JP2007537713A - 第VIII因子及びその誘導体の高発現レベルのための改変されたcDNA - Google Patents

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Abstract

本発明は、生物学的に活性のある組換えヒト第VIII因子及びその誘導体をコードする改変されたDNA配列、このようなDNA配列を含有する組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞及び、組換えヒト第VIII因子及びその誘導体の製造のための方法に関する。本発明はまた、このように改変されたDNA配列を含む、ヒトの遺伝子治療における使用のためのトランスファーベクターを含む。

Description

本発明は、生物学的に活性のある組換えヒト第VIII因子及びその誘導体をコードする改変DNA配列、このようなDNA配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞、及び組換えヒト第VIII因子及びその誘導体の製造のためのプロセスに関する。本発明は、このような改変DNA配列を含むヒト遺伝子治療における使用のためのトランスファーベクターも含む。
古典的な血友病又は血友病Aは、最も一般的な遺伝性の出血疾患である。それは、血液凝固第VIII因子の染色体X−リンク欠陥の結果であり、10,000に1〜2個体の発生率で殆ど排他的に男性に罹患する。X染色体異常は、その人自身は血友病ではない女性のキャリアーから伝達される。血友病Aの臨床症状は、異常な出血傾向であり、第VIII因子濃縮物を用いた治療が導入される前、重篤な血友病を患うヒトの平均寿命は、20年未満であった。血漿からの第VIII因子の濃縮物の使用は、血友病患者にとっての状況を顕著に改善した。平均寿命は幅広く上昇し、殆どの人にほぼ通常の生活を送る可能性を与えた。しかし、血漿由来の濃縮物及びそれらの使用には一定の問題が存在し、その最も重大なものは、ウイルスの伝染である。現在まで、AIDSを引起すウイルス、B型肝炎、及び非A非B型肝炎が人々を深刻に打撃した。異なるウイルスの不活性化方法及び新たな高度に精製された第VIII因子濃縮物が、近年開発されたが、ウイルス汚染がないことの保証はない。また、第VIII因子濃縮物は、限られたヒト血漿原料の供給のために、かなり高価である。
組換え材料に由来する第VIII因子製品は、血友病Aの治療のための血漿由来第VIII因子濃縮物の使用に付随した問題の大部分を解決するであろう。しかし、組換え第VIII因子の開発は、幾つかの困難、例えば、十分に高い収率の生産レベルを達成する問題(特に、完全な長さの分子に関して)に遭遇した。
プロテアーゼ阻害剤の存在下で調整された新鮮な血漿において、第VIII因子は、280kDaの分子量を有し、各々200kDa及び80kDaの2つのポリペプチド鎖から成ることが示された(Andersson, L.−O., et al.(1986) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 83、2979−2983)。これらの鎖は金属イオンブリッジによって共に保持される。幾分タンパク質分解的に分解された形態の第VIII因子の分子が、商業的濃縮物からの精製された第VIII因子材料における活性断片として見られる(EP0197901)。260kDa〜170kDaの分子量を有する断片化された形態の第VIII因子は、180kDa〜90kDaの範囲の分子量を有する1つの重鎖から成り、ここで全てのバリアントは、1つの80kDaの軽鎖と組み合わせて、同一のアミノ末端を有する。重鎖のアミノ末端領域は、第VIII因子のcDNAのヌクレオチド配列データから導き出され得る単一鎖の第VIII因子ポリペプチドのものと同一である(Wood, W.I., et al.(1984) Nature 312 330 − 336; Vehar, G.A., et al.(1984) Nature 312, 337−342)。
1つの90kDa及び1つの80kDa鎖から成る170kDaの分子量を有する第VIII因子の最も小さい活性形態は、トロンビンによってより高い分子量の形態と同程度に活性化され得、従って、非活性化状態を示す。血友病の犬において試験されるように、それは、in vivoで完全な生物学的活性を有することも示された(Brinkhous, K.M., et al.(1985) Proc. Natl. Aca. Scl. USA 82, 8752−8756)。従って、170kDaの形態の止血効果は、第VIII因子の高分子量形態と同一である。
アミノ酸Arg−740とGlu−1649の間に存在する第VIII因子ポリペプチド鎖の中間の大量にグリコシル化された領域が完全な生物学的活性のために必要と思われない事実は、何人かの研究者にこの領域を欠く組換え第VIII因子の誘導体を生産することを試みることを促した。これは、第VIII因子の中間の大量にグリコシル化された領域をコードするcDNAの部分を完全に又は部分的に欠失することによって達成された。
例えば、J.J.Toole等は、アミノ酸982〜1562及び760〜1639を各々欠く第VIII因子の構築及び発現を報告した(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 5939−5942)。D.L.Eaton等は、アミノ酸797〜1562を欠く第VIII因子の構築及び発現を報告した(Biochemistry (1986) 25, 8343−8347)。R.J.Kaufmanは、アミノ酸741〜1646を欠く第VIII因子の発現を記載した(PCT出願番号WO87/04187)。N.Sarver等は、アミノ酸747〜1560を欠く第VIII因子の構築及び発現を報告した(DNA(1987)6, 553−564)。M.Pasekは、アミノ酸745〜1562及びアミノ酸741〜1648を各々欠く第VIII因子の構築及び発現を報告した(PCT出願番号WO88/00831)。K.−D.Langnerは、アミノ酸816〜1598及びアミノ酸741〜1689を各々欠く第VIII因子の構築及び発現を報告した(Behring Inst. Mitt., (1988)No.82, 16−25, EP295597)。P.Meulienらは、アミノ酸868〜1562及びアミノ酸771〜1666を各々欠く第VIII因子の構築及び発現を報告した(Protein Engineering (1988) 2(4), 301−306, EP0303540 A1)。これらの欠失された形態の第VIII因子cDNAを哺乳類細胞で発現すると、生産レベルは、典型的に、完全長の第VIII因子と比較して10倍高い。
さらに、同一の細胞における2つの異なるcDNA誘導体から、別個に90kDa及び80kDaの鎖を発現させる試みがなされた(Burke, R.L., et al. (1986), J. Biol. Chem. 261、12574−12578, Pavirani, A., et al.(1987) Biochem. Biophys. Res. Comm., 145, 234−240)。しかし、このシステムにおいて、in vivoの再構築は、回復した第VIII因子:C活性において有効性が限られているようである。
幾つかの研究は、異なる細胞系における低い第VIII因子の産生レベルを強調した:第VIII因子の生合成は、少なくとも三つの異なるレベルにおいて制御されることが示された。第一に、第VIII因子のcDNA配列中に、A2コーディングドメインに局在する二つのヌクレオチドストレッチは、転写サイレンサーとして働くことが実証された(Fallaux et al., 1996; Hoeben et al., 1995; Koeberl et al., 1995; Lynch et al., 1993)。第二に、第VIII因子タンパク質合成は、幾つかの小胞体シャペロンによって厳密に制御されている(BIP; Calreticulin; Calnexin; ERGIC−53)。これらの相互作用の多くは、第VIII因子を細胞中に残し、細胞分解機構中を通らせる(Dorner et al., 1987; Nichols et al., 1998; Pipe et al., 1998)。第三に、一度分泌された第VIII因子は、プロテアーゼ分解に敏感であり、フォンビルブラント因子(vWF)によって保護される必要がある(Kaufman et al., 1989)。従って、結果としてより高い収率の第VIII因子を生じる改良された方法を開発することが問題である。本発明は、改変された第VIII因子cDNAによるこの問題に対する解決策を提供する。
EP1038959、EP1048726、EP1231220、EP1233064、EP1283263及びEP1284290は、ゲノム第VIII因子のイントロン1及び13の位置に対応するcDNAの位置で切断された(truncated)FIXイントロンI又は他のイントロンのようなスプライシング可能なヌクレオチド配列の導入が第VIII因子の発現レベルを劇的に上昇し得ることを記載する。
EP0260148は、プロテイン様の第VIII因子のコーディング配列の上流にイントロン導入することは、異種の発現システムにおける発現レベルも上昇し得ることを記載する。EP0874057は、それ自体が第VIII因子のように発現されるタンパク質をコードする配列の上流であるイントロンの上流に第二のイントロンドナー配列を導入することによる発現レベルの更なる改善を記載する。
本発明は、組換え第VIII因子又はその誘導体の薬学的調製物のための工業的プロセスにおいて使用され得る従来技術と比較して第VIII因子の発現量のさらなる増加を結果生じる第VIII因子cDNAを記載する。
本発明は、第VIII因子cDNAの1及び13の位置(ゲノムFVIIIクローンにおける対応するイントロンの位置を示す)におけるスプライシング可能なヌクレオチド配列と第VIII因子のコーディング配列の上流のスプライシング可能な配列を組み合わせることによって、EP1038959、EP1048726、EP1231220、EP1233064、EP1283263、EP1284290、及びEP0260148と比較して、FVIII(完全長因子並びに欠失突然変異体及び誘導体)の発現レベルを更に増加することが可能であるという驚くべき発見に基づく。
本発明に従って、このような第VIII因子cDNAは、第VIII因子のゲノムDNAのイントロン1及び13の位置において1つ以上のスプライシング可能なヌクレオチド配列(又は、核からのプレ−mRNAの輸送時にスプライシングされるヌクレオチド配列)が挿入されるように改変される。
特に、第VIII因子のゲノムDNAのイントロン1及び13の位置に1つ以上の完全な又な切断されたイントロン或いはスプライシングされる能力を保持した1つ以上の合成イントロンが挿入されると、第VIII因子の発現レベルは、EP1038959、EP1048726、EP1231220、EP1233064、EP1283263及びEP1284290に記載されるように顕著に増加する。
本発明に従って、このような第VIII因子cDNAは、プロモーターの下流且つ第VIII因子のコーディング配列の上流にスプライシング可能なヌクレオチド配列を導入することによって更に改変され得る。
本発明の更なる目的は、第VIII因子及びその誘導体の発現レベルを、野生型の第VIII因子cDNAのB−ドメインが短縮され若しくは完全に除かれた改変第VIII因子cDNAの使用によって、向上することである。
好ましくは、ヒト第VIII因子のアミノ酸1〜740をコードする第一DNAセグメント及びヒト第VIII因子のアミノ酸1649〜2332をコードする第二DNAセグメントを含む、改変第VIII因子cDNAが使用される。これら2つのセグメントは、国際特許出願WO92/16557において記載されるように、好ましくは、リシン又はアルギニンから選択される少なくとも二つのアミノ酸のリンカーペプチドをコードするリンカーDNAセグメントによって相互に連結され得る。
適した宿主細胞における高レベルの第VIII因子の産生は、効率的な転写ユニット中への上記の改変第VIII因子DNAのアセンブリ及び、当業者に公知の方法に従ってE.coli中で増殖され得る、組換え発現ベクター中の適切な制御エレメントを必要とする。効率的な転写制御エレメントは、動物細胞を天然の宿主として有するウイルス又は動物細胞の染色体DNAに由来し得る。好ましくは、シミアンウイルス40、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、又はラウス肉腫ウイルスの長い末端反復由来のプロモータ−エンハンサの組合せ、或いはベータアクチン又はGRP78のような動物細胞中で強く恒常的に転写される遺伝子を含むプロモータ−エンハンサの組合せが使用され得る。第VIII因子のDNAから転写されるmRNAの安定な高レベルを達成するために、転写ユニットは、その3’近位部分に転写終結ポリアデニル化配列をコードするDNA領域を含むべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイスル40の初期転写領域、ウサギのベータグロビン遺伝子またはヒト組織プラスミノゲンアクチベータ遺伝子に由来する。
従って、第VIII因子cDNAは、効率的な組換え発現ベクター中にアセンブル化され、次いで第VIII因子タンパク質の発現のために適した宿主細胞系中に導入される。好ましくは、この細胞系は、正しい折りたたみ、ジスルフィド結合の形成、アスパラギンで連結されたグリコシル化及び他の翻訳後修飾、並びに培養培地中への分泌を確実にするために、脊椎動物起源の動物細胞系である。他の翻訳後改変の例は、チロシンO−硫酸化、及び新生ポリペプチド鎖のタンパク質分解プロセシングである。使用され得る細胞系の例は、サルCOS−細胞、マウスL−細胞、マウスC127−細胞、ハムスターBHK−21細胞、ヒト胎児腎293細胞及び、好ましくはCHO細胞である。
第VIII因子をコードする組換え発現ベクターは、幾つかの異なる方法で動物細胞系中に導入され得る。例えば、組換え発現ベクターは、異なる動物ウイルスに基づいて、ベクターから作られ得る。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及び好ましくはウシパピローマウイルスに基づくベクターである。
第VIII因子をコードする転写ユニットはまた、他の組換え遺伝子と共に動物細胞中に導入され得、これは、ゲノム中に組換えDNAを取り込んだ特定の細胞クローンの単離を促進するためのこれらの細胞におけるドミナント選択マーカーとして機能し得る。このタイプのドミナント選択マーカー遺伝子の例は、ゲネテシン(Geneticin)(G418)に対する抵抗性を付与するTn5アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシンに対する抵抗性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、第VIII因子のcDNAをコードするものと同一のベクター上に存在し得、又はそれは、宿主細胞のゲノム中に同時に導入され且つ取り込まれる別個のベクター上にコードされ得、頻繁に異なる転写ユニット間の密な物理的結合を結果生じる。
第VIII因子のcDNAと共に使用され得る他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)をコードする種々の転写ユニットに基づく。内因性のdhfr活性を欠く細胞中(好ましくは、CHO−細胞(DUKX−B11,DG−44)へのこのタイプの遺伝子の導入の後、それは、ヌクレオシドを欠く培地中でこれらが生育することを可能にする。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジン、及びグリシンのないHam‘sF12である。これらdhfr遺伝子は、第VIII因子cDNAの転写ユニットと共に、上記のタイプのCHO−細胞中に、同一のベクター又は異なるベクター上に連結されて導入され得、従って、組換え第VIII因子タンパク質を産生するdhfr陽性の細胞系を作る。
細胞毒性のdhfr阻害剤であるメトトレキセートの存在下で上記の細胞系が成育する場合、メトトレキセートに対して抵抗性のある新たな細胞系が出現する。これらの細胞系は、増幅した数の連結したdhfr及び第VIII因子転写ユニットに起因して、上昇した速度で組換え第VIII因子タンパク質を産生し得る。メトトレキセートの濃度を上昇させてこれらの細胞系を増殖させれば(1〜10000nM)、非常に高速度で第VIII因子タンパク質を産生する新たな細胞系を得ることができる。
第VIII因子タンパク質を産生する上記の細胞系は、大規模(懸濁培養において又は種々の固体支持体上で)においても増殖し得る。これら支持体の例は、デキストラン若しくはコラーゲンのマトリクス上のミクロキャリア、又は中空糸若しくは種々のセラミック材料の形態の固体支持体である。懸濁培養又はミクロキャリアにおいて生育する場合、上記の細胞系の培養は、バス培養(bath culture)として又は長期間のコンディションドメディウムの連続的な生産を伴う灌流培養として実施され得る。従って、本発明に従って、上記の細胞系は、人の血漿から単離され得る組換え第VIII因子の生産のための工業的プロセスの開発のために十分に適している。
上記のタイプのCHO細胞の培地中で蓄積する組換え第VIII因子タンパク質は、濃縮され、そして細胞培養培地中の組換え第VIII因子タンパク質と他の物質間のサイズ、電荷、疎水性、溶解度、特定の親和性等の違いを利用する方法を含む種々の生化学的な方法によって精製され得る。
このような精製の例は、固体の支持体上に固定化されたモノクローナル抗体への組換え第VIII因子タンパク質の吸着である。脱着後、その第VIII因子タンパク質は、上記の性質に基づく種々のクロマトグラフィー技術によってさらに精製され得る。
本発明において記載される第VIII因子活性を有する組換えタンパク質は、治療用途のための薬学的製剤に配合され得る。精製された第VIII因子タンパク質は、従来の生理学的に適合性のある水性バッファー溶液(必要に応じて、薬学的製剤を提供するために、薬学的補助剤を添加し得る)中に溶解され得る。
本発明の改変された第VIII因子のDNAはまた、ヒトの遺伝子治療における使用のためのトランスファーベクター中に組み込まれ得る。
本発明は、以下の実施例においてより詳細に更に説明される。本発明の特別な実施形態のこの説明は、添付の図面と併せてなされる。
実施例1:1及び13の位置における切断されたFIXイントロンを含むFVIII cDNAの5’末端におけるイントロンの追加効果
1.1 pD−L2ベクターの生成
全ての第VIII因子コンストラクトは、pcDNA3.1ベクター(pD)(Invitrogen, Leek オランダ国)中に挿入された。
PD−FVIII−L2(又はpD−L2)及びpD−FVIII−L2l1+13(又はpD−L2−2l)は、以前に説明されるコンストラクトを突然変異誘発することによって得られた(pD−FVIII−L0−l1+13又はpD−L0−2l)(Plantier, J. L., Rodriguez, M.H., Enjolras, N., Attali, O., and Negrier, C. (2001) Thromb Haemost 86, 596−603)。
pD−L2−2lは、StratageneからのQuickchangeキットを使用し、製造者の指示書に従って、pD−L0−2lを突然変異させて得た。突然変異された配列の一部は、シークエンシングによって制御され、pD−L0−2l骨格中に再導入され、pD−L2−2lベクターを作った。オリゴヌクレオチドFVIII−L2−2l−S及びFVIII−L2−2l−ASは、突然変異誘発のために使用された(表I参照)。生成されたタンパク質の間の違いがB−ドメインにおいて存在し、リンカーを置換し、これは、L0についてR740−R−R−R−1649そしてL2についてR740−R−R−G−G−R−R−である。
イントロンのないpD−L2を作成するために、AatII制限部位がpD−L0(イントロンがない)において生成され、L0−newを作製した。フラグメントはオリゴヌクレオチドFVIII−N538−S及びFVIII−L0−New−ASを用いて増幅され(表Iを参照)、pCRII−Topoベクター(InVitrogen)中にクローニングされた。AatII部位は、コーディング配列を改変しなかった。フラグメントの完全なシークエンシングに従って、BgI II−Sal Iフラグメントが除去され、同一の酵素によって開裂されたpKS−L0中に挿入され、pKS−L0−newを作製した。FVIIIのNot l−Aat II断片は、除去され、ベクターpKS−L2−2l中に再挿入され、イントロンのないpD−L2を作製した。
Figure 2007537713
1.2 FVIII−L2 cDNAの5’におけるβ−グロビンイントロン2の挿入
ウサギのβ−グロビンイントロン2を含むpSG5−プラスミドがPCRのためのマトリクスとして使用された。β−グロビンイントロン2DNAフラグメントは増幅され、NheI及びNotI部位によって囲まれ、オリゴヌクレオチドβ−Glob−NheI−S及びβ−Glob−NotI−ASによってもたらされた。該フラグメントは、両酵素によって消化され、同一酵素によって開裂されたpD−L2又はpD−L2−2l中に挿入された。フラグメントの配列は、シークエンシングによって制御された。
Figure 2007537713
1.3 細胞培養条件
CHO及びCOS−1細胞は、ECACC(Sigma, L’lse d’Abeau, フランス国)から得た。HEK−293及びHKB−11細胞は、LGC Promochem (Molsheim, France)フランスのATCC配給業者から得た。全ての細胞培養試薬(培地、抗生物質、添加物及び血清)は、InVitrogen(Cergy Pontoise,フランス国)からである。細胞は、5%COの加湿されたインキュベータ中で37℃でインキュベートされた。CHO及びCOS−1細胞は、10%ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン及び1%ペニストレプトマイシン(penistreptomycin)を添加されたIMDM培地において増殖された。HEK−293細胞は、10%ウシ胎児血清、1%NEAA、2mM L−グルタミン及び1%ペニストレプトマイシンが添加されたEMEM培地中で増殖された。HKB−11細胞は、2.5%のウシ胎児血清、2%HAT、2mM L−グルタミン及び1%ペニストレプトマイシンが添加されたRPMI培地中で増殖された。
1.4 トランスフェクション条件
5.10細胞(又は、HEK−293について1×10)が、9.5cmのディッシュ中にプレーティングされた。一日後、細胞は、製造者の推奨に従って5μlのFuGENE−6試薬でプレコンプレックスされた1μgのDNAと共に6時間インキュベートされた。次いで、新たな培地が添加された。
トランスフェクション後48時間で、細胞ディッシュは、PBSで3回洗浄された。細胞は次いで、1%BSAを含むSVFの無い培地中で6時間インキュベートされた。
1.5 第VIII因子発現の分析
FVIII抗原の濃度は、ELISAキット(Asserachrom FVIII, Stago, Asnieres,フランス国)を用いて、細胞コンディションドメディウム中で測定された。
活性は、Coamaticキット(Chromogenix,ミラノ、イタリア国)を用いて、製造者の推奨に従って制御された。活性は、2〜8ng/mlの範囲で測定された。2つの希釈が各々のサンプルについて分析された。
1.6 結果
続くコンストラクトは、異なる細胞系においてFuGENE−6を用いてトランスフェクトされた:pD−FVIII−L2(イントロンの無いL2)、pD−FVIII−L2−5’(5’におけるβ−グロビンイントロンを有する5’I)、pD−L2−2l(1及び13の位置においてTFIXI1を有する2l)及びpD−L2−3l(5’におけるβ−グロビンイントロン2及び1及び13の位置におけるTFIXI1を有する3l)。ネガティブコントロールとして、トランスフェクトされていない細胞が等しく処理された。トランスフェクション後2日で、細胞は、1%BSAを含むIMDM中で6時間インキュベートされた。この間に産生されたFVIIIの量は、ELISAを用いて定量化された。
二つの独立したトランスフェクションがCHO細胞において行われた(図1)。イントロンの無いコンストラクトから産生されたFVIIIの割合は、基礎レベルとして使用された。結果は、この基礎レベルと比較したFVIII生産における増加のパーセンテージとして示される。
同一の実験が、COS−7細胞において(図2)、HKB−11細胞において(図3)及びHEK−293細胞において(図4)反復された(但し、後の2セットの結果については、3回のトランスフェクションが実施された)。
イントロンの無いコンストラクトと比較したFVIII産生における増加の一覧は、以下の表に示される。評価された4つの細胞系からの結果が示される。
Figure 2007537713
イントロンを含む全てのコンストラクトは、全ての細胞系において、イントロンを有さないコンストラクトよりも顕著に高い第VIII因子の発現へと導く。FVIII配列中の2つのイントロンか、又は5’位における特有のイントロンを有するコンストラクトは、同様のレベルの産生を与えるが、5’イントロンを有するクローンについて幾分優れた発現レベルを与える。
これに対し、3イントロンコンストラクト(5’イントロン及び第VIII因子ゲノムDNAの1及び13のイントロン位置におけるイントロンを含む)は、一貫して全ての細胞系中で最も高い発現レベルへと導くコンストラクトであった。発現収率における増加は、細胞系に依存して、5’イントロンクローンと比較して20〜42%、1+13イントロンクローンと比較して40〜67%であった。従って、このコンストラクトは、FVIIIを発現するための現在の技術を改善するために重要である。
CHO細胞における、pD−FVIII−L2、pD−FVIII−L2−5’、pD−L2−2l及びpH−L2−3lの発現 COS−7細胞における、pD−FVIII−L2、pD−FVIII−L2−5’、pD−L2−2l及びpD−L2−3lの発現 HKB−11細胞における、pD−FVIII−L2、pD−FVIII−L2−5’、pD−L2−2l及びpD−L2−3lの発現 HEK−293細胞における、pD−FVIII−L2、pD−FVIII−L2−5’、pD−L2−2l及びpD−L2−3lの発現
配列番号1は、オリゴヌクレオチドFVIII−L2−2I−Sである。
配列番号2は、オリゴヌクレオチドFVIII−L2−2I−ASである。
配列番号3は、オリゴヌクレオチドFVIII−N538−Sである。
配列番号4は、オリゴヌクレオチドFVIII−L0−New−ASである。
配列番号5は、オリゴヌクレオチドb−GIob−NheI−Sである。
配列番号6は、オリゴヌクレオチドb−GIob−NotI−ASである。
配列番号7は、オリゴヌクレオチドF8/AG−kozak.Sである。
配列番号8は、オリゴヌクレオチドF8/ATG−kozak.ASである。

Claims (16)

  1. ゲノム第VIII因子配列のイントロン1と13が挿入される位置において、第VIII因子のcDNAはまた、1つ以上のスプライシング可能なヌクレオチド配列、又はプレ−mRNAの核からの輸送時にスプライシングされるヌクレオチド配列、さらにプロモーター配列の下流且つ改変された第VIII因子cDNAの上流に挿入された別のスプライシング可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、改変第VIII因子のcDNA。
  2. ゲノム第VIII因子配列のイントロン位置1及び/又は13において1つ以上の完全な又は切断されたイントロンが挿入されたことを特徴とする、請求項1に記載の改変された第VIII因子のcDNA。
  3. ゲノム第VIII因子配列のイントロン位置1及び/又は13において、スプライシングされる能力を保持する1つ以上の天然又は合成の核酸配列が挿入されたことを特徴とする、請求項1に記載の改変された第VIII因子のcDNA。
  4. ゲノム第VIII因子配列のイントロン位置1及び13において切断されたFIXイントロンIが挿入されたことを特徴とする、請求項1に記載の改変された第VIII因子のcDNA。
  5. プロモーターの下流且つFVIIIコーディング配列の上流において、1つの完全な又は切断されたイントロンが挿入されたことを特徴とする、請求項1に記載の改変された第VIII因子のcDNA。
  6. プロモーターの下流且つFVIIIコーディング配列の上流において、スプライシングされる能力を保持する1つの天然又は合成の核酸配列が挿入されたことを特徴とする、請求項1に記載の改変された第VIII因子のcDNA。
  7. プロモーターの下流且つFVIIIコーディング配列の上流においてβ−グロビンイントロン2が挿入されたことを特徴とする、請求項1に記載の改変された第VIII因子のcDNA。
  8. ヒト第VIII因子のアミノ酸1〜740をコードする第一DNAセグメントとヒト第VIII因子のアミノ酸1649〜2332をコードする第二DNAセグメントを含み、前記セグメントがリシン及びアルギニンから選択される少なくとも二つのアミノ酸のリンカーペプチドをコードするリンカーDNAセグメントによって相互に連結されていることを特徴とする、請求項1又は4に記載の改変された第VIII因子のcDNA。
  9. 請求項1〜5の改変された第VIII因子のcDNA配列を含む転写ユニット、転写プロモーター及びポリアデニル化配列を含有する組換え発現ベクター。
  10. 請求項9の組換え発現ベクターを用いて形質転換された動物由来の宿主細胞系。
  11. 生物学的活性のある組換えヒト第VIII因子又はその誘導体の製造方法であって、前記製造は請求項10の動物細胞系をヒト第VIII因子またはその誘導体の発現及び分泌を可能にする栄養培地中で培養し、前記発現産物を該培養培地から回収することによって実施されることを特徴とする、方法。
  12. 請求項11の方法によって調製されるヒト第VIII因子又はその誘導体。
  13. 請求項12に記載される第VIII因子を含有する薬学的組成物。
  14. 請求項1〜5に記載の改変された第VIII因子のcDNAを含むことを特徴とする、ヒト遺伝子治療における使用のためのトランスファーベクター。
  15. それがヒトの細胞であることを特徴とする、請求項10の宿主細胞。
  16. 該細胞が人体中にあることを特徴とする、請求項15に記載の宿主細胞。

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2573027T3 (es) * 2006-05-17 2016-06-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Células productoras de polipéptido
FR2913020B1 (fr) 2007-02-23 2012-11-23 Biomethodes Nouveaux facteurs viii pour le traitement des hemophiles de type a
TWI791433B (zh) 2016-04-15 2023-02-11 賓州大學委員會 治療a型血友病之基因治療
CN109790214B (zh) 2016-09-29 2022-09-06 豪夫迈·罗氏有限公司 用于选择产生多肽的细胞的改进方法
CN109507435A (zh) * 2018-11-23 2019-03-22 重庆医科大学 Grp78蛋白双抗夹心elisa法检测试剂盒及其检测方法
GB202108855D0 (en) * 2021-06-21 2021-08-04 Cambridge Entpr Ltd Methods of eukaryotic gene expression

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63152986A (ja) * 1986-09-12 1988-06-25 ジェネンテク,インコーポレイテッド 改良型の組換え発現
JPH06343476A (ja) * 1993-06-10 1994-12-20 Miles Inc 改良された生産性を有するベクターおよび哺乳動物細胞系
EP1048726A2 (en) * 1999-04-27 2000-11-02 Centeon Pharma GmbH Modified factor VIII cDNA
JP2003070491A (ja) * 2001-08-08 2003-03-11 Aventis Behring Gmbh 第VIII因子およびその誘導体の高発現レベル改変cDNA

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1038959A1 (en) * 1999-03-17 2000-09-27 Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung Factor VIII without B-domain, comprising one or more insertions of a truncated intron I of factor IX
EP1233064A1 (en) * 2001-02-09 2002-08-21 Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung Modified factor VIII cDNA and its use for the production of factor VIII
EP1283263A1 (en) * 2001-08-08 2003-02-12 Aventis Behring GmbH Modified cDNA for high expression levels of factor VIII and its derivatives

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63152986A (ja) * 1986-09-12 1988-06-25 ジェネンテク,インコーポレイテッド 改良型の組換え発現
JPH06343476A (ja) * 1993-06-10 1994-12-20 Miles Inc 改良された生産性を有するベクターおよび哺乳動物細胞系
EP1048726A2 (en) * 1999-04-27 2000-11-02 Centeon Pharma GmbH Modified factor VIII cDNA
JP2003070491A (ja) * 2001-08-08 2003-03-11 Aventis Behring Gmbh 第VIII因子およびその誘導体の高発現レベル改変cDNA

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