JP4804356B2 - 第ＶＩＩＩ因子及びその誘導体の高発現レベルのための改変されたｃＤＮＡ - Google Patents

Description

本発明は、生物学的に活性のある組換えヒト第ＶＩＩＩ因子及びその誘導体をコードする改変ＤＮＡ配列、このようなＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞、及び組換えヒト第ＶＩＩＩ因子及びその誘導体の製造のためのプロセスに関する。本発明は、このような改変ＤＮＡ配列を含むヒト遺伝子治療における使用のためのトランスファーベクターも含む。

古典的な血友病又は血友病Ａは、最も一般的な遺伝性の出血疾患である。それは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の染色体Ｘ−リンク欠陥の結果であり、１０，０００に１〜２個体の発生率で殆ど排他的に男性に罹患する。Ｘ染色体異常は、その人自身は血友病ではない女性のキャリアーから伝達される。血友病Ａの臨床症状は、異常な出血傾向であり、第ＶＩＩＩ因子濃縮物を用いた治療が導入される前、重篤な血友病を患うヒトの平均寿命は、２０年未満であった。血漿からの第ＶＩＩＩ因子の濃縮物の使用は、血友病患者にとっての状況を顕著に改善した。平均寿命は幅広く上昇し、殆どの人にほぼ通常の生活を送る可能性を与えた。しかし、血漿由来の濃縮物及びそれらの使用には一定の問題が存在し、その最も重大なものは、ウイルスの伝染である。現在まで、ＡＩＤＳを引起すウイルス、Ｂ型肝炎、及び非Ａ非Ｂ型肝炎が人々を深刻に打撃した。異なるウイルスの不活性化方法及び新たな高度に精製された第ＶＩＩＩ因子濃縮物が、近年開発されたが、ウイルス汚染がないことの保証はない。また、第ＶＩＩＩ因子濃縮物は、限られたヒト血漿原料の供給のために、かなり高価である。

組換え材料に由来する第ＶＩＩＩ因子製品は、血友病Ａの治療のための血漿由来第ＶＩＩＩ因子濃縮物の使用に付随した問題の大部分を解決するであろう。しかし、組換え第ＶＩＩＩ因子の開発は、幾つかの困難、例えば、十分に高い収率の生産レベルを達成する問題（特に、完全な長さの分子に関して）に遭遇した。

プロテアーゼ阻害剤の存在下で調整された新鮮な血漿において、第ＶＩＩＩ因子は、２８０ｋＤａの分子量を有し、各々２００ｋＤａ及び８０ｋＤａの２つのポリペプチド鎖から成ることが示された（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｌ．−Ｏ．， ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３、２９７９−２９８３）。これらの鎖は金属イオンブリッジによって共に保持される。幾分タンパク質分解的に分解された形態の第ＶＩＩＩ因子の分子が、商業的濃縮物からの精製された第ＶＩＩＩ因子材料における活性断片として見られる（ＥＰ０１９７９０１）。２６０ｋＤａ〜１７０ｋＤａの分子量を有する断片化された形態の第ＶＩＩＩ因子は、１８０ｋＤａ〜９０ｋＤａの範囲の分子量を有する１つの重鎖から成り、ここで全てのバリアントは、１つの８０ｋＤａの軽鎖と組み合わせて、同一のアミノ末端を有する。重鎖のアミノ末端領域は、第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列データから導き出され得る単一鎖の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのものと同一である（Ｗｏｏｄ， Ｗ．Ｉ．， ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２ ３３０ − ３３６； Ｖｅｈａｒ， Ｇ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２， ３３７−３４２）。

１つの９０ｋＤａ及び１つの８０ｋＤａ鎖から成る１７０ｋＤａの分子量を有する第ＶＩＩＩ因子の最も小さい活性形態は、トロンビンによってより高い分子量の形態と同程度に活性化され得、従って、非活性化状態を示す。血友病の犬において試験されるように、それは、in vivoで完全な生物学的活性を有することも示された（Ｂｒｉｎｋｈｏｕｓ， Ｋ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ． Ｓｃｌ． ＵＳＡ ８２， ８７５２−８７５６）。従って、１７０ｋＤａの形態の止血効果は、第ＶＩＩＩ因子の高分子量形態と同一である。

アミノ酸Ａｒｇ−７４０とＧｌｕ−１６４９の間に存在する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド鎖の中間の大量にグリコシル化された領域が完全な生物学的活性のために必要と思われない事実は、何人かの研究者にこの領域を欠く組換え第ＶＩＩＩ因子の誘導体を生産することを試みることを促した。これは、第ＶＩＩＩ因子の中間の大量にグリコシル化された領域をコードするｃＤＮＡの部分を完全に又は部分的に欠失することによって達成された。

例えば、Ｊ．Ｊ．Ｔｏｏｌｅ等は、アミノ酸９８２〜１５６２及び７６０〜１６３９を各々欠く第ＶＩＩＩ因子の構築及び発現を報告した（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８６） ８３， ５９３９−５９４２）。Ｄ．Ｌ．Ｅａｔｏｎ等は、アミノ酸７９７〜１５６２を欠く第ＶＩＩＩ因子の構築及び発現を報告した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９８６） ２５， ８３４３−８３４７）。Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎは、アミノ酸７４１〜１６４６を欠く第ＶＩＩＩ因子の発現を記載した（ＰＣＴ出願番号ＷＯ８７／０４１８７）。Ｎ．Ｓａｒｖｅｒ等は、アミノ酸７４７〜１５６０を欠く第ＶＩＩＩ因子の構築及び発現を報告した（ＤＮＡ（１９８７）６， ５５３−５６４）。Ｍ．Ｐａｓｅｋは、アミノ酸７４５〜１５６２及びアミノ酸７４１〜１６４８を各々欠く第ＶＩＩＩ因子の構築及び発現を報告した（ＰＣＴ出願番号ＷＯ８８／００８３１）。Ｋ．−Ｄ．Ｌａｎｇｎｅｒは、アミノ酸８１６〜１５９８及びアミノ酸７４１〜１６８９を各々欠く第ＶＩＩＩ因子の構築及び発現を報告した（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ．， （１９８８）Ｎｏ．８２， １６−２５， ＥＰ２９５５９７）。Ｐ．Ｍｅｕｌｉｅｎらは、アミノ酸８６８〜１５６２及びアミノ酸７７１〜１６６６を各々欠く第ＶＩＩＩ因子の構築及び発現を報告した（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （１９８８） ２（４）， ３０１−３０６， ＥＰ０３０３５４０ Ａ１）。これらの欠失された形態の第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを哺乳類細胞で発現すると、生産レベルは、典型的に、完全長の第ＶＩＩＩ因子と比較して１０倍高い。

さらに、同一の細胞における２つの異なるｃＤＮＡ誘導体から、別個に９０ｋＤａ及び８０ｋＤａの鎖を発現させる試みがなされた（Ｂｕｒｋｅ， Ｒ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （１９８６）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１、１２５７４−１２５７８， Ｐａｖｉｒａｎｉ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １４５， ２３４−２４０）。しかし、このシステムにおいて、in vivoの再構築は、回復した第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性において有効性が限られているようである。

幾つかの研究は、異なる細胞系における低い第ＶＩＩＩ因子の産生レベルを強調した：第ＶＩＩＩ因子の生合成は、少なくとも三つの異なるレベルにおいて制御されることが示された。第一に、第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ配列中に、Ａ２コーディングドメインに局在する二つのヌクレオチドストレッチは、転写サイレンサーとして働くことが実証された（Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｈｏｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｋｏｅｂｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。第二に、第ＶＩＩＩ因子タンパク質合成は、幾つかの小胞体シャペロンによって厳密に制御されている（ＢＩＰ； Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ； Ｃａｌｎｅｘｉｎ； ＥＲＧＩＣ−５３）。これらの相互作用の多くは、第ＶＩＩＩ因子を細胞中に残し、細胞分解機構中を通らせる（Ｄｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７； Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｐｉｐｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。第三に、一度分泌された第ＶＩＩＩ因子は、プロテアーゼ分解に敏感であり、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）によって保護される必要がある（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。従って、結果としてより高い収率の第ＶＩＩＩ因子を生じる改良された方法を開発することが問題である。本発明は、改変された第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡによるこの問題に対する解決策を提供する。

ＥＰ１０３８９５９、ＥＰ１０４８７２６、ＥＰ１２３１２２０、ＥＰ１２３３０６４、ＥＰ１２８３２６３及びＥＰ１２８４２９０は、ゲノム第ＶＩＩＩ因子のイントロン１及び１３の位置に対応するｃＤＮＡの位置で切断された(truncated)ＦＩＸイントロンＩ又は他のイントロンのようなスプライシング可能なヌクレオチド配列の導入が第ＶＩＩＩ因子の発現レベルを劇的に上昇し得ることを記載する。

ＥＰ０２６０１４８は、プロテイン様の第ＶＩＩＩ因子のコーディング配列の上流にイントロン導入することは、異種の発現システムにおける発現レベルも上昇し得ることを記載する。ＥＰ０８７４０５７は、それ自体が第ＶＩＩＩ因子のように発現されるタンパク質をコードする配列の上流であるイントロンの上流に第二のイントロンドナー配列を導入することによる発現レベルの更なる改善を記載する。

本発明は、組換え第ＶＩＩＩ因子又はその誘導体の薬学的調製物のための工業的プロセスにおいて使用され得る従来技術と比較して第ＶＩＩＩ因子の発現量のさらなる増加を結果生じる第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを記載する。

本発明は、第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの１及び１３の位置（ゲノムＦＶＩＩＩクローンにおける対応するイントロンの位置を示す）におけるスプライシング可能なヌクレオチド配列と第ＶＩＩＩ因子のコーディング配列の上流のスプライシング可能な配列を組み合わせることによって、ＥＰ１０３８９５９、ＥＰ１０４８７２６、ＥＰ１２３１２２０、ＥＰ１２３３０６４、ＥＰ１２８３２６３、ＥＰ１２８４２９０、及びＥＰ０２６０１４８と比較して、ＦＶＩＩＩ（完全長因子並びに欠失突然変異体及び誘導体）の発現レベルを更に増加することが可能であるという驚くべき発見に基づく。

本発明に従って、このような第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡは、第ＶＩＩＩ因子のゲノムＤＮＡのイントロン１及び１３の位置において１つ以上のスプライシング可能なヌクレオチド配列（又は、核からのプレ−ｍＲＮＡの輸送時にスプライシングされるヌクレオチド配列）が挿入されるように改変される。

特に、第ＶＩＩＩ因子のゲノムＤＮＡのイントロン１及び１３の位置に１つ以上の完全な又な切断されたイントロン或いはスプライシングされる能力を保持した１つ以上の合成イントロンが挿入されると、第ＶＩＩＩ因子の発現レベルは、ＥＰ１０３８９５９、ＥＰ１０４８７２６、ＥＰ１２３１２２０、ＥＰ１２３３０６４、ＥＰ１２８３２６３及びＥＰ１２８４２９０に記載されるように顕著に増加する。

本発明に従って、このような第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡは、プロモーターの下流且つ第ＶＩＩＩ因子のコーディング配列の上流にスプライシング可能なヌクレオチド配列を導入することによって更に改変され得る。

本発明の更なる目的は、第ＶＩＩＩ因子及びその誘導体の発現レベルを、野生型の第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのＢ−ドメインが短縮され若しくは完全に除かれた改変第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの使用によって、向上することである。

好ましくは、ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１〜７４０をコードする第一ＤＮＡセグメント及びヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１６４９〜２３３２をコードする第二ＤＮＡセグメントを含む、改変第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡが使用される。これら２つのセグメントは、国際特許出願ＷＯ９２／１６５５７において記載されるように、好ましくは、リシン又はアルギニンから選択される少なくとも二つのアミノ酸のリンカーペプチドをコードするリンカーＤＮＡセグメントによって相互に連結され得る。

適した宿主細胞における高レベルの第ＶＩＩＩ因子の産生は、効率的な転写ユニット中への上記の改変第ＶＩＩＩ因子ＤＮＡのアセンブリ及び、当業者に公知の方法に従ってＥ．ｃｏｌｉ中で増殖され得る、組換え発現ベクター中の適切な制御エレメントを必要とする。効率的な転写制御エレメントは、動物細胞を天然の宿主として有するウイルス又は動物細胞の染色体ＤＮＡに由来し得る。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、又はラウス肉腫ウイルスの長い末端反復由来のプロモータ−エンハンサの組合せ、或いはベータアクチン又はＧＲＰ７８のような動物細胞中で強く恒常的に転写される遺伝子を含むプロモータ−エンハンサの組合せが使用され得る。第ＶＩＩＩ因子のＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの安定な高レベルを達成するために、転写ユニットは、その３’近位部分に転写終結ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含むべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイスル４０の初期転写領域、ウサギのベータグロビン遺伝子またはヒト組織プラスミノゲンアクチベータ遺伝子に由来する。

従って、第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡは、効率的な組換え発現ベクター中にアセンブル化され、次いで第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現のために適した宿主細胞系中に導入される。好ましくは、この細胞系は、正しい折りたたみ、ジスルフィド結合の形成、アスパラギンで連結されたグリコシル化及び他の翻訳後修飾、並びに培養培地中への分泌を確実にするために、脊椎動物起源の動物細胞系である。他の翻訳後改変の例は、チロシンＯ−硫酸化、及び新生ポリペプチド鎖のタンパク質分解プロセシングである。使用され得る細胞系の例は、サルＣＯＳ−細胞、マウスＬ−細胞、マウスＣ１２７−細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胎児腎２９３細胞及び、好ましくはＣＨＯ細胞である。

第ＶＩＩＩ因子をコードする組換え発現ベクターは、幾つかの異なる方法で動物細胞系中に導入され得る。例えば、組換え発現ベクターは、異なる動物ウイルスに基づいて、ベクターから作られ得る。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及び好ましくはウシパピローマウイルスに基づくベクターである。

第ＶＩＩＩ因子をコードする転写ユニットはまた、他の組換え遺伝子と共に動物細胞中に導入され得、これは、ゲノム中に組換えＤＮＡを取り込んだ特定の細胞クローンの単離を促進するためのこれらの細胞におけるドミナント選択マーカーとして機能し得る。このタイプのドミナント選択マーカー遺伝子の例は、ゲネテシン（Geneticin）（Ｇ４１８）に対する抵抗性を付与するＴｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ピューロマイシンに対する抵抗性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡをコードするものと同一のベクター上に存在し得、又はそれは、宿主細胞のゲノム中に同時に導入され且つ取り込まれる別個のベクター上にコードされ得、頻繁に異なる転写ユニット間の密な物理的結合を結果生じる。

第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡと共に使用され得る他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする種々の転写ユニットに基づく。内因性のｄｈｆｒ活性を欠く細胞中（好ましくは、ＣＨＯ−細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１，ＤＧ−４４）へのこのタイプの遺伝子の導入の後、それは、ヌクレオシドを欠く培地中でこれらが生育することを可能にする。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジン、及びグリシンのないＨａｍ‘ｓＦ１２である。これらｄｈｆｒ遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの転写ユニットと共に、上記のタイプのＣＨＯ−細胞中に、同一のベクター又は異なるベクター上に連結されて導入され得、従って、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生するｄｈｆｒ陽性の細胞系を作る。

細胞毒性のｄｈｆｒ阻害剤であるメトトレキセートの存在下で上記の細胞系が成育する場合、メトトレキセートに対して抵抗性のある新たな細胞系が出現する。これらの細胞系は、増幅した数の連結したｄｈｆｒ及び第ＶＩＩＩ因子転写ユニットに起因して、上昇した速度で組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生し得る。メトトレキセートの濃度を上昇させてこれらの細胞系を増殖させれば（１〜１００００ｎＭ）、非常に高速度で第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生する新たな細胞系を得ることができる。

第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生する上記の細胞系は、大規模（懸濁培養において又は種々の固体支持体上で）においても増殖し得る。これら支持体の例は、デキストラン若しくはコラーゲンのマトリクス上のミクロキャリア、又は中空糸若しくは種々のセラミック材料の形態の固体支持体である。懸濁培養又はミクロキャリアにおいて生育する場合、上記の細胞系の培養は、バス培養（bath culture）として又は長期間のコンディションドメディウムの連続的な生産を伴う灌流培養として実施され得る。従って、本発明に従って、上記の細胞系は、人の血漿から単離され得る組換え第ＶＩＩＩ因子の生産のための工業的プロセスの開発のために十分に適している。

上記のタイプのＣＨＯ細胞の培地中で蓄積する組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、濃縮され、そして細胞培養培地中の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質と他の物質間のサイズ、電荷、疎水性、溶解度、特定の親和性等の違いを利用する方法を含む種々の生化学的な方法によって精製され得る。

このような精製の例は、固体の支持体上に固定化されたモノクローナル抗体への組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の吸着である。脱着後、その第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、上記の性質に基づく種々のクロマトグラフィー技術によってさらに精製され得る。

本発明において記載される第ＶＩＩＩ因子活性を有する組換えタンパク質は、治療用途のための薬学的製剤に配合され得る。精製された第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、従来の生理学的に適合性のある水性バッファー溶液（必要に応じて、薬学的製剤を提供するために、薬学的補助剤を添加し得る）中に溶解され得る。

本発明の改変された第ＶＩＩＩ因子のＤＮＡはまた、ヒトの遺伝子治療における使用のためのトランスファーベクター中に組み込まれ得る。

本発明は、以下の実施例においてより詳細に更に説明される。本発明の特別な実施形態のこの説明は、添付の図面と併せてなされる。

実施例１：１及び１３の位置における切断されたＦＩＸイントロンを含むＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡの５’末端におけるイントロンの追加効果
１．１ ｐＤ−Ｌ２ベクターの生成
全ての第ＶＩＩＩ因子コンストラクトは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ｐＤ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｌｅｅｋ オランダ国）中に挿入された。

ＰＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２（又はｐＤ−Ｌ２）及びｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２ｌ１＋１３（又はｐＤ−Ｌ２−２ｌ）は、以前に説明されるコンストラクトを突然変異誘発することによって得られた（ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ０−ｌ１＋１３又はｐＤ−Ｌ０−２ｌ）（Ｐｌａｎｔｉｅｒ， Ｊ． Ｌ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ， Ｍ．Ｈ．， Ｅｎｊｏｌｒａｓ， Ｎ．， Ａｔｔａｌｉ， Ｏ．， ａｎｄ Ｎｅｇｒｉｅｒ， Ｃ． （２００１） Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８６， ５９６−６０３）。

ｐＤ−Ｌ２−２ｌは、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅキットを使用し、製造者の指示書に従って、ｐＤ−Ｌ０−２ｌを突然変異させて得た。突然変異された配列の一部は、シークエンシングによって制御され、ｐＤ−Ｌ０−２ｌ骨格中に再導入され、ｐＤ−Ｌ２−２ｌベクターを作った。オリゴヌクレオチドＦＶＩＩＩ−Ｌ２−２ｌ−Ｓ及びＦＶＩＩＩ−Ｌ２−２ｌ−ＡＳは、突然変異誘発のために使用された（表Ｉ参照）。生成されたタンパク質の間の違いがＢ−ドメインにおいて存在し、リンカーを置換し、これは、Ｌ０についてＲ７４０−Ｒ−Ｒ−Ｒ−１６４９そしてＬ２についてＲ７４０−Ｒ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｒ−である。

イントロンのないｐＤ−Ｌ２を作成するために、ＡａｔＩＩ制限部位がｐＤ−Ｌ０（イントロンがない）において生成され、Ｌ０−ｎｅｗを作製した。フラグメントはオリゴヌクレオチドＦＶＩＩＩ−Ｎ５３８−Ｓ及びＦＶＩＩＩ−Ｌ０−Ｎｅｗ−ＡＳを用いて増幅され（表Ｉを参照）、ｐＣＲＩＩ−Ｔｏｐｏベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングされた。ＡａｔＩＩ部位は、コーディング配列を改変しなかった。フラグメントの完全なシークエンシングに従って、ＢｇＩ ＩＩ−Ｓａｌ Ｉフラグメントが除去され、同一の酵素によって開裂されたｐＫＳ−Ｌ０中に挿入され、ｐＫＳ−Ｌ０−ｎｅｗを作製した。ＦＶＩＩＩのＮｏｔ ｌ−Ａａｔ ＩＩ断片は、除去され、ベクターｐＫＳ−Ｌ２−２ｌ中に再挿入され、イントロンのないｐＤ−Ｌ２を作製した。

１．２ ＦＶＩＩＩ−Ｌ２ ｃＤＮＡの５’におけるβ−グロビンイントロン２の挿入
ウサギのβ−グロビンイントロン２を含むｐＳＧ５−プラスミドがＰＣＲのためのマトリクスとして使用された。β−グロビンイントロン２ＤＮＡフラグメントは増幅され、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ部位によって囲まれ、オリゴヌクレオチドβ−Ｇｌｏｂ−ＮｈｅＩ−Ｓ及びβ−Ｇｌｏｂ−ＮｏｔＩ−ＡＳによってもたらされた。該フラグメントは、両酵素によって消化され、同一酵素によって開裂されたｐＤ−Ｌ２又はｐＤ−Ｌ２−２ｌ中に挿入された。フラグメントの配列は、シークエンシングによって制御された。

１．３ 細胞培養条件
ＣＨＯ及びＣＯＳ−１細胞は、ＥＣＡＣＣ（Ｓｉｇｍａ， Ｌ’ｌｓｅ ｄ’Ａｂｅａｕ， フランス国）から得た。ＨＥＫ−２９３及びＨＫＢ−１１細胞は、ＬＧＣ Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ （Ｍｏｌｓｈｅｉｍ， Ｆｒａｎｃｅ）フランスのＡＴＣＣ配給業者から得た。全ての細胞培養試薬（培地、抗生物質、添加物及び血清）は、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，フランス国）からである。細胞は、５％ＣＯ_２の加湿されたインキュベータ中で３７℃でインキュベートされた。ＣＨＯ及びＣＯＳ−１細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１％ペニストレプトマイシン（penistreptomycin）を添加されたＩＭＤＭ培地において増殖された。ＨＥＫ−２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％ＮＥＡＡ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１％ペニストレプトマイシンが添加されたＥＭＥＭ培地中で増殖された。ＨＫＢ−１１細胞は、２．５％のウシ胎児血清、２％ＨＡＴ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１％ペニストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ培地中で増殖された。

１．４ トランスフェクション条件
５．１０^５細胞（又は、ＨＥＫ−２９３について１×１０^６）が、９．５ｃｍ^２のディッシュ中にプレーティングされた。一日後、細胞は、製造者の推奨に従って５μｌのＦｕＧＥＮＥ−６試薬でプレコンプレックスされた１μｇのＤＮＡと共に６時間インキュベートされた。次いで、新たな培地が添加された。

トランスフェクション後４８時間で、細胞ディッシュは、ＰＢＳで３回洗浄された。細胞は次いで、１％ＢＳＡを含むＳＶＦの無い培地中で６時間インキュベートされた。

１．５ 第ＶＩＩＩ因子発現の分析
ＦＶＩＩＩ抗原の濃度は、ＥＬＩＳＡキット（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＦＶＩＩＩ， Ｓｔａｇｏ， Ａｓｎｉｅｒｅｓ，フランス国）を用いて、細胞コンディションドメディウム中で測定された。

活性は、Ｃｏａｍａｔｉｃキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，ミラノ、イタリア国）を用いて、製造者の推奨に従って制御された。活性は、２〜８ｎｇ／ｍｌの範囲で測定された。２つの希釈が各々のサンプルについて分析された。

１．６ 結果
続くコンストラクトは、異なる細胞系においてＦｕＧＥＮＥ−６を用いてトランスフェクトされた：ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２（イントロンの無いＬ２）、ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２−５’（５’におけるβ−グロビンイントロンを有する５’Ｉ）、ｐＤ−Ｌ２−２ｌ（１及び１３の位置においてＴＦＩＸＩ１を有する２ｌ）及びｐＤ−Ｌ２−３ｌ（５’におけるβ−グロビンイントロン２及び１及び１３の位置におけるＴＦＩＸＩ１を有する３ｌ）。ネガティブコントロールとして、トランスフェクトされていない細胞が等しく処理された。トランスフェクション後２日で、細胞は、１％ＢＳＡを含むＩＭＤＭ中で６時間インキュベートされた。この間に産生されたＦＶＩＩＩの量は、ＥＬＩＳＡを用いて定量化された。

二つの独立したトランスフェクションがＣＨＯ細胞において行われた（図１）。イントロンの無いコンストラクトから産生されたＦＶＩＩＩの割合は、基礎レベルとして使用された。結果は、この基礎レベルと比較したＦＶＩＩＩ生産における増加のパーセンテージとして示される。

同一の実験が、ＣＯＳ−７細胞において（図２）、ＨＫＢ−１１細胞において（図３）及びＨＥＫ−２９３細胞において（図４）反復された（但し、後の２セットの結果については、３回のトランスフェクションが実施された）。

イントロンの無いコンストラクトと比較したＦＶＩＩＩ産生における増加の一覧は、以下の表に示される。評価された４つの細胞系からの結果が示される。

イントロンを含む全てのコンストラクトは、全ての細胞系において、イントロンを有さないコンストラクトよりも顕著に高い第ＶＩＩＩ因子の発現へと導く。ＦＶＩＩＩ配列中の２つのイントロンか、又は５’位における特有のイントロンを有するコンストラクトは、同様のレベルの産生を与えるが、５’イントロンを有するクローンについて幾分優れた発現レベルを与える。

これに対し、３イントロンコンストラクト（５’イントロン及び第ＶＩＩＩ因子ゲノムＤＮＡの１及び１３のイントロン位置におけるイントロンを含む）は、一貫して全ての細胞系中で最も高い発現レベルへと導くコンストラクトであった。発現収率における増加は、細胞系に依存して、５’イントロンクローンと比較して２０〜４２％、１＋１３イントロンクローンと比較して４０〜６７％であった。従って、このコンストラクトは、ＦＶＩＩＩを発現するための現在の技術を改善するために重要である。

ＣＨＯ細胞における、ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２、ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２−５’、ｐＤ−Ｌ２−２ｌ及びｐＨ−Ｌ２−３ｌの発現 ＣＯＳ−７細胞における、ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２、ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２−５’、ｐＤ−Ｌ２−２ｌ及びｐＤ−Ｌ２−３ｌの発現 ＨＫＢ−１１細胞における、ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２、ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２−５’、ｐＤ−Ｌ２−２ｌ及びｐＤ−Ｌ２−３ｌの発現 ＨＥＫ−２９３細胞における、ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２、ｐＤ−ＦＶＩＩＩ−Ｌ２−５’、ｐＤ−Ｌ２−２ｌ及びｐＤ−Ｌ２−３ｌの発現

配列番号１は、オリゴヌクレオチドＦＶＩＩＩ−Ｌ２−２Ｉ−Ｓである。
配列番号２は、オリゴヌクレオチドＦＶＩＩＩ−Ｌ２−２Ｉ−ＡＳである。
配列番号３は、オリゴヌクレオチドＦＶＩＩＩ−Ｎ５３８−Ｓである。
配列番号４は、オリゴヌクレオチドＦＶＩＩＩ−Ｌ０−Ｎｅｗ−ＡＳである。
配列番号５は、オリゴヌクレオチドｂ−ＧＩｏｂ−ＮｈｅＩ−Ｓである。
配列番号６は、オリゴヌクレオチドｂ−ＧＩｏｂ−ＮｏｔＩ−ＡＳである。
配列番号７は、オリゴヌクレオチドＦ８／ＡＧ−ｋｏｚａｋ．Ｓである。
配列番号８は、オリゴヌクレオチドＦ８／ＡＴＧ−ｋｏｚａｋ．ＡＳである。

Claims (13)

1. ゲノム第ＶＩＩＩ因子配列のイントロン１と１３が挿入される位置において、第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡはまた、１つ以上のスプライシング可能なヌクレオチド配列、又はプレ−ｍＲＮＡの核からの輸送時にスプライシングされるヌクレオチド配列、
   さらにプロモーター配列の下流且つ改変された第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの上流に挿入された別のスプライシング可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、改変第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ。
2. ゲノム第ＶＩＩＩ因子配列のイントロン位置１及び／又は１３において、１つ以上の完全な又は切断されたイントロンが挿入されたことを特徴とする、請求項１に記載の改変された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ。
3. ゲノム第ＶＩＩＩ因子配列のイントロン位置１及び／又は１３において、スプライシングされる能力を保持する１つ以上の天然又は合成の核酸配列が挿入されたことを特徴とする、請求項１に記載の改変された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ。
4. ゲノム第ＶＩＩＩ因子配列のイントロン位置１及び１３において、切断されたＦＩＸイントロンＩが挿入されたことを特徴とする、請求項１に記載の改変された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ。
5. プロモーターの下流且つＦＶＩＩＩコーディング配列の上流において、１つの完全な又は切断されたイントロンが挿入されたことを特徴とする、請求項１に記載の改変された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ。
6. プロモーターの下流且つＦＶＩＩＩコーディング配列の上流において、スプライシングされる能力を保持する１つの天然又は合成の核酸配列が挿入されたことを特徴とする、請求項１に記載の改変された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ。
7. プロモーターの下流且つＦＶＩＩＩコーディング配列の上流において、β−グロビンイントロン２が挿入されたことを特徴とする、請求項１に記載の改変された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ。
8. ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１〜７４０をコードする第一ＤＮＡセグメントとヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１６４９〜２３３２をコードする第二ＤＮＡセグメントを含み、前記セグメントがリシン及びアルギニンから選択される少なくとも二つのアミノ酸のリンカーペプチドをコードするリンカーＤＮＡセグメントによって相互に連結されていることを特徴とする、請求項１又は４に記載の改変された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ。
9. 請求項１〜５の改変された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ配列を含む転写ユニット、転写プロモーター及びポリアデニル化配列を含有する組換え発現ベクター。
10. 請求項９の組換え発現ベクターを用いて形質転換された動物由来の宿主細胞系。
11. 生物学的活性のある組換えヒト第ＶＩＩＩ因子又は該ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ａｒｇ−７４０とＧｌｕ−１６４９の間に存在するグリコシル化された領域を欠いた組換えヒト第ＶＩＩＩ因子誘導体の製造方法であって、
    該製造方法が請求項１０の宿主細胞系を前記ヒト第ＶＩＩＩ因子または前記誘導体の発現及び分泌を可能にする栄養培地中で培養し、前記発現産物を該培養培地から回収することによって実施されることを特徴とする、方法。
12. 請求項１〜５に記載の改変された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡを含むことを特徴とする、ヒト遺伝子治療における使用のためのトランスファーベクター。
13. それがヒトの細胞であることを特徴とする、請求項１０の宿主細胞系。

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