MX2010012069A

MX2010012069A - Vacuna de la leishmaniasis con el uso del inmunogeno salival de la mosca de la arena.

Info

Publication number: MX2010012069A
Application number: MX2010012069A
Authority: MX
Inventors: Laurent Bernard Fischer; Jesus G Valenzuela
Original assignee: Merial Ltd
Priority date: 2008-05-08
Filing date: 2009-05-06
Publication date: 2010-12-14
Also published as: BRPI0915605B1; US20090324649A1; CN103768588A; MA32376B1; EP2899203A2; WO2009137577A3; HK1150616A1; ES2760004T3; IL209107A0; EP2283035A2; MX348137B; EP2283035B1; US9228002B2; EP2899203B1; BRPI0915605A2; WO2009137577A2; EP2899203A3; BRPI0915605B8; US8603808B2; IL209107A

Abstract

La presente invención proporciona vectores que contienen y expresan in vivo o in vitro antígenos salivales de la mosca de la arena Lu. longipalpis que provocan una respuesta inmunológica en animales o seres humanos contra la Leishmaniasis, composiciones para vacuna que comprenden dichos vectores y/o polipéptidos salivales de Lu. longipalpis, métodos de vacunación contra la Leishmaniasis y equipos que se usan con dichos métodos y composiciones.

Description

VACUNA DE LA LEISHMANIASIS CON EL USO DEL INMUNÓGENO SALIVAL DE LA MOSCA DE LA ARENA INCORPORACIÓN MEDIANTE REFERENCIA La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional EE.UU. No. de Serie. 61/051,635 consignada el 8 de Mayo de 2008 y de la solicitud provisional de EE.UU. No. 61/101,345 consignada el 30 de Septiembre de 2008, la cual hace referencia a la Solicitud Internacional No. PCT/US2003/034453 titulada Polipéptidos de Lutzomyia Longipalpis y Métodos de Uso consignada el 29 de Octubre de 2003, la cual reivindica prioridad sobre la solicitud provisional No. 60/422,303 consignada el 29 de Octubre de 2002.

Todos los documentos citados o a los cuales se hace referencia en el presente documento ("documentos citados en el presente documento") y todos los documentos citados o a los cuales se hace referencia en documentos citados en el presente documento, junto con cualesquiera instrucciones de fabricante, descripciones, especificaciones de productos y hojas de productos correspondientes a cualquier producto mencionado en el presente documento o en cualquier documento incorporado mediante referencia al presente documento, se incorporan al presente documento mediante referencia y pueden usarse para llevar a la práctica la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con formulaciones para combatir infecciones de Leishmaniasis en animales o seres humanos. Específicamente, la presente invención proporciona vectores que contienen y expresan in vivo o in vitro antígenos salivales de la mosca de la arena Lu. longipalpis que provocan una respuesta inmunológica en animales o seres humanos contra la Leishmaniasis, incluidas las composiciones que comprenden dichos vectores, métodos de vacunación contra la Leishmaniasis y equipos que se usan con dichos métodos y composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Leishmaniasis es una enfermedad importante y grave que afecta a los seres humanos, caninos (perros, lobos, zorros, coyotes, chacales) y, en un menor grado, felinos (leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes y otros felinos incluidos el guepardo y el lince) .

La Leishmaniasis . y el subgénero Viannia se agrupan en complejos des especies y subespecies con base en semejanzas moleculares, bioquímicas e inmunológicas . Existen varias formas de la enfermedad designadas por su presentación clínica, incluida la Leishmaniasis cutánea, mucocutánea o visceral. Cada una de estas formas de la enfermedad es ocasionada por especies diferentes de la mosca de la arena halladas en diferentes regiones del mundo. La Leishmaniasis cutánea del ser humano está vinculada con miembros de los complejos L. atópica, L. principal, y L. trópica en el viejo mundo y complejos L. mexicana y L. braziliensis en el nuevo mundo. La Leishmaniasis Visceral es ocasionada por L. donovani y L. infantum en las regiones del Viejo mundo mientras que L. chagasi es primariamente responsable de la enfermedad visceral en el nuevo mundo. Puesto que L. infantum es el agente primario vinculado con la Leishmaniasis canina, las infecciones en los perros a menudo se consideran viscerales aun cuando tienden a causar tanto la enfermedad visceral como la cutánea.

El agente de la Leishmaniasis visceral es un parásito protozoario y pertenece al complejo Leishmaniasis donovani. Este parásito se distribuye ampliamente en países templados y subtropicales de Europa meridional, Africa, Asia, America del Sur y America Central (Desjeux P. et al.). La Leishmaniasis donovani infantum (L. infantum) es responsable de la enfermedad en felinos y caninos en Europa meridional, Africa, y Asia. En America del Sur y America Central, el agente es Leishmaniasis donovani chagasi (L. chagasi) , el cual está íntimamente relacionado con L. infantum. En los seres humanos, el agente es Leishmaniasis donovani donovani (L. donovani), el cual además se relaciona con L. infantum y L. chagasi.

Las moscas de la arena del género Phlebotomus (viejo mundo) y Lutzomyia (nuevo mundo) son los vectores primarios responsables de la transmisión de la enfermedad. Actualmente son éstos los únicos vectores conocidos capaces de esparcir la enfermedad; no se ha demostrado que las pulgas, garrapatas y otros artrópodos sean vectores competentes. Sin embargo, se han contraído casos cases raros de Leishraaniasis a través del intercambio de sangre o fluidos corporales, contacto directo y como mínimo un caso de transmisión congénita. La importancia de las moscas de la arena originarias todavía sigue sin determinarse pero pudiera estar relacionada con la dosis infecciosa del organismo. Aún así, en años recientes, y en ausencia de vectores conocidos, se ha observado una abrumadora incidencia de Leishmaniasis en criaderos de perros raposeros a lo largo y ancho de Estados Unidos. No se conoce todavía cómo ocurrió la transmisión de la enfermedad o cómo la enfermedad se mantiene en estos perros porque no se tienen informes de moscas de la arena infectadas en Estados Unidos. Sin embargo, ciertas especies de Lutzomyia (L. shannoni) , halladas a lo largo de Estados Unidos y hacia el norte llegando a Nueva Jersey, se considera un vector potencialmente competente de L. mexicana. Phlebotomus ariasi (P. ariasi) y Phlebotomus perniciosus (P. perniciosus) , Phlebotomus neglectus (P. neglectus) son los portadores más comunes en Europa meridional, Africa, y Asia, donde Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) es el portador más común en América Meridional y Central.

Leishmaniasis es una enfermedad de avance lento que puede demorar hasta 7 años en hacerse aparente clínicamente (McConkey SE et al.; Slappendel RJ et al.). Incluso transcurrido ese tiempo, a menudo las señales no son específicas y muy raras veces se considera la posibilidad de diagnosticar Leishmaniasis . Los perros se infectan más frecuentemente con L. infantum (complejo L. donovani) el cual es responsable de la enfermedad viscerotrópica en las personas. Sin embargo, hasta 90% de los perros infectados presentan lesiones tanto viscerales como cutáneas (Slappendel RJ et al.). Por otro lado, muchos perros se muestran, naturalmente resistentes a este parásito y pueden permanecer asintomáticos a pesar de que se conozca su infección (Grosjean NL et al.). Se estima que apenas 10% de los perros que viven en áreas endémicas en realidad desarrollan la enfermedad clínica (Lindsay DS et al.). Esta incidencia más baja de la enfermedad clínica se atribuye a una predisposición genética de ciertos perros para dar una respuesta inmunológica mediada por células más protectora que una respuesta humoral (Lindsay DS et al., McConkey SE et al., Slappendel RJ, et al.). Más aún, se ha informado que hasta 20% de los perros infectados pueden dar una respuesta inmunológica adecuada y recuperarse espontáneamente de la enfermedad clínica (McConkey SE et al.). En los animales que dan una respuesta humoral, IgGl parece correlacionarse con la enfermedad clínica en tanto que los perros asintomáticos tienen niveles de anticuerpo IgG2 más altos (Lindsay et al.).

Algunas de las señales clínicas más frecuentes en los informes con respecto a la Leishmaniasis incluyen languidez, fatiga e intolerancia al ejercicio acoplada con anorexia y pérdida de peso que eventualmente culmina como caquexia (McConkey SE et al.). Estas señales pueden estar acompañadas o no de fiebre, linfadenopatía local o generalizada (90%) y/o hepatoesplenomegalia (Grosjean NL et al., Lindsay DS et al., McConkey SE et al., Martínez-Subiela S et al.). También es bastante frecuente la participación de las articulaciones y puede estar presente como debilidad con articulaciones hinchadas o sencillamente como andar - rígido. Entre los hallazgos menos frecuentes se incluyen las lesiones oculares (<5%), diarrea crónica (30%) y uñas larga y . deformadas (20%) denominadas onicogrifosis . (Lindsay DS et al., Slappendel RJ et al.). Hay lesiones cutáneas presentes hasta en 89% de los perros infectados, con o sin señales abiertas de participación visceral. Las lesiones de la Leishmaniasis cutánea pueden aparecer en cualquier parte del cuerpo pero los sitios más frecuentes son aquellos expuestos al ambiente y, en consecuencia, más susceptibles a mordidas de la mosca de la arena. La pápula inicial rápidamente abre paso a una ulcera. La Leishmaniasis visceral es invariablemente fatal si no se trata a tiempo. La Leishmaniosis visceral afecta los órganos internos del cuerpo, específicamente el bazo y el hígado.

Los perros son considerados el mayor depósito de Leishmaniasis. La enfermedad se caracteriza por la evolución crónica de señales víscero-cutáneas que aparecen en menos de 50% de los animales infectados (Lanotte G. et al.) . Tanto los perros asintomáticos como los sintomáticos con anticuerpos detectables pueden ser infecciosos (Molina R. et al.; Courtenay 0. et al.). También los gatos pueden ser portadores de los parásitos protozoarios y, por ende, se les considera depósitos potenciales secundarios.

Debido a una cantidad de factores, las opciones de tratamiento para la Leishmaniasis en el perro y la respuesta a la terapia son limitadas, en el mejor de los casos. Por razones no definidas, la Leishmaniasis visceral es más difícil de tratar en el perro que en el ser humano. No existe una opción de tratamiento 100% eficaz para eliminar la infección parasitaria y la enfermedad clínica a menudo reaparece después' del cese de la terapia (Lindsay DS et al.). En áreas endémicas, el régimen de tratamiento más común ha sido una combinación de alopurinol con un antimonial pentavalente como por ejemplo, meglumina antimonita o estibogluconato de sodio (Lindsay DS et al., Slappendel RJ et al.). Sin embargo, en años recientes, este protocolo ha perdido apoyo debido a una creciente resistencia del parásito a la droga así como por efectos colaterales adversos vinculados con estos compuestos (Lindsay DS et al.). Para limitar más aún las opciones de tratamiento, Pentostam® (estibogluconato de sodio) es el único antimonial disponible en Estados Unidos y su distribución es regulada por los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en Atlanta, GA (Lindsay DS et al.).

Se han intentado otros protocolos pero sin comprobar su eficacia en la erradicación de la infección parasitaria o en la prevención de la recurrencia clínica. Adicionalmente, cada protocolo está vinculado a efectos adversos potenciales. Amfotericina B se une a esteróles y perturba la permeabilidad de la membrana celular pero es nefrotóxica (Lindsay DS et al.). Cuando se administra parenteralmente, la Paramomicina actúa en sinergia con los antimoniales lo cual ocasiona niveles más altos de antimonial durante períodos más prolongados pero también es nefrotóxico y no se recomienda actualmente para su uso clínico (Lindsay DS et al.). El isetionato de pentamidina es eficaz contra la Leishmaniasis pero requiere como mínimo 15 inyecciones intramusculares y es bastante doloroso (Lindsay DS et al.). Ketaconazole, miconazole, fluconazole y itraconazole son drogas orales que pueden ser útiles pues contienen la enfermedad pero su costo es prohibitivo y tienen el riesgo de resistencia a la droga cuando se trata sintomáticamente al paciente. En resumen, los diversos regímenes de tratamiento para la Leishmaniasis en el perro ha sido objeto de investigación pero no son 100% eficaces; la recaída es más la norma que la excepción. A final de cuentas, el veterinario tratante se enfrenta al dilema de tratar los brotes sintomáticos de la Leishmaniasis en los perros con el riesgo de desarrollar cepas resistentes al medicamento del parásito que se encuentra en Estados Unidos.

La detección masiva de perros seropositivos seguido de sacrificio selectivo y/o tratamiento con drogas o la aplicación masiva de collares impregnados de deltametrina, ha mostrado un impacto sobre la reducción de la prevalescencia de Leishmaniasis humana y canina en áreas endémicas de Europa meridional, Africa, y Asia (Maroli M. et al. Mazloumi Gavgani A.S. et al.), si bien la eficacia de eliminar a los caninos seropositivos es un tema de debate (Dietze R. et al.; oreira Jr. E.D. et al.). Estas medidas de control se consideran o bien inaceptables, costosas o ineficaces (Gradoni L. et al.).

Los modelos matemáticos usados para comparar la eficacia de diversas herramientas para el control de la Leishmaniasis sugieren que el método más práctico y eficaz puede ser la vacuna para caninos (Dye C). En consecuencia, el desarrollo de vacunas con capacidad para proteger a los caninos de la Leishmaniasis y/o prevenir el avance de la enfermedad en animales infectados es altamente deseable para la implementación de programas de control de Leishmaniasis asi como para la comunidad veterinaria (Gradoni L. et al.).

Investigaciones previas se han propuesto identificar métodos de diagnóstico y tratamiento a través, por ejemplo, de la administración de polipéptidos antigénicos (véase, por ejemplo,. WO 2004/039958 la cual se incorpora totalmente al presente documento mediante referencia) . Sin embargo, hasta la fecha, no existe una vacuna disponible para el tratamiento de la Leishmaniasis. Los vectores y formulaciones de las vacunas de la presente invención vienen a satisfacer esta necesidad histórica dentro de la tecnología.

Las citas o la identificación de cualquier documento en la presente solicitud no constituye una aceptación de que dicho documento está disponible como tecnología anterior a la presente invención.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención puede ser cualquiera o la totalidad de proporcionar vectores recombinantes o virus así como métodos para fabricar dichos virus, y proporcionar composiciones y/o vacunas así como métodos para el tratamiento y la profilaxia de la infección por Leishmaniasis .

La invención proporciona un vector recombinante, como por ejemplo, un virus recombinante, por ejemplo, un poxvirus recombinante, que contiene y expresa como mínimo una molécula exógena de ácido nucleico y, la molécula exógena de ácido nucleico que existe como mínimo puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica un immunógeno o epitomo de interés a partir de proteínas salivales de vectores de Lu. Longipalpis de la mosca de la arena En particular, la presente invención proporciona un vector recombinante, como por ejemplo un vector recombinante, por ejemplo, un poxvirus recombinante, que contiene y expresa como mínimo una molécula exógena de ácido nucleico y, la molécula exógena de ácido nucleico . que existe como mínimo puede comprender polipéptidos salivales de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos.

Estas vacunas pueden prevenir la difusión y/o reproducción del parásito en un anfitrión.

La invención proporciona además composiciones inmunológicas (p immunogénicas) o composiciones para vacuna que comprenden dicho vector de expresión o el (los) producto (s) de expresión de dicho vector de expresión.

La invención proporciona además métodos para inducir una respuesta inmunológica (o inmunogénica) o protectora contra la Leishmaniasis, asi como métodos para prevenir o tratar la Leishmaniasis o estado (s) de enfermedad causados por Leishmaniasis, que comprenden la administración al vector de expresión o un producto de expresión del vector de expresión o una composición que comprende el vector de expresión ó una composición que comprende un producto d.e expresión del vector de expresión.

La invención se relaciona también con productos de expresión del virus asi como los anticuerpos generados de los productos de expresión o la expresión de los mismos in vivo y los dichos correspondientes a dichos productos y anticuerpos, por ejemplo, en aplicaciones de diagnostico.

Estas y otras realizaciones se develan o son obvias a partir de la Descripción Detallada siguiente y son abarcadas por la misma .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS ILUSTRACIONES La siguiente descripción detallada, . la cual se presenta a manera de ejemplo, y la cual no pretende limitar la invención a las realizaciones especificas que se describen , puede entenderse en conjunto con las figuras acompañantes, las cuales se incorporan al presente documento mediante referencia, en las cuales: La Figura 1 muestra la secuencia de ácido nucleico de una hebra del plásmido pVR2001 LJM17 (NO. IDENT . SEC..9), donde los dos sitios de restricción BamHI están en negrita, la secuencia que codifica el péptido de la señal tPA está subrayado y la secuencia que codifica LJM17 aparece en letras mayúsculas negritas .

La Figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico de una hebra del plásmido pVR2001 LJL143 (NO. IDENT. SEC.:10), donde los dos sitios de restricción BamHI está en negritas, la secuencia que codifica el péptido de la señal tPA está subrayado y la secuencia que codifica LJL143 aparece en letras mayúsculas negritas.

La Figura 3 muestra un mapa del vector donante, pALVAC C3 H6p-LJM17, que tiene 5737 pares de base.

La Figura 4 ilustra el vector de expresión de la viruela del canario vCP2390, tanto para hebras complementarias directa e inversa (NO. IDENT. SEC.:93 y NO. IDENT. SEC.:92). NO. IDENT. SEC.:93 representa la hebra del vector VCP2390 la cual contiene el polinucleótido LJM17 de codones optimizados en la dirección que codifica el Polipéptido LJ 17 (NO. IDENT. SEC..5).

La Figura 5 muestra un mapa del vector donante, pALVAC C3 H6p-LJL143, que tiene pares de base 5400.

La Figura 6 ilustra el vector de expresión de la viruela del canario vCP2389 con su inserción que codifica LJL143 y proporciona la secuencia de nucleótidos de una hebra del vector de expresión (NO. IDENT. SEC.:94).

La Figura 7 ilustra anticuerpos anti-IgG a ambos LJM17 y LJL143, absorbencia medida a 405 nm, en perros control vacunados, a partir del día anterior a la administración VI hasta dos semanas después de la administración V5.

La Figura 8 ilustra la secreción de interferon-gamma (pg/mL) en perros PBMC que corresponden a los 5. grupos, 2 semanas después de la quinta inmunización (administración V5) . PBMC fueron estimulados por SGH (2 pares), LJL143 (4 ]ig) , LJM17 (4 \xq) , ConA (4 µ ) o no estimulados por el medio (med) .

La Figura 9 muestra un esquema de una prueba de eliminación in vitro incluidos los resultados, expresados en porcentaje de macrófagos infectados (NT: sin _ tratamiento, LPS: lipopolisacárido, conA: concavalina A) .

La Figura 10 muestra biopsias de perros control vacunados, en los sitios de picadura de la mosca de la arena, marcados con hematoxilina/eosina (H & E) , Luna' s, azul de Toluidina y procedimientos inmunohistoquimicos para CD3 y marcadores macrófago/monocito (Mac) .

La Figura 11 muestra la secuencia de ácido nucleico de una hebra del plásmido pNBO002 (NO. IDENT. SEC.:19), donde los dos sitios de restricción de BamHI están en negritas, la secuencia que codifica el péptido de la señal tPA está subrayado y la secuencia que codifica LJM17 aparece en letras mayúsculas negritas.

La Figura 12 muestra un mapa del vector plásmido pNBO002 con su inserción que codifica LJM17, que tiene 6247 pares de base.

La Figura 13 muestra la secuencia de ácido nucleico de una hebra del plásmido pNBO003 (NO. IDENT. SEC.:20), donde los dos sitios de restricción de BamHI están en negritas, la secuencia que codifica el péptido de la señal tPA está subrayado y la secuencia que codifica LJL143 aparece en letras mayúsculas negritas .

La Figura 14 muestra un mapa del vector plásmido pNBO003 con su inserción que codifica LJL143, que tiene 5899 pares de base .

La Figura 15 muestra las secuencias de proteina de LJL143 y LJM17 de L. longipalpis.

La Figura .16 muestra las secuencias de ADN de LJL143 y LJM17 de L. longipalpis.

La Figura 17 muestra las tablas de identidad de secuencia. La Figura 18 muestra el NO. IDENT. SEC. asignado a cada ADN y polipéptido.

La Figura 19 es un conjunto de gráficos e imágenes que demuestran la inmunidad antisalival en perros expuestos a ataques de la mosca de la arena Lu. longipalpis. La FIG. 19A es un conjunto de gráficos que demuestran la cinética temprana de títulos de anticuerpo anti-Lu. longipalpis IgG, IgG2 y IgGl en perros expuestos. La FIG. 19B es un gráfico de una reacción de hipersensibilidad retardada en un perro representativo a través de los experimentos de exposición. FIG. 19C es un conjunto de imágenes de un análisis histológico H/E realizado en biopsias por punción dérmica antes de la exposición (EO), 47 h después de la primera exposición (El) , 48 h después de la segunda exposición (E2) y 48 h después de la tercera exposición (E3) a picaduras de la mosca de la arena. La. FIG. 19D es un conjunto de imágenes que caracterizan la población inflamatoria a 48 h después de la tercera exposición (E3) a picaduras de mosca de la arena con inmunohistoquímica para CD3+ T linfocitos y macrófagos y coloración de Luna para los eosinófilos.

La Figura 20 es un conjunto de gráficos e imágenes que demuestran una prueba de análisis del antígeno inverso de cADN en el perro.

La Figura 21 es un conjunto de gráficos e imágenes que demuestran una prueba de análisis de antígeno inverso de proteína en el perro.

La Figura 22 es un conjunto de dos gráficos que demuestra la producción de interferon ? de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de perros vacunados después de la estimulación con proteina salival recombinante.

La Figura 23 es un conjunto de cuatro gráficos de barra que demuestran una prueba de eliminación in vitro para la Leishmaniasis chagasi por PBMCs de perros inmunizados (NT, sin tratamiento; Ly, linfocitos) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA Cabe destacar que en la presente revelación y particularmente en las reivindicaciones, términos como por ejemplo, "comprende", "compuesto de", "que comprende" y otros términos semejantes pueden tener el significado atribuido por la Ley de Patentes de EE.UU.; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y otros semejantes; y que términos como por ejemplo "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tiene el significado adscrito a los mismos por la Ley de Patentes de EE.UU., por ejemplo, permiten elementos no enumerados explícitamente, pero excluyen elementos que se hallan en la tecnología anterior o que afectan una característica básica o novedosa de la invención.

Salvo que se establezca lo contrario, los términos técnicos se usan de conformidad con el uso - convencional . Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en .Benjamín Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.)/ The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference, publicada por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Los términos singulares "un," "una" y "el" "la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente de otro modo. De igual manera, la palabra "o" pretende incluir "y" salvo que el contexto lo indique claramente de otro modo. La palabra "o" significa cualquier miembro de una lista particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista.

Cabe destacar en esta revelación y las reivindicaciones y/o párrafos anexos, el término "polipéptido salival de Lu. longipalpis", "polipéptido Lu. longipalpis" ó "polipéptido salival" se usa de manera intercambiable, el término "polinucleótido salival de Lu. longipalpis", "Polinucleótido de Lu. longipalpis" ó "polinucleótido salival" se usa de manera intercambiable.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en este documento para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácido consecutivos.

El término "ácido nucleico", "nucleótido", y "polinucleótido" se refiere a ARN ó' ADN y derivados de los mismos, como por ejemplo aquellos que contienen columnas modificadas. Cabe destacar que la invención proporciona polinucleótidos que comprenden secuencias complementarias a las descritas en este documento. Los polinucleótidos de conformidad con la invención pueden prepararse de diferentes maneras (por ejemplo mediante síntesis químicas, mediante clonación genética etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo lineal o ramificada, de una sola hebra o de doble hebra, o un híbrido de los mismos, cebadores, sondas etc.).

El término "gene" se usa de manera amplia para hacer referencia a cualquier segmento de polinucleótido vinculado con una función biológica. Así, los genes o polinucleótidos incluyen intrones y exones como en una secuencia genómica o sólo las secuencias de codificación como en cADN , como por ejemplo un marco de lectura abierta (ORF) , a partir del codón de arranque (codón metionina) y finalizando con una señal de terminación (codón de parada) . Los genes y polinucleótidos también pueden incluir regiones que regulan su expresión, como por ejemplo iniciación de transcripción, traducción y terminación de transcripción. Por ende, también se incluyen regiones promotoras y de unión de ribosomas (en general estos elementos regulatorios descansan aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos aguas arriba del codón de arranque de la secuencia o gen de codificación; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), los terminadores de transcripción (en general el terminador se ubica dentro de aproximadamente 50 nucleótidos aguas abajo del codón de parada de la secuencia o gen de codificación; Ward C K et al.). El gen o polinucleótido también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa mRNA o ARN funcional ó codifica una proteina especifica y la cual incluye secuencias regulatorias .

El término "polipéptido inmunogénico" o "fragmento inmunogénico" según se usa en este documento se refiere a un polipéptido o un fragmento de un polipéptido que comprende un motivo especifico de alelo, un epitopo u otra secuencia de modo que el polipéptido o el fragmento se une con una molécula MHC e induce una respuesta citotóxica de linfocito T ("CTL") y/o una respuesta de células B (por ejemplo, producción de anticuerpos) , y/o respuesta de linfocitos andantes T y/o una respuesta de hipersensibilidad retardada (DTH) contra el antigeno del cual se deriva el polipéptido inmunogénico o el fragmento inmunogénico. Una respuesta DTH es una reacción inmune en la cual la activación de macrófagos dependientes de células T y la inflamación causan lesiones en los tejidos. Una reacción DTH a la inyección subcutánea de antigeno a menudo se usa como una prueba de inmunidad mediada por células.

Por definición, un epitopo es un determinante antigénico que es activo inmunológicamente en el sentido de que una vez administrado al anfitrión, es capaz de provocar una respuesta inmunológica de tipo humoral (Células B) y/o celular (Células T) . Estos son grupos químicos particulares o secuencias de péptidos en una molécula que son antigénicos. Un anticuerpo específicamente se une a un epitomo antigénico particular en un polipéptido. Entre los ejemplos específicos, no limitativos, de un epitomo se encuentra una secuencia de tetra a penta péptidos en un polipéptido, una secuencia de tri a penta glicósidos en un polisacárido . En el animal la mayoría de los antígenos presentan varios o incluso numerosos determinantes antigénicos de manera simultánea. Dicho polipéptido puede calificarse también como un polipéptido inmunogénico y el epitomo puede identificarse según se describe más adelante.

Un componente biológico "aislado" (como por ejemplo un ácido nucleico o proteína u organela) se refiere a un componente que ha sido sustancialmente separado o purificado lejos de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el cual el componente aparece por naturaleza, por ejemplo, otros ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, proteínas y organelas. Entre los ácidos nucleicos y proteínas que han sido "aislados" se encuentran ácido nucleicos y proteínas purificadas por métodos de purificación convencionales. El término también abarca ácido nucleicos y proteínas preparadas por tecnología recombinante así como por síntesis químicas.

El término "purificado" según se usa en este documento no requiere pureza absoluta; más bien, se propone como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación purificada de polipéptidos es aquella en la cual el polipéptido está más enriquecido que el polipéptido que se encuentra en su ambiente natural. Una preparación de polipéptidos será sustancialmente purificada cuando el polipéptido representa varias realizaciones, como mínimo 60%, como mínimo 70%, como mínimo 80%, como mínimo 90%, como mínimo 95% ó como mínimo 98%, del contenido total de polipéptido de la preparación. Lo anterior es pertinente a algunos polinucleótidos . Los polipéptidos revelados en este documento pueden ser purificados mediante cualquier medio conocido dentro de la tecnología.

Un polinucleótido recombinante es aquel que posee una secuencia que no se observa en la naturaleza o que posee una secuencia obtenida mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial se logra a menudo mediante síntesis químicas o, más frecuentemente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética. En una realización, un polinucleótido recombinante codifica una proteína de fusión.

En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos de la especie de mosca de la arena Lu. longipalpis. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87, y variante o fragmento del mismo.

Más aún, se pretende que los homólogos de polipéptidos de la especie de mosca de la arena Lu. longipalpes estén dentro del alcance de la presente invención. Según se usa en este documento, el término "homólogos" incluye otólogos, análogos y parálogos. El término "análogo" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen una función igual o semejante pero que han evolucionado de manera separada en organismos no relacionado. El término "otólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común mediante la especiación. Normalmente los otólogos codifican polipéptidos que tienen funciones iguales o semejantes. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos normalmente tienen funciones diferentes pero estas funciones pueden estar relacionadas. Análogos, otólogos y parálogos de un polipéptido salival tipo salvaje puede diferir del polipéptido salival tipo salvaje por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácido o por ambos. En particular, los homólogos de la invención exhiben generalmente como mínimo 80-85%, 85-90%, 90- 95% ó 95%, 96%, 97%, 98% , 99% de identidad de secuencia, con la totalidad o una parte del polipéptido salival tipo salvaje o secuencias de polinucleotido y exhiben una función semejante.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene como mínimo 70%, como mínimo 75%, como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57,· 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona fragmentos y variantes de los polipéptidos L. longipalpis identificados anteriormente (NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87) los cuales pueden prepararse fácilmente de acuerdo con las técnicas de biología molecular bien conocidas por las personas capacitadas en la tecnología.

Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos como mínimo 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de . identidad con la secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87.

Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" * se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos de una proteina y que existe dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus) . Dichas variaciones alélicas naturales pueden normalmente conducir a una varianza 1- 5% en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse mediante la secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en una cantidad de especies diferentes, las cuales pueden llevarse a cabo fácilmente mediante sondas de hibridización para identificar el mismo locus genético del gen en esas especies. Se pretende que cualesquiera de dichas variaciones de ácido nucleico y los polimorfismos de aminoácido o las variaciones obtenidos que son resultado de la variación alélicas natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interés, estén dentro del alcance de la invención.

Una variante es cualquier polipéptido segregado por la saliva Lu. longipalpis, capaz de inducir en animales, como por ejemplo perros, vacunados con este polipéptido, una respuesta inmunológica especifica con base en células caracterizada por la segregación de interferon gamma (IFN-gamma) después de la estimulación con compuestos de extracto de glándula salival de Lu. longipalpis. Dicha segregación de IFN-gamma puede demostrarse con el uso de metodología in vitro (es decir, inmunoprueba Quantikine® de R&D Systems .Inc. (número de catálogo* CAIFOO) ; Djoba Siawaya JF et al.).

Según se usa en este documento, el término "derivado" o "variante" se refiere a un polipéptido ó un ácido nucleico que codifica un polipéptido, el cual tiene una o más variaciones de aminoácido conservadoras u otras modificaciones menores de modo que (1) el polipéptido correspondiente tiene una función sustancialmente equivalente cuando se compara con el polipéptido en estado salvaje o (2) un anticuerpo levantado contra el polipéptido sea inmunoreactivo con el polipéptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipéptidos que tienen modificaciones menores de las secuencias de aminoácido primarias del polipéptido Lu. longipalpis que pueden llevar a péptidos que poseen actividad sustancialmente equivalente cuando se comparan con el polipéptido equivalente sin modificar. Dichas modificaciones pueden ser deliberadas, en forma de mutagenesis dirigida a sitios ó pueden ser espontáneas. El término "variante" contempla adicionalmente eliminaciones, adiciones y sustituciones realizadas a la secuencia, en la medida en que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica según se define en el presente documento.

El término "variación conservadora" denota el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente semejante ó el reemplazo de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de modo que el residuo de aminoácido codificado no cambie o es otro residuo biológicamente semejante. En este sentido, se prefiere particularmente las sustituciones conservadoras en la naturaleza, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) acidico-aspartato y glutamato; (2) básico--lisina, arginina, histidina; (3) no-polar--alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polar sin carga --glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Entre los ejemplos de variación conservadora se incluye la sustitución de un residuo hidrofóbico, como por ejemplo isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrofóbico ó la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, como por ejemplo la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico ó glutamina por asparagina y otros semejantes; o un reemplazo conservador semejante de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente que no tiene un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácido como molécula de referencia pero poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente la inmunogenicidad de la proteína están, en consecuencia, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones están incluidos en este documento. El término "variación conservadora" incluye también el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original sin sustituir en el entendido de que los anticuerpos levantados para el polipéptido sustituido también inmunoreaccionan con el polipéptido sin sustituir.

Un fragmento inmunogénico de un polipéptido Lu. longipalpis incluye como mínimo 8, 10, 15 ó 20 aminoácidos consecutivos, como mínimo 21 aminoácidos, como mínimo 23 aminoácidos, como mínimo 25 aminoácidos ó como mínimo 30 aminoácidos de un polipéptido L. longipalpis que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87 ó variantes del mismo. En otra realización, un fragmento de un polipéptido de Lu. longipalpis incluye un epitomo antigénico específico hallado en un polipéptido de Lu. Longipalpis de cadena completa.

Procedimientos para determinar fragmentos de polipéptido y epitopo como por ejemplo, la generación de bibliotecas de péptidos superpuestos (Hemmer B. et al.), Pepscan (Geysen H. M. et al., 1984; Geysen H. M. et al., 1985; Van der Zee R. et al.; Geysen H. M. ) y algoritmos (De Groot A. et al.; Hoop T. et al.; Parker K. et al.), pueden usarse en la práctica de la invención, sin experimentación excesiva. Generalmente, los anticuerpos se unen específicamente a un epitomo antigénico particular. Entre los ejemplos específicos no limitativos de epitopos se incluye una secuencia de tetra- a penta péptidos en un polipéptido, una secuencia de tri a penta glicósidos en un polisacárido . En animales la mayoría de los antígenos presentan varios o incluso numerosos determinantes antigénicos de manera simultánea. Preferiblemente donde el epitopo es un fragmento de proteína de una molécula más grande tendrá sustancialmente la misma actividad inmunologica que la proteína total.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido de la mosca de arena Lu. longipalpis, como por ejemplo un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87. En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene como mínimo 70%, como mínimo 75%, como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75„ 77, 79, 81, 83, 85, 87 ó una variante conservadora, una variante alélica, un homologo o un fragmento inmunogénico que comprende como mínimo ocho o como mínimo diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos o una combinación de estos polipéptidos .

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 ó 91 o una variante del mismo. En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido que tiene como mínimo 70%, como mínimo 75%, como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95%, como mínimo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia para uno de un polinucleótido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 ó 91 ó una variante del mismo.

Estos polinucleótidos pueden incluir secuencias de ADN, cDNA, y ARN que codifican un polipéptido de Lu. longipalpis. Se entiende que todos los . polinucleótidos que codifican un polipéptido de Lu. longipalpis también están incluidos en este documento, en la medida en que codifican un polipéptido con la actividad reconocida, como por ejemplo la unión a un anticuerpo que reconoce el polipéptido, la inducción de una respuesta inmunológica al polipéptido ó un efecto sobre la sobrevivencia de Leishmaniasis cuando se administra a un individuo expuesto al parásito o que experimenta una reducción en una señal o síntoma de infección por Leishmaniasis.

Los polinucleótidos de la revelación incluyen secuencias que se degeneran como resultado del código genético, por. ejemplo, uso de codones optimizados para un anfitrión específico. Según se usa en este documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que ha sido genéticamente diseñado para incrementar su expresión en una especie dada. Para contemplar polinucleótidos optimizados que codifican para polipéptido salivales, la secuencia de ADN del gen de proteína salival puede modificarse para 1) comprender codones preferidos por generar altamente expresados en una especia particular; 2) comprender un contenido de A+T ó G+C en la composición base de nucleótidos hasta la que se halla sustancialmente en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dichas especies; o 4) eliminar secuencias que causan desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación de ARN o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. La expresión aumentada de proteína salival en las mencionadas especies puede lograrse mediante la utilización de la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas ó en una especia en. particular. El término "frecuencia de uso de codones preferidos" se refiere a la preferencia exhibida por una célula anfitriona especifica en el uso de codones de nucleótido para especificar un aminoácido dado. Existen 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. En consecuencia, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas se incluyen . en la revelación en la medida en que la secuencia de aminoácidos del Polipéptido salival de Lu. longipalpis codificada por la secuencia de nucleótidos no tenga cambios desde el punto de vista funcional.

La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácido puede ser establecida por el Centro nacional de Información Biotecnológica (NCBI por sus siglas en inglés) por BLAST en pares y matriz blosum62, con el uso de parámetros convencionales (véase, por ejemplo, el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor de "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, d., USA), así como en Altschul et al.; y por ende, este documento habla del uso del algoritmo o BLAST BLASTX y matriz BLOSUM62 mediante el término "blasts") .

La identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos también puede determinarse con el uso del programa "Align" de Myers y Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988) y disponible en NCBI, así como programas iguales o semejantes disponibles por medio de Internet en sitios como por ejemplo el sitio de NCBI.

De manera alternativa o de manera adicional, el término "identificar", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótido o aminoácido, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre dos secuencias. La homología de secuencia porcentual puede calcularse según lo siguiente: (Nref - Ndif) *100/Nref , donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando están alineadas y donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por ende, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia de 75% con la secuencia AATCAATC (Nref = 8; Ndif=2) .

De manera alternativa o de manera adicional, "identidad" con respecto a las secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos idénticos o aminoácidos divididos entre .el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias donde la alineación de las dos secuencias puede determinarse de acuerdo con el algoritmo de ilbur y Lipman (Wilbur y Lipman) , por ejemplo, con un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalización por hueco de 4, y análisis asistido por computadora e interpretación de los datos de secuencia que incluyen la alineación pueden realizarse de manera conveniente con el uso de programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA) . Cuando se dice que las secuencias de ARN son semejantes o tienen un grado de identidad de secuencia u homología con Secuencias de ADN, la timidina (T) en la Secuencia de ADN se considera igual a uracil (U) en la secuencia de ARN. Así, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden derivarse de secuencias de ADN, por timidina (T) en la secuencia de ADN se consideran igual a. uracil (U) en las secuencias de ARN.

La identidad de secuencia o semejanza de secuencias de dos secuencias de aminoácido ó la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos pueden determinarse con el uso del paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, GA) .

De manera ventajosa, la identidad de secuencia u homología como por ejemplo la identidad de secuencia u homología de aminoácidos puede determinarse con el programa BlastP (Altschul et al.) y disponible en NCBI, así como programas iguales o diferentes disponibles por medio de Internet en sitios como por ejemplo el sitio de NCBI.

Los documentos siguientes proporcionan algoritmos para la comparación de la identidad relativa u homología de secuencias, y de manera adicional o alternativa con respecto a lo dicho anteriormente, pueden usarse las enseñanzas en estas referencias . para determinar la homología o identidad porcentual: Needleman SB y unsch CD; Smith TF y Aguaman MS; Smith TF, Aguaman MS y Sadler JR; Feng DF y Dolittle RF; Higgins DG y Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ; y, Devereux J, Haeberlie P y Smithies 0. Y, sin experimentación excesiva, el artesano capacitado puede consultar cualquiera de los numerosos programas o referencias existentes para determinar la homología porcentual.

El polinucleótido de Lu. longipalpis puede incluir un ADN recombinante que se incorpora a un vector, a un plásmido de replicación autónoma o virus ó a un ADN genómico de una procariota o eucariota o el cual existe como molécula separada (por ejemplo, un cDNA) independiente de otras secuencias.

Los vectores recombinantes revelados en este documento pueden incluir un polinucleótido que codifica un polipéptido, una variante del mismo o un fragmento del mismo. Los vectores recombinantes pueden incluir ·¦ plásmidos y vectores virales y pueden usarse para la expresión in vitro o in vivo. Los vectores recombinantes pueden incluir adicionalmente un péptido señal. Los péptidos señal son cadenas cortas de péptidos (3-60 aminoácidos de longitud) que dirigen el transporte posterior a la traducción de una proteina (la cual se sintetiza en el citosol) hasta ciertas organelas como por ejemplo el núcleo, matriz mitocondrial, retículo endoplásmico, cloroplastos, apoplasto y peroxisoma. Normalmente, el polipéptido salival de Lu. Longipalpis que existe en la naturaleza, como por ejemplo las proteínas LJM17 y LJL143, puede transducirse como precursores, que tienen una secuencia de péptido señal secuencia N-terminal y un dominio de proteína "maduro". El péptido señal puede segmentarse rápidamente después de la traducción. La secuencia de señales puede ser la secuencia natural de la proteína salival o un péptido señal de una proteína segregada, por ejemplo el péptido señal de la proteína activadora de plasminógeno en tejidos (tPAj , en particular la tPA humana (S. Friezner Degen et al.; R. Rickles et al.; D. Berg. et al.) ó el péptido señal del factor de crecimiento semejante a insulina 1 (IGF1), en particular el IGF1 equino (K. Otte et al.), el IGFl canino (P. Delafontaine et al.), IGF1 felino (WO03/022886) , IGFl bovino (S. Lien et al.), IGFl porcino (M. Muller et al.), IGFl del pollo (Y. ajimotó et al.), IGFl del pavo (GenBank. número dé acceso AF074980) . El péptido señal del IGFl puede ser natural u optimizado lo cual puede lograrse mediante la retirada de sitios de emplace crípticos y/o mediante adaptación del uso de codones. Después de la traducción, el polipéptido sin procesar puede segmentarse en un sitio de segmentación para conducir al polipéptido maduro. El sitio de segmentación puede predecirse con el método de Von Heijne (1986) .

Un plásmido puede incluir . una unidad de transcripción de ADN, por ejemplo una secuencia de ácido nucleico que le permite la replicación en una célula anfitriona, como por ejemplo un origen de replicación (procariota o eucariota) . Un plásmido también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos dentro de la tecnología. Las formas circular y lineal de los plásmidos están abarcadas en la presente revelación.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un vector de expresión in vivo que comprende una secuencia de polinucleótidos, la cual contiene y expresa in vivo en un anfitrión el polipéptido salival de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos del mismo.

El vector de expresión in vivo puede incluir cualquier unidad de transcripción que contiene un polinucleotido o un gen de interés y los elementos esenciales para su expresión in vivo. Estos vectores de expresión pueden ser plásmidos o vectores virales recombinantes . Para la expresión in vivo, el promotor puede ser de origen viral o celular. En una realización, el promotor puede ser el citomegalovirus (CMV) promotor temprano (promotor CMV-IE), el promotor temprano o tardío del virus SV40 o el promotor de virus Rous Sarcoma LTR, un promotor de un gen citoesqueleto, como por ejemplo el promotor de desmina (Kwissa M. et al.) ó el promotor de actina (Miyazaki J. et al.). Cuando están presentes varios genes en el mismo plásmido, los mismos pueden estar contemplados en la misma unidad de transcripción o en unidades diferentes.

Según se usa' en este documento, el término "plásmido" puede incluir cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido de conformidad con la invención y los elementes necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del anfitrión o meta deseados; y, en este sentido, cabe destacar que se busca que un plásmido circular, superenrrollado o no superenrrollado, asi como una forma lineal, estén dentro del alcance de la invención. Los plásmidos también pueden comprender otros elementos de transcripción-regulación como por ejemplo, por ejemplo, secuencias de estabilización de tipo intrón. En varias realizaciones, los plásmidos pueden incluir el primer intrón de CMV-IE (WO 89/01036) , el intrón II del gen de betaglobina de conejo (van Ooyen et al.), la secuencia de señales de la proteina codificada por el activador de plasminógeno del tejido (tPA; Montgomery et al.), y/o una señal de poliadenilación (poliA) , en particular poliA de gen de la hormona bovina de crecimiento (bGH) (US 5, 122, 458) o poliA del gen de betaglobina del conejo o de virus SV40.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición para vacuna que comprende: a) un vector de expresión in vivo, donde el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis, y una mezcla de los mismos; y b) un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición para vacuna que comprende: a) un primer vector de expresión in vivo, donde el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del. grupo que consiste en un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis, y una mezcla de los mismos; b) un segundo vector de expresión in vivo, donde el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis, y una mezcla de los mismos; y c) un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

El término "composición para vacuna" o "vacuna" comprende cualquier composición, una vez inyectada a un anfitrión, incluidos caninos, felinos y seres humanos, que protege al anfitrión de la Leishmaniasis cutánea y/o Leishmaniasis visceral, y/o la cual puede prevenir la implantación del parásito y/o la cual puede prevenir el avance de la enfermedad en un paciente infectado, y/o la cual puede limitar la difusión de parásitos fugitivos hacia los órganos internos y/o la cual puede evitar o limitar la absorción del parásito. por una mosca de la arena durante un alimentación con sangre en un perro vacunado. Lo anterior puede lograrse después de la vacunación de conformidad con la presente invención a través de la inducción de la secreción de citoquina, notablemente la secreción de IFN-gamma (a modo de ejemplo de un método de medición de la secreción de IFN-gamma, puede usarse la inmunoprueba Quantikine® de R&D Systems Inc. (número de catalogo* CAIFOO) (Djoba Siawaya JF et al.)).

Los vehículos o excipientes aceptables farmacéuticamente a usar son convencionales. Remington' s Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) , describe composiciones y formulaciones adecuadas para la distribución farmacéutica de polipéptidos, plásmidos, vectores virales revelados en este documento. En general, la naturaleza del vehículo o excipiente dependerá del modo particular de administración que se adopte. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos aceptables farmacéutica y fisiológicamente como por ejemplo agua, suero fisiológico, soluciones salinas balanceadas, dextrosa acuosa, glicerol o semejantes como vehículo. Para composiciones solidas (por ejemplo, pastilla liofilizada, polvo, pildora, tableta ó capsula) , los vehículos o excipientes sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de mannitol, lactosa, almidón ó estearato de magnesio. Adicionalmente a los vehículos o excipientes neutrales biológicamente, las composiciones immunogénicas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, como por ejemplo agentes de humectación o emulsificación, preservativos y agentes de regulación de pH y otros semejantes, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato sorbitano .

Las vacunas de conformidad con la invención pueden incluir vectores que codifican cualquier polinucleotido de conformidad con la presente invención según se describe anteriormente.

Es posible realizar múltiples inserciones en el mismo vector a través de diferentes sitios de inserción o a través del mismo sitio de inserción. Cuando se trabaja con el mismo sitio de inserción, cada inserción de polinucleotido, el cual puede ser cualquier polinucleotido de la presente invención anteriormente mencionada, puede introducirse con el control del mismo promotor y/o promotores diferentes. La inserción puede hacerse extremo a extremo ("cola a cola") , cabeza a cabeza, extremo a cabeza o cabeza a extremo. También pueden usarse los elementos IRES (Internal Ribosome Entry Site, ver EP 0803573) para separar y expresar múltiples inserciones vinculadas de manera operativa a promotores iguales y/o diferentes.

En una realización, la presente invención se relaciona con un vector de expresión que comprende un polinucleotido anteriormente mencionado. El vector de expresión puede ser un vector de expresión in vivo ó un vector de expresión in vitro.

De manera más general, la presente invención' abarca vectores de expresión in vivo incluidos cualquier plásmido (EP-A2-1001025; Chaudhuri P.) que contiene y expresa in vivo en un anfitrión el polinucleótido o gen del polipéptido salival de Lu. longipalpis, variante del mismo o fragmento del mismo y los elementos necesarios para su expresión in vivo.

En un ejemplo especifico no limitativo, el plásmido pVR1020 o pVR1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al.; Hartikka J. et al.), pVR2001-TOPA (o pVR2001-TOPO) (Oliveira F. et al.) o pABUO (US 6, 852,705) puede utilizarse como vector para la" inserción de una secuencia de polinucleótidos . El plásmido pVR1020 se deriva de pVR1012 y contiene la secuencia de señal tPA humana. El pVR102'0 es una columna de plásmido disponible en Vical, Inc., (San Diego, CA) la cual se ha usado previamente, véase, por ejemplo, Patente EE.UU. Nos. 6,451,769 y 7,078,507. Según se describe en Oliveira et al., el plásmido pVR2001-TOPO (opVR2001-TOPA) es pVR1020 modificado por la adición de topoisomerasas que flanquean el sitio de clonación y contienen la codificación de un péptido señal de secreción y su expresión, por ejemplo, péptido señal de activador de plasminógeno del tejido (tPA) , que incrementa la probabilidad de producir una proteina segregada (véase la Figura 1 en Oliveira F. et al.) .

Cada plásmido puede comprender o contener o consistir esencialmente del polinucleotido de conformidad con la presente invención, vinculado de manera operativa con un promotor o de conformidad con el control de un promotor o dependiente de un promotor, donde el promotor puede estar adyacente de manera 5 ventajosa al polinucleotido para el cual se desea la expresión.

En general, es ventajoso trabajar con un promotor fuerte que sea funcional en las células eucariotas. Un ejemplo de un promotor útil puede ser el promotor citomegalovirus temprano inmediato (CMV-IE) de origen humano o murino o puede 0 opcionalmente tener otro origen como por ejemplo, la rata o ;??: '; "conejillo dé indias. El'^ 'romo't-e^dé^GM ^TE puede comprender la parte del promotor real, el cual puede o no estar vinculado con la parte del reforzador. Puede hacerse una referencia a EP 260 148, EP 323 597, US 5,168,062, 5,385,839, y 4,968,615, asi como 5 WO 87/03905. El promotor CMV-IE puede ventajosamente ser CMV- IE humano (Boshart M. et al.) o CMV-IE murino. En términos más generales, el promotor puede tener un origen o bien viral o celular. Un promotor viral fuerte distinto a CMV-IE, que puede usarse de manera útil un en la práctica de la invención es el 0 promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus sarcoma Rous . Un promotor celular fuerte que puede usarse de manera útil un en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, como por ejemplo el promotor de desmina (Kwissa M. et al.) o el promotor de actina (Miyazaki J. 5 et al.). Se incluyen en la invención subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, porciones de estos promotores que mantiene una actividad promotora adecuada, por ejemplo promotores de CMV-IE truncados, de conformidad con WO 98/00166 o US 6,156,567 y pueden usarse en la práctica de la invención. Un promotor útil en la práctica de la invención puede incluir en consecuencia, derivados y/o sub fragmentos de un promotor de longitud completa que mantiene una actividad promotora adecuada y por ende, funciona como promotor, y el cual puede tener actividad promotora de manera ventajosa, sustancialmente semejante al promotor actual o de longitud completa a partir del cual se deriva el derivado o sub fragmento, por ejemplo, semejante a la actividad de los promotores de CMV-IE truncados de US 6,156,567 en comparación con la actividad de los promotores de CMV-IE de longitud completa. Asi, un promotor de CMV-IE en la práctica de la invención puede comprender o consistir esencialmente en la porción del promotor del promotor de longitud completa y/o la porción del reforzador del promotor de longitud completa, asi como derivados y/o sub fragmentos de los mismos.

De manera ventajosa, los plásmidos comprenden o consisten esencialmente en otros elementos de control de expresión. Resulta especialmente ventajoso incorporar secuencias de estabilización, por ejemplo, secuencia de intrones, por ejemplo, el primer intrón del hCMV-IE (WO 89/01036), el intrón II del gen de ß-globin del conejo (van Ooyen et al.). En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales diferentes a poxvirus, puede usarse la señal de poli (A) del gen de la hormona bovina de crecimiento (bGH) (ver US 5,122,458) ó la señal poli (A) del gen de ß-globin del conejo o la señal poli (A) del virus SV40.

En una realización de la presente invención, el vector del plásmido es pVR2001 que comprende polinucleótido LJM17, según se describe en el Ejemplo 1 en este documento.

En otra realización de la presente invención, el vector del plásmido es pVR2001 que comprende Polinucleótido LJL143, según se describe en el ejemplo 2 en este documento.

En otra realización de la presente invención, el vector del plásmido es pNBO002, según se describe en el ejemplo 9 en este documento.

En otra realización adicional de la presente invención, el vector del plásmido es pNBO003, según se describe en el ejemplo 10 en este documento.

De manera más general, la presente invención abarca vectores de expresión in vivo incluido cualquier vector viral recombinante que contiene un polinucleótido o gen que codifica uno o más inmunógenos salivales de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, incluido cualquier elemento necesario para su expresión in vivo.

Dichos vectores virales recombinantes pueden seleccionarse de, por ejemplo, los poxvirus, especialmente virus de la viruela aviar, como por ejemplo virus de viruela de aves de corral, virus de la viruela del canario. En una realización, el virus de viruela de aves de corral es TROVAC (véase O 96/40241) . En otra realización, el vector de la viruela del canario es un ALVAC. El uso de estos vectores virales recombinantes y la inserción de polinucleótidos o genes de interés se describen completamente en US 5,174,993; US 5,505,941 y US 5,766,599 para la viruela de las aves de corral, y en US 5,756,103 para la viruela del canario. Puede usarse más de un sitio de inserción dentro del genoma viral para la inserción de múltiples genes de interés.

En una realización el vector viral es un adenovirus, como por ejemplo, un adenovirus humano (HAV) o un adenovirus canino (CAV) .

En otra realización el vector viral es un adenovirus humano, específicamente un adenovirus serotipo 5 resultó incompetente para la replicacion por una supresión en la región del genoma viral, especialmente desde aproximadamente el nucleótido 459 hasta aproximadamente el nucleótido 3510 por referencia a la secuencia de hAd5 que se revela en Genbank con el número de acceso M73260 y en la publicación mencionada Chroboczek et al, 1992. El adenovirus suprimido se propaga en una expresión El-la expresión 293 (Graham et al., 1977) o células PER, especialmente PER.C6 (Falloux et al., 1998). El adenovirus humano puede suprimirse de manera adicional o alternativa en la región E3, especialmente desde aproximadamente el nucleótido 28592 hasta aproximadamente el nucleótido 30470. La supresión en la región puede hacerse en combinación con una supresión en la región E3 (véase, por ejemplo Shriver et al.; Graham et al.; lian et al.; Las patentes estadounidenses No. 6,133,028 y 6,692,956; Tripathy et al.; Tapnell; Danthinne et al.; Berkner; Berkner et al.; Chavier et al.). Los sitios de inserción pueden' ser loci (región) El y/o E3 eventualmente después de una supresión parcial o completa de las regiones El y/o E3. De manera ventajosa, cuando el vector de expresión es un adenovirus, el polinucleótido a expresar se inserta con el control de un promotor funcional en células eucariotas, como por ejemplo, un promotor fuerte, de manera ventajosa un promotor del gen inmediató-temprano del citomegalovirus (promotor del CMV-IE) , especialmente la región del reforzador / promotor desde aproximadamente el nucleótido -734 hasta aproximadamente el nucleótido +7 en Boshart et al. ó la región del reforzador / promotor del vector pCI de Promega Corp. El promotor de CMV-IE es de manera ventajosa de origen murino o humano. También puede usarse el promotor del factor de elongación- la. Se usa también un promotor especifico de músculo (Li et al.). Los promotores fuertes son abordados también en este documento en relación con los vectores de plásmidos. En una realización, puede ubicarse una secuencia de empalmes aguas debajo de la región del reforzador / promotor. Por ejemplo, el intrón 1.aislado del gen de C V-IE (Stenberg et al.), el intrón aislado del gen de ß-globina humana o del conejo, especialmente el intrón 2 del gen de ß-globina, el intrón aislado del gen de inmunoglobulina, una secuencia de empalme del gen temprano de SV40 o la secuencia quimérica de nitrones aislados del vector de pCI de Promege Corp. Puede insertarse una poli (A) secuencia y secuencia terminadora aguas abajo del polinucleótido a expresar, por ejemplo un gen de hormona bovina del crecimiento, especialmente desde aproximadamente el nucleótido 2339 hasta aproximadamente el nucleótido 2550 en Genbank con el número de acceso BOVGHRH, un gen de ß-globina de conejo o una señal de poliadenilación del gen tardío SV40.

En otra realización el vector viral es un adenovirus canino, especialmente un CAV-2 (véase, por ejemplo Fischer et al.; U.S. No. de Patente 5,529,780 y 5,688,920; O 95/14102). Para CAV, los sitios de inserción pueden estar en la región E3 y /o en la región ubicada entre la región E4 y la región ITR derecha (véase las patentes estadounidenses Nos. 6,090,393 y 6, 156, 567). En una realización la inserción se hace con el control de un promotor, como por ejemplo un promotor del gen inmediato-temprano del citomegalovirus (promotor CMV-IE) o un promotor descrito anteriormente para un vector de adenovirus humano. Puede insertarse una poli (A) secuencia y secuencia terminadora aguas abajo del polinucleótido a expresar, por ejemplo un gen de la hormona bovina del crecimiento o una señal de poliadenilacion de ß-globina del conejo.

En otra realización, el vector viral es un herpesvirus como por ejemplo un herpesvirus canino (CHV) o un herpesvirus felino (FHV) . Para el CHV, los sitios de inserción pueden ser en el gen de timidina quinasa, en 0RF3 ó en UL43 ORF (ver US 6,159,477). En una realización el polinucleótido a expresar se introduce con el control de un promotor funcional en células eucariotas, de manera ventajosa un promotor CMV-IE (murino o humano). Puede insertarse una poli (A) secuencia y secuencia terminadora aguas abajo del polinucleótido a expresar, por ejemplo señal de poliadenilacion del gen de la hormona bovina del crecimiento o la ß-globina del conejo.

Para los vectores recombinantes con base en un vector de poxvirus, puede usarse un virus de vacuna o un virus atenuado de vacuna, (por ejemplo, - MVA, una cepa modificada Ankara obtenida después de más de 570 pasos de la cepa del virus de vacuna Ankara por fibroblastos de embriones de pollo; ver Stickl & Hochstein- intzel; Sutter et al.; disponible como ATCC VR-1508; o NYVAC, ver US 5,494,807, y patente EE.UU. No. 5,494,807 la cual aborda la construcción de NYVAC, asi como las variaciones de NYVAC con ORF adicionales suprimidos del genoma del virus de vacuna de la cepa de Copenhagen, así como la inserción heterologos que codifican moléculas de ácido nucleico en sitios de este recombinante, y además, el uso de promotores correspondientes; ver también WO 96/40241) , un virus de viruela aviar o un virus atenuado de viruela aviar (por ejemplo, viruela del canario, viruela de aves de corral, viruela de la paloma, viruela del pichón de paloma, viruela de la codorniz, ALVAC o TROVAC; véase, por ejemplo, Las patentes estadounidenses No. 5,505,941, 5,494,807). Los virus atenuados de la viruela del canario aparecen descritos en US 5,756,103 (ALVAC) y WO 01/05934. Se hace referencia también a US5,766,599 la cual se relaciona con la cepa atenuada de viruela de aves de corral TROVAC. Se hace referencia a la viruela del canario disponible en ATCC con el número de acceso VR-111. Están disponibles también numerosas cepas de vacunación del virus de la viruela de aves de corral, por ejemplo la cepa DIFTOSEC CT comercializada por MERIAL y la vacuna NOBILIS VARIOLE comercializada por INTERVET. Para información sobre el método usado para generar recombinantes de los mismos y cómo administrar recombinantes de los mismos, el artesano capacitado puede consultar los documentos citados en este documento y WO 90/12882, por ejemplo, acerca de los virus de vacuna, cabe mencionar las patentes EE.UU. No. 4,769,330, 4,722,848, 4,603,112, 5,110,587, 5,494,807, y 5, 762, 938 ínter alia; acerca de la viruela de aves de corral, cabe mencionar las patentes EE.UU. No. 5,174,993, 5,505,941 y 5,766,599 Ínter alia; acerca de la viruela del canario, cabe mencionar las patentes EE.UU. No. 5,756,103 ínter alia. Cuando el vector de expresión es un virus de vacuna, el sitio o los sitios de inserción para el polinucleotido o los polinucleótidos a expresar están de manera ventajosa en el gen de timidina quinasa (TK) o sitio de inserción, el gen de hemaglutinina (HA) o sitio de inserción, la región que codifica el cuerpo de inclusión del tipo A (ATI) ; ver también los documentos citados en este documento, especialmente los relacionados con los virus de vacuna. En el caso de la viruela del canario, de manera ventajosa el sitio de inserción o los sitios de inserción son ORF(s) C3, 'C5 y/o C6; ver también documentos citados en este documento, especialmente los relacionados con el virus de la viruela del canario. En el caso de la viruela de aves de corral, de manera ventajosa el sitio o los sitios de inserción son ORF F7 y/o F8; ver también documentos citados en este documento, especialmente aquellos relacionados con el virus de la viruela de aves de corral. El sitio o los sitios de inserción de los virus MVA son de manera ventajosa iguales a los descritos en diversas publicaciones, incluidos Carroll M. W. et al.; Stittelaar K. J. et al.; Sutter G. et al.; y, en este sentido cabe destacar también que el genoma MVA completo aparece descrito en Antoine G., Virology, lo cual permitirá al artesano capacitado usar otros sitios de inserción u otros promotores. De manera ventajosa, el polinucleotido a expresar se introduce con el control de un promotor especifico de poxvirus, por ejemplo, el promotor de vacuna 7.5 kDa (Cochran et al.), el promotor de vacuna I3L (Riviere et al.), el promotor de vacuna HA (Shida) , el promotor de la viruela de la vaca ATI (Funahashi et al. ),, el promotor de vacuna H6 (Taylor J. et al.; Guo P. et al. J.; Perkus M. et al . ) , ínter alia .

En una realización adicional, el vector viral recombinante es el virus recombinante de la viruela del canario ALVAC VCP2390-NO. IDENT. SEC.:6, que expresa el Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17, según se describe en el ejemplo 3.

En una realización adicional, el vector viral recombinante es el virus recombinante de la viruela del canario ALVAC vCP2390, que expresa el Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17, según se describe en el ejemplo 11.

En una realización adicional, el vector viral recombinante es el virus recombinante de la viruela del canario ALVAC VCP2389-NO. IDENT. SEC.:2, que expresa el Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143, según se describe en el ejemplo 4.

En una realización adicional, el vector viral recombinante es el virus recombinante de la viruela del canario ALVAC VCP2389, que expresa el Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143, según se describe eh el ejemplo 12.

En una realización adicional, el vector viral recombinante es el virus recombinante MVA MVA-LJM17, que expresa el Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17, según se describe en el ejemplo 5.

En una realización adicional, el vector viral recombinante es el virus recombinante MVA MVA-LJL143, que expresa el Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143, según se describe en el ejemplo 6.

Cualquiera de los polinucleotidos revelados en el presente documento puede ser expresado in vitro por transferencia de ADN o vector de expresión a una célula anfitriona adecuada. La célula anfitriona puede ser procariota o eucariota. El término "célula anfitriona" incluye también cualquier progenie de la célula anfitriona. Los métodos de transferencia estable, lo cual significa que el polinucleótido externo se mantiene continuamente en la célula anfitriona, se conocen dentro de la tecnología. Las células anfitrionas pueden incluir bacterias (por ejemplo, Escherichia coli) , levadura, células de insecto y células de vertebrados. Los métodos de expresión de secuencias de ADN en células eucariotas se. conocen bien dentro de la tecnología. Como método para la expresión in vitro, los vectores baculovirus recombinantes (por ejemplo, el virus Autographa California Nuclear Polihedrosis (AcNPV) ) pueden usarse con los ácidos nucleicos revelados en este documento. Por ejemplo, los promotores de polihedrina pueden utilizarse con las células de insecto (por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda, como células Sf9 disponibles en ATCC con el número de acceso CRL 1711 ó células Sf21) (ver por ejemplo, Smith et al.; Pennock et al.; Vialard et al.; Verne A.; O'Reilly et al.; idd I. M. & Emery V.C.; EP 0370573; EP 0265785; US 4,745,051).

Para expresión, puede usarse el paquete BaculoGold Starter Package (Cat # 21001 ) de Pharmingen (Becton Dickinson) . Como método para expresión in vitro, puede usarse E. coli recombinante con- un vector. Por ejemplo, cuando se hace la clonación en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles como por ejemplo el promotor de arabinosa, pL de bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido de ptrp-lac) y otros semejantes. La transformación de una célula anfitriona con ADN recombinante puede realizarse mediante técnicas convencionales bien conocidas para las personas capacitadas en la tecnología. Cuando el anfitrión es procariota, como por ejemplo E. coli, las células anfitrionas competentes que puede absorber el ADN pueden ser preparadas a partir de células cosechadas después de la fase de crecimiento exponencial y tratadas subsiguientemente por el método CaC12 con procedimientos bien conocidos en la tecnología. De manera alternativa, puede usarse MgC12 o RbCl . También puede realizarse la transformación mediante electroporacion. Cuando el anfitrión es una eucariota, pueden usarse dichos métodos de transducción de ADN como coprecipitados de fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales como por ejemplo micro inyecciones, electroporacion, inserción de un plásmido encubierto en liposomas ó vectores de virus. Las células eucariotas pueden cotransformarse también con secuencias de polinucleótidos L. Iongipalpis y una segunda molécula ADN externa que codifica un fenotipo seleccionadle,' como por ejemplo el gen de timidina quinasa del herpes simplex. Otro método consiste en usar un vector viral de eucariota (ver arriba), como por ejemplo un virus del herpes o adenovirus (por ejemplo, adenovirus canino 2) , para translucir de manera transitoria células eucariotas y expresar la proteina (Gluzman EA) . Adicionalmente, puede usarse un agente de transfección, como por ejemplo, dioleoil-fosfatidil-etanolamina (DOPE) .

El aislamiento y la purificación de polipéptido expresado de manera recombinante pueden realizarse con ayuda de medios convencionales incluidos cromatografía preparatoria (por ejemplo, exclusión de tamaño, intercambio de iones, afinidad) , precipitación selectiva y ultrafiltración. Entre los ejemplos de técnicas de última tecnología que se pueden usar, aunque no taxativamente, se encuentran en "Aplicaciones de purificación de proteínas", Segunda Edición, Editado por Simón Roe y disponible en Oxford University Press. Dicho polipéptido expresado de manera recombinante forma parte de la presente revelación. Los métodos para la producción de cualquier polipéptido de conformidad con la presente invención según se describe anteriormente también están abarcados, en particular el uso de un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de conformidad con la revelación y de una célula anfitriona.

Las vacunas que contienen vectores virales recombinantes de conformidad con la invención pueden ser liofilizadas , de manera ventajosa con un estabilizador. La liofilización puede hacerse de conformidad con procedimientos de liofilización convencionales conocidos. Los estabilizadores aceptables desde el punto de vista farmacéutico o veterinario pueden ser carbohidratos (por ejemplo sorbitol, mannitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa) , glutamato de sodio (Tsvetkov T et al.; Israeli E et al.), proteínas como por ejemplo pep.tona, albúmina, lactalbumina o caseína, proteínas que contienen agentes como por ejemplo leche descremada (Mills C K et al.; olff E et al.) y soluciones reguladoras (por ejemplo solución reguladora de fosfato, solución reguladora de fosfato de metal alcalino) . Puede usarse un adyuvante para hacer solubles las preparaciones liofilizadas .

Cualquier composición para vacuna de conformidad con la invención puede también de manera ventajosa contener uno o más adyuvantes.

Las vacunas con base de plásmidos pueden formularse con lípidos catiónicos, de manera ventajosa con DMRIE (N-(2- hidroxietil) -N, N-dimetil-2 , 3-bis (tetradeciloxi) -1-propanammonio ; WO96/34109) , y de manera ventajosa en vinculación con un lípido neutro, por ejemplo DOPE (dioleoil-fosfatidil- etanolamina ; Behr J. P.), a objeto de formar DMRIE-DOPE. En una realización, la mezcla se hace de forma extemporánea, y antes de su administración conviene esperar aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 60 minutos, por ejemplo, aproximadamente 30 min, para la complej ación apropiada de la mezcla. Cuando se usa DOPE, la relación molar de DMRIE/DOPE puede ser entre 95/5 a 5/95 y de manera ventajosa 1/1. La relación de peso plásmido/DMRIE o DMRIE-adyuvante DOPE es, por ejemplo, entre 50/1 y 1/10, entre 10/1 y 1/5 o entre 1/1 y 1/2.

Opcionalmente, puede agregarse una citoquina a la composición, especialmente GM-CSF o citoquinas que inducen Thl (por ejemplo IL12) . Estos citoquinas pueden agregarse a la composición como un plásmido que codifica la proteina de citoquina. En una realización, las citoquinas son de origen canino, por ejemplo GM-CSF canino del cual la secuencia de genes ha sido depositada en la base de datos GenBank (número de acceso S49738) . Esta secuencia puede usarse para crear dicho plásmidó de manera semejante a lo realizado en WO 00/77210.

La vacuna con base en vector viral recombinante puede combinarse con fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; US 6,017,537) y/o adyuvante de Carbomero (Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996) . Las personas capacitadas en la tecnología pueden consultar también US 2,909,462, la cual describe dichos polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene como mínimo 3 grupos hidróxilos, de manera ventajosa no más de 8, los átomos de hidrógeno de como mínimo tres hidróxilos se reemplazan por radicales alifáticos no saturados que tienen como mínimo 2 átomos de carbono. Por ejemplo, los radicales son aquellos contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente no saturados. Los radicales no saturados pueden contener otros sustituyentes, como por ejemplo metilo. Los productos vendidos con el nombre Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) son apropiados. Los productos son reticulados con una sacarosa de alilo o con pentaeritritol de alilo. Entre ellos, puede mencionarse de manera ventajosa el Carbopol® 974P, 934P y 971P. y Entre los copolimeros de anhídrido maleico y derivados de alquenilo, son ventajosos los copolimeros EMA® (Monsanto) los cuales son copolimeros de anhídrido maleico y etileno, lineales o reticulados, por ejemplo, reticulados con éter de divinilo. Puede hacerse referencia a J. Fields et al.

Los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolimeros EMA® se forman, por ejemplo, con unidades básicas de la siguiente formula en la cual: - Rl y R2, los cuales son idénticos o diferentes, representan H ó CH3 x = 0 ó 1, preferiblemente x = 1 y = 1 ó 2, con x + y = 2 Para los copolímeros EMAD, x = 0 y = 2. Para los carbomeros, x = y =1.

La disolución de estos' polímeros en agua conduce a una solución ácida, la cual se neutraliza, de manera ventajosa hasta pH fisiológico, a objeto de proporcionar la solución adyuvante en la cual la vacuna propiamente dicha se incorpora. Los grupos carboxilo del polímero están parcialmente en forma C00- .

En una realización, se prepara una solución de adyuvante, especialmente de carbomero ( Pharmeuropa, vol . 8, No.2, Junio 1996) , en agua destilada,> de manera ventajosa en presencia de cloruro de sodio, la solución obtenida tiene un pH acídico. Esta solución madre se diluye mediante adición de la misma a la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada) ó una parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCl, de manera ventajosa suero fisiológico (NaCl 9 g/1) todo de una vez en varias porciones con neutralización concomitante o subsiguiente (pH 7.3 a 7.4), de manera ventajosa con NaOH. Esta solución a pH fisiológico se usa para mezclar con la vacuna, la cual puede ser especialmente almacenada en forma liofilizada, liquida o congelada.

La concentración de polímeros en la composición final para vacuna puede ser de 0.01% a 2% w/v, de 0.06 a 1% w/v ó de 0.1 a 0.6% w/v.

La vacuna de subunidad puede combinarse con adyuvantes, como emulsiones de aceite en agua, agua en aceite en agua con base en aceite mineral ylo aceite vegetal y surfactantes no iónicos como por ejemplo copolimeros de bloqueo, Tween®, Span®. Dichas emulsiones son particularmente las que se describen en la página 147 de "Vacuna Design - The Subunit y Adyuvante Approach", Pharmaceutical Biotechnology, 1995 ó Emulsiones TS, particularmente la emulsión TS6 y emulsiones LF, particularmente la emulsión LF2 (tanto para emulsiones TS como LF, ver WO 04/024027). Otros adyuvantes adecuados son por ejemplo vitamina E, saponinas y Carbopol® (Noveon; ver WO 99/51269; WO 99/44633), hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio ("Vacuna Design, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, 1995), adyuvantes biológicos (es decir, C4b, particularmente C4b murino (Ogata R T et al.) o C4b equino, GM-CSF, particularmente GM-CSF equino (US 6,645,740)), toxinas (es decir, toxinas de cólera CTA o CTB, toxinas lábiles al calor Escherichia coli LTA ó LTB (Olsen C W et al.; Fingerut E et al.; Zurbriggen R et al. Peppoloni S et al.), y CpG (es decir CpG #2395 (ver Jurk M et al.), CpG #2142 (ver SEQ. ID. NO: 890 en EP 1,221,955)).

La vacuna también puede contener o comprender uno o más antigenos Leishmaniasis, por ejemplo, proteina 11 de membrana quinetoplástida (KMP11) .

Los antigenos KMP11 de Leishmaniasis se derivan, por ejemplo, de L. infantum o L. chagasi. KMP11 es una proteina de membrana superficial altamente conservada presente en todos los miembros de la familia Kinetoplastidae y se expresa de manera diferencial tanto en formas de amastigote y promastigote de Leishmaniasis (Jardim A. et al.; Jardim A. et al.; Berberich C. et al.). La secuencia de ácido nucleico del gen y la secuencia de aminoácidos de la proteína KMPll de Leishmaniasis están disponibles en bases de datos públicas, particularmente como L. infantum en la base de datos GenBank con el número de accesos X95627 y X95626. La secuencia de ácido nucleico de L. donovani también está disponible en la base de datos GenBank, particularmente con el número de acceso S77039.

La tecnología reciente con respecto a KMPll, los vectores que expresan KMPll y las vacunas se encuentran mejor resumidos en la solicitud de patente WO 08/064181. Una vacuna con base en plásmido que comprende pVR1020 KMPll aparece descrita en el ejemplo 1 y 'en el ejemplo 3 se describe la vacuna con base en el vector del virus de la viruela del canario que comprende vCP2350. WO 08/064181 también brinda información con respecto a adyuvantes, formulación, dosis y rutas de administración.

Es posible producir, aislar y purificar polipéptidos KMPll y variantes o fragmentos de los mismos de la misma manera establecida para la expresión in vitro de los polipéptidos salivales de la mosca de la arena.

En una realización, la vacuna comprende polipéptidos salivales de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos y/o vectores que comprenden un polinucleotido .que codifica el polipéptido Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos y/o vectores que comprenden el polinucleotido KMP11 que codifica el polipéptido KMP11 y/o fragmentos o variantes del mismo de Leishmaniasis . En un ejemplo especifico no limitativo de esta realización, el Polipéptido salival de Lu. longipalpis incluye un polipéptido que tiene como mínimo 70%, como mínimo 75%, como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87. En otro ejemplo específico no limitativo de esta realización, el polinucleotido codifica a Polipéptido salival de Lu. longipalpis que tiene como mínimo 70%, como mínimo 75%, como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87. En otro ejemplo específico no limitativo adicional, el polinucleotido tiene como mínimo 70%, como mínimo 75%, como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polinucleotido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 , 54, 56 , 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 7 6 , 78 , 80 , 82 , 84 , 8 6 , 88 , 89 , 90 ó 91 .

En una realización particular, la vacuna comprende polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17s y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleotido que codifica el polipéptido de Lu. longipalpis LJM17 y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleotido KMPll que codifica el polipéptido KMPll y/o fragmentos o variantes del mismo de Leishmaniasis . Por ejemplo, los vectores for LJM17 pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR2001 LJM17, pNBO002, vCP2390, VCP2390-NO. IDENT. SEC . : 6 y MVA-LJM1 . Los vectores for KMPll pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR1020 KMPll y VCP2350. En una realización, la vacuna comprende plásmidos pVR2001 LJM17 y pVR1020 KMPll. En otra realización, la vacuna comprende vectores VCP2390 y vCP2350. En otra realización adicional, la vacuna comprende plásmidos pNBO002 y pVR1020 KMPll. En otra realización adicional, la vacuna comprende VCP2390-NO. IDENT. SEC.:6 y VCP2350.

En otra realización particular, la vacuna comprende Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143s y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleotido que codifica el Polipéptido de Lu. longipalpis LJL143 y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleotido que codifica polipéptidos KMPll de Leishmaniasis y/o variantes o fragmentos del mismo. Por ejemplo, los vectores para LJL143 pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR2001 LJL143, pNBO003, VCP2389, VCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y MVA-LJL143. Los vectores para KMPll pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR1020 KMPll y vCP2350. En una realización, la vacuna comprende plásmidos pVR2001 LJL143 y pVR1020 KMPll. En otra realización, la vacuna comprende vectores VCP2389 y vCP2350. En otra realización adicional, la vacuna comprende plásmidos pNBO003 y pVR1020 KMPll. En otra realización adicional, la vacuna comprende vectores VCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y vCP2350.

En otra realización particular, la vacuna comprende Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJLl43s, variantes del mismo, fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleotido que codifica el polipéptido de Lu. longipalpis LJL143 y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o polipéptido salival de Lu. longipalpis salival LJM17s y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleotido LJM17 que codifica el polipéptido de Lu. longipalpis LJM17 y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o Leishmaniasis KMPll polipéptidos y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleotido KMPll o gen. Por ejemplo, los vectores para LJL143 pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR2001 LJL143, pNBO003, vCP2389, vCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y MVA-LJL143. Los vectores para LJM17 pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR2001 LJM17, pNBO002, VCP2390, vCP2390-NO. IDENT. SEC.:6 y MVA-LJM17. Los vectores para KMP11 pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR1020 KMP11 y vCP2350. En una realización, la vacuna comprende plásmidos pVR2001 LJL143, pVR2001 LJM17 y pVR1020 KMP11. En otra realización, la vacuna comprende vectores vCP2389, vCP2390 y vCP2350. En otra realización adicional, la vacuna comprende plásmidos pNBO003, pNBO002 y pVR1020 MP11. En otra realización, la vacuna comprende vectores vCP2389-NO. IDENT. SEC..:2, VCP2390-NO. IDENT. SEC.:6 y VCP2350.

La vacuna puede estar además vinculada con como mínimo un antígeno de Leishmaniasis, por ejemplo Leishmaniasis desactivada.

En una realización particular, la cepa de Leishmaniasis puede ser Leishmaniasis infantum, y/o Leishmaniasis braziliensis. En una realización preferida, la' cepa de Leishmaniasis puede ser Leishmaniasis braziliensis.

Estas cepas de Leishmaniasis pueden ser inactivadas mediante métodos químicos o físicos. Los métodos químicos son particularmente BPL, formaldehido . Los métodos físicos pueden ser particularmente sonicación. Un método para la inactivación de la Leishmaniasis a usar en una vacuna aparece descrito en R. Cordeiro Giunchetti et al., Vacuna, 2007. Se cultivan los promastigotes en medio NNN/LIT durante 6 a 14 días, pero más preferiblemente 10 días, hasta lograr la diferenciación entre la forma prociclica del promastigote en la forma metaciclica del promastigote sobre la base de la observación con microscopio. El cultivo puede entonces cosecharse por centrifugación (2000Xg, 20minutos, 4°C). De ser pertinente, se descarta el sobrenadante y se lava la biomasa tres veces en solución reguladora de suero fisiológico. Sea o no clarificado el cultivo, la suspensión de promastigote (es decir, el cultivo crudo o promastigote resuspendido en solución reguladora de suero fisiológico después de centrifugación) se perturba subsiguientemente mediante tratamiento de ultrasonido con una alimentación de 10 a 375W, pero más preferiblemente 40W, durante 1 minuto, a 0°C. El volumen por lote para este tratamiento es entre 5 y 150 mL, preferiblemente 30 mL. Después del tratamiento puede guardarse el lisato a -80°C.

La formulación de la vacuna puede prepararse a partir del concentrado de proteínas que se obtiene después de la lisis celular. La cantidad de proteínas del lisato celular que puede usarse para la vacunación de un canino es desde aproximadamente 50 µg hasta aproximadamente 2000 µg, preferiblemente desde aproximadamente 50 g hasta aproximadamente 600 µg. La concentración de proteínas se determina de conformidad con el método de Lowry.

La vacuna de Leishmaniasis desactivada puede combinarse con adyuvantes, como aquellos que se describen previamente para las vacunas subunidad.

En una realización, la vacuna comprende Polipéptidos salivales de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleótido salival Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos del mismo y/o Leishmaniasis desactivada. En un ejemplo especifico no limitativo de esta realización, el polipeptido salival de Lu. longipalpis incluye un polipéptido que tiene como mínimo 70%, como mínimo 75%, como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de "identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23., 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87. En otro ejemplo específico no limitativo de esta realización, el polinucleótido codifica a un polipéptido salival de Lu. longipalpis que tiene como mínimo 70%, como mínimo 75%, como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87. En otro ejemplo específico no limitativo adicional, el polinucleótido tiene como mínimo 70%, como mínimo 75%, como mínimo 80%, como mínimo 85%, como mínimo 90%, como mínimo 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polinucleótido que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 ó 91.

En una realización particular, la vacuna comprende polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17s y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleótido LJM17 y/o variantes o fragmentos del mismo y/o Leishmaniasis desactivada. Por ejemplo, los vectores para LJ 17 pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en pVR2001 LJM17, pNBO002, vCP2390, vCP2390-NO. IDENT. SEC: 6 y MVA-LJ 17 y pueden combinarse con Leishmaniasis desactivada seleccionada del grupo que consiste en Leishmaniasis infantum y/o Leishmaniasis braziliensis desactivada sonicada. Por ejemplo, en una realización, la vacuna comprende el vector VCP2390 y Leishmaniasis braziliensis desactivada sonicada. En otra realización, la vacuna comprende el vector vCP2390-NO. IDENT. SEC: 6 y Leishmaniasis braziliensis desactivada sonicada.

En otra realización particular, la vacuna comprende polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143s y/o variantes o fragmentos del mismo y/o vectores que comprenden el polinucleótido LJL143 y/o variantes o fragmentos del mismo y/o Leishmaniasis desactivada. Por ejemplo, los vectores for LJL143 pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR2001 LJL143, pNBO003, VCP2389, VCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y MVA-LJL143. La Leishmaniasis desactivada puede ser seleccionada del grupo que consiste en Leishmaniasis infantum desactivada sonicada y/o Leishmaniasis braziliensis . Por ejemplo, en una realización, la vacuna comprende el vector vCP2389 y Leishmaniasis braziliensis desactivada sonicada. En otra realización, la vacuna comprende el vector vCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y Leishmaniasis braziliensis desactivada sonicada.

En otra realización particular, la vacuna comprende polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143s y/o variantes o fragmentos del mismo y/o vectores que comprenden el polinucleótido LJL143 y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17s y/o variantes o fragmentos del mismo y/o vectores que comprenden el polinucleótido LJM17 y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o Leishmaniasis desactivada. Por ejemplo, los vectores pudieran ser seleccionados para LJL143 del grupo que consiste en pVR2001 LJL143, pNBO003, VCP2389, VCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y VA-LJL143. Para LJM17, los vectores pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR2001 LJM17, pNBO002, vCP2390, vCP2390-NO. IDENT. SEC.:6 y MVA-LJM17. La Leishmaniasis desactivada puede ser seleccionada del grupo que consiste en Leishmaniasis infantum desactivada sonicada y/o Leishmaniasis braziliensis . En una realización, la vacuna comprende vectores vCP2389 y vCP2390 y Leishmaniasis braziliensis desactivada sonicada. En otra realización, la vacuna comprende vectores vCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y vCP2390-NO. IDENT. SEC.:6 y Leishmaniasis braziliensis desactivada sonicada.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con métodos de vacunación a un anfitrión contra la Leishmaniasis con ayuda de las composiciones para vacuna reveladas en este documento .

El anfitrión puede ser cualesquiera o la totalidad entre seres humanos, felinos (por ejemplo, gatos domesticados, gatitos, gatos grandes y gatos salvajes) y caninos (por ejemplo, perros, perras, cachorros, zorros, chacales y lobos) . En una realización, el anfitrión es un canino.

Las rutas de administración pueden ser, por ejemplo, intramuscular (IM) o intradérmica (ID) o transdérmica (TD) o subcutánea (SC) . Los medios de administración pueden ser, por ejemplo, una jeringa con una aguja ó aparato sin agujas ó una jeringa con una aguja acoplada con tratamiento de electrotransferencia (ET) ó aparato sin agujas acoplado con tratamiento ET.

Otro aspecto of la invención se relaciona con el uso de una vacuna con base de plásmidos de conformidad con la presente invención para su administración para la Leishmaniasis , un anfitrión, donde la administración .está acoplada con el tratamiento ET . La administración de una vacuna con base de plásmidos es ventajosamente intramuscular. 'El medio de administración es, por ejemplo, una jeringa y una aguja. Es posible administrar una o varias inyecciones · de manera sucesiva. En el caso de varias inyecciones, las mismas pueden realizarse cada 2 a 6 semanas, por ejemplo, aproximadamente cada 3 semanas. En una realización, se administra adicionalmente un reforzador semi-anual o un reforzador anual.

Para vacunas con base de plásmidos, las rutas ventajosas de administración pueden ser ID ó IM. La administración puede hacerse a través de una jeringa con una aguja o con un aparato sin agujas como Dermojet o Biojector (Bioject Oregon, USA) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet™ (Bioject Inc.), ver US 2006/0034867. La dosis puede ser de 50 ]iq a 500 ]iq por plásmido. Cuando se agrega DMRIE-DOPE, es posible utilizar 100 µ? por plásmido. Cuando se usa GM-CSF canino u otras citoquinas, el plásmido que codifica esta proteina puede estar presente a una dosis desde aproximadamente 200 g hasta aproximadamente 500 pg y puede ser de manera ventajosa 200 g. El volumen de dosis puede estar entre 0.01 mi y 0.5 mi, por ejemplo, 0.25 mi. La administración puede proporcionarse a través de puntos múltiples de inyección.

De manera alternativa, las vacunas con base de plásmidos pueden administrarse por medio de ruta IM acoplada con tratamiento de electrotransferencia (ET) . El tratamiento ET puede realizarse con un aparato de electrotransferencia y las especificaciones del fabricante (es decir, generador Sphergen G250 (Sphergen SARL, Evry Genopole, France) ; sistema de electroporación MedPulser® ADN (Innovio Biomedical Corporation, San Diego, California, USA) ) . En una realización, el aparato de electrotransferencia tiene un campo unipolar. La intensidad de campo puede ser desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 250 V/cm, desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 V/cm ó desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 175 V/cm. La duración del pulso puede ser desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 msec ó desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 25 msec. La frecuencia puede ser desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 Hz ó desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15 Hz. El intervalo de interpulso puede ser desde aproximadamente 1 hasta 1000 msec ó desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 200 msec. El número de pulsos puede ser desde 1 hasta 20 ó desde 5 hasta 10. La intensidad intra tejido puede ser de manera ventajosa de hasta aproximadamente 2 A. La distancia 'entre electrodos puede ser desde aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 1 cm ó desde aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 0.5 cm.

Para vacunas virales con base de vector recombinante, las rutas de administración pueden ser de manera ventajosa SC ó IM ó TD ó ID. La administración puede realizarse mediante una jeringa con una aguja o con un aparato sin agujas como Dermojet o Biojector (Bioject Oregon, USA) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet™ (Bioject Inc.). La dosis puede ser desde aproximadamente 103 pfu hasta aproximadamente 109 pfu por vector recombinante de poxvirus. Cuando el vector es un virus de la viruela del canario, la dosis puede ser, por ejemplo, desde aproximadamente 105 pfu hasta aproximadamente 109 pfu ó desde aproximadamente 106 pfu hasta aproximadamente 108 pfu. El volumen de dosis puede ser desde aproximadamente 0.01 mi hasta 0.2 mi y ventajosamente es de 0.1 mi. La administración puede comprender puntos múltiples de inyección.

Para la ruta IM el volumen de la vacuna proporcionada puede ser de 0.2 a 2 mi, en particular desde aproximadamente 0.5 hasta 1 mi. Las mismas dosis fueron utilizadas para cualquiera de los vectores de la presente invención.

Para vacunas subunidad, la ruta de administración puede hacerse de manera ventajosa por medio de SC ó IM ó TD ó ID. La administración puede hacerse mediante una jeringa con una aguja o con un aparato sin agujas como Dermojet o Biojector (Bioject Oregon, USA) ó Vetjet™ (Merial) ó Vitajet™ (Bioject Inc.). La dosis puede ser desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 500 g, en particular desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 \iq, y más particularmente desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 xq. El volumen de la vacuna subunidad proporcionada es de 0.2 a 2 mi, en particular desde aproximadamente 0.5 a 1 mi.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una estrategia de vacuna, la cual se basa sobre un régimen de primo administración de refuerzos, donde ¦ la primo administración y la administración de refuerzos (s) utilizan una composición que comprende un excipiente, diluyente o vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario y un vector de expresión in vivo que comprende una secuencia de polinucleótidos, que contiene y expresa el polipéptido salival de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos del mismo.

La presente invención se relaciona con el uso de vectores de expresión in vivo en un régimen de primo administración de refuerzos, que comprende una primo administración de una vacuna que comprende un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un vector de expresión in vivo que contiéne una secuencia de polinucleótidos para la expresión, in vivo, de polipéptidos salivales de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos del mismo, seguida de una administración de refuerzos de una vacuna que comprende un vehículo excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un vector de expresión in vivo que contiene una secuencia de polinucleótidos para la expresión, in vivo, del polipéptido de la mosca de la arena de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos del mismo según se describe anteriormente, para proteger a un anfitrión contra la Leishmaniasis y/o prevenir el avance de la enfermedad en anfitriones infectados.

Un régimen de primo refuerzo comprende como mínimo una primo administración y como mínimo una administración de refuerzos que usa como mínimo un polipéptido frecuente y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna usada para la primo administración puede ser diferente en su naturaleza de las usadas como vacuna posterior de refuerzo. La primo administración puede comprender uno o más administraciones. De manera semejante, la administración de refuerzos puede comprender uno o más administraciones.

Las rutas de administración, dosis y volúmenes son los revelados previamente en este documento.

La primo administración de refuerzos puede realizarse de manera ventajosa cada 2 a 6 semanas, por ejemplo, aproximadamente cada 3 semanas. De conformidad con una realización, se propone también un refuerzo semi-anual o un refuerzo anual, de manera ventajosa con la vacuna viral con base en vector. Los animales tienen de manera ventajosa como mínimo 6 a 8 semanas de edad al momento de la primera administración .

En una realización particular, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de plásmidos de conformidad con la presente invención y como mínimo una administración de refuerzo de una vacuna viral con base en vector recombinante de conformidad con la presente invención.

En otra realización particular, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna viral con base en vector recombinante de conformidad con la presente invención y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna subunidad de conformidad con la presente invención.

En otra realización particular, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna viral . con base en vector recombinante de conformidad con la presente invención y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de plásmidos de conformidad con la presente invención.

En una realización, la presente invención se relaciona con un método de vacunación de un individuo susceptible a la Leishmaniasis que comprende un régimen de primo administración de refuerzos donde dicho régimen comprende una primo administración de una vacuna que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un plásmido que contiene un polinucleótido para la expresión, in vivo, de un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis ó una mezcla de los mismos, seguida de una administración de refuerzos de una vacuna que comprenden, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un vector viral recombinante. que comprende un polinucleótido para la expresión, in vivo, del mismo (los mismos) polipéptido (s ) salivales de Lu. longipalpis, variante de los mismos, fragmento de los mismos, para proteger al individuo de Leishmaniasis y/o prevenir el avance de la enfermedad en un paciente infectado.

En otra realización, la presente invención se relaciona con un método de vacunación de un individuo susceptible a la Leishmaniasis que comprende un régimen de primo administración de refuerzos donde dicho, régimen comprende una primo administración de una vacuna que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un vector viral recombinante que comprende un polinucleótido para la expresión, in vivo, de un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis ó una mezcla de los mismos, seguida de una administración de refuerzos de una vacuna que comprende, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un plásmido que contiene un polinucleótido para la expresión, in vivo, del mismo (los mismos) polipéptido ( s ) salivales de Lu. longipalpis, variante del mismo, fragmento del mismo, para proteger al individuo de la Leishmaniasis y/o prevenir el avance de la enfermedad en un paciente infectado.

En otra realización adicional, la presente invención relacionada con un método de vacunación de un individuo susceptible a Leishmaniasis que comprende un régimen de primo administración de refuerzos donde dicho régimen comprende una primo administración de una vacuna que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un vector viral recombinante que comprende un polinucleotido para la expresión, in vivo, de un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis ó una mezcla de los mismos, seguida de una administración de refuerzos de una vacuna que comprende, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, el mismo (los mismos) polipéptido ( s ) salivales de Lu. longipalpis, variante del mismo, fragmento del mismo, para proteger al individuo de la Leishmaniasis y/o prevenir el avance de la enfermedad en un paciente infectado.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de plásmidos pVR2001 LJM17 ó pNBO002 y como mínimo , la administración de un refuerzo de una vacuna con base de vectores vCP2390 ó vCP2390-NO. IDENT. SEC.:6.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de plásmidos pVR2001 LJL143 ó pNBO003 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de vectores vCP2389 ó VCP2389-NO. IDENT . SEC.:2.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de plásmidos pVR2001 LJL143 y pVR2001 LJM17 , y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de vectores vCP2389 y VCP2390.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de plásmidos pNBO003 y pNBO002 y como mínimo la administración de un refuerzo de una a vCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y vCP2390-NO. IDENT. SEC.:6 vacuna con base de vectores.

En otra realización adicional, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una pVR2001 LJM17 ó pNBO002 vacuna con base de plásmidos y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de vectores MVA-LJM17.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de. plásmidos pVR2001 LJL143 o pNBO003 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de vectores MVA-LJL143.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de plásmidos pVR2001 LJL143 y pVR2001 LJM17 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de vectores MVA-LJL143 y MVA-LJM17.

En otra realización adicional, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de plásmidos pNBO003 y pNBO002 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de vectores MVA-LJL143 y MVA-LJM17.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores vCP2390 o VCP2390-NO. IDENT. SEC.:6, y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna subunidad del polipéptido LJM17.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores vCP2389 o vCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna subunidad de polipéptido LJL143.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores VCP2389 o vCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y VCP2390 ó vCP2390-NO. IDENT. SEC.:6, y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna subunidad del Polipéptido LJL143 y Polipéptido LJM17.

En otra realización adicional, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores MVA-LJM17 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna subunidad de polipéptido LJM17.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores MVA-LJL143 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna subunidad de polipéptido LJL143.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores VA-LJL143 y MVA-LJM17 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna subunidad de Polipéptido LJL143 y polipéptido LJM17.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores vCP2390 o vCP'2390-??. IDEN . SEC.:6 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de plásmidos pVR2001 LJM17 ó pNBO002.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores vCP2389 ó VCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de plásmidos pVR2001 LJL143 ó pNBO003.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores vCP2389 y vCP2390 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de plásmidos pVR2001 LJL143 y pVR2001 LJM17.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores VCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y vCP2390-NO. IDENT. SEC.:6 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna pNBO003 y pNBO002 con base de plásmidos .

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo úna primo administración de una vacuna con base de vectores MVA-LJM17 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de plásmidos pVR2001 LJM17 ó pNBO002.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores V7A-LJL143 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de plásmidos pVR2001 LJL143 ó pNBO003.

En otra realización, el régimen de primo administración de refuerzos comprende como mínimo una primo administración de una vacuna con base de vectores MVA-LJL143 y MV7A-LJM17 y como mínimo la administración de un refuerzo de una vacuna con base de plásmidos pNBO003 y pNBO002.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un equipo para la primo vacunación de refuerzo de conformidad con la presente invención. El equipo puede comprender como mínimo dos viales:, un primer vial que contiene una vacuna para la primo vacunación de conformidad con la presente invención y un segundo vial que contiene una vacuna para la vacunación de refuerzo de conformidad con la presente invención. El equipo puede contener de manera ventajosa el primer o segundo vial adicional para primo-vacunaciones adicionales o vacunaciones de refuerzo adicionales.

En una realización, el equipo puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna con base de plásmidos para la primo vacunación de conformidad con la presente invención, el otro vial que contiene una vacuna viral con base en vector recombinante para la vacunación de refuerzo de conformidad con la presente invención.

En otra realización, el equipo puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna viral con base en vector recombinante para la primo vacunación de conformidad con la presente invención, el otro vial que contiene una vacuna subunidad para la vacunación de refuerzo de conformidad con la presente invención.

En otra realización, el equipo puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna viral con base en vector recombinante para la primo vacunación de conformidad con la presente invención, el otro vial que contiene una vacuna con base de plásmidos para la vacunación de refuerzo de conformidad con la presente invención.

Se revela en este documento que los individuos que experimentan una conversión de respuesta DTH anti-Leishmaniasis DTH tienen también un incremento en anticuerpos contra la proteina salival de Lu. longipalpis. Asi, la presencia o ausencia de anticuerpos a la proteina salival de Lu. longipalpis puede usarse para determinar si un individuo tiene una infección por Leishmaniasis .

En este documento se revela un método para el diagnóstico de la infección por Leishmaniasis mediante la detección de la presencia de anticuerpos que específicamente se unen a uno o más polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC. : 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, '29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87 ó un polipéptido que tiene como mínimo 80%, como mínimo 90%, como mínimo 95% ó como mínimo 99% homólogo a uno de estos polipéptidos, una variante conservadora, un homologo o un fragmento inmunogénico de uno de estos polipéptidos. El método puede utilizar un solo Polipéptido de Lu. longipalpis o una combinación de estos polipéptidos. En ciertos ejemplos, el método de diagnóstico detecta anticuerpos que específicamente se unen como mínimo 3, 6 ó 10 de estos polipéptidos ó fragmento inmunogénicos de los mismos.

En una realización, pueden haber uno o más- polipéptido de Lu. longipalpis unido a un sustrato sólido. Por ejemplo, el polipéptido Lu. longipalpis que tiene una secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ó 87 puede estar unido al sustrato. Uno o más de estos, polipéptidos puede estar unido al sustrato, por ejemplo como mínimo 3, 6 ó 10 de estos polipéptidos ó un fragmento inmunogénico del mismo. En un ejemplo, uno o más polipéptidos que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 25, 33, 39, 47 ó 77 puede estar unido al sustrato. En otro ejemplo, uno o más polipéptidos de Lu. longipalpis que tiene una secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17 ó 57 pueden estar unidos al sustrato. En un ejemplo específico no limitativo, como mínimo seis Polipéptido de Lu. longipalpis están unidos a un sustrato sólido, donde cada uno de los polipéptidos comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 25, NO. IDENT. SEC: 1 (o 3 ó 11 ó 13), NO. IDENT. SEC: 5 (o 7 ó 15 ó 17), NO. IDENT. SEC: 47, NO. IDENT. SEC: 73 ó NO. IDENT. SEC: 77 ó un fragmento inmunogénico del mismo. En otro ejemplo especifico no limitativo, como mínimo tres Polipéptido de Lu. longipalpis se unen a un sustrato sólido, donde cada uno de los polipéptidos comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 1 (or 3 ó 11 ó 13), NO. IDENT. SEC: 5 (or 7 ó 15 ó 17) ó NO. IDENT. SEC: 57 ó un fragmento inmunogénico del mismo .

En una realización, dos o más (por ejemplo como mínimo. 3, 6 ó 10) Polipéptido de Lu. longipalpis (o fragmentos inmunogénicos del mismo) se aplican a un sustrato sólido, por ejemplo, como una serie de "puntos," como por ejemplo en una prueba "dot blot". En otra realización, se aplican dos o más polipéptidos de Lu. longipalpis a un sustrato como por ejemplo en un arreglo lineal. En una realización adicional, se aplican los polipéptidos de Lu. longipalpis a una membrana en un arreglo de dos dimensiones. De esta manera, se evalúa la presencia de anticuerpos a más de un polipéptido de Lu. longipalpis. Cada polipéptido de Lu. longipalpis puede aplicarse directamente a la superficie de una membrana en una sola ubicación o en una combinación de ubicaciones.

El sustrato sólido puede ser una gota de poliestireno, una membrana, una lámina o un plato. Puede utilizarse un sustrato plástico o de vidrio. En otras realizaciones, se utiliza una membrana compuesta por materiales porosos como por ejemplo nilón, nitrocelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio y otros polímeros porosos. La superficie de un apoyo sólido puede ser activada por procesos químicos que ocasionan la unión covalente del polipéptido al apoyo. Sin embargo, puede usarse cualquier otro método adecuado para inmovilizar un polipéptido en un soporte solido incluido, no taxativamente, interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas, interacciones covalentes y otras semejantes. Una vez que el polipéptido se aplica al sustrato, el sustrato puede entrar en contacto con una sustancia, como por ejemplo, una solución que contiene proteína, la cual de manera no específica satura los sitios de unión en el mismo. Los ejemplos específicos no limitativos de una solución que contiene proteina incluye una solución preparada a partir de leche o albúmina sérica pulverizada, como por ejemplo albúmina de suero bovino..

Seguidamente se agrega un espécimen (por ejemplo, suero, sangre, plasma, orina, semen, saliva, esputo, fluido lagrimal, fluido linfático) al sustrato y el espécimen y el sustrato combinados se incuban durante un tiempo suficiente para permitir uniones específicas. Se detectan seguidamente uniones específicas de anticuerpos al polipéptido Lu. longipalpis revelado en este documento, con ayuda de cualquier medio conocido para la persona capacitada en la tecnología. En una realización, se usa un anticuerpo secundario marcado para detectar los anticuerpos que específicamente se unen al polipéptido Lu. longipalpis. La marca puede ser una marca radiactiva (por ejemplo, 1251), una marca enzimática (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante) ó una marca fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceina) . Los sistemas de detección para estas marcas son conocidas para las personas capacitadas en la tecnología. Las uniones del espécimen ó un componente del espécimen, al polipéptido Lu. longipalpis, según lo indica la presencia del marcador, indica una infección por Leishmaniasis .

En otra realización, el espécimen es absorbido en un sustrato sólido que contiene sitios de unión para polipéptidos, como por ejemplo moléculas de anticuerpo. En una realización, el sustrato sólido es una gota de poliestireno, una lámina, una membrana o una placa. El sustrato a partir de ese momento entra en contacto con una substancia, como por ejemplo una solución que contiene proteína que satura de manera no específica los sitios de unión. Seguidamente se lava el sustrato con una solución reguladora. Se agrega una solución de uno o más Polipéptido de Lu. longipalpis a los especímenes unidos. En una realización, el polipéptido Lu. longipalpis es marcado directamente. El marcado del polipéptido Lu. longipalpis puede ser realizarse con ayuda de cualquier marcador, como por ejemplo por incorporación de un isótopo radioactivo o un grupo o por acoplamiento de este componente a una enzima, un material de coloración, por ejemplo una parte de molécula cromofórica o un grupo fluorescente. Las enzimas a usar son aquellas que pueden determinarse de manera colorimétrica, espectrofotométrica o fluorimétrica . Entre los ejemplos no limitativos de enzimas a usar en la presente invención se incluyen enzimas del grupo de oxidoreductasas, como por ejemplo catalasa, peroxidasa, glucosa oxidasa, beta-glucuronidasa, beta-D-glucosidasa, beta-D-galactosidasa, ureasa y galactosa oxidasa. Después de incubar el polipéptido marcado de Lu. longipalpis con el sustrato sólido, se retira por lavado cualquier polipéptido marcado de Lu. longipalpis que haya quedado sin unión. Se detecta entonces el polipéptido de Lu. longipalpis unido y marcado en una prueba apropiada. Las uniones del polipéptido marcado de Lu. longipalpis al espécimen ó al componente del espécimen, son indicativas de una infección con Leishmaniasis .

En general, los pasos de incubación utilizados para realizar los procedimientos pueden realizarse de manera conocida, como por ejemplo mediante la incubación a temperaturas entre aproximadamente 4° C y aproximadamente 25° C, durante aproximadamente 30 minutes hasta aproximadamente 48 horas. Las lavaduras pueden ser incluidas con una solución acuosa como por ejemplo una solución reguladora, donde la solución reguladora es desde aproximadamente pH 6 hasta aproximadamente pH 8, como por ejemplo mediante el uso de una solución isotónica de suero fisiológico de un pH de aproximadamente 7.

También son útiles las pruebas de uniones competitivas para detectar la infección con Leishmaniasis . La persona capacitada en la tecnología, una vez cuente con el polipéptido Lu. longipalpis revelado en este documento, podrá diseñar fácilmente pruebas adicionales, como por ejemplo, pruebas de uniones competitivas, útiles para la detección de la infección por Leishmaniasis.

En otra realización, el polipéptido Lu. longipalpis revelado en este documento puede ser incluido en un equipo de pruebas de diagnostico. Por ejemplo, un equipo de pruebas de diagnostico para detectar una infección por Leishmaniasis incluye un sustrato sólido al cual se ha aplicado uno o más polipéptidos de Lu. longipalpis revelados en este documento. En otras realizaciones, el equipo incluye instrucciones escritas y/o un recipiente con una cantidad especificada de anticuerpos marcados a inmunoglobulinas, como por ejemplo anticuerpos secundarios marcados IgG ó IgM que se unen a anticuerpos de unas especies de interés. Por ejemplo, se pueden proporcionar anticuerpos marcados que específicamente detectan inmunoglobulinas de perro o del ser humano. Los anticuerpos marcados pueden estar marcados de manera fluorescente, enzimática o radiactiva. Los anticuerpos marcados usados en los equipos de prueba descritos anteriormente pueden ser empaquetados o bien en forma de solución o en forma liofilizada adecuada para su reconstitución .

En otra realización el equipo de prueba incluye una cantidad "especificada de uno o más polipéptidos de Lu. longipalpis descritos en este documento en un contenedor e instrucciones escritas. En un ejemplo, el polipéptido Lu. longipalpis se marca directamente. En otro ejemplo, el uno o más polipéptidos de Lu. longipalpis carecen de marca. Si el polipéptido Lu. longipalpis carece de marca, puede incluirse además un recipiente con un reagente de detección que se una específicamente al polipéptido Lu. longipalpis, como por ejemplo, un anticuerpo monoclonal marcado. El equipo puede incluir opcionalmente un sustrato sólido para unirse al espécimen .

El proceso descrito anteriormente y el equipo de prueba para la detección de anticuerpos al polipéptido Lu. longipalpis revelados en el presente documento pueden utilizarse en numerosas aplicaciones, incluidas, no taxativamente, la detección de la infección por Leishmaniasis en un individuo que usa los métodos revelados en este documento. Las pruebas y equipos revelados en el presente documento pueden usarse para detectar la eficacia de un tratamiento terapéutico en un individuo. En otra realización adicional, las pruebas y equipos revelados en el presente documento también pueden usarse para evaluar una infección primaria de Leishmaniasis o para predecir la recuperación de la infección por Leishmaniasis tomando un fluido corporal de un individuo infectado, por ejemplo, a diversas horas posteriores a la infección, y aplicando los procedimientos de detección descritos anteriormente .

*** A continuación se describe la invención mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Sin elaboración adicional, se cree que la persona capacitada en la tecnología puede, con ayuda de las descripciones anteriores, practicar la presente invención en su máxima extensión. Los siguientes ejemplos detallados deben interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos de la revelación precedente de manera alguna. Las personas capacitadas en la tecnología reconocerán oportunamente las variaciones apropiadas de los procedimientos tanto en lo relacionado con los reactivos como con las condiciones y técnicas.

La construcción de inserciones de ADN, plásmidos y vectores virales recombinantes se realizó con ayuda de técnicas de biología molecular convencionales descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) . Todos los fragmentos de restricción usados para la presente invención fueron aislados con el equipo "Geneclean" (BIO 101 Inc., La Jolla, Calif.).

EJEMPLO 1: Construcción del plasmido pVR2001 LJM17 que expresa el polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17 El polinucleótido que codifica el polipéptido de Lu. longipalpis LJM17 es sintetizado y posee la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC: 8 la cual contiene un extremo ("cola") poli (A) . El fragmento LJM17 es amplificado por PCR y clonado en el sitio de clonación TOPO del plásmido del donante pVR2001-TOPA (también denominado pVR2001-TOPO) .

El plásmido obtenido, pVR2001 LJM17 en consecuencia contiene y expresa un nucleótido que codifica un promotor capaz de activar la expresión en una célula de mamífero, un péptido líder para facilitar la secreción/liberación de una secuencia de proteína procariota a partir de una célula de mamífero, LJM17, topoisomerasas que flanquean el ADN que codifica LJM17, así como una secuencia de terminación.

La secuencia de ácido nucleico de una hebra del plásmido pVR2001 LJM17 es descrita en NO. IDENT. SEC: 9 y en La Figura 1, donde los sitios de BamHI están en las posiciones [4-9] y [5051-5056], la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de la señal tPA está en la posición [4976-5062] y la secuencia de nucleótidos que codifica LJM17 está en la posición [5063-6247].

EJEMPLO 2: Construcción del plásmido pVR2001 LJL143 que expresa el polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143 El polinucleótido .que codifica el polipéptido de Lu. longipalpis LJL143 es sintetizado y posee la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC: 4 la cual contiene extremo ("cola") poli (A) . El fragmento LJL143 es amplificado por PCR y clonado en el sitio de clonación TOPO del plásmido pVR2001-TOP según se describe en el ejemplo 1, para generar el plásmido pVR2001 LJL143.

La secuencia de ácido nucleico de una hebra del plásmido pVR2001 LJL143 es descrita en NO. IDENT. SEC: 10 y en La Figura 2, donde los sitios BamHI están en las posiciones [4-9] y [5051-5056], la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de la señal tPA está en la posición [4976-5062] y la secuencia de nucleótidos que codifica LJL143 está en la posición [5063-5899] .

EJEMPLO 3: Construcción de un Vector del virus de la viruela del canario ALVAC que expresa el Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17 Para consultar la discusión y los ejemplos del plásmido pALVAC y el locus C3, véase por ejemplo, las patentes estadounidenses No. 5,756,103; 5,833,975; y 6,780,407. La secuencia del promotor del virus de vacuna H6 ha sido descrita con anterioridad (véase por ejemplo, Taylor et al.; Taylor et al . ; Guo et al . ) .

El polinucleótido que codifica el Polipéptido de Lu. longipalpis LJM17 es sintetizado y posee la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC.:6. Este polinucleótido se liga seguidamente al plásmido del donante pALVAC C3 H6p mediante lo cual se obtiene pALVAC C3 H6p-LJM17 que contiene 5737 pares de base (Figura 3).

Para generar VCP2390-NO. IDENT. SEC.:6, se lineariza el plásmido pALVAC C3 H6p-LJM17 con la enzima de restricción Notl. Los fragmentos linearizados se transfectaron individualmente en células CEF primarias infectadas con ALVAC con ayuda del método de precipitación de fosfato de calcio (véase, Panicali et al.; Piccini et al.). Después de 24h, las células transfectadas son cosechadas, sonicadas y usadas para el tamizado del vector recombinante .

Se tamizan las placas recombinantes con base en el método de hibridización de levantamiento de placa con una sonda especifica de Lu. longipalpis LJM17 la cual se marca con peroxidasa de rábano picante de conformidad con el protocolo del fabricante (Amersham Cat# RPN-3001) . Después de tres rondas secuenciales de purificación de placas, los recombinantes se generan mediante confirmación de hibridización como 100% positivos para la inserción de Lu. longipalpis LJ 17 y 100% negativa para C3 ORF.

Se selecciona una sola placa de la tercera ronda de purificación de placas y se expande hasta obtener compuestos madres Pl (60 mm) , P2 (matraces T75) y P3 (botellas de cultivo rotatorias) para amplificar vCP2390-NO. IDENT. SEC.:6. El fluido de cultivo de las células infectadas de las botellas de cultivo rotatorias se cosecha y concentra para producir el compuesto madre del virus.

Se realiza la secuencia del constructo para confirmar las secuencias de la inserción de Lutzomyia longipalpis LJM17 y los brazos izquierdo y derecho de C3 alrededor de la inserción de Lutzomyia longipalpis LJ 17 en vCP2390-NO. IDENT. SEC.:6.

EJEMPLO 4 : Construcción de un Vector del virus de la viruela del canario ALVAC que expresa el Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143 El polinucleótido. que codifica el Polipéptido de Lu. longipalpis LJL143 es sintetizado y posee la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC.:2. Esta secuencia se liga seguidamente a un plásmido donante de pALVAC C3 H6p. . El plásmido obtenido, pALVAC C3 H6p-LJL143 comprende 5400 pares de base (La Figura 5) , y se realiza la secuencia para confirmar la secuencia de ácido nucleico (NO. IDENT. SEC. : 2) del gen LJL143.

Para generar vCP2389-NO. IDENT. SEC.:2, se lineariza el plásmido pALVAC C3 H6p-LJL143 con la enzima de restricción Notl. Los fragmentos linearizados se transfectan de manera individual a células CEF primarias infectadas con ALVAC con ayuda del método de precipitación de fosfato de calcio (véase, Panicali et al.; Piccini et al.). Después de 24h, las células transfectadas son cosechadas, sonicadas y usadas para el tamizado del vector recombinante .

Se tamizan las placas recombinantes con base en el método de hibridización por levantamiento de placa con el uso de una sonda especifica de Lu. longipalpis LJL143 la cual se marca con peroxidasa de rábano picante de conformidad con el protocolo del fabricante (Amersham Cat# RPN-3001) . Después tres rondas secuenciales de purificación de placas, se generan los recombinantes mediante confirmación de hibridización como 100% positiva para la inserción de Lu. longipalpis LJL143 y 100% negativa para C3 ORF.

Se selecciona una placa sencilla de la tercera ronda de purificación de placas y se expande para obtener compuestos madres Pl (60 mm) , P2 (T75 matraces), P3 (botellas de cultivo rotatorias) para amplificar VCP2389-NO. IDENT. SEC.:2. El fluido del cultivo de las células infectadas de las botellas de cultivo rotatorias es cosechado y concentrado para producir compuesto madre del virus.

Se hacen secuencias del constructo para confirmar las secuencias de la inserción de Lutzomyia longipalpis LJL143 y el brazo izquierdo y derecho de C3 alrededor de la inserción de Lutzomyia LJL143 en vCP2389-NO. IDENT. SEC.:2.

EJEMPLO 5 : Construcción, de un vector MVA que expresa el polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17 MVA es una cepa Ankara modificada obtenida después de pasar más de 570 veces la cepa de vacuna Ankaruna en fibroblastos de embriones de pollo (ver Stickl & Hochstein-Mintzel; Sutter et al.) disponible como ATCC VR-1508. Su adaptación a estas células causaron la escisión de 6 regiones las cuales no son esenciales para su desarrollo y su ciclo infeccioso en este tipo de células (desaparición de aproximadamente 15% del genoma viral; Meyer et al.). Es posible introducir material genético exógeno en cualquiera de estas regiones. En el contexto de la presente invención, se introduce material genético extraño en las escisiones II y III las cuales se ubican con los fragmentos de restricción HindIII N y A respectivamente (AÍtenburger et al.).

El diseño del virus MVA recombinante que expresa LJM17 se realiza según se describe previamente en Staib C. et al., con excepción de que el fragmento de ADN de 723 pares de base que contiene gfp ORF es reemplazado por el fragmento de ADN de 1239 pares de base ADN que codifica el antigeno LJM17 (NO. IDENT. SEC: 6), lo cual genera MVA-LJM17.

EJEMPLO 6: Construcción de a MVA vector que expresa el Polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143 La construcción del virus MVA recombinante que expresa LJL143 se realiza según se describe previamente en Staib C. et al., con excepción de que el fragmento de ADN que contiene 723 pares de base que contiene gfp ORF es reemplazado por el fragmento de ADN de 906 pares de base que codifica el añtigeno LJL143 (NO. IDENT. SEC: 2), lo cual genera MVA-LJL143.

EJEMPLO 7 : Expresión de la proteina salival de Lu . longipalpis in vi ro Los plásmidos de expresión que contienen antigenos salivales de Lu. longipalpis marcados con His codificados por cDNA derivados de los plásmidos pVR2001 LJM17 (ver ejemplo 1) y pVR2001 LJL143 (ver ejemplo 2) se construyen y transfectan en células HE -293F. Los sobrenadantes recogidos a las 72 h son analizados por Cromatografía HPLC con el uso de columna de níquel y gradiente de imidazole. Las fracciones de HPLC positivas para la proteína salival recombinante con motivo His 6x en su terminal C se prueban con suero policlonal de ratón previamente inmunizado con los correspondientes plásmidos cDNUn originales. Las proteínas recombinantes se prueban mediante SDS-PAGE y Western blotting ( "inmunoblot" ) , alícuotas en PBS y se almacenan a -70° C.

La vacuna subunidad que comprende LJM17 se denomina en este documento rLJMl7. La vacuna se prepara mediante la combinación de 100 µg de proteína recombinante purificada LJM17 con 300 µg del adyuvante CpG #2142 en 20% Emulsigen® (laboratorios MVP) (para CpG #2142, ver SEQ. ID. NO: 890 en EP-Bl-1, 221, 955) .

La vacuna subunidad que comprende LJL143 se denomina en este documento as rLJL143. La vacuna se prepara mediante la combinación 100 pg de proteína recombinante purificada LJL143 con 300 pg del adyuvante CpG #2142 in 20% Emulsigen®. EJEMPLO 8 : Vacunación de perros contra la Leishmaniasis Se dividen al azar 25 perros (beagles hembra de 1-2 años) en 5 grupos de 5 perros cada uno. Todos los perros de los grupos 1 a 4 se vacunan en DO (VI) por ruta intradérraica (ID) en el pabellón de la oreja con una jeringa y una. aguja con 500 µg de plásmido purificado pVR2001 LJM17 (ejemplo 1) la expresión LJM17 (grupos 1 y 2) o plásmido pVR2001 LJL143 (ejemplo 2) que expresan LJL143 (grupos 3 y 4).

Los perros del grupo 1 y grupo 3 se refuerzan en D14 (V2) y D28 (V3) con 500 pg de los mismos plásmidos usados para VI por ruta transdérmica (TD) en la parte superior interna de ambas patas traseras con el dispositivo de distribución sin agujas VetJetTM (Merial) . Los perros del grupo 1 y grupo 3 recibieron un refuerzo adicional en D42 (V4) con 500 \ig de los mismos plásmidos por la ruta intramuscular acoplado con electroporación (ET/IM) en el lado externo de ambos muslos con el uso del dispositivo y tecnología Sphergén (parámetros: 88V, Tl=20, T2=80, N=10) .

Los perros de los grupos 2 y 4 se refuerzan en D14 (V2) y D28 (V3) con 500 \ig de los mismos plásmidos usados para VI por la ruta IM acoplado con electroporación (ET/IM) según se describe anteriormente. Los perros de los grupos 2 y 4 reciben refuerzo adicional en D42 (V4) por la ruta ID en el pabellón de la oreja según se describe anteriormente con vacunas subunidad (ver ejemplo 7) rLJM17 (grupo 2) o rLJL143 (grupo 4), respectivamente .

Todos los perros de los grupos 1 y 2 reciben un refuerzo de vacuna final en D192 (V5) por la via IM en los cuádriceps izquierdos con 108 pfu de un virus recombinante de la viruela del canario VCP2390 (ejemplo 3) la expresión LJM17. Todos los perros de los grupos 3 y 4 reciben un refuerzo de vacuna final en D192 (V5) por la via IM en los cuádriceps izquierdos con 108 pfu de un virus recombinante de la viruela del canario vCP2389 (ejemplo 4) que expresa LJL143.

Los perros del grupo 5 son vacunados con 500 µq del plásmido parental purificado pVR2001 el cual no expresa antigeno a DO por ID, D14 por TD, D28 por TD y D42 por ET/IM y recibe un refuerzo final en D192 por la via IM con 108 pfu de un virus control recombinante de viruela del canario (PurevaxTM) .

EJEMPLO 9: Construcción del plásmido pNBO002 que expresa el polipéptido salival de Lu. longipalpis LJM17 Se sintetizó la secuencia de ácido nucleico que codifica el Polipéptido de Lu. longipalpis LJM17 y posee la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC: 18 la cual contiene un extremo ("cola") poli (A) . El fragmento fue amplificado por PCR y clonado en el sitio de clonación TOPO del plásmido donante pVR2001-TOPA según se describe en el ejemplo 1, para generar el plásmido pNBO00.2.

La secuencia de ácido nucleico de una hebra del plásmido pNBO002 es descrita en NO. IDENT. SEC: 19 y en La Figura 11, donde Los sitios BamHI están en las posiciones [1819-1824] y [3019-3024] , la secuencia de nucleotidos que codifica el péptido de la señal tPA está en la posición [1744-1830] y la secuencia de nucleotidos que codifica LJM17 está en la posición [1831-3015]. El mapa del plásmido pNBO002 aparece en La Figura 12. pNBO002 es análogo de pVR2001 LJM17. En este caso, este cpnstructo y el constructo del ejemplo 1 son identificables por la secuencia de ácido nucleico de sus inserciones, NO. IDENT. SEC: 18 y NO. IDENT. SEC: 8, respectivamente.

EJEMPLO 10: Construcción del plásmido pNBO003 que expresa el polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL1 3 La secuencia de ácido nucleico que codifica Lu. longipalpis LJL143 fue sintetizado y posee la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC: 14, la cual contiene extremo ("cola") poli (A) . EL fragmento LJL143 fue amplificado por PCR y clonado en el sitio de clonación TOPO del plásmido pVR2001- TOPUn, según se describe en el ejemplo 1, para generar el plásmido pNBO003.

La secuencia de ácido nucleico de una hebra del plásmido pNBO003 es descrita en NO. IDENT. SEC: 20 y en La Figura 13, donde Los sitios BamHI están en las posiciones [1819-1824] y [2671-2676] , la secuencia de nucleotidos que codifica el péptido de la señal tPA está en la posición [1744-1830] y la secuencia de nucleótidos que codifica LJL143 está en la posición [1831-2667] . El mapa del plásmido pNBO003 aparece en la Figura 14. pNBO003 es análogo de pVR2001 LJL143. En este caso, este constructo y el constructo del ejemplo 2 son identificables por la' secuencia de ácido nucleico de sus inserciones, NO. IDENT. SEC: 14 y NO. IDENT. SEC: 4, respectivamente.

EJEMPLO 11: Construcción de un vector del virus de la viruela del canario ALVAC que expresa el Polipóptido salival de Lu. longipalpis LJM17 Para la discusión y ejemplos del plásmido pALVAC y el locus C3, véase por ejemplo, las patentes estadounidenses No. 5,756,103; 5,833,975; y 6,780,407. La secuencia del promotor del virus de vacuna H6 ha sido descrita con anterioridad (véase por ejemplo, Taylor et al.; Taylor et al.; Guo et al.).

Se sintetizó la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de Lu. longipalpis LJM17 y posee la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC: 6. Esta secuencia fue objeto de optimización de codones para la expresión en mamíferos por Geneart GmbH (Regensburg, Germany) , mediante lo cual se obtuvo la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC: 91, la cual codifica el polipéptido LJM15 (NO. IDENT. SEC:5).

Esta secuencia con optimización de codones fue seguidamente ligada al plásmido donante de pALVAC C3 H6p para generar pALVAC C3 H6p-LJM17 que contiene 5737 pares de base (La Figura 3) . Con el plásmido obtenido, pALVAC C3 H6p-LJM17, se hizo la secuencia y la confirmación para contener la secuencia de ácido nucleico (NO. IDENT. SEC.:91) of the LJM17 gene.

Para generar VCP2390, el pALVAC C3 H6p-LJ 17 se linearizó el plásmido con la enzima de restricción Notl. Los fragmentos linearizados fueron transfectados individualmente en células CEF primarias infectadas con ALVAC con ayuda del método de precipitación de fosfato de calcio descrito previamente (Panicali et al.; Piccini et al.). Después de 24h, las células transfectadas fueron cosechadas, sonicadas y usadas para el tamizado del vector recombinante .

Se tamizaron de las placas recombinantes con base en el método de hibridización por levantamiento de placa con el uso de una sonda específica de Lu. longipalpis LJM17 la cual se marcó con peroxidasa de rábano picante de conformidad con el protocolo del fabricante (Amersham Cat# RPN-3001) . Después tres rondas secuenciales de purificación de placas, se generaron los recombinantes y se confirmaron mediante hibridización como 100% positive para la inserción de LJM17 sintético y 100% negativo para C3 ORF.

Se seleccionó una sola placa de la tercera ronda de purificación de placas y se expandió para obtener compuestos madre Pl (60 mm) , P2 (T75 matraces), P3 (botellas de cultivo rotatorias) para amplificar vCP2390. El fluido del cultivo de las células infectadas de las botellas de cultivo rotatorias fue cosechado y concentrado para producir compuesto madre del virus.

Se realizó la secuencia del constructo para confirmar las secuencias del inserción LJM17 de codones optimizados y el brazo izquierdo y derecho C3 alrededor del inserción LJM17 de codones optimizados en vCP2390.

El vector vCP2390 se ilustra en La Figura 4. La secuencia de ácido nucleicos para ambas cepas vCP2390 se describe en La Figura .

EJEMPLO 12: Construcción da un vector del virus de la viruela del canario ALVAC que expresa el polipéptido salival de Lu. longipalpis LJL143 La secuencia de ácido nucleico que codifica Lu. longipalpis LJL143 fue sintetizada y posee la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC.:2. Esta secuencia con optimización de codones para la expresión en mamíferos por Geneart GmbH (Regensburg, Germany) , llevó a la secuencia descrita en NO. IDENT. SEC.:22, la cual codifica la proteína LJL143 (NO. IDENT. SEC. :1) .

Esta secuencia con optimización de codones fue seguidamente ligada al plásmido donante de pALVAC C3 H6p mediante lo cual se obtuvo pALVAC C3 H6p-LJL143 que contiene 5400 pares de base (Figura 5), se realizó la secuencia y se confirmó que contenía la secuencia de ácido nucleico (NO. IDENT. SEC.:22) del gen LJL143.

Para generar vCP2389, el plásmido pALVAC C3 H6p-LJL143 se linearizó el plásmido con la enzima de restricción Notl. Los fragmentos linearizados fueron' transíectados individualmente en células CEF primarias infectadas con ALVAC con ayuda del método de precipitación de fosfato de calcio (ver, Panicali et al.; Piccini et al.). Después de 24h, las células transíectadas fueron cosechadas, sonicadas y usadas para el tamizado del vector recombinante .

Se tamizaron las placas recombinantes con base en el método de hibridización por levantamiento de placa que usa una sonda especifica de Lu. longipalpis LJL143 sintética especifica la cual fue marcada con peroxidasa de rábano picante de conformidad con el protocolo del fabricante (Amersham Cat# RPN- 3001) . Después de tres rondas secuenciales de purificación de placas, se generaron los recombinantes y se confirmaron mediante hibridización como 100% positivos para el inserción LJL143 sintético y 100% negativo para C3 ORF.

Se seleccionó una placa sencilla de la tercera ronda de purificación de placas y se expandió para obtener compuestos madre Pl (60 mm) , P2 (T75 matraces), P3 (botellas de cultivo • rotatorias) para amplificar vCP2389. El fluido del cultivo de las células infectadas de las botellas de cultivo rotatorias fue cosechado y concentrado para producir compuesto madre.

Después de la realización de las secuencias, los resultados mostraron que la secuencia del inserción LJL143 sintético y el brazo izquierdo y derecho C3 alrededor del inserción sintético LJL143 en VCP2389 eran correctos.

El vector vCP2389 se ilustra en la Figura 6.

EJEMPLO 13 : Expresión de proteina salival Lu . longipalpis in vitro Plásmidos de expresión que contienen antigenos salivales Lu. longipalpis marcados por His codificados por cDNA derivados de plásmidos pNBO002 (ver ejemplo 9) y pNBO003 (ver ejemplo 10) fueron construidos y transíectados en células HEK-293F. Se recogieron los sobrenadantes a las 72 h, se analizaron por cromatografía HPLC con columna de níquel y gradiente de imidazole. Las fracciones de HPLC positivas para la proteína salival recombinante con motivo His 6x en su término C fueron probadas con suero policlonal de ratón previamente inmunizado con los correspondientes plásmidos cDNUn originales. Las proteínas recombinantes fueron probadas por SDS-PAGE y Western blotting ( "inmunoblot" ) , alícuotas en PBS y almacenadas en -70 °C.

La vacuna subunidad que comprende LJM17 se denomina en este documento rLJM17. La vacuna se prepara mediante la combinación de 100 µg de proteína recombinante purificada LJM17 con 300 ]ig del adyuvante CpG #2142 en 20% Emulsigen® (laboratorios VP) (para CpG #2142, ver SEQ. ID. NO: 890 en EP 1, 221, 955) .

La vacuna subunidad que comprende LJL143 se denomina en este documento rLJL143. La vacuna se prepara mediante la combinación de 100 µ? de proteina recombinante purificada LJL143 con 300 iq del adyuvante CpG #2142 en 20% Emulsigen®.

EJEMPLO 14: Vacunación de perros contra la Leishmaniasis Se dividió al azar 25 perros (beagles hembra de 1-2 años de edad) en 5 grupos de 5 perros cada uno. Se vacunó a todos los perros de los grupos 1 al a DO (VI) por la ruta intradérmica (ID) en el pabellón de la oreja con una jeringa y una aguja con 500 'µ? de plásmido pNBO002 purificado (ejemplo 9) que expresa antigenos LJM17 (grupos 1 y 2) o plásmido pNBO003 (ejemplo 10) que expresa LJL143 (grupos 3 y 4), respectivamente .

Los perros del grupo 1 y grupo 3 recibieron refuerzo en D14 (V2) y D28 (V3) con 500 g de los mismos plásmidos usados para VI por la ruta transdérmica (TD) en la parte superior interna de ambas patas traseras con el dispositivo de distribución sin agujas VetJetTM (Merial) . Los perros del grupo 1 y grupo 3 recibieron otro refuerzo en D42 (V4) con 500 pg de los mismos plásmidos por la ruta intramuscular acoplado con electroporación (ET/I ) en el lado externo de ambos muslos con el dispositivo y la tecnología Sphergen (parámetros: 88V, Tl=20, T2=80, N=10) .

Los perros de los grupos 2 y 4 recibieron refuerzo D14 (V2) y D28 (V3) con 500 µq de los mismos plásmidos usados para VI por la vía IM acoplado con electroporación (ET/IM) según se describe anteriormente. Los perros de los grupos 2 y 4 recibieron otro refuerzo en D42 (V'4) por la ruta ID en el pabellón de la oreja según se describe anteriormente con vacunas subunidad (ver ejemplo 13) rLJM17 (grupo 2) o rLJLl43 (grupo 4), respectivamente.

Todos los perros de los grupos 1 y 2 recibieron un refuerzo de vacuna final en D192 (V5) por la via IM en los cuádriceps izquierdos con 108 pfu de un virus recombinante de la viruela del canario vCP2390 (ejemplo 11, que tienen NO. IDENT. SEC: 21 como inserción) que expresa LJM17. Todos los perros de los grupos 3 y 4 recibieron un refuerzo de vacuna final en D192 (V5) por la via IM en los cuádriceps izquierdos con 108 pfu de un virus recombinante de la viruela del canario VCP2389 (ejemplo 12, que tiene NO. IDENT. SEC: 22 como inserción) que expresa LJL143.

Los perros del grupo 5 fueron vacunados con 500 µg del plásmido parental purificado VR2001 el cual no expresa antigeno en DO por ID, D14 por TD, D28 por TD y D42 por ET/IM y recibió un refuerzo final a D192 por la via IM con 108 pfu de un virus control recombinante de viruela del canario (PurevaxTM) .

Quedó en evidencia la inmunidad humoral especifica y significativa tanto para LJM17 como LJL143 mediante ELISA en perros vacunados (ver Figura 7) . Se cubrieron placas de 96 pocilios (MaxisorpTM, Nunc) de un día para otro a 4o C con proteina rLJM17 (2 g/mL) o rLJL143 (2 pg/mL) . Se agregó suero de perro de manera sucesiva a las placas por triplicado a una dilución de 1/50 con IgG antiperro AffiniPure conejo conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch) a 1/5000 y p-nitrofenilfosfato (Sigma) . Se midió la absorbencia a 405 nm con un Spectramax Plus (Dispositivos moleculares) .

Los títulos de anticuerpo significativos persistieron hasta 6 meses después de la administración V4. EL reforzador · vCP (V5) recordó respuestas anticuerpo especificas en perros vacunados de manera eficiente. Las respuestas anamnésticas vCP establecieron la expresión de LJL143 y LJM17 a partir de vCP2389 y vCP2390 respectivamente y la capacidad de los vectores para reforzar las respuestas inmunes humorales in vivo .

PBMC de perros tomadas 2 semanas después de la administración V5 fueron estimulados por 2 pares de homogenato de glándula salival (SGH) , LJL143 (4 µ?) , y LJM17 (4 µ?) ó por ConA (4 µg) . PBMC no estimulados por el medio (med) sirvieron de control. Se evaluó la producción de IFN-gamma. mediante la medición de los niveles de secreción IFN-gamma en el medio a 72 horas (Quantikine ELISA; R&D Systems) .

Los resultados se ilustran en la Figura 8. La adición de las proteínas LJM17 o LJL143 purificadas recombinantes causaron que PBMCs de perros vacunados LJM17 o LJL143 incrementaran la secreción de IFN-gamma. No hubo evidencia de aumento de la secreción de IFN-gamma cuando PBMC estaban en presencia del medio control (med) .

La adición de ConA o SGH a PB Cs de perros vacunados LJM17 o LJL143 también causó una secreción incrementada de IFN-gamma. Particularmente, el antigeno LJM17 ocasionó fuertes respuestas INF-gamma en animales del grupo 2 (1800 pg/mL) y también causó una fuerte respuesta en animales del grupo 1 (200 pg/mL) . El antigeno LJL143 también causó respuestas INF-gamma sumamente fuertes en animales de los grupos 3 y 4, con más de 2000 pg/mL, lo cual era comparable a los resultados observados cuando PBMCs fueron estimulados por ConA.

Dos semanas después de la administración V5, PBMCs fueron aislados de los dos perros que habían sido vacunados con LJM17 y LJL143 . Las células T linfocitos autólogas (5.106 células) fueron estimuladas o bien con 25 µg de LJM17 recombinante, 25 ig de LJL143 recombinante ó 4 µg de ConA. Seguidamente se incubaron las células en presencia de macrófagos infectados por amastigotes de Leishmaniasis chagasi (infectados a una relación de 5:1). Los lipopolisacáridos (LPS) y células T no estimuladas (NT, sin tratamiento) sirvieron como controles. Se evaluaron las células para conocer su eficiencia de eliminación la cual se midió mediante una reducción significativa en el porcentaje de macrófagos infectados (Figura 9) .

Los linfocitos estimulados con LJM17 recombinante o LJL143 recombinante fueron tan citotóticos a los macrófagos como los linfocitos que había sido estimulados por el mitógeno no especifico ConA.

Los perros control vacunados LJL143 y LJ 17 recibieron un dispositivo de collar Velero. El dispositivo de collar Velero fue preparado mediante la disposición de veinte Lu. longipalpis hembra de 6 días de edad, no infectadas, en un dispositivo de Plexiglás de 10 mm de espesor, el cual contenia un tornillo firme y una malla de nilón por uno de sus lados de manera que las moscas de la arena estuvieran en capacidad de explorar a través de la malla. Se mantuvo el dispositivo a 25° C antes de la exposición para limitar la condensación y seguidamente se fijó firmemente a un collar Velero durante 10 minutos sobre el vientre afeitado de perros control vacunados LJL143 y LJM17. Los perros no tenían restricciones durante el tiempo de la exposición. Se tomaron biopsias mediante punciones dérmicas de 4 mm ó 6 mm (Acuderm) del vientre de perros anestesiados 48 horas después de s r atacados por moscas de la arena.

Se almacenaron las biopsias en formaldehído con solución reguladora neutra (10% formalina) y seguidamente se procesaron de manera rutinaria para marcar con hematoxilin/eosina (H & E) , Luna's, azul de Toluidina y procedimientos inmunohistoquímicos para marcadores CD3 y macrófago/monocito (Mac) . La Figura 10 proporciona los resultados inmunohistoquímicos de picaduras de la mosca de la arena. Se observó una infiltración celular inmune específica (puntos más oscuros en las fotos) en perros vacunados mientras que no se observó infiltración en los perros control.

EJEMPLO 15: La vacunación de perros con proteínas salivales LJL1 3 y LJM17 produce una respuesta protectora inmune que elimina los amastigotes de Leishmanxasis chagasi in vitro.

En este estudio, se probaron proteínas salivales de Lu. longipalpis para determinar si las mismas son inmunogénicas en los perros. Adicionalmente, se identificaron proteínas salivales Lu. longipalpis que pueden producir una respuesta inmunológica protectora celular y elimina la Leishmaniasis infantum en una prueba in vitro.

' Para identificar estos componentes salivales, se desarrolló una prueba in vivo inversa de alto rendimiento de análisis de antígenos con base en ADN. Este análisis identificó dos fuertes antígenos que inducen DTH entre las 35 proteínas más abundantes en las glándulas salivales de Lu. longipalpis. Estos datos fueron validados adicionalmente con las proteínas recombinantes, lo cual llevó a la confirmación de un potencial de inducción de DTH para las proteínas salivales Lu. longipalpis LJM17 (NO. IDENT. SEC.:5) y LJL143 (NO. IDENT. SEC.:1). Más aun, las células mononucleares de sangre periférica de los perros vacunados con LJL143 y LJM17 produjeron interferon (IFN)- ? luego de la estimulación con las proteínas salivales recombinantes y, más importante, la estimulación de estas células con las proteínas recombinantes llevó a la eliminación de Leishmaniasis infantum in vitro.

Estas moléculas representan en consecuencia fuertes candidatos a usar como vacuna para el control Leishmaniasis infantum en perros .

Materiales y Métodos Perros: Beagles hembra de 1-2 años de edad (Marshall Farms) alojadas en una planta animal de NIH, Bethesda, USA, con cumplimiento de las pautas para el cuidado animal y comité de usuarios. Eran animales bien alimentados sometidos a escrutinio constante en cuanto a problemas de salud, a cargo de un veterinario y que recibían todas las vacunas de rutina. No se administraron tratamientos ectoparasíticos durante los últimos cuatro meses antes de los experimentos con exposición a la mosca de la arena.

Moscas de la arena: Lutzomyia longipalpis, cepa Jacobina, criadas usando como alimento de las larvas una mezcla de heces de conejo fermentadas y alimento para conejos. Se ofreció a las moscas de la arena adultas un hisopo que contenía 20% sacarosa pero se les privó de azúcar 24 horas antes de los experimentos de exposición. Se usaron algunas hembras para la disección de glándulas salivales a 4-7 días después de la emergencia y se prepararon homogenatos de glándulas salivales (SGH) según se describe anteriormente.

Exposición a las picaduras de moscas de la arena: Se colocaron hembras de seis días de edad Lu. longipalpis en un dispositivo de Plexiglás de 10 mm de espesor. El dispositivo contenia un tornillo firme y una malla de nilón por uno de sus lados para que la mosca de la arena pudiera explorar a través del mismo. Se mantuvo el dispositivo a 25°C antes de su exposición para limitar la condensación y se unió firmemente con un collar Velero en el cuello afeitado de los perros durante 20 minutos. Los perros se mantuvieron sin restricciones durante el tiempo de exposición.

Prueba inversa del antígeno (RAS) : Los perros expuestos previamente a picaduras de la mosca de la arena estaban anestesiados y se les inyectó intradérmicamente con plásmidos ADN o las proteínas recombinantes. Se separaron los sitios de inyección 15mm entre sí. Para los plásmidos de ADN, se codificaron las moléculas y se reagruparon al azar para cada perro antes de su inyección en el vientre. Se descifró el código únicamente después de terminar, las pruebas de endurecimiento y eritema. Para ADN-RAS, se inyectaron 38 muestras en un volumen total de 40 pL, incluidos PBS, 1 par de Lu. longipalpis SGH diluido en PBS y 20 g de vector control y los 35 Plásmidos de ADN recombinantes, diluidos en PBS, que codifica proteínas salivales individuales de Lu. longipalpis. Para RAS de proteínas, se inyectaron 5 muestras por duplicado (40 incluidos PBS, 1 par de Lu. longipalpis SGH diluido en PBS, y 3 proteínas recombinantes salivales de Lu. longipalpis (300 ng) .' Se realizó la medición de endurecimiento y diámetros de eritema 48 horas después de la inyección intradérmica de las muestras .

Histología y PCR en tiempo real . en las biopsias por punción de la piel: se tomaron biopsias por punción de la piel de 4mm o 6mm (Acuderm) del cuello o el vientre de perros anestesiados y se dividió en dos mitades iguales. Una mitad se almacenó en formaldehido con solución reguladora neutra (10% formalina) procesada luego de manera rutinaria para marcar con hematoxilin/eosina, Luna' s, azul de Toludine y procedimientos inmunohistoquímicos para CD3 y marcadores macrófago/monocito . La otra mitad, almacenada en RNAlater (Sigma), se usó para la extracción de ARN (Agencourt® RNAdvanceTM Tissue, Beckman Coulter) . Se realizó la transcripción inversa de ARN (" Transcriptor first strand cDNA synthesis", Roche) y se usó en PCR en tiempo real con LightCycler 480 (Roche), conjunto de cebadores (concentración final 0.2µ?) y sondas de doble marca FAM/TAMRA para un total de 15 µ? por reacción por triplicado. Los cebadores y sondas para IL4, IL12, TGF-ß, IFN-? y GAPDH canino aparecen descritos previamente (Breathnach et al.). Las condiciones de amplificación, adquisición, análisis de curva de fusión y curva estándar se realizaron según se ha descrito previamente (Breathnach et al.). Se normalizaron los niveles de expresión del gen de interés hasta niveles de GAPDH endógeno para controlar la cantidad de ARN. cDNA recombinante: De una biblioteca de cDNA (ver arriba), se seleccionaron las 35 moléculas más abundantes de Glándulas salivales de Lu. longipalpis y se clonó su cDNA en el vector pVR2001-TOPO mediante técnicas de clonación estándar. Se prepararon los plásmidos con plásmido. exento de toxinas GenEluteTM Plasmid Megaprep (Sigma) , limpiado con agua ultrapura con Centricon® Plus-20 (Millipore) y elución con PBS. El control de calidad de los 35 plásmidos purificados incluyó mediciones de endotoxina, análisis de perfil de restricción y realización de secuencias. Los plásmidos salivales purificados de ADN se filtraron de manera estéril y se almacenaron a -70 °C.

Proteínas recombinantes : Se construyeron plásmidos de expresión que contienen antígenos salivales Lu. longipalpis marcados con His que codifica cDNA derivado de plásmidos de ADN salivales parentales, de acuerdo con la descripción (Oliveira et al.) y se transíectaron en células HEK-293F. Se recogieron los sobrenadantes a 72 h y sometieron a una Cromatografía HPLC con columna de níquel y gradiente de imidazóle. Se probaron fracciones de HPLC positivas para la proteína salival recombinante con motivo 6x His en su término C, con suero policlonal de ratón previamente inmunizado con los correspondientes plásmidos cDNUn originales. Se probaron las proteínas recombinantes mediante SDS-PAGE y Western blotting, ("inmunoblot") , se hicieron alícuotas en PBS y se almacenaron a -70 °C.

Virus recombinantes de la viruela del canario: Dos virus de la viruela del canario derivados de vectores ALVAC que expresan respectivamente los antigenos LJL143 (vCP2389) o LJM17 (vCP2390) fueron generados con métodos convencionales y validados mediante secuencias de ADN viral, RT-PCR en mRNA de células infectadas y Western blotting ("inmunoblot") de sobrenadantes de células infectadas. Se usó la vacuna PurevaxTM de moquillo del hurón (Merial) como control de las inyecciones del virus de la viruela del canario.

Inmunización de perros con vacunas salivales : Se dividió al azar 25 perros en 5 grupos de 5 perros cada uno. Se vacunó a todos los perros de los grupos 1 al 4 a DO (VI) por la ruta intradérmica (ID) en el pabellón de la oreja con una jeringa y una aguja con 500 g de plásmido purificado que expresa antigenos LJM17 (grupos 1 y 2) o LJL143 (grupos 3 y 4), respectivamente. Los perros del grupo 1 y grupo 3 recibieron refuerzo D14 (V2) y D28 (V3) con 500µ? de los mismos plásmidos usados para VI mediante ruta transdérmica (TD) en la parte superior interna de ambas patas traseras con el dispositivo de distribución sin agujas VetJetTM (Merial) . Los perros del grupo 1 y grupo 3 recibieron otro refuerzo en D42 (V4) con 500ug de los mismos plásmidos mediante ruta intramuscular (IM) acoplado con electroporación en el lado externo de ambos muslos con dispositivo y tecnología Sphergen (parámetros: 88V, Tl=20, T2=80, N=10) . Los perros de los grupos 2 y 4 recibieron refuerzo D14 (V2) y D28 (V3) con 500 g de los mismos plásmidos usados para VI por la vía IM acoplado con electroporacion según se describe anteriormente. Los perros de los grupos 2 y 4 recibieron otro refuerzo en D42 (V4) con lOO g de la anteriormente mencionada proteína recombinante purificada LJM17 (rLJM17) (grupo 2) o LJL143 (rLJL143) (grupo 4) en conjunto con 300 g CpG ODN in 20% Emulsigen® (laboratorios MVP) por la ruta ID en el pabellón de la oreja según se describe anteriormente. Todos los perros de los grupos 1 al 4 recibieron un refuerzo de vacuna final en D192 (V5) por la vía IM en los cuádriceps izquierdos con 108 pfu de un virus recombinante de la viruela del canario vCP2390 y vCP2389 que expresan respectivamente antígenos LJM17 (grupos 1 y 2) o LJL143 (grupos 3 y 4) . Se vacunó a los perros del grupo 5 en DO, D14, D28 y D42 con 500 g del plásmido parental purificado VR2001 que no expresa antígeno y recibió un refuerzo final en D192 por la vía IM con 108 pfu de un virus recombinante control de la viruela del canario (PurevaxTM) .

ELISA: Se cubrieron placas de 96 pocilios (MaxisorpTM, Nunc) de un día para otro a 4 °C con Lu. longipalpis SGH (5 pares/ml), rLJM17 proteína (2 g/mL) o rLJL143 (2 g/mL) . En forma sucesiva se agregó a las placas suero de perro por triplicado, a una dilución de 1/50, IgG antiperro dé conejo AffiniPure conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch) a 1/5000 y p-nitrofenilfosfato (Sigma) . Se midió 405nm absorbencia con Spectramax Plus (Molecular Devices). La producción de IFN-? en sobrenadantes celulares se midió después de 72 h (Quantikine ELISA; R&D Systems) después de la estimulación con SGH (1 o 2 pares), conA (4 µ?) , rLJM17 (2 o 10 yg) o rLJL143 (2 o 10 yg) .

Actividad Anti-Leishmaniasis : Se prepararon macrófagos caninos derivados de monocito de acuerdo con métodos convencionales . Se tomaron Células T autólogas (células 5x106) del cultivo después de 1 semana, se estimularon con Lu. longipalpis SGH (2 pares), conA (4 yg) , rLJ 17 (25 yg) o rLJL143 (25 yg) , y se regresaron nuevamente en presencia de macrófagos infectados con L. infantum infectados a una relación de 5 : 1. Se evaluó la actividad Anti-Leishmaniasis mediante los cambios en los porcentajes de las células infectadas y el número de amastigotes per macrófago después de examen microscópico de las preparaciones marcadas con Giemsa.

Las picaduras de las moscas de la arena Lutzomyia longipalpis inducen una fuerte hipersensibilidad del tipo retardada en los perros En modelos de roedores, la inmunidad celular caracterizada por una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada Thl (DTH) a las proteínas salivales de la mosca de la arena, protege a los animales de la Leishmaniasis cutánea y visceral. No existe información relacionada con la presencia y naturaleza de la inmunidad celular a la saliva de la mosca de la arena en los perros, los principales depósitos de Leishmaniasis visceral causada por Leishmaniasis infantum (chagasi) en Europa y América Latina. Asi, la cinética temprana de la inmunidad anti-saliva en los perros después de la exposición a picaduras de Lutzomyia longipalpis, se investigó el vector de Leishmaniasis infantum chagasi en América Latina. Siete de nueve beagles mostraron anticuerpos antisaliva específicos una semana después de la tercera exposición a las picaduras (FIG. 19A) . Excepto por un solo perro, estos mostraron una fuerte respuesta de anticuerpo IgG2 en ausencia de IgGl (FIG. 19A) . Un perro mostró una respuesta mixta de anticuerpo IgG2/IgGl. Para investigar si los perros expuestos a las picaduras de la mosca de la arena desarrollan una respuesta DTH, se midió el endurecimiento de la piel, en el sitio de la picadura hasta 96 horas después de cada exposición. Después de la segunda exposición a picaduras de la mosca de la arena, se observó un pequeño endurecimiento en los 7 perros que produjeron niveles significativos de anticuerpos IgG Lu. longipalpis anticuerpos (FIG. 19B) . Lo anterior se caracterizó por eritema localizado, hinchazón y eventualmente engrosamiento de la piel. La intensidad y duración del endurecimiento observado fue incrementado significativamente después de la tercera exposición para alcanzar hasta 96 horas después de las picaduras de moscas de la arena (FIG. 19B) . Este endurecimiento no fue observado después de la primera exposición en animales que nunca antes habían recibido tratamiento (FIG. 19B).. Los análisis histológicos del sitio de endurecimiento muestran una inflamación mínima caracterizada por linfocitos perivasculares dispersos y neutrófilos raros dentro de la dermis superficial 48 horas después de la primera y segunda exposición (FIG. 19C) . Se observó un incremento dramático en el infiltrado celular 48 horas después de la tercera exposición. Lo anterior se caracterizó por un engrosamiento prominente de la epidermis y la presencia de infiltrados multifocales de células inflamatorias que consiste en linfocitos, macrófagos y eosinófilos (FIG. 19D) . Con base en el ritmo de la reacción así como de la naturaleza del infiltrado, se concluyó que la saliva de la mosca de la arena induce una reacción de hipersensibilidad del tipo retardado en la piel de los perros después de exposiciones repetidas.

Proteínas salivales de Lutzomyia longipalpis que inducen DTH en perros Se investigó a las moléculas salivales de Lu. longipalpis las cuales son responsables de generar una respuesta DTH en los perros. Las transcripciones que codifican para las 35 proteínas segregadas más abundantes de las glándulas salivales de esta especie se identifican anteriormente. La identificación de candidatos capaces de inducir una respuesta inmune celular de un conjunto grande de antígenos en animales grandes como por ejemplo perros es prohibitiva en términos de costo y espacio. Para superar este obstáculo, se desarrolló un enfoque de prueba inversa de antígeno que consistía en exponer a un número mínimo de perros (cinco) a picaduras de moscas de la arena e inyección de cada animal con hasta 38 muestras (35 Plásmidos de ADN que codifican para proteínas salivales y tres controles) (FIG. 20A) . De los 35 plásmidos de ADN inyectados sólo 4 (LJM17, LJM11, LJL143 y LJL138) indujeron un eritema significativo en más de 3 perros, 48 horas después del desafío (FIG. 20B) y sólo 2 Plásmidos de ADN' (LJL143 y LJM17 ) produjeron un fuerte endurecimiento en 3 perros, 48 horas después del desafío (FIG. 20B) . La mayor parte de los plásmidos inyectados no produjeron un eritema o endurecimiento significativo (FIG. 20B) y la inyección de PBS y el control de vector vacío indujeron un eritema mínimo en el sitio de la inyección comparado con LJM17 y LJL143 (FIG. 20C) . La especificidad y reactividad de los Plásmidos de ADN inyectados aparece en la FIG. 20D. Con base en estos resultados se escogió a LJM17 y LJL143 para un análisis adicional. LJL143 y LJM17 indujeron la producción de citoquinas indicativas de ' un ambiente Thl en el sitio de la inyección, incluidos IL-12 y IFN-? (FIG. 20E) . Las secciones histológicas tomadas 48 horas después del desafío muestran que LJL143 y LJM17 reclutan linfocitos y macrófagos en el sitio de la inyección lo cual indica una clásica respuesta de hipersensibilidad del tipo retardada (DTH) (FIG. 20F) . Para validar la especificidad de este enfoque se preparó LJL143, LJM17 y LJM111 soluble y altamente purificado, entre otras proteínas recombinantes salivales (FIG. 21A) . Las proteínas recombinantes LJL143 y LJM17 reprodujeron la respuesta DTH observada después de la inyección de sus respectivos plásmidos de ADN (FIG. 21B y 21C) incluido el reclutamiento de linfocitos y macrófagos al ^ sitio de la inyección of inyección (FIG. 21D) .

Los perros inmunizados con LJL143 y LJM17 producen proteínas salivales especificas de IFN-? a recombinantes Se inmunizaron los perros (5 por grupo) con Plásmidos de ADN que codifican para LJL143, LJM17 o un plásmido de ADN control, un refuerzo primo con las correspondiente proteínas salivales recombinantes y una inmunización final con virus de la viruela del canario que expresan las respectivas proteínas salivales (Tabla 1) . Se estimuló PBMC de perros inmunizados con hasta 4 ug de su respectiva proteína recombinante, ConA y 1 par de homogenato de glándula salival (SGH) . Los perros vacunados con LJL143 produjeron niveles significativos de IFN-? cinco semanas posteriores a la cuarta vacunación y antes de la inyección de la viruela del canario (FIG. 22A) . Más importante, la proteína nativa LJL143 presente en 1 par de homogenato de glándula salival estuvo en capacidad de generar una respuesta semejante en perros vacunados con LJL143 (FIG. 22A) . Los perros vacunados con LJM17 produjeron niveles considerablemente más bajos de IFN-? en comparación con perros vacunados ' con LJL143 (FIG. 22A) . Se observó un perfil semejante dos. semanas después de la vacunación de la viruela del canario, donde PBMC de perros vacunados con LJL143 produjo IFN-? dos veces más alto en comparación con su estado previo a la viruela (FIG. 22B) .

Tabla 1 La vacunación con LJL143 y LJM17 genera una respuesta protectora inmune que elimina los amastigotes Leishmaniasis chagasi in vitro.

Los macrofagos infectados de PBMCs de dos perros vacunados con LJM17 y LJL143 eliminaron de manera eficiente los amastigotes de Leishmaniasis chagasi después de la adición de linfocitos autólogos estimulados con proteínas recombinantes LJM17 y LJL143 respectivamente (FIG. 23) . La eficiencia de la eliinación se midió mediante una reducción¦ significativa en el porcentaje de macrofagos infectados (FIG. 23A) así como en el número de amastigotes por macrofagos (FIG. 23B) . Este efecto de eliminación era comparable al observado después de agregar el mitógeno no específico ConA (FIG. 23) .

EJEMPLO 16: Producción de una respuesta inmunológica en perros Doce perros de aproximadamente tres años de edad con inmunidad natural contra Leishmaniasis fueron inyectados por medio de una ruta intradérmica (ID) en la espalda después que tienen, con 100 µ? de cada plásmido individual suspendido en 100 µ? de PBS . Se inyecta cada plásmido en un punto diferente. Los puntos se separan en como minimo 3 cm para evitar la interferencia entre respuestas DTH. El control negativa (100 µ? de solución reguladora) también se inocula por ruta ID.

La respuesta DTH se evalúa 72 horas después de la inyección mediante la medición del diámetro más grande del área de tumefacción de la piel. Los resultados se expresan como el valor medio del área de tumefacción para todos los perros y como un porcentaje de perros que tienen una respuesta DTH positiva. Una DTH positiva es un área de tumefacción de un diámetro superior o igual a 4 mm a 72 horas después de la inyección .

En un segundo estudio, se inmuniza a 10 perros que nunca recibieron tratamiento de 4 a 6 meses 'de edad mediante inyección ID en 10 puntos (100 µ? por punto) en la oreja derecha con ün conjunto de plásmidos que codifican un polipéptido de Lu. longipalpis, 100 µg por cada uno suspendido en 1000 µ? of PBS. El día 21, se inyecta a los perros en 10 puntos (100 µ? por punto) en la oreja izquierda y en 10 puntos (100 µ? por punto) en el vientre con un conjunto de plásmidos, 100 µg por cada uno suspendido en 2000 µ? de PBS. Se presenta el desafio a todos los perros el día 35 mediante inoculación por ruta ID en la espalda (después de afeitar), con 100 pg de cada plásmido individual suspendido en 100 µ? de PBS. Cada plásmido se inyecta en un punto diferente. Los puntos se separan en como mínimo 3 cm para evitar la interferencia. A modo de control negativo, se inocula intradérmicamente 100 µ? de solución reguladora. Se evalúa la respuesta DTH 72 horas después del desafío, mediante la medición del diámetro más largo del área de tumefacción de la piel. Los resultados se expresan como el valor medio del área de tumefacción para todos los perros y como un porcentaje de perros que tienen una respuesta DTH positive. Una DTH positiva es un área de tumefacción de diámetro superior o igual de 4 mm a 72 horas después de la inyección.

Los resultados de este estudio muestran que los plásmidos pueden inducir una inmunidad celular en perros después de la inyección, una inmunidad celular revelada por una respuesta DTH. La variación del nivel de respuesta DTH puede ser mediante la variación de la expresión de la inserción.

Resulta obvio que los detalles precisos de los métodos descritos pueden variarse o modificarse sin desviarse del alcance de la revelación descrita. Reivindicamos dichas modificaciones y variaciones que se ubican dentro del alcance y el espíritu de las reivindicaciones siguientes.

*? + Referencias 1. Adler and Theodor, Ann. Trop. Med. Parasitol . 20:109, 1926 2. Altenburger et al., 1989, Arch. Virol. 105, 15-27 3. Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410 4. Altschul et al., Nucí. Acids Res. 25, 3389-3402 5. Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396 6. Bairoch, Nucleic Acids Res. 19 (Suppl .): 2241, 1991 7. Barral et al., Am J Trop Med Hyg 62:740-5, 200 8. Behr J. P., Bioconjugate Chemistry, 1994: 5: 382-389 9. Berberich C. et al., Biochim. Biophys . Acta, 1998, 1442: 230-7 10. Boshart M. et al., Cell, 1985, 41, 521-530 11. Boshart M. et al., Cen 41:521-530, 1985 12. Breathnach et al., Vet Dermatol 2006, 17:313-21 13. Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394 14. Charlab et al., Proc Nati Acad Sci USA 96:15155-60, 1999 15. Chaudhuri P Res. Vet. Sci. 2001, 70(3), 255-6 16. Chung J Y et al., FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289-296 17. Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35 18. D. Berg. et al Biochem. Biophys. Res. 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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para vacuna que comprende: a) un vector de expresión, donde el vector comprende un polinucleotido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis y una mezcla de los mismos; y b) un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

2. La vacuna de la Reivindicación 1, donde el vector de expresión es seleccionado del grupo que consiste en pVR2001-TOPO, pVR2001-TOPA, pVR1020, pVR1012, pABUO, ALVAC, TROVAC, MVA, y vector baculovirus.

3. La vacuna de la Reivindicación 1, donde el polinucleotido codifica un polipéptido que tiene como mínimo 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17.

4. La vacuna de la Reivindicación 1, donde el polinucleotido tiene como mínimo 70% de identidad de secuencia con un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17.

5. La vacuna de la Reivindicación 1, donde el polinucleotido tiene como mínimo 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SE'C: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 89, 90 ó 91.

6. La vacuna de la Reivindicación 1, donde el vector se selecciona del grupo que consiste en pVR2001 LJM17 (NO. IDENT. SEC.:9), pVR2001 LJL143 (NO. IDENT. SEC..10), VCP2390 (NO. IDENT.. SEC.:93 o NO. IDENT. SEC.:92), VCP2389 (NO. IDENT. SEC.:94), MVA-LJM17, MVA-LJL143, pNBO002 (NO. IDENT. SEC.:19), pNBO003 (NO. IDENT. SEC.:20), VCP2390-NO. IDENT. SEC.:6, VCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y mezclas de los mismos.

7. Una composición para vacuna que comprende: a) un primer vector de expresión, donde el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis y una mezcla de los mismos; b) un segundo vector de expresión, donde el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis y una mezcla de los mismos; y c) un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

8. La vacuna de la Reivindicación 7, donde el vector de expresión se selecciona del grupo que consiste en pVR2001-TOPO, pVR2001-TOPA, pVR1020, pVR1012, pABllO, ALVAC , TROVAC, MVA, y vector baculovirus.

9. La vacuna de la Reivindicación 7, donde el polinucleotido codifica un polipéptido que tiene como mínimo 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC. : 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17.

10. La vacuna de la Reivindicación 7, ' donde el polinucleotido tiene como mínimo 70% de identidad de secuencia con un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17.

11. La vacuna de la Reivindicación 7, donde el polinucleotido tiene como mínimo 70% de identidad de secuencia con un polinucleotido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: NO. IDENT. SEC: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 89, 90 ó 91.

12. La vacuna de la Reivindicación 7, donde el primer o segundo vector de expresión se selecciona del grupo que consiste en pVR2001 LJM17 (NO. IDENT. SEC: 9), pVR2001 LJL143 (NO. IDENT. SEC: 10), vCP2390 (NO. IDENT. SEC: 93 or NO. IDENT. SEC: 92), VCP2389 (NO. IDENT. SEC: 94), MVA-LJM17, VA-LJL143, pNBO002 (NO. IDENT. SEC: 19), pNBO003 (NO. IDENT. SEC.:20), VCP2390-NO. IDENT. SEC: 6, vCP2389-NO. IDENT. SEC.:2 y mezclas de los mismos.

13. Una composición para vacuna que comprende: a) un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis ó una mezcla de los mismos; y c) un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario.

14. La vacuna de la Reivindicación 13, donde el polipéptido Lu. longipalpis comprende una secuencia de aminoácidos que tiene como mínimo 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17.

15. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde la vacuna comprende además como mínimo un antígeno de Leishmaniasis .

16. La vacuna de la Reivindicación 15, donde el antígeno de Leishmaniasis es KMP11.

17. La vacuna de la Reivindicación 15, donde el antígeno de Leishmaniasis es Leishmaniasis desactivada.

18. Un vector que comprende uno o más polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene como mínimo 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17; b) un polinucleótido que tiene como mínimo 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17; y b) un polinucleótido que tiene como mínimo 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 89, 90 ó 91; donde el vector es un vector de expresión in vivo o un vector de expresión in vitro.

19. El vector de la Reivindicación 18, donde el vector es un vector baculovirus.

20. El vector de la Reivindicación 18, donde el vector es un plásmido.

21. El vector de la Reivindicación 18, donde el vector es un vector viral.

22. Una célula anfitriona transformada con el vector de la Reivindicación 18.

23. Un método de vacunación de un individuo susceptible a Leishmaniasis que comprende como mínimo una administración de la vacuna de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 17.

24. El método de la Reivindicación 23, donde el individuo es humano, canino ó felino.

25. Un método de vacunación de un individuo susceptible a Leishmaniasis que comprende un régimen de administración de vacunas principales ("prime-boost") seguido de una administración de refuerzos de una vacuna.

26. El método de la Reivindicación 25, donde dicho régimen comprende una administración de vacuna principal que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un plásmido que contiene un polinucleotido para la expresión, in vivo, de un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis ó una mezcla de los mismos, y donde dicha administración de refuerzos de una vacuna comprende, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un vector viral recombinante que contiene un polinucleotido para la expresión, in vivo, del mismo (los mismos) polipéptido (s) salivales de Lu. longipalpis, variantes de los mismos, fragmentos de los mismos, para proteger al individuo de la Leishmaniasis y/o prevenir el avance de la enfermedad en un paciente infectado.

27. El método de la Reivindicación 25, donde dicho régimen comprende una primo administración de una vacuna que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un vector viral recombinante que contiene un polinucleotido para la expresión, in ' vivo, de un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis ó uña mezcla de los mismos, y donde dicha administración de refuerzos de una vacuna comprende, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un plásmido que contiene un polinucleótido para la expresión, in vivo, del (los) mismo (s) polipéptido (s) salivales de Lu. longipalpis, variantes del mismo, fragmentos del mismo, para proteger el individuo contra la Leishmaniasis y/o prevenir el avance de la enfermedad en un paciente infectado.

28. El método de la Reivindicación 25, donde dicho régimen comprende una primo administración de una vacuna que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, un vector viral recombinante que contiene un polinucleótido para la expresión, in vivo, de un polipéptido salival de Lu. longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis ó una mezcla de los mismos, y donde dicha administración de refuerzos de una vacuna comprende, en un vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario, el mismo (los mismos) polipéptido (s) salivales de Lu. longipalpis, variantes del mismo, fragmentos del mismo, para proteger al individuo contra la Leishmaniasis y/o prevenir el avance de la enfermedad en un paciente infectado.

29. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 23- 28, donde el polipéptido salival de Lu. longipalpis es un Polipéptido LJL143 o un Polipéptido LJM17.

30. Un método de diagnóstico de la infección por Leishmaniasis en un individuo, que comprende: a) contacto con un sustrato sólido que comprende como mínimo tres, seis ó diez polipéptidos, donde cada uno de los polipéptidos comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17 ó un fragmento inmunogénico. del mismo; b) contacto del sustrato sólido con una muestra obtenida del individuo; y c) detección de la unión de un componente de la muestra con como mínimo un polipéptido presente en el sustrato sólido, donde la detección de la unión del componente con el sustrato indica que el individuo está infectado con Leishmaniasis, mediante lo cual se hace el diagnóstico de la infección por Leishmaniasis en el individuo.

31. Un polinucleótido aislado, donde el polinucleótido comprende : a) una secuencia de nucleótidos que tiene como mínimo 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 89, 90 ó 91; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene como mínimo 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: .1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17; o c) un polinucleótido que tiene como mínimo 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC. : 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17.

32. El polinucleótido de la Reivindicación 31, donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que tiene como mínimo 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 89, 90 ó 91.

33. El polinucleótido de la Reivindicación 31, donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene como mínimo 90% de identidad de secuencia con un polipéptido . que tiene la secuencia según se. establece en 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17.

34. Un polipéptido salival de Lu. Longipalpis sustancialmente purificado, donde el polipéptido comprende: a) urta secuencia de aminoácidos que tiene como mínimo 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC. : 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17; b) una variante conservadora de la secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13,. 15 ó 17; c) un fragmento inmunogénico que comprende como mínimo ocho aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17, que se une específicamente a un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17; o d) una secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC. : 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17, y donde la administración del polipéptido a un individuo produce una respuesta inmunologica a Lu. longipalpis.

35. El polipéptido de la Reivindicación 34, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene como mínimo 90% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, .13, 15 ó 17.

36. El polipéptido de la Reivindicación 34, donde el polipéptido comprende un fragmento inmunogénico que comprende como mínimo ocho aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC. : 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17, que se une específicamente a un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos según se establece en NO. IDENT. SEC: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17.

37. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la Reivindicación 34.