DE3730599A1 - Verfahren zur kontinuierlichen herstellung von heterologen proteinen in eukaryontischen wirtszellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Anwendung der rekombinanten DNA- Technik zur Herstellung von zur Expression von gewünschten Proteinen fähigen Vektoren, so daß eine kontinuierliche Herstellung der Proteine ermöglicht wird. Ferner betrifft die Erfindung die Konstruktion eines zur Erzeugung von stabiler zytoplasmatischer mRNA fähigen Expressionsvektors, so daß ein Weg zur kontinuierlichen Herstellung des gewünschten Proteins ermöglicht wird. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor mit einer speziellen stabilisierenden Sequenz in 5′-Stellung zu einer für ein gewünschtes Protein kodierenden DNA. Schließlich betrifft die Erfindung die Transfektion von eukaryontischen Zellen mit derartigen Vektoren und die Auswahl von Wirtszellen, so daß eine kontinuierliche Herstellung des gewünschten Proteins durch diese Zellinie ermöglicht wird.

Die rekombinante DNA-Technik wird in letzter Zeit in zunehmendem Maße auf eukaryontische Zellen angewandt, insbesondere sind Säugetierzellen mit heterologer, für einen selektierbaren Phänotyp kodierenden DNA transformiert worden; vgl. M. Wigler et al., Cell, Bd. 11 (1977), S. 223-232. Es wurde ferner gezeigt, daß eukaryontische Zellen unter Erzeugung von Transformanten transformiert werden können, die in die chromosomale DNA des eukaryontischen Zellkerns integrierte heterologe DNA enthalten.

Eine erfolgreiche Transformation von eukaryontischen Zellkulturen und eine Expression von für ein gewünschtes Protein kodierenden DNA-Sequenzen wurde beschrieben; vgl. z. B. Europäische Patentveröffentlichungen 73 659 und 73 656. Bei diesen erfolgreichen Transformationen wurden Vektoren zur Expression von komplementärer DNA (cDNA's) verwendet, bei denen lediglich 5′-Steuersignale, z. B. Verstärker (enhancer) (vgl. Y. Gluzman und T. Shenk (Hrsg.), Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Laboratoy, 1983), Promotoren (vgl. D. H. Hamer et al., Cell, Bd. 21 (1980), S. 697) und 3′-Polyadenylierungsstellen (vgl. N. J. Proudfoot und G. C. Brownlee, Nature, Bd. 263 (1976), S. 211) erforderlich sind.

Im Jahre 1977 wurde festgestellt, daß in Eukaryonten die zytoplasmatische mRNA nicht immer kolinear mit der DNA ist. Es wurde gefunden, daß für Proteine kodierende DNA-Sequenzen durch Bereiche nicht-kodierender DNA unterbrochen sind. Es gibt lange Bereiche von Basensequenzen in der DNA des Gens, die nicht in der endgültigen mRNA erscheinen. Es wurde beobachtet, daß die primären mRNA-Transkripte unter Entfernung der nicht-kodierenden Sequenzen, d. h. Sequenzen, die nicht für ein Protein kodieren, "gespleißt" wurden. Diese nicht-kodierenden Sequenzen in DNA werden allgemein als Introns (früher als Zwischensequenzen; intervening sequences benannt) bezeichnet, während die kodierenden Sequenzen als Exons bekannt sind. RNA-Polymerase bildet ein primäres Transkript der gesamten DNA, sowohl der Exons als auch der Introns. Dieses Transkript wurde so bearbeitet, daß die Introns entfernt wurden, während gleichzeitig die Exons alle in der richtigen Reihenfolge miteinander verbunden wurden. Dieser zum vorstehenden Ergebnis führende Mechanismus wird als "Spleißen" bezeichnet.

Es wurden zahlreiche gespaltene oder gespleißte Gene entdeckt. Tatsächlich gibt es Introns in praktisch allen Säugetier- und Wirbeltier-Genen und auch in Genen von eukaryontischen Mikroorganismen. Introns sind nicht auf den kodierenden Bereich einer Botschaft beschränkt. Beispielsweise wurde ein Intron im Leader-Bereich von Plasminogen-Aktivator- mRNA vor der kodierenden Sequenz zusätzlich zu mehrfachen Spleißstellen an anderen Stellen im Gen gefunden; vgl. R. Fisher et al., J. Biol. Chem., Bd. 260 (1985), S. 1122. Es wurden eine Reihe von Theorien über die Gründe der Entstehung von Introns und ihre Entwicklung zu einem derart allgemeinen Merkmal in eukaryontischen Genen aufgestellt; vgl. F. Crick., Science, Bd. 204 (1979), S. 264; und P. A. Sharp, Cell, Bd. 23 (1981), S. 643-646.

Angesichts der Allgegenwart von Introns ist es nicht überraschend, daß das Spleißen in Zusammenhang mit der rekombinanten DNA-Technik untersucht wurde. Beispielsweise wurde ein SV40-Vektor konstruiert, der eine Kaninchen-β-Globin- cDNA, in die Transkriptions-Initiation und -Termination verwickelte Bereiche, Spleißstellen von einer mehrteiligen Leader-Sequenz in 5′-Stellung zur β-Globin-cDNA-Sequenz und eine Polyadenylierungssequenz enthält; vgl. R. C. Mulligan et al., Nature, Bd. 277 (1979) S. 108-114. Von diesem rekombinanten Genom wurde festgestellt, daß bei Infektion in Affennierenzellen hybride mRNA's mit einem Gehalt an dem Leader-Bereich für 16S- und 19S-späte RNA und der für β-Globin kodierende Sequenz gebildet werden. Diese Hybrid-mRNA bildete wesentliche Mengen an Kaninchen-β-Globin-Polypeptid. Mulligan et al. erörtern einen Versuch, bei dem Mutanten mit einem Mangel an Spleißvermögen keine diskreten mRNA's bildeten; a. a. O. S. 109.

In einem Versuch, die physiologische Rolle, die das RNA- Spleißen bei der Genexpression spielt, festzustellen, manipulierten D. H. Hamer und P. Leder, Cell, Bd. 18 (1979), S. 1299-1302 die Stellung und/oder die Anwesenheit einer Spleißstelle in in Affenzellen transfizierten SV40- Rekombinanten. Hamer und Leder, a. a. O., verwendeten eine Spleißstelle, die sich innerhalb des für das gewünschte Protein kodierenden Gens befand, oder zwei Spleißstellensequenzen, von denen sich eine am 5′-Ende und die andere innerhalb des für das gewünschte Protein kodierenden Gens befanden. Sie stellten dabei fest, daß vorübergehend von sämtlichen Viren, die zumindest eine funktionelle Spleißverbindung behalten haben, RNA gebildet wurde. Sie schlossen, daß das Spleißen eine Voraussetzung für die stabile RNA-Bildung sei. Unter Bestätigung dieses Befunds stellten P. Gruss et al., PNAS (USA), Bd. 76 (1979), S. 4317-4321 fest, daß die Konstruktion einer SV40-Mutante ohne Zwischensequenz kein nachweisbares Kapsidprotein lieferte. Die Gruss-Arbeit bediente sich eines mehrteiligen Leaders mit mehreren Spleißstellensequenzen. Die drei erörterten Arbeiten bedienen sich alle viraler Vektoren mit zahlreichen Spleißstellen in verschiedenen Positionen. Diese viralen Vektoren unterscheiden sich in mehrfacher Hinsicht von den nicht-viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung. Zunächst befinden sich virale Introns sowohl in 5′- und 3′- Stellung zur Transkriptionseinheit als auch innerhalb der kodierenden Sequenz selbst. Erfindungsgemäß befindet sich die stabilisierende Sequenz am 5′-Ende des für das gewünschte Protein kodierenden Gens. Ferner replizieren virale Vektoren fortlaufend unabhängig von der Wirts-DNA, integrieren sich nicht und sind lytisch. Schließlich erforden zahlreiche virale Vektoren eine frühe Genfunktion für den korrekten Verlauf des Spleißens.

Diese beiden Arbeiten legen es nahe, daß das RNA-Spleißen in einem rekombinanten Milieu wichtig ist. Jedoch wurde gemäß anderen Untersuchungen das Spleißen aufgegeben und Proteine nur unter Anwendung von 5′-Steuersignalen, wie Verstärkern, sowie Promotoren und 3′-Polyadenylierungsstellen exprimiert. Tatsächlich wurde in einer jüngeren Arbeit von U. B. Reddy et al., Transcriptional Control Mechanisms, J. Cell. Biochem. Suppl., Bd. 10D (1986), S. 154 festgestellt, daß die Einverleibung von Introns in einen Expressionsvektor zu einer Verringerung der Expressionsmenge des gewünschten Proteins führte. Die Autoren schlossen, daß Introns keinen wesentlichen Teil von Vektoren für die Expression eines gewünschten Proteins darstellen. Hall. et al., beobachtete ebenfalls, daß die Einverleibung eines Introns für die Proteinexpression nachteilig war. Es wurde festgestellt, daß die Deletion einer Akzeptor-Sequenz zur vorübergehenden Bildung einer ungespleißten, zytoplasmatischen, viralen mRNA führte; vgl. R. Treismann et al., Nature, Bd. 292 (1981), S. 595-600. Diese Ergebnisse stützen die Auffassung, daß Spleißen nicht zwingend ist.

Eine direkte Expression unter Verwendung von rekombinanten Standardsteuersignalen, wie Verstärkern, Promotoren und 3′- Polyadenylierungsstellen, läßt sich nicht immer erreichen. Der SV40-Promotor ohne eine Spleißstelle wurde zur direkten Expression von zahlreichen cDNAs verwendet; β-Galactosidase, C. V. Hall et al., J. Mol. Applied Genetics, Bd. 2; Humaninterferon, P. W. Gray et al., Nature, Bd. 295 (1982), S. 503; Hämagglutinin, Gethin et al., Nature, Bd. 293 (1981), S. 620; Human-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, J. McLean et al., PNAS, Bd. 33 (1986), S. 2335; DHFR, C. C. Simonsen et al., PNAS, Bd. 80 (1983), S. 2495; Humaninterleukin-2, W. T. Leonard et al., Nature, Bd. 311 (1984), S. 626; ras-2, D. J. Capon et al., Nature, Bd. 304 (1983); src, Snyder et al., Cell, Bd. 32 (1983), S. 891; und Hepatitis B-Oberflächenantigen, C. S. Croxley et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 3 (1983), S. 44-55. Jedoch wurde keine diskrete Faktor-VIII-Botschaft von korrekter Größe unter Verwendung eines Expressionsvektors mit einem Gehalt an SV40-Promotor unter Verknüpfung an eine für Faktor VIII kodierende cDNA, der in eine Reihe von Zellen transfiziert worden war, nachgewiesen. Die Transkription von anderen, im gleichen Plasmid vorhandenen Genen, wie DHFR, führte zur korrekten Botschaft. Da der SV40-Promotor mRNA für bestimmte Proteine, jedoch nicht für Faktor VIII exprimieren konnte, wurde festgestellt, daß die Schwierigkeit entweder in Zusammenhang mit der Transkription/Spleißung von mRNA, die eine kontinuierliche Expression ermöglichen würde, oder einfach in Zusammenhang mit einer fehlenden Anreicherung der Faktor VIII-Botschaft steht. Das erstgenannte Problem wird hier als das Problem mit der "Stabilität" von mRNA bezeichnet.

Zahlreiche Untersuchungen unter Anwendung von verschiedenen Kombinationen von transkriptionalen Startsignalen mit für Faktor VIII kodierender cDNA wurden durchgeführt. Mit derartigen Vektoren transfizierte Zellen wurden mit der Northern-Analyse auf die Faktor VIII-Botschaft analysiert. Es wurde keine diskrete Botschaft mit der korrekten Größe gefunden.

Untersuchungen wurden auch mit den in den Vektoren vorhandenen Introns und Spleißstellen durchgeführt. H. Okayama und p. Berg, Mol. Cell. Biol., Bd. 3(2) (1983), S. 280-289 verwenden einen Plasmidvektor, pCD, mit einem Gehalt an SV40- Frühbereich-Promotor, SV40-Spätbereich-Intron mit einer Donorstelle und zwei Akzeptorstellen, cDNA und einem Polyadenylierungssignal. Ein Vektor mit dem Adenovirus-späten Hauptpromotor und einem dreiteiligen Leader, der drei Spleißstellen und eine für Faktor VIII kodierende cDNA umfaßt, wurde gemäß der Europäischen Patentveröffentlichung 1 60 457 konstruiert. Dieser Vektor wurde analysiert. Dabei wurde festgestellt, daß er zufallsmäßig die Expression von Faktor VIII in voller Länge bewirkt. Dies konnte teilweise durch kryptisches Spleißen erklärt werden. Der dreiteilige Leader-Bereich wird zu Mehrfachkodierungsbereichen unter Bildung einer endgültigen Botschaft gespleißt. Die Komplexizität des Spleißmusters ergibt sich aus der Tatsache, daß vier primäre Transkripte unterschiedlich unter Erzeugung von 14 diskreten Botschaften gespleißt werden konnten; J. Nevins und M. Wilson, Nature, Bd. 290 (1981), S. 113. Die Steuerung für die Selektion der Spleißung stromabwärts zur kodierenden Sequenz ist nicht erklärbar. Jedoch gehen die Selektion der geeigneten Polyadenylierungsstelle und die Transkriptionstermination dem endgültigen Spleißereignis voraus und können die Auswahl der 3′-Spleißstelle bewirken. Aus diesen Gründen und aufgrund der Tatsache, daß der Informationsgehalt der Basensequenzen an den Exon-Intron- Verbindungsstellen relativ gering ist, ist es nicht überraschend, daß die Spleißung gelegentlich unkorrekt, d. h. kryptisch, erfolgt; Hamer et al., Cell, Bd. 21 (1980), S. 697-708; und Mansur et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 6 (1986), S. 2684. Kryptisches Spleißen könnte den zufallsmäßigen Erfolg bei der Expression des Faktors VIII von voller Länge unter Verwendung des Adenovirus-späten Hauptpromotors und des dreiteiligen Leaders erklären.

Weitere Analysen von Vektoren mit einem Gehalt an dem Adenovirus-späten Hauptpromotor wurden durchgeführt. Adenovektoren wurden zur Expression von anderen Proteinen verwendet, ergaben jedoch ein beschränktes Expressionsmuster, was den Schluß nahelegt, daß die Adenosteuerbereiche in einer begrenzten Anzahl von Zelltypen funktionieren können; A. S. Levine et al., Virol., Bd. 11 (1973) S. 672-681; und T. J. Grodzicker et al., J. Virol., Bd. 9 (1976), S. 559-571. Vektoren wurden unter Verwendung von cDNAs von anderen Proteinen, wie DHFR oder t-PA, mit den identischen 5′- und 3′- Steuerbereichen gemäß der Europäischen Patentveröffentlichung 1 60 457 konstruiert. Im Anschluß an die Transfektion dieser Plasmide in COS-, 293-, BHK- und CHO-Zellen wurden die Transfektanten entweder in bezug auf ihre t-PA-Expression durch Immunoperoxidase-Färbung oder auf ihre DHFR-Expression unter Verwendung von Methotrexat geprüft. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß sich zu keinem Zeitpunkt irgendeiner dieser späten Adenovektoren als fähig erwies, t-PA oder DHFR in beliebiger, von 293- oder COS-Zellen abweichenden Zelltypen zu exprimieren. Eine vorübergehende Expression von t-PA ließ sich in 293- oder COS-Zellen feststellen, jedoch war die Faktor VIII-Expression unter identischen Bedingungen zufallsmäßig. Diese Ergebnisse wurden durch drei Arbeiten bestätigt, bei denen es bei Verwendung eines Teils einer viralen mehrteiligen Leader-Sequenz nicht möglich war, das gewünschte Protein zu exprimieren. In der ersten Arbeit konstruierten R. J. Kaufman und P. A. Sharp, Mol. Cell. Biol., Bd. 2(11) (1982), S. 1304 einen Vektor, der den späten Adeno- Hauptpromotor unter Einschluß des ersten Leaders und der 5′- Spleiß-Donor-Stelle der Adenovirus-dreiteiligen mRNA-Leader- Sequenz unter Verknüpfung mit den zwei 3′-Spleißstellen- Akzeptor-Sequenzen, die aus einem Immunoglobulin-variablen Genbereich und dem DHFR-kodierenden Bereich isoliert worden waren, umfaßte. Dieser in DHFR^--CHO-Zellen transfizierte Vektor bildete in sehr geringer Häufigkeit DHFR⁺-Zellen. In einer zweiten Arbeit beschrieben R. J. Kaufman und P. A. Sharp, J. Biol. Mol., Bd. 159 (1982), S. 601-621 das gleiche Plasmid und gaben an, daß keine Expression von DHFR erhalten wurde; a. a. O. S. 606. G. C. Wong et al., Science, Bd. 228 (1985), S. 810-815 verwenden einen Expressionsvektor, der folgende Bestandteile aufweist: einen SV40-Verstärker; den Adenovirus- späten Hauptpromotor und dreiteilige Leader-Sequenzen; ein Hybrid-Intron, bestehend aus einer 5′-Spleißstelle vom ersten Exon des dreiteiligen Leaders und einer 3′-Spleißstelle von einem Mäuse-Immunoglobulingen; zwei cDNAs, von denen die erste für ein gewünschtes Protein, einen kolonienstimulierenden Faktor, und die zweite für DHFR kodiert; die SV40- Polyadenylierungssequenz; und das VA-Gen. Dieser polycistronische Vektor erwies sich jedoch nur vorübergehend als arbeitsfähig (a. a. O. S. 810), erforderte die Anwesenheit von VA-RNA zur Steigerung der Translatierbarkeit (a. a. O. S. 811) und benötigte eine zweite cDNA, d. h. die von DHFR, zur Erhöhung der mRNA-Stabilität (a. a. O. S. 811). Obgleich somit ein beschränktes, vorübergehendes Expressionsvermögen für einige Proteine bei Adenovirus-späten Hauptvektoren, die den gesamten dreiteiligen Leader umfaßten, festgestellt wurde, bestehen bei bestimmten Proteinen zusätzliche Anforderungen für eine erfolgreiche kontinuierliche Expression.

Ein Vektor wurde konstruiert, der einen Zytomegalie-Virus- Promotor und -Verstärker, eine für Faktor VIII kodierende cDNA und eine 3′-Terminationssequenz enthielt, jedoch frei von jeglichen Introns oder konstruierten Spleißstellen war. Weder eine vorübergehende noch eine stabile Expression von Faktor VIII ließ sich bei irgendeiner der getesteten Zelltypen feststellen.

Ein weiterer Vektor, der frei von Introns oder konstruierten Spleißstellen war, aber die SV40-frühen Transkriptionssequenzen unter Einschluß des Verstärkers und Promotors, der für Faktor VIII kodierenden cDNA und der SV40- Polyadenylierungsstelle enthielt, ergab weder eine vorübergehende noch eine stabile Expression.

Ein Vektor, der den SV40-Promotor und -Verstärker, den gesamten dreiteiligen Adenovirus-späten Leader, d. h. drei Introns mit entsprechenden Donor- und Akzeptorstellen, für Faktor VIII kodierende cDNA und die 3′-Hepatitis- Oberflächenantigen-Polyadenylierungsstelle enthielt, ergab eine vorübergehende Expression von Faktor VIII nur in COS- Zellen, jedoch nicht in anderen Zelltypen.

Ein Vektor, der den SV40-Verstärker und -Promotor, das erste Intron des dreiteiligen Adenovirus-späten Hauptleaders, eine Akzeptorstelle des Immunoglobulin (Ig)-variablen Bereichs, für Faktor VIII kodierende cDNA und die SV40-Polyadenylierungsstelle enthielt, exprimierte den Faktor VIII vorübergehend in COC-Zellen, bewirkte jedoch keine Expression in anderen Zelltypen.

Ein Vektor wurde konstruiert, der einen SV40-Verstärker und -Promotor, die erste Donorstelle und das Intron des dreiteiligen Adenovirus-Hauptleaders, die Consensus-Sequenz für die Akzeptorsequenz des Ig-variablen Bereichs, die für Faktor VIII kodierende cDNA und die 3′-Polyadenylierungsstelle des Hepatitis-Oberflächenantigens enthielt. Dieser Vektor war nicht zur vorübergehenden oder stabilen Expression des Faktors VIII in der Lage.

Ein weiterer Vektor wurde konstruiert, der den SV40-Verstärker und -Promotor, die für Faktor VIII kodierende cDNA, ein SV40- kleines t-Antigen-Intron in 3′-Stellung zur cDNA, komplett mit Donor- und Akzeptorsequenz, und die SV40-Frühbereich- Polyadenylierungsstelle enthielt. Dieser Vektor war weder zur vorübergehenden noch zur stabilen Expression von Faktor VIII in beliebigen Zelltypen in der Lage.

Die hier beschriebenen Versuche belegen, daß eine stabilisierende Sequenz, d. h. entweder eine Donor-Intron- Akzeptor-Sequenz oder eine gentechnisch manipulierte Spleißsequenz für die stabile Expression von bestimmten Proteinen erforderlich ist. Diese Versuche zeigen ferner, daß die Position der stabilisierenden Sequenz für die stabile kontinuierliche Expression wichtig ist. Die Erfindung ist auf die Konstruktion und Verwendung von Vektoren mit einer speziellen stabilisierenden Sequenz in 5′-Stellung zur DNA, die für bestimmte, schwierig zu exprimierende Proteine kodiert, gerichtet. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor bewirkt nach Transfektion in eine ausgewählte Wirtszelle eine Transformation dieser Wirtszelle in der Weise, daß die Zelle zur kontinuierlichen Bildung des gewünschten Proteins, z. B. Faktor VIII, in der Lage ist. Ferner ist die Erfindung auf die Wahl einer geeigneten Zellinie und auf die Transfektion einer derartigen Wirtszelle abgestellt, so daß man eine für die kontinuierliche Herstellung des gewünschten Proteins geeignete Zellinie erhält.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß eine kontinuierliche Herstellung von einigen Proteinen unter Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors eine spezielle Anordnung einer stabilisierenden Sequenz in 5′-Stellung zu der für das gewünschte Protein kodierenden DNA erfordert. Ferner betrifft die Erfindung eine stabile zytoplasmatische mRNA, die sich unter Verwendung einer in 5′-Stellung zu einer für ein gewünschtes Protein kodierenden DNA befindlichen stabilisierenden Sequenz ergibt. Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf Expressionsvektoren abgestellt, die in Übereinstimmung mit den vorstehenden Befunden konstruiert sind und die das für das gewünschte heterologe Protein kodierende Gen exprimieren.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Wahl einer geeigneten Wirtszelle zur Transfektion mit dem erfindungsgemäßen Vektor. Schließlich betrifft die Erfindung die Transformation einer Wirtszelle unter Bildung einer stabilen Zellinie zur Herstellung des gewünschten heterologen Proteins.

Nachstehend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Konstruktion eines zur Bereitstellung von Produktionszellinien für Faktor VIII verwendeten Expressionsvektors, pF8CIS;

Fig. 2 die Konstruktion eines zur Bereitstellung von Produktionszellinien für Faktor VIII verwendeten Expressionsvektors, pF8CIS;

Fig. 3 die Immunoperoxidase-Färbung von Zellen nach der Transfektion; (A) zeigt die Expression nach Transfektion mit pF8CIS und (b) die Expression nach Transfektion mit pF8CIS;

Fig. 4 die Immunoperoxidase-Färbung von mit pF8CIS transfizierten, einer Amplifikationsrunde unterworfenen CHO- Zellen;

Fig. 5 die Immunoperoxidase-Färbung von mit pF8CIS transfizierten und drei Amplifikationsrunden unterworfenen CHO-Zellen;

Fig. 6 die Konstruktion eines zur Bereitstellung von Produktionszellinien für eine Faktor VIII-Variante verwendeten Faktor VIII-Varianten-Expressionsvektors, pF8CIS9080;

Fig. 7 die Immunoperoxidase-Färbung von mit dem Vektor pF8CIS9080, der für die Faktor VIII-Variante oder -Fusionsprotein kodiert, transfizierten Zellen;

Fig. 8 die Immunoperoxidase-Färbung von mit pF8CIS transfizierten, der kontinuierliche Amplifikation unterworfenen CHO-Zellen;

Fig. 9 die Konstruktion eines Expressionsvektors, pF8CIS-336E, der eine cDNA enthält, die für Faktor VIII mit Resistenz gegen proteolytische Spaltung durch aktiviertes Protein C kodiert;

Fig. 10 die Konstruktion eines Expressionsvektors, pF89080-336E, der eine cDNA enthält, die für ein Fusionsprotein von Faktor VIII mit Resistenz gegen proteolytische Spaltung durch aktiviertes Protein C kodiert;

Fig. 11 SDS-PAGE und Western-Blot-Analysen von gereinigtem 90kd+142aa+80kd-Fusionsprodukt: Etwa 8 µg des 90kd+ 142aa+80kd-Fusionsprodukts wurden SDS-PAGE aufgetrennt. Anschließend wurde das Protein durch Färben mit Coomassie-Blau nachgewiesen (A) oder auf Nitrocellulose für die Western-Blot-Analyse übertragen (B). Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen von Faktor VIII abgeleitetes Plasma wurde zum Nachweis des an Nitrocellulose gebundenen 90kd+142aa+ 80kd-Fusionsprodukts verwendet.

Fig. 12 die Thrombinaktivierung des 90kd+142aa+80kd- Fusionsprodukts. Etwa 11 µg des gereinigten 90kd+142aa+80kd- Fusionsprodukts in 0,05 m Tris vom pH-Wert 7,4 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl, 2,5 millimolar CaCl₂ und 5% Glycerin wurden mit 55 ng Thrombin 0,1 bis 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Aliquotmengen entfernt, in 0,05 m Tris vom pH-Wert 7,4 mit einem Gehalt an 0,01% Rinderserumalbumin auf 1/2000 bis 1/10 000 verdünnt und durch Koagulationsanalyse getestet. SDS-Puffer wurde zum Rest der Probe zugesetzt, die dann 5 Minuten auf 90°C erwärmt und anschließend der SDS-PAGE-Analyse (Inset) unterworfen wurde.

Fig. 13 die Bindung von 90kd+142aa+80kd-Fusionsprodukt an vWF. Das 90kd+142aa+80kd-Fusionsprodukt (275 Einheiten) in 0,05 m Tris vom pH-Wert 7,4 mit einem Gehalt an 150 nanomolar NaCl, 2,5 millimolar CaCl₂ und 5% Glycerin wurde über eine vWF-Sepharose-Säule gegeben. Die Säule wurde anschließend mit 3 Säurevolumina des vorgenannten Puffers gewaschen. Das 90kd +142aa+80kd-Fusionsprodukt wurde mit 0,25 m CaCl₂ eluiert. Die vWF-Sepharose-Säule wurde hergestellt, indem man reines vWF an Affigel 10 (Bio Rad) gemäß den Herstellerangaben kuppelte.

Fig. 14 die Konstruktionen eines zur Bereitstellung von Produktionszellinien für Prorelaxin verwendeten Prorelaxin- Expressionsvektors, pCIHRX;

Fig. 15 die Konstruktionen eines zur Bereitstellung von Produktionszellinien für Prorelaxin verwendeten Prorelaxin- Expressionsvektors, pCISRX;

Fig. 16 die Konstruktion eines zur Bereitstellung von Produktionszellinien für t-PA verwendeten t-PA- Expressionsvektors, pCIHt-PA;

Fig. 17 die Sequenz eines Teils von pF8CIS. Die DNA-Sequenz des Expressionsvektors enthält den Zytomegalie-Viurs-Verstärker und -Promotor (Nucleotide 1-732), die stabilisierende Sequenz, d. h. die Spleiß-Donor-Intron-Sequenz, die Ig-variabler Bereich-Intron- und Spleiß-Akzeptor-Sequenz (Nucleotide 733-900).

Fig. 18 die Sequenz eines Teils von pF8SCIS. Die DNA-Sequenz des Expressionsvektors enthält den SV40-Verstärker und -Promotor (Nucleotide 1-360), die stabilisierende Sequenz, die Zytomegalie-Viurs-Donor- und Intron-Sequenz, die Ig-variabler Bereich-Intron- und Spleiß-Akzeptor-Sequenz (Nucleotide 361-580).

Fig. 19 die Sequenz eines Teils von pF8CSSS. Die DNA-Sequenz des Expressionsvektors enthält den Zytomegalie-Viurs-Verstärker, -Promotor und -Leader (Nucleotide 1-732), die stabilisierende Sequenz unter Einschluß der gentechnisch manipulierten Spleiß-Donor- und Akzeptor-Sequenz (Nucleotide 733-736), Rest Leader.

Fig. 20 die Konstruktion eines zur Bereitstellung von Produktionszellinien von t-PA verwendeten t-PA- Expressionsvektors, pCISt-PA.

Definitionen und allgemeine Methoden

Der Ausdruck "Nucleotidsequenz" bezieht sich auf Nucleinsäure, die eine Reihe von Nucleotiden in einer 5′- an 3′- Phosphatdiester-Verknüpfung umfaßt, wobei es sich entweder um eine RNA- oder DNA-Sequenz handeln kann. Bei DNA kann die Nucleotidsequenz entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein. In ähnlicher Weise bezieht sich der Ausdruck "DNA- Sequenz" auf einzelsträngige und doppelsträngige Ausführungsformen.

Der Ausdruck "gewünschtes heterologes Protein" bezieht sich auf ein Protein, dessen Expression in einer Wirtszelle erwünscht ist, das aber die Wirtszelle selbst normalerweise nicht oder nur in geringen Mengen bildet und das für das Fortbestehen der Zellen normalerweise nicht notwendig ist. Zu diesen Proteinen gehören beliebige Moleküle mit der Prä- oder reifen Aminosäuresequenz sowie Aminosäure- und Glycosylierungsvarianten (unter Einschluß natürlicher Allelen), die mit dem gewünschten heterologen Protein eine biologische Wirkung gemeinsam haben.

Der Ausdruck "Spleißen" bezieht sich auf einen Mechanismus, bei dem ein einziges funktionelles RNA-Molekül durch Entfernung von einem oder mehreren inneren RNA-Bereichen während der Verarbeitung des primären Transkripts gebildet wird. Man nimmt an, daß das Spleißen mit einer Schleifenbildung des Introns beginnt, so daß das 5′-Ende des Introns (als Donor bezeichnet) neben das 3′-Ende des Introns (als Akzeptor bezeichnet) zu liegen kommt. Ein Vergleich der Basensequenzen an Intron-Exon-Verbindungsstellen ergibt übereinstimmende (Konsens-) Sequenzen, wobei die ersten beiden Basen am 5′-Ende eines jeden Introns GT und die letzten beiden Basen am 3′-Ende AG sind.

Der Ausdruck "gespleißte mRNA" bezieht sich auf mRNA, die hergestellt ist entweder durch Entfernung von einem oder mehreren internen RNA-Bereichen oder durch Konstruktion einer DNA, die bei der Transkription eine mRNA mit den gleichen Eigenschaften wie eine mRNA, die dem Spleißen unterworfen worden ist, aus der aber tatsächlich keine Nucleotidsequenz entfernt worden ist, bildet.

Der Ausdruck "stabilisierende Sequenz" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die die Bildung einer gespleißten mRNA durch Kodieren entweder einer Spleiß-Donor-Intron-Akzeptor-Sequenz oder durch Kodieren einer Sequenz, die die vollständige Konsens-Sequenz oder einen Teil davon für die Donor- und Akzeptor-Sequenz und die geeigneten Nucleotide an der Donor/Akzeptor-Verbindungsstelle umfaßt, veranlaßt, so daß die erhaltene mRNa funktionell einer gespleißten mRNA gleicht. Die stabilisierende Sequenz wird in die Leader- Sequenz des für das gewünschte heterologe Protein kodierenden Gens gebracht. Der Ausdruck "Leader-Sequenz" bezieht sich auf den mRNA-Bereich, der sich im 5′-nicht-translatierten Bereich zwischen der CAP-Stelle und dem AUG-Translationsstartsignal befindet.

Der Ausdruck "Konsens-Sequenz" bezieht sich auf die Sequenzen AG/GT AGT, die an der Exon-Intron-Grenze (oder Donor-Sequenz) auftreten, und (tNAG/G, die an der Intron-Exon-Grenze (oder Akzeptor-Sequenz) auftreten; vgl. S. M. Mount, Nucleic Acids Research, Bd. 10(2) (1982), S. 459-472. Analysen der Häufigkeit, mit der einzelne Basen in bestimmten Stellungen auftreten, ergaben eine Konsens-Sequenz für die Donor- und Akzeptor-Sequenzen. Es ist auch bekannt, daß Introns mit GT beginnen und mit AG enden; vgl. R. Breathnach et al., PNAS (USA), Bd. 75 (1978), S. 4853-4857. Ferner ist bekannt, daß bestimmte mehrteilige Leader-Sequenzen, in denen mehrfache Spleißereignisse auftreten, zusätzliche Faktoren der frühen Genfunktion benötigen können, um eine einwandfreie Funktion zu erreichen; vgl. L. E. Babiss et al., Mol. and Cell. Biol., Bd. 5(10) (1985), S. 2552-2558. Der Fachmann ist in der Lage, für ein gewünschtes Protein eine spezielle stabilisierende Sequenz auszuwählen, indem er sich der erfindungsgemäßen Lehre über die Donor- und Akzeptor- Konsens-Sequenzen, die mehrteiligen Leader-Sequenzen, in denen mehrfache Spleißereignisse eine frühe Genfunktion erforderlich machen, und die Konsens-Spleiß-Sequenzen-Regel bedient.

Der Ausdruck "Steuerbereich" bezieht sich auf spezielle Sequenzen an den 5′- und 3′-Enden von eukaryontischen Genen, die an der Steuerung der Transkription oder der Translation beteiligt sein können. Praktisch alle eukaryontischen Gene besitzen einen AT-reichen Bereich, der sich etwa 25 bis 30 Basen stromaufwärts von der Stelle, von der aus die Transkription eingeleitet wird, befindet. Eine weitere Sequenz, die sich etwa 70 bis 80 Basen stromaufwärts vom Start der Transkription befindet, ist ein CXCAAT-Bereich, in dem X ein beliebiges Nucleotid sein kann. Am 3′-Ende der meisten eukaryontischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Polyadenylierungsschwanzes an das 3′-Ende der transkribierten mRNA sein kann.

Der Ausdruck "Promotor" bezieht sich auf das Nucleotidsegment, das durch RNA-Polymerase-Moleküle, die die RNA-Synthese starten, erkannt wird. Promotoren, die die Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen steuern, lassen sich aus verschiedenen Quellen erhalten, z. B. den Genomen von Viren, wie Polyoma, Simian-Virus 40 (SV40), Adenovirus, Retroviren, Hepatitis B-Virus und insbesondere Zytomegalie-Viurs; oder von heterologen Säugetier-Promotoren, wie β-Actin-Promotor. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden im allgemeinen als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch die SV40-virale Ursprungsstelle der Replikation enthält; vgl. Fiers et al., Nature, Bd. 273 (1978), S. 113. Der unmittelbare frühe Promotor des humanen Zytomegalie-Viurs wird zweckmäßigerweise als ein HindIII E-Restriktionsfragment erhalten; P. J. Greenaway et al., Gene, Bd. 18 (1982), S. 355-360. Selbstverständlich sind auch Promotoren aus der Wirtszelle oder verwandten Spezies geeignet.

Der Ausdruck "Verstärker" bezieht sich auf cis-wirkende DNA-Elemente, im allgemeinen mit etwa 10-300 bp, die auf einen Promotor unter Steigerung von dessen Transkription wirken. Die Transkription von DNA, die für die Bildung eines gewünschten heterologen Proteins durch höhere Eukaryonten kodiert, wird durch Insertieren einer Verstärkersequenz in den Vektor gesteigert. Verstärker sind relativ orientierungs- und stellungsunabhängig und wurden in 5′-Stellung (vgl. L. Laimins et al., PNAS, Bd. 78 (1981), S. 993) und 3′-Stellung (vgl. M. L. Lusky et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 3 (1983), S. 1108) zur Transkriptionseinheit innerhalb eines Introns (vgl. J. L. Banerji et al., Cell, Bd. 33 (1983), S. 729) sowie innerhalb der kodierenden Sequenz selbst (vgl. T. F. Osborne et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 4 (1984), S. 1293) gefunden. Viele Verstärkersequenzen aus Säugetiergenen sind bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und Insulin). Typischerweise verwendet man jedoch einen Verstärker aus einem eukaryontischen Zellvirus. Beispiele sind der SV40-Verstärker an der späten Seite der Replikationsursprungsstelle (bp 100-270), der Zytomegalie-Viurs-frühe Promotor-Verstärker, der Polyoma-Verstärker auf der späten Seite der Replikationsursprungsstelle und Adenovirus-Verstärker.

In eukaryontischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, menschliche oder nukleierte Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendete Expressionsvektoren enthalten auch Sequenzen, die für die Termination der Transkription erforderlich sind und die mRNA- Expression beeinflussen können. Diese Bereiche werden als polyadenylierte Segmente im nicht-translatierten Bereich der für das gewünschte heterologe Protein kodierenden m-RNA transkribiert. Die 3′-nicht-translatierten Bereiche umfassen auch Transkriptions-Terminationsbereiche.

Expressionsvektoren können ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Ein Selektionsgen kodiert für ein Protein, gelegentlich als sekundäres Protein bezeichnet, das für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erforderlich ist. Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat-reduktase (DHFR), Thymidin-kinase oder Neomycin. Wenn derartige selektierbare Marker erfolgreich in eine Säugetierwirtszelle übertragen werden, kann die Säugetierwirtszelle überleben, wenn sie unter selektiven Druck gebracht wird. Es gibt zwei weit verbreitete unterschiedliche Kategorien von selektiven Systemen. Die erste Kategorie beruht auf einem Zellstoffwechsel und der Verwendung einer mutanten Zellinie, der die Fähigkeit zum Wachstum ohne Ergänzung des Mediums fehlt. Zwei Beispiele sind CHO-DHFR^-- Zellen und Mäuse-LTK^--Zellen. Diesen Zellen fehlt die Fähigkeit zum Wachstum ohne Zugabe von Nährstoffen, wie Thymidin oder Hypoxanthin. Da diesen Zellen bestimmte Gene, die für einen vollständigen Nucleotid-Syntheseweg erforderlich sind, fehlen, können sie nicht überleben, wenn nicht die fehlenden Nucliotide in einem ergänzten Medium bereitgestellt werden. Eine Alternative zu den ergänzten Medien ist es, ein intaktes DHFR- oder TK-Gen in Zellen, denen die jeweiligen Gene fehlen, einzuführen, wodurch deren Wachstumsbedürfnisse verändert werden. Individuelle Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformiert worden sind, sind nicht zum Überleben auf nicht-ergänzten Medien in der Lage. Daher erfordert die direkte Selektion von diesen Zellen das Zellwachstum in Abwesenheit von Ergänzungsnährstoffen.

Bei der zweiten Kategorie handelt es sich um eine dominante Selektion, die sich auf ein Selektionsschema bezieht, das in beliebigen Zelltypen angewandt wird und nicht die Verwendung einer mutanten Zellinie erforderlich macht. Bei diesen Schemata wird üblicherweise ein Arzneistoff angewandt, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Die Zellen mit einem neuen Gen exprimieren ein Arzneistoff- Resistenz mit sich bringendes Protein und überleben die Selektion. Beispiele für Arzneistoffe bei einer derartigen dominanten Selektion sind Neomycin (vgl. P. Southern und P. Berg, J. Molec. Appl. Genet., Bd. 1 (1982), S. 327), Mycophenolsäure (vgl. R. C. Mulligan und P. Berg, Science, Bd. 209 (1980), S. 1422) oder Hygromycin (vgl. B. Sugden et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 5 (1985), S. 410-413.) Die drei vorstehenden Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryontischer Steuerung zur Herbeiführung von Resistenz gegen den Arzneistoff Neomycin (G418 oder Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin. In den nachstehenden Versuchen handelt es sich beim Selektionsmittel der Wahl sehr häufig um G418-Geneticin, sofern nicht speziell auf CHO-DHFR^-- Zellen Bezug genommen wird. In diesem Fall wurde die direkte Selektion zur DHFR-Bildung angewandt.

Der Ausdruck "Amplifikation" bezieht sich auf die Vermehrung oder Replikation eines isolierten Bereichs innerhalb der chromosomalen DNA einer Zelle. Amplifikation wird unter Verwendung eines Selektionsmittels, z. B. Methotrexat (MTX), das DHFR inaktiviert, erreicht. Die Amplifikation oder Herstellung von aufeinanderfolgenden Kopien des DHFR-Gens führt zur Bildung von größeren DHFR-Mengen in Anwesenheit von größeren Mengen an MTX. Der Amplifikationsdruck wird trotz der Gegenwart von endogenem DHFR angewandt, indem man immer mehr MTX zum Medium gibt. Die Amplifikation eines gewünschten Gens kann durch Cotransfektion einer Säugetierwirtszelle mit einem Plasmid durchgeführt werden, das eine für ein gewünschtes Protein kodierende DNA und DHFR- oder Amplifikationsgen enthält, so daß die Cointegration ablaufen kann. Man gewährleistet, daß die Zelle mehr DHFR benötigt. Dieser Bedarf wird durch Replikation des Selektionsgens gestillt, indem man nur die Zellen selektiert, die in aufeinanderfolgenden Runden von immer größeren MTX- Konzentration wachsen können. Solange das für ein gewünschtes heterologes Protein kodierende Gen mit dem amplifizierbaren Gen kointegriert ist, gibt die Replikation dieses Gens zur Replikation des für das gewünschte Protein kodierenden Gens Anlaß. Somit ergibt sich, daß die vermehrten Kopien eines Gens, d. h. ein amplifiziertes Gen, das für das gewünschte heterologe Protein kodiert, größere Mengen des gewünschten heterologen Proteins exprimieren.

Bevorzugte geeignete Wirtszellen zum Exprimieren der erfindungsgemäßen Vektoren, die für die gewünschten heterologen Proteine in höheren Eukaryonten kodieren, sind: mit SV40 transformierte Affennieren-CVI-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); Human-Embryonieren-Linie (293; vgl. F. L. Graham et al., J. Gen. Virol., Bd. 36 (1977), S. 59), Babyhamster- Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10), Ovarialzellen des chinesischen Hamsters-DHFR (beschrieben von Urlaub und Chasin, PNAS (USA), Bd. 77 (1980), S. 4216), Mäuse-Sertoli-Zellen (TM4, J. P. Mather, Biol. Reprod., Bd. 23 (1980), S. 243-251); Affennieren-Zellen (CVI, ATCC CCL 70); Nierenzellen des grünen afrikanischen Affen (VERO-76, ATCC CRL 1587), humane Cervixkarzinom-Zellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenieren-Zellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane Lungenzellen (W 138, ATCC CCL 75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäusemammatumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); Ratten-Hepatomzellen (HTC, M1.54, H. Baumann et al., J. Cell. Biol., Bd. 85 (1980), S. 1-8); und TRI-Zellen (J. P. Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci-, Bd. 383 (1982), S. 44-68).

Der Ausdruck "Transformation" bezieht sich auf die Einführung von DNA in einen Organismus, so daß die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. Sofern nichts anderes angegeben ist, wird als Methode für die Transformation der Wirtszellen die Methode von F. Graham und A. van der Eb., Virology, Bd. 52 (1973), S. 456-457 angewandt.

Wirtszellen können mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transformiert und in herkömmlichen Nährmedien, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation von Genen modifiziert sind, gezüchtet werden. Die Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und dergl., entsprechen den Bedingungen, die bisher bei der für die Expression gewählte Wirtszelle angewendet worden sind und für den Fachmann ersichtlich sind.

Der Ausdruck "Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob irgendwelche kodierende Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Methoden für die Transfektion, z. B. CaPO₄-Behandlung und Elektroporation, sind dem Fachmann geläufig. Eine erfolgreiche Transfektion wird im allgemeinen erkannt, wenn es irgendeinen Hinweis gibt, daß dieser Vektor innerhalb der Wirtszelle eine Tätigkeit ausübt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft die erfolgreiche Transfektion jedoch eine stabile kontinuierliche Expression eines gewünschten heterologen Proteins durch eine Wirtskultur über zahlreiche Generationen hinweg.

Die Wahl der Wirtsproduktionszelle wird durch Screening auf vorübergehende Expression und anschließend auf nicht- amplifizierte Expression unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erreicht. Vektoren werden einem Screening auf vorübergehende Expression unterzogen, um festzustellen, ob diese Vektoren zur Expression eines gewünschten heterologen Proteins verwendet werden können. Eine vorübergehende Expression gibt einen Hinweis darauf, ob das spezielle Plasmid, das Funktionen aufgenommen hat, d. h. ob es unter Bildung des gewünschten Proteins transkribiert und translatiert worden ist. Während dieser Zeit wird die Plasmid- DNA, die in die Zelle eigetreten ist, in den Zellkern übertragen. Die DNA befindet sich in einem nicht-integrierten Zustand frei innerhalb des Kerns. Die Transkription des durch die Zelle aufgenommenen Plasmids erfolgt während dieser Periode. Vektoren, von denen die Fähigkeit zur vorübergehenden Bildung des gewünschten heterologen Proteins festgestellt worden ist, werden zur Bereitstellung einer stabilen kontinuierlichen Produkionszelle verwendet. Die vorübergehende Expression bezieht sich auf eine kurze Periode (12-72 h) im Anschluß an die Transfektion. Nach dieser anfänglichen Periode im Anschluß an die Transfektion wird die Plasmid-DNA abgebaut oder durch Zellteilung verdünnt. Eine willkürliche Integration innerhalb des Zellchromatins erfolgt. Ein Screening der Zellen nach zwei bis drei Wochen einer nicht-amplifizierten Expression gibt ein Indiz für Zellen, bei denen die rekombinante DNA erhalten geblieben ist und die zu einer permanenten Zellinie führen.

Ein Test auf der Basis einer Immunoperoxidase-Färbung von transfizierten Zellen wurde entwickelt, um rasch festzustellen, ob ein gewünschtes heterologes Protein exprimiert worden ist; vgl. C. M. Gorman et al., Cell, Bd. 42 (1985), S. 519-522). Für das gewünschte heterologe Protein spezifische monoklonale Antikörper wurden zur Verwendung in diesem Test ausgewählt. Wirtszellen mit einem Gehalt an dem Vektor wurden gefärbt und mit der Elternzellinie zum Screening von Zellen, die ein spezielles Protein bilden, verglichen. Ein monoklonaler Antikörper wurde ausgewählt, der das stärkste Signal bei geringstem Hintergrund ergab. Vorübergehende Transfektionen wurden zum Test von Vektoren auf die Fähigkeit zur Bildung eines gewünschten Proteins durchgeführt. Zellen (COS, 293, CHO, BHK, TM4) wurden unter Verwendung der CaPO₄-Technik transfiziert; Graham und van der Eb, modifiziert durch C. M. Gorman et al., Science, Bd. 221 (1983), S. 551-553. Wir verwendeten 10 µg pro ml Niederschlag des speziellen, zu testenden Proteinvektors. Die Niederschläge wurden 3 bis 4 h auf den Zellen belassen. Sodann wurden die Zellen durchschnittlich 1 Minute einem Glycerin-Schock unterworfen. 36 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit Aceton-Methanol (50 : 50) fixiert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Färbung wurde durchgeführt, indem man entweder unverdünnten, monoklonalen Antikörper-Überstand oder in PBS mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum auf 1 : 3000 verdünnten gereinigten Antikörper verwendete. Der erstgenannte Antikörper verblieb 2 h auf den Zellen. Während dieser Zeit wurden Platten auf einen langsamen Schüttler gelegt. Die Zellen wurden 5-mal innerhalb von 10 Minuten gewaschen. Beim zweiten verwendeten Antikörper handelte es sich um Kaninchen-anti- Mäuse-IgG (Dakopatts). Er wurde in PBS+fötales Kälberserum auf 1 : 150 verdünnt. Einer 2-stündigen Inkubation schloß sich eine weitere Serie von Waschvorgängen an. Zur Entwicklung wurde das Peroxidase-Reagens o-Dianisidin als Substrat verwendet. Eine mit Äthanol gesättigte Lösung von o-Dianisidin wurde 1 : 100 in PBS verdünnt, wobei die Verdünnung von Wasserstoffperoxid 1 : 10 000 betrug. Dieses Substrat wurde 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C stehen gelassen.

Gemäß diesem Verfahren konnte für eine große Anzahl von für ein gewünschtes Protein kodierenden Vektoren rasch ein Screening auf die Fähigkeit zur direkten Proteinexpression durchgeführt werden.

Coatest-Faktor VIII wurde von Helena Laboratories, Beaumont, TX (Kat. Nr. 5293) bezogen. Das Verfahren entsprach im wesentlichen der vom Hersteller angegebenen "Endpunktsmethode" für Proben mit einem Gehalt an weniger als 5% Protein.

Die Produktionszellinien wurden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Plasmide, die eine vorübergehende Funktion in einer großen Anzahl von Zellen zeigten, bereitgestellt. Expressionsvektoren wurden in eine Anzahl von Zellinien transfiziert. Für diese Transfektionen wurden insgesamt 10 µg DNA/ml Niederschlag verwendet. Die Selektion in bezug auf die Expression wurde in diesen Zellen unter Verwendung eines vorstehend beschriebenen selektierbaren Markers ermöglicht. Sämtliche Zellen wurden mit modifizierter CaPO₄-Technik transfiziert, mit Ausnahme von BRL-Zellen, bei denen eine Empfindlichkeit gegen Calcium festgestellt wurde. Für diese Zellen wurde die Elektroporation angewandt. Transfizierte Zellen wurden, wie vorstehend beschrieben, aus geeigneten Wirtszellen ausgewählt.

Das Verfahren zur Bereitstellung von Produktionszellinien beruhte in starkem Umfang auf den vorstehend beschriebenen Färbeverfahren. Zwei Tage nach der Transfektion wurden Subkulturen der Zellen in einem Selektionsmedium hergestellt. Das Medium wurde zur Festlegung einer geeigneten Menge der speziellen, für die Selektion erforderlichen Substanz titriert. Gleichzeitig mit der Transfektion der Zellen zur Bereitstellung einer Produktionzellinie wurde eine Schale des jeweiligen Zelltyps auf die vorübergehende Expression getestet.

Um die folgenden Beispiele übersichtlicher zu gestalten, werden nachstehend einige häufig vorkommende Methoden und/oder Ausdrücke beschrieben.

"Plasmide" werden durch den vorangestellten Kleinbuchstaben p und anschließende Großbuchstaben und/oder Zahlen bezeichnet. Die hier verwendeten Ausgangsplasmide sind entweder handelsüblich, öffentlich unbeschränkt zugänglich oder lassen sich aus erhältlichen Plasmiden gemäß bekannten Verfahren konstruieren. Ferner sind Plasmide, die mit den beschriebenen Plasmiden äquivalent sind, bekannt und dem Fachmann geläufig.

Der Ausdruck "Verdauung" von DNA bezieht sich auf eine katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf bestimmte Sequenzen, Restriktionsstellen, in der DNA wirkt. Die hier verwendeten verschiedenen Restriktionsenzyme sind handelsüblich. Ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Erfordernissen entsprachen dem Kenntnisstand des Fachmanns. Für analytische Zwecke wurde typischerweise 1 µg des Plasmids oder DNA-Fragments mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 ml Pufferlösung verwendet. Zur Isolation von DNA- Fragmenten für die Plasmidkonstruktion wurden typischerweise 5 bis 10 µg DNA mit 20 bis 40 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete Puffer- und Substratmengen für die speziellen Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 h bei 37°C werden üblicherweise angewandt. Diese Zeiten können aber in Übereinstimmung mit den Herstellerangaben variieren. Nach der Verdauung wird die Reaktion direkt auf einem Gel durchgeführt, um das gewünschte Fragment zu isolieren.

Der Ausdruck "Dephosphorylierung" bezieht sich auf die Entfernung der terminalen 5′-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Dieses Verfahren hindert die beiden durch die Restriktion gespaltenen Enden eines DNA-Fragments an der "Zirkularisierung" oder Bildung einer geschlossenen Schleife, was die Inserion eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Für die Dephosphorylierung werden übliche Verfahren und Reagenzien angewandt; vgl. T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 1982, S. 133-134. Reaktionen unter Verwendung von BAP wurden in 50 millimolar Tris bei 68°C durchgeführt, um die Aktivität von Exonucleasen, die in den Enzympräparationen vorhanden sein können, zu unterdrücken. Die Reaktionen wurden 1 h durchgeführt. Im Anschluß an die Reaktion wurde das DNA- Fragment der Gelreinigung unterzogen.

Der Ausdruck "Oligonucleotide" bezieht sich auf kurze einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide, die chemisch nach bekannten Verfahren synthetisiert und anschließend an Polyacrylamidgelen gereinigt werden.

Der Ausdruck "Ligation" bezieht sich auf ein Verfahren zur Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten; vgl. T. Maniatis, a. a. O., S. 146. Sofern nichts anderes angegeben ist, kann die Ligation unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten an T4-DNA-Ligase (Ligase) pro 0,5 mg von etwa äquimolaren Mengen der zu verknüpfenden DNA- Fragmente erreicht werden.

Die Ausdrücke "Füllen" oder "Abstumpfen" beziehen sich auf Verfahren, bei denen das einzelsträngige Ende an der kohäsiven Endposition einer durch ein Restriktionsenzym gespaltenen Nucleinsäure in einen doppelsträngigen Zustand übergeführt wird. Dadurch wird die kohäsive Endposition beseitigt und ein stumpfes Ende gebildet. Dieses Verfahren ist ein vielseitiges Werkzeug zur Umwandlung eines durch Restriktion geschnittenen Endes, das mit den Enden, die nur durch ein einziges oder wenige andere Restriktionsenzyme geschaffen werden, kohäsiv ist, in eine Endposition, die mit beliebigen abgestumpften, durch eine Restriktionsendonuclease geschnittenen oder anderweitig gefüllten kohäsiven Endpositionen verträglich ist. Typischerweise wird das Abstumpfen durch Inkubieren von 2 bis 15 µg der Ziel-DNA in 10 millimolar MgCl₂, 1 millimolar Dithiothreit, 50 millimolar NaCl, 10 millimolar Tris-Puffer (pH-Wert 7,5) von etwa 37°C in Gegenwart von 8 Einheiten Klenow-Fragment von Polymerase I und jeweils 250 mikromolar der vier Desoxynucleosid-triphosphate erreicht. Die Inkubation ist im allgemeinen nach 30 Minuten beendet. Anschließend folgt eine Extraktion mit Phenol und Chloroform und eine Fällung mit Äthanol.

Der Ausdruck "Northern-Blotting" bezieht sich auf ein Verfahren, durch das die Anwesenheit von zellulärer mRNA durch Hybridisierung mit einem bekannten, markierten Oligonucleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Sofern nichts anderes angegeben ist, wird hier unter Northern-Analyse die einfache elektrophoretische Trennung von mRNA an 1% Agarose in Gegenwart eines Denaturierungsmittels (7% Formaldehyd), Übertragung auf Nitrocellulose und Hybridisierung mit einem markierten Fragment gemäß T. Maniatis et al., a. a. O. S. 202 verstanden.

Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung der bisher bekannten günstigsten Ausführungsformen der Erfindung, sollen jedoch nicht als Beschränkung verstanden werden. Auch der Inhalt der genannten Druckschriften soll zum Offenbarungsgehalt der Beschreibung gehören.

Beispiel 1 Expressionsvektor 1. Konstruktion von Expressionsvektoren

Die für den humanen Faktor VIII kodierende cDNA wurde zur Konstruktion von Plasmiden verwendet, die die Expression von Faktor VIII-Protein in transfizierten Säugetierzellen dirigieren; vgl. W. Wood et al., Nature (London), Bd. 312 (1984), S. 330-337. Diese transformierten Säugetierzellen schieden etwa 0,14 mU/ml Faktor VIII aus. Das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet die kontinuierliche Herstellung von Faktor VIII mit erheblich größeren Ausbeuten.

a) pF8CIS

Der Vektor pF8CIS, der den Zytomegalie-Viurs-Verstärker (vgl. M. Boshart et al., Cell., Bd. 41 (1985), S. 520) und -Promotor (vgl. D. R. Thomson et al., PNAS, Bd. 81 (1984), S. 659-663), die Zytomegalie-Viurs-Spleiß-Donor-Stelle und einen Teil eines Introns (vgl. R. M. Sternberg et al., T. of Virol., Bd. 49 (1984), S. 190-199), die Ig-variabler Bereich-Intron- und -Spleiß-Akzeptor-Stelle, die für Faktor VIII kodierende cDNA und die SV40-Polyadenylierungsstelle enthält, wurde konstruiert.

Fig. 1 zeigt die Stufen der Konstruktion für den Faktor VIII- Expressionsvektor, die zur Bereitstellung von Produktionszellinien für den Faktor VIII angewandt wurden. Nachstehend sind die drei Teile der Konstruktion näher erläutert.

1) Der Ampicillin-Restistenzmarker und die Replikations­ ursprungsstelle des endgültigen Vektors wurden vom Startplasmid pUC13pML, einer Variante des Plasmids pML (vgl. M. Lusky und M. Botchen, Nature, Bd. 293 (1981), S. 79 abgeleitet. pUC13pML wurde durch Übertragen des Polylinkers von pUC13 (vgl. J. Veira und J. Messing, Gene, Bd. 19 (1982), S. 259) auf die EcoRI- und HindIII-Stellen von pML konstruiert. Ein zweites Startplamid pUC8CMV war die Quelle für die CMV- Verstärker-, -Promotor- und -Spleiß-Donor-Sequenz. pUC8CMV wurde konstruiert, indem man die Nucleotide 1-732, wie in Fig. 17 gezeigt, für CMV-Verstärker, -Promotor und -Spleiß-Donor- Sequenz in die abgestumpften PstI- und SphI-Stellen von pUC8 insertierte; vgl. J. Veira und J. Messing, a. a. O.). Synthetische BamHI-HindIII-Linker (im Handel erhältlich von New England Biolabs) wurden mit dem kohäsiven BamHI-Ende unter Schaffung einer HindIII-Stelle verknüpft. Anschließend an diese Ligation wurde eine HindIII-HincII-Verdauung durchgeführt. Diese Verdauung lieferte ein Fragment von etwa 800 bp, die den CMV-Verstärker, -Promotor und -Spleiß-Donor- Stelle enthielten. Nach Gelisolation dieses 800 bp-Fragments wurde mit einem 2900 bp-Stück von pUC13pML verknüpft. Das für die Konstruktion von pF8CIS erforderliche Fragment wurde durch Verdauung des vorstehenden Zwischenplasmids mit SalI und HindIII erhalten. Dieses 3123 bp-Stück enthielt den Resistenzmarker für Ampicillin, die Ursprungsstelle aus pUC13pML und die Steuersequenzen für CMV unter Einschluß von Verstärker, Promotor und Spleiß-Donor-Stelle.

2) Die Ig-variabler Bereich-Intron- und -Spleiß-Akzeptor- Sequenz wurde unter Verwendung eines synthetischen Oligomeren, wie im Mittelbereich von Fig. 1 gezeigt, konstruiert. Ein 99-mer und ein 30-mer wurden chemisch mit der folgenden Sequenz für die IgG-Intron- und -Spleiß-Akzeptorstelle synthetisiert (vgl. Bothwell et al., 1981).

DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) wurde in das synthetische Stück gefüllt und schuf ein doppelsträngiges Fragment; vgl. R. M. Wartell und W. S. Reznikoff, Gene, Bd. 9 (1980), S. 307. Daran schloß sich eine Doppelverdauung mit PstI und HindIII an. Dieser synthetische Linker wurde in pUC13 (vgl. J. Veira und J. Messing, Gene, Bd. 19 (1982), S. 259) in die PstI- und HindIII-Stellen geklont. Der das synthetische Oligonucleotid, d. h. markiertes pUCIg.10 enthaltende synthetische Klon wurde mit PstI verdaut. Eine ClaI-Stelle wurde an dieses Fragment unter Verwendung eines PstI-ClaI-Linkers angefügt. Nach Verdauung mit HindIII wurde ein 118 bp-Stück mit einem Teil des Ig-Introns und des Ig-variabler Bereich-Spleiß-Akzeptors durch Gelisolation gewonnen.

3) Im dritten Teil des Konstruktionsschemas wurde das Hepatitis-Oberflächenantigen-3′-Ende durch die Polyadenylierungsstelle und die Transkriptions- Terminationsstelle des frühen Bereichs von SV40 ersetzt. Der Vektor pUC.SV40 mit einem Gehalt an SV40-Sequenzen wurde in pUC8 an der von J. Veira und J. Messing, a. a. O. beschriebenen BamHI-Stelle insertiert. pUC-SV40 wurde sodann mit EcoRI und HpaI verdaut. Ein 143 bp-Fragment, das nur die SV40- Polyadenylierungsstelle enthielt, wurde aus diesem Verdauungsprodukt durch Gelisolation gewonnen. Zwei zusätzliche Fragmente wurden durch Gelisolation im Anschluß an die Verdauung von pSVE.8c1D gewonnen; Europäische Patentveröffentlichung 1 60 457. Das durch EcoRI- und ClaI- Verdauung gebildete 4,8 kb-Fragment enthält die SV40-DHFR- Transkriptionseinheit, die Ursprungsstelle von pML und den Ampicillin-Resistenzmarker. Das im Anschluß an Verdauung mit ClaI und HpaI gebildete 7,5 kb-Fragment enthält die cDNA für Faktor VIII. Eine dreiteilige Ligation liefert pSVE.8c24D. Dieses Zwischenplasmid wurde mit ClaI und SalI verdaut, wodurch ein 9601 bp-Fragment mit einem Gehalt an der cDNA für Faktor VIII mit SV40-Polyadenylierungs- und Transkriptions- Terminationsstellen, gefolgt von der SV40-DHFR- Transkriptionseinheit erhalten wurde.

Zur endgültigen Ligation der drei Teile unter Bildung von pF8CIS wurden verwendet:

• a) das 3123 bp-SalI-HindIII-Fragment mit der Replikationsursprungsstelle, der Ampicillin- Resistenzmarker und der CMV-Verstärker, -Promotor und -Spleiß-Donor;
• b) das 118 bp-HindIII-ClaI-Fragment mit dem Ig- Intron und -Spleiß-Akzeptor; und
• c) ein 9611 bp-ClaI-SalI-Fragment mit der cDNA für Faktor VIII, der SV40-Polyadenylierungsstelle und der SV40-Transkriptionseinheit. Ein Teil der Sequenz des Expressionsvektors pF8CIS ist in Fig. 17 gezeigt.

b) pF8CSSS

Der Vektor pF8CSSS mit dem Zytomegalie-Viurs-Verstärker und -Promotor, einer gentechnisch manipulierten stabilisierenden Sequenz, der für Faktor VIII kodierenden cDNA und der SV40- Polyadenylierungsstelle wurde konstruiert. Der gesamte Intron- Bereich unter Einschluß der Donor- und Akzeptorsequenzen wurde deletiert und durch eine gentechnisch manipulierte, stabilisierende Sequenz ersetzt. Bei der stabilisierenden Sequenz handelte es sich um ein synthetisches doppelsträngiges Oligomer mit einer Sequenz der reifen mRNA unter anschließender Spleißung. Die stabilisierende Sequenz wurde zwischen die einzigen SacII- ClaI-Stellen von pF8CIS insertiert. Die Sequenzen der synthetischen Oligomeren waren folgende:

Die synthetischen Oligomeren umfassen die geeigneten Nucleotide der Donor- und Akzeptor-Konsens-Spleiß-Sequenzen. Die Nachbarstellung der Spleiß-Donor-Sequenz zur Spleiß- Akzeptor-Sequenz ist durch Unterstreichung angezeigt. Dieser Vektor gleicht dem vorstehend erörterten pF8CIS-Vektor mit Ausnahme der Deletion des Intron-Bereichs und Ersatz durch eine gentechnisch manipulierte Sequenz. Diese Konstruktion beseitigt die tatsächliche Spleißung des nicht kodierenden Bereichs von der kürzlich transkribierten mRNA. Ein Teil der Sequenz des Expressionsvektors pF8CSSS mit der gentechnisch manipulierten stabilisierenden Sequenz ist in Fig. 19 gezeigt.

c) pF8CIS

Der Vektor pF8CIS mit dem SV40-Verstärker und -Promotor, der Zytomegalie-Virus-Spleiß-Donor-Stelle und einem Teil des Introns, dem Ig-Intron und -Spleiß-Akzeptor-Stelle, der für Faktor VIII kodierenden cDNA und den SV40-Polyadenylierungs- und -Transkriptions-Termiantionsstellen wurde konstruiert.

Fig. 2 zeigt die Konstruktion von pF8SCIS.

Dieser Vektor wurde unter Anwendung einer dreiteiligen Ligation konstruiert. Die Herstellung der einzelnen drei DNA-Fragmente für diese Ligation ist nachstehend beschrieben:
Das erste Fragment enthielt den SV40-Frühbereich-Promotor und -Verstärker und eine Hälfte des Ampicillin-Resistenzmarkers, der aus dem Plasmid pML erhalten worden war. Das Startplasmid für die ersten drei Fragmente war pAML3P.8Cl; Europäische Patentveröffentlichung 1 60 457. Dieses Plasmid wurde mit SacI geschnitten. Unter Verwendung der Gesamt-Enzym-DNA-Polymerase I wurde dieser durch SacI geschaffene 3′-Überhang abgestumpft. Anschließend an diese Reaktion wurde das Plasmid mit PvuI geschnitten. Das gewünschte 434 bp-Fragment wurde aus einem Acrylamidgel isoliert.

Die für diese Konstruktion verwendeten zweiten und dritten Fragmente wurden aus dem vorstehend beschriebenen Plasmid pF8CIS isoliert.

Das Fragment 2 enthielt den Spleiß-Donor aus dem CMV- unmittelbaren frühen Gen und einen Teil des folgenden Introns. Intron und Spleiß-Akzeptor wurden synthetisch auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt. pF8CIS wurde mit SacII geschnitten und der erhaltene 3′-Überstand wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I abgestumpft. Dieser Reaktion folgte die Spaltung mit ClaI. Da die die ClaI-Stelle umgebende Sequenz in pF8CIS die Spaltung verhindert, wenn das Plasmid in einem Methylierungs-plus-Stamm gezüchtet wird, wurde pF8CIS aus dem dam^--Stamm GM48 hergestellt; vgl. M. G. Marinus und N. R. Maris, Bacteriol., Bd. 114 (1973), S. 1143-1150; und G. E. Geier und P. Madrid, J. Biol. Chem., Bd. 254 (1979), S. 1408-1413. Da sowohl SacII als auch ClaI einzige Stellen in diesem Vektor sind, wurde das 231 bp-Fragment leicht aus einem Agarosegel isoliert.

Das dritte Fragment enthält die cDNA für Faktor VIII, die SV40-Frühbereich-Polyadenylierungsstelle, eine SV40-DHFR- transkriptionale Einheit, die Replikationsursprungsstelle von pML und die Hälfte des Ampicillin-Gens. Das 11308 bp-Fragment wurde durch Verdauung von pF8CIS (dam^-) mit ClaI und PvuI hergestellt.

Die dreiteilige Ligation unter Schaffung von pF8CIS zerstört die SacI- und SacII-Stellen, erhält die Cla-Stelle und rekonstruiert das amp^r-Gen an der PvuI-Stelle. Ein Teil der Nucleotidsequenz des Expressionsvektors pF8CIS ist in Fig. 18 gezeigt.

Beispiel 2 Expressionsanalyse 1. Vorübergehende Expression

Die Faktor VIII-Expression wurde auf der Basis der Immunoperoxidase-Färbung von transfizierten Zellen getestet; vgl. Gorman et al., Cell, Bd. 42 (1985), S. 519-526. Diese Bestimmung wurde verwendet, um Vektoren in bezug auf die Expression von Faktor VIII zu testen. 12 für Faktor VIII spezifische, monoklonale Antikörper wurden zur Verwendung in diesem Test ausgewählt. BHK-31A3B-Zellen (Europäische Patentveröffentlichung 1 60 457) wurden gefärbt und mit der Eltern-BHK-Linie zum Screening von Zellen, die Faktor VIII bilden, verglichen. Der monoklonale Antikörper BH6 zeigte das stärkste Signal mit dem geringsten Hintergrund. Transfektionen wurden durchgeführt und die vorübergehende Expression von Faktor VIII getestet. Zellen (COS, 293, CHO, BHK, TM4) wurden unter Anwendung der CaPO₄-Technik transfiziert. 10 µg pro ml Faktor VIII-Vektor-Niederschlag wurden getestet. Die Niederschläge wurden 3 bis 4 h auf den Zellen belassen. Sodann wurden die Zellen durchschnittlich 1 Minute einem Glycerin- Schock unterworfen. 36 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit Aceton-Mehanol (50 : 50) fixiert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellen wurden unter Verwendung von entweder unverdünntem BH6- Überstand oder von gereinigtem BH6-Antikörper, der in PBS mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum auf 1 : 3000 verdünnt worden war, gereinigt. Dieser erste Antikörper verblieb 2 h auf den Zellen. Während dieser Zeit wurden Platten auf einen langsamen Schüttler gelegt. Die Zellen wurden 5-mal innerhalb von 10 Minuten gewaschen. Ein zweiter Antikörper von Kaninchen-anti-Mäuse-IgG (Dakopatts) wurde in PBS+fötales Kälberserum auf 1 : 150 verdünnt. Einer 2-stündigen Inkubation schloß sich eine weitere Serie von Waschvorgängen an. Zur Entwicklung wurde das Peroxidase-Reagens o-Dianisidin (Sigma) als Substrat verwendet. Eine mit Äthanol gesättigte Lösung von o-Dianisidin wurde 1 : 100 in PBS verdünnt, wobei die Verdünnung von Wasserstoffperoxid 1 : 10 000 betrug. Dieses Substrat wurde 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C auf den Zellen belassen.

Dieses Verfahren ergab ein Screening auf die Faktor VIII-Vektoren, die die Faktor VIII-Expression dirigieren. Dieses Verfahren bestimmt die vorübergehende Faktor VIII-Expression. Eine Färbung 36 h nach der Transfektion ergibt einen Hinweis, ob der Vektor transkribiert und die mRNA translatiert worden ist.

pF8CIS dirigierte die vorübergehende Expression von Faktor VIII in mindestens fünf unterschiedlichen Zellinien: COS, 293, CHO, TM4 und BHK. Fig. 3A zeigt die vorübergehende Expression des Vektors pF8CIS in CHO-Zellen.

Es wurde festgestellt, daß pF8SCIS die vorübergehende Expression von Faktor VIII ebenso wirksam dirigiert wie pF8CIS. Fig. 3B zeigt die vorübergehende Expression des Vektors pF8SCIS in CHO-Zellen. Da der CMV-Verstärker und -Promotor vollständig durch den analogen SV40-Verstärker und -Promotor ersetzt werden können, ist die Faktor VIII-Bildung nicht vom spezifischen Transkriptionsstartsignal abhängig, sondern vielmehr von anderen Teilen des Steuerbereichs, z. B. von der Stelle der stabilisierenden Sequenzen im Vektor.

Gleichzeitig mit der Transfektion der Zellen zur Bereitstellung einer Produktionszellinie wurden eine Schale eines jeden Zelltyps auf die vorübergehende Expression getestet. Als Ergebnis des Screenings auf vorübergehende Expression von Faktor VIII ergaben sich zwei Klassen von Zellen; Zelltypen, die eine positive Färbung auf Faktor VIII 36 h nach der Transfektion ergaben (Kategorie 1); und Zelltypen, die keine nachweisbare vorübergehende Expression von Faktor VIII zeigten (Kategorie 2). Die Wirtszellen mit den jeweiligen Kategorien sind nachstehend angegeben.

Kategorie 1Kategorie 2 CHOMDCK 293BRL BHKHeLa TM4Vero HTCWI38 COSCV1 HepG2
TR1

Wie vorstehend erläutert, führt die Deletion der Ig-variabler Bereich-Intron-Donor- und Akzeptor-Stellen unter Beibehaltung der anderen Steuerbereiche zu einer Elimination der vorübergehenden Expression von Faktor VIII. Aus diesen Daten ergibt sich, daß mindestens eine Spleiß-Donor-Intron- Akzeptor-Sequenz für die Expression erforderlich ist.

Weitere Versuche zeigen, daß die Stellung der stabilisierenden Sequenz wichtig ist. Beispielsweise ergab die Positionierung eine Introns in 3′-Stellung zur für Faktor VIII kodierenden cDNA keine Expression von Faktor VIII. Vektoren, die unter Einschluß der Spleißstellen von nativem Faktor VIII, d. h. Spleißstellen innerhalb des kodierenden Bereichs, konstruiert wurden, erwiesen sich ebenfalls als erfolglos. Die Spleiß-Donor-Akzeptor-Anordnung, enthaltend die CMV-Spleiß- Donor-Sequenz und ein chimäres Intron, umfassend CMV-Sequenzen und das synthetisierten Ig-variabler Bereich-Intron und -Akzeptor, ist ein Beispiel für eine stabilisierende Sequenz, die zur Bereitstellung einer Zellinie für die kontinuierliche Herstellung von Faktor VIII führt.

2. Kontinuierliche Herstellung

Produktionszellinien wurden bereitgestellt, indem man die Plasmide, die eine stabilisierende Sequenz enthielten und in einer großen Anzahl von Zellen vorübergehend ihre Funktion zeigten, in eine Anzahl von Zellinien transfizierte. Für diese Transfektionen wurden insgesamt 10 µg/ml Niederschlag verwendet. Zur Transfektion von CHO-DHFR-Zellen wurden 4 µg Faktor VIII-Plasmid zu 6 µg Lachssperma-DNA, die als Träger diente, gegeben; vgl. M.Wigler et al., a. a. O. Die direkte Selektion auf Expression des DHFR-Gens war in diesen Zellen möglich. Sämtliche übrigen Zelltypen erforderten eine Cotransfektion mit einem das Neomycin-Gens exprimierenden Plasmid; vgl. J. Davies und A. Jenning, Am. J. Trop., Med. Hyg., Bd. (5) (1980), S. 1089-1092. Es wurden entweder PSVENeoBa16 (Europäische Patentveröffentlichung 1 60 457) oder pRSVNeo (Gorman et al., Science, Bd. 221 (1983), S. 551-553) verwendet. Für diese Transfektion wurden 4 µg Faktor VIII-Plasmid für 1 µg Neomycin enthaltendes Plasmid und 5 µg Lachsspermaträger verwendet. Sämtliche Zellen wurden unter Anwendung der vorstehend erörterten modifizierten CaPO₄- Technik transfiziert, ausgenommen BRL. Zu den transfizierten Zellen gehörten: BHK, CHO-DHFR, CV1, VERO, WI38, 293, TM4, HeLa, MDCK, HTC, BRL, TR1 und HepG2.

Bei der Bereitstellung der Produktionslinien stützte man sich weitgehend auf die vorstehend beschriebene Färbemethode. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in Selektionsmedien mit einem Mangel an Glycin, Hypoxanthin und Thymidin im Fall der CHO-DHFR-Zellen oder in G418 enthaltenden Medien einer Subkultur unterworfen. Die G418-Konzentrationen wurden zur Bereitstellung der geeigneten Menge für die Selektion titriert.

3 bis 4 Wochen nach dem Einsetzen der Selektion wurden die Zellen einem Screening auf stabile Expression von Faktor VIII unterworfen. Eine Schale der Klone wurde gefärbt, um den prozentualen Anteil an Faktor VIII exprimierenden Klonen zu bestimmen. Im Anschluß an diese Bestimmung wurden jeweils 12 Klone der Zelltypen zum Färben entnommen. Klone, die sich zu diesem Zeitpunkt als positiv erwiesen, was auf eine stabile Expression hinwies, wurden sodann quantitativ nach dem Coatest-Verfahren bestimmt.

Die Zellen, die keine vorübergehende Expression ergaben, zeigten zu diesem Zeitpunkt keine stabile Expression, z. B. VERO, HeLa. Die stabile Expression von Faktor VIII wurde in zwei Zellkategorien beobachtet:

• 1) einige Zellen, die während dieser ersten Runde von stabiler Expression eine negative Bewertung hinsichtlich der vorübergehenden Expression von Faktor VIII erhielten, z. B. CHO- und BHK-Zellen, zeigten keine zur Färbung ausreichend hohen stabilen Expressionsniveaus; und
  2) Zellinien, die sowohl in den vorübergehenden als auch in den nicht-amplifizierten Stadien eine positive Färbung zeigten, z. B. TM4, HTC und 293, die dann als potentielle Produktionszellinien bezeichnet werden. +-TM4CHO HTCBHK 293VERO
  HeLA
  CV1
  WI38
  BRL

Niedere Konzentrationen an Faktor VIII in CHO-Zellen wurden durch das Coatest-Verfahren ermittelt. Folgende Ergebnisse wurden beim Coatest erhalten:
Faktor VIII-Konzentrationen in nicht-amplifizierten Zellen

WirtszellenmU/10⁴-Zellen/Tag

TM4  1,8 HTC  0,5 293  2,5 CHO<0,15 BHK<0,15

Die Ergebnisse der vorstehenden Tests belegen variierende Konzentrationen der Faktor VIII-Bildung innerhalb der Klasse von Produktionswirtszellen. Die Ergebnisse der Immunoperoxidase-Färbung von für eine vorübergehende Expression transfizierten Zellen zum Zeitpunkt 36 bis 48 h und der anschließenden Färbung von nicht-amplifizierten Zellen 3 bis 4 Wochen danach, ermöglichten eine Vorhersage für die Verwendung eines speziellen Zelltyps als Produktionszelle für Faktor VIII. Wenn die Zellen keine positive Färbung ergaben, was ein fehlender Faktor VIII im vorübergehenden und im nicht- amplifizierten Niveau zeigte, war es unwarscheinlich, daß die Wirtszelle als Produktionszellinie für Faktor VIII dienen konnte. Dieser Schluß wird durch die Ergebnisse der Färbung von CHO-, BHK-, TM4- und 293-Zellen auf Faktor VIII-Expression nach Amplifikationsrunden gestützt.

Im Anschluß an die erste Amplifikationsrunde (MTX: 100 nanomolar) wurden Klone wieder aus den vorhergehenden transformierenden Zelltypen isoliert und auf die Herstellung von Faktor VIII analysiert. Die Ergebnisse der Faktor VIII-Expression nach dieser ersten Amplifikationsrunde waren folgende:
Faktor VIII-Konzentrationen nach 1 Amplifikationsrunde

WirtszellenmU/10⁴ Zellen/Tag

TM43,0 HTC2,3 CHO0,1 mU/ml BHK0,1 mU/ml

Sowohl die Klone als auch die Massenpopulationen wurden der weiteren Amplifikation unterzogen. Obgleich Faktor VIII sowohl in CHO- als auch in BHK-Zellen vorübergehend festgestellt wurden, wurden wenige Klone nach 1 MTX-Amplifikationsrunde identifiziert, und nach fortgesetzter Passage der Zellen gingen die niederen Konzentrationen an Faktor VIII verloren. In diesen Klonen konnten Heterogenität festgestellt werden; vgl. Fig. 4. CHO-Zellen, die den Faktor VIII bilden, weisen eine stark erhöhte Verdopplungszeit von 45 bis 52 h auf und werden von nicht-exprimierenden Zellen in der Population, die eine Verdopplungszeit von 28 h aufweisen, überwachsen. Eine sorgfältige Untersuchung belegte, daß kontinuierliche CHO- Klone, die den Faktor VIII exprimieren, schwierig bereitzustellen sind. Die nachstehend aufgeführten Werte zeigen die Häufigkeit von Klonen, die Faktor VIII in DHFR- positive CHO-Klonen sowohl im nicht-amplifizierten Niveau als auch nach einer Amplifikationsrunde exprimieren. TM4-Zellen sind zu Vergleichszwecken angegeben. Die Anzahl der Klone, die eine positive Färbung auf Faktor VIII ergab, ist als prozentualer Anteil der Anzahl der nach der Transfektion erhaltenen stabilen Klone angegeben.

Bei der zweiten oder dritten Amplifikationsrunde, üblicherweise 1 µm Methotrexat, war Faktor VIII in CHO-Zellen nachweisbar. Auch bei diesem hohen Amplifikationsniveau war die Aktivität an Faktor VIII nieder, nämlich 63 mU/ml. Eine fortgesetzte Amplifikation führte in CHO-Zellinien nicht zu einer verstärkten Bildung. Die morphologische Analyse der drei getrennt abgeleiteten CHO-Linien zeigt eine Vergrößerung und Abflachung der in bezug auf Faktor VIII gefärbten Zellen; vgl. Fig. 5. Auf 10 mikromolar amplifizierte, transformierte CHO- Zellen bildeten nicht mehr als 200 mU/ml. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wahl einer Wirtszelle eine wichtige Stufe bei der Bereitstellung eines Produktionszellsystems für Faktor VIII darstellt. Derzeit werden TM4, HTC und 293 zur Bereitstellung von permanenten Zellinien, die eine kontinuierliche Herstellung von Faktor VIII gewährleisten und somit als Produktionszellinien geeignet sind, verwendet.

Beispiel 3 Koagulationsaktivität von Faktor VIII

Die Expression und Sekretion von aktivem Faktor VIII aus TM4-Zellen wurde durch Koagulationsanalyse bestimmt. Serumfreie Medien, die 48 h durch mit pF8CIS transfizierte TM4-Zellen konditioniert worden waren, wurden auf Faktor VIII getestet. Wie in Tabelle I gezeigt, verkürzten TM4-Kulturmedien die Gerinnungszeit von hämophilem Plasma. Ein Großteil dieser Koagulationsaktivität wurde neutralisiert, wenn TM4-Medien mit einem polyklonalen Antikörper gegen humanen Faktor VIII vorinkubiert wurden.

Tabelle I

Tabelle I:
Sekretion von aktivem Faktor VIII aus TM4-Zellen. TM4-Medien wurden entweder mit einem Humanfaktor VIII- polyklonalem Antikörper oder ohne eine derartige Zugabe 30 min bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurden die Medien 1 : 1 mit 0,05 m Tirs vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,01% BSA verdünnt und der Koagulationsanalyse unterworfen. Aus gereinigtem Plasma abgeleiteter Faktor VIII (pd VIII) wurde auf ähnliche Weise behandelt.

Beispiel 4 Expressionsvektor von Faktor VIII-Variante

Ein Weg zur Erzielung eines wirksameren Proteins besteht in der Proteinmanipulation, d. h. durch Einführung von Veränderungen innerhalb des Gens auf dem DNA-Niveau können in der Zellkultur Varianten gebildet werden, die eine spezielle Modifikation der Proteinfunktion ermöglichen. Drei Varianten wurden hergestellt. Das einkettige Protein von nativem Faktor VIII mit 300 000 Dalton wurde in Untereinheiten von 90 000 und 80 000 Dalton gespalten, die wiederum zu aktiven Untereinheiten von 50 000, 43 000 und 73 000 Dalton gespalten wurden. Der B-Bereich zwischen Aminosäure 742 bis 1648 hat keine definierte Funktion; vgl. G. A. Vehar et al., Nature, Bd. 312 (1984), S. 330-337. Die gleichen Zellsysteme, die für die Expression von rekombinantem Faktor VIII-Protein voller Länge beschrieben wurden, wurden zur Expression der Mutante verwendet.

pF8CIS9080

Der zur Expression des Faktor VIII-Fusionsproteins verwendete eukaryontische Faktor enthielt folgende Bestandteile: den Verstärker (vgl. Boshart et al., a. a. O.) und Promotor (vgl. Thomson et al., a. a. O.) von humanem Zytomegalie-Virus (CMV)- unmittelbarem frühem Gen; die Spleiß-Donor-Sequenz in 3′- Stellung der Transkriptionsinitiationsstelle dieses Gens (vgl. Boshart et al., a. a. O.; Sternberg et al., a. a. O.); und eine synthetische Spleiß-Akzeptor-Stelle aus dem Mäuse- Immunoglobulin-variablen Bereich (vgl. Bothwell et al., a. a. O.). Der neue kodierende Bereich ist am 3′-Ende von der SV40-frühen Polyadenylierungssequenz und der Transkriptionsterminationsstelle flankiert (Fiers et al., a. a. O.). Der Vektor umfaßt einen amplifizierbaren Marker, die SV40-DHFR-Transkriptionseinheit.

Die Konstruktion des Expressionsvektors pF8CIS9080, der für das Faktor VIII-Fusionsprotein 90kd+142aa+80kd kodiert, ist in Fig. 6 gezeigt. Ausgehend vom Plasmid pSVE.8cID (Europäische Patentveröffentlichung 1 60 457) wurde eine kurze Deletion im 3′-nicht-translatierten Bereich durch Schneiden mit SstII, Abstumpfen der kohäsiven Enden mit Sl, weiteres Spalten mit HpaI und Wiederverknüpfen der beiden stumpfen Enden unter Erzeugung von pSVE.8c9 durchgeführt. Dieses Plasmid wurde mit ClaI und SalI gespalten und das 10031 bp-Fragment in das SalI, ClaI geklont. Ein 6761 bp-Promotor, enthaltend ein Fragment von pAML3P.D22 (Europäische Patentveröffentlichung 1 60 457) wurde insertiert. Die Fusion im Faktor VIII-Gen wurde durch Ligation der gefüllten Tth111 I- und BamHI- (Aminosäure 1563)- Stellen innerhalb des Faktor VIII-Gens vorgenommen. Fig. 6 zeigt die Ligation eines 2516 bp-Fragments von pAML3P.8c1 (Europäische Patentveröffentlichung 1 60 457) und eines 11991 bp-Fragments von pAML3P.8c9 zur Konstruktion von pAML3P.8L19 mit einem Gehalt an dem fusionsierten Bereich. Diese Fusion wurde durch die DNA-Sequenz bestätigt. Ein 4722 bp-ClaI-XbaI- Fragment mit einem Gehalt an dem Fusionsbereich wurde in ein 5828 bp-ClaI-XbaI-Fragment von pF8CIS mit einem Gehalt an dem CMV-Promotor-Verstärker-Expressionsvektor geklont. Das CMV- Fragment wurde aus einem dam^--Stamm von E. coli, in dem die Methylierung ein Zerschneiden an der ClaI-Stelle nicht verhindert, erhalten.

Beispiel 5 Expressionsergebnis

Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde auf die Expression der Faktor VIII-Variante, in der die Nucleotide 796 bis 1562 deletiert waren, d. h. pF8CIS9080 angewandt. Das 90kd +142aa+80kd-Fusionsprotein wird im Vergleich zum Protein voller Länge in höheren Konzentrationen exprimiert. Jedoch bleiben erhebliche Unterschiede zwischen den Zelltypen hinsichtlich der Fähigkeit zur Expression des Fusionsproteins bestehen.

Die folgenden Daten zeigen, daß die Wahl einer geeigneten Wirtszelle die kontinuierliche Herstellung des gewünschten Fusionsproteins in gewerblich verwertbaren Mengen ermöglicht. Mit pF8CIS9080 transfizierte TM4-Zellen zeigten sowohl eine vorübergehende als auch eine stabile Expression des Fusionsproteins. Mit pF8CIS9080 transfizierte TM4-Zellen ergaben einen 5-fachen Anstieg der Konzentrationen des Fusionsproteins im Vergleich zum Faktor VIII von voller Länge. Bei 100 nanomolar Methotrexat gepoolte Klone des Fusionsfaktors VIII ergaben 12 mU/10⁴ Zellen/Tag. HTC-Zellen zeigten eine ähnliche Verstärkung der Expression des Fusionsfaktors VIII im Vergleich zum Faktor VIII voller Länge.

Die Expression von Fusionsprotein-Faktor VIII ist in 293-Zellen im Vergleich zur Expression von Faktor VIII voller Länge sehr hoch. In 293-Zellen, die mit dem Fusionsproteinvektor pF8CIS9080 transformiert worden waren, wurden routinemäßig nicht-amplifizierte Populationsniveaus von 85 mU/10⁴ Zellen/Tag erreicht. Die Expressionsniveaus von Faktor VIII voller Länge waren geringer als beim Fusionsfaktor VIII, wo sich 2,5 mU/10⁴ Zellen/Tag ergaben. Da die Steuersignale in pF8CIS und pF8CIS9080 identisch sind, muß der Unterschied in den Expressionsniveaus im Vermögen der Zellen zur Erzeugung der Botschaft und/oder des Proteins voller Länge liegen.

Das Fusionsprotein wurde zu einem früheren Amplifikationszeitpunkt (100 nanomolar) als das Protein voller Länge (1000 nanomolar) nachgewiesen, jedoch waren, wie in Fig. 7 gezeigt, diese Zellen durch die Expression des Fusionsproteins belastet. 90kd+142aa+80kd exprimierende Zellen bildeten bei 1000 nanomolar 0,5 µU/10⁴ Zellen/Tag. Eine fortgesetzte Amplifikation war aufgrund der in Fig. 8 gezeigten gemischten Population schwierig. Bei 1 mikromolar MTX und 5 mikromolar MTX selektierte Klone zeigten keine höheren Expressionsniveaus als 0,1 mikromolar MTX-Linien. Zusammenfassend ist festzustellen, daß bestimmte Wirtszellen besonders gut zur Expression von Faktor VIII oder von dessen Varianten geeignet sind, z. B. TM4. Andere Wirtszellen waren von mittlerer Qualität insofern, als die Variante exprimiert wurde, während der Faktor VIII voller Länge in niedrigen Konzentrationen oder gar nicht exprimiert wurde, z. B. 293- Zellen. Bei einer letzten Gruppe von Wirtszellen ist es unwahrscheinlich, daß Faktor VIII in für Prokuktionszwecke ausreichendem Maße bebildet wird, z. B. TRI.

Beispiel 6 Reinigung und Charakterisierung von Fusionsprotein

Das 90kd+142aa+80kd Fusionsprodukt wurde aus 293-Medien unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Methoden für den rekombinanten Faktor VIII voller Länge gereinigt; vgl. D. E. Eaton et al., Biochemistry, Bd. 25 (1986), S. 505-512. Das gereinigte Fusionsprodukt wies eine spezifische Aktivität von 4000-6000 Einheiten/mg auf, was mit der spezifischen Aktivität von aus Plasma abgeleitetem Faktor VIII vergleichbar ist. Das Fusionsprodukt wurde durch SDS-PAGE-Analyse in zwei Hauptbanden mit M _r 115 000 und 80 000 aufgetrennt. Eine Bande mit einem M _r -Wert von 180 000 wurde ebenfalls beobachtet. Sie repräsentiert vermutlich die einkettige Form des Fusionsprodukts. Die M _r -180 000-, 115 000- und -80 000- Proteine wurden alle durch einen Faktor VIII-polyklonalen Antikörper in einem Western-Blot nachgewiesen (vgl. Fig. 11).

Die Koagulationsaktivität des 90kd+142aa+80kd- Fusionsprodukts wurde durch Thrombin auf das 10- bis 20-fache aktiviert (vgl. Fig. 12). Diese Aktivierung stimmte mit der Erzeugung von Untereinheiten mit M _r -Werten von 50 000, 43 000 und 73 000 (vgl. oben) überein. Da der Faktor VIII im Plasma gebunden an Willebrands-Faktor (vWF) zirkuliert, wurde die Bindung des 90kd+142aa+80kd-Fusionsprodukts an vWF ebenfalls getestet. Gereinigtes 90kd+142aa+80kd- Fusionsprodukt, das über eine vWF-Sepharose-Säule gegeben wurde, wurde quantitativ an die Säule gebunden (vgl. Fig. 13). Anschließend wurde das Fusionsprodukt von der Säule mit 0,25 m CaCl₂ eluiert, das bekanntlich zur Dissoziation von Faktor VIII-vWF-Komplexen führt.

Die vorstehenden Daten zeigen, daß das aus 293-Zellen exprimierte und sekretierte 90kd+142aa+80kd-Fusionsprodukt funktionsmäßig sich ähnlich verhielt, wie der aus Plasma abgeleitete Faktor VIII. Das 90kd+142aa+80kd- Fusionsprodukt verkürzte die Gerinnungszeit von hämophilem Plasma und seine Aktivität wurde durch einen Faktor VIII- Antikörper neutralisiert. Das Fusionsprodukt wurde durch Thrombin ähnlich wie aus Plasma abgeleiteter Faktor VIII aktiviert und verarbeitet. Das 90kd+142aa+80kd- Fusionsprodukt wurde auch an an Sepharose immobilisiertem vWF gebunden und unter den Bedingungen, die bekanntlich zu einer Dissoziation von Faktor VIII-Komplexen führen, vom vWF dissoziiert.

Beispiel 7 Koagulationsaktivität des Fusionsproteins

Serumfreie Medien, die 48 h durch mit pF8CIS9080 transfizierte 293-Zellen konditioniert worden waren, wurden durch Koagulationsanalyse auf ihre Faktor VIII-Koagulationsaktivität getestet. Nach Verdünnung der Medien auf 1/50 wurde der Test durchgeführt und festgestellt, daß die Gerinnungszeit von hämophilem Plasma von 120 sec auf 58,9 sec verkürzt wurde, was 5,5 Einheiten/ml an Faktor VIII-Koagulationsaktivität entsprach. Diese Aktivität wurde durch einen polyklonalen Antikörper gegen aus Plasma abgeleiteten Faktor VIII neutralisiert (vgl. Tabelle II).

Tabelle II

Tabelle II: Koagulationsaktivität in 293-Medien.

50 µl hämophiles Plasma wurden mit 50 µml Platelin (General Diagnostics) 8 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 50 µl Medium, das mit 0,05 m Tris-Puffer vom pH-Wert 7,4 mit einem Gehalt an 0,01% BSA auf 1/50 verdünnt worden war, zugesetzt und 30 sec inkubiert. 50 µl CaCl₂ (25 millimolar) wurden zugegeben, und die Gerinnungszeit wurde gemessen. Das aus der Elternzellinie erhaltene Medium, das nicht transfiziert worden war, wurde nicht verdünnt. Antikörper- Neutralisationsversuche wurden durchgeführt, indem die unverdünnten Medien (100 µl) mit 10 µg Faktor VIII- polyklonalem Antikörper 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert wurden. Die Medien wurden sodann verdünnt und getestet.

Beispiel 8 Expressionsvektor von Faktor VIII-Variante mit Resistenz gegen aktiviertes Protein C

Von aktiviertem Protein C (APC), einem Plasmaprotein, wurde gezeigt, daß es Human-Faktor VIII durch limitierte Proteolyse inaktiviert. Eine mögliche Stelle dieser Inaktivierungsspaltung liegt beim Arginin in Stellung 336. Dieses Arginin in Stellung 336 kann in eine andere Aminosäure, z. B. Lysin oder Glutaminsäure, abgeändert werden. Zwei Vektoren, nämlich pF8CIS336E und pF8CIS9080-336E, wurden konstruiert, um festzustellen, ob es sich bei der Position 336 um eine Inaktvierungsstelle handelt. Unter Anwendung von in vitro- Mutagenese (vgl. K. Norris et al., Nucleic Acids Research, Bd. 11 (1983), S. 5103-5112) wurde das Arginin in Stellung 336 in eine Glutaminsäure mutiert (vgl. Fig. 9). Für die Mutagenese wurde ein 792 bp-HindIII-KpnI-Fragment aus pF8CIS in die HindIII-KpnI-Stellen von M13 insertiert. Das nachstehend angegebene 18 pb-Oligomer wurde zur Mutagenese dieses Fragments verwendet.

Im Anschluß an die Strangextension des doppelsträngigen mutagenisierten M13-Kons wurde mit AccI und KpnI geschnitten. Ein 778 bp-Fragment wurde durch Geltechnik gereinigt. Das Plasmid pF8CIS wurde in einem dam^--Stamm von E. coli, GM48, gezüchtet. Aufgrund der Sequenz des in Fig. 1 gezeigten PstI- ClaI-Linkers wird die ClaI-Stelle von pF8CIS nicht geschnitten, wenn das Plasmid in einem Methylierungs-plus-Stamm von Bakterien gezüchtet wird, wie vorstehend erläutert. Zwei Fragmente wurden aus der dam^--pF8CIS-DNA isoliert, ein 10 kb KpnI-partielles-ClaI-Fragment und ein 1108 bp-ClaI-AccI- Fragment. Eine dreiteilige Ligation war erforderlich, um die native Faktor VIII-Sequenz durch die mutagenisierte Sequenz zu ersetzen; vgl. Fig. 9.

Die Konstruktion von pF89080-336E verlief über eine weitere dreiteilige Ligation, wie in Fig. 10 gezeigt. Ein 115 bp-SpeI- BglII-Fragment mit einem Gehalt an der 336E-Aminosäurevariante wurde übertragen, um eine weitere Fusionsproteinvariante durch Ligation an ein 891 bp-SacII-SpeI-Fragment, zu schaffen und ein 8564 bp-BglII-SacII-Fragment wurde aus pF8CIS9080 isoliert.

Beide Proteinvarianten wurden in 293-Zellen exprimiert. Der Faktor VIII voller Länge wurde durch diese Mutation mit 2,8 mU/10⁴ Zellen/Tag exprimiert, während die Fusionsvariante mit 15 mU/10⁴ Zellen/Tag exprimiert wurde.

Beispiel 9 Aktivität von Faktor VIII mit Resistenz gegen Protein C

Ein aus mit pF8CIS-336E transfizierten 293-Zellen erhaltenes Medium verkürzte die Gerinnungszeit von hämophilem Plasma. Diese Aktivität wurde durch einen Faktor VIII-polyklonalen Antikörper neutralisiert (vgl. Tabelle III). Aktiviertes Protein C führte jedoch nicht zur Inaktivierung von rekombinantem Faktor VIII mit einem Gehalt an Glutaminsäure in Position 336 (vgl. Tabelle III).

Tabelle 

Tabelle III:
Stabilität von Faktor VIII/336E voller Länge gegenüber aktiviertem Protein C. Serumfreies Medium, das 48 h mit transfizierten 293-Zellen, die den Faktor VIII/336E (in der Tabelle als "293-336E" bezeichnet) bildeten, wurden auf das 27-fache eingeengt. 100 µl-Aliquotanteile dieses Mediums wurde mit 10 µml Kaninchenhirn-Cephalin und 10,0 ng APC versetzt. Bei Kontrollversuchen erfolgte keine APC-Zugabe. Die Proben wurden 40 Minuten bei 37°C inkubiert. In entsprechender Weise wurde rekombinanter Faktor VIII mit einem Gehalt an Arginin in Stellung 336 (rVIII) mit 0,05 m Tris vom pH-Wert 7,5, 150 millimolar NaCl, 2,5 millimolar CaCl₂ auf 1 Einheit/ml verdünnt und mit Kaninchenhirn-Cephalin und APC inkubiert. Medien aus transfizierten 293-Zellen, die den Faktor VIII/336E voller Länge (26 λ) bildeten, wurden ebenfalls mit Faktor VIII- polyklonalem Antikörper (1 µl IgG-Präparat) 40 min bei 37°C inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Proben durch Koagulationsanalyse getestet.

Beispiel 10 Prorelaxin-Expressionsvektor 1. pCIHRX

Der Vektor pCIHRX enthält den Zytomegalie-Viru 17210 00070 552 001000280000000200012000285911709900040 0002003730599 00004 17091s-Verstärker und -Promotor, die Zytomegalie-Virus-Spleiß-Donor-Stelle, die Ig- variabler Bereich-Spleiß-Akzeptor-Stelle, die für H2- Präprolaxin kodierende cDNA und die Hepatitis- Oberflächenantigen-Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminations-Stellen. Fig. 14 zeigt die Stufen für die Konstruktion des Prorelaxin-Vektors. Die gleiche Intron- und Spleiß-Akzeptor-Sequenz, wie vorstehend beschrieben, aus dem Ig-variablen Bereich wurde beibehalten. 677 bp der Präprorelaxin-cDNA folgten diesen 5′-Processing- Signalen. Während die 5′-Steuersignale identisch mit pF8CIS waren, stammten Polyadenylierungsbereich- und Terminationssequenz-Signale aus dem Hepatitis- Oberflächenantigen und nicht aus SV40.

Zunächst wurde das intermediäre Plasmid pClaRX konstruiert. Das Plasmid pSVERX (vgl. US-Anmeldung 06/9 07 197 vom 12. September 1986; siehe Anhang) wurde mit HindIII geschnitten, um ein 1700 bp- Fragment mit einem Gehalt an der Präprorelaxin-cDNA gefolgt von der Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)-3′- Polyadenylierungsstelle zu isolieren. Eine KpnI-Stelle befand sich in 3′-Stellung zur HBsAg-Polyadenylierungsstelle und in 5′-Stellung zur Startstelle des SV40-frühen Promotors, der in diesem Vektor zum Treiben der Expression von DHFR-cDNA verwendet wurde.

Dieses HindIII-Fragment wurde in an der HindIII-Stelle linearisiertes pML insertiert. Erneute Schließungen wurden durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) minimiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, um Klone zu isolieren, in die das Präprorelaxin-Gen so insertiert worden war, daß sich das 5′-Ende des Gens nächst der ClaI-Stelle von pML befand.

Das intermediäre Plasmid pClARX wurde mit ClaI und KpnI geschnitten, um ein 1360 bp-Fragment zu isolieren, das das Präprorelaxin-Gen und anschließend die Hepatitis- Oberflächenantigen-3′-Polyadenylierungssequenz enthielt. Dieses Fragment wurde an das 5143 bp-Fragment, das durch Schneiden von pF8CIS-dam^- mit ClaI und KpnI erzeugt worden war, geknüpft.

2. pCISRX

Da bekannt ist, daß die Wahl der Polyadenylierungssequenzen das 5′-Processing von Messenger-RNA beeinflußt (vgl. Wilson und Nevins, a. a. O.), wurde die 3′-Hepatitis- Polyadenylierungssequenz in pCIHRX durch die pSV40- Polyadenylierungssequenz ersetzt. Diese Konstruktion wurde mit pCISRX bezeichnet. Die beiden Startvektoren für diese Konstruktion sind pCIHRX und pF8CIS. Der letztgenannte Vektor weist die gleichen 5′-Kontrollen wie pCIHRX auf, umfaßt aber die cDNA für Faktor VIII und die SV40-Polyadenylierungsstelle. SacII wurde zur Spaltung der 3′-Stelle der cDNA verwendet. Der erhaltene 3′-Überhang wurde durch T4-Polymerase abgestumpft. pCIHRX wurde sodann mit BamHI geschnitten. Diese Stelle trennt das chimäre Intron vom 5′-Ende des Relaxin-Gens. Ein 861 bp- Fragment wurde durch Gelisolation aus dem BamHI- Behandlungsprodukt erhalten. Die SV40-Polyadenylierungsstelle, DHFR, Transkriptionseinheit, bakterielle Replikationsursprungsstelle und amp^r-Gen sowie CMV-Verstärker und -Promotor und -Spleiß-Donor wurden aus pF8CIS isoliert. Diese Elemente wurden in zwei Fragmenten als ein 2525 bp-SalI- BamHI-Fragment und HpaI-SalI-3113 bp-Fragment isoliert. Eine dreiteilige Ligation des (abgestumpften) BamHI-SacII-Fragments mit dem HpaI-SalI-Fragment und dem SalI- bis BamHI-Fragment ergibt pXISRX.

Beispiel 11 Expression von Prorelaxin

Das Expressionsvermögen der beiden Relaxin-Expressionsvektoren pCIHRX und pCISRX wurde unter Verwendung von verschiedenen anti-Relaxin-Antikörpern mit der vorstehend beschriebenen Immunoperoxidase-Methode getestet. Drei polyklonale Kaninchen- und drei monoklonale Mäuse-Antikörper wurden an mit pSVERX transifizierten COS-Zellen getestet. Ein monokonales RX-I wurde gefunden, das eine intensive Färbung ohne Hintergrund ergab.

Die beiden erfindungsgemäßen Vektoren pCIHRX und pCISRX wurden auf die Prorelaxin-Expression getestet und mit pSVIRX verglichen. Die pCIHRX- und pCISRX-Vektoren unterschieden sich in der Polyadenylierungssequenz. pCIHRX enthielt die Hepatitis-Oberflächenantigen-Polyadenylierungssequenz, während pCISRX die SV40-Frühbereich-Polyadenylierungssequenz enthielt.

293-, TM4- und CHO-Zellen wurden mit insgesamt 10 µg DNA, die 1 µg pRSVneo, 5 µg Lachsspermaträger und 4 µg Plasmide pSVERX, pCIHRX und pCISRX enthielt, transfiziert. Die Zellen wurden, wie vorstehend beschrieben, einem Glycerinschock unterworfen. 36 h nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und mit IH6 gefärbt, um Prorelaxin bildende Zellen zu identifizieren. Positiv gefärbte Zellen wurden in mit pCIHRX zbd pCISRX transfizierten 293- und TM4-Zellen gefunden. Doppelplatten von CHO-, 293- und TM4-Zellen wurden geteilt und dem vorstehend beschriebenen Verfahren zum Screening auf Prorelaxin bildende Zellen unterworfen.

Die Expressionsergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt, die zeigen, daß die Vektoren mit einem Gehalt an der stabilisierenden Sequenz in 5′-Stellung der für Prorelaxin kodierenden DNA beträchtlich höhere Konzentrationen an Prorelaxin als das Vergleichsplasmid pSVERX bildeten. Im Fall von stabiler Expression wurde der Mediumtest auf Prorelaxin an der allgemeinen Zellpopulation durchgeführt.

Vorübergehende Expression von Prorelaxin

Beispiel 12 Expressionvektor t-PA 1. pCIHt-PA

Der Vektor pCIHt-PA, der den Zytomegalie-Virus-Verstärker und -Promotor, die Zytomegalie-Virus-Spleiß-Donor-Stelle und -Intron, die Ig-variabler Bereich-Spleiß-Akzeptor-Stelle, die für t-PA kodierende cDNA (vgl. Pennica et al., Nature, Bd. 301 (1983), S. 214) und die Hepatitis-Oberflächenantigen- Polyadenylierungs- und Transkriptionstermiantions-Stelle enthielt, wurde konstruiert.

Fig. 16 zeigt die Stufen für die Konstruktion des t-PA-Vektors.

Die t-PA-cDNA wurde zuerst in pML geklont, um eine ClaI-Stelle am 5′-Ende des Gens bereitzustellen. Um dies durchzuführen, wurde ein 3238 bp-HindIII-Fragement aus pSVpa-DHFR (in der GB- PS 21 19 804 B als pETPFR bezeichnet) in die HindIII-Stelle von pML insertiert. Die Kolonien wurden einem Screening auf Klone, bei denen das 5′-Ende der cDNA sich neben der ClaI-Stelle befindet, unterworfen. Das mit pCLAt-PA markierte intermediäre Plasmid ist in Fig. 16 gezeigt. Eine t-PA-cDNA, gefolgt vom 3′-Polyadenylierungsbereich, wurde als ein ClaI- KpnI-Fragment von 2870 bp isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem 5146 bp-Fragment von pF8CIS verknüpft. Dieses ClaI-KpnI- Fragment des CIS-Vektors ergab den 5′-Steuerbereich, eine SV40-DHFR-Transkriptionseinheit, das Ampicillin-Resistenzgen und den Ursprungsbereich von pML. pCIHt-PA ist analog zum vorstehend erörterten pCIHRX, mit der Ausnahme, daß die cDNA für das gewünschte heterologe Gen kodiert.

Die Expressionsniveaus von t-PA wurden verglichen, indem man CHO- und 293-Zellen mit pSVpaDHFR, pCMVt-PA und pCIHt-PA transfizierte. Die beiden erstgenannten Vektoren enthielten keine stabilisierende Sequenz und dienten daher als Kontrollen für den Vektor pCIHt-PA, der die erfindungsgemäß konstruierte, für t-PA kodierende cDNA enthielt. Medien der einzelnen gezüchteten, transformierten 293-Zellen wurden getestet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: pSVpaDHFR ergab 30 ng/ml t-PA; pCMVt-PA ergab 200 ng/ml t-PA; und pCIHt-PA ergab 420 ng/ml t-PA.

2. pCISt-PA

Der Vektor pCISt-PA, der den Zytomegalie-Virus-Verstärker und -Promotor, die Zytomegalie-Virus-Spleiß-Donor-Stelle und -Intron, die Ig-variabler Bereich-Spleiß-Akzeptor-Stelle, die für t-PA kodierende cDNA und die pSV40-Polyadenylierungssequenz enthielt, wurde konstruiert.

Die Startvektoren für diese Konstruktion waren pCIHt-PA und pF8CIS (vgl. Fig. 20). Der letztgenannte Vektor wies die gleichen 5′-Kontrollen wie pCIHt-PA auf, umfaßte aber die cDNA für Faktor VIII und die SV40-Polyadenylierungsstelle. SacII wurde zur Spaltung der 3′-Stellung der t-PA-cDNA verwendet. Der erhaltene 3′-Überhang wurde mit T4-Polymerase abgestumpft. pCIHt-PA wurde sodann mit ClaI geschnitten. Diese Stelle trennt das chimäre Intron vom 5′-Ende des t-PA-Gens. Ein 2870 bp-Fragment wurde durch Gelisolation aus dem ClaI- Behandlungsprodukt erhalten. Die SV40-Polyadenylierungsstelle, DHFR, Transkriptionskontrolle, bakterielle Replikationsursprungsstelle und amp^r-Gen sowie der CMV- Verstärker und -Promotor und -Spleiß-Donor wurden aus pF8CIS isoliert. Diese Elemente wurden als ein 2525 bp-SlaI-ClaI- Fragment und ein HpaI-SalI-3113-Fragment isoliert. Eine dreiteilige Ligation des SacII(abgestumpft)-ClaI-Fragments mit dem HpaI-SalI-Fragment und SalI-ClaI-Fragment ergab pCISt-PA.

Die Expressionsniveaus an t-PA wurden verglichen, indem man 293- und CHO-Zellen mit pCIHt-PA und pCISt-PA transfizierte. Medien der jeweiligen gezüchteten transformierten Zellen wurden getestet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

vorübergehende Expression
(t-PA ng/ml) CHO
  CIS  55   CIH  15 293
  CIS3000   CIH1300

Die Präprorelaxin-DNA wird aus dem Klonierungsvektor wie bei p. Hudson et al., The EMBO Journal Bd. 3, S. 2333-2339, beschrieben unter Anwendung einer vollständigen HpaII- Verdauung, gefolgt von einer partiellen HinfI-Verdauung ausgeschnitten. Der einsträngige DNA-Primer der Sequenz 5′-ATGCCTCGCCTGTTT-3′ (ATG-Primer) wird synthetisiert, mit dem Präprorelaxin-DNA-Segment vermischt, worauf man die Mischung kocht, um die Stränge des Präprorelaxin-Segments abzutrennen, und abkühlt, um das ATG-Primer mit dem gegensinnigen DNA-Strang von Präprorelaxin zu verknüpfen.

Das Klenox-Fragment von DNA-Polymerase I wird dann verwendet, um das ATG-Primer in der 3′-Richtung nahe dem Ende des Präprorelaxin-DNA-Segements zu verlängern. Zusätzlich baut die 3′ → 5′-exonucleolytische Aktivität des Klenow-Fragments das 3′-Ende am gegenläufigen Präprorelaxin-Strang exakt bis zu dem Nucleotid ab, das ein Basenpaar mit dem endständigen 5′-′A′ des ATG-Primers bildet, wodurch dieses Ende stumpfendig wird. Dieses neue doppelsträngige Präprorelaxin-Segement wird an eine AvaII-Stelle im nicht-translatierten 3′-Bereich des Präprorelaxin-Segements verdaut und das AvaII-Ende wird mit dem Klenow-Fragment-Enzym aufgefüllt, um dieses Ende stumpfendig zu machen.

Das Fragment wird dann stumpfendig in das Plasmid trp207-1*tetxap (G. L. Gray et al., Gene, Bd. 39, S. 247-254 (1985)) ligiert, das mit EcoRI gespalten worden ist und dessen Enden mit dem Klenow-Fragment-Enzym aufgefüllt worden sind. Das von Gray et al. beschriebene Plasmid hatte ein AvaI-PvuII- Segment deletiert und eine EcoRI-Stelle an der 5′-Seite des trp-Promotors entfernt. Nach Selektion der Plasmide, welche das Präprorelaxin-Segement in der korrekten Orientierung enthalten, wird das Präprorelaxin-trp207-1*tetxap-Plasmid mit ClaI verdaut und die Enden werden mit Klenow aufgefüllt. Das linearisierte Plasmid wird weiter mit XbaI verdaut und das Präprorelaxin-Segement durch Gelelektrophorese isoliert.

Der eukaryotrische Expressionsvektor p342E (C. W. Crowley et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 3, S. 44-55 (1983)) wird mit BamHI verdaut, die Enden werden mit Klenow aufgefüllt und der Vektor wird weiter mit XbaI verdaut, worauf man das Vektorfragment durch Gelelektrophorese isoliert. Das p342E-Plasmid wird durch Zugabe einer für DHFR kodierenden DNA (siehe E. J. Patzer et al., J. Virol., Bd. 51, S. 346-353 (1984)) modifiziert. Das von Crowley et al. beschriebene Plasmid hatte eine XbaI- Stelle im Anschluß an den frühen SV40-Promotor unter Verwendung eines synthetischen Polylinkers (von New England Biolabs) addiert. Dieses Plasmid wird mit pSVCV202 bezeichnet. Dieses Vektorfragment wird dann mit dem XbaI-ClaI- Präprorelaxin-Fragment ligiert, wodurch das eukaryotische Expressionsplasmid pSV-Präprorelaxin 157 (auch bezeichnet als "pSVERX") entsteht.
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Claims (37)

1. Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung eines gewünschten heterologen Proteins in einer eukaryontischen Wirtszelle, umfassend

• a) die Konstruktion eines Expressionsvektors mit einer Sequenz von doppelsträngiger DNA, die folgende Elemente aufweist:
  • 1) eine stabilisierende Sequenz stromabwärts zu einem Promotor und stromaufwärts zu einer für die Aminosäuresequenz des gewünschten heterologen Proteins kodierenden DNA;
  • 2) für die Aminosäuresequenz des gewünschten heterologen Proteins kodierende DNA stromabwärts zur stabilisierenden Sequenz; und
  • 3) für eine Polyadenylierungssequenz kodierende DNA, wobei sich stromabwärts von dieser DNA eine Transskriptionsterminationsstelle befindet;
• b) Transfektion und anschließend Auswahl einer eukaryontischen Wirtszelle mit dem Expressionsvektor; und
• c) Züchtung der transfizierten eukaryontischen Wirtszelle unter für die kontinuierliche Herstellung des gewünschten Proteins günstigen Bedingungen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor aus dem unmittelbaren frühen Gen von humanem Zytomegalievirus stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor aus Simian-Virus 40 (SV40) stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Sequenz mindestens eine, aber nicht mehr als zwei Spleiß-Donor-Intron-Akzeptor-Sequenzen umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Sequenz eine gentechnisch manipulierte DNA umfaßt, die für eine mRNA mit den gleichen Eigenschaften wie eine mRNA, die einen Spleißvorgang unterzogen worden ist, aber aus der keine Nucleotidsequenz entfernt worden ist, kodiert.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Spleiß-Donor-Sequenz der Spleiß-Donor-Intron- Akzeptor-Sequenz aus dem unmittelbaren frühen Gen von humanem Zytomegalievirus stammt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Intron der Spleiß-Donor-Intron-Akzeptor-Sequenz aus humanem Zytomegalievirus und dem Immunoglobulin-variablen Bereich stammt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Spleiß-Akzeptor-Sequenz der Spleiß-Donor-Intron- Akzeptor-Sequenz der Immunoglobulin-Akzeptor-Sequenz entspricht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Aminosäuresequenz eines heterologen Proteins kodierende DNA für Faktor VIII kodiert.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Aminosäuresequenz eines heterologen Proteins kodierende DNA für t-PA kodiert.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Aminosäuresequenz eines heterologen Proteins kodierende DNA für Prorelaxin kodiert.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Aminosäuresequenz eines heterologen Proteins kodierende DNA für eine Variante von Faktor VIII kodiert.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Polyadenylierungssequenz kodierende DNA aus Simian-Virus 40 (SV40) stammt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Wirtszellen um Mäuse-Sertoli-Zellen (TM4) handelt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Wirtszellen um Hepatomzellen (HTC) handelt.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Wirtszellen um Humanembryo-Nierenzellen (293) handelt.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das für die Aminosäuresequenz eines heterologen Proteins kodierende Gen für einen gegenüber der Spaltung durch aktiviertes Protein C resistenten Faktor VIII kodiert.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor einen Verstärker umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker sich stromaufwärts zum Promotor befindet.

20. Expressionsvektor für die kontinuierliche Expression eines gewünschten heterologen Proteins in einer eukaryontischen Wirtszellenkultur, umfassend

• 1) eine stabilisierende Sequenz stromabwärts zu einem Promotor und stromaufwärts zu einer für die Aminosäuresequenz des gewünschten heterologen Proteins kodierenden DNA;
• 2) für die Aminosäuresequenz des gewünschten heterologen Proteins kodierende DNA stromabwärts zur stabilisierenden Sequenz; und
• 3) für eine Polyadenylierungssequenz kodierende DNA, wobei

sich stromabwärts von dieser DNA eine Transskriptionster­ minationsstelle befindet.

21. Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Sequenz mindestens eine, aber nicht mehr als zwei Spleiß-Donor-Intron-Akzeptor-Sequenzen umfaßt.

22. Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Spleiß-Donor-Sequenz der Spleiß-Donor-Intron-Akzeptor- Sequenz aus dem unmittelbaren frühen Gen von humanem Zytomegalievirus stammt.

23. Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Intron der Spleiß-Donor-Intron-Akzeptor-Sequenz aus humanem Zytomegalievirus und dem Immunoglobulin-variablen Bereich stammt.

24. Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Spleiß-Akzeptor-Sequenz der Spleiß-Donor-Intron- Akzeptor-Sequenz der Immunoglobulin-Akzeptor-Sequenz entspricht.

25. Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Polyadenylierungsstelle kodierende DNA aus Simian- Virus 40 (SV40) stammt.

26. Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Sequenz eine gentechnisch manipulierte DNA umfaßt, die für eine mRNA mit den gleichen Eigenschaften wie eine mRNA, die einem Spleißvorgang unterzogen worden ist, aber aus der keine Nucleotidsequenz entfernt worden ist, kodiert.

27. Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor aus dem unmittelbaren frühen Gen von humanem Zytomegalievirus stammt.

28. Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Verstärker umfaßt.

29. Vektor nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß sich der Verstärker stromaufwärts zum Promotor befindet.

30. Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Verstärker und Promotor aus Simian-Virus 40 (SV40) umfaßt.

31. Mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 20 transformierte TM4-Zellen.

32. Mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 26 transformierte TM4-Zellen.

33. Mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 20 transformierte HTC-Zellen.

34. Mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 26 transformierte HTC-Zellen.

35. Mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 20 transformierte 293-Zellen.

36. Mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 26 transformierte 293-Zellen.