EA028914B1

EA028914B1 - Исследования для мониторинга нарушений свертываемости крови

Info

Publication number: EA028914B1
Application number: EA201490328A
Authority: EA
Inventors: Юрг Зоммер; Хайянь Цзян; Синь ЧЖАН; Буюйэ Ян; Гленн Пирс
Original assignee: Байоджен Хемофилия Инк.
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2012-07-25
Publication date: 2018-01-31
Also published as: EP2737311A1; EP2737311B1; US20150079072A1; WO2013016454A1; US20200386774A1; EA201490328A1; US10656167B2; EP2737311A4; US11747351B2

Abstract

Изобретение обеспечивает способы дозирования химерных и гибридных полипептидов фактора VIII или фактора IX. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает высокочувствительные способы определения количества активированного белка FIX в тестируемом образце.

Description

изобретение относится в основном к области терапии гемостатических нарушений. Предшествующий уровень техники

Гемофилия является нарушением свертываемости крови, при котором свертывание крови нарушено нехваткой определенных факторов свертывания в плазме. Гемофилия А и гемофилия В являются двумя разными типами гемофилии, которые вызываются дефицитом фактора VIII (РУП) и фактора IX соответственно.

Гемофилия А характеризуется спонтанным кровоизлиянием и избыточным кровотечением после травмы. Со временем повторяющиеся кровотечения в мышцы и суставы, которые часто начинаются в раннем детском возрасте, приводят к гемофилической атрофии и необратимому повреждению суставов. Это повреждение прогрессирует и может привести к тяжелому ограничению подвижности суставов, мышечной атрофии и хронической боли (Кобпдие/-МегсНап Е.С., 5>епип. ТЬготЬ. Нетоз! 29:87-96 (2003), который включен во всей полноте в данный документ путем ссылки).

Гемофилия В (также известна как болезнь Кристмаса) является одним из наиболее распространенных наследственных нарушений свертываемости крови в мире. Оно приводит к сниженной ίη νίνο и ίη νίίτο коагуляционной активности крови и требует обширного медицинского мониторинга на всем протяжении жизни больного пациента. При отсутствии вмешательства больной пациент будет страдать от спонтанных кровотечений в суставах, которые вызывают сильную боль и истощающую неподвижность; кровотечение в мышцах вызывает накопление крови в этих тканях; спонтанное кровотечение в горле и глотке может причинять асфиксию, если немедленно не лечить; также широко распространены почечное кровотечение и сильное кровотечение после хирургической операции, небольших нечаянных повреждений или удаления зубов.

Лечение нарушеня свертываемости крови, например гемофилии, осуществляют путем заместительной терапии направленного восстановления активности факторов VIII и IX. Лечение гемофилии А является заместительной терапией, направленной на восстановление активности РУН от 1 до 5% от нормальных уровней, для предотвращения спонтанного кровотечения (Мапписа Р.М., еί а1., N. Епд1. I. Меб. 344:1773-1779 (2001), который включен в данный документ во всей полноте путем ссылки). Имеются продукты, полученные из плазмы и рекомбинантного РУП, доступные для лечения эпизодов кровотечения по необходимости или для предотвращения эпизодов кровотечения, происходящих путем профилактического лечения. Исходя из периода полувыведения этих продуктов режим лечения требует частого внутривенного введения. Такое частое введение является болезненным и неудобным.

Лечение гемофилии В происходит путем замены недостающего фактора свертывания крови концентратами экзогенного фактора, высоко обогащенными фактором IX, но это также проблематично. Получение такого концентрата из крови чревато техническими трудностями. Очистка фактора IX от плазмы (полученный из плазмы фактор IX; рбЕК) почти исключительно дает активный фактор IX. Однако такая очистка фактора IX от плазмы является очень трудной, поскольку фактор IX присутствует в плазме только в низких концентрациях (5 мкг/мл, Апбегззоп, ТЬготЬоз13 КезеагсЬ 7: 451-459 (1975). Дополнительно, очистка от остатков крови требует удаления или инактивации инфекционных агентов, таких как ШУ и НСУ. Кроме того, рбРК имеет короткий период полувыведения и тем самым нуждается в частом дозировании. Рекомбинантный фактор IX (гЕШ) также доступен, но страдает от того же короткого периода полувыведения и требует частого дозирования (например, 2-3 раза в неделю для профилактики), как и рбЛХ гРК также имеет более постепенное восстановление (К-значение) по сравнению с рбРК, что делает необходимым применять более высокие дозы гЕК, чам дозы рбРТХ

Снижение смертности, предупреждение повреждений суставов и улучшенное качество жизни являются важными достижениями благодаря развитию продуктов, полученных из плазмы и рекомбинантного фактора VIII и фактора IX. Длительная защита от кровотечения представляет собой другое ключевое улучшение в лечении пациентов с гемофилией. Для того чтобы исследовать эту потребность, разработаны рекомбинантные белки факторов VIII и IX, экспрессированные в виде Рс-слияний. Однако способы определения приемлемых доз этих продуктов, которые обладают уникальными фармакокинетическими свойствами у человека, еще не разработаны. Поэтому остается потребность в усовершенствованных способах лечения гемофилии из-за недостатка факторов VIII и IX, которые являются более приемлемыми и более эффективными, чем современная терапия.

Краткое изложение сущности изобретения

Это описание предусматривает способ оптимизации лечения нарушения свертываемости крови у субъекта, нуждающегося в нем, включающий:

a) измерение ех νί\Ό по меньшей мере одного свойства сгусткообразования в образце крови, взятого у пациента, имеющего введенное количество химерного полипептида фактора VIII или IX; и

b) сравнение по меньшей мере одного свойства с соответствующим стандартом ех νί\Ό свойства сгусткообразования, где указанный стандарт свойства сгусткообразования коррелирует с терапевтической эффективностью лечения.

Это описание дополнительно предусматривает способ оптимизации лечения нарушения свертываемости крови у пациента, нуждающегося в нем, включающий:

- 1 028914

a) введение пациенту химерного полипептида фактора VIII или IX;

b) получение образцов крови у пациента;

c) измерение по меньшей мере одного свойства сгусткообразования в образце крови, где по меньшей мере одно свойство является одним или более из тромбинообразования, кинетики образования сгустков, силы образования сгустков и стабильности образования сгустков; и

ά) приспосабливание количества химерного полипептида фактора VIII или IX в последующих введениях соотносительно активности измеренного свойства.

Это описание дополнительно предусматривает способ определения эффективности лечения нарушения свертываемости крови, включающий:

b) получение образцов крови у пациента;

ά) сравнение измеренного свойства с) с измеренным свойством известного нормального образца, где значительно похожие свойства между нормальным образцом и образцом пациента являются индикаторными для терапевтической активности.

Это описание дополнительно предусматривает способ лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

a) получение образца крови пациента, подлежащего оценке и лечению по поводу нарушения свертываемости крови;

b) измерение способности образовывать сгустки в образце крови;

c) сравнение результатов пациента касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением; и

ά) введение оптимизированного лечения пациенту, где лечение является заданным или приспособленным, исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Это описание дополнительно предусматривает способ лечения нарушения свертываемости крови у пациента включающий:

b) передачу образца крови для измерения способности образовывать сгустки и сравнение с соответствующим стандартом, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением; и

c) введение оптимизированного лечения пациенту, где лечение является заданным или приспособленным, исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

a) измерение способности образовывать сгустки в образце крови, полученном от пациента, подлежащего оценке и лечению по поводу нарушения свертываемости крови;

b) сравнение результатов пациента касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением; и

c) инструктирование лечащего врача по поводу заданного и приспособленного лечения пациента, где лечение является заданным или приспособленным, исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Это описание дополнительно предусматривает способ оптимизации лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

c) введение оптимизированного лечения пациенту, где лечение является заданным или приспособ- 2 028914

ленным, исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

c) инструктирование лечащего врача по поводу оптимизации лечения пациента, где лечение является заданным или приспособленным, исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Это описание дополнительно предусматривает способ определения эффективности лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

c) сравнение результатов пациента касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, где стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, и где схожесть между результатами пациента и стандартом указывает на эффективность лечения пациента; и

б) поддержание или приспосабливание лечения пациента исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

b) передачу образца крови для измерения способности образовывать сгустки и сравнение с соответствующим стандартом, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением, и где схожесть между результатами пациента и стандартом указывает на эффективность лечения пациента; и

c) поддержание или приспосабливание лечения пациента исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

b) сравнение результатов пациента касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, где стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, и где схожесть между результатами пациента и стандартом указывает на эффективность лечения пациента; и

c) инструктирование лечащего врача по поводу заданного и приспособленного лечения пациента исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Это описание дополнительно предусматривает способ стандартизации результатов анализа гемостаза, включающий:

a) получение образцов крови от популяции пациентов, подлежащих лечению по поводу нарушения свертываемости крови;

b) измерение способности образовывать сгустки в образцах крови, где измерения проводят, используя стандартизированные реагенты и способы;

c) сравнение результатов пациентов касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, где стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, и где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов; и

б) поддержание или приспосабливание лечения пациентов исходя из относительной разницы между результатами пациентов касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

b) передачу образцов крови для измерения способности образовывать сгустки и сравнение с соответствующим стандартом, где измерения проводят, используя стандартизированные реагенты и способы, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением, и где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов; и

c) поддержание или приспосабливание лечения пациентов исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

- 3 028914

a) измерение способности образовывать сгустки в образцах крови, полученных от популяции пациентов, подлежащих лечению по поводу нарушения свертываемости крови;

b) сравнение результатов пациентов касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, где стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, где измерения проводят, используя стандартизированные реагенты и способы, и где схожесть результатов пациента и стандарта является индикатором дэффективности современного лечения пациентов; и

c) инструктирование медицинских работников, от которых были получены образцы, по поводу поддержания или приспособления лечения пациентов исходя из относительной разницы между результатами пациентов касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Это описание дополнительно предусматривает способ стандартизации результатов в многоцентровом клиническом испытании факторов свертывания крови, включающий:

a) получение образцов крови от тестируемых пациентов с нарушением свертываемости крови в многочисленных центах клинических испытаний;

b) измерение способности образовывать сгустки в образцах крови, где измерения проводят, используя обычные реагенты и способы;

c) сравнение результатов пациентов касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, где стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов, и где расхождение результатов между многими центрами клинических испытаний не является статистически значимым; и

ά) поддержание или приспосабливание лечения пациентов исходя из относительной разницы между результатами пациентов касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

b) передачу образцов крови для измерения способности образовывать сгустки и сравнение с соответствующим стандартом, где измерения проводят, используя обычные реагенты и способы, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением, где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов, и где расхождение результатов между многими центрами клинических испытаний не является статистически значимым; и

a) измерение способности образовывать сгустки в образцах крови полученных от тестируемых пациентов с нарушением свертываемости крови в многочисленных центах клинических испытаний;

b) сравнение результатов пациентов касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, где измерения проводят, используя обычные реагенты и способы, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением, где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов, и где расхождение результатов между многими центрами клинических испытаний не является статистически значимым; и

c) инструктирование медицинских работников участвующих в клинической испытании, от которых были получены образцы, по поводу поддержания и приспособления лечения тестируемых пациентов исходя из относительной разницы между результатами пациентов касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно свойство оценивают, анализирую один или более из тромбинообразования, кинетики образования сгустков, силы образования сгустков и стабильности образования сгустков. В некоторых аспектах по меньшей мере одно свойство измеряют с помощью анализа тромбинообразования (ТОЛ), тромбоэластографии (ТЕС), ротационной тромбоэластометрии (КОТЕМ®) и анализа формы сигналов.

В некоторых аспектах способ дополнительно включает приспосабливание количества химерного полипептида фактора VIII или фактора IX, вводимого субъекту в последующих введениях для достижения более эффективных результатов. В некоторых аспектах химерный полипептид фактора VIII или IX содержит домен Рс, например человеческого домена Рс.

В некоторых вариантах осуществления изобретения химерный полипептид фактора VIII для использования в предусмотренном способе содержит фактор VIII с делецией В-домена. Химерный полипептид фактора VIII может содержать §ЕЦ ГО N0: 6 или §ЕЦ ГО N0: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения химерный полипептид фактора IX может содержать §ЕЦ ГО N0: 14.

Образец крови для использования в предусмотренном способе может быть, например, цельной кро- 4 028914

вью или плазмой.

Это описание дополнительно предусматривает способ определения количества белка, способного проявлять активность ИХ, который находится в активированной форме (активированный белок ИХ) в тестируемом образце, способ включает измерение активности тромбинообразования тестируемого образца в присутствии ИХ-дефицитной плазмы или ИХ-дефицитной крови и в присутствии экзогенного тромбина, где экзогенный тромбин присутствует в концентрации не выше приблизительно 50 нМ, где измерение проводят в отсутствие экзогенного тканевого фактора (ТИ), и где количество активированного белка И1Х в тестируемом образце является индикатором активности тромбинообразования, измеренного в тестируемом образце. В некоторых аспектах измерение проводят в присутствии фосфолипидов.

В некоторых аспектах этого способа стандартную кривую используют для определения количества активированного белка И1Х в тестируемом образце. Стандартную кривую строят путем, например, а) обеспечения по меньшей мере двух контрольных образцов, каждый содержит разную известную концентрацию активированного контрольного белка; и Ь) измерение активности тромбинообразования для каждого контрольного образца в присутствии И1Х-дефицитной плазмы или И1Х-дефицитной крови и в присутствии экзогенного тромбина, где экзогенный тромбин присутствует в концентрации не выше приблизительно 50 нМ, где измерение проводят в отсутствие экзогенного тканевого фактора (ТИ), и где концентрация активированного контрольного белка И1Х в контрольном образце является индикатором активности тромбинообразования, измеренного для каждого контрольного образца. В некоторых аспектах каждый контрольный образец содержит от приблизительно 0 пМ до приблизительно 200 пМ или от приблизительно 0 пМ до приблизительно 100 пМ активированного белка И1Х. Активированный контрольный белок И1Х может быть, например, полученным из плазмы активированным белком И1Х.

В некоторых вариантах осуществления этого способа экзогенный тромбин может присутствовать в концентрации не выше приблизительно 40 нМ, не выше приблизительно 30 нМ, не выше приблизительно 20 нМ или не выше приблизительно 10 нМ, например в концентрации от приблизительно 1 нМ до приблизительно 10 нМ или приблизительно 5 нМ.

В некоторых вариантах осуществления этого способа И1Х-дефицитная плазма может быть И1Хдефицитной плазмой.

Этот метод можно приспосабливать для точного измерения, например, меньше чем приблизительно 100 пМ, меньше чем приблизительно 90 пМ, меньше чем приблизительно 80 пМ, меньше чем приблизительно 70 пМ, меньше чем приблизительно 60 пМ, меньше чем приблизительно 50 пМ, меньше чем приблизительно 30 пМ, меньше чем приблизительно 20 пМ, меньше чем приблизительно 10 пМ или меньше чем приблизительно 5 пМ активированного белка И1Х в тестируемом образце.

В некоторых аспектах тестируемый образец содержит общее количество белка, способного проявлять активность фактора 1Х, где часть общего количества белка присутствует в его активированной форме. Например, тестируемый образец может содержать общее количество белка, способного проявлять активность фактора 1Х, где меньше чем приблизительно 1% (мас./мас.) от общего количества белка, способного проявлять активность И1Х, присутствует в его активированной форме. Например, в некоторых аспектах тестируемый образец содержит меньше чем 2 пМ активированного белка И1Х. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок, обладающий активностью И1Х, содержит гетерологичный фрагмент, например константную область имуноглобулина (Ис) или ее часть, альбумин или его фрагмент, полипептид ХТЕЫ, фрагмент неразветвленного или разветвленного полиэтиленгликоля (РЕС), последовательность РА§ или фрагмент гидроксиэтилового крахмала (НЕ§) или их производное. В некоторых вариантах осуществления изобретения геторогичный фрагмент является первой областью Ис и может содержать вторую область Ис, где вторая область Ис соединяется с первой областью Ис ковалентной связью или нековалентной связью. В некоторых аспектах белок, способный проявлять активность И1Х, является рекомбинантным слитым белком фактор 1Х-Ис (И1Х-Ис).

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Схематическая репрезентация белка гИУШИс.

Фиг. 2. Схематическое изображение одного типа химерного полипептида фактора, белка гИХИс.

Фиг. 3А. Кривые зависимости активности ТСА от дозы для ВЕХЕИ1Х® и гИ1ХИс в И1Х-дефицитной плазме.

Фиг. 3В. Активность ТСА для ВЕХЕИ1Х® и гИ1ХИс в И1Х-дефицитной плазме в отсутствие тканевого фактора (аутоактивация). Без тканевого ВЕХЕИ1Х® (1 МЕ/мл) генерирует значительное количество тромбина, между тем как гИ1ХИс (1 МЕ/мл) не демонстрирует тромбинообразования.

Фиг. 3С. Профиль тромбинообразования ВЕХЕИ1Х® после ингибирования активного сайта протеазы (И1Ха). После ингибирования активного сайта ВЕХЕИ1Х® показал подобную гИ1ХИс способность к тромбинообразованию.

Фиг. 3Ό. Титрование полученного из плазмы И1Ха в И1Х-дефицитную плазму в отсутствие тканевого фактора.

Фиг. 3Е. Определение количества И1Ха в ВЕХЕИ1Х® и лекарственных продуктов гИ1ХИс по ТСА (стандартная кривая). Ось У=нМ тромбина как на фиг. 3Ό.

- 5 028914

Фиг. 3Ρ. Вызванный тканевым фактором профиль тромбинообразования в сравнении с ΒΕΝΕΡΙΧ® и τΡΙΧΡο, каждый дополнен повышающимся Р1Ха, полученным из плазмы.

Фиг. 4. Стандартизация ΚΟΤΕΜ® в клиническом испытании фактора VIII.

Фиг. 5. Фармакокинетика τΡνίΙΙΡε с помощью одностадийного анализа активности.

Фиг. 6А-6С. Результаты ΚΌΤΕΜ® для τΡνίΙΙΡε воспроизводимы в рамкам пациента. ΝΑΤΕΜ (6А): очень чуствительная оценка равновесного состояния активации и ингибирования коагуляции; ΕΧΤΕΜ (6С): первая оценка образования сгустков, полимеризации фибрина и фибринолиза через наружный путь; ΙΝΤΕΜ (6Β): первая оценка образования сгустков, полимеризации фибрина и фибринолиза через внутренний путь.

Фиг. 7А-7С. Кореляции между активностью ΡνΙΙΙ временем образования сгустков ΚΌΤΕΜ®. ΝΑΤΕΜ (7А): очень чуствительная оценка равновесного состояния активации и ингибирования коагуляции; ΕΧΤΕΜ (7С): первая оценка образования сгустков, полимеризации фибрина и фибринолиза через наружный путь; ΙΝΤΕΜ (7Β): первая оценка образования сгустков, полимеризации фибрина и фибринолиза через внутренний путь.

Фиг. 8. Диаграмма потоков операций для стандартизации ΚΟΤΕΜ® в фазе 3 клинического испытания.

Фиг. 9. Изменчивость и диапазон результатов ΚΟΤΚΟΕ N из 7 клинических центров.

Фиг. 10. Пациент-специфические различия особенностей коагуляции ΡΙΧ-дефицитной плазмы. Фиг. 10А и 10С - параметры ΚΟΤΕΜ® при эквивалентных уровнях ΡΙΧ значительно отличались в плазмах двух доноров. Фиг. 10В - плазма донора 2 демонстрировала более длительное время коагуляции с помощью αΡΤΤ по сравнению с плазмой донора 1.

Фиг. 11. Результаты коагуляции ΚΟΤΕΜ® с использованием контролей плазмы (ΡΙΧ-дефицитная плазма, обогащенная 1, 5, 15 или 30 МЕ/дл τΡΙΧ). Сравнение результатов между одним (локальным) центром и глобальными центрами.

Фиг. 12. Время коагуляции ΚΟΤΕΜ® с использованием контролей плазмы (гемофильная плазма, обогащенная 30, 15, 5 и 1% фактора νΙΙΙ). Сравнение результатов между одним (локальным) центром и глобальными центрами.

Фиг. 13. Реагенты одностадийного анализа и решающие шаги в методологии, примененной 30 участвующими лабораториями.

Фиг. 14. Характеристика τΡνΊΙΙΡο в экспериментальных исследованиях (одностадийный анализ коагулирующей активности, п=30 лабораторий).

Фиг. 15. Характеристика τΡνΊΙΙΡο в экспериментальных исследованиях (хромогенный анализ, п=11 лабораторий).

Фиг. 16. Соотношение хромогенный/одностадийный анализ в клинических исследованиях. Подробное описание сущности изобретения

Использование ίη νίΐτο одностадийного анализа коагулирующей активности или тестирования с помощью хромогенного субстрата не является точно предсказующим ίη νίνο активность для терапевтических средств фактороа νΙΙΙ и фактора ΙΧ длительного действия. Оттого это описание предусматривает способы оптимизации стратегий дозирования терапевтических средств фактора νΙΙΙ ("ΡνΊΗ") и фактора ΙΧ ("ΡΙΧ") с использованием общих анализов гемостаза. Некоторые полипептиды ΡνΙΙΙ и ΡΙΧ для использования в способах, предусмотренных в данном документе, описаны в международной заявке № ΡΟΤ/ϋδ 2010/059136, поданной 6 декабря 2010, в международной заявке № ΡΟΤ/ϋδ 2011/043569, поданной 11 июля 2011, каждая из которых во всей полноте вкалючена в данный документ путем ссылки.

Некоторые коммерчески доступные терапевтические композиции ΡΙΧ содержат количества активированного белка ΡΙΧ (см., например, Κ.Τ. Ре1ег5 с1 а1., Рго1опдеб αοίίνίΐν фактора ΙΧ а§ а тонотепс Ρο Гиδίοη рго1е1п. Βίοοά 2010; 115: 2057-2064), а некоторые форматы анализов, использованные для определения терапевтической активности/силы композиций ΡΙΧ (например, при анализах контроля качества), могут давать неверные результаты из-за присутствия активированного белка ΡΙΧ (например, остаточный активированный белок ΡΙΧ) в этих композициях.

Это описание предусматривает процедуры анализов, которые могут отличить ίη νίΐτο биологическую активность, полученную от природного белка ΡΙΧ, в сравнении с ίη νίίτο активностью, полученной от соответствующей активированной формы белка ΡΙΧ (т.е. предварительно активированного). Активированный белок ΡΙΧ в таких препаратах может рассматриваться как загрязнение, поскольку активированный белок не обладает такой же полезной ίη νίνο биологической активностью как белок ΡΙΧ, который активируется ίη νίνο. Процедуры анализов, предусмотренные в этой заявке, могут использоваться для выявления присутствия активированного белка ΡΙΧ в тестируемом образце, а также могут использоваться для точного измерения очень маленьких концентраций (например, меньше чем 100 пМ) активированного белка ΡΙΧ в тестируемом образце (высокочувствительный анализ).

В некоторых аспектах это описание предусматривает способы (например, высокочувствительные способы) определения количества (или определения концентрации) белка, обладающего активностью ΡΙΧ, который находится в своей активированной форме (преактивированный белок ΡΙΧ) в тестируемом

- 6 028914

образце. Пример способа включает: (ί) измерение активности тромбинообразования для тестируемого образца в присутствии ΡΙΧ-дефицитной плазмы или ΡΙΧ-дефицитной крови и в присутствии экзогенного тромбина, причем экзогенный тромбин присутствует в концентрации не выше приблизительно 50 нМ (например, не выше приблизительно 30 нМ, не выше приблизительно 10 нМ или приблизительно 5 нМ), и где измерение осуществляют в отсутствие экзогенного тканевого фактора (ТР). Индикатором количества или концентрации активированного белка ΡΙΧ в тестируемом образце является активность тромбинообразования, измеренная в тестируемом образце.

Другой пример способа включает: (ί) измерение активности тромбинообразования в анализируемой смеси, содержащей тестируемый образец, причем анализируемая смесь дополнительно содержит ΡΙΧдефицитную плазму или ΡΙΧ-дефицитную кровь и экзогенный тромбин, где экзогенный тромбин добавляют к анализируемой смеси перед измерением (например, перед инициацией тромбинообразования) в концентрации не выше приблизительно 50 нМ (например, не выше приблизительно 50 нМ или не выше приблизительно 10 нМ), и где измерение проводят в отсутствие экзогенного тканевого фактора (ТР). Количество или концентрацию активированного белка ΡΙΧ в тестируемом образце определяют по активности тромбинообразования, измеренного в анализируемой смеси.

Активность тромбинообразования может быть выражена, например, как количество полученного тромбина или пик концентрации тромбина, измеренный во время аналитической процедуры. Активность тромбинообразования можно определить, например, используя известный анализ тромбинообразования (ТОЛ), приспособленный согласно вышеуказанному способу. Пример ТОЛ описан в примере 1. Результаты обычного анализа ТОА представлены на фиг. 3А-3Р.

Тестируемым образцом может быть любой образец, содержащий белок, обладающий активностью ΡΙΧ. В одном примере тестируемым образцом является фармацевтический препарат, содержащий белок, обладающий активностью ΡΙΧ, например рекомбинантный белок, обладающий активностью ΡΙΧ (например, рекомбинантный ΡΙΧ, такой как ΒΕΝΕΡΙΧ® или τΡΙΧ-Ρο).

В одном примере тестируемый образец содержит общее количество белка, обладающего активностью ΡΙΧ. Вышеуказанный способ полезен для определения того, сколько (если имеется) (например, процентное содержание, соотношение) общего количества белка, обладающего активностью ΡΙΧ, в тестируемом образце присутствует в активированной форме. В другом примере тестируемый образец содержит общее количество белка, обладающего активностью ΡΙΧ, причем часть (например, меньше чем 10%) общего количества присутствует в его активированной форме. В другом примере тестируемый образец содержит общее количество белка, обладающего активностью ΡΙΧ, причем незначительная (например, меньше чем 0,2% мас./мас.) часть общего количества присутствует в его активированной форме.

Вышеуказанный способ может дополнительно включать: (ίί) использование стандартной кривой активированного белка ΡΙΧ для определения концентрации или количества активированного белка ΡΙΧ в тестируемом образце.

В одном примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления способ дополнительно включает перед измерением контактирование тестируемого образца с ΡΙΧ-дефицитной плазмой или кровью. Это может выполняться, например, с помощью метода добавки в объем ΡΙΧ-дефицитной плазмы или крови.

В одном примере согласно любому вышеуказанному варианту ΡΙΧ-дефицитная плазма является гемофилической плазмой (например, плазма, полученная из ΡΙΧ-дефицитной, например, гемофильной цельной крови). В другом примере ΡΙΧ-дефицитная плазма является человеческой ΡΙΧ-дефицитной или гемофилической плазмой. В еще другом примере ΡΙΧ-дефицитная кровь является человеческой ΡΙΧдефицитной кровью.

Термин "отсутствие тканевого фактора" означает, что экзогенный ТЕ не добавлен в качестве аналитического реагента. Однако малые количества ТЕ могут присутствовать в анализируемой смеси, например, как результат использования ΡΙΧ-дефицитной плазмы или крови, в которой может присутствовать экзогенный ТВ. Следовательно, низкий уровень активности тромбинообразования может быть измерен из-за присутствия эндогенного ТВ. Однако любая остаточная активность тромбинообразования может быть рассчитана с помощью построения стандартной кривой, как описано ниже. В одном примере концентрация ТΡ, присутствующая во время измерения, составляет меньше чем приблизительно 5 пМ, меньше чем приблизительно 1 пМ, меньше чем приблизительно 0,5 пМ, меньше чем приблизительно 0,1 пМ, меньше чем приблизительно 0,05 пМ или меньше чем приблизительно 0,01 пМ.

Непредвиденно изобретатели обнаружили, что малое количество тромбина, добавленное в анализируемую смесь в самом начале анализа (например, перед инициированием тромбинообразования), значительно повышает чувствительность анализа для измерения присутствия активированного белка ΡΙΧ в тестируемом образце. Например, "экзогенный тромбин" добавляют к анализируемой смеси перед измерением тромбинообразования, например перед инициированием реакции тромбинообразования (например, перед добавлением инициатора реакции). В одном примере тромбинообразование инициируют добавлением кальция в анализируемую смесь (т.е. рекальцификация). В одном примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления экзогенный тромбин присутствует (например, добавлен в анализируемую смесь перед инициацией реакции тромбинообразования) в концентрации не выше прибли- 7 028914

зительно 90 нМ, не выше приблизительно 80 нМ, не выше приблизительно 70 нМ, не выше приблизительно 60 нМ, не выше приблизительно 50 нМ, не выше приблизительно 40 нМ, не выше приблизительно 30 нМ, не выше приблизительно 20 нМ, не выше приблизительно 10 нМ или от приблизительно 1 нМ до приблизительно 20 нМ. В другом примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления экзогенный тромбин присутствует (например, добавлен в анализируемую смесь) в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,2 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,3 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,5 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,6 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,7 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,8 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,8 нМ, по меньшей мере приблизительно 1 нМ, по меньшей мере приблизительно 2 нМ, по меньшей мере приблизительно 3 нМ, по меньшей мере приблизительно 4 нМ или по меньшей мере приблизительно 5 нМ. В другом примере тромбин присутствует в концентрации приблизительно от 1 нМ до приблизительно 10 нМ или от приблизительно 3 нМ до приблизительно 8 нМ. В еще другом примере экзогенный тромбин присутствует в концентрации приблизительно 5 нМ.

В одном примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления измерение проводят в присутствии фосфолипидов (РЬ). Например, измерение проводят в присутствии по меньшей мере приблизительно 0,5 пМ, по меньшей мере приблизительно 1 пМ, по меньшей мере приблизительно 2 пМ, по меньшей мере приблизительно 3 пМ, по меньшей мере приблизительно 4 пМ, по меньшей мере приблизительно 5 пМ, по меньшей мере приблизительно 6 пМ, по меньшей мере приблизительно 7 пМ, по меньшей мере приблизительно 8 пМ, по меньшей мере приблизительно 9 пМ или по меньшей мере приблизительно 10 пМ фосфолипидов. Например, измерение проводят в присутствии от приблизительно 1 пМ до приблизительно 10 пМ, от приблизительно 2 пМ до приблизительно 6 пМ, приблизительно от 3 пМ до 5 пМ или приблизительно 4 пМ фосфолипидов.

В другом примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления белок, обладающий активностью ΡΙΧ, может быть любым белком фактора IX, например белком, описанным в данном документе. В другом примере согласно этому способу белок, обладающий активностью ΡΙΧ, является химерным белком ΡΙΧ, содержащим гетерологичный фрагмент, например, выбранный из тех, что описаны в данном документе. В еще другом примере белок, обладающий активностью ΡΙΧ, содержит гетерологичный фрагмент, выбранный из константной области иммуноглобулина (Рс) или ее части, альбумина или его части, полипептида ΧΤΕΝ, неразветвленного или разветвленного фрагмента полиэтиленгликоля (РЕС), последовательности РА§ и фрагмента гидроксиэтилового крахмала (ΗΕδ) или их производных. В дополнительном примере гетерологичный фрагмент содержит по меньшей мере одну область Рс или ее часть. В другом примере гетерологичный фрагмент содержит первую область Рс. В другом примере гетерологичный фрагмент содержит первую область Рс и дополнительно содержит вторую область Рс, причем вторая область Рс связана с первой областью Рс (например, ковалентной связью или нековалентной связью).

В еще другом примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления белок, обладающий активностью ΡIX, является рекомбинантным слитом белком фактора ΙΧ-Рс (ΡIX-Ρс), например, выбранным из тех, что описаны в данном документе.

В одном примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления способ дополнительно содержит (ίίί) построения стандартной кривой для активированного белка ΡIX. В одном примере стандартную кривую строят путем а) обеспечения образцов сравнения (например, по меньшей мере двух образцов сравнения), содержащих разные концентрации активированного белка ΡIX (например, экзогенного белка ΡIX); и Ь) измерение активности тромбинообразования для каждого образца сравнения с использованием анализа тромбинообразования (ТСА), описанного выше. Например, измерение проводят в присутствии ΡIX-дефицитной плазмы или крови, измерение проводят в присутствии экзогенного тромбина, причем экзогенный тромбин присутствует в концентрации не выше приблизительно 100 нМ, и измерение проводят в отсутствие тканевого фактора (ТР) (например, экзогенного ТР).

Концентрацию/количество активированного белка ΡIX в образцах сравнения определяют по активности тромбинообразования, измеренной в образцах сравнения.

В другом примере стандартную кривую строят путем а) смешивая повышающихся количеств активированного белка ΡIX (например, экзогенного активированного белка ΡIX, полученного из плазмы) с ΡIX-дефицитной плазмой или кровью (например, добавляя повышающиеся концентрации активированного белка ΡIX в ΡIX-дефицитную плазму), тем самым создавая ряд образцов сравнения, содержащих разные концентрации активированного белка ΡIX; и Ь) измерение активности тромбинообразования в каждом образце сравненя, используя анализ тромбинообразования (ТСА), описанный выше.

В одном примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления образцы сравнения, используемые для построения стандартной кривой, содержат от приблизительно 0 пМ до приблизительно 500 пМ, от приблизительно 0 пМ до приблизительно 400 пМ, от приблизительно 0 пМ до приблизительно 300 пМ, от приблизительно 0 пМ до приблизительно 200 пМ активированного белка ΡIX. В другом примере образцы сравнения, используемые для построения стандартной кривой, содержат от приблизительно 0 пМ до приблизительно 100 пМ активированного белка ΡIX.

В еще другом примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления вышеуказанный

- 8 028914

способ дополнительно содержит (ίν) использование стандартной кривой для определения концентрации/количества активированного белка ИХ в тестируемом образце.

В еще другом примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления способ полезен для измерения очень низких концентраций активированного белка ИХ. В одном примере ТСА приспосабливают для точного (например, с не выше чем ±10% изменчивостью в серии опытов) измерения меньше чем приблизительно 500 пМ, меньше чем приблизительно 400 пМ, меньше чем приблизительно 300 пМ, меньше чем приблизительно 200 пМ, меньше чем приблизительно 100 пМ, меньше чем приблизительно 90 пМ, меньше чем приблизительно 80 пМ, меньше чем приблизительно 70 пМ, меньше чем приблизительно 60 пМ, меньше чем приблизительно 50 пМ, меньше чем приблизительно 30 пМ, меньше чем приблизительно 20 пМ, меньше чем приблизительно 10 пМ или меньше чем приблизительно 5 пМ активированного белка ИХ в тестируемом образце или образце сравнения.

В дополнительном примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления меньше чем приблизительно 20%, меньше чем приблизительно 10%, меньше чем приблизительно 1% (мас./мас.), меньше чем приблизительно 0,9% (мас./мас.), меньше чем приблизительно 0,8% (мас./мас.), меньше чем приблизительно 0,7% (мас./мас.), меньше чем приблизительно 0,6% (мас./мас.), меньше чем приблизительно 0,5% (мас./мас.), меньше чем приблизительно 0,4% (мас./мас.), меньше чем приблизительно 0,3% (мас./мас.), меньше чем приблизительно 0,2% (мас./мас.) или меньше чем приблизительно 0,1% (мас/мас.) общего количества белка, обладающего активностью ИХ, содержащегося в тестируемом образце, присутствует в своей активированной форме.

В другом примере согласно любому вышеуказанному варианту осуществления меньше чем приблизительно 20%, меньше чем приблизительно 10%, меньше чем приблизительно 1%, меньше чем приблизительно 0,9%, меньше чем приблизительно 0,8%, меньше чем приблизительно 0,7%, меньше чем приблизительно 0,6%, меньше чем приблизительно 0,5%, меньше чем приблизительно 0,4%, меньше чем приблизительно 0,3%, меньше чем приблизительно 0,2% или меньше чем приблизительно 0,1% общей активности ТСА в тестируемом образце является результатом присутствия активированного белка ИХ.

В еще другом примере тестируемый образец содержит меньше чем приблизительно 50 пМ, меньше чем приблизительно 40 пМ, меньше чем приблизительно 30 пМ, меньше чем приблизительно 20 пМ, меньше чем приблизительно 10 пМ, меньше чем приблизительно 9 пМ, меньше чем приблизительно 8 пМ, меньше чем приблизительно 7 пМ, меньше чем приблизительно 6 пМ, меньше чем приблизительно 5 пМ, меньше чем приблизительно 4 пМ, меньше чем приблизительно 3 пМ или меньше чем приблизительно 2 пМ активированного белка ИХ.

I. Определения.

"Общие анализы гемостаза", как использовано в данном документе, являются анализами, которые определяют механические свойства сгусткообразования. Такие свойства ключают особенности изменений упругости при сдвиге развивающегося сгустка, определение кинетии образования сгустков, а также и силы, и стабильности образованного сгустка. Включенным в измеряемые свойства является тромбинообразование. Эти свойства можно измерить с помощью анализов, известных из уровня техники, включая анализ тромбинообразования (ТСА), тромбоэластографию (ТЕС), ротационную тромбоэластометрию (КОТЕМ®, оборудование и способы доступны от Тет 1п1сгпа11опа1 СтЬН, Митей, Сегтапу) и анализ формы сигналов. Как известно из уровня техники, тромбоэластометрия является вискозоэластометрическим методом для тестирования гемостаза в цельной крови. ТЕМ измеряет взаимодействие факторов свертывания крови, ингибиторов и клеточных компонентов во время фазы коагуляции и последующего лизиса в течение продолжительного времени. ТЕС является методом тестирования эффективности коагуляции в крови. Например, ТСА может использоваться для мониторинга количества активного тромбина, продуцируемого в плазме пациента после рекальцификации, который репрезентирует полезное показание в оценке коагуляционной способности гемофильной плазмы.

"Экзогенный" по отношению к веществу, используемому в аналитической процедуре (например, ТСА), означает, что вещество (например, тканевый фактор, тромбон) добавлено в аналитический раствор или аналитический буфер (например, в качестве реагента). Это же вещество может эндогенно присутствовать или нет, например, когда в анализе используют плазму цельной крови. Термин "экзогенный тромбин" нужно отличать от тромбина, который получают в анализе (например, анализ тромбинообразования). Например, "экзогенный тромбин" добавляют в анализируемую смесь перед инициированием реакции тромбинообразования, например с помощью добавления инициатора реакции. В одном примере тромбинообразование инициируют добавлением кальция к анализируемой смеси (т.е. рекальцификация). В другом примере "экзогенный тромбин" добавляют в анализируемую смесь перед инициированием тромбинообразования.

"Введение", как использовано в данном документе, означает предоставление фармацевтически приемлемого полипептида фактора VIII или 1Х, включая химерный полипептид, субъекту фармацевтически приемлемым путем. Путь введения включает внутривенный, например внутривенную инъекцию или внутривенную инфузию, например, через центральный венозный доступ. Дополнительные пути введения включают подкожное, внутримышечное, оральное, назальное или легочное введение. В некоторых вари- 9 028914

антах осуществления изобретения введение является подкожным. Химерные полипептиды факторов VIII и IX и гибридные белки могут вводиться в качестве части фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один эксципиент. Преимущества согласно настоящему изобретению включают усовершенствованную схему приема; снижение разрушений во время кровоточивости; повышенную защиту суставов от кровоточивости; предотвращение повреждений суставов; сниженную смерность; сниженную заболеваемость; длительную защиту от кровотечения; уменьшенные тромботическое и улучшенное качество жизни.

"Культура", "культивировать" и "культивирование", как использовано в данном документе, означает инкубирование клеток в ίη νίΐτο условиях, которые обеспечивают рост клеток и распространение и поддержание клеток в живом состоянии. "Культивированные клетки", как использовано в данном документе, означают клетки, которые размножаются ίη νίΐτο.

"Эквивалентное количество", как использовано в данном документе, означает некоторое количество активности факторов VIII или IX, выраженное в международных единицах, которое не зависит от молекулярного веса обсуждаемого полипептида. Одна Международная единица (МЕ) активности факторов VIII или IX соответствует приблизительно количеству факторов VIII или IX в одном миллилитре нормальной человеческой плазмы. Доступно несколько анализов для измерения активности факторов VIII или IX, включая тестирование с помощью хромогенного субстрата согласно Европейской Фармокопеи и одностадийный анализ коагулирующей активности.

"Полипептид", "пептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к полимерному соединению, содержащему ковалентно связанные аминокислотные остатки.

"Полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются взаимозаменяемо и относятся к полимерному соединению, содержащему ковалентно связанные нуклеотидные остатки. Полинуклеотиды могут быть ДНК, кДНК, РНК, одноцепочечными или двуцепочечными, векторами, плазмидами, фагами или вирусами. Полинуклеотиды включают полинуклеотиды из последовательностей в табл. 1, которые кодируют полипептиды из последовательностей в табл. 2 (см. последовательности табл. 1). Полинуклеотиды также включают фрагменты полинуклеотидов из последовательностей в табл. 1, например последовательности, которые кодируют полипептиды из последовательностей в табл. 2, такие как факторы VIII, IX, Ее, сигнальная последовательность, пропептид, бНгз и другие фрагменты полипептидов из последовательностей в табл. 2.

"Субъект", как использовано в данном документе, означает человека или нечеловеческое млекопитающее. Нечеловеческие млекопитающие включают мышей, собак, приматов, медведей, кошек, лошадей, коров, свиней и других домашних животных и мелких животных. Субъекты также включают педиатрических людей. Педиатрическими человеческими субъектами являются субъекты в возрасте от рождения и до 20 лет, например от рождения и до 18 лет, от рождения и до 1б лет, от рождения и до 15 лет, от рождения и до 12 лет, от рождения и до 11 лет, от рождения и до б лет, от рождения и до 5 лет, от рождения и до 2 лет.

Способы согласно изобретению могут применяться к субъектам, нуждающимся в контроле или предотвращении кровотечения, эпизодов кровотечения или гемофилических нарушений. Такие субъекты включают тех, которые нуждаются в контроле и предотвращении кровотечения при малых кровоизлияниях, гемартрозах. Такие субъекты включают тех, которые нуждаются в контроле или предотвращении кровотечения поверхностных мышц, кровотечения мягких тканей, умеренного кровотечения, внутримышечного и мягкотканевого кровотечения с расслоением, кровотечения слизистой оболочки, гематурии, обширного кровотечения, кровотечения глотки, заглоточного кровотечения, кровотечения забрюшинного пространства, кровотечения центральной нервной системы, гематомы, порезов, соскобов, суставных кровотечений, носового кровотечения, ротового кровотечения, кровоточивости десен, внутричерепного кровотечения, внутрибрюшинного кровотечения, малого спонтанного кровотечения, кровотечения после обширной травмы, умеренных кожных гематом или спонтанного кровотечения в суставах, мышцах, внутренних органах или головном мозге, но не ограничиваются ими. Такие субъекты также включают тех, которые нуждаются в периоперативном менеджменте, таком как управление кровотечением, связанным с хирургическим вмешательством или удалением зубов.

"Вариант", как использовано в данном документе, отностится к полинуклеотиду или полипептиду, отличающемуся от оригинального полинуклеотида или полипептида, но сохраняющего его необходимые свойства, например коагулирующую активность фактора VIII, коагулирующую активность фактора IX или активность Ее (связывание ЕеКи ЫпФпд). В основном варианты являются в целом полностью похожими и во многих участках идентичными оригинальному полинуклеотиду или полипептиду. Варианты включают полинуклеотидные или полипептидные фрагменты, делеции, вставки или модифицированные версии оригинальных полипептидов.

Вариантные полинуклеотиды могут содержать, или альтернативно, состоять из нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 9б, 97, 98 или 99% идентична, например, нуклеотиду, кодирующему последовательность в 8ЕЦ ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11 или 13 (часть фактора VIII, часть фактора IX, часть Ес, отдельно или вместе), или комплементарной нити вдобавок нуклеотидной кодирующей последовательности известного мутанта и рекомбинантного фактора VIII, фактора IX или

- 10 028914

Рс, как такие, что раскрыты в публикациях и патентах, указанных в данном документе, или комплементарной нити вдобавок нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид из ЗЕО ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 14 (часть фактора VIII, часть фактора IX, часть Рс, отдельно или вместе), и/или полинуклеотидных фрагментов любой из этих молекул нуклеиновых кислот (например, фрагменты, описанные в данном документе). Полинуклеотиды, которые гибридизируют с этими молекулами нуклеиновых кислот в жестких условиях гибридизации или в условиях пониженной жесткости, также включены в качестве вариантов, как и полипептиды, кодируемые этими полинуклеотидами, пока они функциональны.

Вариантные полинуклеотиды могут содержать, или альтернативно, состоять из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% идентична, например, полинуклеотидной последовательности, показанной в ЗЕО ГО N0: 2, 4, 8, 8, 10, 12 или 14 (часть фактора VIII, часть фактора IX, часть Рс, отдельно или вместе), и/или полинуклеотидных фрагментов любого из этих полинуклеотидов (например, фрагменты, описанные в данном документе).

Если нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% "идентичную" контрольной нуклеотидной последовательности, то предполагается, что нуклеотидная последовательность нуклеиновой кислоты идентична контрольной последовательности, если не считать того, что нуклеотидная последовательность может включать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов контрольной нуклеотидной последовательности. Иначе говоря для получения нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную контрольной нуклеотидной последовательности, до 5 % нуклеотидов в контрольной последовательности могут быть удалены или замещены другим нуклеотидом, или количество нуклеотидов до 5% от общего количества нуклеотидов в контрольной последовательности могут быть вставлены в контрольную последовательность. Запрошенная последовательность может быть, например, полной последовательностью в ЗЕО ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11 или 13, 0РР (открытой рамкой считывания) или любым фрагментом, определенным как описано в данном документе.

Полипептид, который является "выделенным", представляет собой полипептид, который находится в форме, отличной от той, что существует в природе. Выделенные полипептиды включают те, которые очищены до степени, когда они не длиннее формы, в которой обнаружены в природе. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид, который выделен, является в основном чистым.

"Рекомбинантный" полипептид или белок относится к полипептиду или протеину, полученному с помощью технологии, рекомбинантны ДНК. Рекомбинантно полученные полипептиды или белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, как задумано, выделяют для целей изобретения, как природные или рекомбинантные полипептиды, которые разделяют, фракционируют или частично или значительно очищают с помощью любого пригодного метода. Полипептиды, раскрытые в данном документе, например факторы свертывания крови или прокоагулянтные пептиды, могут быть получены рекомбинантно с использованием методов, известных из уровня техники. Альтернативно, белки и пептиды, раскрытые в данном документе, могут быть синтезированы химически.

"Консервативное аминокислотное замещение" является замещением, в котором аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, имеющим похожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи, определены в уровне техники, включая основные боковые цепи (например, Ьук, Лтд, Ηίκ), кислотные боковые цепи (например, Акр, О1и), незаряженные полярные боковые цепи (например, О1у, Аки, Οίη, Зег, ТЬг, Туг, Сук), неполярные боковые цепи (например, А1а, να1, Ьеи, Не, Рго, РИе. Ме1, Тгр), бета-разветвленные боковые цепи (например, ТЬт, να1, Не) и ароматические боковые цепи (например, Туг, РЬе, Тгр, Ηίκ). Таким образом, если аминокислоту в полипептиде заменяют другой аминокислотой из того же семейства боковых цепей, замещение считается консервативным. В другом варианте осуществления изобретения нить аминокислот может быть консервативно заменена структурно похожей нитью, которая отличается в порядке и/или композицией представителей семейства боковых цепей.

Неконсервативные замещения включают те, в которых (ί) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь (например, Агд, Ηίκ или Ьук) замещают электроотрицательным остатком (например, О1и или Акр), (ίί) гидрофильный остаток (например, Зег или ТЬг) замещают гидрофобным остатком (например, А1а, Ьеи, Не, РЬе или να1), (ίίί) цистеин или пролин замещают любым другим остатком, или (ίν) остаток, имеющий объемную гидрофобность или ароматическую боковую цепь (например, να1, Не, РЬе или Тгр), замещают остатком, имеющим маленькую боковую цепь (например, А1а, Зег) или не имеющим боковой цепи (например, О1у).

Термин "процент идентичности последовательности" между двумя полинуклеотидными или полипептидными последовательностями относится к количеству идентичных спаренных положений, принадлежащих последовательностям по всему окну сравнения, принимая во внимание добавки или делеции (например, бреши), которые могут вводиться для оптимального выравнивания двух последовательностей. Спаренное положение представляет собой любое положение, где идентичный нуклеотид или аминокислота присутствует и в последовательности-мишени, и в контрольной последовательности. Бреши, присутствующие в последовательности-мишени не подсчитываются, поскольку бреши не являются нуклеотидами или аминокислотами. Таким образом, бреши, присутствующие в контрольной последователь- 11 028914

ности, не подсчитываются, поскольку не подсчитываются нуклеотиды или аминокислоты последовательности-мишени без нуклеотидов или аминокислот из контрольной последовательности.

Процент идентичности последовательностей подсчитывают путем определения количества положений, в которых находятся идентичные остатки аминокислот и нуклеиновых оснований в обеих последовательностях для получения количества спаренных положений, деления количества спаренных положений на общее количество положений в окне сравнения и умножение полученного результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно совершать, применяя легко доступное программное обеспечение для оийие использования и для загрузки. Пригодные программные обеспечения доступны из разных источников и для выравнивания белковых и нуклеотидных последовательностей. Одной из доступных программ для определения процента идентичности последовательностей является ЬПкес.]. часть набора программ ВЬЛ8Т, доступная из веб-сайта Национального центра биотехнологической информации ВЙЛ8Т правительства США (ЫазкпсЫ.Ыт.шЬ.доу). В12зец осуществляет сравнение между двумя последовательностями, используя алгоритм ВЬЛЗТЫ или ВЙЛ8ТР. ВЬЛЗТЫ используется для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, тогда как ВЙЛ8ТР используется для сравнения аминокислотных последовательностей. Другими пригодными программами являются, например, №еб1е, 8йе1сйет, \Уа1ег или Ма1сйет, часть набора биоинформационных программ ЕМВО88, а также доступные от Эвропейского института биоинформаций (ЕВ1) на ууу.еЪкас.ик/ТооВ/рза.

Разные участки в пределах одной полинуклеотидной или полипептидной последовательностимишени, которую выравнивают с полинуклеотидной или полипептидной контрольной последовательностью, могут иметь свой собственный процент идентичности последовательностей. Принято к сведению, что значение процента идентичности последовательностей округляют до ближайшей десятой. Например, 80,11, 80,12, 80,13 и 80,14 округляют, понижая до 80,1, в то время как 80,15, 80,16, 80,17, 80,18 и 80,19 округляют, повышая до 80,2. Также принято к сведению, что значение длины всегда является целым числом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения процент идентичности "X" первой аминокислотной последовательности к второй аминокислотной последовательности рассчитывают как 100χ(Υ/Ζ), где Υ является количеством аминокислотных остатков, отмеченных как идентичные пары в выравнивании первой и второй последовательностях (как выравненных путем визуальной инспекции или конкретной программы выравнивания последовательностей), а Ζ является общим количеством остатков во второй последовательности. Если длина первой последовательности длиннее, чем у второй последовательности, то процент идентичности первой последовательности со второй последовательностью будет выше, чем процент идентичности второй последовательности с первой последовательностью.

Специалист в данной области техники примет во внимание, что создание линейной последовательности для подсчета процента идентичности не ограничивается бинарными сравнениями последовательность-последовательность, обусловленными только данными первичной последовательности. Линейные последовательности можно получить из множественного выравнивания последовательностей. Одной из пригодных программ для получения множественных выравниваний последовательностей является С1из1а1^2, доступная из ууу.с1ик1а1.огд. Другой пригодной программой является Ми8СЬЕ, доступная из \у\у\уДпуе5.сот/иш5с1е/. С1из1а1^2 и Ми8СЬЕ альтернативно доступны, например от ЕВ1.

Также следует принять во внимание, что линейные последовательности можно создавать путем суммирования данных последовательности с данными из гетерологичных источников, таких как структурные (например, кристаллографические структуры белков), функциональные данные (например, местонахождение мутаций) или филогенетические данные. Пригодной программой, которая суммирует неоднородные данные для создания множественных выравниваний последовательностей, является ТСойее, доступная из уууЛсойее.огд, и альтернативно доступная, например, от ЕВ1. Также следует принять во внимание, что конечное выравнивание, используемое для расчета процента идентичности последовательностей, может курироваться автоматически или вручную.

Если полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% "идентичную" контрольной аминокислотной последовательности согласно настоящему изобретению, то предполагается, что аминокислотная последовательность испытуемого полипептида идентична контрольной последовательности, если не считать того, что последовательность испытуемого полипептида может включать до пяти аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот контрольной аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность с контрольной аминокислотной последовательностью, вплоть до 5% аминокислотных остатков в испытуемой последовательности можно вставить, удалить или заменить другой аминокислотой. Эти изменения контрольной последовательности могут происходить в положениях на амино или карбоксильных концах контрольной аминокислотной последовательности или где угодно между этими терминальными положениями, разбросав индивидуально среди остатков в референтной последовательности или в одной, или более прилегающих группах в пределах контрольной последовательности.

На практике любой конкретный полипептид является по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или

- 12 028914

99% идентичным, например, аминокислотным последовательностям из ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 4, ЗЕО ГО N0: 6 или ЗЕО ГО N0: 14 (часть фактора VIII, часть фактора IX, часть Рс, отдельно или вместе), или полипептидной последовательности известных фактора VIII, или IX, или Рс, то это обычно можно определить, используя известные компьютерные программы. Один метод для определения лучшего полного спаривания между последовательностью запроса (контрольная или оригинальная последовательность) и испытуемой последовательностью, также рассматриваемый как глобальное выравнивание последовательности, можно определить, используя компьютерную программу ΡΑ3ΤΌΒ, базирующуюся на алгоритме из ВгиНад с1 а1., Сотр. Αρρ. Βίοδά. 6:237-245(1990), включен во всей полноте в данный документ путем ссылки. При выравнивании последовательностей последовательность запроса и испытуемая последовательность представляют собой нуклеотидные последовательности или аминокислотные последовательности. Результатом этого глобального выравнивания последовательностей является процент идентичности. Типичными параметрами, используемыми в аминокислотном выравнивании ΡΑ3ΤΌΒ, являются: матрица=РАМ 0, к-кортеж=2. Штраф за несоответствием, штраф за сопряжение=20, длина группы рандомизации=0, критическая оценка=1, размер окна=длина последовательности. Штраф за пропуск в последовательности=5, штраф за размер пропуска=0,05, размер окна=500 или длина испытуемой аминокислотной последовательности, какой бы не была короткой.

Если испытуемая последовательность короче, чем последовательность запроса из-за N или Сконцевых делеций, а не из-за внутренных делеций, то результаты могут корректироваться вручную. Это оттого, что программа ΡΑ3ΤΌΒ не учитывает N и С-концевые усечения испытуемой последовательности, когда рассчитывает общий процент идентичности. Для испытуемых последовательностей, усеченных на N и С-конце относительно последовательности запроса, процент идентичности корректируют путем подсчитывания количества остатков последовательности запроса, которые являются N и Сконцевыми в испытуемой последовательности, которые не спарены/выравнены с соответствующим испытуемым остатком, как процент общих оснований последовательности запроса. Является ли остаток спаренным/выравненным, определяют по результатам выравнивания последовательностей ΡΑ3ΤΌΒ. Этот процент затем вычитают из процента идентичности, рассчитанного с помощью вышеуказанной программы ΡΑ3ΤΌΒ, используя установленные параметры, для достижения окончательного показателя процента идентичности. Этот окончательный показатель процента идентичности используют для целей согласно настоящему изобретению. Только остатки на N и С-конце испытуемой последовательности, которые не спарены/выравнены с последовательностью запроса, предусмотрены для корректировки показателя процента идентичности вручную. Говоря иными словами, только положения остатков последовательности запроса вне отдаленных N и С-концевых остатков испытуемой последовательности.

Например, 90 аминокислотных остатков испытуемой последовательности выравнены с 100 остатками последовательности запроса для определения процента идентичности. Делеция происходит на N конце испытуемой последовательности, по этой причине выравнивание ΡΑ3ΤΌΒ не показывает спаривание/выравнивание первых 10 остатков на Ц-конце. 10 неспаренных остатков представляют 10% последовательности (количество остатков на N и С-конце не спаренных/общее количество остатков в последовательности запроса), поэтому 10% вычитают из показателя процента идентичности, рассчитенного с помощью программы ΡΑ3ΤΌΒ. Если оставшиеся 90 остатков были отлично спарены, то конечный процент идентичности составляет 90%. В другом примере 90 аминокислотных остатков испытуемой последовательности сравнивают со 100 остатками последовательности запроса. Этот размер делеций является внутренними делециями, поэтому нет остатков на Ц-или С-конце испытуемой последовательности, которые не спарены/выравнены с запросом. В этом случае процент идентичности, рассчитанный с помощью программы ΡΑ3ΤΌΒ, не корректируется вручную. Еще раз только положения остатков вне N и Стерминальных концов испытуемой последовательности, как показано в выравнивании ΡΑ3ΤΌΒ, которые являются не спаренными/выравненными с последовательностью запроса, корректируются вручную.

Полинуклеотидные варианты могут содержать изменения в кодирующих участках, некодирующих участках или в обеих. Примеры включают, без ограничения, полинуклеотидные варианты, содержащие изменения, которые продуцируются молчащими замещениями, добавками или делециями, но не изменяют свойства или активности кодируемого полипептида. Нуклеотидные варианты могут продуцироваться молчащими замещениями из-за вырождения генетического кода. Кроме того, включены варианты, в которых 5-10, 1-5 или 1-2 аминокислот замещены, удалены или добавлены в любой комбинации. Полинуклеотидные варианты могут продуцироваться для разных целей, например для оптимизации экспрессии кодона для конкретного хозяина (замена кодонов в человеческой мРНК кодонами, предпочтительными для бактериального хозяина, такого как Е. соН).

Варианты природного происхождения названы "аллельными вариантами" и относятся к одной или нескольким альтернативным формам гена, оккупирующими заданный локус на хромосоме в организме (Сспс5 II, ЬеМи В., οά., Ιοίιη \УПеу & 3οηδ, №ν Уогк (1985)). Эти аллельные варианты могут изменяться на полинуклеотидном и/или полипептидном уровне, они включены в настоящее изобретение. Альтернативно, не встречающиеся в природе варианты могут продуцироваться с помощью технологий мутагенеза или прямого синтеза.

Используя известные способы конструирования белков и технологию рекомбинантного ДНК, вари- 13 028914

анты могут быть получены для улучшения или изменения характеристик полипептидов. Например, одну или более аминокислот можно удалить с Ν-конца или С-конца секретированного белка без существенной потери биологической функции. Авторы Кои с1 а1., 1. ΒίοΙ. СЬет. 268: 2984-2988 (1993), включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки, сообщают вариантные протеины КОР, обладающие гепаринсвязывающей активностью даже после удаления 3, 8 или 27 аминоконцевых аминокислотных остатков. Подобным образом, интерферон гамма демонстрировал до десяти раз высшую активность после удаления 8-10 аминокислотных остатков с карбоксиконца этого белка (ЭоЬеЬ е! а1., 1. Вю1есЬио1оду 7:199-216 (1988), включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки).

Более того, достаточное доказательство демонстрирует, что варианты часто остаются биологически активными подобно белку природного происхождения. Например, Оау1е и сотрудники (1. Вю1. СЬет. 268:22105-22111 (1993), включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки) провели большой мутационный анализ человеческого цитокина 1Ь-1а. Они использовали случайный мутагенез для получения более 3500 индивидуальных мутантов 1Ь-1а, что в среднем равнялось 2,5 аминокислотным изменениям на вариант по всей длине молекулы. Многочисленные мутации исследовались в каждом возможном аминокислотном положении. Исследователи обнаружили, что "[т]о81 молекулы может заменяться с небольшим влиянием на [связывающую или биологическую активность]" (см. реферат). Фактически только 23 уникальные аминокилотные последовательности из более чем 3500 исследованных нуклеотидных последовательностей продуцировали белок, который значительно отличался по активности от дикого типа.

Как указано выше, полипептидные варианты включают модифицированные полипептиды. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, ΆΌΡ-рибосилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение фрагмента гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование ΟΡΙ-якоря, гидроксилирование, йодинирование, метилирование, миристоилизацию, окисление, пегилирование, протеолитическую обработку, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селенирование, сульфатацию, перенос РНК, опосредованный добавлением аминокислот к белкам, такой как аргинилирование, и убиквитинирование.

Термин "приблизительно" используется в данном документе для обозначения около, округленно, близко или в районе. Когда термин "приблизительно" используют в связи с числовым диапазоном, он изменяет диапазон, расширяя его за пределы выше или ниже числовых значений, указанных в нем. Так, "приблизительно 10-20" означает "приблизительно от 10 до приблизительно 20". Обычно термин "приблизительно" используют в данном документе для изменения числового значения выше или ниже указанного значения путем изменения на 10% вверх или вниз (выше или ниже).

Как использовано в данном документе, термин "медицинский работник" относится к индивидуумам или учреждениям, которые непосредственно взаимодействуют и управляют живыми субъектами, например человеческими пациентами. Неограничивающие примеры медицинских работников включают врачей, медицинских сестер, лаборантов, терапевтов, фармацевтов, советников, врачей, практикующих в нетрадиционной медицине, лечебно-профилактические учреждения, врачебные кабинеты, госпитали, пункты первой помощи, клиники, центры оказания неотложной помощи, клиники/учреждения нетрадиционной медицины и любые другие подразделения, обеспечивающие общее и/или специализированное лечение, оценку, поддержание, терапию, медикаментозное лечение и/или консультацию относительно всего или любой части состояния здоровья пациента, включая основное медицинское, специализированное медицинское, хирургическое лечение и/или любой другой тип лечения, оценки, поддержания, терапии, медикаментозного лечения и/или консультации, но не ограничиваясь ими.

Как использовано в данном документе, термин "клиническая лаборатория" относится к учреждению для исследования или обработки материалов от живых субъектов, например человека. Неограничивающие примеры обработки включают биологическую, биохимическую, серологическую, химическую, иммуногематологическую, гематологическую, биофизическую, цитологическую, патологическую, генетическую или другое исследование материалов, полученных из тела человека с целью обеспечения информации, например для диагностирования, предупреждения или лечения любого заболевания или ухудшения или для оценки здоровья живых субъектов, например человека. Эти исследования могут также включать процедуры для сбора или получения иным путем образца, препарирования, определения, измерения или описания другим путем присутствия или отсутствия различных веществ в теле живого субъекта, например человека, или в образце, полученном из тела живого субъекта, например человека. В некоторых аспектах клиническая лаборатория может быть "централизованной" или "локальной", подразумевается, что небольшое количество или одна лаборатория делает все измерения образцов, предоставленных из всех внешних источников. В других аспектах многочисленные клинические лаборатории, именуемые как "сателитные" или "общие" лаборатории, могут быть валидированными по всем регламентируемым стандартам, надежным результатам, которые можно легко сравнить.

- 14 028914

Как использовано в данном документе, термин "работник медицинского обеспечения" охватывает индивидуальные лица, организации или группы, обеспечивающие, дарящие, жертвующие, оплачивающие полностью или частично или связанные иным способом с предоставлением пациенту доступа к одному или более медицинским обеспечениям, планам льгот, предоставляемых работодателем, медицинскому страхованию и/или медицинским программам расходных счетов.

В некоторых аспектах медицинский работник может руководить и инструктировать другого медицинского работника касательно введения терапии для лечения заболевания или нарушения свертываемости крови. Медицинский работник может снабжать инструментами и инструктировать другого медицинского работника или пациента касательно проведения следующих действий: взятие образца, обработка образца, предоставление образца, получение образца, передача образца, анализ или измерение образца, количественное определение образца, обеспечение результатов, полученных после анализирования/измерения/количественного определения образца, поступление результатов, полученных после анализирования/измерения/количественного определения образца, сравнивать/оценивать результаты, полученные после анализирования/измерения/количественного определения образца, обеспечивать сравнение/оценку одного или более образцов, получать сравнение/оценку одного или более образцов, вводить терапию или терапевтический агент (например, фактор свертывания крови, такой как полипептид фактора VIII или IX), начинать введение терапии, прекращать введение терапии, продолжать введение терапии, временно прерывать введение терапии, повышать количество введенного терапевтического агента, снижать количество введенного терапевтического агента, продолжать введение количества терапевтического агента, повышать частоту введения терапевтического агента, снижать частоту введения терапевтического агента, поддерживать такой же частоту дозирования терапевтического агента, заменять терапию или терапевтический агент, по меньшей мере, другой терапией или терапевтическим агентом, комбинировать терапию или терапевтический агент, по меньшей мере, с другой терапией или дополнительным терапевтическим агентом. В некоторых аспектах работник медицинского обеспечения может санкционировать или запрещать, например, сбор образца, обработку образца, представление образца, поступление образца, передачу образца, анализ или измерение образца, количественное определение образца, обеспечение результатов, полученных после анализирования/измерения/количественного определения образца, поступление результатов, полученных после анализирования/измерения/количественного определения образца, сравнивать/оценивать результаты, полученные после анализирования/измерения/количественного определения образца, обеспечивать сравнение/оценку одного или более образцов, получать сравнение/оценку одного или более образцов, вводить терапию или терапевтический агент, начинать введение терапии, прекращать введение терапии, продолжать введение терапии, временно прерывать введение терапии, повышать количество введенного терапевтического агента, снижать количество введенного терапевтического агента, продолжать введение количества терапевтического агента, повышать частоту введения терапевтического агента, снижать частоту введения терапевтического агента, поддерживать такой же частоту дозирования терапевтического агента, заменять терапию или терапевтический агент, по меньшей мере, другой терапией или терапевтическим агентом, комбинировать терапию или терапевтический агент, по меньшей мере, с другой терапией или дополнительным терапевтическим агентом.

В дополнение работник медицинского обеспечения может, например, санкционировать или запрещать назначение терапии, санкционировать или запрещать страхование терапии, санкционировать или запрещать возмещать стоимость терапии, определять или запрещать пригодность терапии и т.п.

В некоторых аспектах клиническая лаборатория может, например, собирать или получать образец, обрабатывать образец, получать образец, передавать образец, анализировать и измерять образец, количественно определять образец, обеспечивать результаты, полученные после анализирования/измерения/количественного определения образца, получать результаты, полученные после анализирования/измерения/количественного определения образца, сравнивать/оценивать результаты, полученные после анализирования/измерения/количественного определения одного или более образцов, обеспечивать сравнение/оценку одного или более образцов, получать сравнение/оценку одного или более образцов.

Перечисленные выше действия могут проводиться медицинским работником, работником медицинского обеспечения или пациентом автоматически, используя компъютерно-выполнимый метод (например, через веб-сервис или автономную компьютерную систему).

Сокращения.

- 15 028914

лису·,.

лис_а

лиср

А1рНа НЬ

Ве1аНЬ

С168

Стах

СУ%

С1

ινκ

К-значение

МКТ

N

N0

ΝΚ

δϋ

δΕ

ТВЬР1

ТВЬРЗ

ТВЬР5

ИСХОД. У88

νί

ЕХТЕМ

ΙΝΤΕΜ

Площадь под кривой зависимости концентрации от времени от ноля до бесконечности

Площадь под кривой зависимости концентрации от времени в течение фазы распределения

Площадь под кривой зависимости концентрации от времени в течение фазы элиминации

Полупериод фазы распределения

Полупериод фазы элиминации; также именуемый как На

Предполагаемая активность Р1ХРс выше исходной приблизительно на 168 часе после дозы

Максимальная концентрация, возникающая при Т_тях

Процентный коэффициент вариаций

Клиренс

ίη νίνο восстановление (%)

Постепенное восстановление

Средне время удержания

Номер

Нерасчитываемый

Не сообщается

Допустимое отклонение

Допустимая ошибка

Прогнозированное на основе модели время после дозы, когда активность Р1ХРс опустилась до, приблизительно, 1 МЕ/длвыше исходной Прогнозированное на основе модели время после дозы, когда активность Р1ХРс опустилась до, приблизительно, 3 МЕ/длвыше исходной Прогнозированное на основе модели время после дозы, когда активность Р1ХРс опустилась до, приблизительно, 5 МЕ/длвыше исходной Объем распределения в равновесном состоянии

Объем распределения центральной камеры

Тромбоэластометрия с использованием внешнего активатора, такого как тканевый фактор (ТЕ)

Тромбоэластометрия с использованием внутреннего активатора, такого как элаговая кислота

ΝΑΤΕΜ Тромбоэластометрия с использованием природного активатора после рекальцификации

КОТЕМ® Ротационная тромбоэластометрия РРР Обедненная тромбоцитами плазма

II. Фактор VIII и полипептиды фактора IX.

А. Полипептиды фактора VIII.

"Фактор VIII", как использовано в данном документе, означает функциональный полипептид фактора VIII в его нормальной роли в коагуляции, если специально не указано иное. Таким образом, термин фактор VIII включает варианты полипептидов, которые являются функциональными. Белки фактора VIII включают человеческие, свиные, собачьи и мышиные белки фактора VIII. Известны непроцессированные полипептидные и полинуклеотидные последовательности, как и многочисленные функциональные фрагменты, мутанты и модифицированные версии. Примеры последовательностей человеческого фактора VIII показаны в последовательностях в БЕр ГО N0: 2, 6, 8, 10 и 12 (последовательность в табл. 2). Полипептиды фактора VIII включают, например, непроцессированный фактор VIII, непроцессированный фактор VIII минус Ме! на Ν-конце, зрелый фактор VIII (минус сигнальная последовательность), зрелый фактор VIII с дополнительным Ме! на Ν-конце и/или фактор VIII с полностью или частично удаленном В-доменом. Полипептиды фактора VIII включают делеции В-домена, полное или частичное удаление сигнальной цепи РУШ. Фактор VIII можно получить с помощью рекомбинантных средств ("рекомбинантный фактор VIII или гРУШ), т.е. он не встречается в природе и не получен из плазмы.

"В-домен" фактора VIII, как использовано в данном документе, является тем же, что и В-домен, известный из уровня техники, который определяется идентичностью внутренней аминокислотной последовательности и сайтами протеолитического расщепления тромбином, например остатками Бег741-Аг§1648 непроцессированного человеческого фактора VIII. Другие домены человеческого фактора VIII определяют по следующим аминокислотным остаткам: А1, остатки А1а1-Аг§372; А2, остатки Бег373-Аг§740; А3, остатки Бег1690-Ие2032; С1, остатки Агд2033-Азп2172; С2, остатки Бег2173-Туг2332. Последовательность А3-С1-С2 включает остатки Бег1690-Туг2332. Остаточная последовательность, остатки О1и1649-Аг§1689, обычно именуется как активационный пептид легкой цепи фактора VIII. Местонахождение пределов всех доменов, включая В-домены свиного, мышиного и собачьего фактора VIII, также известны из уровня техники. В некоторых аспектах В-домен фактора VIII удален ("фактор VIII с удаленным В-доменом" или "ΒΌΌ ΗΥΕΤ'). Примером ΒΌΌ РVIII является НЕРАСТ0 (рекомбинантный ΒΌΌ РVIII), который имеет ту же последовательность как и часть последовательности фактора VIII в последовательностях в табл. 2А(1) (аминокислоты от 19 до 1438 или от 1 до 1438 в БЕр ГО N0: 2).

"Фактор VIII с удаленным В-доменом", который может иметь полное удаление или частичные делеции, раскрыт в патентах США №№ 6316226, 6346513, 7041635, 5789203, 6060447, 5595886, 6228620, 5972885, 6048720, 5543502, 5610278, 5171844, 5112950, 4868112 и 6458563, каждый из них включен во

- 16 028914

всей полноте в данный документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность фактора VIII с удаленным В-доменом согласно настоящему изобретению содержит любую одну из делеции, раскрытых в колонке 4, от линии 4 до линии 28 в колонке 5 и в примерах 1-5 патента США № 6316226 (также в патенте США № 6346513). В некоторых вариантах осуществления изобретения фактор VIII с удаленным В-доменом согласно настоящему изобретению имеет делецию, раскрытую в колонке 2, линии 26-51 и в примерах 5-8 патента США № 5789203 (патенты США №№ 6060447, 5595886 и 6228620). В некоторых вариантах осуществления изобретения фактор VIII с удаленным В-доменом имеет делецию, описанную в колонке 1, от линии 25 до линии 40 в колонке 2, патента США № 5972885; кол. 6, линии 1-22 и пример 1 патента США № 6048720; кол. 2, линии 17-46, патента США № 5543502; кол. 4, от линии 22 до линии 36 в кол. 5, патента США № 5171844; кол. 2, линии 55-68, фиг. 2 и пример 1 патента США № 5112950; кол. 2, от линии 2 до линии 21 в кол. 19, и табл. 2 патента США № 4868112; кол. 2, от линии 1 до линии 19 в кол. 3, от линии 40 до линии 67 в кол. 4, 7, от линии 43 до линии 26 в кол. 8 и 11, от линии 5 до линии 39 в кол. 13, патента США № 7041635 или кол. 4, линии 25-53, патента США № 6458563. В некоторых вариантах осуществления изобретения фактор VIII с удаленным В-доменом имеет делецию большинства В-домена, но все еще содержит аминоконцевые последовательности В-домена, которые необходимы для ίη νίνο протеолитического процессирования исходного трянсляционного продукта в две полипептидные цепи, как описано в АО 91/09122, который включен во всей полноте в данный документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения фактор VIII с удаленным В-доменом конструируют с делецией аминокислот 747-1638, например виртуально полное удаление В-домена. НоеЬеп К.С, е! а1., ί. ΒίοΙ. СЬет. 265 (13): 7318-7323 (1990), включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки. Фактор VIII с удаленным В-доменом также может содержать делецию аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 фактора VIII. МеиЪеп Р., е! а1., Рго!еш Епд. 2(4): 301-6 (1988), включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки. Дополнительные делеции В-домена, которые являются частью изобретения, включают, например, делецию аминокислот с 982 по 1562 или с 760 по 1639 (Тоо1е е! а1., Ргос. Ν;·ι11. Асай. 8с1. И.8.А. (1986) 83, 5939-5942)), с 797 по 1562 (Еа!оп, е! а1., В1осЬет18Ьу (1986) 25:8343-8347)), с 741 по 1646 (КаиТтап (опубликованная заявка РСТ № АО 87/04187)), 747-1560 (8зг\ег. е! а1., ΌΝΑ (1987) 6:553-564)), с 741 по 1648 (Ракек (заявка РСТ № АО 88/00831)), с 816 по 1598 или с 741 по 1689 (Ьадпег (ВеЬгшд Шк!. МЬ!. (1988) № 82:16-25, ЕР 295597)), каждый из них включен во всей полноте в данный документ путем ссылки.

В других вариантах осуществления изобретения ΒΌΌ РУШ включает полипептид РУШ, содержащий фрагменты В-домена, которые сохранили один или более Ν-присоединенных сайтов гликозилирования, например остатки 757, 784, 828, 900, 963 или оптимально 943, которые соответствуют аминокислотной последовательности непроцессированной последовательности РVШ. Примеры фрагментов Вдомена включают 226 аминокислот или 163 аминокислот В-домена, как описано у М1ао Η.Ζ., е! а1., В1оой 103(а): 3412-3419 (2004), Какийа А., е! а1., ί. ТЬготЬ. Наеток!. 6: 1352-1359 (2008), и Р1ре 8.А., е! а1., ί. ТЬготЬ. Наеток!. 9: 2235-2242 (2011) (например, первые 226 аминокислот или 163 аминокислот Вдомена сохранены). В еще других вариантах осуществления изобретения ΒΌΌ РVШ дополнительно содержит точечные мутации в остатке 309 (от РЬе до 8ег) для улучшения экспрессии белка ΒΌΌ РVШ (см. М1ао Η.Ζ., е! а1., Β^ά 103(а): 3412-3419 (2004)). В еще других вариантах осуществления изобретения ΒΌΌ ЕШП включает полипептид Ε^Π, содержащий часть В-домена, но не содержащий один или более фуриновых сайтов расщепления (например, Агд1313 и Агд 1648) (см. Р1ре 8.А., е! а1., ί. ТЬготЬ. Наеток!. 9: 2235-2242 (2011). Рекомендации включены в данный документ путем ссылки, и каждая из вышеуказанных делеций может быть осуществлена в любой последовательности фактора VIII.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ΕΥΠ включает одноцепочечный полипептид ΕVШ. В одном варианте осуществления одноцепочечный полипептид ЕШП может содержать одну или более мутаций или замещений при К1645 и/или К1648, соответствующих непроцессированной последовательности фактора VIII. Дополнительные примеры одноцепочечных полипептидов ЕШП могут быть найдены в предварительной заявке США № 61/668889, поданной 6 июля 2012, которая включена во всей полноте в данный документ путем ссылки. В другом варианте осуществления изобретения одноцепочечный полипептид ЕШП содержит полипептид ΕΎΉ, имеющий делеции в К1645 или К1648, соответствующих непроцессированной последовательности ΕΎΉ, или делеции последовательности, содержащей К1645 или К1648, соответствующих непроцессированному ΡΎΣΗ. Например, одноцепочечный ЕШП может содержать делецию аминокислотных положений от 746 до 1649, от 746 до 1652, от 746 до 1655, от 758 до 1649, от 758 до 1652, от 758 до 1655, от 765 до 1649, от 765 до 1652, от 765 до 1655, от 748 до 1658, от 755 до 1658, от 762 до 1658, от 769 до 1658, от 776 до 1658 или от 783 до 1658, соответствующих непроцессированной последовательности ΕVШ. Дополнительные примеры одноцепочечного ЕШП можно найти в патенте США № 7041635, поданном 3 января 2003, который включен во всей полноте в данный документ путем ссылки.

Огромное количество функциональных вариантов фактора VIII известно, как обговорено выше и ниже. Кроме того, обнаружены тысячи нефункциональных мутаций фактора VIII у пациентов с гемофилией, и было определено, что действие этих мутаций на функцию фактора VIII больше, когда они располагаются в трехмерной структуре фактора VIII, а не в природе замещения (Си!1ег е! а1., Нит. Ми!а!.

- 17 028914

19:274-8 (2002), включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки). Кроме того, сравнение между фактором VIII от человека и других видов обнаружило сохраненные остатки, которые, вероятно, необходимы для функции (Сатегоп е! а1., ТЬготЬ. Наеток!. 79:317-22 (1998); США 6251632), включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки.

Ген человеческого фактора VIII был выделен и экспрессирован в клетки млекопитающего (Тоо1е II, е! а1., Уинге 312:342-347 (1984); ОШеЫег I., е! а1., Уинге 312:326-330 (1984); Аооб АТ., е! а1., Ыа1ше 312:330-337 (1984); УеЬаг С.Л., е! а1., Уинге 312:337-342 (1984); АО 87/04187; АО 88/08035; АО 88/03558; патент США № 4757006), каждый из них включен во всей полноте в данный документ путем ссылки, а аминокислотная последовательность была выведена из кДНК. Сароп е! а1., патент США № 4965199, включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки, раскрывает метод рекомбинантных ДНК для получения фактора VIII в млекопитающих и очистку человеческого фактора VIII. Сообщалось о экспрессии фактора VIII в клетках СНО (яичник китайского хомячка) и ВНКС (клетки почки новорожденного хомяка). Человеческий фактор VIII модифицировали для удаления части или всего Вдомена (патенты США № 4994371 и 4868112, каждый из них включен во всей полноте в данный документ путем ссылки), и проводили замещение В-домена человеческого фактора VIII В-доменом человеческого фактора V (патент США № 5004803, включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки). Последовательность кДНК, кодирующая человеческий фактор VIII, и предсказанная аминокислотная последовательность показаны в δΕΟ ГО 1 и 2 соответственно в публикации заявки США № 2005/0100990, включенной в данный документ во всей полноте путем ссылки.

Патент США № 5859204 Ьо11аг Τδ., включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки, раскрывает функциональные мутанты фактора VIII, обладающие сниженной антигенностью и сниженной иммуногенностью. Патент США № 6376463, Ьо11аг Τδ., включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки, также раскрывает мутанты фактора VIII, обладающие сниженной иммуногенностью. Публикация заявки США № 2005/0100990, §аепко е! а1., включенная в данный документ во всей полноте путем ссылки, раскрывает функциональные мутации в домене А2 фактора VIII.

Количество молекул функционального фактора VIII, включая делеции В-домена, описаны в следующих патентах США №№ 6316226 и 6346513, переуступлены Вах!ег; № 7041635 переуступленный Ш2Оеп; №№ 5789203, 6060447, 5595886 и 6228620, переуступленные СЫгоп; №№ 5972885 и 6048720, переуступленные ВюуЬгит, №№ 5543502 и 5610278, переуступленные Ыоуо ЫогШкк; № 5171844, переуступленный Iттиηо Ад; № 5112950, переуступленный Тгапкдепе 8.А.; № 4868112, переуступленный Оепе!1С8 ЬъШШе. каждый из них включен во всей полноте в данный документ путем ссылки.

Опубликована последовательность фактора VIII свиньи (Тоо1е И, е! а1., Ргос. УШ. Асаб. δα. И8А 83:5939-5942 (1986)), включенная в данный документ во всей полноте путем ссылки, и описана полностью свиная последовательность кДНК, полученная из ПЦР-амплификации последовательностей фактора VIII из библиотеки кДНК селезенки свиньи (Неа1еу ТР., е! а1., В1ооб 88:4209-4214 (1996), включенных в данный документ во всей полноте путем ссылки). Гибрид человеческого/свиного фактора VIII, имеющий замещения всех доменов, всех субъединиц и специфических аминокислотных последовательностей, раскрыт в патенте США № 5364771, Ьо11аг апб Кипде, и в АО 93/20093, включенных в данный документ во всей полноте путем ссылки. Совсем недавно сообщалось о нуклеотидной и соответствующей аминокислотной последовательностях доменов А1 и А2 свиного фактора VIII и химерном факторе VIII со свиными доменами А1 и/или А2, замещенными соответствующими человеческими доменами (АО 94/11503, включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки). Патент США № 5859204, Ьо11аг Τδ. также раскрывает свиную кДНК и выведенные аминокислотные последовательности. Патент США № 6458563, включенный в данный документ во всей полноте путем ссылки, переуступленный Итогу, раскрывает свиной фактор VIII с удаленным В-доменом.

Фактор VIII (или часть фактора VIII химерного полипептида) может быть по меньшей мере на 90 или 95% идентичным аминокислотной последовательности фактора VIII, показанной в последовательностях в табл. 2 без сигнальной последовательности (аминокислоты от 1 до 1438 в δΕΟ ГО NО: 2; аминокислоты от 1 до 2332 в δΕΟ ГО NО: 6; аминокислоты от 1 до 740 в δΕΟ ГО NО: 8; аминокислоты от 1 до 745 в δΕΟ ГО NО: 10 или аминокислоты от 1 до 684 в δΕΟ ГО NО: 12). Фактор VIII (или часть фактора VIII химерного полипептида) может быть идентичным аминокислотной последовательности фактора VIII, показанной в последовательностях в табл. 2 без сигнальной последовательности (аминокислоты от 1 до 1438 в δΕΟ ГО NО: 2; аминокислоты от 1 до 2332 в δΕΟ ГО NО: 6; аминокислоты от 1 до 740 в δΕΟ ГО NО: 8; аминокислоты от 1 до 745 в δΕΟ ГО NО: 10 или аминокислоты от 1 до 684 в δΕΟ ГО NО: 12).

Фактор VIII (или часть фактора VIII химерного полипептида) может быть по меньшей мере на 90 или 95% идентичным аминокислотной последовательности фактора VIII, показанной в последовательностях в табл. 2, с сигнальной последовательностью (аминокислоты от 19 до 1438 в δΕΟ ГО NО: 2; аминокислоты от 19 до 2332 в δΕΟ ГО NО: 6; аминокислоты от 19 до 740 в δΕΟ ГО NО: 8; аминокислоты от 19 до 745 в δΕΟ ГО NО: 10 или аминокислоты от 20 до 684 в δΕΟ ГО NО: 12). Фактор VIII (или часть фактора VIII химерного полипептида) может быть идентичным аминокислотной последовательности фактора VIII, показанной в последовательностях в табл. 2, с сигнальной последовательностью (аминокислоты от 19 до 1438 в δΕΟ ГО NО: 2; аминокислоты от 19 до 2332 в δΕΟ ГО NО: 6; аминокислоты от 19 до 740 в

- 18 028914

БЕф ΙΌ N0: 8; аминокислоты от 19 до 745 в БЕф ГО N0: 10 или аминокислоты от 20 до 684 в БЕф ГО N0: 12).

В. Полипептиды фактора IX.

"Фактор IX", "ΡΙΧ", "белок, обладающий активностью ΡΙΧ", "белок ΡΙΧ" или "полипептид ΡΙΧ", как использовано в данном документе, означает функциональный полипептид фактора ΙΧ в его природной роли в коагуляции, если специально не указано иное. Таким образом, термин "фактор ΙΧ" включает вариантные полипептиды, которые являются функциональными, и полинуклеотиды, которые кодируют такие функциональные вариантные полипептиды. Полипептиды фактора ΙΧ включают человеческие, бычьи, свиные, собачьи, кошачьи и мышиные полипептиды фактора ΙΧ. Непроцессированные полипептидные и полинуклеотидные последовательности фактора ΙΧ известны, как и многие функциональные варианты, например, фрагменты, мутанты и модифицированные версии. Полипептиды фактора ΙΧ включают непроцессированный фактор ΙΧ, непроцессированный фактор ΙΧ минус Ме! на Ν-конце, непроцессированный фактор ΙΧ минус сигнальная последовательность, зрелый фактор ΙΧ (минус сигнальная последовательность и пропептид) и зрелый фактор ΙΧ с дополнительным Ме! на Ν-конце. Фактор ΙΧ можно получить с помощью рекомбинантных средств ("рекомбинантный фактор ΙΧ" или "τΡΙΧ"), т.е. он не встречается в природе и не получен из плазмы.

Известно огромное количество функциональных вариантов фактора ΙΧ. Международная публикация номер \У0 02/040544 А3, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки, раскрывает мутанты, которые демонстрируют повышенную резистентность к ингибированию гепарином, на 15, линии 6-31. Международная публикация номер \У0 03/020764 А2, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки, раскрывает мутанты фактора ΙΧ со сниженной Т-клеточной иммуногенностью в табл. 2 и 3 (на с. 14-24) и на с. 12, линии 1-27. Международная публикация номер \У0 2007/149406 А2, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки, раскрывает молекулы функционального мутантного фактора ΙΧ, которые демонстрируют повышенную белковую стабильность, повышенное ίη νίνο и ίη νίίτο, время полураспада и повышенную резистентность к протеазам, на с. 4 от линии 1 до линии 11 на с. 9. \У0 2007/149406 А2 также раскрывает химерные и другие вариантные молекулы фактора ΙΧ на с. 19, от линии 12 до линии 9 на с. 20. Международная публикация номер \У0 08/118507 А2, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки, раскрывает мутанты фактора ΙΧ, которые демонстрируют повышенную коагулирующую активность, на с. 5, от линии 14 до линии 5 на с. 6. Международная публикация номер \У0 09/051717 А2, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки, раскрывает мутанты фактора ΙΧ, имеющие увеличенное количество Ν-связанных и/или О-связанных сайтов гликозилирования, которые приводят к повышенному времени полураспада и/или выведения, на с. 9, от линии 11 до линии 2 на с. 20. Международная публикация номер \У0 09/137254 А2, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки, также раскрывает мутанты фактора ΙΧ с повышенным количеством сайтов гликозилирования на с. 2, параграф [006] на с. 5, параграф [011] на с. 16, от параграфа [044] до параграфа [057] на с. 24. Международная публикация номер \У0 09/130198 А2, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки, раскрывает молекулы мутантного фактора ΙΧ, которые имеют повышенное количество сайтов гликозилирования, которые вызывают повышенное время полураспада, на с. 4, от линии 26 до линии 6 на с. 12. Международная публикация номер \У0 09/140015 А2, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки, раскрывает функциональные мутанты фактора ΙΧ, которые имеют повышенное количество остатков Су8, которые могут быть использованы для полимерной конъюгации (например, РЕС), на с. 11, от параграфа [0043] до параграфа [0053] на с. 13.

Кроме того, у пациентов с гемофилией были идентифицированы тысячи нефункциональных мутаций в факторе ΙΧ, многие из которых раскрыты в табл. 1, на с. 11-14 международной публикации номер \У0 09/137254 А2, которая включена во всей полноте в данный документ путем ссылки. Такие нефункциональные мутации не включены в изобретение, но обеспечивают дополнительные правила для таких мутаций, и являются более или менее пригодными для получения функционального полипептида фактора ΙΧ.

Фактор ΙΧ (или часть фактора ΙΧ химерного полипептида) может быть по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95 или 100% идентичной аминокислотной последовательности фактора ΙΧ, представленной в последовательностях в табл. 2 без сигнальной последовательности и пропептидной последовательности (аминокислоты от 1 до 415 в БЕф ГО N0: 14), или альтернативно, с пропептидной последовательностью или с пропептидной и сигнальной последовательностями (непроцессированный фактор ΙΧ).

Коагулирующую активность фактора ΙΧ выражают в Международных единицах (МЕ). Активность фактора ΙΧ в одну МЕ соответствует приблизительно количеству фактора ΙΧ в одном миллилитре нормальной человеческой плазмы. Доступно несколько анализов для измерения активности фактора ΙΧ, включая одностадийный анализ коагуляции (время образования и активности тромбопластина; аРТТ), времени тромбинообразования (ТСА) и ротационная тромбоэластометрия (Р0ТЕМ®).

"Белок, обладающий активностью ΡΙΧ, который находится в активированной форме" или "активированный белок ΡΙΧ" означает активированную форму соответствующего белка ΡΙΧ/полипептида. Тер- 19 028914

мин "активированный" в сочетании с активированным белком ΡΙΧ/полипептидом используют согласно его обычному значению. Например, ίη νίνο фактор ΙΧ продуцируется как зимоген, неактивный прекурсор. Его обрабатывают для удаления сигнального пептида, гликозилируют, а затем расщепляют, например, фактором ΧΙα или УПа для получения активированного ΡΙΧ (ΡΙΧα), двуцепочечной формы, когда две цепи соединяются дисульфидным мостиком. Например, активированный белок ΡΙΧ может образовываться во время получения и/или очистки рекомбинантного белка ΡΙΧ. В одном примере в фармацевтических композициях полипептида ΡΙΧ активированная форма полипептида ΡΙΧ может рассматриваться как загрязнение.

ΙΙΙ. Химерные полипептиды факторов УШ и ΙΧ.

"Химерный полипептид," как использовано в данном документе, означает полипептид, который включает в себя по меньшей мере два фрагмента (или их части, такие как последовательности или пептиды) из различных источников. Химерные полипептиды могут содержать два, три, четыре, пять, шесть, семь или более полипептидов или их частей из различных источников, таких как различные гены, различные кДНК, различные животные или другие виды. Химерные полипептды могут содержать один или более линкеров, соединяющих различные полипептиды или их части. Таким образом, полипептиды или их части могут соединяться непосредственно или они могут соединяться опосредованно через линкеры или тем и другим способом в пределах одного химерного полипептида. Химерные полипептиды могут содержать дополнительные пептиды, такие как сигнальные последовательности и последовательности, такие как 6Ηίδ и ΡΕΑΟ, которые способствуют очищению или выявлению белков. Кроме того, химерные полипептиды могут иметь аминокислотные или пептидные добавки на Ν- и/или С-конце.

В некоторых вариантах осуществления изобретения химерный полипептд является фактором свертывания крови длительного действия. "Фактор свертывания крови длительного действия", такой как ΡΧΙΙΙ длительного действия или ΡΙΧ длительного действия, является фактором УШ или фактором ΙΧ, обладающим повышенным временем полураспада (также названным в данном документе как Н/2, 11/2 бета, периодом полувыведения и НЬ) относительно фактора УШ или фактора ΙΧ соответственно. Повышенное время полураспада фактора УШ длительного действия или фактора ΙΧ длительного действия может быть следствием слияния полипептидов, не принадлежащих фактору УШ или фактору ΙΧ, таких как, например, Ρο, XТΕN, альбумин, последовательность РА§, трасферин, СТР (28-аминокислотный Сконцевой пептид (СТР) ИСО с его 4 О-гликанами), полиэтиленгликоль (РЕО), гидроксиэтиловый крахмал (НЕ§), альбуминсвязывающий полипептид, альбуминсвязывающие малые молекулы или две или более их комбинации. Повышенное время полураспада может быть следствием одной или более модификаций, таких как, например, пегилирование. Примеры полипептидов фактора свертывания крови длительного действия включают, например, полипетиды химерного фактора УШ, содержащего Ρο, полипептиды химерного фактора УШ, содержащего XТΕN, полипептиды химерного фактора УШ, содержащего альбумин, полипептиды химерного фактора ΙΧ, содержащего Ρο, полипептиды химерного фактора ΡΙΧ, содержащего XТΕN, или полипептиды химерного фактора ΙΧ, содержащего альбумин. Дополнительные примеры полипептидов фактора свертывания крови длительного действия включают, например, пегилированный фактор УШ или пегилированный фактор ΙΧ.

"Контрольным" полипептидом в случае полипептида химерного фактора УШ длительного действия является полипептид, состоящий в основном из части фактора УШ химерного полипептида, например единственно части фактора УШ без Ρο-части, без XТΕN-части или без альбуминовой части. "Контрольным" полипептидом в случае полипептида химерного фактора ΙΧ длительного действия является полипептид, состоящий в основном из части фактора ΙΧ химерного полипептида, например, единственно части фактора ΙΧ без Ρο-части, без XТΕN-части или без альбуминовой части. Таким же образом, контрольным полипептидом в случае модифицированного фактора УШ или фактора ΙΧ является единственно фактор УШ или фактор ΙΧ без модификации, например фактор УШ без пегилирования или фактор ΙΧ без пегилирования.

В некоторых вариантах осуществления изобретения химерный полипептид содержит часть фактора УШ и часть, не принадлежащую фактору УШ. В некотором варианте осуществления изобретения химерный полипептид содержит часть фактора ΙΧ и часть, не принадлежащую фактору ΙΧ. Примеры частей, не принадлежищие фактору УШ или фактору ΙΧ, включают, например, Ρο, ΧΨΕΝ и альбумин. Примеры химерных полипептидов включают, например, полипептиды химерного фактора УШ-Ρο, полипептиды химерного фактора ΙΧ-Ρο, полипептиды химерного фактора УШ-XТΕN, полипептиды химерного фактора ΙΧ-Χ’ΓΕΝ, полипептиды химерного фактора УШ-альбумин и полипептиды химерного фактора ΙΧальбумин.

"Связывающий партнер ΡοΚη," "ΡοΡη ВР" или "Ρο", как использовано в данном документе, означает связывающие партнеры функциональных неонатальных Ρο-рецепторов (ΡοΚη), если не указано иное. Связывающим партнером ΡοΚη является любая молекула, которая может специфически связываться с рецептором ΡοΚη с последующим активным транспортом с помощью рецептора ΡοΚη связывающего партнера ΡοΚη. Таким образом, термин ΡοΚη ВР или Ρο включает любые функциональные варианты Ρο для Ι§0. Например, область части Ρο для Ι§0, которая связывается с рецептором ΡοΚη, описанная на основании рентгеновской кристаллографии (ВигшсМсг с! а1., 1994, №Лигс 372:379, во всей полноте вклю- 20 028914

ченный в данный документ). Основная контакная область Рс с РсКп находится возле сочленения доменов СН2 и СН3. Все контакты Рс-РсКп находятся в пределах единой тяжелой цепи 1д. РсКп ВР включают весь 1дО, Рс-фрагмент 1дО и другие фрагменты 1дО, которые содержат полный участок связывания РсКп. Основные контактные сайты включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2 и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена СН3. Ссылки сделаны на нумерацию аминокислот иммуноглобулинов, или фрагментов иммуноглобулинов, или участков или всех исходя из КаЬа! е! а1., 1991, Зециепсез о£ Рго!етз о£ 1ттипо1о§1са1 1п1егезр и.8. Иераг!теп! о£ РиЬйс НеаЙР, ВеФезба; ΜΌ, во всей полноте включенного в данный документ путем ссылки. Рецептор РсКп можно выделить из нескольких видов млекопитающих, включая человека. Известны последовательности РсКп человека, РсКп крысы и РсКп мыши (8!огу е! а1., 1994, 1. Ехр. Меб. 180: 2377), во всей полноте включенного в данный документ путем ссылки. РсКп ВР может содержать домены СН2 и СН3 иммуноглобулина с или без шарнирной области иммуноглобулина. Примеры вариантов РсКп ВР обеспечены в Ж7 2004/101740 и Ж7 2006/074199, во всей полноте включенных в данный документ путем ссылки.

РсКп ВР также содержит альбумин или его фрагменты, которые связываются с РсКп. В определенных аспектах альбумин является человеческим альбумином. Фактор VIII или IX может сливаться либо с Ν-концом альбумина, либо с С-концом альбумина, обеспечивая компонент фактора VIII или фактора IX альбуминового слитого белка, может обрабатываться ферментативно активной белковой конвертазой с получением полепептида, содержащего процессированный фактор VIII или фактор IX. Примеры альбумина, например его фрагментов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, известны, например, из патентов США № 7592010; № бб86179; и 8сйи1!е, ТЬготЬоз1з Кез. 124 8ирр1. 2:86-88 (2009), каждый из них во всей полноте включен в данный документ путем ссылки.

РсКп ВР (или часть РсКп ВР химерного полипептида) может содержать одну или боле мутаций или комбинаций мутаций. РсКп ВР (или часть РсКп ВР химерного полипептида) может содержать мутации, предоставляющие повышенное время полураспада, такие как Μ252Υ, 8254Т, Т256Е и их комбинации, как описано у Одапезуап е! а1., Мо1. ^типок 46:1750 (2009), который во всей полноте включен в данный документ путем ссылки; Н433К, Ν434Η и их комбинации, как раскрыто у Vасса^о е! а1., Ν!. Вю!есйпо1. 23:1283 (2005), который во всей полноте включен в данный документ путем ссылки; мутанты, раскрытые на с. 1 и 2, параграфе [0012], и примерах 9 и 10 патентной заявки США 2009/0264627 А1, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки; и мутанты, раскрытые на с. 2, параграфах от [0014] до [0014] патентной заявки США 2009/0163699 А1, которая во всей полноте включена в данный документ путем ссылки.

РсКп ВР (или часть РсКп ВР химерного полипептида) может также включать, например, следующие мутации: Рс-область может быть модифицирована согласно известной процедуре, такой как сайт-направленный мутагенез и подобные, для получения модифицированного или фрагментов Рс или их частей, которые будут связывать РсКп. Такие модификации включают модификации, дистанированные от сайтов контактирования РсКп, а также модификации в пределах сайтов контактирования, которые сохраняют или равномерно повышают связывание с РсКп. Например, следующие одиночные аминокислотные остатки в человеческом Рс ^01 (Рсу1) могут заменяться без существенной потери аффинности связывания Рс для РсКп:

Р238А, 8239А, К246А, К248А, Ό249Α, М252А,

Т256А, Е258А, Т260А, Ό265Α, 8267А, Н268А, Е269А, Ό270Α, Е272А, Ь274А, Ν276Α, Υ278Α,

Ό280Α, У282А, Е283А, Н285А, Ν286Α, Т289А, К290А, К292А, Е293А, Е294А, Ц295А, Υ296Ρ,

Ν297Α, 8298А, Υ300Ρ, К301А, УЗОЗА, У305А, Т307А, Ь309А, Ц311А, Ό312Α, Ν315Α, К317А,

Е318А, К320А, К322А, 8324А, К326А, А327Ц, Р329А, АЗЗОЦ, А3308, Р331А, Р3318, ЕЗЗЗА,

К334А, Т335А, 8337А, К338А, К340А, (Ц42А, К344А, Е345А, Ц347А, К355А, Е356А, М358А,

Т359А, К360А, N361 А, Ц362А, Υ373Α, 8375ΑΌ376Α, А378Ц, Е380А, Е382А, 8383Α, Ν384Α,

Ц386А, Е388А, Ν389Α, Ν390Α, Υ391Ρ, К392А, Ь398А, 8400А, Ό401Α, Ό413Α, К414А, К416А,

Ц418А, Ц419А, Ν421Α, У422А, 8424А, Е430А, Ν434Α, Т437А, Ц438А, К439А, 8440А, 8444А и К447А,

где, например, Р238А представляет пролин дикого типа, замещенный аланином в положении номер 238. Кроме аланина другие аминокислоты могут замещать аминокилоты дикого типа в положениях, указанных выше. Мутации можно вводить отдельно в Рс, порождая более чем одну тысячу партнеров связывания РсКп, отличных от природной Рс. Кроме того, комбинации двух, трех или более этих индивидуальных мутаций можно вводить вместе, порождая тысячи и более партнеров связывания РсКп. Некоторые из этих мутаций могут придавать новую функциональность партнеру связывания РсКп. Например, один вариант осуществления изобретения внедряет Ν297Α, удаляя высококонсервативный сайт Νгликозилирования. Эффектом такой мутации является снижение иммуногенности, тем самым повышая время полуциркулирования партнера связывания РсКп, и предоставляет партнеру связывания РсКп неспособность связывания с РсуК!, РсуКПА, РсуКИВ и РсуКША без компроментирования аффиности для РсКп (Кои!1ебде е! а1., 1995, Тгапзр1ап!а!юп 60:847, который во всей полноте включен в данный документ

- 21 028914

путем ссылки; Рпепб еί а1., 1999, Тгапзр1айаЬоп 68:1632, который во всей полноте включен в данный документ путем ссылки; 8Ые1бз еί а1., 1995, I. Вю1. СЬет. 276:6591, который во всей полноте включен в данный документ путем ссылки). Кроме того, обнаружено по меньшей мере три человеческих гамма рецептора Рс для распознавания сайтов связывания на !дС в пределах нижней шарнирной области, в основном аминокислоты 234-237. Следовательно, другой пример новой функциональности и потенциально пониженной иммуногенности может возникнуть вследствие мутации в этой области, как например, путем замены аминокислот 233-236 человеческого ^01 "ЕЬЬО" соответствующей последовательностью из ^02 "РVА" (с одной аминокислотной делецией). Было показано, что РсуШ, РсуКП и РсуКШ, которые опосредуют различные эффекторные функции, не связываются с Σ§01, когда вводятся такие мутации (\Уагб апб ОЬеПе 1995, ТЬегареибс бпншпо^ду 2:77, который во всей полноте включен в данный документ путем ссылки; и Агтоиг еί а1., 1999, Еиг. I. Iттиηο1. 29:2613, который во всей полноте включен в данный документ путем ссылки). В качестве дополнительного примера новой функциональности, возникающей вследствие мутаций, описанных выше, в некоторых случаях помимо этого можно повысить аффиность для РсКп дикого типа. Эта повышенная аффинность может отражать повышенную скорость ассоциации, сниженную скорость диссоциации или, скорость ассоциации и скорость диссоциации. Мутации, задуманные для придания повышенной аффинности для РсКп, включают Т256А, Т307А, Е380А и Ν434Α (8Ше1бз еί а1. 2001, I. Вю1. СЬет. 276:6591, который во всей полноте включен в данный документ путем ссылки).

РсКп ВР (или часть РсКп ВР химерного полипептида) может быть по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95 или 100% идентичной аминокислотной последовательности Рс, показанной в последовательности табл. 2 без сигнальной последовательности (аминокислоты от 1 до 227 последовательности 8Е0 ГО N0: 4), или альтернативно, с сигнальной последовательностью (аминокислоты от 20 до 227 последовательности 8Е0 ГО N0: 4).

Рс (или часть Рс химерного полипептида) может быть по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95 или 100% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в последовательности табл. 2 (аминокислоты от 1439 до 1665 последовательности 8Е0 ГО N0: 2; аминокислоты от 2333 до 2559 последовательности 8Е0 ГО N0: 6; аминокислоты от 741 до 967 последовательности 8Е0 ГО N0: 8; аминокислоты от 746 до 972 последовательности 8Е0 ГО N0: 10; аминокислоты от 685 до 924 последовательности 8Е0 ГО N0: 12).

Примеры химерных полипептидов включают фактор VIII или фактор IX, слитый с одним или более полипептидов XТЕN (см., например, 8сЬе11епЬигдег еί а1., №·ιΙ В1о1есЬ 27:1186-90 (2009), который во всей полноте включен в данный документ путем ссылки. Фактор VIII или IX могут сливаться с ^концом полипептида XТЕN или с С-концом полипептида XТЕN, обеспечивая компонент фактора VIII или IX слитого белка XТЕN, могут обрабатываться протеазами для получения полипептида, содержащего процессированный фактор VIII или IX. Протеазный сайт может быть включен между частью XТЕN и частью фактора VIII, что разрешает такое процессирование. Полипептиды XТЕN включают, например, полипептиды, раскрытые в \\'0 2009/023270, \\'0 2010/091122, \\'0 2007/103515, США 2010/0189682 и США 2009/0092582, каждый из них во всей полноте включен в данный документ путем ссылки.

Примеры химерных полипептидов также включают фактор VIII или фактор IX, слитый с одним или более альбуминовых полипептидов. Альбумин может быть человеческим альбумином. Фактор VIII или фактор IX может сливаться или с ^концом альбумина, или с С-концом альбумина, обеспечивая компонент фактора VIII или фактора IX альбуминового слитого белка, может обрабатываться ферментативно активными пропротеинконвертазами для получения полипептида, содержащего процессированный фактор VIII или IX. Примеры альбумина, например, его фрагменты, которые могут быть ипользованы в настоящем изобретении, известны из, например, патента США № 7592010; патента США № 6686179; и 8сЬиЬе, ТЬготЬоз13 Кез. 124 8ирр1. 2:86-88 (2009), каждый из них во всей полноте включен в данный документ путем ссылки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения химерный полипептид, содержащий фактор VIII или часть фактора химерного белка, обладает повышенным временем полураспада (ί1/2) относительно полипептида, состоящего единственно из части фактора VIII или фактора IX без части, не принадлежащей фактору VIII или IX. Химерный полипептид фактора VIII или IX с повышенным ί1/2 может упоминаться в данном документе как фактор VIII длительного действия или фактор IX длительного действия. Химерные полипептиды фактора VIII длительного действия или фактора IX длительного действия включают, например, фактор VIII или фактор IX, слитый с Рс (включая, например, химерные полипептиды фактора VIII или фактора IX в форме гибрида, такого как мономерный димерный гибрид РУПРс; см., например, фиг. 1 и 2 и табл. 2; и патенты США № 7404956 и 7348004), фактор VIII или фактор IX, слитый с XТЕN, и фактор VIII или IX, слитый с альбумином.

Примеры химерных полипептидов фактора VIII согласно изобретению включают, например, химерные полипептиды фактора УП-Рс, химерные полипептиды фактора VШ-XТЕN и химерные полипептиды фактора УП-альбумин. Примеры химерных полипептидов фактора УП-Рс включают, например, 8Е0 ГО N0: 2, 6, 8, 10 и 12 (последовательность в табл. 2), с или без их сигнальных последовательностей и химерный полипептид Рс последовательности 8Е0 ГО N0: 4 (последовательность в табл. 2). Химерный

- 22 028914

полипептид может содержать последовательность, по меньшей мере на 90 или 95% идентичную аминокислотной последовательности фактора VIII и Рс, показанной в последовательностях в табл. 2Ά(ΐ) без сигнальной последовательности (аминокислоты от 1 до 1665 последовательности 8Ер ГО N0: 2), или по меньшей мере на 90 или 95% идентичной аминокислотной последовательности фактора VIII и Рс, показанной в последовательностях в табл. 2Ά(ΐ), с сигнальной последовательностью (аминокислоты от 19 до 1665 последовательности 8Ер ГО N0: 2). Химерный полипептид может содержать последовательность, идентичную аминокислотной последовательности фактора VIII и Рс, показанной в последовательностях в табл. 2Ά(ΐ), без сигнальной последовательности (аминокислоты от 1 до 1665 последовательности 8Ер ГО N0: 2) или идентичную аминокислотной последовательности фактора VIII и Рс, показанной в последовательностях в табл. 2Ά(ΐ), с сигнальной последовательностью (аминокислоты от 19 до 1665 последовательности 8Ер ГО N0: 2).

Примерами химерных полипептидов фактора IX согласно изобретению являются химерные полипептиды фактора К-РсКп ВР, например химерные полипептиды фактора К-Рс, такие как МХРс в 8Ер ГО N0: 2 (последовательности в табл. 2), с или без ее сигнальной последовательности и пропептидом. Другие примеры химерных полипептидов согласно изобретению включают химерные полипептиды фактора ХТЕ^ но не ограничиваются ими. Фактор IX может быть слитым либо с ^концом, либо с Сконцом ХТЕМ Химерный полипептид может содержать последовательность, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95 или 100% идентичную фактору IX и РсКп ВР, например аминокислотную последовательность Рс, показанную в последовательностях в табл. 2А, без сигнальной последовательности и пропептидной последовательности (аминокислоты от 1 до 642 последовательности 8Ер ГО N0: 14), или альтернативно, с пропептидной последовательностью, или альтернативно, с сигнальной последовательностью и пропептидной последовательностью.

Последовательность РА8.

В других вариантах осуществления изобретения гетерологичным фрагментом является последовательность РА8. Последовательность РА8, как использовано в данном документе, обозначает аминокислотную последовательность, содержащую главным образом остатки аланина и серина или содержащую главным образом остатки аланина, серина и пролина, аминокислотную последовательность, образующую случайную спиральную конформацию в физиологических условиях. Соответственно последовательность РА8 является строительным блоком, аминокислотным полимером или последовательностной кассетой, состоящими в основном из или состоящими из аланина, серина и пролина, которые могут быть использованы в качестве части гетерологичного фрагмента в химерном полипептиде. Однако специалист в данной области знает, что аминокислотный полимер также может образовывать случайную спиральную конформацию, когда остатки, отличные от аланина, серина и пролина, добавлены в качестве малой составляющей в последовательность РА8. Термин "малая составляющая", как использовано в данном документе, обозначет, что аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут добавлятся в последовательность РА8 до определенного уровня, например вплоть до приблизительно 12%, например приблизительно 12 из 100 аминокислот последовательности РА8, вплоть до приблизительно 10%, например приблизительно 10 из 100 аминокислот последовательности РА8, вплоть до приблизительно 9%, например приблизительно 9 из 100 аминокислот последовательности РА8, вплоть до приблизительно 8%, например приблизительно 8 из 100 аминокислот, приблизительно 6%, например приблизительно 6 из 100 аминокислот, приблизительно 5%, например приблизительно 5 из 100 аминокислот, приблизительно 4%, например приблизительно 4 из 100 аминокислот, приблизительно 3%, например приблизительно 3 из 100 аминокислот, приблизительно 2%, например приблизительно 2 из 100 аминокислот, приблизительно 1%, например приблизительно 1 из 100 аминокислот. Аминокислоты, отличающиеся от аланина, серина и пролина, могут быть выбранными из группы, состоящей из Агд, Азп, Азр, Суз, Θΐη, О1и, О1у, Ηΐδ, Не, Ьеи, Ьуз, Мер РЬе, ТЬг, Тгр, Туг и Vа1.

В физиологических условиях отрезок последовательности РА8 образует случайную спиральную конформацию и тем самым может опосредовать повышенную ΐη νινο и/или ΐη νΐΐΓΟ стабильность к фактору или белку коагуляционной активности. Пока случайный спиральный домен не принял стабильную структуру или функцию сам по себе, биологическая активность полипептида в основном сохраняется. В других вариантах осуществления изобретения последовательности РА8, которые образуют случайный спиральный домен, являются биологически инертными, особенно что касается протеолиза в сыворотке крови, иммуногенности, изоэлектрической точки/электростатического поведения, связывания рецепторов клеточной поверхности или интернализации, но все еще являются биодеградирующими, что обеспечивает явное преимущество над синтетическими полимерами, такими как РЕО.

Неограничивающие примеры последовательностей РА8, образующих случайную спиральную конформацию, содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

АЗР ААР АР АЗР ААР АРЗАР А (ЗЕ() ГО № 15),

ААРА8РАРААР8АРАРААР8 (8Еф ГО № 16), АР88Р8Р8АР88Р8РА8Р88 (8Еф ГО № 17),

АР88Р8Р8АР88Р8РА8Р8 (ЗЕф ГО № 18), 88Р8АР8Р88РА8Р8Р88РА (ЗЕ() ГО № 19), АА8РААР8АРРААА8РААР8АРРА (ЗЕ() ГО № 20) и А8АААРААА8ААА8АР8ААА (ЗЕ() ГО № 21)

- 23 028914

или любой их комбинации. Дополнительные примеры последовательностей РА§ известны, например, из патентной публикации США № 2010/0292130 А1, патентной публикации РСТ № \УО 2008/155134 А1.

Гидроксиэтиловый крахмал (НЕ§).

В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичным фрагментом является полимер, например гидроксиэтиловый крахмал (НЕ§) или его производные. Гидроксиэтиловый крахмал (НЕ§) является производным амилопектина природного происхождения и деградирует под действием альфа-амилазы в организме. НЕ§ является замещенным производным карбогидратного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации вплоть до 95 вес.%.. НЕ§ демонстрирует полезные биологические свойства и используется в качестве заместительного агента в гемодилюционной терапии в клиниках (Зоттегтеуег с1 а1., КгапкспНаикркагта/ю. 8(8), 271-278 (1987); и ХУеШЛег е1 а1., Аг7пе1т.-Иог5сЬип§/ПгидКе5., 41, 494-498 (1991)).

Амилопектин содержит фрагменты глюкозы, причем в основной цепи присутствуют альфа-1,4гликозидные связи, а в разветвленных сайтах обнаружены альфа-1,6-гликозидные связи. Физикохимические свойства этой молекулы в основном определяются типом гликозидных связей. Благодаря зазубренной альфа-1,4-гликозидной связи образуются спиральные структуры из приблизительно шести глюкозных полимеров на виток. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера можно модифицировать путем замещения. Введение гидроксиэтиловой группы можно осуществить путем щелочного гидроксиэтилирования. Путем приспособления условий реакции можно использовать разную реактивность соответствующей гидроксильной группы в незамещенном глюкозном мономере что касается гидроксиэтилирования. Ввиду этого факта специалист в данной области способен влиять на схему замещения для ограничения протяженности.

НЕ§ в основном характеризируется молекулярно-массовым распределением и степенью замещения. Степень замещения, обозначенная как Όδ, относится к молярному замещению, известному специалисту в данной области (см. 8оттегтеуег е1 а1., Кгапкепкаи5ркагта/1е, 8(8), 271-278 (1987), как указано выше, особенно с. 273).

В одном варианте осуществления изобретения гидроксиэтиловый крахмал имеет средний молекулярный вес (средний вес) от 1 до 300, от 2 до 200, от 3 до 100 или от 4 до 70 кДа. Гидроксиэтиловый крахмал может дополнительно экспонировать молярную степень замещения от, например, 0,1 до 3, 0,1 до 2, 0,1 до 0,9 или от 0,1 до 0,8 и отношение между С2:С6 замещением в диапазоне от 2 до 20 что касается гидроксиэтиловых групп. Неограничивающим примером НЕ8, имеющим молекулярный вес приблизительно 130 кДа, является НЕ8 со степенью замещения от 0,2 до 0,8, такой как 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, например от 0,4 до 0,7, такой как 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7. В определенной варианте осуществления изобретения НЕ8 со средним молекулярным весом приблизительно 130 кДа представляет собой УОкУУкХ® от Игекетик. УОЬиУЕХ® является искусственным коллоидом, применяемым, например, для замещения объема, используемым при терапевтических показаниях для лечения и профилактики гиперволемии. Характеристиками УОЬиУЕХ® являются средний молекулярный вес 130000±20000 Да, молярное замещение 0,4 и соотношение С2:С6 приблизительно 9:1. В других вариантах осуществления изобретения диапазон среднего молекулярного веса гидроксиэтилового крахмала составляет, например, от 4 до 70, или от 10 до 70, или от 12 до 70, или от 18 до 70, или от 50 до 70, или от 4 до 50, или от 10 до 50, или от 12 до 50, или от 18 до 50, или 4 до 18, или от 10 до 18, или от 12 до 18, или от 4 до 12, или от 10 до 12, или от 4 до 10 кДа. В еще других вариантах осуществления изобретения средний молекулярный вес используемого гидроксиэтилового крахмала находится в диапазоне от выше 4 и ниже 70 кДа, такой как приблизительно 10 кДа, или в диапазоне от 9 до 10, или от 10 до 11, или от 9 до 11, или приблизительно 12, или в диапазоне от 11 до 12, или от 12 до 13, или от 11 до 13, или приблизительно 18, или в диапазоне от 17 до 18, или от 18 до 19 , или от 17 до 19, или приблизительно 30, или в диапазоне от 29 до 30, или от 30 до 31, или приблизительно 50, или в диапазоне от 49 до 50, или от 50 до 51 , или от 49 до 51 кДа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичный фрагмент может быть смесью гидроксиэтиловых крахмалов, имеющих разный средний молекулярный вес и/или разные степени замещения и/или разные соотношения С2:С6 замещения. Следовательно, могут использоваться смеси гидроксиэтиловых крахмалов, имеющие разный молекулярный вес, разные степени замещения и разные соотношения С2:С6 замещения, или имеющие разный молекулярный вес и разные степени замещения, и одинаковое или приблизительно одинаковое соотношение С2:С6 замещения, или имеющие разный молекулярный вес и одинаковые или приблизительно одинаковые степени замещения, и разные соотношения С2:С6 замещения, или имеющие одинаковый или приблизительно одинаковый молекулярный вес и разные степени замещения, и разные соотношения С2:С6 замещения, или имеющие разный молекулярный вес и одинаковые или приблизительно одинаковые степени замещения, и одинаковое или приблизительно одинаковое соотношение С2:С6 замещения, или имеющие одинаковый или приблизительно одинаковый молекулярный вес и разные степени замещения, и одинаковое или приблизительно одинаковое соотношение С2:С6 замещения, или имеющие одинаковый или приблизительно одинаковый молекулярный

- 24 028914

вес и одинаковые или приблизительно одинаковые степени замещения, и разные соотношения С2:С6 замещения, или имеющие приблизительно одинаковый средний молекулярный вес и приблизительно одинаковую степень замещения, и приблизительно одинаковое соотношение С2:С6 замещения.

Ιν. Гибридные полипептиды фактора УШ и фактора ΙΧ.

"Гибридные" полипептиды и белки, как использовано в данном документе, означают комбинацию химерного полипептида с другим полипептидом. Химерный полипептид и другой полипептид в гибриде могут связываться друг с другом с помощью нековалентных белок-белковых взаимодействий, таких как заряд-зарядных или гидрофобных взаимодействий. Химерный полипептид и другой полипептид в гибриде могут связываться друг с другом с помощью ковалентной связи(ей), таких как дисульфидные связи. Химерный полипептид и другой полипептид в гибриде могут связываться друг с другом с помощью более чем одного типа связи, таких как нековалентная и дисульфидная связи. Гибриды описаны в νΟ 2004/101740, νΟ 2005/001025, патентах США 7404956, 7348004 и νΟ 2006/074199, каждый из них во всей полноте включен в данный документ путем ссылки. Второй полипептид может быть второй копией того же химерного полипептида или он может быть неидентичным химерным полипептидом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения второй полипептид является полипептидом, содержащим Рс. В некоторых вариантах осуществления изобретения химерный полипептид является химерным полипептидом фактора УШ-Рс, а второй полипептид состоит в основном из Рс, например рекомбинантного слитого белка гРУШРс, состоящего из одной молекулы рекомбинантного человеческого РУШ (ВИИ-гРУШ) с удаленным В-доменом, слитого с димерным доменом Рс человеческого !дС1. с непромежуточной линкерной последовательностью. Этот гибридный полипептид назван в данном документе как РУШРс мономерный Рс-слитый белок, мономерный гибрид РУШРс, мономерный РУППРсгибрид и РУШРс мономерный димер. В некоторых вариантах осуществления изобретения химерным полипептидом является фактор ΙΧ-РсКп ВР, например химерный полипептид фактора ΙΧ-Рс, а второй полипептид состоит в основном из Рс (см., например, табл. 2 (§Еф ΙΌ ΝΟ: 14 и 4), патент США 7404956, который во всей полноте включен в данный документ путем ссылки).

Второй полипептид в гибриде может содержать или состоять в основном из последовательности, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95 или 100% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в последовательностях в табл. 2 без сигнальной последовательности (аминокислоты от 1 до 227 последовательности §Еф ГО ΝΟ: 4), или альтернативно по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95 или на 100% идентичной аинокислотной последовательности, показанной в последовательностях в табл. 2 с сигнальной последовательностью (аминокислоты от 20 до 227 последовательности §Еф ГО ΝΟ: 4).

Фиг. 1 представляет схему, демонстрирующую структуру химерного полипептида фактора УШ-Рс с удаленным В-доменом и его связь с вторым полипептидом, который является Рс-полипептидом. Для получения этого гибрида кодирующую последовательность человеческого рекомбинантного РУШ с удаленным В-доменом получали путем полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (КТ-РСК) из человеческой печеночной поли А РНК (С1оп1сск). используя РУШ-специфические праймеры. Последовательность РУШ содержит природную сигнальную последовательность для РУШ. Делеция В-домена происходила от серина 743 (§743; 2287 п.о.) до глутамина 1638 (ф1638; 4969 п.о.) для общей делеции из 2682 п.о. Потом кодирующую последовательность для человеческого рекомбинантного Рс получали с помощью КТ-РСК из библиотеки кДНК человеческих лейкоцитов (С1оп1есй), используя Рсспецифические праймеры. Праймеры конструировали таким образом, чтобы последовательность РУШ с удаленным В-доменом сливалась непосредственно с Ν-концом последовательности Рс с непромежуточным линкером. Последовательность ДНК РУШРс клонировали в двойной вектор экспрессии млекопитающего рВиБСЕ4.1 ДпуПгодеп) под контролем СМУ-промотора. Вторую идентичную Рспоследовательность, включающую сигнальную последовательность мышиного ΙβΚ, получали с помощью КТ-РСК и клонировали по ходу транскрипции второго промотора, ЕР1а, в вектор экспрессии рВИИСЕ4.1.

Вектор экспрессии гРУШРс трансфицировали в клетки 293 человеческой эмбриональной почки (НЕК293Н; Шуйгодеп), используя трасфикационный реагент липофектамин 2000 ДпуПгодеп). Стабильные клональные клеточные линии получали путем селекции с зеоцином Дпуйгодеп). Одна клональная клеточная линия, 3С4-22, была использована для получения РУШРс для ίη У1уо охарактеризования. Был получен и очищен рекомбинантный РУШРс (МсСие е1 а1., 2009) в центральном сайте. Ожидалось, что стратегия трансфицирования, описанная выше, даст три продукта, мономерные гибриды гРУШРс, димерные гибриды гРУШРс и димерный Рс. Однако в кондициированной среде из этих клеток, по существуй было обнаружено димерного гРУШРс. Предпочтительно кондициированная среда содержала Рс и мономерный гРУШРс. Не исключено, что размер димерного гРУШРс был чересчур большим и мешал эффективной секреции из клетки. Этот результат был полезным, так как он предоставил очистку мономера менее осложненную, чем если бы присутствовали все три белка. Материал, использованный в этих исследованиях, имел удельную активность приблизительно 9000 МЕ/мг.

У. Дозирование и введение факторов УШ и ΙΧ.

"Интервал дозирования", как использовано в данном документе, означает промежуток времени, ко- 25 028914

торый истекает между многократными приемами доз, введенных субъекту. Сравнение интервала дозирования можно провести у одного пациента или в популяции субъектов, а затем можно подсчитать среднее, полученное в популяции.

Интервал дозирования, когда вводят химерный полипептид фактора νΙΙΙ или ΙΧ, например химерный полипептид фактора νΙΙΙ-Ρο или фактора ΙΧ-Ρο (полипептид, содержащий фактор νΙΙΙ или ΙΧ, или гибрид), может быть по меньшей мере приблизительно в полтора раза дольше, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентного количества указанного ΡνΙΙΙ или ΡΙΧ без части, не принадлежащей ΡνΙΙΙ или ΡΙΧ, например, без Ρο-части (полипептид, состоящий из указанного ΡνΙΙΙ или ΡΙΧ). Интервал дозирования может быть по меньшей мере приблизительно от полтора до шести раз дольше, от полтора до пяти раз дольше, от полтора до четырех раз дольше, от полтора до трех раз дольше, от полтора до двух раз дольше, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентного количества указанного ΡνΙΙΙ или ΡΙΧ без части, не принадлежащей ΡνΙΙΙ или ΡΙΧ, например без Ρο-части (полипептид, состоящий из указанного фактора νΙΙΙ). Интервал дозирования может быть по меньшей мере приблизительно в полтора, два, два с половиной, три, три с половиной, четыре, четыре с половиной, пять, пять с половиной или шесть раз дольше, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентного количества указанного ΡνΙΙΙ или ΡΙΧ без части, не принадлежащей ΡνΙΙΙ или ΡΙΧ, например без Ρο-части (полипептид состоящий из указанного ΡνΙΙΙ или ΡΙΧ).

Интервал дозирования может составлять приблизительно каждые пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать или четырнадцать дней или дольше. Интервал дозирования может составлять по меньшей мере приблизительно от полтора до 5, полтора, 2, 3, 4 или 5 дней или дольше. Для лечения при необходимости интервал дозирования указанного химерного полипептида или гибрида составляет приблизительно один раз каждые 24-36, 24-48, 24- 72, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 или 72 ч или дольше.

В определенных аспектах эффективная доза для фактора νΙΙΙ составляет 25-65 МЕ/кг (25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64 или 65 МЕ/кг), а интервал дозирования составляет один раз каждые 3-5, 3-6, 3-7, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 дней или более, или три раза в неделю, или не больше трех раз в неделю. В одном аспекте эффективная доза составляет 65 МЕ/кг, а интервал дозирования составляет один раз в неделю или один раз каждые 6-7 дней.

"Фактор νΙΙΙ длительного действия" представляет собой фактор νΙΙΙ, имеющий повышенное время полураспада (также названным в данном документе как ί1/2, ί1/2 бета, периодом полувыведения и НЬ) относительно контрольного фактора νΙΙΙ. Повышенное время полураспада фактора νΙΙΙ длительного действия может быть следствием слияния одного или более полипептидов, не принадлежащих фактору νΙΙΙ, таких как, например, Ρο, ΧΤΕΝ, альбумин. Повышенное время полураспада может быть следствием одной или более модификаций, таких как, например, пегилирование. Примеры полипептидов фактора νΙΙΙ длительного действия включают, например, полипетиды химерного фактора νΙΙΙ, содержащего Ρο, полипептиды химерного фактора νΙΙΙ, содержащего ΧΤΕΝ, полипептиды химерного фактора νΙΙΙ, содержащего альбумин. Дополнительные примеры полипептидов фактора νΙΙΙ длительного действия включают, например, пегилированный фактор νΙΙΙ.

"Контрольным" полипептидом в случае химерного полипептида фактора νΙΙΙ длительного действия является полипептид, состоящий в основном из части фактора νΙΙΙ химерного полипептида, например, единственно части фактора νΙΙΙ без Ρο-части, без части ΧΤΕΝ или части альбумина. Таким же образом, контрольным полипептидом в случае модифицированного фактора νΙΙΙ является единственно фактор νΙΙΙ без модификации, например фактор νΙΙΙ без пегилирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения фактор νΙΙΙ длительного действия обладает одним или более следующих свойств, когда вводится субъекту:

среднее время удержания (ΜΚΤ) (активность) у указанного пациента составляет приблизительно 14-41,3 ч;

клиренс (СЬ) (активность) у указанного пациента составляет приблизительно 1,22-5,19 мл/ч/кг или меньше;

ί1/2 бета (активность) у указанного пациента составляет приблизительно 11-26,4 ч; постепенное восстановление (значение К) (активность; наблюдаемая) у указанного пациента составляет приблизительно 1,38-2,88 МЕ/дл на МЕ/кг;

ν§5 (активность) у указанного пациента составляет приблизительно 37,7-79,4 мл/кг; и

АиС/доза у указанного пациента составляет приблизительно 19,2-81,7 МЕ-ч/дл на МЕ/кг.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фактор νΙΙΙ длительного действия обладает одним или более следующих свойств, когда вводится популяции пациентов:

среднее постепенное восстановление (значение К) (активность; наблюдаемая) выше чем 1,38 МЕ/дл на МЕ/кг;

среднее постепенное восстановление (значение К) (активность; наблюдаемая) по меньшей мере приблизительно 1,5, по меньшей мере приблизительно 1,85 или по меньшей мере приблизительно 2,46

- 26 028914

МЕ/дл на МЕ/кг.

средний клиренс (СЬ) (активность) в указанной популяции пациентов приблизительно 2,33±1,08 мл/ч/кг или меньше;

средний клиренс (СЬ) (активность) в указанной популяции пациентов приблизительно 1,8-2,69 мл/ч/кг;

средний клиренс (СЬ) (активность) в указанной популяции пациентов, который составляет приблизительно 65% клиренса полипептида, содержащего указанный фактор VIII без модификации;

среднее среднее время удержания (МКТ) (активность) в указанной популяции пациентов по меньшей мере приблизительно 26,3±8,33 ч;

среднее МКТ (активность) в указанной популяции пациентов приблизительно 25,9-26,5 ч; среднее МКТ (активность) в указанной популяции пациентов, которое приблизительно в 1,5 раза длиннее, чем среднее МКТ полипептида, содержащего указанный фактор VIII без модификации;

среднее 11/2 бета (активность) в указанной популяции пациентов приблизительно 18,3±5,79 ч; среднее 11/2 бета (активность) в указанной популяции пациентов, которое составляет приблизительно 18-18,4 ч;

среднее 11/2 бета (активность) в указанной популяции пациентов, которое приблизительно в 1,5 раза длиннее, чем среднее 11/2 бета полипептида, содержащего указанный фактор VIII без модификации;

среднее постепенное восстановление (значение К) (активность; наблюдаемая) в указанной популяции пациентов приблизительно 2,01±0,44 МЕ/дл на МЕ/кг;

среднее постепенное восстановление (значение К) (активность; наблюдаемая) в указанной популяции пациентов приблизительно 1,85-2,46 МЕ/дл на МЕ/кг;

среднее постепенное восстановление (значение К) (активность; наблюдаемая) в указанной популяции пациентов, которое составляет приблизительно 90% среднего постепенного восстановления полипептида, содержащего указанный фактор VIII без модификации;

среднее Vδδ (активность) в указанной популяции пациентов приблизительно 55,1±12,3 мл/кг; среднее V88 (активность) в указанной популяции пациентов приблизительно 45,3-56,1 мл/кг; среднее АИС/доза (активность) в указанной популяции пациентов приблизительно 49,9±18,2

МЕ-ч/дл на МЕ/кг;

среднее АИС/доза (активность) в указанной популяции пациентов приблизительно 44,8-57,6 МЕ-ч/дл на МЕ/кг.

В некоторых вариантах осуществления изобретения интервал дозирования для фактора К составляет 6-18, 6-10, 9-18, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17 или по меньшей мере 18 дней. Интервал дозирования может составлять по меньшей мере приблизительно один раз в неделю и может составлять 6-10 дней, например приблизительно 7-10, приблизительно 7-9, приблизительно 7-8, приблизительно 810, приблизительно 9-10, приблизительно 6-7, приблизительно 8-9, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9 или приблизительно 10 дней.

Интервал дозирования может составлять 9-18 дней, например приблизительно 9-17, приблизительно 9-16, приблизительно 9-15, приблизительно 9-14, приблизительно 9-13, приблизительно 9-12, приблизительно 9-11, приблизительно 9-10 дней, приблизительно 10-18, приблизительно 11-18, приблизительно 12-18, приблизительно 13-18, приблизительно 14-18, приблизительно 15-18, приблизительно 16-18, приблизительно 17-18 дней, приблизительно 10-11, приблизительно 11-12, приблизительно 12-13, приблизительно 13-14, приблизительно 14-15, приблизительно 15-16 и приблизительно 16-17 дней, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17 или приблизительно 18 дней. Интервал дозирования может составлять приблизительно 10-14 дней. Интервал дозирования может составлять приблизительно каждые две недели или два раза в месяц. Интервал дозирования может быть длиннее 18 дней, например приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39 или приблизительно 40 дней. Интервал дозирования может быть фиксированным интервалом, например один раз на день по 25-50 МЕ/кг, 10-13 дней по 50-100 МЕ/кг или 14 дней по 100-150 МЕ/кг. Фиксированный интервал и дозу определяют таким образом, чтобы комбинация интервала и дозы приводила к по меньшей мере приблизительно 1-5, или по меньшей мере приблизительно 1-3, или по меньшей мере приблизительно 1, по меньшей мере приблизительно 2 или по меньшей мере, приблизительно 3 МЕ/дл минимуму активности ИХ в популяции пациентов или у индивидуального пациента. Фиксированный интервал дозирования может также составлять 7 дней для 20-50 МЕ/кг, 10-14 дней для 50-100 МЕ/кг, 14-16 дней для 100-150 МЕ/кг, 7 дней для 10-50 МЕ/кг, 10-13 дней для 15-100 МЕ/кг или 14-15 дней для 50-150 МЕ/кг. Фиксированный интервал дозирования может также составлять

- 27 028914

7 дней для 10-30 МЕ/кг, 10 дней для 15-50 МЕ/кг, 11 дней для 20-70 МЕ/кг, 12 дней для 25-85 МЕ/кг, 13 дней для 30-100 МЕ/кг, 14 дней для 40-125 МЕ/кг и 15 дней для 50-150 МЕ/кг.

В некоторых вариантах осуществления изобретения интервал дозирования составляет 20 МЕ/кг один раз в день, 40 МЕ/кг каждые 10 дней или 100 МЕ/кг каждые две недели (дважды в месяц).

Интервал дозирования может быть индивидуализированным интервалом для каждого пациента исходя из данных фармакокинетики или другой информации о такой пациенте. Комбинация индивидуализированная доза/интервал дозирования может быть такой же, как и для режимов фиксированного интервала в предшествующих параграфах или может отличаться. Изначально режим может быть фиксированным интервалом дозирования, а затем он может измениться в индивидуализированный интервал дозирования.

Кровоточивость или нарушение свертываемости крови, как использовано в данном документе, означает генетически унаследованное или приобретенное состояние, характеризирующееся склонностью к кровоточивости, спонтанной или в результате травмы или хирургической операции, вследствие нарушенной способности или неспособности образовывать фибриновый сгусток. Кровоточивость или нарушение свертываемости крови может нуждаться в лечении при необходимости или профилактическом лечении. Примерами нарушений свертываемости крови являются гемофилия А, гемофилия В.

"Лечение при необходимости", как использовано в данном документе, означает лечение, которое предназначено для прохождения за короткое время и в ответ на существующее состояние, такое как случай кровоточивости или необходимый воспринимаемый короткий срок, такой как плановая хирургическая операция. Состояния, которые требуют лечения при необходимости, включают случай кровоточивости, гемартроз, мышечную кровоточивость, оральную кровоточивость, кровоизлияние, кровоизлияние в мышцах, оральное кровоизлияние, травму, 1гаита сарПк, желудочно-кишечное кровоизлияние, внутричерепное кровоизлияние, внутрибрюшное кровоизлияние, внутригрудное кровоизлияние, перелом костей, кровоточивость центральной нервной системы, кровоточивость в заглоточном пространстве, кровоточивость в заборюшинном пространстве или кровоточивость во влагалище. Случаи кровоточивости, отличные от этих, также включены. Пациент может нуждаться в хирургической профилактике, периоперативном менеджменте, хирургическом лечении. Такие хирургические операции включают малую операцию, большую операцию, удаление зубов, тонзилэктомию, другие стоматологические/тораколицевые операции, паховое грыжесечение, синовэктомию, полную замену коленного сустава, другие замены суставов, краниотомию, остеосинтез, хирургическое лечение травм, внутричерепную операцию, внутрибрюшную операцию, внутригрудную операцию. Операции, отличные от этих, также включены.

Дополнительные состояния, которые требуют лечения при необходимости, включают малое кровотечение, гемартроз, кровотечение поверхностных мышц, кровотечение мягких тканей, умеренное кровотечение, внутримышечное и мягкотканевое кровотечение с расслоением, кровотечение слизистой оболочки, гематурию, обширное кровотечение, кровотечение глотки, заглоточное кровотечение, кровотечение забрюшинного пространства, кровотечение центральной нервной системы, гематомы, порезы, соскобы, суставное кровотечение, носовое кровотечение, ротовое кровотечение, кровоточивость десен, внутричерепное кровотечение, внутрибрюшинное кровотечение, малое спонтанное кровотечение, кровотечение после обширной травмы, умеренные кожные гематомы или спонтанное кровотечение в суставах, мышцах, внутренних органах или головном мозге. Дополнительные основания для лечения при необходимости включают необходимость периоперативного менеджмента для операции или удаления зубов, большую операцию, обширную челюстно-лицевую операцию, урологическую операцию, операцию по поводу грыжи, ортопедическую операцию, такую как замена коленного, бедренного или других основных суставов.

В некоторых аспектах лечение при необходимости устраняет больше чем 80% (больше чем 81%, больше чем 82%, больше чем 83%, больше чем 84%, больше чем 85%, больше чем 8б%, больше чем 87%, больше чем 88%, больше чем 89%, больше чем 90%, больше чем 91%, больше чем 92%, больше чем 93%, больше чем 94%, больше чем 95%, больше чем 9б%, больше чем 91%, больше чем 98%, больше чем 99 или 100%) или 80-100, 80-90, 85-90, 90-100, 90-95 или 95-100% кровотечений (например, спонтанных кровотечений) в разовой дозе. В некоторых аспектах больше чем 80% (больше чем 81%, больше чем 82%, больше чем 83%, больше чем 84%, больше чем 85%, больше чем 8б%, больше чем 87%, больше чем 88%, больше чем 89%, больше чем 90%, больше чем 91%, больше чем 92%, больше чем 93%, больше чем 94%, больше чем 95%, больше чем 9б%, больше чем 97%, больше чем 98 или 100%) или 80-100, 80-90, 85-90, 90-100, 90-95 или 95-100%) случаев кровотечений расцениваются лечащими врачами как отличные или хорошие после лечения при необходимости. В некоторых аспектах больше чем 5% (больше чем б%, больше чем 7%, больше чем 8%, больше чем 9%, больше чем 10%, больше чем 11%, больше чем 12%, больше чем 13%, больше чем 14%, больше чем 15%, больше чем 1б%, больше чем 17%, больше чем 18%, больше чем 19%, больше чем 20%) или 5-20, 5-15, 5-10, 10-20 или 10-15% случаев кровотечений расцениваются лечащими врачами как удовлетворительные после лечения при необходимости.

"Профилактическое лечение" или "профилактика", как использовано в данном документе, означает введение полипептида фактора VIII или IX в многократных дозах в течение периода времени для повышения уровня активности фактора VIII или IX в плазме пациента. В некоторых аспектах повышенного

- 28 028914

уровня достаточно для снижения частоты возникновения спонтанного кровотечения или для предотвращения кровотечения в случае непредвиденного повреждения. Профилактическое лечение снижает или предотвращает случаи кровотечения, например, описанные под лечением при необходимости. В некоторых вариантах осуществления изобретения профилактическое лечение проводят таким образом, чтобы уровень белков плазмы у пациента не падал ниже исходного уровня для этого пациента или ниже уровня фактора VIII или IX, который характеризует тяжелую гемофилию. Профилактическое лечение может быть фиксированным или может быть индивидуализированным, как обсуждалось под "интервалом дозирования", например, для компенсирования межиндивидуального колебания.

В некоторых аспектах профилактический режим является "настроенным" на индивидуального пациента, например, путем определения данных РК для каждого пациента и введение фактора РУН согласно изобретению в интервале доз, который поддерживает минимальный уровень активности РУН 13%. Внесение поправок осуществляют, когда пациент переживает неприемлемые случаи кровотечений, определенные как >2 случаев спонтанных кровотечений в течение повторяющегося двухмесячного периода. В этом случае внесение поправок направлено на минимальные уровни 3-5%. В некоторых аспектах профилактическое лечение приводит к предупреждению и контролю над кровотечением, длительному контролю над кровотечением, длительной защите от кровотечения и/или длительному эффекту. Профилактика, например длительная защита, может быть продемонстрирована повышенной площадью под кривой "концентрация-время" от момента введения препарата до определения последней поддающийся количественному измерению концентрации (АИС-ЬАЗТ) и сниженным клиренсом, приводящими к повышенному конечному 11/2 по сравнению с РУН быстрого действия. В некоторых аспектах профилактика демонстрируется лучшей Стах, лучшим Т_тах и/или большим средним временем удерживания в сравнении с РУН быстрого действия. В некоторых аспектах профилактика приводит к неспотанным случаям кровотечения в течение приблизительно 24, 36, 48, 72 или 96 ч (например, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 или 96 ч, например в течение 72 ч) после инъекции (например, последней инъекции). В некоторых аспектах профилактика приводит к больше чем 30% (например, больше чем 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 96, 87, 88, 89 или 90%, например больше чем 50%) среднему снижению общегодовых случаев кровотечения одним еженедельным дозированием (например, при 65 МЕ/кг).

Фармакокинетические параметры (РК) включают вышеуказанные термины и следующие термины, которые имеют обычный смысл в данном уровне техники, если не указано иное. Некоторые термины более детально обяснены в примерах. Параметры РК могут основываться на антигенном уровне РЕХ (часто обозначенном в скобках в данном документе как "антиген") или уровне активности РК (часто обозначенном в скобках в данном документе как "активность"). В литературе парметры РК часто основываются на уровне активности РК из-за присутствия в плазме некоторых пациентов эндогенного, неактивного РК, который мешает измерить введенный РК (т.е. экзогенный) с использованием антител против РК. Однако, когда РК вводят в виде части слитого белка, содержащего гетерологичный полипептид, такой как РсКп ВР, введенный антиген РК (т.е. экзогенный) можна тщательно измерить, используя антитело к гетерологичному полипептиду. Кроме того, некоторые параметры РК могут базироваться на данных прогнозирования на основе модели (часто обозначенные в скобках в данном документе как "спрогнозированные на модели") или на основе данных наблюдений (часто обозначенные в скобках в данном документе как "наблюдаемые") и могут основываться на результатах измерений.

"Исходный", как использовано в данном документе, является самым низким уровнем РУН или РК, измеренным в плазме пациента перед введением дозы. "Исходный" можно также получить из контрольных измерений, проведенных у пациентов с известной тяжестью заболевания, здоровых индивидуумов или их комбинации.

"Площадь под кривой зависимости концентрации от времени" ("АИС"), которая, как использовано в данном документе, базируется на скорости и степени выведения РУН или РК после введения. АИС определяют за определенный период времени, такой как 12, 18, 24, 36, 48 или 72 ч, или до бесконечности, используя экстраполяцию, исходя из наклона кривой. Если в данном документе не указано иное, то АИС определяют до бесконечности (АИС_ЮР). АИС также можно рассчитать на дозовой основе. Как и многие другие параметры РК, определение АИС можно проводить для отдельного пациента или для популяции пациентов, для которых рассчитывают среднее. Потому среднее АИС/доза в популяции пациентов может составлять приблизительно 26-40, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39 или приблизительно 40 МЕ-ч/дл на МЕ/кг.

'Ίη νίνο восстановление" ("ТУК.") репрезентируется постепенным восстановлением (К-значение), которое представляет собой наблюдаемый пик активности минус уровень предведения, а затем деленный на дозу. IVК также можно рассчитать в процентах. Для наглядности в данном документе используются

- 29 028914

единицы (К-значение или МЕ/дл на МЕ/кг против %). Среднее ΙΥΚ можно определить в популяции пациентов или индивидуальное ΙΥΚ можно определить у отдельного пациента. Химерные полипептиды согласно изобретению могут демонстрировать среднее ΙΥΚ в популяции пациентов 0,85-1,15 (например, приблизительно 0,85, приблизительно 0,86, приблизительно 0,87, приблизительно 0,88, приблизительно 0,89, приблизительно 0,90, приблизительно 0,91, приблизительно 0,92, приблизительно 0,93, приблизительно 0,94, приблизительно 0,95, приблизительно 0,96, приблизительно 0,97, приблизительно 0,98, приблизительно 0,99, приблизительно 1,0, приблизительно 1,05, приблизительно 1,10, приблизительно 1,15) и ΙΥΚ у пациента по меньшей мере приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1 или приблизительно 1,2 МЕ/дл на МЕ/кг.

"Скорость выведения/клиренса" ("СЬ"), как использовано в данном документе, является измерением способности организма выводить лекарственное средство и выражается как объем очищенной от лекарств плазмы в зависимости от времени. Химерные полипептиды согласно изобретению могут проявлять среднюю СЬ в популяции 3,0-3,72, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7 или 3,72 мл/ч/кг.

"Среднее время удержания" ("МКТ"), как использовано в данном документе, является измерением среднего времени жизни молекул лекарственного средства в организме. Химерные полипептиды согласно изобретению могут проявлять среднее МКТ в популяции 60-78, приблизительно 60, приблизительно 62, приблизительно 64, приблизительно 66, приблизительно 68, приблизительно 70, приблизительно 72, приблизительно 74, приблизительно 76 или приблизительно 78 ч и МКТ у пациента по меньшей мере приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85 или приблизительно 90 ч.

"ΐι_/2β" или £ ._2Ье|,," или "бета НЕ", как использовано в данном документе, является временем полужизни, связанным с фазой выведения, 1_1/2в=(1и2)/константа скорости элиминации, связанные с терминальной фазой. Химерные полипептиды согласно изобретению могут проявлять среднее Т^больше чем приблизительно 47, приблизительно 48, приблизительно 49, приблизительно 50, приблизительно 51, приблизительно 52, приблизительно 53, приблизительно 54, приблизительно 55, приблизительно 56, приблизительно 57, приблизительно 58, приблизительно 59 или приблизительно 60 ч.

"Минимум", как использовано в данном документе, является самым низким уровнем активности РУШ или ΡΙΧ, достигнутым после введения дозы химерного полипептида РУШ или ΡΙΧ и перед следующей дозой, если она вообще будет введена. В данном документе минимум используется взаимозаменяемо с "пороговой величиной". Исходные уровни РУШ или ΡΙΧ вычитают из измеренных уровней РУШ или ΡΙΧ для подсчета минимального уровня. В некоторых вариантах осуществления изобретения минимум составляет 1-5 или 1-3 МЕ/дл после приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13 или приблизительно 14 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень химерного полипептида в плазме достигает среднего минимума по меньшей мере приблизительно 1 МЕ/дл после по меньшей мере приблизительно 6 дней в по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90% или приблизительно 100% пациентов популяции или достигает минимума по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4 или 5 МЕ/дл после по меньшей мере приблизительно 6 дней у пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень указанного химерного полипептида в плазме достигает среднего минимума приблизительно 1-5 или 1-3 МЕ/дл. Такой минимум или средний минимум может достигаться после приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39 или приблизительно 40 дней.

"Объем распределения в равновесном состоянии" (У88), как использовано в данном документе, является кажущемся пространством (объем), в котором распределяется лекарственное средство. У88 - количество лекарственного средства в организме, деленное на концентрацию плазмы в равновесном состоянии. Средний У88 в популяции пациентов может составлять 200-300, приблизительно 200, приблизительно 210, приблизительно 220, приблизительно 230, приблизительно 240, приблизительно 250, приблизительно 260, приблизительно 270, приблизительно 280, приблизительно 290 или приблизительно 300 мл/кг. У88 для отдельных пациентов может составлять приблизительно 145, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 210, приблизительно 220, приблизительно 230, приблизительно 240, приблизительно 250, приблизительно 260, приблизительно 270, приблизительно 280, приблизительно 290, приблизительно 300, приблизительно 310, приблизительно 320, приблизительно 330, приблизительно 340, приблизительно 350, приблизительно 360 или приблизительно 370 мл/кг.

"Терапевтическая доза", как использовано в данном документе, означает дозу, которая достигает

- 30 028914

терапевтической цели, как описано в данном документе Расчет требуемой дозы фактора VIII основывается на эмпирической результате - в среднем 1 МЕ фактора VIII на килограмм массы тела повышает активность фактора VIII в плазме приблизительно на 2 МЕ/дл. Требуемую дозу определяют, используя следующую формулу:

Требуемые единицы=вес тела (кг)/желательное повышение фактора VIII (МЕ/дл или % от нормы)/0.5 (МЕ/кг на МЕ/дл).

Терапевтические дозы РУШ, которые могут использоваться в способах согласно изобретению, составляют приблизительно 10-100 МЕ/кг, более определенно, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 7080, 80-90 или 90-100 МЕ/кг и еще более определенно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 МЕ/кг.

Дополнительные терапвтические дозы Ρ^Π, которые могут использоваться в способах согласно изобретению, составляют приблизительно от 10 до приблизительно 150 МЕ/кг, более определенно приблизительно 100-110, 110-120, 120- 130, 130-140, 140-150 МЕ/кг и еще более определенно приблизительно 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 или 150 МЕ/кг.

Расчет требуемой дозы фактора IX (рбРЕХ), полученного из плазмы, базируется на эмпирическом результате - в среднем 1 МЕ рбРРХ на кг веса тела повышает активность фактора IX плазмы в среднем на 1 МЕ/дл (1 %). Исходя из этой основы требуемую дозу определяют, используя следующую формулу:

Требуемые единицы=вес тела (кг)/желательное повышение фактора IX (МЕ/дл или % от нормы)/1 (МЕ/кг на МЕ/дл)

Так как РРХРе, например, как описано на фиг. 1, имеет постепенное восстановление, сходное с рбРЕХ (отличается от ΒΕΝΕΡΚ®), требуемую дозу определяют, используя вышеуказанную формулу, или слегка ее приспосабливают. Для педиатрических пациентов, использующих рбРК, правила дозирования такие же, как и для взрослых. Однако педиатрические пациенты могут иметь низкое постепенное восстановление, а поэтому дозирование может нуждаться в большей корректировке.

Терапевтические дозы, которые можно использовать в способах согласно изобретению, составляют 10-180, 20-180 или 25-180 МЕ/кг, более определенно примерные дозы для 6-10 дневного интервала дозирования являются следующими: приблизительно 25-110, приблизительно 30-110, приблизительно 40-110, приблизительно 50-110, приблизительно 60-110, приблизительно 70-110, приблизительно 80-110, приблизительно 90-110 и приблизительно 100-110; приблизительно 30-100, приблизительно 30-90, приблизительно 30-80, приблизительно 30-70, приблизительно 30-60, приблизительно 30-50, приблизительно 30-40; приблизительно 40-110, приблизительно 50-100, приблизительно 60-90 и приблизительно 70-80 МЕ/кг; приблизительно 40-50, приблизительно 50-60, приблизительно 60-70, приблизительно 70-80, приблизительно 80-90, приблизительно 90-100 и приблизительно 100-110 МЕ/кг; приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100, приблизительно 105 и приблизительно 110 МЕ/кг. 6-10-дневный интервал дозирования включает еженедельный интервал дозирования. Дополнительные терапевтические дозы для 6-10-дневного, например, еженедельного, интервала дозирования включают 20-50, 20-100 и 20-180 МЕ/кг, более определенно примерные дозы для 6-10-дневного, например, еженедельного, интервала дозирования являются следующими: приблизительно 20-110, приблизительно 20-100, приблизительно 20-90, приблизительно 20-80, приблизительно 20-70, приблизительно 20-60, приблизительно 20-50, приблизительно 20-40, приблизительно 2030, приблизительно 20-40 и приблизительно 20 МЕ/кг. Дозы могут быть ниже чем 20 МЕ/кг, если эффективны для получающего пациента, например приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18 или приблизительно 19 МЕ/кг.

Примерные терапевтические дозы для 9-18-дневного, например, два раза в месяц, интервала дозирования могут быть следующими: приблизительно 50-180, приблизительно 60-180, приблизительно 70180, приблизительно 80-180, приблизительно 90-180, приблизительно 100-180, приблизительно 110-180, приблизительно 120-180, приблизительно 130-180, приблизительно 140-180, приблизительно 150-180, приблизительно 160-180 и приблизительно 170-180 МЕ/кг; приблизительно 90-170, приблизительно 90160, приблизительно 90-150, приблизительно 90-140, приблизительно 90-130, приблизительно 90-120, приблизительно 90-110 и приблизительно 90-100; приблизительно 100-170, приблизительно 110-160, приблизительно 120-150 и приблизительно 130-140 МЕ/кг; приблизительно 90-100, приблизительно 100110, приблизительно 110-120, приблизительно 120-130, приблизительно 130-140, приблизительно 140150, приблизительно 150-160 и приблизительно 160-170 МЕ/кг; приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100, приблизительно 105, приблизительно 110, приблизительно 115, приблизительно 120, приблизительно 125, приблизительно 130, приблизительно 135, приблизительно 140, приблизительно 145, приблизительно 150, приблизительно 155, приблизительно 160, приблизительно 165, приблизительно 170, приблизительно 175 и приблизительно 180 МЕ/кг.

- 31 028914

Примерами терапевтических доз являются 10-50, 15-100, 20-100, 20-50, 50-100, 10,20,40, 50 и 100 МЕ/кг.

Терапевтические дозы могут составлять приблизительно 20-50, приблизительно 20-100, приблизительно 20-180, 25-110, приблизительно 30-110, приблизительно 40-110, приблизительно 50-110, приблизительно 60-110, приблизительно 70-110, приблизительно 80-110, приблизительно 90-110, приблизительно 100-110, приблизительно 30-100, приблизительно 30-90, приблизительно 30-80, приблизительно 3070, приблизительно 30-60, приблизительно 30-50, приблизительно 30-40 МЕ/кг, приблизительно 40-110, приблизительно 50-100, приблизительно 60-90, приблизительно 70-80 МЕ/кг, приблизительно 40-50, приблизительно 50-60, приблизительно 60-70, приблизительно 70-80, приблизительно 80-90, приблизительно 90-100, приблизительно 100-110 МЕ/кг, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100, приблизительно 105 и приблизительно 110 МЕ/кг. Такие дозы могут использоваться для интервалов дозирования приблизительно 6-10, приблизительно 7-10, приблизительно 7-9, приблизительно 7-8, приблизительно 8-10, приблизительно 9-10, приблизительно 6-7, приблизительно 8-9, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9 и приблизительно 10 дней, и один раз в неделю.

Терапевтические дозы могут составлять приблизительно 90-180, приблизительно 100-180, приблизительно 110-180, приблизительно 120- 180, приблизительно 130-180, приблизительно 140-180, приблизительно 150-180, приблизительно 160-180 и приблизительно 170-180 МЕ/кг. Дозы могут составлять приблизительно 90-170, приблизительно 90-160, приблизительно 90-150, приблизительно 90-140, приблизительно 90-130, приблизительно 90-120, приблизительно 90-110 и приблизительно 90-100 МЕ/кг. Дозы могут составлять приблизительно 100-170, приблизительно 110-160, приблизительно 120-150 и приблизительно 130-140 МЕ/кг. Дозы могут составлять приблизительно 90-100, приблизительно 100-110, приблизительно 110-120, приблизительно 120-130, приблизительно 130-140, приблизительно 140-150, приблизительно 150-160 и приблизительно 160-170 МЕ/кг. Дозы могут составлять приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 100, приблизительно 105, приблизительно 110, приблизительно 115, приблизительно 120, приблизительно 125, приблизительно 130, приблизительно 135, приблизительно 140, приблизительно 145, приблизительно 150, приблизительно 155, приблизительно 160, приблизительно 165, приблизительно 170, приблизительно 175 и приблизительно 180 МЕ/кг. Такие дозы могут использоваться для интервала дозирования приблизительно 9-18, приблизительно 9-17, приблизительно 916, приблизительно 9-15, приблизительно 9-14, приблизительно 9-13, приблизительно 9-12, приблизительно 9-11, приблизительно 9-10, приблизительно 10-18, приблизительно 11-18, приблизительно 12-18, приблизительно 13-18, приблизительно 14-18, приблизительно 15-18, приблизительно 16-18, приблизительно 17-18, приблизительно 10-11, приблизительно 11-12, приблизительно 12-13, приблизительно 1314, приблизительно 14-15, приблизительно 15-16 и приблизительно 16-17 дней, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17 и приблизительно 18 дней, один раз в месяц и два раза в месяц (каждые две недели). Примерными терапевтическими дозами и интервалом дозирования являются следующие: 20 МЕ/кг один раз в неделю, 40 МЕ/кг каждые 10 дней и 100 МЕ/кг каждые две недели (дважды в месяц). Дополнительные комбинации доз и интервалов дозирования включают: доза по меньшей мере приблизительно 50 МЕ/кг и интервал дозирования по меньшей мере приблизительно 7 дней, доза по меньшей мере приблизительно 100 МЕ/кг и интервал дозирования по меньшей мере, приблизительно 9 дней, доза по меньшей мере приблизительно 100 МЕ/кг и интервал дозирования по меньшей мере приблизительно 12 дней, доза по меньшей мере приблизительно 150 МЕ/кг и интервал дозирования по меньшей мере приблизительно 14 дней, 20-50 или 20-100 МЕ/кг и указанный интервал дозирования один раз в неделю, доза 20-50 МЕ/кг и интервал дозирования 7 дней, доза 50-100 МЕ/кг и интервал дозирования 10-14 дней, или доза 100-150 МЕ/кг и интервал дозирования 14-16 дней. Примерные комбинации интервала дозирования и дозы также включают 10-50 МЕ/кг для 7 дней, 15-100 МЕ/кг для 10-13 дней, 50-150 МЕ/кг для 14-15 дней, 10-30 МЕ/кг для 7 дней, 15-50 МЕ/кг для 10 дней, 20-70 МЕ/кг для 11 дней, 25-85 МЕ/кг для 12 дней, 30-100 МЕ/кг для 13 дней, 40-125 МЕ/кг для 14 дней и 50-150 МЕ/кг для 15 дней.

VI. Тестирование коагулирующей активности у пациентов.

Способы и системы согласно настоящему описанию могут применяться для лечения пациента или оценивания или определения того, будет ли польза пациенту от введения терапевтически эффективной дозы терапевтического агента, который способен лечить нарушение свертывания крови, например гемофилию А или гемофилию В. Применение способов и систем, описанных в данном документе, можно использовать для определения более точного дозирования факторов свертывания крови для пациентов.

В дополнительном аспекте способы и системы, раскрытые в данном документе, можно применять для повышения силы и эффективности клинических испытаний. Таким образом, в исследовании можно мониторить индивидуумов и приспосабливать дозировки индивидуально.

Настоящее описание также предусматривает способы лечения нарушения свертываемости крови

- 32 028914

путем введения фактора свертываемости крови, например фактора VIII или IX. Индивидуализированное лечение, использующее способы, предусмотренные данным документом, могут вызывать меньше обострений заболевания и тем самым обеспечивать высокое качество жизни пациента.

С целью лечения пациента у пациента берут образцы перед и после введения полипептида РЮП или ИХ. В некоторых случаях последующие образцы можно получить у пациента после начавшегося лечения фактором свертывания крови или после приостановленного лечения. Образцы можно, например, запрашивать через медицинского работника (например, врача) или работника медицинского обеспечения, получать и/или обрабатывать с помощью одного и того же или другого медицинского работника (например, медсестры, больницы) или клинической лаборатории, а после обработки результаты могут отправляться еще другому медицинскому работнику, работнику медицинского обеспечения или пациенту. Подобным образом, измерение/определение времени коагулирования, сравнение между точками времени и решения касательно лечения могут проводиться одним или более медицинскими работниками, работниками медицинского обеспечения и/или клиническими лабораториями.

Способы, описанные в данном документе, могут использоваться для разных оценок, включая без ограничения анализ крови пациента перед лечением (или после завершения промывания перед терапевтическим лечением для оценки "исходного" образования сгустков (которое может коррелировать с тяжестью заболевания) и 2) добавляя разные терапевтические композиции, такие как рекомбинантный ΡνΠ или ИХ, ех У1уо к такой крови с целью прогнозирования ответа пациента на лечение.

В некоторых аспектах раскрытых способов образец крови получают от пациента или субъекта. Пациент или субъект могут иметь диагностированное состояние нарушения свертываемости крови, такое как гемофилия, или может быть пациентом или субъектом, у которого подозревается нарушение свертываемости крови, но которое еще не диагностировано. Образец крови можно получить с помощью любого известного способа, включая венопункцию, кожную пункцию, например, пальцевый стержень с ланцетом или другое приспосабливание, или взятие крови из артерии, но не ограничиваются ими. Образец крови может быть, например, цельной кровью, сывороткой или плазмой. Образец крови можно хранить для последующей оценки коагуляции или можно оценить во время получения образца крови. Образец крови можно получить с помощью пациента или субъекта, медицинского работника или в клинической лаборатории. Полученный образец крови может исследоваться медицинским работником или передаваться в клиническую лабораторию медицинским работником, или пациентом, или субъектом.

В дополнительном аспекте раскрытых способов измеряют одно или более свойств образования сгустков полученного образца крови. Такие свойства включают любое измерение фенотипического или физиологического события, связанного со свертыванием крови. Свойства образования сгустков, которые можно измерить, включают особенности изменений упругости при сдвиге развивающегося сгустка, определение кинетики образования сгустков, а также силы и стабильности образованного сгустка, но не ограничиваются ими. Другие свойства образования сгустков включают время и степень тромбинообразования или время и степень получения конкретных факторов свертывания крови, таких как РЮП или ИХ. Любое измеряемое свойство образования сгустков, которое может использоваться для оценки гемостаза, может быть измерено согласно способам, предусмотренным данным документом. Примерные способы для измерения свойств сгусткообразования, такие как ТОА, КОТЕМ®, КОТЕО и подобные, описаны в данном документе. В некоторых аспектах многие измерения осуществляют по прошествии длительного времени. Одно или более измерений можно проводить перед лечением, на всем протяжении курса лечения или после лечения.

В некоторых аспектах свойства сгусткообразования у одного или более нормальных здоровых субъектов могут измеряться для обеспечения исходных, стандартных или нормальных результатов в качестве негативных контролей. Подобным образом свойства сгусткообразования могут измеряться у пациентов, известных как страдающие от конкретного состояния нарушения свертываемости крови, или у популяции пациентов, известных как имеющие нарушения свертываемости крови разной тяжести, для использования в качестве положительных контролей. В некоторых аспектах свойства сгусткообразования могут измеряться у пациентов, испытующих лечение факторами свертывания крови перед, во время и после лечения для "исходных" результатов, соответствующих эффективному лечению. Как будет оценено, "исходные" результаты у пациентов с нарушением свертываемости крови, испытующих лечение, могут значительно отличаться от результатов, полученных у нормальных здоровых индивидуумов, даже если лечение является очень эффективным. Как будет понятно специалисту в данной области, результаты могут значительно отличаться у одного субъекта или между субъектами, даже между здоровыми субъектами. Соответственно в некоторых аспектах изобретения свойства сгусткообразования могут измеряться много раз в одном полученном образце крови или в отдельно полученных образцах крови, и для стандартов и контролей измерения свойств сгусткообразования могут усредняться для популяции субъектов, например 3, 5, 10 или 100, или более субъектов.

Одно или более свойств сгусткообразования может измеряться медицинским работником в клинической лаборатории или с помощью любого другого разрешенного приспособления. В некоторых аспектах измерение одного или более свойств сгусткообразования может предлагаться первоначально пациентом или специализированным медицинским работником. В некоторых аспектах пациент или субъект

- 33 028914

может запросить снятые измерения. В некоторых аспектах измерение одного или более свойств сгусткообразования может запрашиваться работником медицинского обеспечения, например, перед санкционированием платы за лечение нарушения свертываемости крови.

В некоторых аспектах раскрытых способов результаты измерения одного или более свойств сгусткообразования, как описано выше, могут сравниваться с одним или более контрольными измерениями. Такие контрольные измерения могут быть, например, индивидуальным исходным измерением у пациента, например, до или после лечения. Альтернативно, контрольные измерения могут быть измерениями свойств сгусткообразования у одного или более нормальных здоровых субъектов или измерениями свойств сгусткообразования у одного или более известных пациентов с известным нарушением свертываемости крови, леченными, нелеченными или обоими.

В некоторых аспектах контрольные и исходные измерения проводят в тоже время и отдают в качестве измерений свойств сгусткообразования у субъекта, подлежащего оценке. Имея для проведения таких контролей любое время, измерение проводят у известного или потенциального пациента с нарушением свертываемости крови, оно может быть затруднительным и дорогостоящим. Соответственно в одном аспекте изобретения стандартизированные исходные или контрольные измерения проводят централизовано и используют для сравнения измерения пациентов или потенциальных пациентов. Для гарантии того, что измерения при централизированном помещении и измерения в разных сателитных помещениях могут быть стандартизированы, обычные инструменты, реагенты и материалы обеспечиваются для каждого сателитного помещения. Контрольные измерения могут проводиться регулярно в каждом сателитном помещении для валидации точности измерений свойств сгусткообразования, которые будут проводиться в этом помещении. Валидация сателитных лабораторий для измерения свойств сгусткообразования может обеспечиваться путем "глобализации" измерений свойств сгусткообразования. Такая стандартизация позволяет медицинским работникам более точно определять и/или приспосабливать терапевтические режимы для данного пациента или определять, что субъект не нуждается в лечении.

В некоторых аспектах сравнение с исходными и контрольными измерениями проводят с помощью медицинского работника, используя данные пациента, полученные медицинским работником или обеспеченные сателитной лабораторией или централизированной лабораторией, и сравнивая данные с исходными или контрольными данными, полученными медицинским работником, сателитной лабораторией или централизированной лабораторией или их комбинацией. В некоторых аспектах сравнение проводят с помощью клинической лаборатории (валидизированное сателитное оборудование или централизированное оборудование), используя образец крови пациента, обеспеченный медицинским работником, со сравнением, производимым с данными, полученными на сателитном оборудовании или централизированном оборудовании.

В некоторых аспектах способы, описанные в данном документе, обеспечивают медицинские работники или пациенты, с более точным и надежным способом лечения или оценки нарушения свертываемости крови. Исходя из данных общего анализа гемостаза, как предусмотрено в данном документе, можно определить, имеет ли субъект или нет нарушение свертываемости крови. Более того, лечения могут быть более точно приспособленными к качеству и тяжести нарушения свертываемости крови у пациента. Например, лечение пациента может изменяться, повышаться, уменьшаться, повышаться по частоте, уменьшаться по частоте или прекращаться. В некоторых аспектах пациент с известным нарушением свертываемости крови, который обдумывает такую процедуру, как хирургическая операция, может быть тщательно проверен, а лечение пациента приспособлено для любой проводимой процедуры. В некоторых аспектах способы, предусмотренные в данном документе, обеспечивают путь для улучшения результатов, полученных в клинических испытаниях новых способов лечения нарушения свертываемости крови, таких как рекомбинантные или синтетические факторы свертываемости крови.

Варианты лечения, засвидетельствованные результатами, полученными в раскрытых способах, можно автоматически получить по сравнению с исходными контрольными результатами, или результаты могут пересылаться медицинскому работнику, который делает выбор вариантов лечения, исходя из результатов. В некоторых аспектах, когда варианты лечения получают из клинической лаборатории, результаты, отосланные медицинскому работнику, могут включать инструкции для медицинского работника касательно начала, приспособления, изменения, оптимизации или прекращения лечения ввиду результатов анализа. В некоторых аспектах такие инструкции могут исходить из статистических данных, полученных от множества пациентов, демонстрирующих сходные результаты. Несмотря на то что медицинский работник является нормальным, окончательное решение касательно лечения нарушения свертываемости крови принимает лицо, выдавшее денежное обязательство, как использовано в данном документе, понятие "инструктирование медицинского работника относительно начала, приспособления, изменения, оптимизации или прекращения лечения" относится, например, к сообщению, которое предусмотрено для медицинского работника, указывающему рекомендуемые варианты лечения, принимая во внимание результаты.

Путем обеспечения более стандартизированных анализов для измерения свойств сгусткообразования способы, предусмотренные в данном документе, обеспечивают пациентов и медицинских работников более точными и надежными инструментами для лечения нарушений свертываемости крови.

- 34 028914

Дополнительные варианты осуществления изобретения включают:

Ε1. Способ лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

ο) сравнение результатов пациента касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением; и

ά) введение оптимизированного лечения пациенту, причем лечение является заданным или приспособленным, исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Ε2. Способ лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

b) передачу образца крови для измерения способности образовывать сгустки и сравнение с соответствующим стандартом, причем стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением; и

ο) введение оптимизированного лечения пациенту, причем лечение является заданным или приспособленным, исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Ε3. Способ лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

b) сравнение результатов пациента касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, причем стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением; и

ο) инструктирование лечащего врача по поводу заданного и приспособленного лечения пациента, причем лечение является заданным или приспособленным, исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Ε4. Способ оптимизации лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

ο) сравнение результатов пациента касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, причем стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением; и

Ε5. Способ оптимизации лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

Ε6. Способ оптимизации лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

ο) инструктирование лечащего врача по поводу оптимизации лечения пациента, причем лечение является заданным или приспособленным, исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Ε7. Способ определения эффективности лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

ο) сравнение результатов пациента касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, причем стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, и причем схожесть между результатами пациента и стандартом указывает на эффективность лечения пациента; и

ά) поддержание или приспосабливание лечения пациента исходя из относительной разницы между результатами пациента касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

- 35 028914

Е8. Способ определения эффективности лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

b) передачу образца крови для измерения способности образовывать сгустки и сравнение с соответствующим стандартом, причем стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением, и где схожесть между результатами пациента и стандартом указывает на эффективность лечения пациента; и

Е9. Способ определения эффективности лечения нарушения свертываемости крови у пациента, включающий:

b) сравнение результатов пациента касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, причем стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, и где схожесть между результатами пациента и стандартом указывает на эффективность лечения пациента; и

Е10. Способ стандартизации результатов анализа гемостаза, включающий:

b) измерение способности образовывать сгустки в образцах крови, причем измерения проводят, используя стандартизированные реагенты и способы;

c) сравнение результатов пациентов касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, причем стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, и где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов; и

Е11. Способ стандартизации результатов анализа гемостаза, включающий:

b) передачу образцов крови для измерения способности образовывать сгустки и сравнение с соответствующим стандартом, причем измерения проводят, используя стандартизированные реагенты и способы, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением, и где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов; и

Е12. Способ стандартизации результатов анализа гемостаза, включающий:

b) сравнение результатов пациентов касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, причем стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, где измерения проводят, используя стандартизированные реагенты и способы, и где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов; и

Е13. Способ стандартизации результатов в многоцентровом клиническом испытании факторов свертывания крови, включающий:

b) измерение способности образовывать сгустки в образцах крови, причем измерения проводят, используя обычные реагенты и способы;

c) сравнение результатов пациентов касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, причем стандарт является репрезентативным касательно терапевтической эффективности лечения, где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов, и где расхождение результатов между многими центрами клинических испытаний не является статистически значимым; и

б) поддержание или приспосабливание лечения пациентов исходя из относительной разницы между

- 3б 028914

результатами пациентов касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Е14. Способ стандартизации результатов в многоцентровом клиническом испытании факторов свертывания крови, включающий:

b) передачу образцов крови для измерения способности образовывать сгустки и сравнение с соответствующим стандартом, причем измерения проводят, используя обычные реагенты и способы, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением, где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов, а расхождение результатов между многими центрами клинических испытаний не является статистически значимым; и

Е15. Способ стандартизации результатов в многоцентровом клиническом испытании факторов свертывания крови, включающий:

a) измерение способности образовывать сгустки в образцах крови, полученных от тестируемых пациентов с нарушением свертываемости крови в многочисленных центах клинических испытаний;

b) сравнение результатов пациентов касательно образования сгустков с соответствующим стандартом, причем измерения проводят, используя обычные реагенты и способы, где стандарт коррелирует с терапевтически эффективным лечением, где схожесть между результатами пациентов и стандартом указывает на эффективность лечения пациентов, а расхождение результатов между многими центрами клинических испытаний не является статистически значимым; и

c) инструктирование медицинских работников, участвующих в клинической испытании, от которых были получены образцы, по поводу поддержания и приспособления лечения тестируемых пациентов исходя из относительной разницы между результатами пациентов касательно образования сгустков и соответствующим стандартом.

Е16. Способ согласно любому одному из вариантов осуществления Е1-Е15, отличающийся тем, что лечение включает введение белка фактора VIII или его фрагмента, варианта или производного, или белка фактора ЕХ или его фрагмента, варианта или производного.

Е17. Способ согласно варианту осуществления Е16, отличающийся тем, что лечение включает введение химерного слитого белка фактора УШ-Рс или химерного слитого белка фактора ГХ-Рс.

Е18. Способ согласно варианту осуществления Е17, отличающийся тем, что часть Рс химерного белка фактора VIII или И содержит человеческий домен Рс.

Е19. Способ согласно любому одному из вариантов осуществления Е16-Е18, отличающийся тем, что химерный белок фактора VIII содержит фактор VIII с удаленным В-доменом.

Е20. Способ согласно варианту осуществления Е19, отличающийся тем, что п химерный белок фактора VIII содержит §Е0 ГО N0: 6.

Е21. Способ согласно варианту осуществления Е19, отличающийся тем, что химерный белок фактора VIII содержит §Е0 ГО N0: 2.

Е22. Способ согласно варианту осуществления Е17 или варианту осуществления Е18, отличающийся тем,что химерный белок фактора !Х содержит §Е0 ГО N0: 13.

Е23. Способ согласно любому одному из вариантов осуществления Е1-Е22, отличающийся тем, что способность образовывать сгустки является тромбинообразованием, кинетикой образования сгустков, силой образования сгустков, стабильностью образования сгустков или их комбинацией.

Е24. Способ согласно любому одному из вариантов осуществления Е1-Е23, отличающийся тем, что указанный образец крови является цельной кровью.

Е25. Способ согласно любому одному из вариантов осуществления Е1-Е23, отличающийся тем, что указанный образец крови является плазмой.

Е26. Способ согласно любому одному из вариантов осуществления Е1-Е25, отличающийся тем, что способность образовывать сгустки измеряют с помощью анализа тромбинообразования (ТСА), тромбоэластографии (ТЕС), ротационной тромбоэластометрии (КОТЕМ®), анализа формы сигналов или их комбинации.

Е27. Способ согласно варианту осуществления Е26, отличающийся тем, что способность образовывать сгустки измеряют с помощью ТСА.

Е28. Способ согласно варианту осуществления Е26, отличающийся тем, что способность образовывать сгустки измеряют с помощью ТЕС.

Е29. Способ согласно варианту осуществления Е26, отличающийся тем, что способность образовывать сгустки измеряют с помощью КОТЕМ®.

Е30, Способ согласно варианту осуществления Е26 отличающийся тем, что способность образовывать сгустки измеряют с помощью анализа формы сигналов 8.

Е31. Способ согласно любому одному из вариантов осуществления Е1-Е9, дополнительно включающий добавление ех νίνο, ряда доз факторов свертывания крови терапии к аликвотам образцов крови,

- 37 028914

полученным от пациента, и сравнение ряда результатов, полученных с добавлением факторов свертывания крови терапии к стандарту.

Е32. Способ согласно варианту осуществления Е31, отличающийся тем, что стандартом является стандартная кривая результатов образования сгустков, полученная с повышающимися количествами фактора свертывания крови, добавленными к РУШ или ΡΙΧ-дефицитной плазме.

Е33. Способ согласно любому одному из вариантов осуществления Е1-Е9, отличающийся тем, что пациента еще не лечили фактором свертывания крови.

Е34. Способ согласно любому одному из вариантов осуществления Е1-Е9, отличающийся тем, что пациент перед лечением получал терапию общепринятым фактором свертывания крови, но лечение было прекращено в течение периода времени, достаточного для очищения крови пациента от терапевтического фактора свертывания крови.

Имея описанное настоящее изобретение в деталях, то же самое будет более понятно с помощью ссылки на следующие примеры, которые включены в данный документ только с целью иллюстрации и не предназначены ограничивать изобретение. Все патенты и публикации, указанные в данном документе, специально включены путем ссылки.

Примеры

Пример 1 Очевидные ошибки активности γΡΙΧΡο У5. ВЕЦЕРК® в ТСА из-за высоких примесей РКа в ВЕ№РК®.

Анализ тромбинообразования (ТСА), общий анализ гемостаза, который осуществляет контроль количества активного тромбина, продуцируемого в плазме пациента после рекальцификации, отображает полезное показание в оценке коагуляционной способности гемофильной плазмы.

Образцы после введения гРКРс или ВΕNΕΡIX® (РП/ег) анализировали с помощью ТСА. Когда равные единицы гРКРс и ВЕ№РК®, определенные с помощью одностадийного анализа, были внесены в гемофильную плазму и их коагуляционная способность оценена с помощью ТСА, то ВΕNΕРIX® вызвал в 2 раза высший пик и тромбиновую кривую, существенно сдвинутую влево относительно γΡΙΧΡο, в присутствии лимитирующего тканевого фактора (ТР) и 4 мкМ фосфолипидов (РЬ). Как показано на фиг. 3А, ВЕЦЕРК®, кажется, обладает удвоенной ίη νίίτο активностью в стандартном ТСА (1 пмМ ТР+4 мкМ РЬ) по сравнению с γΡΙΧΡο (1 МЕ/мл гРКРс®)® МЕ/мл ВепеРК®; МЕ /мл по аРТТ).

В поверочной пробе в отсутствие инициирующего тканевого фактора ВΕNΕРIX® демонстрировал изрядную тромбогенную активность, тогда как γΡΙΧΡο по сути был неактивным (фиг. 3В). Наблюдалось, что ВЕЦЕРК® обладал заметно более высоким уровнем примесей ΡΙΧα, чем γΡΙΧΡο в факторе ΙΧα ЕЫБА (см. КТ. Ре!егк е! а1., Рго1опдеД ас!М!у фактора ΙΧ ак а топотепо Рс Γπκίοη рго!ет. Βίοοά 2010; 115: 2057-2064). Протеаза фактора Ка, как известно, является тромбогенной в модели ίη νίνο (см. Сгау Е. е! а1., МеакитетеШ оГ ас!Ка!еД Рас!ог ΙΧ ίη Рас!ог ΙΧ сοηсеη!^а!е8: соггсСПоп \νί11ι ίη νίνο !ЬтотЪодетсЬу. ТЬготЬ. Наеток!. 1995; 73(4):675-679; Виуие Υ. е! а1., ТЬе Ьератш-ЪтДшд ехокЬе фактора Ка 18 а сгШса1 геди1а!ог оГ р1акта !ЬтотЪш деиетНом апД νеηοи8 !ЬтотЪок18. В1ооД 2008; 112(8):3234-3241.). Вследствие этого предполагается, что повышенный ίη νί!το профиль тромбинообразования ВЕЦЕРК® вызван присутствием избытка фактора Ка.

Профиль тромбинообразования ВЕ№РК® после ингибирования активных центров протеазы (ΡΊΧ).

Чтобы проверить высказанную выше гипотезу, ВемеРК® инкубировали в течение ночи с блокатором активных центров сериновой протеазы, ЕСК-хлорметиловым кетоном и диализировали с помощью экстенсивной замены буфера. Тромбинообразование инициировали 1 пмМ тканевого фактора в присутствии 4 мкМ фосфолипидов в дефицитной по ΡΙΧ плазме, дополненной 1 МЕ/мл ΡΙΧ-материала. Заблокированный РКа или ΒΕNΕРIX® с ингибированными активными центрами показали очень похожие профили тромбинообразования (ЕТР, тромбиновый пик, зависимость от времени и наклон) с тРКРс, подтверждая роль РКа в тромбинообразовании с помощью ВЕЦЕРК® (фиг. 3С).

Титриметрический анализ полученного из плазмы РКа в дефицитной по ΡΙΧ плазме в отсутствие тканевого фактора. Количественное определение РКа в лекарственных продуктах ВЕЦЕРК® и гРКРс с помощью ТСА.

РКа можно более легко определить количественно в ТСА без добавления (экзогенного) ТР, но примированного 5 нМ тромбина, который потребляется при осуществлении реакции, как показано контролем '0 РКа' на фиг. 3Ό.

Для количественного определения активного фактора Ка в ВЕЦЕРК® и гРКРс калибровочную кривую для полученного из плазмы фактора Ка (например, рРКа, из Наета!о1одю ТесЬш^дхек, Еккех 1ипс!юп, УегтоШ) строили методом добавок возрастающих концентраций фактора Ка (0-100 пМ) к дефицитной по человеческому фактору ΙΧ плазме в присутствии 4 мкМ фосфолипидов. Перед началом измерения добавляли 5 нМ тромбина к пробирному анализу с целью улучшения чувствительности (фиг. 3Е).

Эффект дозы наблюдали с пределом чувствительности до 0,5 пМ рРКа в дефицитной по ΡΙΧ плазме. ΒΕNΕРIX®, РКа-блокированный ВЕ№РК® и гРКРс равной активности (1 МЕ/мл, с помощью

- 38 028914

одностадийного анализа коагулирующей активности) вызывали тромбиновые ответы, сравнимые с 20 пМ, 1 прМ и 2 пМ рНХа соответственно, указывая количество НХа, присутствующего в каждом ИХ. Репрезентативная кривая и аппроксимация кривой показаны на фиг. 3Ό и Е. Похожие результаты наблюдались в разных партиях дефицитных по ИХ плазмах (разные доноры).

В обычном анализе тромбинообразования, инициированного лимитирующим ТР, 1 МЕ/мл гНХРе, дополненный 20 пМ рНХа, демонстрировал равный тромбиновый пик и индекс скорости с 1 МЕ/мл ΒΕΝΕΡΡΧ®.

Сравнение инициированных тканевым фактором профилей тромбинообразования ΒΕΝΕΙ-ΊΧ® и гНХРе, дополненного увеличивающимся НХа, полученным из плазмы.

Для подтверждения результатов титрования рНХа анализ инициированного тканевым фактором тромбинообразования осуществляли путем дополнения 1 МЕ/мл гНХРе возрастающими концентрациями рНХа к дефицитной по ИХ плазме и сравнения с 1 МЕ/мл ΒеηеРIX® без НХа (фиг. 3Р). В этом эксперименте 1 МЕ/мл гИХРе+20 пМ рНХа вызывал такое же количество тромбина, что и 1 МЕ/мл ΒΕΝΕНХ® без добавления НХа в реакции тромбинообразования. Результаты просуммированы в табл. 1.

Таблица 1

Сравнение ΒΕΝΕΡΚ® и гНХРе, дополненного полученным из плазмы , НХа

рИХа (пМ) дополненный	лаг-период (мин.)	ЕТР (нМ*мин.)	Тромбиновый пик (нМ)	Время пика (мин.)
гИХРс+0 пМ ИХа	8,5	1175,5	90,37	13
гИХРс+10 пМ ИХа	7,88	1301,5	143,58	11,75
гИХРс+20 пМ ИХа	6,62	1452	231,47	9,62
гИХРс+50 пМ ИХа	6,12	1548	268,13	8,75
гИХРс+100 рМИХа	5,5	1600	314,68	7,5
ВепеИХ+0 пМ ИХа	6,75	1430,5	224,61	9,62

Заключение.

Эти данные подтверждают, что:

1) минорные количества НХа в лекарственном продукте НХ (например, следовое количество 0,1%) могут вызывать значительное тромбинообразование в общем анализе гемостаза (например, ТОА);

2) более высокий видимый пик тромбина и сокращенная зависимость от времени на профиле тромбинообразования для ΒΕΝΕΡΚ® по сравнению с гНХРе всецело вызваны присутствием фактора Ка в ΒΕΝΕΡΚ®; и

3) снижая примеси НХа в этих лекарственных продуктах, ΒΕΝΕΡΚ® и гНХРе имеют эквивалентную ΐη уйго активность тромбинообразования на единицу активности ИХ.

Таким образом, при сравнении активности разных продуктов или вариантов ИХ с помощью ТОА можно получить вводящие в заблуждение результаты, если они содержат разные количества примесей НХа. И νίνο НХа быстро инактивируется и не способствует эффективности лекарственного продукта НХ. Стандартизация клинических ТОА с помощью метода добавки лекарственного продукта НХ в исходный образец плазмы может быть ненадежной, но не вызывает такого действия НХа на аРТТ в течение быстрой контактной активации НХ. Таким образом, НХа также может воздействовать на анализы ΚΟТΕМ®/ТΕО, когда в гемофильную кровь вводят лекарственный продукт ИХ.

Исходя из этих результатов можно заключить, что анализы тромбинообразования можно использовать для оценки уровней НХа в продуктах НХ с высокой чувствительностью (0,5 пМ НХа на МЕ/мл НХ), когда во время измерения присутствуют малые количества тромбина (например, в аналитическом буфере/аналитическом растворе).

Пример 2. ΚΟТΕМ® в качестве общего анализа активности Р¥Ш с использованием разных терапий.

Как показано на фиг. 4, ΚΟТΕМ® можно использовать для анализирования образцов клинического исследования Р¥Ш. Анализы проводили в приблизительно 20 клинических базах. Контролями обедненной тромбоцитами плазмы была гемофильная плазма от одного донора (пациент 939), обогащенная 30, 15, 5 и 1% гР¥Ш.

Эти результаты воспроизводимы в рамках пациента. Фармакокинетика активности ^Р¥ШРс против А^¥АТΕ® показана на фиг. 5. Фармакокинетику ^Р¥ШРс повторяли спустя 14 недель.

- 39 028914

Как показано на фиг. 6А-6С, гУШТс улучшал свертываемость крови (сокращенное время сгусткообразования) на более продолжительный период, чем Α^VΑТΕ® (Вах!ег). Результаты ΚΟТΕΜ® для исходной γΡΎΠΙΡο РК (неделя 1) и повторной РК (неделя 14) также совпадали. Важно отметить, что эта воспроизводимость в рамках того же самого пациента является решающей для оценки межсубъектных отличий. Эти данные подтверждают, что существует хорошая корреляция между активностью ΡΥΙΙΙ (путем одностадийного анализа) и временем сгусткообразования с помощью ΚΟТΕΜ®. Как показано на фиг. 7А-7С, при одной и той же активности ΡΥΙΙΙ, γΡΥΙΙΙΡο, кажется, образует сгустки быстрее, чем ΑΌVΑТΕ®.

Пример 3. Стандартизация общего анализа гемостаза в целом по ряду клинических центров исследований.

Измерение активности ΡΥΙΙΙ или ΡΙΧ в клинических образцах с помощью одностадийного анализа коагулирующей активности является стандартным методом оценки ίη νίνο активности современных продуктов замещающих факторов при лечении гемофилии. Однако одностадийный анализ коагулирующей активности не может точно предсказать ίη νίνο активность новых продуктов ΡΥΙΙΙ и ά ΡΙΧ, которые модифицированы для повышения потенциала и более длительного времени полураспада. Общие анализы гемостаза, такие как тромбоэластография (ΎΕΟ) и ротационная тромбоэластометрия (ΚΟТΕΜ®), могут обеспечить дополнительную информацию о ίη νίνο функции продуктов ΡΥΙΙΙ и ΡΙΧ, так как эти анализы цельной крови задуманы для того, чтобы более тщательно отображать ίη νίνο коагуляцию.

ТΕО и ΚΟТΕΜ® анализы не получили широкого распространения в клиническом использовании и обычно не используются при лечении гемофилии в основном из-за нехватки стандартизации анализа, отсутствия контрольных материалов, пригодных для образцов гемофилических пациентов и связанный с затратами времени (низкая выработка) аспект обработки образцов крови. Тем не менее, если должным образом внедрить их как часть клинического испытания, то эти анализы могут обеспечить суррогатный маркер для ίη νίνο активности новых продуктов, когда традиционные анализы факторов могут иметь низкую прогностическую ценность.

Ιη νίνο активность Ρс-слитого белка фактора свертывания крови ΙΧ длительного действия (γΡΙΧΡο) можно более точно измерить, используя такой метод. Рекомбинантный (г) ΡΥΙΙΙΡο и γΡΙΧΡο являются факторами свертывания крови, которые генетическим путем слили с частью Ρο человеческого иммуноглобулина О1 (Ι§01). Полученный слитый белок сохраняет коагулирующую активность в одностадийном анализе коагулирующей активности и в хромогенном анализе.

Стандартизация анализа для измерения активности ίη νίνο.

Эффективность стандартизированной процедуры для проведения анализа ΚΟТΕΜ® в многочисленных клинических центрах оценили на основе фазы 3 клинического испытания слитого белка ΙΧ Ρο длительного действия.

Примерные методы оценивали процесс коагуляции крови и фибринолиза путем измерения вязкоупругих свойств свежесобранной крови в зависимости от времени, тем самым обеспечивая информацию о начале коагуляции и кинетике размножения, взаимодействии фибрин-тромб, прочности сгустков и фибринолизе. Примерами параметров, релевантных для информации о сгустках в гемофилических образцах, являются время свертывания (СТ), время сгусткообразования ^ΡΗ, α-угол (а), прочность сгустков (А5-АХ), максимальная прочность сгустков (МС.Е) и максимальный фибринолитический индекс (МЬ).

Сравнение результатов ΚΟТΕМ® индивидуальных субъектов, например, по всем клиническим центрам, требует стандартизированной процедуры и метода верификации однородных инструментов, оператора и реагентов.

Перед оценкой клинических образцов каждый участвующий центр проводил серию анализов контроля качества (ОС), используя реагенты ЕОТЕОЕ Ν, обеспеченные ТΕМ ΙηηοναΙίοηδ ОтЬН, и серию контролей замороженной плазмы, которая была приготовлена в головном центре путем обогащения гемофилической плазмы 4 разными уровнями лекарственного продукта ΡΙΧ (1, 5, 15 и 30 МЕ/дл).

Чтобы верифицировать стабильность реагентов и производительность оператора, включая все шаги разведения реагентов, контроли замороженной плазмы были приготовлены в головном центре и содержат четыре уровня γΡΙΧ (фиг. 8). Детальный протокол анализа и все реагенты, необходимые для проведения ΚОТΕМ®, включая заказные разбавители, были обеспечены в центры из головного центра, чтобы гарантировать согласованный метод и набор реагентов единообразно для всех центров, участвующих в этом поисковом исследовании. Кроме того, местные операторы в каждом центре участвовали в практическом обучении, обеспеченном головным центром.

ΚΟΓΚΟΕ Ν и контроли плазмы тестировали по несколько раз в каждом центре в течение периода по меньшей мере 26 недель. Данные повторных анализов использовали для определения внутрилабораторных и межлабораторных расхождений. Информационный анализ (ΑΝΟνΑ) проводили для межлабораторных расхождений. Р-значение <0,05 считался статистически значимым. Модель со смешанными эффектами использовали с ковариантами центра и уровнем плазмы. Все статистические анализы проводили в ПВСО δροιΓ^^е δ+8.2 (ПВСО δοΠ\ν;·ιΐΌ Ιηο., РаЮ Αΐΐο, СА).

- 40 028914

Промежуточный анализ проводили по данным ^С, набранным из 6 клинических центров, которые провели в сумме 44 ^С-прогонов для И1Х на 8 инструментах КОТЕМ® (7 моделей Сатта и 1 модель ВеЙа). Среди 4 оцененных параметров КОТЕМ® (время свертывания, СТ; скорость образования сгустков, СИК; максимальная прочность сгустков, МСЕ и угол α), СТ был наиболее воспроизводимым, с относительно небольшим % СУк среди 5 центров, варьируя от 8 до 24% по 4 уровням концентраций Е1Х (табл. 2).

Таблица 2

Суммарные данные КОТЕМ® (время свертывания (ШТЕМ) для контрольных образцов плазмы)

глобальные центры
	30% ИХ (п=11)	15% ИХ (п=11)	5% ИХ (п=11)	1% ИХ (п=10)
средне	901	1041	1342	2003
мин., макс.	549, 1077	907, 1207	1127, 1737	936, 2750
%СУ	17%	8%	13%	24%
головной цент]	3
	30% ИХ(п1 = 19)	15% ИХ (п1 = 19)	5% ИХ (п1 = 19)	1% ИХ (п1 = 19)
средне	893	1010	1295	2178
мин., макс.	776, 1002	895, 1136	1033, 1640	1769, 2837
%СУ	8%	7%	12%	16%

Модель смешанных эффектов приспособили под данные общего ^С КОТЕМ® (переменная отклика) с "центрами" и "уровнями плазмы И1Х" в качестве ковариантов. Центр не имел статистически значимого эффекта на время свертывания (р-значение=0,57) и угол α (р-значение=0,85), но слабо действовал на (р=0.12) и СИК (р-значение=0,07). Как ожидалось, повышение уровня концентрации И1Х показало значительное снижение времени свертывания (р-значение=0,001).

Для дополнительной проверки подхода стандартизации при контролировании межцентровых расхождений данных КОТЕМ® также оценивали два параметра - оператор и инструмент. Сравнение результатов, полученных из 5 клинических центров, с анализом реплик из одного центра (19 прогонов для каждого уровня И1Х проводили в головном центре с помощью одного оператора на 6 инструментах модели ВеЙа) выявило эквивалентную вариабельность с АЫОУА в целом, р-значение 0,85 для СТ (учет корреляции между данными КОТЕМ® и уровнем И1Х) и похожую сравнимость для СИК, МСИ и угла α.

Для верифицирования эффективности каждого инструмента КОТЕМ® в мультицентровом исследовании стандартизированный метод КОТЕМ® ^С ШТЕМ тестировали с использованием одного набора реагентов КОТКОЕ Ν, к!аг-Тет® и т-Тет®. Результаты просуммированы на фиг. 9. Партиеспецифические целевые уровни (пунктирные линии) подтверждены всеми участвующими центрами и не было инструментсвязанного группирования результатов, например, когда образцы анализировались многими инструментами в одном центре и одним оператором. Все инструменты поддерживались в рабочем состоянии согласно инструкции производителя (на данные КОТКОЕ Ν). Таким образом, различия в рабочих характеристиках инструментов/настройке не вносили существенного вклада в межцентровую вариабельность (например, операторская и инструментальная вариабельность не является значительным фактором в исследовании КОТЕМ®).

Принимая во внимание тот факт, что преаналитические переменные для сбора крови также минимизированы в стандартизированной процедуре, то основные различия в субъектных параметрах КОТЕМ® будут важным индикатором их гемостатического потенциала, а не простым расхождением анализа между индивидуальными тестируемыми центрами.

Субъект-специфичные различия в профилях коагуляции И1Х-дефицитной плазмы.

Образцы плазмы от двух доноров с врожденным дефицитом показали <0,3% И1Х и нормальные уровни активности ИУ11 и ИУ111 (табл. 3). Параметры КОТЕМ® при эквивалентных уровнях И1Х значительно отличались в плазме двух доноров (фиг. 10А и 10С). Плазма от донора 2 также демонстрировала более длительное время образования сгустков с помощью аРТТ в сравнении с донором 1 (фиг. 10В). Плазму от донора 2 использовали для приготовления контрольных образцов из-за большей дифференциации при более низких концентрациях И1Х.

Таблица 3

Активность фактора свертывания крови (%)

Анализ	Донор 1	Донор 2
активность РУП РТ [МЕ/дл]	65	59
одностадийная коагулирующая активность РУШ [МЕ/дл]	105	81
одностадийная коагулирующая активность ΡΙΧ [МЕ/дл]	<0,3	<0,3

Сравнение результатов контролей плазмы между одним центром и глобальными центрами. Дозозависимый эффект от 1 до 30 МЕ/дл в И1Х-дефицитной плазме визуализировали с помощью

тромбоэластометрических параметров СТ, α-угла, А5, но не МСИ. Повышение концентраций И1Х значительно снижало время свертывания и α-угол. Модель со смешанными эффектами показала, что центры

- 41 028914

не имели статистически значимого действия на время свертывания (р-значение=0,43), СРК (рзначение=0,41), угол α (р-значение=0,25) или МСР (р-значение=0,83) по сравнению с одним центром (фиг. 11).

Стандартизация анализа для измерения активности гРУПРс ίη νίνο.

Эффективность стандартизированной процедуры для проведения анализа К0ТЕМ® в многочисленных клинических центрах оценивали на основе фазы 3 клинического испытания Рс-слитого белка фактора свертываемости VIII длительного действия.

Сравнение результатов К0ТЕМ® от индивидуальных субъектов, например, по всем клиническим центрам, требует стандартизированной процедуры и метода верификации однородных инструментов, оператора и реагентов.

Перед оценкой клинических образцов каждый участвующий центр (14 центров) серию анализов контроля качества (ОС), используя реагенты К0ТК0Ь Ν, обеспеченные ТЕМ [ппоуайопк ОтЬН. Чтобы верифицировать стабильность реагентов и производительность оператора, включая все шаги разведения реагентов, контроли замороженной плазмы были приготовлены в головном центре и содержали четыре уровня концентраций гРУП (1, 5, 15 и 30%). Детальный протокол анализа и все реагенты, необходимые для проведения К0ТЕМ®, включая заказные разбавители, были обеспечены в центры из головного центра, чтобы гарантировать согласованный метод и набор реагентов единообразно для всех центров, участвующих в этом поисковом исследовании. Кроме того, местные операторы в каждом центре участвовали в практическом обучении, обеспеченном головным центром. Восемь тестов провели для каждого уровня концентрации в головном центре и в целом 35 тестов на уровень концентрации РУП провели в 14 клинических центрах.

Результаты показаны на фиг. 12. Не обнаружено существенных отличий между результатами головного центра и общих результатов для каждой концентрации РУП.

Выводы.

Стандартизация К0ТЕМ® по всем центрам на основе глобального клинического испытания возможна путем обеспечения детальных процедур, практических тренингов и одинаковых реагентов в каждом центе.

Контроли К0ТК0Ь N и замороженной плазмы могут использоваться вместо свежей цельной крови для верификации инструментов и выполнения анализов в каждом центре.

Нормализация результатов цельной крови против стандартов плазмы в качестве метода для усовершенствования сравнимости клинических результатов, несмотря на то, что полезна, может не потребоваться с этим уровнем процедурной стандартизации. Даже если не требуется, стандарты замороженной плазмы могут использоваться для "нормализации" результатов цельной крови, вызванных, например, центр/инструментальными отличиями.

Принимая во внимание тот факт, что преаналитические переменные для сбора крови также минимизированы в стандартизированной процедуре, то основные различия в субъектных параметрах К0ТЕМ® будут важным индикатором их гемостатического потенциала, а не простым расхождением анализа между индивидуальными тестируемыми центрами.

Пример 4. Оценка межцентровых расхождений анализа К0ТЕМ®.

Одностадийный анализ коагулирующей активности является стандартным методом для оценки ίη νίνο активности продуктов, заменяющих фактор свертывания при лечении гемофилии. Общий анализ гемостаза, такой как ротационная тромбоэластометрия (К0ТЕМ®), обеспечивает дополнительную информацию о ίη νίνο функции продукта РУП, так как этот анализ цельной крови задуман для того, чтобы более тщательно отображать ίη νίνο коагуляцию. Однако К0ТЕМ® обычно нельзя использовать при лечении гемофилии, в основном из-за недостатка стандартизации анализа.

Эффективность стандартизированной процедуры К0ТЕМ® на основе фазы 3 клинического испытания Рс-слитого белка фактора свертывания УП длительного действия (гРУПРс).

Промежуточный анализ провели на данных ОС, собранных из 10 клинических центров. Каждый центр провел пакет анализов, используя контроли замороженной плазмы с разными уровнями концентрации лекарственного продукта РУП. Среди 4 оцененных параметров К0ТЕМ® (СТ, СРК, МСЕ и угол α), СТ и МСЕ были наиболее воспроизводимыми с относительно небольшими расхождениями среди всех центров, варьируя от 10 до 18% по уровням концентрации. Модель со смешанными эффектами использовали для данных общего ОС К0ТЕМ® (итоговая переменная) с 'центрами' и 'уровнями концентрации плазмы РУП' в качестве ковариантов. Центр не обладал статистически значимым действием на время свертывания. Как ожидалось, повышение уровня концентрации РУП демонстрировало значительное снижение времени свертывания (р<0,05). Для дополнительной проверки подхода стандартизации при контролировании межцентровых расхождений данных К0ТЕМ® также оценивали два параметра - оператор и инструмент. Сравнение результатов, полученных из 10 клинических центров, с анализом реплик из одного центра (8 прогонов для каждого уровня РУП проводили в головном центре с помощью одного оператора на 4 инструментах модели ЭеЬа) выявило эквивалентную вариабельность с АN0VА в целом, р-значение 0,69 для СТ (учет корреляции между данными К0ТЕМ® и уровнем РУП) и похожую срав- 42 028914

нимость для СРК, МСЕ и угла α. Мы пришли к выводу, что межцентровая вариабельность не является существенным фактором в исследовании КОТЕМ®. Принимая во внимание тот факт, что преаналитические переменные для сбора крови также минимизированы в стандартизированной процедуре, то основные различия в субъектных параметрах КОТЕМ® будут важным индикатором их гемостатического потенциала, а не простым расхождением анализа между индивидуальными тестируемыми центрами.

Пример 5. Сравнительная оценка экспериментальных исследований активности слитого белка рекомбинантного фактора VШ-Ρс (^^^^ в образцах плазмы из клинических гемостазных лабораторий.

Плазму с врожденной гемофилией с недетектируемой активностью РУШ обогащали Α^УΑТЕ® или гРМШРс при номинальных концентрациях 0,05, 0,2 или 0,8 МЕ/мл. Концентрации выбирали по этикеточной активности Α^УΑТЕ® и лекарственного продукта гРМШРс. Тридцать участвующих клинических гемостазных лабораторий в 7 странах получили по 3 набора скрытых образцов для тестирования на 3 отдельных дня с использованием их рутинных анализов для измерения активности ΡVШ. Каждая лаборатория также проводила тестирование РШП с помощью хромогенного субстрата на дополнительном наборе образцов. Результаты анализировали по поводу межлабораторных расхождений и любых статистически значимых корреляций с конкретными аналитическими реагентами, стандартами, инструментарием или методологией. На фиг. 13 показана таблица реагентов для одностадийного анализа и решающие шаги в методологии, примененной 30 участвующими лабораториями.

При 0,8 МЕ/мл среднее восстановление путем одностадийного анализа коагулирующей активности в 30 клинических лабораториях (90 тест-результатов на уровень дозы) составляло от 95 до 100% от ожидаемого для Α^УΑТЕ® и гРМШРс (фиг. 14). При 0,2 МЕ/мл средний результат одностадийного анализа был приблизительно на 10% выше, чем ожидаемый для обоих продуктов. Эта относительная переоценка активности РЮП повышалась до 20% при уровне 0,05 МЕ/мл.

Межлабораторные СУк для одностадийного анализа (п=3 независимых теста на уровень) обычно были ниже 10% (фиг. 14). Суммарное эксплуатационное испытание было сравнимо с Айуа1е® и гРМШРс. Межлабораторный СУ (сравнивая средние результаты из каждой лаборатории) колебался от 10 до 16% при 0,8 МЕ/мл и до выше 30% при 0,05 МЕ/мл (фиг. 14) с некоторыми лабораториями, сообщающими более 2-кратное повышение или снижение результатов, сравненных с консенсусом (фиг. 14).

Приближенно нормальное распределение результатов наблюдалось для обоих продуктов для каждого уровня. Критерий нормальности (Р'АдокРпо & Реагкоп, а=0,05) пригоден для Α^УΑТЕ® при 0,8 и 0,2 МЕ/мл, а для гРМШРс при 0,05 МЕ/мл. Лаборатории, которые отклонялись выше (или ниже) для АЭУΑТЕ®, также сообщали результаты, соответственно выше (или ниже) чем ожидалось для гРМШРс. Эта корреляция была особенно существенной при уровне 0,05-МЕ/мл (Р<0,05). Относительная ошибка в предполагаемой активности ΡVШ не коррелировала с любыми очевидными отличиями в процедуре или реактивах (фиг. 13).

Одиннадцать лабораторий проводили тестирования с помощью хромогенного субстрата. Среднее восстановление с помощью хромогенной активности ΡVШ составило 107±5% от указанной на этикетке активности для Α^УΑТЕ® по 3 концентрациям. Для гРМШРс восстановление с помощью хромогенной активности составило 124±8% (фиг. 15).

Межлабораторные СУк были в основном ниже для хромогенного анализа, чем для одностадийного анализа, но межлабораторные СУк были сравнимы для 2 анализов. Лучшее линейное дозирование наблюдалось для хромогенного анализа, чем для одностадийного анализа коагулирующей активности с неочевидной переоценкой при низких уровнях ΡVШ путем хромогенного анализа. Соотношение хромогенной активности и одностадийной активности было несколько выше для гРМШРс (диапазон 1,04-1,26) по сравнению с Α^УΑТЕ® (диапазон 0,86-1,12), что возможно из-за природы гРМШРс с удаленным Вдоменом (фиг. 16).

Сходимость и точность были сравнимы для гРМШРс и Α^УΑТЕ® с использованием одностадийного анализа коагулирующей активности или тестирования с помощью хромогенного субстрата в 30 и 11 клинических гемостазных лабораториях соответственно. При низких уровнях Α^УΑТЕ® или гРМШРс большинство лабораторий переоценивало активность в одностадийном анализе коагулирующей активности против контрольного стандарта плазмы. Соотношение хромогенной и одностадийной активности зависело от уровня фактора из-за переоценки одностадийной активности при низких уровнях ΡVШ. Результаты экспериментальных исследований показали, что гРМШРс можно мониторить сообразно в клинических гемостазных лабораториях.

Последовательность таблиц.

Последовательность табл. 1. Полинуклеотидные последовательности: ИХ-Рс.

А. ΡVШΡс с удаленным В-доменом.

Последовательность цепи ДНК ΡVШΡс с удаленным В-доменом (сигнальный пептид ΡVШ подчеркнутый. Область Рс выделена жирным) (8ЕЦ NО: 1, который кодирует 8ЕЦ NО: 2)

- 43 028914

«ΐ

«1

»

а«.

1-01

«1

10« . : Г у:

ΪΚ«31 «II И<1 , У 15« 1521 .-.у ГУ. 1801 у У «21 «« «ц 21« 2141 .Гг·. ‘ у.

'У

2«1 «е 2521 . -У »« 1 '-У 210 •у.

1·.

29«

1001

«о

ГУ 3181 у. · 3301 3341 .У. .

А ТОТЫНЙШ дСТСТССЖСС

‘ 1 ГЛ >.у" У «УУ ·

«ГУ N у,у „уу ,

у. --УЛТУТП Ό’-ΤΤ «Г'

7,· * «“" У - ¹ Τι У у _{ Г Д

«о- - у; г.ууу

,_т? . ~._{ιΤ л г}-_п .., _?__:г

«..«.У. Ум. ...· у 1 7УУ

«маис етшетее еаеекаа _ντ.„,_?τ,, _ίΤ„

ь -л Г-, . · « » ,,.г »^. ,

ТГ¹ ,· УАЗ 7 2 ТА?· ‘ГУ-/. Ί ” ТТТ677 «5

УЛУГ ’ «у Г У «УУ , . уу « гууу «У : > . » " ·

; уу ууууу ,»у»у ’дд „уу.. у .у<«.- «·

. ««»' у у « г

~« -- — У У ' Т . «Г Г..,; у.у., ту ,

У «У У -у. ..У УГУ > ««»„< . КУТТ» ‘.«Уд У ' 1АУУУУ .« . У « » к · -У «· У У каказео еестекеее .жеенша.

7Г/ГГГ.Г.” У 7ТАУА ”7 У ГС,“АТТ?,¹, ь . , ,« . У и

ОТАТААСМ СТВСССТСЙС ЕЕйД'ТСйСТЗ

Г»-,. Г .г Г .,.»»<» .У УУУ I, У.УГГ ;У,.«У?У.’.У',.'ГУ уу-т-уу к у ’УУ ·’, ,'Щ Г УУУУ «УУУАГУ . д 'У ί «Г ,л, ' "««

У » ту у уу. у ТУ А д т.,« г У Ж „У.:·· Λ · А Г.,У .Г.Г У .1« „У у АД·'.,,· ТУ, ‘ »» . уу,-;

' , Г . ..'.

ГГ ; «' : .У ДА уу «у » »” ΐ -; г , . г· у -у ГУ >;,

УСУ ГГУ-У-Т Τ7,»·4 , ч ууу , у « дд» ..

л ,у , „ - .у» у г ·’ -у у [' гу-- -у ; · .г уд» .» У-»·» ; гуу .к»г. «

[·--' ДУ·. ТЫДГЩД Д,; ί -у ·»? ГУ « у»к>». ууу ·

Г , -, , ,.г « дд ,у; < ι

УУ» «""«ГУ, У ТУ . у ;.г ι ι «у : · г -г ««

У д,₅ г -у ,у

етежтеее тетаемеа «зматеек ;у»У"« уу;

' УУ «У > «ДУГУ -.УГУ йтдсАйтант САТтюстт жашсиж етеатсста. стодааест ««>««« «У ЛГУ У Л ««.«лот·) ттесууу у.уу уду у уу ’ду ТЕЕАССТЙБТ МйАЖТТЙ ЖТСАЙЕСС йб&бтст@бс т&еашйй жкммжт ттЕАТвдше ЁААЖййттео· сжстсжйж • ; '««, Т у- 'У;' -у. у у

«уу ««««у еаетеетей. жекеаета мажезее

у , у, у уду -Д " •'УТКУ У у У У У ГУДУ У

’ΤΤ',ΓΓΓ УУУУ’ ТТ7УУУ7 У, -Т. - д.у ууу ; д?- ТУТ,; УГУ; к««Ж уууу; гуууг; «тк-у, ; -Уч б · « -«г: , .« У У

1- Г !У· УУ У У У ΤΊ Т А О У 7 ЛУ ТН УУУУ АТУ .У АТ Г Т ГУУ. 7 7 1 АГ·.··, г У У ·«.«.·· «У - У:

УТ с-_- Д-Т-;

... - ГУ .У У У......

овАмае». тсстсзекс екмссзет жеашетге деемсш ееесеюжй вюблмсеж еимтета бкалеюа «ежата евеетсма аашазу

.. _ -_Г._Г1^ . _г _ д

УГУ’.УУЧ Д, УГУУ т.ТГУ’УУ

иаелесаа «стайте аттстетет

ГУД ..-.У, Γ.Ϊ-Λ .‘.У· ί ' ‘У УУ" «У- · ч, . у _Ί ,·? у, у

дд. -гд-г·; ,,д|. . гддд д -дд д ;

тд .. . ’лд-; д ---- д, .ТСТСТС1ЖА СССЙ.ССЙЙТС яважвсс

7, .. - · .,ГГ-Г‘ , ? ' У т- ' ,

.у у .·. у : .-., ,мч? - у

««сайт тжиеска яескжас

У «"У АГУГУУ···’· «УУ ч- · , - · ,,· - У Г. Ч

•ид,··' ’ ' У д. У Г У - ’ У

-7Д--Г.Д- ·!-««”" ’ Д"-д, —

.ашеесжлее. жедажет азмашст

3181 33« У,-г 301 «21 «81 Э«1 »01 3461 4021 «81 «« «01 У. 4121 : у ’ «01 «о У. .

,; ^:

: ·; Ξ

<мх

.•У.

«я

«81

«О

5101

5141

5221

к: У У У

5403

.«г,

5521

««

5541

7УУ

Уд дд.' « у ·, ’ -У уд

СТЙДЙЕЙТЕЖ ЕТТТейСТЕС УЙЕОСЖЗВЕ .й®б®5с>етс жеетеуетт ееадсесттс г у··, гу.у .V ТУТУ. У дугу СЗЕЙЛАЙЕСТБ еТЙЕТТСЖСТ е&ЮМГЖТЕВ

1би««1« тссежттат межамт

Г.ДУА.У «' «ДУГ У У д; .; бовтвЕесме салтанадс жтселттсга,

,.«131« Ϊ д.’иУАУГГ. У .У У У!

УУУ У У ууу-.-уг

тжсвдетвБ датеежеж етттттетве

. У .Д". . 7 ,д.“, ., У,Т д-удтт

7 д.-д.д ддддд-л/дг д_Тд.-д

„ "17У УУ '.У, ί УРГУ

Г у: у г Г· <7 ГАУДУ 1У Г' ту; у · л: «у: гл.у от» г ««г«гг _ . _{ΙΊ ?;!}"Д Г._Л Д- _:ч ддд ГЛ ;уд -дт-д, У::·.,·.?,',,· У’ ··>·""'“««« У У У. У 1 уу:дд- у; У.» -441.177 г

,'Г.АТГ У Л ( А177.7 ТГ -7 ц дт - д ;

«наестсй жсттаестЕ: емвеама.

ГГУУУ1 « гсг. ДДСТС «Г7Т2Г «А гу.-.гту. .-ту у ·« ку···,·,; т

7«:,««« 7 Г УК ;«·..« = У ТУ ί ТК · лжжеаетс· еттежсжест еетв’гвжйст УУ.,- у«У Г-ί д. У-Г

асжАЛУК:

ТУУУУУ АСССТСАСТС ТТССТСТТСС сссзвдсеес тбасвтсаса тссстззтзз а;ут:аа: ;т:; ί ;тдс:??пи ;аг: г;г:сд ;т: ;а; д АведатжсАА сжвсдсстдс ССТСТ5ВТСА "ЗААТСХКАА ОЙАЗТАСААЗ ТЗСААЗЗТСТ АААУАТД1Д САААБССААА «У-КУСС УС353А73А еСТСДССААС ААССАЗЗТСА УЛУГУЛТ СЙССПТбЙАП ТЙЙЙАЯАЗСА УУУУУ' СТТОСАСТСС ГЖ’ШСТССТ АСАБСАОЗТЗ ССАССАСССС ААССТСТ7СТ АУЛЕТАСАГ: (УАСЛАСАЕХ: СТСТГУТСТ

тттевммт еежемжм мисмееа

ГУЛУ 7 К” Г 7 КУ У · 'У.ГУЖ ,

КУ' К- У УУ-· 77

7, К'"- У :»·., «.? : ГУ' ·..· ГУ

Г.УГГ «· У«Д’ ” - гл-,-."Д"

«сесттсса стаже» евсясии,

А » > -,4.-7 УЖУ КГРГГ‘7·· л ттсйтттсдв тееаоюете ттежстетае

Л.'УК 7; Г.,, у Λ,-.д д: ГГК',.71, АГ Л укд ДУГУ уу.;,··<·

тбшаеелл тажетдтсае дстсеествд

ДУГ Д 7 у - .Д'д; Т УдУУ ЧД.ДДДА·, д. .«· ГУ»

К '7 ! ,.,Γ.Τ .ГТУТТУ »7««« , _ТЛ,._Д1;!,.,_П. дддпддд; УУГГ, «У АУТ ГГ ГУ 7 «АУ/Г Т1 ЖАТ» «г У Д'. АД». Г «7 ГАДУ Г »7,4 Г УГУ -Г. , 7 7 У 7·« У УК' 1»«.,·· г.дддгтг-; .·,·»-.;. Г.·/,:· .»·, у-ду’ 777-"»· .Г? «»« УУУ

атжмессте вжаестсае етаимтс жтьтеаж жтсйсдБеж втижЕтяете .« г га. у т тк». "у » гу : - жемзгебсж κϊμμιτϊ тиежежж стстжежссс деоеетдете жетсестжс ЮЯ6СССТ 6*65116616 611СТ606С1 А6АСАТ.»6С АСГЙТЮТА 0СТС6Л6АА6 ОТХААААСС СААГХАСАСС СТЕАТВАТЕТ Т66АССТЕАС ССАССААСАС ССТСАССТСА Ί’ί Й ;атаагся; едлг;αι:аааг; ; ;,;суд х;д.·м зсетсстсАС сстсстесдс сазоастжк ЕСААСАААЗС ССТСССЛЗСС СССА.ТС6А6А ВАВААССАЕА ОТГСТАСАСС СТЕЕГСССАТ ЗСС78АССТ5 ССТС8ТСААА 6ССТТСТАТС АТ60Й1-.А6СГ: 0ПА0ЖА6ААС ТА6АА6Л66Л ТСТ'ГССТСТА сАгл’Алсете ассжссаса ЕА7ССТССВТ САТССАТСАС ВСТСТВСАСА 1ТСР000ТАЖ А

(ϋ) последовательность ДНК Рс (сигнальный пептид мышиного подчеркнут) (δΕρ ГО NО: 3, которая кодирует δΕρ ГО NО: 4).

- 44 028914

»81

а.о«

мм

ю

л

12Ц

81«

«01

8521

»11

• «

' ·: ««ОТ « (««ЛОМСЛ С«гЛ)«МММ

«661 5в61£»а

Т"- Л»? МТ «/•ЛЛЛЧАЛн СТЛАЗЮЮи

1ΑΜΜ.»

ААА-Л" ОТ. 000156161 :' :» т«

·'«<·.

0750010. Л' О «Я??

Бсосаесдсс

1СХСССТСИ

яяомжст»

ООМСОМ!

теасаеи.

«ОСЛА ЛЮТ « (< л,Г! «λΜοο-μύ АСЯАСТЯая А· ;» моя· иаеестст

151ЙСЯЗЗЕ

Μ.ΌΌ

'«ТО» ЭТТ-” «ж· АЛ АТ. ««« >.Г .'5АЛААА’" ' -· ЯММ' ОМ «мял л САССА0500Т ОООЯММ'

бгасвксвс

««.« -! у ,Ч· -о «>?« МО55ОЯ0

ГА? 7-.Я»0О~

,««,,«« - Т«М «АЛ ОГОКМ»

"

_;гл? „„„

.«ЮООЯА

ТЕВсбсма

С10ТСИС0Т "А ««]»«' теойовжет

Л «Я,-0.,7:)7

А ««>.:« лл ««««>·

5 : МмЯЯ ? Я •_ГЮ »«« аскобйоее лзеееиеж л м«;

«ОТОМОЯС/

СТТСССССС1

ееветеас

ооот

•за: «о μι ;м«ом О Л"¹'¹" МОЯ о: ян.. ж ?;';·· 2 «ж ’ ГА '77'ГТ мм моя ' ожж

«« «ТАМ

В. Непроцессированный ΡVШΡс

(ΐ) Последовательность ДНК непроцессированного ΡVШΡс (сигнальный пептид ΡVШ подчеркнут. Область Рс выделена жирным) (8Ε^ ГО N0: 5, которая кодирует 8Ε^ ГО N0: 6)

О.ЛЛТ.МЯМ' ?«« МОЯ

е«
721	7 Т'ГОТГТОТЛ	ТЛ0СТТТТЯ7
«1	ЯЛТЯЛАЯ?- Т",	ТМВ'&МЯ? т
8«	АМТОЛМЯТ	юетбсс»
901	•р-тлгл- ;?·;	ежттасее
Л-' .	вВСТСТССТЙ	ЙВТСОТЖССЙ
1021	жсАтееет	ΪΜΜΜ'ΟΤΤΒ
10Я1	««К-МИТ	мд «мят-;
; .	•-«'ТАММА Я1‘«А«·.«'.?>
: н :	1'^.;· ?»?-«:	Т6ССТ11ССТ
1261	Т1С.Ю5ССТС	А^ч лчачгл
1321	... ««.:-« М	ΑΛΑ.ΜΜΤΤΑ
1381	етаежа аммстсст
т ,	ТЙВВЙТЙСВС	ЯЛ,-.СТ-«ААТВ
1301	' «“.-7?·.Α?ΑΓ·?Α	еТС»ТТ66С
1561	М Т««: и,.	ббтаасат
. .	; л - яятя-лж	77' . ?7Я« ,
»81	О·?:»»»??::	глт'м: я?л
17«	, ....	ссссастас
1801	тсяастат	тстежжтее
18«	ссаматсес	10,61160»
1521	лам?-.-'-вял	тееевстие
1«1	Ж&мметб	в&самддес
'·		• ..««.«мл
аз οι	-ч «л:-?? ГА	« ?·.·.,.4
21«1	ίΜΒΜΑΜ. ' А	«МАЯ. Я Я 1
2221	.?«?,-: члм	« -·«/ « · 0
2281	лажллмм	я голям»
23«	«-««Μ-ТА Г	ТА. 7>М,чМГ
2101	.. ..„,..,,,.,..	? ‘-л’.-.
21<1	.·..· ,. -. ·,.	етсмсстбт
2321	вАЯМСЖ	=«- ММ”
2581	жесюсжс	«б&тесйсж
2«1	ттдетгазсм	е&ббтебсж
2001	ттсвзкттс	: ' ,
2761	ОСТЙТТСОСЙ	ТТСТСЙВБЙВ
3821	1 7-.-ЧЧГ.-	«.> АЯ.М ЯЛ
2881		» «?.««:«;
2«1	ΜΊΜ'ΤΓΑΊΤ
»01	116С1С1166	«««ЯМ·.- Г
3061	мозеттае	тттеоюсй
3121	итеттеатБ	стсттесеас
»81	; ·μλα--««	тмежаетт
ЗМ1	м мятм-лт	·?ч?-ч,л л ЯЛ
3501	ΐ яя-'я.««?-.	Я ,·λ:Α. '. «
»61	-тмя.	ийсттая
«21	«- ««««АЛ	жтттеесйв
«81	7' «ЯЛ'ТЛАТ	ТВТЕММТС
35«	11С1616ТСТ	лом м :·=«·
3601	Я'^ГЯАЯЯТ-«'Я	АТЕЖЙ.ТВ6СС
Э«1	тде»66т»	«МАДАМА

1-..77. ΊΜ»

ЖВНЖМД0

ЛАТС77Т7АА

- »

ΙΟβΚΙΪΟ,

АТОЕЙОСЙБ

А. Я.·’? О . ... ««««

ТАММОМ

«<««««

таме&беж

ВТТДКЗЯШЬ

а .ям

ТТСТВЗК516 ’ л ,-ю? .·« жсиеибе

ОМОТМММЯ

АТГТЛЛТ- Я”,

'.Α М? 7Л · стсосттжвт ля «м ««««?"? АЯЛ л'ЛОА?; 0-, я?.’.ЛТП". « м.ояггмм, ОО.МММ тмттмтм

л·,'.·,

ТТТСВЗТ&ТТ

< пт ..«' ; ·

ΜΌΌ7

.7' Т. ЯМ ЯМ.Г

« Л ¹ ·<ядястмятт

к МТ АЗ ЛАЯ

6181111111

СПЖТВййСС

• ТАЯТ :"-'Л А"

6ЖС1001Ю

АЕДБТССТАС

ТТТСФбМ'а

ЯСМЛМОМ

ЯЯ.М’.ЧЯОАМ

1 .ЛОЯАЛТТТА

а.л;г?.""..··

μόαοο ’

Г .Μ'Ό · ЯМ'ООЯТТ? г АЛО? ·: Т к

Мб

.тавтвссасс

ОЯТОЮТ

мтсжсасе л- ,> мм ББТТТИВВТ тбстеттеет

« V.

детеетемА

стстсибте

;Хпг:_Аа<лп? 7„ 7. --.7: алл» И л л л СЙЕЕТСТОТЕ «лм ж . емссмсес еттевднае •ЛМЗО.МЯЯ ззааежье» БТТТЕЖТВИ ОМ Я. л : АТ·: МОЛОЛ : мл? мя? швиессмт

ма ' л"··?·.

мг .·?. мят

еакгитееж

тееессАЬЕт

жйшот

21? ‘ ДГ._А

темвкеаж

«бвееыз

сатеттттт

Г' »..МОЛ 1 О?л ««

сиЕтсеато

аемзесже

061й61С1@Т

ввемвсетс

«мм

есстими.

Я'Л? М..М,

тссмежест

«,а Я··'? Л-Л· X ЯАЯТААЮЯЛ, ΪΜ1ΜΜ1. «МЯМЛЯМ? : ‘..'"Я’Я'тт тваенмт жееЕЕжакй Т66ВССТ6СТ

маяватаст

Г,Ял “ТС,Я Л 7 Я

иаетсете!

2 ИЛЯВЯЛЯ ? асйвтаотс* втместжя

ОЯОАА.САТЗ ляляяг лот ;

ЯСС1661»

61161166а

ееметеете

осйЕотстаа

жтестбмизМММ м; ст.тдаеадт гяталяяя) ··. «мот ВАС АМТА! А ,;л Алл евтасйЕйв ждали® я ' М.Ж я -;я·· я гмО I ВТ’, :.я Г -ЯМ О МОЛА ? жксавдлс < «л -:гя ' еелаееаж . СМ ЯН Ю

ояежзбис

>: я .»»»

бтстаое»!

ООЙЯ1Я7М Я·’ А? Я’Гл :

тиами

ТСССЙЕЙЙТТ л ,> ОТ „.и. а юля

Я-.Л.ПЛлЛТЯЧ

0ЯЛМТ.Л0СЧЛ

’ Я-Л.,с,«.яя ΐ «тля..

Тл-ОТТЯООЯО ЛЧ”.'В-'.2,ЯГ ,П ?! -777-. дметатсст

о ля·, .ли; ЖевдсгшЗ ляп.яяяа.? ля яг? л-и л ттасастт» ЛЛАЯЯЛЛ'ЯГО мшавтстт •АД Г-76- Я. Л МЯЛЯЮ-Ю .· ;»:.· о·' оал ЛЯп ?.„»·ΗΑ -л/ я- --600-. ТТбЕАТЕССВ, Т6СДСТС1М I ЛЯЛЯ?· 7 Г"ТЯ·?? ОТ Л »6106616 жеетежтев "^т Г ’л” иестеетеж

ВТТЙТВЙЖА6»

ТГООТТЛА? ял;л?л,л-л л жаясаес тететтсаж

-?;· и !

стсеетесст

Όν«-..7:.6.

ЛАДХЛТЧН

.-. ; .. .-. .·

ялюлоялт стасисст 1С1С1СТС1С 7ГЛЛЯ ?._ЛМ ТЯЯЯОЛО Л? »Я'ί_:;λ?0Α'Я смвасяссс ЯМОМ».' л.-?л л я,;

Л 7" кк'-г :л чч Л »70 Я'Я. АТ а? гати ла яма т ГТ·;:?.,/.лоя.? СССС1МТ1Т ЛО."ТТ'"Л -07 ЖИСТИб! СЙЛЕЙВЙЕЙБ ДА ЗА ГО Я'<

- 45 028914

372:1 статтсд» бтиесатст сттаттда. южет асттссмта. аттсмеж «аз тззооооаоотем ноте ιιο .ом-оозотео'; оооо. о 38« · /..057.01. М'.ОО'О ОМΌ Ό 7.О55ОМ5 .-· ‘Ί Г70 ΙΟΟΟΟΟ

»01 /0.00; »«033« О,0,0.»1 «ООО «ЮТ»':» ОО-ООО:

',·:; ТТ757000 5АО7’.5.О5 ’Г»-'»!.» 0,535550·" /-,-^ггу_Т - ΟΟΌ.ΟΟ

3021 зооооо юлю о ;«7О«« .теоо те» оооо. , олоооо

3081 -/1...,,7 ;! «»«О 1 у 0200 »»Ю/ .,/"««» О’,50 <141 астатостта. вбйесйеййй атоизизев йввтсвеши ттсттвшств .йЕйжааси. ιζΰΐ .. т«?.1». > < ллзюте з.ооо то.·» -. > оззоо» т »те? ·?

420 ?.«Μ?-»"Ο зу-угг Т'МОО »»2 0 00540« -«ООО

1321 теззте-.зззз ззззтеоо, лаг-азао-о зззте.зтезз зоттаат·”: οιααααοϊ Ой а; тетео у/оою « шоюа.··. оотеоо

«« а, г.«» о.оооте теооою мотете»; мотете-ш »»за

4501 Α&ΤΤΤΙΜΕ5 тсеттмжге .й'Ттсдмайл тйвжсиае аййсйсасяй· стсйтттстс

«И .00--/-,,,:/.0..4/ .а «»«; «ООО.? О,Г« ,,·;

»21 155ΜΌΟ2Α «ОЗОМ» ίΟΑΟϊΟΟ 7ААОСЗАЕ/ О,«АОАТГ ΟΟΌΟΟ,

<631 ... О- - ........- ... .......- .......

«О 0,1000 о 00.0 .0,,.0 Л ООООЛ-О '-..ООО; 00.0/

4801 -ООЗООО «ΟΟ» »»1,070 ·»»Ο·».'32 «««» «ООО

»<1 ТО' Λ О «,-ΌΟ-Ο. ‘ОЮ -,--.0 ООО--,-О. „'.-„О,?,·..;' -ΓΌ,Ο'

4Я1 смкаие етмеяат яссюсвн иасстаа тмстаса ееяссия

4381 ΟΛ.Ό,-л· _7СТ~™_ГАТ. _Тт«уу-.~/ ккк.к,',Μ 'ίΌ-Ό

50« *еаа.&есабт сатттдтгас .вадеьедал мажжатас сттестттаа датастз&д

ЯО-1 »,зо »,»« Омо.ОМ ?«0«0«0»; -0,02:

5111 5Ο7»Ο57» ЗА».»/» 0300,007 ТМГГОО.ЗЗ Г»6А5ГКО 05.0,5077

о-- «оте/оооте 0...,-,00- 000 о,оо-о, о» оо:о«.о, О; А- -10/30/ /»001-00 /»000-0 >««« ^ООО” о·/-.’./»-" О., А- А 2 ООО 510««.»-. .“.00-10- 000 - Ол 0.0 .'О' ‘ О .0:1.1,.-0

;« „0.0,.,- О, О.,·.» 0-0,:« : ,О«< «« / «О» ««««О.

. Μ ΌΌΟ «-ГГОЗТО 05«»О ОООТ »/»«««' 00005»

^: 1 О — О ' ТО .» 0.00,, '-.»М О 0,0 / 070.,-. .000.2=.

0.0 ,-..0.5--0 0 .О-.З-О-З/ .0 2,,00' 3: /ООО 3.0 «« «ООО О

5641 ЮЗ.ТЖ35ВСТ ΘΛΙΒΕΕΤΞΪ Е0Т07СЙМА ССОМССЙЕТС ТТОЙЖЕВСС АТСАЙС055А

«Οί 0.1000 О .1 ОЗ·”’·· .0.10.30 3 50.0/.ЛЗГ2 О. «ТОО О. О»1.2 .’·'

это, жмы® мимбме мтявмжг тжатао емвимге аввсссссв

5821 10070, 5.03.3.0“/-·· »/5775777 75770700 370005" 717,-5000

5β|1 0050577 5200 -»<¹ 5ΤΟΌΌ.Ο АААОМЮ ОСОТОО ’ГЮОО

5141 О ОГО', 0.0 Ό- 01000' 000 70- ОО '"10,00

60.0,1 0300, 5505.0-20 00,0007 000 0747 «ААООО «377004

«Я 000003 ,,·.,«·»« «ЮЮ 70,00 000 ЛГОООО

«121 оо’/гооо: »5»,,о,о»«-· »«« :-/---/,./1 6-181 ОТ/ЗО 532007577 1770»»2 30.5" О»? 5700005 Ю 070

«О ООООО оооо» О1 ООО //.ото- 02,...0-.: «;«« о

ОИ о/ -о«7‘ у/у/«ГО Г ууу« -/ «-««3« /«/«/-г: у·,/:-««/

»61 .ОООл 0-2 5,0,0.1 000002 1100.00 ГГЮА'.З 3 050.О

«21 О»,» 3.0,0 «ООО».»·. О ЮОО> ООО 000 000

«81 :0-00 »ЮО» «ООО./ 1/ΟΌΟΟΟΑΟ. ГООЗО-О «41 22 05 ; ООО.0,0 0000.03 000 003 ЮО=О ,ЮЗЗ.З

«01 ,,,5.1.3--./-/0 у Г; ООО ЮОДОО («ООО «О «О

«« -швешхвв лтвесастнт жжстста». тссаевтетт тттежжже тБоажиетт «21 А -А1-/А5А /=0/..452171 >» «ООО ΑΖ /<030 -МОЗ/.О,. ОАГОО

ОО .,0,.00 -/«'О »/ ООО» -.1 ООО·.,, 20 ООг» ООО. О

1,0 ΙΟ5151ΌΤ 5&5ООТ7 0377300 ОЗОЗОА 7АТЮ>О57 0000555

«-» -Ο·»-; оу. л ’»» ·->' 00.0’ ΟΟΟΌ5 3 7,/ОЗ 2 ,у:«- «И ТИЖЙ1СЙЛБ 6ТЕЕЙТСТЕТ ТВЕСйОСйМ ЕЙТТМТПМ Е6СЙТСЙЙЕЙ. СССЙЕееТЕС «^:2з ссдтслб&йб ттстсе&есс тстадтстс тевдтттатс жгда-етата. етстжибб "О, :-0:.-,.0.0 ,,,,,/· у р/ о=о о р · ог«»уу.»;» «юо

« :-««,«« уу-уу «у з„п ; τ '««««ο ««/-«

У - ' Ό75Ο- /«.ЗОЮ 3750077· 1 ’ 500ОТТ ООО-»» ОТ»/»,

061

1321

1181

1-1

»11

тем

ОО

1361

тем

7441

30«

ММ

мм

5.0

8281

»«

зимам мябемса тесомтеве

СЙТ1Й0ТБСТ ТСЛТССТВЕТ ТТ1ССМЖЙТ

ОТТОО · ОАА-ОчОА 0.0.007

0.0.00; 03 О-.ОО .ЮО.ОО'-.

ЙТСТСЯЗСТТ АССЖеСЙТВТ .ЖТЕТЕЙДБЕВ , ._ι;Γ?„,_:τ ,._т„.,„_т??тг, у уу-у-.у,,

сткжясст бтеетезлет стстнжсс

СССОСЙЕЖПТ Т555Т5САСС .ВйАТТеСССТ

1 О · САСААААСТС АСАСАТСССС АООММЖ: ттсстсттсс спсгаааагу: Т2А&ЗТСАСА тссетсстее тссасзтзао ΞΤΑ23Τ30ΑΖ 35С5Т35А0С Т5САТААТЗС ЗАОАЮТАГ; СИТЙТОбТСА СССТССТСАС МАМ-АОААС ТССАкОСТСТ ΟΑΑΕΑΑΑ» САААЖ12ААА ССЙСАСЕССС ЙАСЛАЕГАСА ОМАОААЗ ААЮАБОТСА «СТ/МОМ СЙССЗТЗСАС ТС55АСАССА АТССССАЗСС ЗТТЗЗАСТСС САССССТССТ ТСТТССТСТА МАГОМО» ААССТСТТСТ САТСЖСПТ

45 3 »0 о г ОАО о о - ОО О>- «О БТТТЕССВСС ТЕЕТСТССТТ СйЖвВСТЕЕ

Μ/'-ι 2СЗ/ -.,100000 0.0/1.50/ 0-1«.:. .о.··/о» : о,00:· /о :.ТТ/Г7С5ТС 70500577 55Ο72ΌО ОО-ЛОТ П ТОЮ 1 ОО .-.,,--0/

ассетисте Аетеесасс етсвймгаа о оо ю/ отту-от те г- λ' о о АСССТССССА ССТСС.АСААС ТССТСССССС АЛА.«АВАВС ΙΤεΊΑΤΓΑΤΙΤ ССС(2С,АССС(; ССАССААСАС ССТСАСВТСА АСТТСААСТС САА5АСАААС СОЗССОСАСС- АЗСАЕТАСАА гтетсстсд АС САСОЛОТССС тпаатсйсаа ССТСССАССС СГХДТССАЕА 5ДАГ«А»-РС ЯСТЙТАСАСС СТССССССАТ СССЙСЙАТСА /МММСААА ΐΛ«Ι"ΐνΐ·Αΐ·.; ССАООА6А7 ССАСААСААС ТАСААСАССА. СЙССТССССТ САССААССТС АСССТССАСА ДЙАЙСАЙЙТа •ТАТЙСАТЙАЙ ССТСТССАС.А. ЛСОаМбСАС

;уу '««ООО уууу-уу -ууузтзз *

С. (ι) Последовательность ДНК тяжелой цепи (НС)-Рс (нету линкера между НС и Рс) (сигнальный пептид подчеркнут, область Рс выделена жирным) (8ЕР ГО N0: 7, которая кодирует 8ЕР ГО N0: 8)

- 46 028914

¹ МЖАААТАЗ Аастстссдс стгхт'усттт жзтахттт Ч'ЖЯМ'ТСТЗ СТТТАПТССС 61 АССАЗААЗАТ АСТАССТЗСЙ ТаТАЗТЗЙАА^ТЗТСАТЙЙЙ АСТАТАТЙСА ААЙТЙАТСТС -' ? . цеижспх схожие аадаттют пстасастос саааатсттт -гссаттсаас 131 АССТСАЗТС5 ТЗТАСААААА ЗАСТС73777 ЗТАЗЙАТТСА ССЗАТСАССТ ТТТСААСАТС 241 ЗСТААЗССАА ЗЗССАСССТЗ ЗАТСОЙТСТЗ СТАЗЗТССТА ССАТССАЗЗС ТЙАОЙТТТАТ 10'. ЬАТАСАГД-’.Л.; Тим-ГАСАСТ ‘РААЦААСАТД ЗЦТТЦССАТС СТСТСАСТСГ 'ГСАФОСГЦМ¹3€1 'ЗЗТЗТАТССТ АСТССАААЗС ТТСТЗАЗЗЗА ЗС7СААТАТС АТСА7СА0АС САЗТСАААСЗ 421 -ЗАЙЛЛАЗААЙ АТСАТАЛЛЙТ СТ^ЖСТ ЯЯААЗЙЙАТА САТАТСТСТЙ ЙСЛвЙТССТС 4Н ; АААСАЙААТЙ ЙТССААТСНС СЧ'СТЗАСССА СТйТЖСТТА ССТАС’ГСА'ГА ТСТТТСГСАТ Ϊ41 =5Т35АССТ35 ТААААСАСТТ СААТТСА35С СТГАТТ6САЗ СССТАСТА37 АТЗТАЗАЗАА 601 ЙЗЗАЯТПТЗЯ ССААЙЗАААА ЙАСАПАЗАПП Т7ЯСАЙААА7 ТТАТАСТАСТ ТТТТЙСТЙТА 661 ТТТЭАТСААЗ ΒΰΑΑΑΑΟΤΤϋ ЯСАЖЖАА АСАААПААЖ ССТТСДТДСА СЬМ'АССНАТ 721 -ЗСТ-ЙСАТСТЙ СТСЗЗЗССТЗ СССТААААТЗ САСАСАЗТСА АТССТТАТСТ АААСАССТСТ 701 ГТЗГГАС,ΠΤΩ ТГАТТСОАТС СГА£АЙЯААА ТПАЙТСТАТТ СЙГ.АТЙТЙАТ ТССЛАТЙГ.СС 3«. КХАЖОТ АА376САСТС ААТАТ7СЗ?С ЗАА66ТСАСА САТТТСТТЗТ ЗАЗЗААССАТ 901 СЗССАЗЗСЗТ ССТТЗЗАААТ СТСЗССААТА АСТТТССТТА СТЗСТСАААС АСТСТТЗАТС 961 ЭАССТТЗЖ! АЗТТТЙТЛСТ ЙТТТТЗТПАТ АТЖТТеСС: АЙСААСАТПА ТЙЙСАТЙЙАА 1021 ЯСТ7АТ27СА ААСТАЙАСАЙ СТЙТССАЙАЯ ЙААССССААС ТА.ССА.АТСАА АААТААТЙАА 10ίίί ЙАА2СЗЙЛАЗ ЛСТА73АТЙА ТЙАТС7ТАС7 ЙАТТСТЙААА ТССАТЗТСЗТ САЙЯТТТСАТ ..4ί слт:.;а;:аа::т еж:е:·ΐ··ι·ί.:ε;τ·ι· ·ι·Α·ι:.::ΐΑΑΑ·ί·Ί· щϊ::т>:анттз щшдсаанса тгстааааст 1201 ТЗЗЗТАСА7Т АСАТТССТСС ТЗААЗАСЗАЗ ЗАС7ССЗАСТ АТЗСТСССТТ АЗТССТСССС 1261 СССЗАТЗАСА ЗААЙТТАТАА ААЙТ2АА7А7 77ЙААСААТЙ ССССТСАЙСС ЗАТТСЙТАЙЙ :3?) ААЗТАСАААА ААЗТСССАТТ ТАТЖСАТАС АСАЙАТСААА ССТТТААЗАС ТССТСААЗСТ 1391 АТТСАЙСА7Й АА7САЙЙААТ СТТЙ53АССТ 77АС77ТАТС С6СААЙТТ36 АЙАСАСАСТС 1441 ТТГЛТТАТАТ ТТААПААТСА АЙСЛЛНГАЙА ППАТ АТЛАСА ТСТАЙССТСА СЙЙЛА.ТСАЙТ ..501 :,ατι;τ::..;ι;τι: цтттзтаттс аажазатта Жаааажтз таааасаттт зааззагттт 11=41 СЗААТТСТЗС САЗСАЗАААТ АТТЗАААТАТ ААА735АСАЗ ТЗАСТСТАЗА АЗАТСС2ССА 1621 АСТАААТПАЗ АТССТСЙЙТП ЖТПАСЖЖ ТАТТАСТСТА СТТТССТТАА ТАТЙСАСАЯА 5 «31 ·5ΑΤ37Α^7Τ САСЗАСТПАТ ТСЖЖТЖ? СТСАТСТЗСТ АСАААЗААТС ТЗТАСАТСДА 1741 А;5АГ,;9АААСЙ АЯАТААТПТС АЙАСААЗАЗЯ ААТПТСАТСС ТЙТТТТСТЙТ АТТТЙАТ6АЙ ,301 ААЗСЗААЖ? ЗД'ГАССТСАС АЗАЗААТАТА СААСЖТЧ'ТС ТССССААТСС АЗСТЗЗАЗТС 1461 ПАйСТТЙАйй АТССАПАСТТ ЙСААЙСПТПС ААГ.АТСАТйС АСАйСАТСАА ТййСТЛТйТТ - а? 8 ТТТЗАТДЦ'Л· ТЗСАЗТТЗТС АЗТТТЗТТТЗ САТЗАСЗТЗЗ САТАСТСЗТА саттстаасс 1991 АТТЗЗАЗСАС АЗАСТСАС7Т ССТТ7С73ТС ТТСТТСТСТС САТАТАССТТ САААСАСААА 20<1 АТЗЙТ2ТА7Й АА.ЙАСЛСАСТ САССС7А7ТС ССАТТСТСЛС ЙАЙАААСТСТ СТТСАТЙТСЙ 5.0! АТ31А.АААСС САЗЗТСТАТЗ ЙАГГЖЖЖ ТЗГХАСААСТ СДЗАСТТТСЗ СДДГАЗАЗЗС 2161 АТЗАССЗССТ ТАСТЙААЙСТ ТТСТАЗТТЙТ ЗАСААЙААСА СТСЙТЙАТТА ТТАСЙАЖАС 222 2 АЙТТАТЯААЯ АТАТТТСАЙС АТАСТТ.гСТЙ АЗТЛАЛЛАСА АТ)лССАТТЙА АССААЙАЙАС 5581 АЛААСТГЖ* САТССССАСС СТЗСССАЗСТ ССАСААСТСС ТСЗССЗЗАСС ГДСАОТСТТС 2341 СТСТТССССС СААААСССАА ЙСАСАСССТС АТЗАТСТССС ЙЙАССССТСА СЙТСАСАТЙС 2401 :;т:‘«гж'.:жс асйт«ум'.сса пг.аа,запнг:т пайптсаайт тсаастг/:та ·ужхжййс 2461 ЗТЗЗАЗЗТЗС АТААТСССАА ЗАСАААЗСЗЗ СЗЗСАСЗАЗС АЗТАСААСАЗ САСЗТАССЗТ 2522 ЗТЗЗТСАЗСЗ ТССТСАССЗТ ССТ5САССАЗ ЗАСТЗЗСТЗА АТЗССА&ЗЗА СТАСААЗТЙС 5591 АЛЙЙТСТССА АЙАААЙСССТ СССАЙСПССС ЛТЙСАЙАААА ССАТСТССАА АСССАААЙСС 564 1 САЖЖСЗАЗ ААССАСАОСТ СТАСАССЖЗ СССССАТССС ЗССАТСАЗСТ ЗАССААЗААС 2701 САЗЗТСАЗСС 73АССТ0ССТ ЗЗТСАААЗЗС ТТСТАТСССА ЗСЙАСКТСЙС СЗТййАЗТСй 576 5 ЗАЗАЗСААТЗ ЖЗАЗЗСЗЗА СААЗААС7АС ААЗАССАЖС СТШХ'ГНП· ДДАСТССДАС 2321 ЗЗС7ССТТС7 ТССТСТАСАС СААЗСТЗАСЗ ЗТЗСАСААСА ССАССТСССА ССАССЗСААС 2991 ОТСТТЗТСАТ ЗСТСССТЗАТ ЗСАТЗАЗЗСТ ЗТЗСАСААСС АСТАСАСЗСА СААЗАЙССТС 2941 ТССПТЙТЖ СЙЖТААЛ

С. (ϋ) Последовательность ДНК тяжелой цепи (НС)-Рс (5-аминокислотный линкер между НС и Рс) (сигнальный пептид подчеркнут, область Рс выделена жирным, 5-аминокислотный линкер подчеркнут дважды) (8Ер ΙΌ ΝΟ: 9, которая кодирует 8Ер ΙΌ ΝΟ: 10)

* ЛТЗПАААТЙЙ АПСТСТиС&С СТОПТТПТТТ СтаТ1^С777 ^1-ЙАТТСТ^ СТТТАЙТССС 41 АССАЗАЛОАТ АДТАССТСТО ТССАУТЗЗАА СТЗ^САТВДЗ АСТАТАТГХА ААНТНАТСТС 121 ЗЗТ5АЗСТЗС СТ6760АСЗС ААЗАТТТССТ ССТАЗАЗТЗС СААААТСТТТ ТССКТТСААС 181 ЛППТПАЗТСЗ 73ТАГААААА ЙАПТСТЯТТТ ЯТАЙААТТсЛ СвЙАТСАСПТ ΪΤΤίΙΛΛί'.Μΐ 54. ЖТААЗЖАА ЖССАССС73 ЗА'ГЗ'ЖТЗГЗ СТАЖЖХТА ССАТССАЖС ТОАЖТТТАТ 301 ЗАТЛСЛЗТЗЗ 7САТТАСАСТ ТААЗААСАТЗ ЗСТТСССАТС СТЗТСАОТСТ ТСАТЗСТЗТТ 161 ЖТПТАТПНТ АПТПЙАААПС ТТСТПАЖПА ПСТПААТАТП АТПАТГАПАГ: САЙТСАААСЙ 421 ЗАЗАААЗААЗ АТЗАТАААбТ СТТСЗСТЗЗТ ЗЗААЗССАТА САТАТЗТСТС ЗСАЗОТССТС 491 АААЗАЗААТЗ 5ТССААТ63С СТС73АСССА С7373ССТТА ССТАСТСАТА ТСТТТСТСАТ 54". ПТЗЗАПСТЗЗ ТААААПАСТТ ЙААТТПАЯЯП СТПАТТЙЙАЗ СССТАСТАЗТ АТЙТАЙАЙАА 401 ЗЗЗАЗТСТЗЗ СЗААССЛААА САСАСАЗАСС 773САСАААТ ТТАТАСТАСТ ТТТТЗСТСТА 661 ΤΤΤ3Λ73ΑΑ3 ЗЗААААЗТТО ЗСАС7САЗАА АСАААЙААСТ ССТТСАТЗСА ЙЗАТАЗОЗАТ 75. :а'п:Т:: жохгхгж; жггаааат:; г.а;:аг:деж:а атиш-гатст ааага.;£;чч:т ‘'31 СТЗССАЗЗТС 73АТТССАТС ССАСАЗЗААА ТСАЗТСТАТТ ЗССАТЗТСАТ ТССААТССЗС 941 АС2АСТСС73 АА575САСТС ААТА77СС7С 5АА337САСА САТТТСТТЗТ ЙАЙСААССАТ 90; СГХХАЖХЖ¹ ЖТТССАААТ СТСЗССААТА АЖ'ТТСС'ГТА С'1'ЗСТСАААС АСТСТТЗА’ГЗ У61 ЗАССТТЗЗАС АЗТТТСТАСТ СТТТТЗТСАТ АТСТС7ТССС АССААСАТСА ТСССАТССАА 1021 5СТТАТЗТПА АЛЯТАЙАСАЙ СТПТЙЙАГ5АЙ ЯЛАССССААЙ ТАСЙААТЙАА ЛААТААТЙАА .091 ЭААЖХЦ.ААЗ АСТАТСАТСА ТЗАТСТТАЖ 3Α'!"Χ7ϋΑΑΑ ТССАТЗТГХТ САОП’ТГСАТ 1141 ЗАТЗАСААС7 С7ССТТССТТ ТАТССААА77 СЗСТСАСТТС ССААСААССА ТССТААААСТ 1201 ТЖЗТ&САТ? ЛПАТТЙСТСС ТЙАЛЙЛЗПАЙ СЛСТСХЙЛСТ АТСПТПССТТ АСТССТСССС 1561 ЖЖАТЗАЭА 5АДСТТАТАА ААЗЖААТАТ 773ААСАА73 ЖХСГСАЖЗ йАТТ^ГАте 1321 ААЗТАЗАААА ААЗТССЗАТТ ТАТЗЯСАТАС АСАЙАТЗААА ССТТТААСАС ТССТЙААССТ 1.191 АТТПА-КАТЙ ААТСАЗЙААТ СТТЙЗЗАПСТ 7ТАСТ7ТАТЙ ЯйвААСТТПЙ АйАСАСЛСТЙ '.4 41 ТЖАТТАТАГ 7'ГААСААТСА АССААССА.ЗА ССАТДТААСА ТС’ГАССС'ГСА ЖСАДТСАСГ 1501 ЗАТЗТССЗТС СТТТЗТАТТС ЛАЗЗАЗАТТЛ ССААЛАЙСТС ТААААСАТТТ ЙЛЛОЗАГ-ТГ 1561 ПГААТТНТЙГ: НАЙГЛЙАААТ АТТГАААТЛ? ААДТГкЖЛП ТЙАПТЙТАГЛ АЙАТПСЯССА 1621 АСТААА7САЗ АТССТСССТС ССТЗАСССЗС ТАТТАСТСТА СТТТССТТАА ТАТСЗАЙАЗА 1691. ЗАТСТАЖТТ ПАЙЙАОТСАТ ТЙЙПСПТЖ ЙТПАТСТЙСТ АСАААЙААТС ТЙТЛЙАТСАА

741 АОАЖ.АААСС АЗА7ААТЙ7С АСАСААЯАЖ ААТйТСАТСС 'ГЗ'П'ТТСТЦТ А’ГГГЙЛТЯМ;

1901 ААССЗААЗСТ ЗЗТАССТСАС АЗА5АА7АТА СААС5СТТТС ТССССААТСС АССТС-ЙАЙТЗ 1861 ПАЗГТТЙАЗЗ АТСГ.АЯАйТТ СС?Л-ЗССТПГ; ААГ2АТСАТЗС ЛГ.АЯСЛТСАА ТПЙСТАТЯ7Т

- 47 028914

1921 ТТТГАТАЯТТ ТОСАЯТТПТС АСТТТЗТТТЯ сатоапятяп сатастяйта гаттстаапс Л83 А'РТЮАЭСАГ; АЭЛСТСАСП’ ССТТТСТ^Тм ТТ^ТТСТСТС ЗАТАТАССТТ САААСАСААА 2041 АТССТСТА7С ААСАСАСАСТ САСССТАТТС ССАТТСТСАС САСАААСТСТ СТТСАТСТСС 2101 АТЗЗА&ААСС САЗСТСТАТЯ ЗАТТСТЗЗЗЗ ТЗССАСААСТ САСАСТТТСЗ ЗААСАЗАЗЗС 2Л1 АТЖССЮТ ТДСТЗААЗСТ ТТСТАЯТТЗТ САСААЗААСА СТСЯТСАТТА ТТАСЗАЗСАС 2221 АЗТТАТЗААЗ АТАТТТСАСЗС АТАСТТЗСТЗ АЗТАААААСА АТЗССАТТЗА АССААЗААбС 22Я1 ТТЕТСССАЯЛ АТЙАСААААС ТСАСАГАТСС ССАПЭЗТССС САГ^ТССАЯА АСТССТЙЙЙС 2 341 ЗЗАЮТ^АЗ ТСТТССТСТТ ССССССАААА СЗЗААЗСАСА СССТСАТЦАТ СТГХСЗСАСС 2401 ССТЗАЗЗТСА САТОССТЗЗТ 5СТЗЗАС5ТЗ АЗССАССААС АСССТСАССТ СААСТТСААС ?Ш ТГЮРЛ:Ю7Ю лг:гт;ттд ПЙТПОАТААТ ПССААЙАПАА АПУЮСПППА ЛЙДа:АЙ?йС 2>21 ААСАЗСАССТ АСССТСТССТ САСССТССТС АСССТССТСС АССАССАСТС ЗСТЗААТССС 2*81 АА35АЗТАСА А5Т5СААЗЗТ СТССААСААА ЗСССТСССАС СССССАТСЗА ЗААААССАТС 2 €41 ТСГАААЗССА ААСЙПСАЙСС ССГАСААССА САЙСТЯТЛСА СГГТСССССС АТССССЙЯАТ 2701 Ж7ГСАЮА Д£ААССАЙ(7Р САГХ^ЖС ТЗССТССТСА ААЯЗОТСТА ТСССАСССАС 27*1 АТСЗССЯТЯЯ АЗТЗЗЗАЗАЗ СЛАТЗЯЗСАЗ ССЯСАСААСА АСТАСААЯАС САСЯССТССС 2821 ЗТЗТТЗЗАСТ исБАССВСТг; С'СТСТТССТи ‘РАЦАССМОС -РСАСЮТССА СААСАССАСУ 2881 ТОЗСАЗСАЗЗ ЗЗААССТСТТ СТСАТЗСТСС ЗТЗАТССАТС АСССТСТССА СААССАСТАС 2341 АСЗСАСААСА СССТСТСССТ ЯТСТССЗССТ .АЛА

С. (ίίί) Последовательность ДНК легкой цепи (ЬС)-Рс (нету линкера между ЬС и Рс) (сигнальный пептид подчеркнут, область Рс выделена жирным) (ЗЕР ГО N0: 11, которая кодирует ЗЕР ГО N0: 12)

1 АТЗСЬСАСАС АСАС&СТССТ ЗСТАТЗССТА СТССТ5СТСТ ЗССТТССАЗС ТТССАСТСЗТ

«I ЦАЛАФААСТС ‘ТРАСТА С7 ύ Ф ТЙАСТСАСАТ ПААСЛЯЙЛАА ТТЯАСТАТСА ТПАТЛССАТА

. ? _; ТСА5ТТСААА Ί·5ΑΑΰΑΑ36Α АЗАТТТТСАС ΑΤΤΤΑΤ^ΑΤΰ АССАТСАААА ТСАСАССГГГ

181 С5САЗСТТТС ЙААА6ААААС АСЙАСАСТАТ ТТТАТТЗСТЗ САСТЗЗАЗАЙ ЗСТСТСЗЗАТ

?4-. ТАТССЦДТСА УРАССТСССС АСАТОТГСТА АСАААСАСЮС С'РСАСАС'РЖ САГТГСТСССТ

101 САЗТТСААСА ААСТТСТТТТ ССАЗЗААТТТ АСТСАТСССТ ССТТТАС'ГСА ССССТТАТАС

3*1 СЗТЗОЛЗААС ТААА.ТОААСА ТТТ-ЗСЗЛСТС СТСССОССАТ АТАТААС&СС АЗАЛЗТТ-ЗАА

42-. ;ЛТАА7АТ;:Д ?;;ιрраасгр'гт каоааатшА:; ,;;:::τ>:τι:.;τί: ссд'А-рпгтт сгаттстацс

4 У · СТТАТТТСТТ АТСАССААСА ТСАСАЗЗСАА ЗСАССАСААС СТАСАААААА СТТТЗТСААЗ

Я41 ССТААТЯААА ССААААСТТА СТТТТЯЗАЛА ЯТЗСААСАТС: А7АТСССАСС ЙАСТАААЙЛТ

40; САСТТТСАСТ 5САААСССТС ЗССТТА77ТС ТСТСАТС'РТС АСС'РССАААА АСАТСТССАС

ΐΐί ТСАЗСССТ5А ТТС5АССССТ ТСТСЗТСТЗС САСАСТААСА САСТСААССС ТССТСАТССЗ

721 АЛАСААЗТПА САЗТАСАЯЯА АТТТЗС7СТС 77ТТ7САССА ТС.ТТТЙАТЙА ЙАССЛАААЙС

7 5); тсста-тт:;а :;тсаааатат ссалацааа:; тсвАзитете сстссаатат ссасл-р.-.;с;йа

841 ЗАТСССАСТТ ТТАААЙАЗАА ТТАТСЗСТТС СА73СААТСА &ТСССТАС&Т ААТЗОАТАСА

401 ЦТАССТССИТ ТАСТААТЙСС ТСАССЛТСЛА АССАТТСЙАТ ПЯТАТСТССТ СЛГ.САТПССС

9 С: А3.7АА73ААА АСАТССАТТС ТАТТСАФТТС АЗТССАСАТУ ТСТТСАСТЗТ АСОААААААА

1021 САССАСТАТА АААТЗОСАСТ СТАСААТСТС ТАТССАССТЗ ТТТТТЗАЗАС АЗТСЗАААТЗ

1081 ?ТА!ХАТССА ААОСТйОААТ ТТЙГ5СЗЗЯТ:3 ПААТЙССТТА ТТЙОСИАЙСА. «ГСТАСАТЙСГ

1141 ЗЗЗАТЗАЗСА САСТТТТТСТ ССТЗТАСАЗС ААТААСТСТС АСАСТССССТ СЗСААТСССТ

1201 ТСТСЗАСАСЬ ТТАСАСАТТТ ТСАСА7ТЛСА ССТТСАЗЗЛС ААТДТССЙСА ЗТСЗСССССЛ.

Ζ253 ААЮ'.ТПЮСА ЯАСТТСАТТА ТТСГГЛАТГЛ АТСААТЯССТ ППАПСАССАА СЙА.ТСССФТТ

и21 ТСТТЗЗАТСА АЗСТЗСАТСТ сттззсасса АТЗАТТАТТС АССССАТСАА ЗАСССАССЗТ

1331 ЗСССЗТСАЗА АСТТСТССАС ССТСТАСАТС ТСТСАЙТТТА ТСАТСАТСТА ТАСТСТТЗАТ

;44ϊ ΓΖίνΑΑΠΑΑΌΤ ЮСАиАСТТЛ ЧЧ^ССАААТ ТССАСТССАА гхттаатост сттстттусс

1Ь01 ААТЗТЗЗАТТ САТСТСССАТ ААААСАСААТ АТТТТТ&АСС СТССААТТАТ ТССТСЗАТАС

13*1 АТСССТТТЯС АСССААСТСА ТТАТАЯ2АТТ ССГЛЯСАПТС ТТСССАТСЙА ЗТТЗАТЯЯЙС

Л?1 чиТЭАТТТАЛ ΑΤΑ!Γί··ί·15ί;Αϋ САТССЦАТТ!; ииДАТииАСА ί/ГАААиСААТ АТСАСАТТСА

1*81 САЗАТ7А£Т5 £ТТСАТССТА εΤΤΤΑΞΞΑΑΤ АТЗТТТЗССА ССТЗСТСТСС ТТСААААОСТ

1741 СГА;-.Т7-2АГ:С ТССЛАСССЛС ОЛСТААТЭСС: ТССЛПАЙЖ: АЩОТСААТАА ТССААЛАСАС

'.Θ0Ϊ Т^СТ^ААЗ •РЗСДСТТССА СААЗАЦААТУ АААСТСАСАС ^АСТААСРАС ТСДЖЦА'ТГА

18*1 АААТСТСТЯС 7ТАССАЙСАТ ЗТАТЯТЗААЗ ЗАГЗТТССТСА ТСТССАЙСАЗ ТСАЛЗАТСЙС

юю :.;ат;^:.;т;;са ^тститтттт тсазаатээс аааг.ргааащ.; тттгрсасйд.; лаатсаасас

1-т ТССТ7САСАС СТОТССТСАА СТСТС7АЗАС СЗАСССТТАС ТСАСТС5СТА. ССТТССААТ7

2041 ГАС2СГГАЗА ЯТТЗЗЗТЗСА ССАЗАТ7ЯСС ГТЗАЗЗАТЗЗ Α33ΤΤΓ.Τ3Ω3 СТПСЯАГ.ЗСА

? - 0 ί ЖЙАЮ'РТР АЮАСАДааг; 'Рса:.;А1:А1-;.;с юдсютисс САСС'РССАСА АСТССГОССС

2161 &ЗАСС-ЗТСАЗ ТСТТССТСТТ СССЗССЙААЙ СССААЗЗАСА СССТСАТЗАТ СТССС36ЙСС

2221 СС73А337СА САТСССТССТ ЗСТЗЗАСЗТЗ АЗССАССААС АСССТСАССТ СААСТТСААС

5281 ТГ;С'ГА7Г.Л-Й3 АССССС'РЗЗА «ррссатаат зссадзасаа азссзсооза Г^ССАЗТАС

2141 ААСА5САСЗТ АССЗТСТЗЗТ САЗСЗТССТС АССЗТССТЗС АССАЗЗАСТС ЗСТСААТССС

2401 ААЗЗАЙТАСА АГЖд/АЛЙСТ СТССААСААА ОТЖССАЙ СССССАТСПА ЙААЛАССАТС

?4ΐΐ тюаааоюа ААсеседда: сссаоаамза сасстзтаса ссстоссесс атссссссат

2^21 ЗАЗСТЗАССА АЗААССАСВТ САСССТЗАСС ТЗССТЗЗТСА ААСССТТСТА ТСССАСССЛС

253Ϊ АЮХЮИ’Эа аятопйапая смтгю-ж сссвасаасй аятасаайас: сасссстссс

2*41 ЗЮТЗЗАЗТ ^зАссеетс сттстезтс ТАСАССААЗС ТСАССЗТССА СААЗАЗСАЗЗ

2701 ТЗЗСАЗСАЗЗ ЗЗААССТСТТ СТСАТЗСТСС ЗТЗАТССАТС АСССТСТССА СААССАСТАС

27€1 АСЗСАСААЙА ЙЖТСТССКТ ЙТСГС/СЙЛПТ ААА

Ό. Последовательность цепи ДНК РК-Рс (ЗЕР ГО N0: 13, которая кодирует ЗЕР ГО N0: 14) Нуклеотидная последовательность рЗ¥^РК-030 (нуклеотиды от 1 до 7583)

РК экзон 1 (сигнальный пептид, первая аминокислота пропептида): нуклеотиды 690-777 РК миниинтрон: нуклеотиды 778-1076

РК пропептидная последовательность: нуклеотиды 1077-1126 Последовательность зрелого РК: нуклеотиды 1127-2371 Рс: нуклеотиды 2372-3052

- 48 028914

ДГ.{Г.ТС.ρ » .9М4С 7-4 ί 47 99 49(9 ,4 ΜΓ,ΡΜ,,Μ; |99,9"9 . η Γάϊ .--ρ,-.-:-.-..-,-+,:-, + -γ <1 ЩЛ9Ц с! I/ <9’ 1.1 -ΐ < ч · 9 ) ·)!. Μ./Λ-, 1 ΜΪ4 9.0. и . „44 4/4.. ϊ,,;~

ι («. :;Ι ί I?” ,Η 9 Мы- и.'. л,1кц οι-, 4.4 .4 4:- ι· <:Ι -. м4 /-:4 мм-Д 4 ’ 9. 94.9,,9

_{г? >к}.(. _{Ίί4 ν}, ·,►, 94 -Г,, .-л ϊ -Ϊ !· :М“ , 99 9, "9 !Д,р; .“1 - .. · ) с·- 9'

,Ш л? у·,.· { 4р ,ч(-н-4 - 4’·;/4-4Ш 4 **; -л ;‘<· 4 4 ШШЛ.Р 994/--.4 9 ! 1,1!.:·, _Г:4 I '.,ρι. ι.:4ι .4 , ,ι,4рм ;! :.-,4 л : '4'· м ι-μ м 4 4 -- -. . ;! >. . /9. · 4 ,)

Κ. ρ 94.:.., .4.4.4 4 ⁴ "4<:.,· 4м И I.. ου 7 , ι ' 4 ' ,ι 9 ), ’ <’ 4 ¹ ί. -,. ι ·. ,,. !, -Μ ¹ · 4 -Ц 4/

.1,1 4 . Μ). · ·Τ 3 ) 4. 4 ιΓ ,,'Ρ ·>; : 1 >4 · ί <4 ,4 ,1 ί ·. Μ,9· *- 1,9,1.+ -1 · 4-+ )

Ί.(.·| 4:4 /44,4 ! ,1-1),1- -,: ι· 4/1.:44 ,49,ιτ,ι;, .·π:-γ 1 мм. м:4 49999:44· .4499' ·4 <44Ч:'4 9ПН4, ) 4 9 4, „М м , ' 4 - г 9 4 ! , 9 9 94 ’ 9 - ί Γ - + >"

4)4 Τ / Г4 4.4,44 т- ,4 4,444. Γ4Λ 44 4С 1444,,.3.44' 4,4444 ' . 4:444.4 1 ! ! 1,14! МП. -, 1 4. ι 9, ,11 ΜΙ ί :,.-1/,1.:(4 41 Μ 1 9 4 4 Ш >'· Ш ^! 44 <4 '1 Ш 4 '9‘ . =

I ,. 1 .4 4 - .,1 (1-:,.-. + .1,4,.44, 4 ..;ι, 44 94-, 444 л .-V ·.. ι -, - 4-94 9 4 . 9 9

4 мШ 4 44 μ44 44 44 4-4 3,μ 14,44 μ 4-4 4.4’ 4.·,. 4· I ι44 4.4 I? /.4 „„«Γ.+ ,-,ι,Η' 1,1 мг 444 9 9 :9/.,9 1/.4 ·4 194 Ί,7Γ4ί.|1ί Г) 99'4 49 'МЦ !· 9·9 _; Ί ,

)МзУ4‘и! ,;,()·,3 4Γ4*3)ΠΊ ;,114.:.(4М344''.-„,.-9.·'·.· „-, 4:/. Мм’ -1-.44 ! !/;Ρ44·ι,,!9 434μι:λΙ·94! 4^;4· ' ”4- -4 49 · 1,14 им -4; 4'¹ 7 - " '44-’ \Γ ·^:*-’ ’ -^Λ

* _Γ|..._; и,9/4 94,44 ρ ,_Λ + _Ύι,._)Τ. ·,-,ι_1Ί -,] _τ μ .:,(,-,4.,17, η 4.99 9 г. . - -,м ,4-37

,-,-4\?-._г9Г9.’94:1.н,.19 < :4ϊ4 _?9М' -9 944ί ' 9 - Ш 4 4 9 4-+,9.4-- ! , 4 ,.: 4

,(,1,4 4,1,1-9 .4 ::).,9,4- .1-.41,9 .:· « ,1! ! Ил) ,9 4; мж! 94.9 9 лммм ί ! 4 1-4-! миг С<сЁ5а^ас4|ЬЙ,М’йс1д<ЬдЬддвсЬаЬдГлааЬ^!Е,с1:ас1даадс1дааасеа-ЬЁЬйдд«‘Сааеа'Бсас1*сааад

, .- , ,-.4 9»* .4 1, ♦, 41 ,₄ Г „,1 « .4 »

ί г! 71,4.9 Ш-Щ ,4..1(( 4747.1 ил:г4 г ,4- 44 1.Н 4,1.· 1.9 м.г ! 4 7 '/.44 г.9 ;.-9 Т- 9 ( !Ц.' Л 44,9.(1 1'+9 4 С‘1> м4;|.<-.4 9.4 . + )4---..,1 · 99.-(- . 4 ,

9)494,1,19,4 9+1 з.ък.зм; ,Κ'.-ΐΐ! ,! !М,4 :М'.и 944’М --4 9(..-3- 9

4.1.. 41.4.4.1.9 :.)9..19 -1.99 0..:4,9. 444 И 9.-1+ :4 М· 444.4 м·' <,:·!' 9-4 ' 4.М 44 494,4 44·: '4 ι ’4 м944-'ч . ( 9.44м. ) М 4 <>4, 4949 4-, ,'4 * 4,

,7 ,4 ( , .-,-4 ! .9 ' см- 4 4 -- л. ,4 -7' ' ! г ел! 4 .9 ι 1 4 ' с гч Р - ' ,-9 -,-.:-,-9.--9 Д ’ ” 4 :р ! ,_Гу> *

г ми мм.τ: 1.4 м : ιμ+··Μ :+ : , :μι7,ιμι··:4 тмм: · - и МЛ о+мп! щ :-7 5 и- -.74+- -м

л и (- (),-.-1 4‘4-4 ί 4,и .МАО - 9 4 и ц-: . и. , ,4 и 444 44 4-++ -4 4+. 4 «(

, ,1,9 : ΐ: м Г 4914,1,1,44,149119. М .9 ) 9,1 ,9914 9 -9 9 4 49. . Μ ΜΙ '.,„· -4 7,- 9--4.,..5 44 ’ 4+( 94

" (,7,-4174,1 ΤΪ ,-:-9--(99 ,7- -.4,4,7,1,-.-,-4,1.:77--44 -ми ти и --4.7744 - 9-.: 447 и-,· - .9 ) 1Ϊ 9 1-4,4 9.9..4.9 1М..94 .49X9.9 9 4 4+4-4 Μ-.',ί 4 9% 4 „4.4.. 4 .

.],! 4-, .4 т:м:т, · ч- ι,„· ,м .,с ;М, , 9 л! :·-:μ,·.- р ' (м м’’’ 4 ·' 4' +4' ‘

Ц>п 3 !>. 1Μ : + 4 3,4 <4 >г 1М 4 4 '4.1.9 «394 . „4 .44. мм '44-. 4 + 7..4 4 4:.:,7-4, ζ ’

,1 1 !,-> ,1 ;« -4.-9,11.41 9)<γ!,·!4 .--.Μ»-, ·- ,1' .)-,:,9.,4 (.4,..:9,-.-1:.494 ..,··' )М

4 ЦП 9-:4,-(,97 994.4,1 ,441.-4,7)49,9141,-:49 199.,1,4-.4-4--.9 ;.-,· 4-9 ·. 9:-4-...,44 . Г9.4.4. .4;*- С 91 ¹ , им-М, -.4 4. 4. М-. и- ; · 4> м _ 9 ! 1. „ „> 4 ’ и , ^!...м.‘

;т! 4 ϊ - ι ; 9 +-:! м! м ,-ι! мкм-) -9 ,μιμ,μ,4.--4:,-4 9-7 ;.)’-4 + и·;·!

4.. :.4.1,1.14,,:.1,4 ΙΜ .1 ί ;.Р щ-.мг ,ι· -и 44 19.19 ’ +4 4 > ι·.:·' ‘ 94 4 4 Ί.' 4 4 ':1м' 4 .7-1

аа.'С.дсГЫ.аМ.ЁдЬдааат.дЁда-ЬдеХа'ЫгдстаЬЫдЬааееаИ.аХа.адеСдеаа-С.ааасаадЬСддддСдд ММ,.,: М.,1 ' , ,ιρ :1 , .· - : ! 4,1.9-,-9 1! .-,1:9 м: 9 -< <44 мм л 9 ' .мм ί

,41. 9 -,,4 4: 4 · 9 4+4 , +-,4.44. 4 4 з·;··’. г. ,г 4, ‘ ‘ ,>4 .4м4 . - 79 ·Μ'.: М )·)'* ι ; ·.: 1.4)94,р ’ , . 7 9 · .1- )„ ' 4- 9 4-9.4: “ ,.м 9м. -4.4 4.4.-9! м < ::.:,,.1.)- !,.м! 7 м-.м. .:,1,4. 4 (ММ· Ϊ.· 4 рм-м : Л -"Х - · .« : 9 41'' ’ + ' 49 49,

'и,· 9,Р 'Л.'Л-'Лч.) ·„ /М ·<* -3 4 ; 4 < п; МММ 4 . ,4 4„ 4 4'¹ 4

Г), 9 Ы.-и,1 !|'.<.44.<|;<3,4 Ί '9 Л ·.(*. 144 ’ 4-44: ι 4' .9/44.1 1)

„-.Г 91 ,941-1 4 1,9 - ‘ Г .р 7 7⁺ * Г ,1 + 7 ) Г - Л 9, ,9 с ‘ ‘ Ц !; М с Γ Ι' Т 99 .4 .9-), ) -,9

4' Μ'ΡΡΜι-.Μ. Г. .7 444 <44 Ц.Д' Ми ) 'Е/Г.ЧШ "Мм 4 М'м+.Р.З . „ 4. 44 ’М 44 4 , .1,1.1,1,1-94· -!'. ,и ί.-ι-.ί ' , 1 рз.Мг.)./ - 4-,.-4-/. .99 44. .-4 г 449.·: 4 4. 4 +. ι 9

41,4 449.71-, Г,9 Т 9 .791-,1.11 .99:- 7.7,1 9 ) Т-ТМ/МТ,-!-Т») ! 3,-7.-47.-7)- -4-7,; )- )9-)494.-:9 : 7,7.93 437,-,1

I < 4 .4 1 4: 4м4 < 4 1 ; м 4 4 4 ,9 9 4.1,.4.1 ! I ' : 1 ι : “ 4.4^4< ⁴ ’ · '’М М' 4’ ’ / 7 '·

! ! ]ι ( ):· ί ,м I < мм! .1 /4 ί ί м ,-.(,9 Μι < 9 -4.)- ¹ ,--.9 94- 7 )49.9 > ( ---+ 9:-4 .»9 -4 ..

_г ; , _{? :},_;г, ,, _{7 :с}» _г _ , . 7,,7..7 7) ; .,7..4 ,7- .79 -4 74 " - 97. :-443 -9 -4

('4 ι,ίκ.ιΤ’ 4:.1,1-. - . 4 4.9.49 Λ·' 4 4 Млш ( 094 ---1-4 .'.’ЛмС М-.. 44 . ·. .4.

! 9 I 9 -4,9-)-)4)-/-9 4/,99-: ,-! .4 ,4 ,9.4 м ,9.4 ,9! 9- , -/4)9( 9499 4:-99 9 )--1( ! ! 7:97: с 7 ;.|, 1-,-.1-4 9),.,1 и - . 7’ ·* 4 ,7 71 ί Г > Г ГГ 777---4-- 7 ·' 9 )!’’ 9 ·+ ‘,.4Т7'"Г 9 4 4"! -4-5-,9 .· 19,4.,44--4 4 11)! )4-994 МТ’.М -9) Г ..,4. -4-4)9 / 4)9 4-,> ) · - ", -7 ; · 1)-,-. 4

- 9. 1ц! и 9..-Ϊ 4.9)9-. ):;.)! :).:,-.9449-: - м 9 -4. : + м '4 'мЦ'м -..9.49-9-974-! :..1)).4 14!. ,,),.(4.9 7! ' ‘ : .1,7 9,4 44,1.4 Ϊ ' 4. 7 .1 -.4. 4.9 мм 4. 9 4 4 4;.)

< ( 4 ). м: :· , , 7).4 ,-· / мм ! ).)! ,4 4'1/9. < - ,_:с,-_с 77 ,,,.· ^7 ....9,

,,4Г τ;.-,!-,ιζ т: 4 ::-:17,7 ,777,7,-,97-:.,7,7-7. ) 7-- 9 - 77.,7,1 4.«, )<т ι<-·~-. 1-4(9-- ¹ 9-..-.,,--9,Г ? 1Г 4 1 _; М ;,-и 4-9-..-4 .---4.411:-)19 4 ,-,4.,4 С:’· - ,,94),) 4';' ’’ · 44.

- 4-:,19 9,1,1,4,4 9 -М ·!.<< -9. 4Т - Г.-< ,1-4-; ;./ 4 .ц _яп 9.9,3.-,4,.-.9- /7.),9,. .)..44

. .49: :,.)4 9, ! ,1 .1 1,17 7.-,1 1 ί МММ- 4 4,.79 4 .),7, , 7; , 7 4 _ч 4 7. ; ,(.4 9 - .1 .7

9< 41)9 ,19 4 1. (.1.-494-9, 1 91/9. ) Г 9 ·9 I =1 9-4(. )),444 з, //4.,4/3 4- - 7'9 ⁴ 1.4 1/9.

! -.Μ,;-) Η ί -- .с м.9,1 4 -..).4, с/):! -4:,49. ί :.ы 4 ! 9)4 -/-4:-.4 ! -:7м -υ ¹ ! -) ιί 9 /;! ϊ 4 м-> I дед 4 ! ! м М - - 99.7,1 -г· 47 7 4- ⁴ ' ^7-4.,.47, 4 -,.57, 4 , 74,,4 . ,4. 37 .. , _ϊ 1 > - 7 - 4 . (-44·-; , + ,

' 4 .М/.М.·* ,-47.9(.3..4 К ·,. ! 4 4·. 1 1₍а(, 9. ' > 4 „9 * '< |<4 ‘ 4 ' ’ ( ’ Л 4"¹ 1·.

М4> ί м, ,к ! 4 1/1 .9.1.1( ! .-.-к 9 .4 /- < м :· · <>4 1..9( /и, · 9.4 994-4. ·.:·/' 4)' 4 '

49ΛΙ-.ΙΜ 4,1,1-. ,1.3-41 н (4< : 9 - (4.-.·!.,- < МмС.'Л. ;· 4. 4/ '7. ’ ¹ I, 7) 9Жим-' I г 9)·'" 1-4' ". 9. 1 ; 4 ,4)1 99 ‘ ) . ‘ , ,417 ¹ г, .4 -зМ- - г \·.. “ · · V 4 < ί ’ ^! - ‘7 мим;! ,9,мм9м-1 -4 1.- >494 М1 9 4 М-! К,1 9 -.-:,4,,9 М9м4 М)м! 7799.4.-7

м-4 М μι, ,4<,- м'з/! г.;н ,.г.С-|’.м ι :,11)9 3(.14.., 9, м., ;! ..4-.--9.

44 4 1' м г 4 ) .. 4 , . 9Ϊ.. +4 9 4 м „ зМмчм ι 4 ’ 4 ·.-> 4 - ‘.(4-:.- -9

г, Μ ; Μ I .7,9 ,4 ,7, ';* К-.М-Т) 9 1.1 7-1.7,,-Ы( ,7 : : 1С. ,. 7М-79 77; 9 4.4- -94

ί |·) 9’ Г. , · .:),- Г ' 4 - ⁴ 1 ‘ * -:9.:,91 М Г. 9 · 7* ММ. .> ,М ) 9 :/<* I -- Ц --М С 9 -с

,4·ρ’ί9ΐ·;,ι’·ί< 1(.-.17- ' 44-:,494-,1- 1- 141,474:4 -Г4--Г 97’94 * >_/4 .

17.9·.! I ! 9 I 79. ; . 9 .< -.-1(4 5,..1 : .7 ,ί,Ι ТМ !..!>.· . 1.1- >. ) ί 4 ' *.</ МГ <- 4 1.4 · ¹ '7, 3‘ ‘

М- ,4 г ом- г ' »-. и/,/,...-^{4 4} (,-,,,.1,:.,:..4...»: м /, = . :·: ί - . мм < ^{4 4} ···, им и - : 4 -44

-.114: ---.4-( .-.-мм, .7! -7. 1.4 ,4 · ·/,:· +4 ) )9.94 ·- 9* ·. Μ 1 ' - Н · · 4 94 ϊ 9 4 .9.9 9.4 ί

• к<4 41:-,(99.-44 7: >4 177)7( '".-НГС! -999777777)7077) М94 .ихзглпг : -40777-: 99+9 9)4

мед.·) 44,1 ),-’ 4 ' 1 .-1494131 .17’ < ..Μ / С Г/ι Г-1 :94-40) 'МММ', ,--:4 = 4 1 4-99-.4/- м,4‘

,-.4,11 3.1,1' , ,1.4; ).4 .1 1 -/, д. 9,,,11- ,1’ -4 ) 1 )· .11.1 1 )944-.:,. -1 - Λ Ι-/· ) - -.)-.71 !л <)> 9. ·. Ιρ-.ρ

г.),- ,т9 Т.М-7 9 5 Г ! “ <-,14М-<4- ( <4-7>4 МГ - 4..Т- 7 9 44 ‘М ,1,1,1 4 I ’ 19 Р! . 11 "Г -9194+ 7'9

4,9 43’ ,4 1441141( 4 - .4145/.’" (4 4- М ’ '/*- 4 4 ' . 4 . ’ 9.

! м 9,4 ,-!Μ·: 4 - ,! ( ! 9 ,м, ( . 4-7,1,1 : -.4 .:-,9 1- ι ,<ι м! 9 м:' 4 9 / ·.·:

М . 7 <* 1 '.ММ М - - 94 9 ( , ;4 ,г Л Μ. < γ м м - » '4 ! ’ Г 4 " .4 . <

: ,-1,1. ! ,9 -)4 9 М1/1 .. ,лсм< /з! ,1.1 м- «, (9-4 зммМ мм л-;· -.)+. ) 4 -+ . -..9-4 +)-:-.,,.

м-р 9 9 49 749,-7. 9474,1, 3-979 ,4 Γ,τ.ι,ΐΜί 9,1,-:.4 :--- 99 9 мм; 9. 9· 49-0-Μι 4" .7:-:)1--.- / Ί »44., 4)7 9,.99 Г М 9,1,9 11-44 м-'Л -,34 4 9 .4 <4 ΜΙ/ ΐ - Μ ΐ 9 ’ ·9 ' 1 -/-9

⁺ ΜΙ. 94,-Μ 9*49 Г 9 4 47 1,.-, .1.1.., 4,194, Μ ).1:.1.11,1.11(. 4- !/,-. 44,-. / -4 · 4-г .1 9 ·-: +

( ,, ./:.14.-.-,19: 4' 1 477--’ 7-1-9·+ и-44 11-74.) 9 4-4+97 9,-49 9--9( 79./.-⁴ Μ“)4’

1 9.149,-4 ' '-9 4.44 ‘ Μ < !. 44 мм·.,. 4Ϊ 9 (4 ι. 9.-9· 4 4 - Μ д - » :. -4 ‘ ' . 4 7 9.4

М1< /9,4'4 ,.( .4 Й,1 МММ! 9 .. /мм «мм зп/-.- >. -4 * ,и.: м м. е! ,м,.мл<4.)'.! и/949’ Х-,4м „

•4.9 1 7,03,- г,!: .4-7-.- 149 7,1 4 ,, :,-4 4τι4 ι,ο-τι 4- :> ,-1 4,+ ,9-.- 4- + -7, :г ι- -.мм.ми-))7,-,4), 59 9,4,14 М 1” 1··,.· Μΐ 44(934 (. 9.,· 4 9 474,,-4-. ))4 *9 /-См’мм.

I .-!( .·), I ,4 ! ,1,)9-) М1

В. Последовательность ДНК Рс (сигнальный пептид мышиного ΣβΚ подчеркнут) (ЗЕр ГО N0: 3, которая кодирует ЗЕр ГО N0: 4). Это кассета Рс из ρЗΥN-РIX-030. Кроме того, имеется отдельная кассета

- 49 028914

экспрессии Рс, которую трасфицировали в клеточную линию в плазмиде ρ8Υ\-Γ с-015, которая кодирует такую же аминокислотную последовательность, но содержит несколько некодирующих изменений. Вторая копия кодирующей последовательности Рс разрешает лучшее соотношение мономер: димер

-,ψ[;ΐί’π;Ε··:ιμι':κ'μ-ΐί'υμίμ?ρμη:ρ

дсескЧ\Н€!?пса;с11къ:;)1си?согс1д;ч.7С1::)ддд1\\2ес<ч;дад0Л1Ч\н?пддгд[.:1е;А?септч.\'ес;.11есс дсдэ1211дссюсс;и1дбос;-;11'д:сид<ч-?диее1 юлрргракацдсш/кшссиргриелгрссд'ррпт! дид.:1уадс1ипдЕдс;1дс\\ю₄12иас;|;1ГНх\и'|д;кС1сиСк1л\-дЕдЦудиск-сд0Сидс!еепс11сс1СЧ

еа^ч1ас471с?иилсдс1^а«1д;1исс11:11чч-!дктседс’2иип1

Последовательности табл. 2. Полипептидные последовательности.

А. Мономерный гибрид Ρνΐΐΐ-Рс с удаленным В-доменом (мономерный димер ВЭЭ ΡνΠ^): созданный путем коэкспрессией ВЭЭ РVШРс с цепью Рс.

Конструкт = слитый НС-ЬС-Рс. Экспрессионную кассету Рс котрансфицировали В^^РVШ-Рс для получения мономерного ВЭЭ РVШРс. Для цепи ВЭЭ РVШРс, последовательность Рс показана жирным; последовательность НС показана двойным подчеркиванием; оставшаяся последовательность В-домена показана курсивом. Сигнальные белки подчеркнуты.

ι) Цепь РVШ-Рс с удаленным В-доменом (19-аминокислотная сигнальная последовательность подчеркнута) (8ЕР ГО \О: 2).

М01ЕЬ5ТСГГЪСЬЪНГСГ5

_ЙТЖуу_Шд^_ЬЖ¥;^₅М^

Р?ММСРРСРТГг.,АНУУ0ТУУГГРККУАЗНРУЗРНАУСУЗУЖАЗЕСАКУРУК)ТЗаКЕКЕРРКУЕ&

С'ЗЗНТУУ^й’УРКЕЛСРЮАЗРРРГРТУЗУРЗНУОРУКРРУЗСРТСАРРУСЕЕСЗРАЕЕКТйТРНКЕ

131?АУР2ЕС:<ЧУ.?НЗЕТРЛ1Ю1Ф2РгРьА?и7АРДЙРКИНр.7ыдУУЫК5ЬРУЬ133НЮ:5У УИНУ ГСМ

СТРРЕУН31ГЬЕОНТГЬУАМНР.ПАЗЬ5:ЗР1ТРЬ?2АйТЬЬ’4Р13С?ЬЬГСН:ядндн:ПМ5А¥УК

Е РМРУАРЬУ РАРР РЕЗ ΥΚ3ΟΥ ΡΝΚΘΡΏΚ I ί-КК УККУКРМАУТРЕ Τ ΕΚΤΚΕΆ1ОНЕЗ С1 РСРРРУС

ЕУЗРТРР11ГКПСАЗКРУКГУГ'НС1ТР\⁷РРРУЗЕЕРРКСУКНР?1ЬРР1РРСЕГРКУК??Т-;Т''ЕРС

РРКЗРРР.СЬТ5.УУЗЗЕУЫ14ЕР.РЬАЗСАГСРЬЫСУА£5УРйЕЙМЙ1МЙРККМУ1ЪГЗУГРЕЫЕЗЧ

УРТЕМЮЕГРРМРЛкУ/СРЕРРЕРОАЗЫТМНЗХКСУУЕРЗРйЬЗУУСЗЛЕУАУИУТРЗТСАСУРРРЗ

УЕЕЗСУТГКНХМУУЕРТРТЬТРГЗ СЕТУРМЗМЕЦ? ЗЬШ ШСНЫЙ РРЕКЕСЕТАРЬКУ3 5СРКЯТ СРУУЕРЙУЕЬГЗАУРРЙКЦЫАТЕРЕСГР.ТУРЕРТКАЛСАЕ! ГКЕТРСЙ РфЕЕ Ξ РУРЕ ГIЗУЕМКК ЕОЬ'РТУРЕПЕЫЮРЕйЕСЛА ΡΗΥΕ ЬЮУЕГЫТУЧИ¹- 5йРНУРМЕА'Д ЧРУРмЕКЕУ УЕпЕР'1 Е-С 3 ЕТОЕ'РУЕСЕРЯЕНРкЗРРЧ РУIВ АЕ7ΕΡΝГЛ7 Τ ΕΡ.Ν0Λ3 ЕГ У £ Е¥ 3 3 Ρ13 УЕЕРОЕОСЛЕ РЕК КЕУКРЦЕТКТУЕРЖУРННГ-ЮР'ТКРЕЕРСКЛЖУГЗРУРЕЕКРУНЗеЫбРЫУСНТКтТЕЫРЛНОР. ;УТУйЕЕАЕГГ'1ТРРЕТР:ЗйЗТТЕ1С'.ЕУр_!;РАРСЫ:С_!ИРРРТГКЕиУЕЕН7ПЫОУ1МРГЕРСЕУМ Л0Р0Е1Ет'РРЗМСЗКЕЫ1Н31НГЗСНУРТУЕККЕЕУК1'4АРУЫРУРСУЕЕТУЕ14РРЗКАС1йЕУЕ УЕГЗЕНЕН7ЮКЗТЬЕЬ^т?У0ИКГ0ТРЕОКЛ5АН1ЕРЕСПТАЗС:'УЗСКАРКГ2ЮЬНУ?й5 1ЫЛЧЗТ КЕГЕЗ’/ЛКУРЕЬАГМИНЕГЕТОСАЕСКЕЗЗЬУТЗФЕИМУЗЕР'ГКР'ЖТУЕЕЫЗТЕТЫСУЕЕСМ УР55О1КНЫ1ГЫРР11ΑΕΥТЕЬНРТНУЗТЕЗ ТРЕКЕЬМССРЬЫЗСЗМРЬСМЕ5ΚΑΙ3 ОАОТТАЗ3 УТРЦМГАтаЗРЗКЛЕРН^ЮЕЗЕАЙРУуУЦУРКЕИРОУРЕСКТГ.ЖУТ'У/ТТйЗк/ЕЗРРТЗМУУКЕ ЕР Г 3 5 3ОРСНрИТГГГОЫЖУКУГСбЫОЕ3 ЕТ РУУЫЗ РРРРРР ТЕ ΥΡΕΙНР03ЙУН01АРЕМЕУР СУЕАйРРУПКТНТСеРСРАРЕЬЬееРЗУРРРРЕКРКОТЬМ15ИТРЕУТСУУУОУ5НЕЦРЕУКБТЯ« ΥνθΘνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ0ΥΝ3ΤΥΚνν5νΡΤνΈΗ0ΟΗΡΝΘΚΕΥΚΟΚν5ΝΚΑΤΡΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΑΚ6ς РРЕРОУУТЬРРЗРГОЕЬТКЫЙУЗЬТСЬУКСЕУРЗРХАУЕНЕЗМСОРЕЫЛУКТТРРУТОЗОСЗЕЕЬУ ЗКЕТТОКЗКИСССЫУЕЗСЗУМНЕАЬНКНУТСКЗЬЗРЗРОК

ίί) Цепь Рс (20-аминокислотный гетерологичный сигнальный пептид из цепи мышиного ^к подчеркнут) (8ЕР ГО \О: 4).

метртррриурррздурсзтс

ОКТ НТСР РС ЕАРЕРРССР 5УЕРГР РКРКРТРМIЗЕТРЕУТСУУУРУЗНЕОРЕУКГЫЖУРСУЕУН ΝΆΧΤΚΡΚΕΕΟΥΝ8ТУКУУЗУРТУРНОРИРМСКЕУКСКУЗИКАРРАРIЕКТIБКАКССРЕЕ РОУ У Т

:ЕНЬ.ЗНРЕ1/ГКМПУ31₁П-С;.УКОР¥Р31УАУРЙЕЗРССРЕЦЫУКТТ^,ГРУРРЗОСЗ’-'В^,Р'ГЗЬУ ТУРКУ ШбООСДУРЗСЗУМНЕАиНЫНУТдКЗРЗТ 3РСК

В. Непроцессированный мономерный гибрид РVШРс (Непроцессированный мономерный димер РVШРс): созданный путем коэкспрессией РVШРс и цепью Рс.

Конструкт = слитый НС-В-ЬС-Рс. Экспрессионную кассету Рс котрансфицировали с непроцессированным РVШ-Рс для получения непроцессированного мономера РVШРс. Для цепи РVШРс, последовательность Рс показана жирным; последовательность НС показана двойным подчеркиванием; последовательность В-домена показана курсивом. Сигнальные белки подчеркнуты.

1) Цепь непроцессированного РVШРс ^νΜ сигнальный пептид подчеркнут) (8ЕР ГО \О: 6)

- 50 028914

МОЗЕЪЗТСЕЕЪСЪЬкЕСЕЗ

АТРЛУУГ.С.АУЕТ,, ЗИРУМдЗ РАСЕ I. РУ УЛЕ ЕЖКУ РКЗЕРЕЫТ.ЗУУУККТЪЕУЕ Ε7ΡΗΙ.ΕΝ Τ АКРЕ

ΙΖΖ;5ΖΖΙΖϊϊΖΖα137ΖΖΚεϊε1Ζ';Ζ4Ζ.ΖΖΖΖΖ1Ζ1ΖΖΖΖΖΖΙΖϊΖΖΖΗ1ΖΖΖ1

:- ;-:з -·· - у улу/· уемс - '-/ % у --г :ь ру г чу г,- ус~ ж ;. г -т.уур ус з: сера гул н·’ г

11ЬЕАУЕОЕйКУ/?;13 ΕΙΚΝ 3 ЬМ£ФЕЬ ?ιΑί·ΑΡΑ^ΓήΈ КИНТУ N С ίУЫЕЗЪ РСЪI ССЕЕАЗУ Ϊ КЕУ I СМ

СТТРЕУСЦУЪЕСАЦЬЖ ККНЁ.ПАУ ее ъ3 ρϊ ТЕХ ЁАатъыЪъсйьъъкснъу знангхжАХУК

УОЗ С РЕЕ РдЪЯЖЖЕЕАЕ Ε Υ ЬПЬЪТ ЗВ ЕМРУУк ЕВ ЕРЫ В Р 2 ί Ί 0 ί кВУАККНРКТИУНУ 1ААЕЕ

ЕрИОУАРЪУЪАР О ОКЕ УКЗдУ ЪУЫС РСМ СЕКУ ЕКУКЕКАУ ТОЕТРКТКЕА1ГЖЕЗС1 ЬС РЪЬУ'С

ЕУСРТ7АТТЕтайА5КРУтУРНСУТЕУ?.РЕУЗЕК7.РК€АУНТЖРГРГТЖ5ЕТЕКУКетУТУЕРС

РТК5 РГ-КУ ТЕУУ5 5 ЕУЖЕВ РТ.АЗ СТ, ГС РЕГ, I ЗУКЕ ЗУ Г( уКС-Мд Τ М 3 РКЕЫУТ Т.ЕЯУ ЕРЕКК5К

ΖΖΖΖΖΙΖΖΕΖΖΖΖΖΖΖΗΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΙΖΖΖΖΖΖεΖΙΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖ

УГЕЗСУТЕКНКкУУЕРТЪТЪГРЕЗСЕТУРМЗМЕЫРСЪКТЪССПЫЗРГРМРСМТАЪЪКУЗЗСУКЫТ

С-РУУЕРЗУЕР1_>ЕАУЪРЕКЖА1ЕдРЕгар?у^тгА?УЗ?АЕАр№У?У1ГКУР1РЕТРРУРУЖГР?'У АУ САУУ5 СЕАЖЪАу>Ед1СЪУЪ5± ШьСАУЖУЕУ^ЗУТАЖШУ^ТУЛЖс/ЪЗЫУТ АРхЖУ'ЬпЛСс; ЖГШТРЕЗСЬЖкЬ/ЖДЪСГУА^ЖЬЖУ.ЛГАЛУ-ЗТЗхЖЬГЗГтРЗГЖ.ААСтУТЗЗЪСРРЗЙА %Ь'тСЯЕАУгРУ;ААЪЕ5ЕУ2Е\5РЕУРЪЪУ5АЕ\ЖРРЕАЪЪАУУСУРд^д_СЖРУ5ЪУЖу'УА'.ЕТЬ’5'ГЖЪЕ'АУ;

ΑΈ АНЕР ΛI7. ΤΚΡΝΑI- ГРУЗ757 Ъ ΚΤΝΚ Τ5ΝΝ5 Α ΤΝΚ К ΤΗ А ГС Р 5к Α 7 ΕΥ5 Р5 УШУ ТЕЕ 5 РТР ЕК КГТРкГ_пУ^ШШЗГШАТАЬЕЬКНМЗККТТЗЗК1ШРРРУС&:КРСРТРРРА0КРРК!ЗГРКРК,ЕЬРЕ5 Р,РКТОРТИОККЗ!,КЗООЗРЗРКОТЕКТ.ЗРР.КЗУЕЗОКЕТ.ЗРКК-ШУАЗКОРРТКЕУЕТ,КР№ШРЗ ЕЕ N1, РЬ ^КЬРКЪКЕККТРРКОЕКК! ОЕЕ ТЕККЕ Τ'и ТОЕКУУЬ РО 7И Т У ГС Τ ΚΝΓίΤΚΝΤ ГЫ. 5 ТУ СУ УЕЙ5 У РОЛ КТ Р ГЬ О 0 ЕЕ 5 Τ, ΝΡ3 ΤΝΡ ТЕКИ ТА ИГ 3 ККОР УЕ У Ъ ЕС-" Ε ΟΝΟ Т Ш Т УЕКУА С '^г ТА 75 ΡΝ ТЗОУ^К'^ОРЗКРАкКОГРкРЬЕЕТЕЬЕЬКЫГТРТЗТОК’ЗККТЖИЬТРЗТЬТОТЁРКЕКЕКОАЬ ГС'УРЪаЖАΤΚ3Η31 РО'АКРЗРкРТ ΑΚΓ33ΡΡ31Р,Р1 УЬ ТАУЪгШЖЗЗКЬРААЗУ РЕКЕ ШУСР ЗЗКГк.0ОАККШЕЗкА1Ь1кЕШСЬКтЕУСЗЫТРЗАТКЗГ1^ТККЛШКТЫРКРЬкРКТЗОКГРЬЬ I КУШ УРЕккРРТЕТЗККЗкЗКкГ’к ГРС^кЬОШЪОАкКШШАККРОг, У РУ кРУАТРЗЗАКЫ ЗК ЫРРЬАКШЕУОТС7РКРГККЗОЕКЗРРКТАРКККРТТΤ3ΚΝΑ3Ρ5ΝΚΑ 7АА ΤΝΡΰΰΝΚΡΡТРГТ ШК06РТРШ СЗОКЫУТ. СШРР7ТР ТТТ ОРРСЕРЛ РУРРТТРУЕМР кггогртугереусз рез С КЕТЕНУ ГШ7ГЖ СНЕ ЗР ГН'ЛАЫЖЖ; СЗЖ С УНУУС'ЕШРЗРЕТсТ УРСЕЪЛЕН ЬСТЛСРУТЕ/ЛЕ7ЕГЖГЖ7ТГЙКаДЗВРУ5ГУ53ГЛРУЕЕП0РГ)С4А5.РР5КУЕ'7КРУЕТКТ^ЕККУ0 ННМАРТКШ ГЪСКАЙАУГЗ РУРЪЕКРУНЗеИ ΘΡΡΕνΟΗΤΝΤΡΝΡΛΗΘΕςΡ/ΤνΑ'ΕΕίΛΡΕΓΤ I ЕРЕ 'ГКВЙ1ЕГЕЫЛЕк2]СНЛРСЫ:р«ЕРР^,1Ы-АКУР£^,АА1КСУЛ1С1ЪРСЪ'ЖАуА0Е:АМ1ЪЪЗМ|ССЛ ЕНУНВИ'ЕЗСт.У’ТУкЬ'КСЕУКМАЬхКЪУРСУЕЪТУЕМЪРЗКаСУЙРГ/ЕСЛУСЕНЪНАСГиГЪРЪ V У Р.МКГ0'1'РЪСМА5СН1 НРг'Г)! РАН ЕС УСЮМАРКЬАкЪЕУ 5С51N А’л'З ТКЕ РЕЗ ИIКУРЪЪАРМЪ ТНСТЕТС-САЕСКЕЗРАУСРПЕТГЕУЗГГОРККШТУКСМРЕСТАКУГГСЖГОРРРАЕНУТЕИРРТР АЕ¥1ЕЬНРТН¥Р155ТЕКЕЕАМСССАМЗСЗМРЪСМЕ5КА:РЕАС=ТАРЗУЕ'ТЖГАТИЗР5КАКЬ НТ.аСКЗМАЖРОУЖРКЕет.аУРЕСКТМКУТСУТ^ОСУКЗТ.Т.ТЗМУУКЕРРЛЗРдаРСНОЮЬГЕ

ОМСУУКУУС'СЛУОЗГТРУУКЗЬРРРЬЬТкУЬГЛг.РС'ЗКУНСЛАЬРКЕУЕССЕАУ-ОЬУОКТНТСРР

СРАРЕЪЬбеРБУГЪГРРКРГОТЫПБКТРЕУТСТУУПУЗНЕОРЕУКОВДУУООУЕУНМАКТКРКЕ

ЕОУКЗТУЙ^БУЪТтаН^ПтаМбКЕУКСетЗМКАЬРАРХЕКПЗКАКедРЕЕРОтеТЬРРЗМЗЕЬ

ΤΚΝαν3Μ€ΐνΚ6ΡΥΡ3ΟΙΑνΕΜΕ3ΚβςΡΕΚΝΥΚΤΤΡΡνΐ£8Ο65ΡΡ1Υ3Κ1Τν0Κ3ϊ®00βΝνΡ

ЗСЗТМНЕАЬНМНУТОКЗЬЗЬЗРеК

ϋ) Цепь Ρο (20-аминокислотный гетерологичный сигнальный пептид из цепи мышиного подчеркнут) (δΕρ ΙΌ ΝΟ: 4).

МЕ?РТЫЛ,ИУ1,Г.,Т,И7РС5ТС

ГЕКТНТСРРгРАРЕРЬеСРЗ^РЪ^РРКРКРРЪМТЗРТРРУ'СУУ/УОУеНЕПРЕУТГНтУУРЁУРУН ЖЬТКРЕЕЛСУЫЗТУЕУУЗУ,' ТУ:.НОРЙГ.КеЕЕ.УВ;СЕУ5?ГУАТ,Р7..?1РК7^,ТЗЕАКССРЕР?СУУ^

ЬР РЗкОЕЬТКЫОУЗЬТСЬУКСГУР 3 ШАУЕИЕ ЗМСС?РЕЫКУКТТ РРУЬОЗОСЗ ГГЬУЗКЬТУПКЗ КЙСОСЫУУВСВУМНЬАЫШИУТСАВЖЗЬЗРСК

С. Гетеродимерный гибрид ΡνΙΙΙ-Ρο.

Он получен путем котрансфицирования конструктов НС-Ρο и РС-Ρο. Было сделано два конструкта НС-Ρο. Один не имел линкера между НС и Ρο (НС-Ρο), в то время как другой имел 5-аминокислотный линкер между НС и Ρο (НС+5-Ρο). Сигнальный пептид ΡνΙΙΙ использовали для конструктов НС-Ρο, в то время как сигнальную последовательность мышиного ^к использовали для конструктов ЬС-Ρο.

ΐ) НС-Ρο (последовательность Ρο показана жирным, сигнальный пептид подчеркнут) (δΕρ ΙΌ ΝΟ: 8)

Му7УЪВ1'СЫ ЪСЬ_КЕСЕй

АГкгУУЪилЖЬВДЬ7МСйУЬСЕЬРС_-АкГ_-РРУРкВ5РГ13ТВУЛ’к1Л^!ЬРУЕРТЬПЬР.Ч1А1:РГ РР ТЖСЪЬСРТIОАН УУ АТУ V1ТЪККМАЗ НР УЗ ЪНАУС УЗУ ИКА5ЕЙАЕ УРПСТ З-ЖЕКЕ ОРКУ Ь’Р СС5Н7У\АШУТ.КЕЫСРЛА5ЕГ-Т.САТУ5УГ.8НУШ.УКАТ..ЫССЛАСАТ.Т77СКЕСЗААКЕКТ0ТТ,НКЕ 1ЪЬГА7Г07СК5ННдЕТКЫЗАМдГЖОАА5АААНРКИНТУКСУ7Ьда51ЛЖЪ1ССНКК87У^глЖ71С_тМ СТТ?Е7КЗТЕЬГ6НТЕГ.,7ЕКНЕдАЗЬЕГ5РГТЕГ..7А0ТЬТ,МАЬС0ЕТ,Т.ЕСН155Н0Н0СМ37\У7К УЕ-ЗСРЕЕГ<Л,ЕХКЖТ.ЕАЕАУ7ППТ,ТАЗЕРТО77КГПАПЫЗ?ЗЕТаТКЗУАККНРКТС/НУТААЕЕ ЕУЖУЬРЬУЪЛРОЬРС УЕ.Ж УЪУМСРЧ Р ТевКУУС Ρ7ΕΑΪΤΓΞ5 ΓΚΙΓΈΛΙ «?г.ЕЗСГЪСРЬЬУСЕУСРТЪЪТИКЖ^АЗРРУЫРУРПСИЛУЁРЬУЗРРЬРкСУлНЪКБРРРЪРСЫРКУКЙТУТУТЬС РТКЗЬРкСЬТкУУЗЗРУДМЕкС'ЬАЗСЫСРЬЬТСУКЕЗУООкСЫОРМЗЪКкКУТЬГЗУТОЗККЗН У Ъ ТЕК Ϊ ур Ь Ъ РЫ Ρ Αι В ' Лр ЪЕ С РЕ ЖАВ К1 ΜΙ ί 31Ы С У V Ь О 3 Ь Ж 3 УС Ы ί Ε У Α У Η У 1Ь 3 УУАС Т 01 'Ъ Р УЕРЗСУТгУКНкМУУЕВТЪТГЬТРЗСЕТУГМЗМЕЫРСЬйП.ССНЫЗПЕНЫкПМТАЬЖГУЗЗССКНТ СЪУ¥ЕО£УЕЫЗАУЬЬ£КЫКА1ЕРИОКТНТСРРСРАРЕЬЫЗСРБ7РЬРРРКРКПТЬМ15КТРЕУТ ανννϋνδΗΕΡΡΕνΚΏηϊΥνϋβνΕνΚΝΑΚΤΚΡΚΕΕΏΥΙίδΤΥΚννδνΧΤνί,ΗΏϋΜΧΝαΚΕΥΚΟΚνδΝ КАЬРАР1ЕКТ13КАКЙ0РЕЕР0У¥ТЬРРЗШ)ЕЪТМ50¥ЗЬТСЪ¥КеРУРЗО1А¥ЕтеЗЫе0РЕШ ¥КТТРР\7Ы>ЗОСЗЕЕЬУЗКЬТУОКЗКИ<Здс;КУЕЗС5¥МНЕАЬНЫН¥ГСКЗЪЗЬЗРСК

ΐΐ) НС+5-Ρο (последовательность Ρο показана жирным, 5-аминокилотная линкерная последовательность (из В-домена из ΡνΙΙΙ) показана курсивом, сигнальный пептид подчеркнут.)(δΕ^ ΙΌ ΝΟ: 10).

МдЬЕЪЗТСЕЕЬСЫЕРСЕЗ

АТРкУТЬсАУЕЪЗЙРУАмЗЕЬСЕЬРУЬАкГРРЬР.-'РКЗЕРУЫТЗУУУРКТЬЬ'УЕкТРЦЫЛЯАКЬК РРЖСЪЪСРТГС'АЗУУ7ТУ71ТЪККМАЗкР73Ъ₁ЧА7СУЗУИКА5Р:САкУ0РСТ50кЕКЕ0ОКУкР етЗН^УУ^СЛЛРТЖРРЗЖОРТСШУЗУГ.ЗН’/ШУКЕТЫЯСЛЛСА’.ГЗ/СЯЕСЗТ.АЛЕКТСТТ.НЕ? ТЬТ.ЕА-ЖОЕСКЗИНЗЕТкЫЗТРФЭРКРААЗАКАйРКЕНТУЫеУУЫКЙГ.РСТЛеСНККЗУУЙН'/ГСМ Г-Т^^Е7РЗТЕЬЕСгТГи'"ЕккСА37ЕТгРТТ?ЬЛАСТ1ЬГ5Т лПРЬТ.ЕСЧТЗЗНЛНОСМ^/.З/УК УРЗ г РЕЕ РОЬЕЖЖЕЕЛЕ Г Υ ЕЕРТ.Т ЬЗЕМГЛА/? ШЕГЖ 3-' 8Е Т СI Г- ЗУ* ККНРКТ?7УЕ Υ Τ ЛАЕЕ ЕЬВД0УАРЬУЬАР0Е'КЗУКЗ-ЭУЬЖС?5К1СЙКУККУКЕКАУТБЕТГКТкЕЛ1|ЗЫЕЗСГЬеРЬЬУС Е УСШ'ЪЬ _ 1 ПЖ'АЗ ΚΡΥΝ 7 Υ РНС1Т ЬУЕ РЬТ ЗЕЖРЕСУХНЪКЕЕ'Р 1Ь РСЫ1ΡΚΥΚ МТУ ТУЕ ЬС раКЗЬЬРСЬТк'ШЗЗЛ'УЫЕЕЕЬЬАЗСЫЗРЖЬТУАЕЗУБ'УксЖЛМЗь'КРкУЛЬЬУ'УЬ'ВЕКк^К' УЪТЕКТСкЬЪРЫРАСУаЪкЕРЕЗТрАЗЫШНЫЫСУУЕЕСЖСЪЗУСЬНЕУАУСЛЛЬЗТС-АмТТЬ'ЕЗ УЕЕ5СУТ7КНКМУУЕПТЬТТ,ЕР7 3СЕТУЕМЗМЕЫРС1Л?ТЬеСННЗОГЕЫКСМТАТ,ЕкУЗЗСЗКЫТ СЬУУЕОеУЕЫЗАУЪЬЗКМк'АЬЕРКЗУЖАМЭКТНТСРРСРАРЕЬЬСбРЗУЕЬЕРРКРКВТИИЗК ТРЕУТСТтаЭУ5ЙЕЕРЕ7К™ШГОе7Е7НКАКТКРКЕЕОта8Т¥НОТ5УЬГга,НООИЬИвКЕ¥К СЮ78ЖАЬРАР1ЕКТ18КАК€аРВЕРдтеТЬРР5ИЖЬТ1Ш0¥5ЬТСХЛ7Ке1’УРЗО1АУЕИЕ8М6 αΡ1ΚΝΥΚΤΤΡΡνΊΛ8Ο65ΡΡ^8Κ1ΤνϋΚ8Ε«02βΝνΡ8α8νΜΗΕΑΙ»ΗΝΗΥΤΏΚ31518Κ3Κ

- 51 028914

ΐΐΐ) ЬС-Рс6Н1з (последовательность Рс показана жирным, сигнальный пептид подчеркнут) (8ЕР ГО N0: 12).

МЕ 7 РТ 1,ь Т.ИУЫ, Т.ИУ ?С 5 Т 5

Ε Т7КТТТ г.539ЕР т Б Υ БОТ Ί ?7РК КЕЕ0ГБ Ί ΥΟΕОЕКП?Г= 7 ЕфКЕТР КΥΕΊ ДР ΥΡΡ Т НЕ Υ0Κ 5 5^ЦН7 ЬРЫГЛОЗО?! Р0ГКЕ7УЕСЕГТ7С<.РТ?РГ ΥΡΟΕΓ КЕтЗТЕОРТНАЕУРГЖТМУТЕРИС·

ЛЗР Ρ Υ 5 ΕΥ83 Ы 3 ΪΕΕ Σ О?ОСАЕ ΡΡΚΝΕ7ΚΙ КЕ ТК Т УРиК71;ННМАРТК0Е К ОСЕ АЖУРЗ РУН ЕК0УН80Ы СРЬЬУСНтаТЬЫР ΑΗδΚς-νΤ 7Г)ЕРАЬГГТ IРОЕТЕЗЖЕТЕЫМЕВЖКАРСШ ОМЬ ΟΡ7ΕΚΕΚϊ'κΓίίΑ1Νϋϊ1ΗΟΪ1ΡθϊΥ·'ΜΑ0θ0Κ1№!ΪΑΕ3ΕΟ5ΚΕΝ2Π31ίΑ13ΐΐνί·Τν'ΚΚΚ3ΕΪΚ£4 АЬ ΥΝΙΛ'ΡΟνίΈΤ РЗМЬРЗКАС! МКУЕСЪ1 СЕ НЬНАСМЗ ТЪЕКЛМ' К ЫКСС7Р0С1АД8СН1 ΚΟΡΟΙ 7 чЗСЕОАЧ-СКАРКОАНОНСЗБЗКМАНЗТКОКГЗМККЕОООАКМККЕСККТОСАКуКс'ЗЗОУКйОЬТ! М¥ЗСОСККйОТУР.СКЗТСТЬМ7НЕСттЗЗС-1КЕК1ГЦРРТТАК¥ТКЬКРТН¥3:К5ТОРКЕЬМС С0Т,МсСЗМ?ЪСМЕоКЛТЗПА0ТТ/\3 37^ТКМЕАТУ?8РЗЕА-Т,НТ ОСРЗЖИЕ РСУЖРХЕИЬПУП ΕΟΚΤΜΚντονΤΤΟΟνΚδΙΕ 75ΜΥνΚΕЕТ,Т 3 5 Ε006Ηζ>7?ΤΤ,ΕΕΟΝ6ΚνκνΕΟΟΝΟΠ5 ЕТРУЕК’ЗГ, О КРО^ТК\ОК1НР03М7Н01АОКМС7ОССЕА03ЪУОКТЙТСРРСРДРЕЬЬаеР8¥РЬЕРРКРКОТЬ М13аТРЕТОаАЛт¥ЗИЕОР£^ЖРт«ТОатеШШАКТКРКЕЕ0¥М5ТУ»’ТО5УЬТУЬНаОИЬМе КЕУКСКУ5ЦКАЬРАР1ЕКТ18КАКЭДРКЕР9УУТЬРР5КО£ЬТКЫ£У81ТСЬУКСЕУРЗЗЭ1АУЕет ЕЗЫбаРЕШУКТТРРУЫЭЗСеЗЕЕЬУЗКЬГГОКЗКИООетУЕ’ЗСЗУЮЕАЫадНУТеКЗЬЗЬЗРе К

Ό. Цепь РК^-Рс (8ЕР ГО N0: 14): (28-аминокислотная последовательность подчеркнута, 18аминокислотный пропептид подчеркнут дважды, часть Рс выделена курсивом) С-терминальный лизин отсутствует в каждой субъединице; этот процессинг часто наблюдается в рекомбинантных белках, продуцируемых в культуре клеток млекопитающих, производится в культуре клеток млекопитающих, а также полученных из плазмы белках.

Субъединица РКРС-8С.

Сигнальный пептид Р^: -46 ΜΟΚΥΝΜΙΜΑΕ 8РОЫТ1СЬЬ ОУЬЬЗАЕС

Пропептид РГС:-¹⁸ Τν^ΡΗΕΝΑΝ ΚΙΣΝΚΡΚΚ

1	УНЗбКЬЕЕГУ	□СКЬЕКЕСМЕ	ЕКС§ ЕЕЕАКЕ	νΕΕΝΤΕΕΤΤΕ	ождуупшо
51	СЕзнрськее	ЗСКОШЫЗУЕ	ШСРРОГЕОК	НСЕЫЭУТСШ	КЫБКСЕОЕСК
101	ЫЗАПЖУУСЗ	ΟΤΕΟΥΚΙΑΕΝ	Окзсерауре	рсскузуз<2Т	ЗКЕТОАКОТ
151	ΡΟνΌΥνΝδΤΕ	ΑΕΤΙΙΙ)ΗΙΤ2	8Τζ23ΡΝΟΓΤΚ	УУССЕОАКРС	ОРРЖЖЬШ
201	КТОАЕС0С51	УКЕКШУТАА	НСТЕТ6УК1Т	УУАСЕНШЕЕ	ТЕНТЕОКККУ
251	ΣΒΙΙΡΗΗΝΥΝ	ΑΑΙΝΚΥΝΗϋΙ	ΑϋΕΕΒΕΡίν	Ш5У¥ТР1С1	мжЕУташъ
301	кнззеэтзот	ешнкзщ	ЬУЬОУЪКТРЬ	ТОВАТСЬКЗТ	кртхтаймгс
351	АСЕЙЕСеКОБ	СОСОЗССРНУ	ТЕшетанл	С118ИСЕЕСА	МКСКУС1УТК
401	νδΚΥνΝΗΙΚΕ	КТКЬТРКГЯТ	СРРСРАРЕЫ,	ΰβΡδνΡΊ,ΡΡΡ	кркртшхзр
451	ЗТЯУТСУУТО	ГЗЯЕДРЕУКГ	Ν1ί9ΥνΡ5νΕνΠ	МЛКЮТВЖЕе	УДЗТУКУУЗУ
501	ЬГУЬДСДЖЯ	шщпгскуэрг	К&ЕРАРХЕКТ	1ЖЫЙ30ИШ	РО^УТХРРЗЯ
551	ввьткадтеь	ТОЛКСГУРЗ	вхдтадаэти	дрЕдадастгр	РУЪОЗРЗЗГР
501	ЬУЖЬТУЕКЯ	вжжагетзс	ЗУМНЕАЫШН	УТОКЗЬЗЬЗР	СК

Цепь Рс (8ЕР ΙΡ №4)

20-аминокислотный гетерологичный сигнальный пептид из цепи мышиного (подчеркнут): -20 МЕТРТ1Х1ЛУУ ЬЫЛУУРОЗТО

Последовательность зрелого Рс (соответствует аминокислотам 221-447 человеческого ^О, нумерация ЕЙ).

1	0К1К1С1ЕСЕ	2 2ЕЫССР5У	Ρ1ΡΡΡΚΡΚΏΤ	ΙΜΙ 3 ΚΙ РЕ VI	СУУУЭТ8НЕО
51	РЕУКЕННУУВ	07Ε7ΠΝΑΚΣΚ	ΕΡΕΕΟΥΝ51Ϊ		0Μ1Ν6ΚΕΥΚ
101	СКУЗНКЖЬРА	РТЕКТТЗКАК	ε0ΕΚΕΡ0¥ΥΤ	АРР5КОЕМК	М178СТСТVI
151	0ΡΪΡ8ΌΙΆ7Ε	ΕΕ,,ΙΚΙ^.ΕΝΕ	ΪΚΙΪ'ΡΡ71Ο5	Γ.Ο3ΡΡ1Υ3Κ1	ΡΊΑΡίϊΑ :
201	N71« 57 МНЕ	Α2ΡΝΙΑΉΕΒ	151,5 РОК

Л8РЛЛРЛРЛ8РЛЛРАР8ЛРЛ { 5ЕР Ιϋ ЛЬ Ϊ 5 ),

ААРА8РАРААР8АРАРААР8 ( ВЕРП) ЛЬ 16), ΑΡ83Ρ8Ρ5ΑΡ88Ρ3ΡΑ3Ρ38 { ВЕРП) ЛЬ П), АР88Р8Р5АР88Р5РА8РЗ ( ВЕРП) ЛЬ 18). 35Р5ЛР5Р55РЛ8Р5Р55РА ί ВЕР Ш ЛЬ 19), ААЗРААР8АРРААА5РААР8АРРА | ВЕРП) ЛЬ 20)« А8АААРААА8ААА8АР5ААА ί ВЕР Н) ЛЬ 21)

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ оптимизации лечения гемофилии у нуждающегося в этом субъекта, представляющего собой человека, включающий:

a) введение дозы химерного полипептида РVШ или РК^ указанному субъекту и

b) измерение активности образования тромбина в образце крови от указанного субъекта в присутствии экзогенного тромбина,

причем активность образования тромбина у указанного субъекта сравнивают с соответствующей

- 52 028914

стандартной кривой, где указанная стандартная кривая коррелирует с терапевтически эффективным лечением, и при этом лечение химерным полипептидом РУШ или ЕК продолжают или изменяют на основании относительной разности между активностью образования тромбина у указанного субъекта и указанной соответствующей стандартной кривой.
2. Способ оптимизации лечения гемофилии у нуждающегося в этом субъекта, представляющего собой человека, включающий:

a) введение дозы химерного полипептида РУШ или ЕК указанному субъекту;

b) измерение активности образования тромбина в образце крови от указанного субъекта в присутствии экзогенного тромбина;

c) сравнение активности образования тромбина у указанного субъекта с соответствующей стандартной кривой, причем указанная стандартная кривая коррелирует с терапевтически эффективным лечением; и

б) продолжение или изменение лечения химерным полипептидом ЕМШ или ЕК на основании относительной разности между активностью образования тромбина у указанного субъекта и указанной соответствующей стандартной кривой.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что экзогенный тромбин присутствует в концентрации, не превышающей приблизительно 90 нМ.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что экзогенный тромбин присутствует в концентрации, не превышающей приблизительно 50 нМ.
5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что экзогенный тромбин присутствует в концентрации, не превышающей приблизительно 10 нМ.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что лечение представляет собой профилактическое лечение.
7. Способ по п.б, отличающийся тем, что указанное профилактическое лечение химерным полипептидом ЕVIII или ЕК характеризуется дозой и интервалом между дозами.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что интервал между дозами химерного полипептида ЕУШ составляет по меньшей мере приблизительно 3 или более дней или интервал между дозами химерного полипептида ЕК составляет по меньшей мере приблизительно б или более дней.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что для химерного полипептида ЕУШ интервал между дозами составляет по меньшей мере приблизительно 3 или более дней, а доза составляет по меньшей мере приблизительно 25-б5 МЕ/кг, или для химерного полипептида ЕК интервал между дозами составляет по меньшей мере приблизительно б или более дней, а доза составляет по меньшей мере приблизительно 20180 МЕ/кг.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанное измерение осуществляют в отсутствие экзогенного тканевого фактора (ТФ); и

при этом указанную стандартную кривую строят посредством:

a) обеспечения по меньшей мере двух эталонных образцов, каждый из которых содержит отличающуюся известную концентрацию эталонного активированного белка ЕК; и

b) измерения активности образования тромбина для каждого из указанных эталонных образцов в присутствии плазмы, лишенной ЕК, или крови, лишенной ЕК, и в присутствии экзогенного тромбина.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанные эталонные образцы содержат от приблизительно 0 пМ до приблизительно 200 пМ или от приблизительно 0 пМ до приблизительно 100 пМ активированного белка ЕК.
12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что экзогенный тромбин присутствует в концентрации, не превышающей приблизительно 40 нМ, не превышающей приблизительно 30 нМ, не превышающей приблизительно 20 нМ или не превышающей приблизительно 10 нМ, или в концентрации, которая составляет от приблизительно 1 нМ до приблизительно 10 нМ или приблизительно 5 нМ.
13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что указанный химерный полипептид ЕУШ или ЕК содержит гетерлогичный компонент.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент включает константную область (Ес) иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, линейную или разветвленную молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ), последовательность РЛ8 и молекулу гидроксиэтилового крахмала (ГЭК) или производные или комбинации указанных молекул.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент включает константную область (Ес) иммуноглобулина.

- 53 028914