗體藉由流式細胞測量術量測血小板上之FVII蛋白質濃度。將FVII-200及FVII-189類似地給藥及分析。如圖25中所展示，含有來自抗體34D10之血小板結合單鏈可變區的FVII-189顯示經典的兩相衰減：在相似於循環中rFVIIa速率的速率下之快速初始相，及顯著比rFVIIa速率慢的終止相。添加具有288個胺基酸之單一XTEN(FVII-200)或各具有72個胺基酸之雙XTEN (FVII-238)急劇地降低初始清除率，得到相似改良的PK概況。有趣的是，就雙XTEN而言，將一個XTEN之重鏈(FVII-243)或輕鏈(FVII-242)長度自72減少至42，導致清除率增加(圖26)，如藉由圖25中所述的血小板PK所量測。
因此，聯結至rFVIIa之重鏈之C端的具有288個胺基酸之單一XTEN(亦即FVII-200)或一個融合至重鏈且一個融合至輕鏈的具有72個胺基酸之雙XTEN(亦即FVII-238)改良血小板靶向FVIIa之藥物動力學，使得總暴露(AUC)增加6至7倍。
實例7-9展示，除了其他情況之外，有可能藉由產生具有血小板靶向基序之FVIIa變異體(針對血小板受體GPIIbIIIa之scFv)在融合至XTEN部分時改良rFVIIa之活性及藥物動力學性質。為分別使XTEN及血小板靶向對PK及活性的影響最大化，產生血小板靶向rFVIIa-XTEN變異體的3種構型：構型A，將XTEN及靶向部分分別融合至FVIIa之輕鏈及重鏈之C端；構型B，將XTEN融合至rFVIIa之重鏈之C端，同時將靶向部分融合至XTEN之C端；及構型C，將XTEN融合至重鏈及輕鏈兩者之C端，同時靶向部分位於重鏈XTEN之C端。對於各種構型而言，測試在72至288個胺基酸之範圍內的多個XTEN長度。
基於血小板非依賴方法(sTF-PT)，所有構型中該等變異體之特異性活性以莫耳計小於rFVIIa之特異性 活性。構型A變異體顯示最高特異性活性，其與rFVIIa之特異性活性的44%一樣高，且XTEN於重鏈之C端處的置放(構型B)具有對基於sTF之活性更高的影響。構型C變異體藉由該方法展示最低活性。然而，當藉由ROTEM在全血中以血小板依賴性方法測試時，所有構型顯示活性等於或大於rFVIIa之活性。構型A變異體藉由該方法顯示最高特異性活性，達到活性比rFVIIa高15倍。一般而言，XTEN元件之長度與活性反向關聯。為評估XTEN部分對血小板靶向之影響，藉由生物層干涉術量測來自各種構型之代表性變異體與GPIIb/IIIa之結合。該等分析揭露，血小板靶向FVIIa-XTEN變異體對GPIIb/IIIa之親和力與XTEN長度反向關聯。藉由組合血小板靶向與XTEN技術，已在全血凝血分析中產生比rFVIIa更有效的rFVIIa變異體。在一些狀況下，XTEN可影響rFVIIa變異體對αIIbβ3之親和力。因此，儘管XTEN可改良rFVIIa之藥物動力學性質，但必須最佳化其置放及長度來使血小板靶向技術的影響最大化。
實例5至9進一步展示可使XTEN與不同長度整合。基於藉由FVIIa特異性可溶組織因子-凝血酶原時間(sTF-PT)分析所量測的A型血友病小鼠的血漿活性PK，對於用單一XTEN改良PK而言，發現長度為288個胺基酸(XTEN288)為足夠的，因為具有864個胺基酸之XTEN未提供額外PK益處。研究單一XTEN288以改良αIIbβ3靶向FVIIa之PK。研究顯示止血活性與FVIIa相 等或比其更好的兩種構型：1)重鏈XTEN，其中將XTEN288融合至重鏈且將αIIbβ3-scFv進一步聯結至XTEN288，及2)輕鏈XTEN，其中將αIIbβ3-scFv融合至重鏈且將XTEN288融合至輕鏈。在循環中的血小板上，重鏈XTEN之清除比輕鏈XTEN之清除慢，如藉由在人源化αIIb基因轉殖小鼠中的血小板PK分析所判斷，其中使用螢光標記FVII抗體藉由流式細胞測量術對血小板結合蛋白質進行定量。當與rFVIIa比較時，重鏈XTEN之血漿活性PK分析指示清除降低約7倍及總暴露增加6倍。儘管將XTEN長度減少至144或72增加清除率，但連接兩個具有72個胺基酸之XTEN(一個連接至重鏈且一個連接至輕鏈)有效地將血小板及血漿PK改良至相似於重鏈XTEN288之PK的程度。
已藉助於說明特定功能之實行方案及其關係的功能性建構基元在上文描述本發明。為便於描述，本文中將該等功能性建構基元之邊界已任意地定義。可定義可替代邊界，只要適當地執行特定功能及其關係即可。
特定實施例之前文描述將充分地揭露本發明之一般特性，以使得其他人藉由應用此項技術中之知識，在無不當實驗且不背離本發明之一般概念的情況下，可輕易地針對各種應用對此等特定實施例進行修改及/或改變。因此，基於本文呈現之教示及指導，此等改變及修改意欲在所揭示實施例之等效物的含義及範圍內。應瞭解，本文之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，以使得本 說明書之術語或措辭應由熟習此項技術者根據教示及指導進行解釋。
本發明之廣度及範疇不應受任何上述示範性實施例限制，而應僅根據以下申請專利範圍及其等效物定義。自本文所揭示的本發明之說明書及實踐的考慮，本發明之其他實施例對熟習此項技術者而言將為顯而易見的。
本文所述之所有專利及出版物皆以全文引用之方式併入本文中。
序列說明
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>SEQ_ID_NO：151 37C7 LC* CDR2 測序_未決
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SEQ ID NO：153 >CTP肽1 DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL
SEQ ID NO：154 >CTP肽2 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ
SEQ ID NO：155 >PAS肽1 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA
SEQ ID NO：156 >PAS肽2 AAPASPAPAAPSAPAPAAPS
SEQ ID NO：157 >PAS肽3 APSSPSPSAPSSPSPASPSS
SEQ ID NO：158 >PAS肽4 APSSPSPSAPSSPSPASPS
SEQ ID NO：159 >PAS肽5 SSPSAPSPSSPASPSPSSPA
SEQ ID NO：160
>PAS肽6 AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA
SEQ ID NO：161 >PAS肽7 ASAAAPAAASAAASAPSAAA
SEQ ID NO：162 >白蛋白結合肽核心序列DICLPRWGCLW
SEQ ID NO：163 >GFP蛋白質序列 (基因庫ID AAG34521.1)
SEQ ID NO：164 >實例：單鏈人類IgG1 Fc。(具有加底線之Gly/Ser連接子的Fc序列。)
SEQ ID NO：165 >成熟人類白蛋白蛋白質序列(來源於NCBI參考序列NP_000468)：
SEQ ID NO：166 >連接子，n=0、1、2、3、4或4以上(GGGS)n
SEQ ID NO：167 >白蛋白結合肽1 RLIEDICLPRWGCLWEDD
SEQ ID NO：168 >白蛋白結合肽2 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF
SEQ ID NO：169 >白蛋白結合肽3 QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK
SEQ ID NO：170 >白蛋白結合肽4 GEWWEDICLPRWGCLWEEED
SEQ ID NO：171 >含有半胱胺酸之肽GGGSGCGGGS
SEQ ID NO：172 >人類LRP1序列(訊號肽及跨膜區段加底線；NCBI參考序列：CAA32112)
SEQ ID NO：173 >生物素受體肽(BAP) LNDIFEAQKIEWH
SEQ ID NO：174 >硫辛酸受體肽2(LAP2) GFEIDKVWYDLDA
SEQ ID NO：175 >HAP化基序，n=1至400 (Gly4Ser)n
SEQ ID NO：176 >替代連接子PEAPTDPEAPTD
SEQ ID NO：177 >CTP DSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ
SEQ ID NO：178 >FVII-HC PPT
SEQ ID NO：179 >FVII-LC PPT
SEQ ID NO：180 >FVII HC DNA.
SEQ ID NO：181 >FVII LC DNA
SEQ ID NO：182 >插人物
SEQ ID NO：183 >人類GPIIb。訊號序列(1-31)。跨膜(981-1019)。細胞質(1020-1039)
SEQ ID NO：184 >人類GPIIIa。訊號序列(1-26)。跨膜(719-747)。細胞質(748-788)
SEQ ID NO：185 >人類GPIIb DNA。
SEQ ID NO：186 >人類GPIIIa DNA
SEQ ID NO：187 >FVII-165之DNA序列
SEQ ID NO：188 >FVII-175之DNA序列
SEQ ID NO：189 >FVII-177之DNA序列
SEQ ID NO：190 >FVII-178之DNA序列
SEQ ID NO：191 >FVII-179之DNA序列
SEQ ID NO：192 >FVII-200之DNA序列
SEQ ID NO：193 >FVII-211之DNA序列
SEQ ID NO：269 FVII-227 DNA序列
SEQ ID NO：270 FVII-228 DNA序列
SEQ ID NO：271 FVII-231 DNA序列
SEQ ID NO：272 FVII-232 DNA序列
SEQ ID NO：273 FVII-242 DNA序列
SEQ ID NO：274 FVII-243 DNA序列
SEQ ID NO：275 FVII-238 DNA序列
SEQ ID NO：＿ FVII-189 DNA序列
<110> 拜健艾克麻州股份有限公司
<120> 嵌合FVII-XTEN分子及其用途
<130> 2159.422PC04/C-K/C-Q
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<160> 275
<170> PatentIn 3.5版
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<213> 人工序列
<220>
<223> 18F7 LC CDR2
<400> 62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18F7 LC CDR3
<400> 63
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12B2 HC CDR1
<400> 64
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12B2 HC CDR2
<400> 65
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12B2 HC CDR3
<400> 66
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12B2 LC CDR1
<400> 67
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12B2 LC CDR2
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12B2 LC CDR3
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38F6 HC CDR1
<400> 70
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38F6 HC CDR2
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38F6 HC CDR3
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C4 HC CDR2
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C4 HC CDR3
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 23C10 HC CDR2
<400> 77
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 23C10 HC CDR3
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28C2 HC CDR1
<400> 79
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28C2 HC CDR2
<400> 80
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28C2 HC CDR3
<400> 81
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28C2 LC CDR1
<400> 82
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28C2 LC CDR2
<400> 83
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28C2 LC CDR3
<400> 84
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 9D6 HC CDR1
<400> 85
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 9D6 HC CDR2
<400> 86
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 9D6 HC CDR3
<400> 87
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 9D6 LC CDR1
<400> 88
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 9D6 LC CDR2
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 9D6 LC CDR3
<400> 90
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28F4 HC CDR1
<400> 91
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28F4 HC CDR2
<400> 92
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28F4 HC CDR3
<400> 93
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28F4 LC CDR1
<400> 94
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28F4 LC CDR2
<400> 95
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 28F4 LC CDR3
<400> 96
<210> 97
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 35D1 HC
<400> 97
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 35D1 LC
<400> 98
<210> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B11 LC
<400> 99
<210> 100
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38G8 HC
<400> 100
<210> 101
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38G8 LC
<400> 101
<210> 102
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21F10 HC
<400> 102
<210> 103
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21F10 LC
<400> 103
<210> 104
<400> 104
000
<210> 105
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13C1 HC
<400> 105
<210> 106
<400> 106
000
<210> 107
<400> 107
000
<210> 108
<400> 108
000
<210> 109
<400> 109
000
<210> 110
<400> 110
000
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 35D1 HC CDR1
<400> 111
<210> 112
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 35D1 HC CDR2
<400> 112
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 35D1 HC CDR3
<400> 113
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 35D2 LC CDR1
<400> 114
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 35D2 LC CDR2
<400> 115
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 35D2 LC CDR3
<400> 116
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B11 LC CDR1
<400> 117
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B11 LC CDR2
<400> 118
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4B11 LC CDR3
<400> 119
<210> 120
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38G8 HC CDR1
<400> 120
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38G8 HC CDR2
<400> 121
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38G8 HC CDR3
<400> 122
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38G8 LC CDR1
<400> 123
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38G8 LC CDR2
<400> 124
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38G8 LC CDR3
<400> 125
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21F10 HC CDR1
<400> 126
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21F10 HC CDR2
<400> 127
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21F10 HC CDR3
<400> 128
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21F10 LC CDR1
<400> 129
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21F10 LC CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 21F10 LC CDR2
<400> 130
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 21F10 LC CDR3
<400> 131
<210> 132
<400> 132
000
<210> 133
<400> 133
000
<210> 134
<400> 134
000
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13C1 HC CDR1
<400> 135
<210> 136
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13C1 HC CDR2
<400> 136
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13C1 HC CDR3
<400> 137
<210> 138
<400> 138
000
<210> 139
<400> 139
000
<210> 140
<400> 140
000
<210> 141
<400> 141
000
<210> 142
<400> 142
000
<210> 143
<400> 143
000
<210> 144
<400> 144
000
<210> 145
<400> 145
000
<210> 146
<400> 146
000
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 37C7 HC CDR1
<400> 147
<210> 148
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 37C7 HC CDR2
<400> 148
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 37C7 HC CDR3
<400> 149
<210> 150
<400> 150
000
<210> 151
<400> 151
000
<210> 152
<400> 152
000
<210> 153
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP肽1
<400> 153
<210> 154
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP肽2
<400> 154
<210> 155
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽1
<400> 155
<210> 156
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽2
<400> 156
<210> 157
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽3
<400> 157
<210> 158
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽4
<400> 158
<210> 159
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽5
<400> 159
<210> 160
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽6
<400> 160
<210> 161
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽7
<400> 161
<210> 162
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合肽核心序列
<400> 162
<210> 163
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP蛋白質序列
<400> 163
<210> 164
<211> 474
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
<210> 165
<211> 591
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
<210> 166
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 166
<210> 167
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合肽1
<400> 167
<210> 168
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合肽2
<400> 168
<210> 169
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合肽3
<400> 169
<210> 170
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合肽4
<400> 170
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有半胱胺酸之肽
<400> 171
<210> 172
<211> 4544
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
<210> 173
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素受體肽(BAP)
<400> 173
<210> 174
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 硫辛酸受體肽2(LAP2)
<400> 174
<210> 175
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HAP化基序(可重複至多400次)
<400> 175
<210> 176
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 替代連接子
<400> 176
<210> 177
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP
<400> 177
<210> 178
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
<210> 179
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人
<400> 179
<210> 180
<211> 762
<212> DNA
<213> 智人
<400> 180
<210> 181
<211> 456
<212> DNA
<213> 智人
<400> 181
<210> 182
<400> 182
000
<210> 183
<211> 1039
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(31)
<223> (人類GPIIb)訊號肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (981)..(1019)
<223> (人類GPIIb)跨膜
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1020)..(1039)
<223> (人類GPIIb)細胞質
<400> 183
<210> 184
<211> 788
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(26)
<223> (人類GPIIIa)訊號肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (719)..(747)
<223> (人類GPIIIa)跨膜
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (748)..(788)
<223> (人類GPIIIa)細胞質
<400> 184
<210> 185
<211> 6238
<212> DNA
<213> 智人
<400> 185
<210> 186
<211> 4734
<212> DNA
<213> 智人
<400> 186
<210> 187
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-165之DNA序列
<400> 187
<210> 188
<211> 3147
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-175之DNA序列
<400> 188
<210> 189
<211> 3162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-177之DNA序列
<400> 189
<210> 190
<211> 3069
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-178之DNA序列
<400> 190
<210> 191
<211> 3264
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-179之DNA序列
<400> 191
<210> 192
<211> 3042
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-200之DNA序列
<400> 192
<210> 193
<211> 3228
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-211之DNA序列
<400> 193
<210> 194
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AD家族基序
<400> 194
<210> 195
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AD家族基序
<400> 195
<210> 196
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AD家族基序
<400> 196
<210> 197
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AD家族基序
<400> 197
<210> 198
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE,AM家族基序
<400> 198
<210> 199
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE,AM,AQ家族基序
<400> 199
<210> 200
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE,AM,AQ家族基序
<400> 200
<210> 201
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE,AM,AQ家族基序
<400> 201
<210> 202
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AF,AM家族基序
<400> 202
<210> 203
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AF,AM家族基序
<400> 203
<210> 204
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AF,AM家族基序
<400> 204
<210> 205
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AF,AM家族基序
<400> 205
<210> 206
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG,AM家族基序
<400> 206
<210> 207
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG,AM家族基序
<400> 207
<210> 208
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG,AM家族基序
<400> 208
<210> 209
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG,AM家族基序
<400> 209
<210> 210
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ家族基序
<400> 210
<210> 211
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ家族基序
<400> 211
<210> 212
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ家族基序
<400> 212
<210> 213
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ家族基序
<400> 213
<210> 214
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ家族基序
<400> 214
<210> 215
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ家族基序
<400> 215
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC家族基序
<400> 216
<210> 217
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC家族基序
<400> 217
<210> 218
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC家族基序
<400> 218
<210> 219
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC家族基序
<400> 219
<210> 220
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BD家族基序
<400> 220
<210> 221
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BD家族基序
<400> 221
<210> 222
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BD家族基序
<400> 222
<210> 223
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BD家族基序
<400> 223
<210> 224
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE42
<400> 224
<210> 225
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE42(2)
<400> 225
<210> 226
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE42(3)
<400> 226
<210> 227
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE72
<400> 227
<210> 228
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE72(2)
<400> 228
<210> 229
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE72(3)
<400> 229
<210> 230
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE144
<400> 230
<210> 231
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE144(2)
<400> 231
<210> 232
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE144(3)
<400> 232
<210> 233
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AG144
<400> 233
<210> 234
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE288
<400> 234
<210> 235
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AG288
<400> 235
<210> 236
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE576
<400> 236
<210> 237
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AG576
<400> 237
<210> 238
<211> 864
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AE864
<400> 238
<210> 239
<211> 864
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN AG864
<400> 239
<210> 240
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 240
<210> 241
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 241
<210> 242
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 242
<210> 243
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 243
<210> 244
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 244
<210> 245
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 245
<210> 246
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 246
<210> 247
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 247
<210> 248
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 248
<210> 249
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 249
<210> 250
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 250
<210> 251
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 251
<210> 252
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 252
<210> 253
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 253
<210> 254
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 254
<210> 255
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 255
<210> 256
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 256
<210> 257
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 257
<210> 258
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 258
<210> 259
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 259
<210> 260
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 260
<210> 261
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 261
<210> 262
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 262
<210> 263
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 263
<210> 264
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 264
<210> 265
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 265
<210> 266
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 266
<210> 267
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 267
<210> 268
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘胺酸絲胺酸肽連接子
<400> 268
<210> 269
<211> 2616
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-227之DNA序列
<400> 269
<210> 270
<211> 2832
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-228之DNA序列
<400> 270
<210> 271
<211> 2418
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-231之DNA序列
<400> 271
<210> 272
<211> 2634
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-232之DNA序列
<400> 272
<210> 273
<211> 2751
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-242之DNA序列
<400> 273
<210> 274
<211> 2751
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-243之DNA序列
<400> 274
<210> 275
<211> 2841
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FVII-238之DNA序列
<400> 275

Claims (122)

  1. 一種嵌合分子，其包含因子VII(「FVII」)、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子顯示以下特徵中之一或多者：(a)該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與選自由以下組成之群的抗體特異地結合至相同GPIIb/IIIa抗原決定基：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；(b)該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子競爭地抑制GPIIb/IIIa結合至選自由以下組成之群的抗體：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4；或(c)該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含選自以下者之互補決定區(CDR)的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、或至少六個CDR或其變異體：34D10、12B2、2A2、35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6或28F4。
  2. 如申請專利範圍第1項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含選自由以下組成之群的抗體之六個CDR或其變異體：34D10、12B2、2A2、 35D1、36A8、4B11、1H6、38G8、21F10、38A8、18F7、38F6、13C1、5C4、23C10、37C7、28C2、9D6及28F4。
  3. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：25、31、37、43或111中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：26、32、38、44或112中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：27、33、39、45或113中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：28、34、40、117或114中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：29、35、41、118或115中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：30、36、42、119或116中之任一者至少約60%、70%、80%、90%或95%一致。
  4. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗 GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1，其包含一致序列X1YAMS，其中X1表示胺基酸殘基Thr(T)、Ser(S)或Ala(A)；(ii)VH-CDR2，其包含一致序列SIX2X3GX4X5TYX6X7DSVKX8，其中X2表示胺基酸殘基Ser(S)或Asn(N)，X3表示胺基酸殘基Ser(S)或Gly(G)，X4表示胺基酸殘基Ser(S)或Gly(G)，X5表示胺基酸殘基Ser(S)、Asn(N)或Thr(T)，X6表示胺基酸殘基Tyr(Y)或Phe(F)，X7表示胺基酸殘基Leu(L)或Pro(P)及X8表示胺基酸殘基Gly(G)或Arg(R)；(iii)VH-CDR3，其包含一致序列GGDYGYAX9DY，其中X9表示胺基酸殘基Leu(L)或Met(M)；(iv)VL-CDR1，其包含序列RASSSVNYMY(SEQ ID NO：28)；(v)VL-CDR2，其包含序列YTSNLAP(SEQ ID NO：29)；及，(vi)VL-CDR3，其包含序列QQFSSSPWT(SEQ ID NO：30)。
  5. 如申請專利範圍第4項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：25、31、37、43及111組成之群；(ii)VH-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：26、32、 38、44及112組成之群；(iii)VH-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：27、33、39、45及113組成之群；(iv)VL-CDR1序列，其選自由SEQ ID NO：28、34、40、117及114組成之群；(v)VL-CDR2序列，其選自由SEQ ID NO：29、35、41、118及115組成之群；及，(vi)VL-CDR3序列，其選自由SEQ ID NO：30、36、42、119及116組成之群。
  6. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：1、3、5、7或97中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：2、4、6、99或98中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第6項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：1之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：2之該胺基酸序列(34D10抗體)。
  8. 如申請專利範圍第6項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：3之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：4之該胺基酸序列(2A2抗體)。
  9. 如申請專利範圍第6項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：5之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：6之該胺基酸序列(36A8抗體)。
  10. 如申請專利範圍第6項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：7之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：99之該胺基酸序列(4B11抗體)。
  11. 如申請專利範圍第6項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：97之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：98之該胺基酸序列(35D1抗體)。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之嵌合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之α子單元之細胞外域中或GPIIb/IIIa複合物之細胞外域中的抗原決定基。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子不與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
  14. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：46、52、120或126中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：47、53、121或127中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：48、54、122或128中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：49、55、123或129中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：50、56、124或130中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：51、57、125或131中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
  15. 如申請專利範圍第1、2及14項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：8、10、100或102中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：9、11、101或103中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第15項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：8之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：9之該胺基酸序列(1H6抗體)。
  17. 如申請專利範圍第15項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：10之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：11之該胺基酸序列(38A8抗體)。
  18. 如申請專利範圍第15項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：100之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：101之該胺基酸序列(38G8抗體)。
  19. 如申請專利範圍第15項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：102之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：103之該胺基酸序列(21F10抗體)。
  20. 如申請專利範圍第1、2及14至19項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之該α子單元之該細胞外域中的抗原決定基。
  21. 如申請專利範圍第1、2及14至20項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
  22. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：58至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：59至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：60至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一 致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：61至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：62至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：63至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
  23. 如申請專利範圍第1、2及22項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：12至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：13至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列(18F7抗體)。
  24. 如申請專利範圍第22或23項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之該α子單元之該細胞外域中的抗原決定基。
  25. 如申請專利範圍第22至24項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
  26. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體 或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：64、70或135中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：65、71或136中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：66、72或137中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：67、132或138中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：68、133或139中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：69、134或140中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
  27. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)VH-CDR1，其包含序列SYWIE(SEQ ID NO：64)； (ii)VH-CDR2，其包含一致序列EILPGX14GX15TKYNX16KFKG(SEQ ID NO：__)，其中X14表示胺基酸殘基Ser(S)或Thr(T)，X15表示胺基酸殘基Ile(I)或Tyr(Y)，及X16表示胺基酸殘基Asp(D)或Glu(E)；(iii)VH-CDR3，其包含序列LISYYYAMDY(SEQ ID NO：66)；(iv)VL-CDR1，其包含序列RASQDISNYLN(SEQ ID NO：67)；(v)VL-CDR2，其包含序列YTSRLHS(SEQ ID NO：68)；及，(vi)VL-CDR3，其包含序列QQGNTLPPT(SEQ ID NO：69)。
  28. 如申請專利範圍第1、2、26及27項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：14、16或105中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：15、104或106中之任一者至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
  29. 如申請專利範圍第28項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：14之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：15之該胺基酸序列(12B2抗體)。
  30. 如申請專利範圍第28項之嵌合分子，其中該VH 包含SEQ ID NO：16之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：104之該胺基酸序列(38F6抗體)。
  31. 如申請專利範圍第28項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：105之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：106之該胺基酸序列(13C1抗體)。
  32. 如申請專利範圍第26至31項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之β子單元之細胞外域中的抗原決定基。
  33. 如申請專利範圍第26至32項中任一項之嵌合分子，其中該GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子不與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
  34. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：73、76、79、85或147中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：74、77、80、86或148中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：75、78、81、87或149中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：141、144、82、88或150中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：142、145、83、89或151中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：143、146、84、90或152中之任一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
  35. 如申請專利範圍第1、2及34項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：17、18、19、21或109中之任一者至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：107、108、20、22或110中之任一者至少80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
  36. 如申請專利範圍第35項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：17之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：107之該胺基酸序列(5C4抗體)。
  37. 如申請專利範圍第35項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：18之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：108之該胺基酸序列(23C10抗體)。
  38. 如申請專利範圍第35項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：109之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：110之該胺基酸序列(37C7抗體)。
  39. 如申請專利範圍第35項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：19之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：20之該胺基酸序列(28C2抗體)。
  40. 如申請專利範圍第35項之嵌合分子，其中該VH包含SEQ ID NO：21之該胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO：22之該胺基酸序列(9D6抗體)。
  41. 如申請專利範圍第1、2及34至40項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之該β子單元之該細胞外域中的抗原決定基。
  42. 如申請專利範圍第1、2及34至41項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
  43. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：91至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：92至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：93至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一 致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：94至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：95至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及，(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：96至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致。
  44. 如申請專利範圍第1、2及43項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：VH，其包含與SEQ ID NO：23至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO：24至少約80%、85%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列(28F4抗體)。
  45. 如申請專利範圍第44項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子結合至位於GPIIb/IIIa之該β子單元之該細胞外域中的抗原決定基。
  46. 如申請專利範圍第43至45項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子與血纖維蛋白原競爭結合至GPIIb/IIIa。
  47. 如申請專利範圍第1至46項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含： (a)單鏈Fv(「scFv」)；(b)雙功能抗體；(c)微型抗體；(d)抗體之多肽鏈；(e)F(ab’)2；或(f)F(ab)。
  48. 如申請專利範圍第1至47項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子不抑制血小板功能。
  49. 如申請專利範圍第1至48項中任一項之嵌合分子，其中該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子不活化血小板。
  50. 如申請專利範圍第1至49項中任一項之嵌合分子，其中該嵌合分子不誘發血小板減少症。
  51. 如申請專利範圍第1至50項中任一項之嵌合分子，其中FVII為活化FVII(「FVIIa」)。
  52. 如申請專利範圍第1至51項中任一項之嵌合分子，其進一步包含在FVII與該XTEN多肽之間、在FVII與該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子之間，或在該XTEN多肽與該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子之間的可選連接子。
  53. 如申請專利範圍第1至52項中任一項之嵌合分子，其包含選自由以下組成之群的式：(a)FVII-(L1)-X-(L2)-Tm； (b)FVII-(L1)-Tm-(L2)-X；(c)Tm-(L1)-X-(L2)-FVII；(d)Tm-(L1)-FVII-(L2)-X；(e)X-(L1)-Tm-(L2)-FVII；及(f)X-(L1)-FVII-(L2)-Tm；其中FVII為FVIIA；X為該XTEN多肽；TM為該抗GPIIB/IIIA抗體或其抗原結合分子；L1為第一可選連接子，及L2為第二可選連接子。
  54. 如申請專利範圍第1至50項中任一項之嵌合分子，其包含彼此締合的第一多肽鏈及第二多肽鏈，(a)其中該第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及該XTEN多肽，且該第二多肽鏈包含FVII之重鏈及該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；(b)其中該第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，且該第二多肽鏈包含FVII之重鏈及該XTEN多肽；(c)其中該第一多肽鏈包含呈任何次序的FVII之輕鏈、該XTEN多肽及該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，且該第二鏈包含FVII之重鏈；或(d)其中該第一多肽鏈包含FVII之輕鏈，且該第二鏈包含呈任何次序的FVII之重鏈、該XTEN多肽及該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子。
  55. 如申請專利範圍第1至50項中任一項之嵌合分子，其包含彼此締合的第一多肽鏈及第二多肽鏈，(g)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL-X或X-FVIIL且該第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm或Tm-FVIIH，(h)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL-Tm或Tm-FVIIL且該第二多肽鏈包含式FVIIH-X或X-FVIIH；(i)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL且該第二多肽鏈包含式FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH；(j)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL且該第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm-X或X-Tm-FVIIH；(k)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL-Tm-X或X-Tm-FVIIL且該第二多肽鏈包含式FVIIH；或(l)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL-X-Tm或Tm-X-FVIIL且該第二多肽鏈包含式FVIIH，其中FVIIH為FVII之重鏈；Tm為該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；FVIIL為FVII之輕鏈；及X為該XTEN多肽。
  56. 如申請專利範圍第1至50項中任一項之嵌合分子，其包含選自由以下組成之群的式：(f)X-FVIIL：FVIIH-Tm；(g)Tm-FVIIL：FVIIH-X；(h)FVIIL：FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH：FVIIL；(i)FVIIL：FVIIH-Tm-X或X-Tm-FVIIH：FVIIL； (j)FVIIL-X-Tm：FVIIH或FVIIH：Tm-X-FVIIL；及(k)FVIIL-Tm-X：FVIIH或FVIIH：Tm-X-FVIIL，其中FVIIH為FVII之重鏈；Tm為該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；FVIIL為FVII之輕鏈；X為該XTEN多肽；及(：)為兩條多肽鏈之間的締合。
  57. 如申請專利範圍第54至56項中任一項之嵌合分子，其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈之間的該締合為共價鍵或非共價鍵。
  58. 如申請專利範圍第54至57項中任一項之嵌合分子，其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈之間的該締合為FVII之該重鏈與該輕鏈之間的共價鍵。
  59. 如申請專利範圍第58項之嵌合分子，其中該共價鍵為雙硫鍵。
  60. 如申請專利範圍第1至50項之嵌合分子，其包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含，(a)FVII之輕鏈、該XTEN多肽、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子；或(b)FVII之輕鏈、該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及該XTEN多肽。
  61. 如申請專利範圍第60項之嵌合分子，其中該蛋白酶裂解位點為細胞內加工位點。
  62. 如申請專利範圍第61項之嵌合分子，其中該細胞內加工位點由前蛋白轉化酶加工。
  63. 如申請專利範圍第62項之嵌合分子，其中該前蛋白轉化酶係選自由PC5、PACE、PC7及其任何組合組成之群。
  64. 一種嵌合分子，其包含彼此締合之第一多肽鏈及第二多肽鏈，(e)其中該第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及XTEN多肽，且該第二多肽鏈包含FVII之重鏈及結合至血小板的靶向部分；(f)其中該第一多肽鏈包含FVII之輕鏈及結合至血小板的靶向部分，且該第二多肽鏈包含FVII之重鏈及XTEN多肽；(g)其中該第一多肽鏈包含FVII之輕鏈，且該第二多肽鏈包含FVII之重鏈、XTEN多肽及結合至血小板的靶向部分；或(h)其中該第一多肽鏈包含FVII之輕鏈，且該第二多肽鏈包含FVII之重鏈、結合至血小板的靶向部分或XTEN多肽。
  65. 如申請專利範圍第64項之嵌合分子，(e)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL-Tm或Tm-FVIIL且該第二多肽鏈包含FVIIH-X或X-FVIIH；(f)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL-X或X-FVIIL且該第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm或Tm-FVIIH； (g)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL且該第二多肽鏈包含式FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH；或(h)其中該第一多肽鏈包含式FVIIL且該第二多肽鏈包含式FVIIH-Tm-X或X-Tm-FVIIH，其中FVIIH為FVII之該重鏈；Tm為結合至血小板的該靶向部分；FVIIL為FVII之該輕鏈；及X為該XTEN多肽。
  66. 如申請專利範圍第64項之嵌合分子，其包含選自由以下組成之群的式：(e)X-FVIIL：FVIIH-Tm或Tm-FVIIH：FVIIL-X；(f)Tm-FVIIL：FVIIH-X或X-FVIIH：FVIIL-Tm；(g)FVIIL：FVIIH-X-Tm或Tm-X-FVIIH：FVIIL；及(h)FVIIL：FVIIH-Tm-X或X-Tm-FVIIH：FVIIL；其中FVIIH為FVII之該重鏈；Tm為結合至血小板的該靶向部分；FVIIL為FVII之該輕鏈；X為該XTEN多肽；及(：)為兩條多肽鏈之間的締合。
  67. 如申請專利範圍第64至66項中任一項之嵌合分子，其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈之間的該締合為共價鍵或非共價鍵。
  68. 如申請專利範圍第64至67項中任一項之嵌合分子，其中該第一多肽鏈與該第二多肽鏈之間的該締合為 FVII之該重鏈與該輕鏈之間的共價鍵。
  69. 如申請專利範圍第68項之嵌合分子，其中該共價鍵為雙硫鍵。
  70. 一種嵌合分子，其包含單個多肽鏈，其自N端至C端包含，(a)FVII之輕鏈、XTEN多肽、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及結合至血小板的靶向部分；(b)FVII之輕鏈、結合至血小板的靶向部分、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈及XTEN多肽；(c)FVII之輕鏈、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈、XTEN多肽及結合至血小板的靶向部分；或(d)FVII之輕鏈、蛋白酶裂解位點、FVII之重鏈、結合至血小板的靶向部分及XTEN多肽。
  71. 如申請專利範圍第70項之嵌合分子，其中該蛋白酶裂解位點為細胞內加工位點。
  72. 如申請專利範圍第71項之嵌合分子，其中該細胞內加工位點由前蛋白轉化酶加工。
  73. 如申請專利範圍第72項之嵌合分子，其中該前蛋白轉化酶係選自由PC5、PACE、PC7及其任何組合組成之群。
  74. 如申請專利範圍第64至73項中任一項之嵌合分子，其中該靶向部分係選自由以下組成之群：抗體或其抗原結合分子、受體之受體結合部分及肽。
  75. 如申請專利範圍第64至74項中任一項之嵌合分 子，其中該靶向部分選擇性地結合至靜止血小板或活化血小板。
  76. 如申請專利範圍第64至75項中任一項之嵌合分子，其中該靶向部分選擇性地結合至選自由以下組成之群的標靶：GPIba、GPVI、GPIX、醣蛋白IIb/IIIa(「GPIIb/IIIa」)之非活性形式、GPIIb/IIIa之活性形式、P選擇蛋白、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L、LOX-1及其任何組合。
  77. 如申請專利範圍第76項之嵌合分子，其中該靶向部分為結合至GPIIb/IIIa抗原決定基之抗體或其抗原結合分子。
  78. 如申請專利範圍第1至77項中任一項之嵌合分子，其中相較於由該重鏈及該輕鏈組成的FVIIa而言，FVII之半衰期增加。
  79. 如申請專利範圍第78項之嵌合分子，其中FVII之該半衰期相較於由該重鏈及該輕鏈組成的FVIIa而言延長至少約1.5倍、約2.0倍、約2.5倍、約3.0倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約13倍、約14倍或約15倍。
  80. 如申請專利範圍第1至79項中任一項之嵌合分子，其中FVII之凝結活性等於或大於由該重鏈及該輕鏈組成的FVIIa。
  81. 如申請專利範圍第80項之嵌合分子，其中該凝 結活性藉由ROTEM分析量測。
  82. 如申請專利範圍第81項之嵌合分子，其中該凝結活性藉由aPTT分析量測。
  83. 如申請專利範圍第1至82項中任一項之嵌合分子，其中該XTEN多肽包含AE基序、AG基序、AD基序、AM基序、AQ基序、AF基序、BC基序、BD基序或其任何組合。
  84. 如申請專利範圍第83項中任一項之嵌合分子，其中該XTEN多肽包含約42個胺基酸、約72個胺基酸、約108個胺基酸、約144個胺基酸、約180個胺基酸、約216個胺基酸、約252個胺基酸、約288個胺基酸、約324個胺基酸、約360個胺基酸、約396個胺基酸、約432個胺基酸、約468個胺基酸、約504個胺基酸、約540個胺基酸、約576個胺基酸、約612個胺基酸、約624個胺基酸、約648個胺基酸、約684個胺基酸、約720個胺基酸、約756個胺基酸、約792個胺基酸、約828個胺基酸、約836個胺基酸、約864個胺基酸、約875個胺基酸、約912個胺基酸、約923個胺基酸、約948個胺基酸、約1044個胺基酸、約1140個胺基酸、約1236個胺基酸、約1318個胺基酸、約1332個胺基酸、約1428個胺基酸、約1524個胺基酸、約1620個胺基酸、約1716個胺基酸、約1812個胺基酸、約1908個胺基酸、約2004個胺基酸或其任何組合。
  85. 如申請專利範圍第84項中任一項之嵌合分子， 其中該XTEN多肽係選自由以下組成之群：AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何組合。
  86. 如申請專利範圍第85項之嵌合分子，其中該XTEN多肽係選自由SEQ ID NO：224-239及其任何組合組成之群。
  87. 如申請專利範圍第54至59、64至69及74至97項中任一項之嵌合分子，其進一步包含連接子，其中該連接子連接FVII之該輕鏈與該XTEN多肽、FVII之該重鏈與該靶向部分，或兩者。
  88. 如申請專利範圍第54至59、64至69及74至97項中任一項之嵌合分子，其進一步包含連接子，其中該連接子連接FVII之該輕鏈與該靶向部分、FVII之該輕鏈與該XTEN多肽，或兩者。
  89. 如申請專利範圍第87或88項之嵌合分子，其中該連接子包含至少約1個胺基酸、約10個胺基酸、約20個胺基酸、約30個胺基酸、約40個胺基酸、約50個胺基酸、約60個胺基酸、約70個胺基酸、約80個胺基酸、約90個胺基酸、約100個胺基酸、約110個胺基酸、約120個胺基酸、約130個胺基酸、約140個胺基酸、約150個胺基酸、約160個胺基酸或其任何組合。
  90. 如申請專利範圍第87至89項中任一項之嵌合分子，其中該連接子包含具有式[(Gly)x-Sery]z之肽，其中x為1至4，y為0或1，且z為1至50。
  91. 如申請專利範圍第1至90項中任一項之嵌合分子，其中FVII之該重鏈包含與SEQ ID NO：178至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
  92. 如申請專利範圍第1至91項中任一項之嵌合分子，其中FVII之該輕鏈包含與SEQ ID NO：179至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性。
  93. 如申請專利範圍第1至92項中任一項之嵌合分子，其包含與SEQ ID NO：192或SEQ ID NO：193編碼的該胺基酸序列至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
  94. 如申請專利範圍第93項之嵌合分子，其中該嵌合分子包含SEQ ID NO：192或SEQ ID NO：193編碼的該胺基酸序列。
  95. 如申請專利範圍第1至94項中任一項之嵌合分子，其進一步包含融合至FVII之該重鏈、FVII之該輕鏈、該XTEN多肽、該靶向部分或其任何組合的異源性部分。
  96. 如申請專利範圍第95項之嵌合分子，其中該異源性部分為多肽部分或非多肽部分。
  97. 如申請專利範圍第96項之嵌合分子，其中該異源性部分延長FVII之該半衰期。
  98. 如申請專利範圍第97項之嵌合分子，其中該異 源性部分係選自由以下組成之群：白蛋白、白蛋白結合多肽或脂肪酸、Fc、運鐵蛋白、PAS、人類絨毛膜促性腺激素之β子單元之C端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合小分子、vWF、其他XTEN多肽及其任何組合。
  99. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1至98項中任一項之嵌合分子及醫藥學上可接受的載劑。
  100. 一種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至98項中任一項之嵌合分子或其補體。
  101. 一種多核苷酸組，其包含編碼如申請專利範圍第54至59、64至69及74至98項中任一項之嵌合分子之該第一多肽鏈的第一多核苷酸或其補體，及編碼該嵌合分子之該第二多肽鏈的第二多核苷酸或其補體。
  102. 一種載體，其包含如申請專利範圍第100項之多核苷酸或其補體，或如申請專利範圍第101項之多核苷酸組或其補體。
  103. 一種載體組，其包含：第一載體，其包含如申請專利範圍第101項之第一多核苷酸或其補體；及第二載體，其包含該第二多核苷酸或其補體。
  104. 如申請專利範圍第102項之載體或如申請專利範圍第103項之載體組，其進一步包含編碼加工該細胞內加工位點之酶的核苷酸序列。
  105. 一種寄主細胞，其包含如申請專利範圍第102或104項之載體或如申請專利範圍第103或104項之載體 組。
  106. 如申請專利範圍第105項之寄主細胞，其進一步包含編碼加工該細胞內加工位點之酶的核苷酸序列。
  107. 一種製造嵌合分子之方法，其包括用如申請專利範圍第102或104項之載體或如申請專利範圍第103或104項之載體組轉染寄主細胞及在適合條件下於培養基中培養該細胞。
  108. 如申請專利範圍第107項之方法，其進一步包括分離該嵌合分子。
  109. 一種降低有需要之受試者之出血事件頻率或程度的方法，其包括投與如申請專利範圍第1至98項中任一項之嵌合分子、如申請專利範圍第99項之組合物、如申請專利範圍第100項之多核苷酸或如申請專利範圍第101項之多核苷酸組、如申請專利範圍第102或104項之載體或如申請專利範圍第103或104項之載體組，或如申請專利範圍第105或106項之寄主細胞。
  110. 一種預防有需要之受試者之出血事件發生的方法，其包括投與如申請專利範圍第1至98項中任一項之嵌合分子、如申請專利範圍第99項之組合物、如申請專利範圍第100項之多核苷酸或如申請專利範圍第101項之多核苷酸組、如申請專利範圍第102或104項之載體或如申請專利範圍第103或104項之載體組，或如申請專利範圍第105或106項之寄主細胞。
  111. 如申請專利範圍第109或110項之方法，其中該 受試者已發展或有能力發展抵抗因子VIII(「FVIII」)、因子IX(「FIX」)或兩者之抑制劑。
  112. 如申請專利範圍第111項之方法，其中抵抗FVIII或FIX之該抑制劑為抵抗FVIII、FIX或兩者之中和抗體。
  113. 如申請專利範圍第109至112項中任一項之方法，其中該出血事件係由凝血病症引起。
  114. 如申請專利範圍第113項之方法，其中該凝血病症為A型血友病或B型血友病。
  115. 如申請專利範圍第109至114項中任一項之方法，其中該出血事件來源於關節積血、肌肉出血、口腔出血、失血、向肌肉中失血、口腔失血、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內失血、腹內失血、胸內失血、骨折、中樞神經係統出血、咽後間隙中出血、腹膜後隙中出血、髂腰肌鞘中出血或其任何組合。
  116. 如申請專利範圍第109至115項中任一項之方法，其中該受試者為人類受試者。
  117. 如申請專利範圍第1至98項中任一項之嵌合分子，如申請專利範圍第99項之組合物、如申請專利範圍第100項之多核苷酸或如申請專利範圍第101項之多核苷酸組、如申請專利範圍第102或104項之載體或如申請專利範圍第103或104項之載體組，或如申請專利範圍第105或106項之寄主細胞，其用於在有需要之受試者中降低出血事件頻率或程度或降低或預防出血事件之發生。
  118. 如申請專利範圍第1至98項中任一項之嵌合分子，如申請專利範圍第99項之組合物、如申請專利範圍第100項之多核苷酸或如申請專利範圍第101項之多核苷酸組、如申請專利範圍第102或104項之載體或如申請專利範圍第103或104項之載體組或如申請專利範圍第105或106項之寄主細胞之用途，其用於製造在有需要之受試者中降低出血事件頻率或程度或降低或預防出血事件發生之藥物。
  119. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：31至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(ii)可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：32至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iii)可變重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：33至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(iv)可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列，其與SEQ ID NO：34至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；(v)可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列，其與SEQ ID NO：35至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致；及(vi)可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列，其與SEQ ID NO：36至少約60%、70%、80%、90%或95%一致。
  120. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含：(i)SEQ ID NO：31之可變重鏈CDR-1(VH-CDR1)序列；(ii)SEQ ID NO：32之可變重鏈CDR-2(VH-CDR2)序列；(iii)SEQ ID NO：33之可變的重鏈CDR-3(VH-CDR3)序列；(iv)SEQ ID NO：34之可變輕鏈CDR-1(VL-CDR1)序列；(v)SEQ ID NO：35之可變輕鏈CDR-2(VL-CDR2)序列；及(vi)SEQ ID NO：36之可變輕鏈CDR-3(VL-CDR3)序列。
  121. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO：1之該胺基酸序列。
  122. 一種嵌合分子，其包含FVII、XTEN多肽及抗 GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子，該抗GPIIb/IIIa抗體或其抗原結合分子包含VH及VL，其中該VL包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
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