ES2319198T3 - Adnc modificado para niveles de expresion altos de factor viii y sus derivados. - Google Patents
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Abstract
ADNc de factor VIII modificado, caracterizado porque en las posiciones en las que se insertan intrones 1 y 13 en la secuencia del factor VIII genómico, el ADNc de factor VIII también contiene una o más secuencias de nucleótidos que se pueden empalmar o una secuencia de nucleótidos que se empalmará durante la exportación de pre- ARNm del núcleo y además otra secuencia de nucleótidos que se pueden empalmar que se inserta corriente abajo de la secuencia promotora y corriente arriba del ADNc de factor VIII modificado.
Description
ADNc modificado para niveles de expresión altos
de factor VIII y sus derivados.
La presente invención se refiere a secuencias de
ADN modificado que codifican factor VIII humano recombinante
biológicamente activo y sus derivados, vectores de expresión
recombinantes que contienen secuencias de ADN de este tipo, células
hospedadoras transformadas con vectores de expresión recombinantes
de este tipo, y procedimientos para la fabricación del factor VIII
humano recombinante y sus derivados. La invención también cubre un
vector de transferencia para uso en terapia génica humana que
comprende secuencias de ADN modificado de este
tipo.
tipo.
Hemofilia clásica o hemofilia A es el más común
de los trastornos de hemorragia hereditaria. Procede de una
deficiencia del factor VIII de coagulación de la sangre asociada al
cromosoma X, y afecta casi exclusivamente a varones con una
incidencia entre uno y dos individuos por 10.000. El defecto del
cromosoma X se transmite por portadoras femeninas que no son ellas
mismas hemofílicas. La manifestación clínica de la hemofilia A es
una tendencia anormal a la hemorragia y antes de que se introdujera
el tratamiento con concentrados de factor VIII la duración media de
la vida para una persona con hemofilia grave era de menos de 20
años. El uso de concentrados de factor VIII de plasma ha mejorado
considerablemente la situación para los pacientes de hemofilia. La
duración media de la vida ha aumentado ampliamente, dando a la
mayoría de ellos la posibilidad de vivir una vida más o menos
normal. Sin embargo, ha habido ciertos problemas con los
concentrados derivados de plasma y su uso, de los cuales han sido
los más graves la transmisión de virus. Hasta ahora, los virus que
producen SIDA, hepatitis B, y hepatitis que no es ni A ni B han
castigado severamente a la población. Aunque se han desarrollado
recientemente diferentes métodos de inactivación de virus y nuevos
concentrados de factor VIII altamente purificados no se puede
garantizar la ausencia de contaminación de virus. Asimismo, los
concentrados de factor VIII son bastante costosos debido al
suministro limitado de la materia prima de plasma humano.
Un producto de factor VIII derivado de material
recombinante es probable que resuelva una gran cantidad de los
problemas asociados con el uso de concentrados de factor VIII
derivados de plasma para tratamiento de hemofilia A. Sin embargo,
el desarrollo de un factor VIII recombinante se ha encontrado con
algunas dificultades, por ejemplo, el problema de conseguir niveles
de producción con rendimientos suficientemente altos, en particular
en lo que respecta a la molécula de longitud completa.
En plasma fresco preparado en presencia de
inhibidores de proteasa, se ha mostrado que el factor VIII tiene un
peso molecular de 280 kDa y que está compuesto de dos cadenas
polipeptídicas de 200 kDa y 80 kDa, respectivamente (Andersson,
L.-O., y col. (1986) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 83,
2979-2983). Estas cadenas se mantienen juntas
mediante puentes de iones metálicos. Se pueden encontrar formas de
molécula de factor VIII más o menos degradadas proteolíticamente
como fragmentos activos en material de factor VIII purificado a
partir de concentrados comerciales (EP 0197901). La forma
fragmentada de factor VIII que tiene pesos moleculares de 260 kDa
descendiendo hasta 170 kDa, está constituida por una cadena pesada
con un peso molecular que oscila de 180 kDa descendiendo hasta 90
kDa, en la que todas las variantes tienen terminales amino
idénticos, en combinación con una cadena ligera de 80 kDa. La
región amino terminal de la cadena pesada es idéntica a la del
polipéptido de factor VIII de cadena sencilla que se puede deducir
a partir de los datos de secuencia de nucleótidos del ADNc de factor
VIII (Wood, W.I., y col. (1984) Nature 312,
330-336; Wehar, G. A., y col. (1984) Nature 312,
337-342).
La forma activa más pequeña de factor VIII con
un peso molecular de 170 kDa, que está constituida por una cadena
de 90 kDa y una cadena de 80 kDa, se puede activar con trombina en
la misma medida que las formas de pesos moleculares más altos, y
representa así una forma no activada. También se ha mostrado que
tiene actividad biológica completa in vivo según se ha
probado en perros con hemofilia (Brinkhous, K.M., y col. (1985)
Proc. Natl. Acad. USA 82, 8752-8756). Así, la
eficacia hemostática de la forma de 170 kDa es la misma que para las
formas de peso molecular alto del factor VIII.
El hecho de que la región media fuertemente
glicosilada de la cadena polipeptídica de factor VIII que reside
entre los aminoácidos Arg-740 y
Glu-1649 no parece que sea necesaria para la
actividad biológica completa ha animado a varios investigadores a
intentar producir derivados de factor VIII recombinantes que carecen
de esta región. Esto se ha logrado suprimiendo una porción del ADNc
que codifica la región media fuertemente glicosilada de factor VIII
ya sea enteramente o parcialmente.
Por ejemplo, J.J. Toole, y col., reseñaron la
construcción y expresión de factor VIII, que carece de aminoácidos
982 a 1562, y 760 a 1639 respectivamente (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1986) 83, 5939-5942). D.L. Eaton, y col. reseñaron
la construcción y expresión de factor VIII que carece de aminoácidos
797 a 1562 (Biochemistry (1986) 25, 8343-8347),
R.J. Kaufman describió la expresión de factor VIII que carece de
aminoácidos 741 a 1646 (solicitud PCT Nº WO 87/04187). N. Sarver, y
col. reseñaron la construcción y expresión de factor VIII que
carece de aminoácidos 747 a 1560 (DNA (1987) 6,
553-564). M. Pasek reseñó la construcción y
expresión de factor VIII que carece de aminoácidos 745 a 1562, y
aminoácidos 741 a 1648, respectivamente (solicitud PCT Nº WO
88/00831). K.-D. Langner reseñó la construcción y expresión de
factor VIII que carece de aminoácidos 816 a 1598, y aminoácidos 741
a 1689, respectivamente (Behring Inst. Mitt., (1988) Nº 82,
16-25, EP 295 597). P. Meulien, y col., reseñaron
la construcción y expresión de factor VIII que carece de aminoácidos
868 a 1562, y aminoácidos 771 a 1666, respectivamente (Protein
Engineering (1988) 2(4), 301-306, EP 0303540
A1). Cuando se expresan estas formas de ADNc de factor VIII con
supresiones en células de mamíferos el nivel de producción es
típicamente 10 veces más alto en comparación con el factor VIII de
longitud completa.
Además, se han hecho intentos para expresar las
cadenas de 90 kDa y 80 kDa separadamente a partir de dos derivados
diferentes de ADNc en la misma célula (Burke, R.L., y col. (1986),
J. Biol. Chem. 261, 12574-12578, Pavirani, A., y
col. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm., 145,
234-240). Sin embargo, en este sistema la
reconstitución in vivo parece que es de eficacia limitada en
lo que se refiere a la actividad de factor VIII:C que se
recupera.
Varios estudios han recalcado el bajo nivel de
producción de factor VIII en diferentes sistemas celulares: Se ha
mostrado que la biosíntesis de factor VIII se regula al menos en
tres niveles diferentes. Primero, se demostró que entre la
secuencia de ADNc de factor VIII dos tramos de nucleótidos, situados
en el dominio que codifica A2, actuaban como silenciadores de
transcripción (Fallaux y col., 1996; Hoeben y col., 1995; Koeberl y
col., 1995; Lynch y col., 1993); Segundo, la síntesis de proteína de
factor VIII está estrictamente regulada por varias chaperonas
endoplasmáticas de retículo (BIP; calreticulina; calnexina;
ERGIC-53). Muchas de estas interacciones retienen
factor VIII en la célula y lo dirigen hacia la maquinaria de
degradación celular (Dorner y col., 1987; Nichols y col., 1998;
Pipe y col., 1998). Tercero, una vez segregado el factor VIII es
sensible a la degradación de proteasa y necesita ser protegido por
Factor de von Willebrand (vWF) (Kaufman y col., 1989).
Por lo tanto, hay problemas para desarrollar
procedimientos mejorados que den como resultado rendimientos más
altos de factor VIII. La presente invención ofrece solución a estos
problemas mediante un ADNc de factor VIII modificado.
Los documentos EP 1038959, EP 1048726, EP
1233064, EP 1283263 y EP 1284290 describen que la introducción de
secuencias de nucleótidos que se pueden empalmar como un intrón 1
FIX truncado u otros intrones, en posiciones en el ADNc que
corresponden a posiciones 1 y 13 de intrones genómicos de factor
VIII puede mejorar drásticamente el nivel de expresión del factor
VIII.
El documento EP 0260148 describe que la
introducción de un intrón corriente arriba de la secuencia de
codificación de una proteína como factor VIII también puede
aumentar los niveles de expresión en sistemas de expresión
heterólogos. EP 0874057 describe una mejora adicional en el nivel de
expresión introduciendo una segunda secuencia donante de intrón
corriente arriba de un intrón que está él mismo corriente arriba de
la secuencia que codifica para la proteína que se ha de expresar
como factor VIII.
Esta invención describe los ADNc de factor VIII
que dan como resultado aumentos adicionales del rendimiento de
expresión de factor VIII en comparación con la técnica anterior que
se pueden usar en un procedimiento industrial para preparación
farmacéutica de factor VIII recombinante o sus derivados.
La invención se basa en el descubrimiento
sorprendente de que es posible aumentar adicionalmente los niveles
de expresión de factor VIII, factor de longitud completa así como
mutantes de supresión y derivados, sobre los documentos EP 1038959,
EP 1048726; EP 1231220, EP 1233064, EP 1283263, EP 1284290 y EP
0260148 combinando secuencias de nucleótidos que se pueden empalmar
en posición 1 y 13 de ADNc de factor VIII (referidas a las
correspondientes posiciones de intrón en el clon de FVIII genómico)
con una secuencia que se puede empalmar corriente arriba de la
secuencia de codificación de factor VIII.
Según la presente invención un ADNc de factor
VIII de este tipo se modifica porque en la posición de intrón 1 y
13 del ADN genómico de factor VIII se inserta una o más secuencias
de nucleótidos que se pueden empalmar (o una secuencia de
nucleótidos que será empalmada durante la exportación del
pre-ARNm del núcleo).
Especialmente, si en la posición de intrones 1 y
13 de ADN genómico de factor VIII se insertan uno o más intrones
completos o truncados o uno o más intrones sintéticos que retienen
la capacidad de ser empalmados, el nivel de expresión de factor
VIII se aumenta considerablemente según se describe en los
documentos EP 1038959, EP 1048726; EP 1231220, EP 1233064, EP
1283263 y EP 1284290.
Según esta invención un ADNc de factor VIII de
este tipo se puede modificar adicionalmente introduciendo una
secuencia de nucleótidos que se puede empalmar corriente abajo del
promotor y corriente arriba de la secuencia de codificación para
factor VIII.
Un objeto adicional de esta invención es mejorar
el nivel de expresión de factor VIII y sus derivados mediante uso
de un ADNc de factor VIII modificado en el que el dominio B del ADNc
de factor VIII natural ha sido recortado o completamente
eliminado.
Preferiblemente se usa un ADNc de factor VIII
modificado que comprende un primer segmento de ADN que codifica
para los aminoácidos 1 a 740 del factor VIII humano y un segundo
segmento de ADN que codifica para los aminoácidos 1649 a 2332 del
factor VIII humano. Estos dos segmentos pueden estar interconectados
mediante un segmento de ADN de conexión que codifica
preferiblemente para un péptido de conexión de al menos dos
aminoácidos que se seleccionan entre lisina o arginina según se
describe en la solicitud de patente internacional WO
92/16557.
92/16557.
La producción de proteínas de factor VIII a
niveles altos en células hospedadoras adecuadas, requiere el
ensamblaje de los ADN de factor VIII modificados anteriormente
mencionados en unidades de transcripción eficaces junto con
elementos reguladores adecuados en un vector de expresión
recombinante, que se pueden propagar en E. coli según los
métodos conocidos por los expertos en la técnica. Elementos
reguladores de transcripción eficaces se podrían derivar de virus
que tuvieran células animales como sus hospedadores naturales o de
ADN cromosomial de células animales. Preferiblemente, se pueden
usar combinaciones potenciadoras de promotor derivadas de Virus del
Simio 40, adenovirus, virus de polioma BK, citomegalovirus humano, o
la repetición de terminal largo de virus de sarcoma de Rous, o
combinaciones potenciadoras de promotor que incluyen genes
transcritos constitutivamente de manera fuerte en células animales
como beta-actina o GRP78. A fin de conseguir niveles
altos estables de ARNm transcrito de los ADN de factor VIII, la
unidad de transcripción debería contener en su parte proximal 3'
una región de ADN que codifica una secuencia de poliadenilación de
terminación de transcripción. Preferiblemente, esta secuencia se
deriva de la región de transcripción temprana de Virus del Simio 40,
gen de betaglobina de conejo, o el gen activador de plasminógeno de
tejido humano.
Los ADNc de factor VIII así ensamblados en
vector de expresión recombinante eficaz se introducen a continuación
en una línea celular hospedadora adecuada para expresión de
proteínas de factor VIII. Preferiblemente esta línea celular
debería ser una línea celular animal de origen vertebrado a fin de
asegurar plegado correcto, formación de enlace disulfuro,
glicosilación asociada a asparraguinas y otras modificaciones
posteriores a la traducción así como secreción al medio de cultivo.
Ejemplos de otras modificaciones posteriores a la traducción son
O-sulfación de tirosina, y procesado proteolítico de
la cadena de polipéptidos naciente. Ejemplos de líneas celulares
que se pueden usar son células COS de mono, células L de ratón,
células C127 de ratón, células BHK-21 de hámster,
células embrionarias humanas 293de riñón, y preferentemente células
CHO.
El vector de expresión recombinante que codifica
factor VIII se puede introducir en una línea celular animal de
varias maneras diferentes. Por ejemplo, se pueden crear vectores de
expresión recombinantes a partir de vectores basados en diferentes
virus de animales. Ejemplos de éstos son vectores basados en
baculovirus, virus de vaccinia, adenovirus, y preferiblemente virus
de papiloma bovino.
También se pueden introducir las unidades de
transcripción que codifican factor VIII en células animales junto
con otro gen recombinante, que puede funcionar como marcador
dominante seleccionable en estas células a fin de facilitar el
aislamiento de clones de células específicas, que han integrado el
ADN recombinante en su genoma. Ejemplos de genes marcadores
dominantes seleccionables de este tipo son aminoglicósido
fosfotransferasa Tn5, que confiere resistencia a Geneticina (G418),
higromicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a
higromicina, y puromicina acetiltransferasa, que confiere
resistencia a puromicina. El vector de expresión recombinante que
codifica un marcador seleccionable de este tipo puede residir tanto
en el mismo vector como en el que codifica el ADNc de factor VIII,
o puede estar codificado en un vector separado que se introduce
simultáneamente y se integra en el genoma de la célula
hospedado-
ra, dando como resultado frecuentemente una conexión física firme entre las diferentes unidades de transcripción.
ra, dando como resultado frecuentemente una conexión física firme entre las diferentes unidades de transcripción.
Otros tipos de genes marcadores seleccionables
que se pueden usar junto con los ADNc de factor VIII se basan en
diversas unidades de transcripción que codifican dihidrofolato
reductasa (dhfr). Después de la introducción de este tipo de gen en
células que carecen de actividad de dhfr endógena, preferiblemente
células CHO (DUKX-B11, DG-44), esto
las permitirá crecer en medios que carezcan de nucleósidos. Un
ejemplo de un medio de este tipo es F12 de Ham sin hipoxantina,
timidina ni glicina. Estos genes dhfr pueden ser introducidos junto
con las unidades de transcripción de ADNc de factor VIII en células
CHO del tipo anterior, tanto asociadas al mismo vector como a
diferentes vectores, creando así líneas celulares positivas a dhfr
que producen proteína de factor VIII recombinante.
Si se hacen crecer las líneas celulares
anteriores en presencia del metotrexato inhibidor de dhfr
citotóxico, emergerán nuevas líneas celulares resistentes a
metotrexato. Estas líneas celulares pueden producir proteína de
factor VIII recombinante a una mayor velocidad debido al número
ampliado de y unidades de transcripción de factor VIII y dhfr
asociados. Cuando se propagan estas líneas celulares en
concentraciones crecientes de metotrexato (1-10000
nM), se pueden obtener nuevas líneas celulares que producen proteína
de factor VIII a velocidad muy alta.
Las líneas celulares anteriores que producen
proteína de factor VIII se pueden hacer crecer a gran escala, tanto
en cultivo en suspensión como en diversos soportes sólidos. Ejemplos
de estos soportes son microvehículos basados en matrices de
dextrano o colágeno, o soportes sólidos en forma de fibras huecas o
diversos materiales cerámicos. Cuando se hace crecer en cultivo en
suspensión o en microvehículos el cultivo de las líneas celulares
anteriores se puede realizar tanto en cultivo en baño como en un
cultivo de perfusión con producción continua de medio acondicionado
durante extensos períodos de tiempo. Así, según la presente
invención, las líneas celulares anteriores son muy adecuadas para
el desarrollo de un procedimiento industrial para la producción de
factor VIII recombinante que puede ser aislado de plasma
humano.
La proteína de factor VIII recombinante que se
acumula en el medio de células CHO del tipo anterior, puede ser
concentrada y purificada mediante una diversidad de métodos
bioquímicos, que incluyen métodos que utilizan diferencias en
tamaño, carga, hidrofobia, solubilidad, afinidad específica, etc.,
entre la proteína de factor VIII recombinante y otras sustancias en
el medio de cultivo celular.
Un ejemplo de purificación de este tipo es la
adsorción de la proteína de factor VIII recombinante en un
anticuerpo monoclonal, que está inmovilizado sobre un soporte
sólido. Después de la desorción, la proteína de factor VIII puede
ser purificada adicionalmente mediante una diversidad de técnicas
cromatográficas basadas en las propiedades anteriores.
Las proteínas recombinantes con actividad de
factor VIII que se describen en esta invención se pueden formular
en preparaciones farmacéuticas para uso terapéutico. Las proteínas
de factor VIII purificadas se pueden disolver en soluciones tampón
acuosas convencionales fisiológicamente compatibles a las que se
pueden añadir, opcionalmente, adyuvantes farmacéuticos para
proporcionar preparaciones farmacéuticas.
Los ADN de factor VIII modificados de esta
invención también se pueden integrar en un vector de transferencia
para uso en la terapia génica humana.
La presente invención de describirá
adicionalmente con más detalles en los siguientes ejemplos de la
misma. Esta descripción de realizaciones específicas de la
invención se hará en conjunción con los dibujos que se
acompañan.
Figura 1: Expresión de
pD-FVIII-L2,
pD-FVIII-L2-5',
pD-L2-2I y
pD-L2-3I en células CHO
Figura 2: Expresión de
pD-FVIII-L2,
pD-FVIII-L2-5',
pD-L2-2I y
pD-L2-3I en células
COS-7
Figura 3: Expresión de
pD-FVIII-L2,
pD-FVIII-L2-5',
pD-L2-2I y
pD-L2-3I en células
HKB-11
Figura 4: Expresión de
pD-FVIII-L2,
pD-FVIII-L2-5',
pD-L2-2I y
pD-L2-3I en células
HEK-293
Ejemplo
1
Se insertaron todos los constructos de factor
VIII en vector pcDNA3.1. (pD) (Invitrogen, Leek, Países Bajos).
Se obtuvieron
pD-FVIII-L2 (o
pD-L2) y
pD-FVIII-L2-I1+13 (o
pD-L2-2I) mutando un constructo
previamente descrito
(pD-FVIII-L0-I1+13 o
pD-L0-2I) (Plantier, J.L.,
Rodriguez, M.H., Enjolras, N., Attali, O., y Negrier, C., (2001)
Thromb Haemost 86, 596-603).
Se obtuvo
pD-L2-2I mutando
pD-L0-2I usando el kit Quickchange
de Stratagene, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se
controló una porción de la secuencia mutada secuenciando y se
reintrodujo en una columna vertebral de
pD-L0-2I creando el vector
pD-L2-2I. Se usaron los
oligonucleótidos
FVIII-L2-2I-S y
FVIII-L2-2I-AS para
mutagénesis (véase Tabla I). La diferencia entre las proteínas
generadas reside en el dominio B que sustituye el conector que es
R740-R-R-R-1649
con L0 y
R740-R-R-G-G-R-R
con L2.
Para crear un pD-L2 sin intrón,
se generó un sitio de restricción Aat II en pD-L0
(sin intrón) creando L0 nuevo. Se amplió un fragmento usando los
oligonucleótidos FVIII-N538-S y
FVIII-L0-Nuevo (véase Tabla I) y se
clonó en el vector pCRII-Topo (InVitrogen). El sitio
Aat II no modificó la secuencia de codificación. Después de una
secuenciación completa del fragmento, se retiró el fragmento Bgl
II-Sal I y se insertó en pKS-L0
abierto por la misma enzima creando
pKS-L0-nuevo: El fragmento Not
I-Aat II de FVIII se escindió y se reinsertó en el
vector pKS-L2-2I, creando el
pD-L2 sin intrones.
Se usó el plásmido pSG5 que contiene el intrón 2
de \beta-globina como matriz para PCR. Se amplió
el fragmento de ADN de intrón 2 de \beta-globina,
se rodeó mediante sitios Nhe I y Not I, se llevó mediante los
nucleótidos
\beta-Glob-NheI-S
y \beta-Glob-Not
I-AS. El fragmento se sometió a digestión mediante
ambas enzimas y se insertó en pD-L2 o
pD-L2-2I abiertas por las mismas
enzimas. La secuencia de fragmento se controló mediante
secuenciación.
Se obtuvieron células CHO y
COS-1 de ECACC (Sigma, L'Isle d'Abeau, Francia). Se
obtuvieron células HEK-293 y HKB-11
de LGC Promochem (Molsheim, Francia), el distribuidor francés de
ATCC. Todos los reactivos de cultivos celulares (medios,
antibióticos, suplementos y suero) son de InVitrogen (Cergy
Pontoise, Francia). Las células se incubaron a 37ºC en una
incubadora humidificada de CO_{2} al 5%. Se hicieron crecer
células CHO y COS-1 en medio de IMDM suplementado
con suero fetal bovino al 10%, glutamina-L 2 mM y
peniestreptomicina al 1%. Se hicieron crecer células
HEK-293 en medio de EMEM suplementado con suero
fetal bovino al 10%, NEAA al 1%, glutamina-L 2 mM y
peniestreptomicina al 1%. Se hicieron crecer células
HKB-11 en medio de RPMI suplementado con suero
fetal bovino al 2,5%, HAT al 2%, glutamina-L 2 mM y
peniestreptomicina al 1%.
Se chaparon 5\cdot10^{5} células (ó
1x10^{6} para HEK-293) en una placa de 9,5
cm^{2}. Un día más tarde, se cultivaron las células durante 6
horas con 1 \mug de ADN complejado previamente con 5 \mul de
reactivo FuGENE-6, siguiendo las recomendaciones del
fabricante. A continuación, se añadió medio nuevo.
48 horas después de la transfección, se lavaron
las placas de células 3 veces con PBS. A continuación se incubaron
las células durante 6 horas en medio exento de SVF que contenía 1%
de BSA.
Se midieron las concentraciones de antígeno de
FVIII en el medio celular acondicionado usando un kit ELISA
(Asserachrom FVIII, Stago, Asnières, Francia).
Se controló la actividad usando el kit Coamatic
(Chromogenix, Milán, Italia) siguiendo las instrucciones del
fabricante. La actividad se midió en un intervalo de
2-8 ng/ml. Se analizaron dos diluciones para cada
muestra.
Los siguientes constructos fueron transfectados
usando FuGENE-6 en diferentes líneas celulares:
pD-FVIII-L2 (L2, sin intrón),
pD-FVIII-L2-5' (5'I,
con intrón 2 de \beta-globina en 5'),
pD-L2-2I (2I, con el TFIXI1 en
posiciones 1 y 13) y pD-L2-3I (3I
con un intrón 2 de \beta-globina en 5' y el TFIXI1
en posiciones 1 y 13). Como controles negativos, se trataron de
idéntico modo células no transfectadas. Dos días después de la
transfección, se incubaron las células durante 6 horas en IMDM que
contenía 1% de BSA. La cantidad de FVIII producido durante este
período se cuantificó usando ELISA.
Se hicieron dos transfecciones independientes en
células CHO (figura 1). Se usó como nivel de base la relación de
FVIII producido a partir del constructo sin intrón. Los resultados
se presentan como porcentaje de aumento en la producción de FVIII
en comparación con este nivel de base.
Se repitió un experimento idéntico en células
COS-7 (figura 2) en células HKB-11
(figura 3) y células HEK-293 (figura 4), excepto
que para los dos últimos conjuntos de resultados se hicieron tres
transfecciones.
Un resumen del aumento de producción de FVIII en
comparación con la del constructo carente de intrones se presenta
en la siguiente tabla. Se muestran los resultados de las cuatro
líneas celulares analizadas.
Todos los constructos que contienen intrones
conducen en todas las líneas celulares a expresión de factor VIII
significativamente más alta que la del constructo sin intrón. El
constructo tanto con dos intrones dentro de la secuencia de FVIII
como con un único intrón en la posición 5' dio niveles similares de
producción aunque con nivel de expresión algo mejor para clones con
el intrón 5'.
En contraposición el constructo de 3 intrones
(que contiene un intrón 5' e intrones en las posiciones de intrones
1 y 13 de de ADN genómico de factor VIII) fue el constructo que
condujo regularmente a los más altos niveles de expresión en todas
las líneas celulares. El aumento en rendimiento de expresión,
dependiendo de la línea celular, fue 20-42% en
comparación con el clon de intrón 5' ó 40-67% en
comparación con el clon de intrón 1 + 13. Por lo tanto este
constructo será de interés para mejorar la tecnología actual para
expresar FVIII.
<110> ZLB Behring GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ADNc modificado para niveles de
expresión altos de factor VIII y sus derivados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2003/MO 16 [A077]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 03023637.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-10-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
FVIII-L2-2 1-S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacaatgcca ttgaaccaag acgtcgtgga ggtcgacgag aaataactcg t
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
FVIII-L2-2 1-AS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgagttatt tctcgtcgac ctccacgacg tcttggttca atggcattgt t
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
FVIII-N538-S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatatggaga gagatctagc ttcagg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
FVIII-L0-Nuevo-AS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtcgacg acgtcttggt tcaatgg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
b-glob-NheI-s
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagctagcg tgagtttggg gacccttg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
b-glob-Not I-AS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagtttagc ggccgctgta ggaaaaagaa gaaggc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> F8/AG-kozak.s
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcttacac ccatgcaaat agagctctcc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> F8/ATG-kozal.AS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagagctct atttgcatgg gtgtaagccg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. ADNc de factor VIII modificado,
caracterizado porque en las posiciones en las que se insertan
intrones 1 y 13 en la secuencia del factor VIII genómico, el ADNc de
factor VIII también contiene una o más secuencias de nucleótidos que
se pueden empalmar o una secuencia de nucleótidos que se empalmará
durante la exportación de pre-ARNm del núcleo y
además otra secuencia de nucleótidos que se pueden empalmar que se
inserta corriente abajo de la secuencia promotora y corriente arriba
del ADNc de factor VIII modificado.
2. ADNc de factor VIII modificado según se
describe en la reivindicación 1, caracterizado porque en las
posiciones de intrones 1 y/o 13 de la secuencia del factor VIII
genómico se han insertado uno o más intrones completos o
truncados.
3. ADNc de factor VIII modificado según se
describe en la reivindicación 1, caracterizado porque en las
posiciones de intrones 1 y/o 13 de la secuencia del factor VIII
genómico se ha insertado una o más secuencias de ácidos nucleicos de
origen natural o sintéticos, que conservan la capacidad de ser
empalmados.
4. ADNc de factor VIII modificado según se
describe en la reivindicación 1, caracterizado porque en las
posiciones de intrones 1 y 13 de la secuencia del factor VIII
genómico se han insertado intrones 1 FIX truncados.
5. ADNc de factor VIII modificado según se
describe en la reivindicación 1, caracterizado porque
corriente abajo del promotor y corriente arriba de la secuencia que
codifica FVIII se ha insertado un intrón completo o truncado.
6. ADNc de factor VIII modificado según se
describe en la reivindicación 1, caracterizado porque
corriente abajo del promotor y corriente arriba de la secuencia que
codifica FVIII se han insertado secuencias de ácidos nucleicos de
origen natural o sintéticos que conservan la capacidad de ser
empalmados.
7. ADNc de factor VIII modificado según se
describe en la reivindicación 1, caracterizado porque
corriente abajo del promotor y corriente arriba de la secuencia que
codifica FVIII se ha insertado un intrón 2 de
\beta-globina.
8. ADNc de factor VIII modificado según se
describe en las reivindicaciones 1 ó 4, caracterizado porque
comprende un primer segmento de ADN que codifica para los
aminoácidos 1 a 740 del factor VIII humano y un segundo segmento de
ADN que codifica para los aminoácidos 1649 a 2332 del factor VIII
humano, estando dichos segmentos interconectados mediante un
segmento de ADN de conexión que codifica para un péptido de conexión
de al menos dos aminoácidos que se seleccionan entre lisina y
arginina.
9. Vector de expresión recombinante que contiene
una unidad de transcripción que comprende la secuencia de ADNc de
factor VIII modificado según las reivindicaciones 1 a 5, un promotor
transcripcional y una secuencia de poliadenilación.
10. Una línea de células hospedadoras de origen
animal transformada con el vector de expresión recombinante de la
reivindicación 9, adicionalmente caracterizada porque dicha
línea de células hospedadoras no es una línea de células
hospedadoras troncales embrionarias humanas.
11. Procedimiento para la producción de un
factor VIII humano recombinante biológicamente activo o su derivado,
caracterizado porque la producción se realiza cultivando la
línea de células animales de la reivindicación 10 en un medio
nutritivo que permite la expresión y secreción del factor VIII
humano o su derivado y recuperando dicho producto de expresión del
medio de cultivo.
12. Vector de transferencia para uso en la
terapia génica humana, caracterizado porque comprende un ADNc
de factor VIII modificado según se describe en las reivindicaciones
1 a 5.
13. Una célula hospedadora según la
reivindicación 10, caracterizada porque es una célula humana
que ha crecido en cultivo en suspensión o sobre un soporte
sólido.
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