CN103768588A - 使用白蛉唾液免疫原的利什曼原虫疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供含及体内或体外表达诱发动物或人针对利什曼原虫的免疫应答的白蛉长须罗蛉唾液抗原的载体，包括所述载体及/或长须罗蛉唾液多肽的疫苗组合物，针对利什曼原虫免疫接种的方法，及用于此方法及组合物的试剂盒。

Description

使用白蛉唾液免疫原的利什曼原虫疫苗

本申请是分案申请，母案的申请号为200980123626.9（国际申请号PCT/US2009/042980），申请日为2009年5月6日，发明名称为“使用白蛉唾液免疫原的利什曼原虫疫苗”。

【援引加入】

本申请要求2008年5月8日提交的美国临时申请系列No.61/051,635，及2008年9月30日提交的美国临时申请系列No.61/101,345的权利，其引用2003年10月29日提交的题为“LutzomyiaLongipalpis Polypeptides and Methods of Use”的国际申请No.PCT/US2003/034453，其要求2002年10月29日提交的临时申请No.60/422,303的优先权。

将本文引用或参考的全部文献（“本文引用的文献”），及本文引用的文献中引用或参考的全部文献，以及本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何厂商使用说明，说明书，产品说明，及产品手册通过引用并入本文，及可用于实施本发明。

【技术领域】

本发明涉及用于动物或人对抗利什曼原虫感染的制剂。特异性，本发明提供含及体内或体外表达诱发动物或人针对利什曼原虫的免疫应答的白蛉长须罗蛉唾液抗原的载体，包括组合物，其包括所述载体，针对利什曼原虫免疫接种的方法，及用于此方法及组合物的试剂盒。

【背景技术】

利什曼病是影响人，犬科动物（狗，狼，狐狸，山狗，豺），及次之为，猫科动物（狮，虎，家养猫科动物，野生猫科动物，其他大型猫科动物，及其他猫科动物，包括猎豹及猞猁）的主要及严重的寄生虫疾病。

基于分子学，生物化学及免疫学相似性将利什曼原虫及巴西亚属分入复合种及亚种。根据临床表现命名了几种形式的疾病，包括皮肤利什曼病，皮肤粘膜利什曼病或内脏利什曼病。这些形式的疾病中的每一种由见于世界不同地区的不同种的白蛉引发。人皮肤利什曼病，在旧大陆与埃塞俄比亚利什曼原虫（L.aethiopica），硕大利什曼原虫（L.major），及热带利什曼原虫（L.tropica）复合种的成员有关；而在新大陆与墨西哥利什曼原虫（L.mexicana）及巴西利什曼原虫（L.braziliensis）复合种的成员有关。内脏利什曼病，在旧大陆由杜氏利什曼原虫（L.donovani）及婴儿利什曼原虫引发，而在新大陆，恰加斯利什曼原虫主要引发内脏利什曼病。因为婴儿利什曼原虫主要与犬科动物利什曼病有关，狗中的感染常被认为是内脏利什曼病，尽管它们趋于兼引发内脏利什曼病及皮肤利什曼病。

内脏利什曼病的病原体是原生动物寄生虫，且属于杜氏利什曼原虫复合种。此寄生虫广泛分布于南欧、非洲，亚洲，南美及中美的温带及亚热带国家（Desjeux P.等人）。杜氏利什曼原虫婴儿亚种（婴儿利什曼原虫）在南欧，非洲，及亚洲引发猫科动物及犬科动物疾病。在南美及中美，病原体是杜氏利什曼原虫恰加斯亚种（恰加斯利什曼原虫），其与婴儿利什曼原虫紧密相关。人中，病原体是杜氏利什曼原虫杜氏亚种（杜氏利什曼原虫），其也与婴儿利什曼原虫及恰加斯利什曼原虫（L.chagasi）相关。

白蛉（Phlebotomus）属（旧大陆）及罗蛉（Lutzomyia）属白蛉（新大陆）是疾病传播的主要载体。目前这些是仅知的能传播的载体；也显示跳蚤，蜱及其他节肢动物是有能力的载体。但是，通过血液或体液交换，直接接触及至少一个先天性传播病例染罕见的利什曼病病例。尚未确定天然白蛉的重要性，但可与生物的感染性剂量相关。近些年，仍及在无已知载体的情况下，在全美国的猎狐狗狗舍（Foxhoundkennels）有势不可挡的利什曼病发病率。仍未知疾病传播如何发生或此疾病如何在这些狗中维持，因为美国尚未报道感染的白蛉。但发现，某些罗蛉种（L.shannoni），沿着美国东部及至远北部新泽西，被认为是潜在有能力的墨西哥利什曼原虫载体。Phlebotomus ariasi（P.ariasi）及恶毒白蛉（P.perniciosus），Phlebotomus neglectus（P.neglectus）是在南欧，非洲，及亚洲最常见的载体，而长须罗蛉（Lu.longipalpis）是在南美及中美最常见的载体。

利什曼病是可需7年才变得临床上明显的缓慢进行性疾病（McConkey SE et al.；Slappendel RJ et al.）。尽管如此，体征常非特异且极少考虑利什曼原虫诊断。狗最常感染婴儿利什曼原虫（杜氏利什曼原虫复合种），其导致人中的内脏营养疾病。但是，达90%的感染的狗患内脏及皮肤损伤（Slappendel RJ et al.）。另一方面，许多狗显示出天然抗此寄生虫及可保持无症状，尽管已知感染（GrosjeanNL et al.）。估计仅10%居住在局部地区的狗实际上发生临床疾病（Lindsay DS et al.）。此临床疾病的更低发病率归因于某些狗相比体液应答，引发更多保护性细胞介导的免疫应答的遗传倾向（Lindsay DSet al.，McConkey SE et al.，Slappendel RJ，et al.）。而且，报道称，达20%的感染的狗可引发足够的免疫应答，且从临床病态自发地恢复（McConkey SE et al.）。引发体液应答的动物中，IgG1显示出与临床疾病相关，而无症状狗具有更高的IgG2抗体水平（Lindsay et al.）。

一些利什曼病的更常报道的临床体征包括：伴随厌食及体重减轻的倦怠，疲劳及运动不耐，其最终至消耗病（McConkey SE et al.）。这些体征可伴随或不伴随发热，局部或全身淋巴结病（90%）及/或肝脾肿大（Grosjean NL et al.，Lindsay DS et al.，McConkey SE et al.，Martínez-Subiela S et al.）。关节牵连相当常见，且可呈现为有肿大关节的跛行或简单呈现为僵硬步态。欠常见的发现包括：眼损伤（<5%），慢性腹泻（30%）及被称为甲弯曲的长、变形的脆甲症（20%）（LindsayDS et al.，Slappendel RJ et al.）。皮肤损伤存在于达89%的感染的狗中，有或无明显的内脏牵连体征。身体的任何部位可发生皮肤利什曼病损伤，但最常见的部位是暴露于环境且因此更易被白蛉咬的部位。初始丘疹快速产生溃疡。内脏利什曼病常常致死，如果不及时治疗。内脏利什曼病影响身体内部器官，特别是脾脏及肝脏。

狗被认为是主要的利什曼病储蓄者。疾病的特征在于发生在少于50%的感染的动物中的内脏-皮肤体征的慢性发展（Lanotte G.et al.）。有可检测的抗体的无症状及有症状狗均可为感染性的（Molina R.etal.;Courtenay O.et al.）。猫也可为原生动物寄生虫的载体，及因此考虑为第二潜在的储蓄者。

由于多种因素，最好限制狗中利什曼病的治疗选项及对治疗的反应。由于一些未确定的理由，狗的内脏利什曼病比人的更难治疗。无在清除寄生虫感染中100%有效的治疗选项，且在停止治疗时临床疾病常重现（Lindsay DS et al.）。在局部地区，最常见的治疗方案是别嘌呤醇与五价锑剂（例如锑酸葡甲胺或葡萄糖酸锑钠）的组合（LindsayDS et al.，Slappendel RJ et al.）。但是，近些年，此流程由于增加的寄生虫对药物的抗性以及与这些化合物相关的不利的副作用而变得过时（Lindsay DS et al.）。为进一步限制治疗选项，

（葡萄糖酸锑钠）是在美国仅可用的锑剂，且其分布由GA，亚特兰大的疾病控制及预防中心（CDC）调节（Lindsay DS et al.）。

也尝试了其他流程，但被证明非在清除寄生虫感染或在预防临床复发中更有效。此外，各流程与潜在不利的效果有关。两性霉素B结合甾醇，且破坏细胞膜渗透性，但有肾毒性（Lindsay DS et al.）。当肠胃外给予时，巴龙霉素（Paramomycin）与锑剂协同作用导致更高水平的锑剂持续更长时期，但也有肾毒性，且目前不推荐临床使用（Lindsay DS et al.）。羟乙磺酸喷他咪在抗利什曼病中有效，但要求至少15次肌内注射，且相当痛苦（Lindsay DS et al.）。酮康唑，咪康唑，氟康唑及伊曲康唑是可有用于含疾病的口服药物，但成本受限，且当治疗有症状的患者时有药物抗性的风险。总之，研究了各种狗中利什曼病治疗方案，但不100%有效；复发是常规的，而非以外。最终，美国的兽医学实践者面临治疗在有风险发展此寄生虫的药物抗性株的狗中利什曼病症状蔓延的困境。

大量检测血清阳性狗之后治愈及/或药物治疗，或大量应用溴氰菊酯-浸渍的项圈，已显示对减少南欧，非洲，及亚洲的局部地区的人及犬科动物利什曼病流行有影响（Maroli M.et al.Mazloumi GavganiA.S.et al.），尽管已讨论消除血清阳性犬科动物的效力（Dietze R.etal.;Moreira Jr.E.D.et al.）。这些控制方法或被认为不可接受，或被认为耗资或不有效（Gradoni L.et al.）。使用数学模型来比较控制利什曼病的各种工具的有效性提示，犬科动物疫苗可为最有实践性及有效的方法（Dye C.）。因此，利什曼病控制程序的实施以及兽医学社区高度期望开发出能保护犬科动物免于利什曼病及/或预防感染的动物中的疾病进展的疫苗（Gradoni L.et al.）。

之前的研究用于开发通过，例如，施用抗原性多肽来诊断及治疗利什曼原虫的方法（见，例如，WO2004/039958，通过引用将其整体并入本文）。但是，至今，尚无疫苗可用于治疗利什曼原虫。本发明的载体及疫苗制剂满足了此本领域长期以来的需求。

本申请中引用或列出的任何文献不旨在承认这些文献为本发明的现有技术。

【发明概述】

本发明的目的可为提供重组载体或病毒以及制备此病毒的方法，及提供治疗及预防利什曼原虫感染的组合物及/或疫苗以及方法中的任何一个或全部。

本发明提供重组载体，例如重组病毒，例如重组痘病毒，其含及表达至少一种外源核酸分子，且所述至少一种外源核酸分子可包括编码自长须罗蛉的白蛉载体的唾液蛋白的目的免疫原或表位的核酸分子。

尤其是，本发明提供重组载体，例如重组病毒，例如重组痘病毒，其含及表达至少一种外源核酸分子，且所述至少一种外源核酸分子可包括唾液长须罗蛉多肽及/或其变体或片段。

这些疫苗可预防宿主中寄生虫的扩散及/或复制。

本发明还提供免疫学（或免疫原性），或疫苗组合物，其包括此表达载体或此表达载体的表达产品。

本发明还提供诱导抗利什曼原虫的免疫学（或免疫原性）或保护性应答的方法，以及预防或治疗利什曼原虫或利什曼原虫引发的疾病状态的方法，包括施用表达载体或表达载体的表达产品，或包括表达载体的组合物，或包括表达载体的表达产品的组合物。

本发明也涉及自病毒的表达产品以及从表达产品产生的抗体或其体内表达，及此产品及抗体在例如诊断性应用中的用途。

这些及其他实施方式被以下详述公开，或明显自以下详述，及被以下详述涵盖。

【附图说明】

以例给出的下列详述及附图不旨在限制本发明于特定实施方式。

图1显示质粒pVR2001LJM17的一条链的核酸序列（SEQ IDNO：9），其中2个BamHI限制性内切酶位点以粗体显示，编码tPA信号肽的序列加了下划线，而编码LJM17的序列以粗体大写字母显示。

图2显示质粒pVR2001LJL143的一条链的核酸序列（SEQ IDNO：10），其中2个BamHI限制性内切酶位点以粗体显示，编码tPA信号肽的序列加了下划线，而编码LJL143的序列以粗体大写字母显示。

图3显示具有5737个碱基对的供体载体pALVAC C3H6p-LJM17的图谱。

图4显示vCP2390金丝雀痘表达载体的正向及反向互补链（SEQID NO：93及SEQ ID NO：92）。SEQ ID NO：93表示以编码LJM17多肽（SEQ ID NO：5）的方向含密码子-优化的LJM17多核苷酸的vCP2390载体链。

图5显示具有5400个碱基对的供体载体pALVAC C3H6p-LJL143的图谱。

图6显示插入子编码LJL143的vCP2389金丝雀痘表达载体，及显示表达载体的一条链的核苷酸序列（SEQ ID NO：94）。

图7显示疫苗接种的狗及对照狗中，从V1施用之前一天到V5施用之后2周的兼针对LJM17及LJL143的抗-IgG抗体，在405nm处测量吸光度。

图8显示第五次免疫（V5施用）之后2周的从对应于5组的狗PBMC的干扰素-γ分泌（pg/mL）。用SGH（2对），LJL143（4μg），LJM17（4μg），ConA（4μg）刺激PBMC，或用培养基（med）非刺激。

图9显示包括结果的体外杀试验的图解，以感染的巨噬细胞的百分率表示（NT：无治疗，LPS：脂多糖，conA：刀豆素A）。

图10显示疫苗接种的狗及对照狗的用苏木素/曙红（H&E），Luna氏，Toludine蓝及就CD3的免疫组织化学过程及巨噬细胞/单核细胞标记物（Mac）染色的白蛉叮咬处的活组织检查。

图11显示质粒pNBO002的一条链的核酸序列（SEQ ID NO：19），其中2个BamHI限制性内切酶位点以粗体显示，编码tPA信号肽的序列加了下划线，而编码LJM17的序列以粗体大写字母显示。

图12显示具有6247个碱基对的有编码LJM17的插入子的pNBO002质粒载体的图谱。

图13显示质粒pNBO003的一条链的核酸序列（SEQ ID NO：20），其中2个BamHI限制性内切酶位点以粗体显示，编码tPA信号肽的序列加了下划线，而编码LJL143的序列以粗体大写字母显示。

图14显示具有5899个碱基对的有编码LJL143的插入子的pNBO003质粒载体的图谱。

图15显示自长须罗蛉的LJL143及LJM17的蛋白序列。

图16显示自长须罗蛉的LJL143及LJM17的DNA序列。

图17显示序列同一性表。

图18显示各DNA及多肽指定的SEQ ID NO。

图19是显示暴露于长须罗蛉白蛉叮咬的狗中的抗-唾液免疫的一组坐标图及照片。图19A是显示暴露的狗中抗-长须罗蛉IgG，IgG2，及IgG1抗体效价的早期动力学的一组坐标图。图19B是贯穿暴露实验的代表性的狗中的延迟型超敏反应的坐标图。图19C是暴露于白蛉叮咬之前（E0），第一次暴露于白蛉叮咬（E1）之后47h时，第二次暴露于白蛉叮咬（E2）之后48h时及第三次暴露于白蛉叮咬（E3）之后48h时，对皮肤钻取活组织检查进行的H/E组织学分析的一组照片。图19D是第三次暴露于白蛉叮咬（E3）之后48h时用对CD3+T淋巴细胞及巨噬细胞的免疫组织化学及用对嗜酸性粒细胞的Luna氏染色表征炎症群的一组照片。

图20是显示狗中cDNA反抗原筛选试验的一组坐标图及照片。

图21是显示狗中蛋白反抗原筛选试验的一组坐标图及照片。

图22是显示用重组唾液蛋白刺激之后自疫苗接种的狗的外周血单核细胞（PBMC）的干扰素γ产生的一组2个坐标图。

图23是显示自免疫的狗的由PBMC的对恰加斯利什曼原虫的体外杀试验的一组4个柱状图（NT，无治疗；Ly，淋巴细胞）。

【发明详述】

需知，本公开中及尤其权利要求中，术语例如“包括（comprises）”，“包括（comprised）”，“包括（comprising）”等可具有美国专利法规定的含义；例如它们可意指“包括（includes）”，“包括（included）”，“包括（including）”等；且术语例如“基本上由…组成（consistingessentially of）”及“基本上由…组成（consists essentially of）”具有美国专利法规定的含义，例如它们允许尚未明确叙述的因素的存在，但排除见于现有技术或影响本发明的基本特征或新特征的因素。

除非另有说明，根据常规应用使用技术术语。分子生物学中常见的术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V.Oxford UniversityPress出版,1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew et al.(eds.),TheEncyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9);及Robert A.Meyers(ed.),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。单数术语“a”、“an”及“the”包括复数，除非文中另有明确说明。类似地，词语“或”旨在包括“及”，除非文中另有说明。词语“或”是指特定列表中的任何一个成员，及也包括该列表成员的任何组合。

需知，在本公开及随附的权利要求及/或段落中，术语“唾液长须罗蛉多肽”，“长须罗蛉多肽”，或“唾液多肽”可互换使用，术语“唾液长须罗蛉多核苷酸”，“长须罗蛉多核苷酸”，或“唾液多核苷酸”可互换使用。

术语“多肽”及“蛋白”在本文可互换使用，指连续氨基酸残基的聚合物。

术语“核酸”，“核苷酸”，及“多核苷酸”指RNA或DNA及其衍生物，例如含修饰的主链的那些。应知，本发明提供包括互补于本文所述的多核苷酸的序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可用不同方法制备（例如通过化学合成，通过基因克隆等），且可取各种形式（例如线性或分支的，单或双链，或其杂交体，引物，探针等）。

术语“基因”广义指相关于生物学功能的任何多核苷酸区段。因此，基因或多核苷酸可如在基因组序列中包括内含子及外显子，或如在cDNA中仅包括编码序列，例如，始于起始密码子（甲硫氨酸密码子）及终于终止信号（终止密码子）的开放阅读框（ORF）。基因及多核苷酸也可包括调控它们的表达的区，例如转录起始，翻译及转录终止。因此，也包括启动子及核糖体结合区（通常，这些调控元件位于编码序列或基因的起始密码子上游的约60与250个核苷酸之间；Doree S Met al.；Pandher K et al.；Chung J Y et al.），转录终止子（通常，终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游的约50个核苷酸之内；Ward C K et al.）。基因或多核苷酸也指表达mRNA或功能性RNA，或编码特异蛋白的核酸片段，及其包括调控序列。

本文使用的术语“免疫原性多肽”或“免疫原性片段”指包括等位基因-特异基序，表位或其他序列的多肽或多肽片段，由此，多肽或片段将与MHC分子结合，及诱导细胞毒性T淋巴细胞（“CTL”）应答，及/或B细胞应答（例如，抗体产生），及/或T-辅助淋巴细胞应答，及/或针对衍生出免疫原性多肽或免疫原性片段的抗原的延迟型超敏反应（DTH）。DTH反应是免疫应答，其中T细胞-依赖性巨噬细胞活化及炎症导致组织损伤。对抗原皮下注射的DTH反应常被用作用于细胞介导的免疫的试验。

据定义，表位是一旦施用于宿主，就能引发体液（B细胞）及/或细胞型（T细胞）免疫应答的免疫学活跃的抗原决定簇。这些是有抗原性的分子上的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的特定抗原性表位。表位的特定非限制性实施例包括多肽中的四肽～五肽序列，多糖中的三糖苷～五糖苷序列。动物中，多数抗原将同时呈递几种或甚至许多抗原决定簇。此多肽也可定量为免疫原性多肽，而表位可如下所述鉴定。

“分离的”生物学成分（例如核酸或蛋白或细胞器）指已基本上从生物细胞中的其他生物学成分分离出或纯化出的成分，其中成分天然存在，例如，其他染色体及染色体外DNA及RNA，蛋白，及细胞器。已“分离的”核酸及蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸及蛋白。术语也包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸及蛋白。

本文使用的术语“纯化的”不要求绝对纯净；而是旨在表示相对术语。因此，例如，纯化的多肽制剂是其中多肽比多肽在天然环境中更富含的多肽制剂。多肽制剂是基本上纯化的，由此多肽代表制剂的总多肽含量的至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，或至少98%的几个实施方式。多核苷酸也同样。本文公开的多肽可通过任何现有技术中已知的手段纯化。

重组多核苷酸是具有不天然存在的序列或具有通过人工组合2个别样分离的序列区段制备的序列的多核苷酸。此人工组合常通过化学合成，或更常通过人工操作分离的核酸区段，例如，通过遗传工程技术实现。在一实施方式中，重组多核苷酸编码融合蛋白。

一方面，本发明提供自白蛉物种长须罗蛉的多肽。另一方面，本发明提供具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87，及其变体或片段所示的序列的多肽。

而且，自白蛉物种长须罗蛉的多肽同源物旨在本发明的范围之内。本文使用的术语“同源物”包括直系同源物，类似物及旁系同源物。术语“类似物”指具有相同或相似功能，但在不相关的生物中独立进化的2个多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”指自不同物种，但通过物种形成从共同祖先基因进化而来的2个多核苷酸或多肽。通常，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”指通过基因组内复制而相关的2个多核苷酸或多肽。旁系同源物常具有不同功能，但这些功能可相关。通过翻译后修饰，通过氨基酸序列差异，或兼通过二者，野生型唾液多肽的类似物，直系同源物，及旁系同源物可与野生型唾液多肽不同。尤其是，本发明的同源物将一般与全部或部分野生型唾液多肽或多核苷酸序列呈现至少80～85%，85～90%，90～95%，或95%，96%，97%，98%，99%序列同一性，及将呈现相似功能。

另一方面，本发明提供与具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽。

再一方面，本发明提供上述长须罗蛉多肽的片段及变体（SEQ IDNO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87），其可由本领域技术人员使用熟知的分子生物学技术容易制备。

变体是具有与SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87所示的氨基酸序列具有至少75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%同一性的氨基酸序列的同源多肽。

变体包括等位变体。术语"等位变体"指含多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白的氨基酸序列变化，及存在于天然群（例如病毒物种或变种）内。此天然等位变异可一般导致多核苷酸或多肽的1～5%方差。等位变体可通过测序许多不同物种的目的核酸序列来鉴定，其可容易通过使用杂交探针进行，以在那些物种中鉴定相同基因遗传座位。天然等位变异的结果及如果感兴趣、不改变基因的功能活性的任何及全部此核酸变异及产生的氨基酸多态性或变异旨在本发明的范围之内。

变体是自长须罗蛉唾液的任何分泌的多肽，能在用此多肽疫苗接种的动物（例如狗）中诱导特异的基于细胞的免疫应答，其特征在于，通过长须罗蛉唾液腺提取化合物刺激后分泌干扰素γ（IFN-γ）。此IFN-γ分泌可使用体外方法展示（即自R&D Systems Inc.的

immunoassay（货号#CAIF00）；Djoba Siawaya JF et al.）。

本文使用的术语"衍生物"或“变体”指多肽，或编码多肽的核酸，所述多肽具有一个或多个保守氨基酸变异或其他小修饰，由此：（1）相应多肽相比野生型多肽具有基本上等同的功能，或（2）针对多肽产生的抗体与野生型多肽发生免疫反应。这些变体或衍生物包括具有长须罗蛉多肽一级氨基酸序列的小修饰的多肽，所述修饰可产生相比未修饰的该多肽具有基本上等同的活性的肽。此修饰可有意，如通过定点诱变，或可自发。术语“变体”还包括对序列的缺失，添加及置换，只要多肽发挥产生本文定义的免疫学反应的功能。

术语"保守变异"是指氨基酸残基被另一生物学相似的残基取代，或核酸序列中的核苷酸取代，由此编码的氨基酸残基不变化，或是转变成另一生物学相似的残基。在这点上，尤其优选的置换一般将在性质上保守，即，氨基酸家族内发生的置换。例如，氨基酸一般被分为4个家族：（1）酸性--天冬氨酸及谷氨酸；（2）碱性--赖氨酸，精氨酸，组氨酸；（3）非极性--丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及（4）不带电的极性--甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸，及酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的例包括一个疏水性残基（例如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸）被另一疏水性残基置换，或一个极性残基被另一极性残基置换，例如精氨酸被赖氨酸，谷氨酸被天冬氨酸，或谷氨酰胺被天冬酰胺置换等；或将对生物学活性无主要影响的氨基酸被结构上相关的氨基酸的相似保守取代。因此，与参照分子具有基本上相同的氨基酸序列，但加工了少数基本上不影响蛋白的免疫原性的氨基酸置换的蛋白在参照多肽的定义之内。通过这些修饰产生的全部多肽包括在本文中。术语"保守变异"也包括代替未取代的原氨基酸使用取代的氨基酸，前提是，针对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。

长须罗蛉多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87或其变体所示的序列的长须罗蛉多肽的至少8，10，15，或20个连续氨基酸，至少21个氨基酸，至少23个氨基酸，至少25个氨基酸，或至少30个氨基酸。另一实施方式中，长须罗蛉多肽片段包括见于全长长须罗蛉多肽的特异抗原性表位。

确定多肽片段及表位的方法，例如，产生重叠肽文库（Hemmer B.et al.），肽扫描术（Geysen H.M.et al.,1984;Geysen H.M.et al.,1985;Van der Zee R.et al.;Geysen H.M.）及算法（De Groot A.et al.;HoopT.et al.;Parker K.et al.）可在本发明的实践中使用，无需过多的实验。一般而言，抗体特异性结合特定抗原性表位。特异地，表位的非限制性实施例包括多肽中的四肽～五肽序列，多糖中的三糖苷～五糖苷序列。在动物中，多数抗原将同时呈递几种或甚至许多抗原决定簇。其中表位优选是更大分子的蛋白片段，其将与总蛋白具有基本上相同的免疫学活性。

另一方面，本发明提供编码自长须罗蛉白蛉的多肽的多核苷酸，例如编码具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87所示的序列的多肽的多核苷酸。再一方面，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽，或者这些多肽之一的保守变体，等位变体，同源物或包括至少8或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段，或者这些多肽的组合的多核苷酸。

另一方面，本发明提供具有SEQ ID NO：2，4，6，8，12，14，16，18，21，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，89，90，或91，或其变体所示的核苷酸序列的多核苷酸。再一方面，本发明提供与具有SEQ ID NO：2，4，6，8，12，14，16，18，21，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，89，90，或91，或其变体所示的序列的多核苷酸之一具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多核苷酸。

这些多核苷酸可包括编码长须罗蛉多肽的DNA，cDNA，及RNA序列。需知，编码长须罗蛉多肽全部多核苷酸也包括在本文中，只要它们编码有指定活性的多肽，所述活性例如，当施用给暴露于寄生虫的受试者或经历利什曼原虫感染体征或症状降低的受试者时，结合识别多肽的抗体，诱导对多肽的免疫应答，或对利什曼原虫存活率的影响。

本文公开的多核苷酸包括遗传密码简并所致的序列，例如对特异宿主的优化的密码子利用。本文使用的，“优化的”指经遗传工程改造以增加其在给定物种中表达的多核苷酸。为提供编码唾液多肽的优化的多核苷酸，唾液蛋白基因的DNA序列可经修饰，以1）包括优选在特定物种中高度表达的基因的密码子；2）核苷酸碱基组成中包括基本上见于所述物种中的A+T或G+C含量；3）形成所述物种的起始序列；或4）消除导致去稳定化，不恰当的多聚腺苷酸化，RNA降解及终止的序列，或形成二级结构发卡或RNA剪接位点。所述物种中唾液蛋白的升高的表达可通过利用真核生物及原核生物中，或特定物种中密码子利用的分布频率来实现。术语“优选的密码子利用的频率”指特异宿主细胞在核苷酸密码子利用中表现出的指定给定氨基酸的偏好。有20种天然氨基酸，多数指定多于一种密码子。因此，全部简并核苷酸序列包括在本公开中，只要核苷酸序列编码的长须罗蛉唾液多肽氨基酸序列功能上未变化。

2个氨基酸序列之间的序列同一性可使用标准参数通过NCBI（National Center for Biotechnology Information）配对blast及blosum62矩阵确定（见，例如"National Center for BiotechnologyInformation"上可用的BLAST或BLASTX算法（NCBI，Bethesda，Md.，USA）服务器，以及中Altschul et al.中；及因此，此文献教导使用术语“blasts”的算法或BLAST或BLASTX及BLOSUM62矩阵）。

2个核苷酸序列之间的序列同一性也可使用Myers及Miller的“Align”程序确定（“Optimal Alignments in Linear Space”，CABIOS4，11-17，1988），及可在NCBI上确定，以及通过互联网的网站（例如NCBI网站）上的相同或其他程序确定。

或者或另外，术语“同一性”（例如，有关核苷酸或氨基酸序列）可表示2个序列之间的同源性的定量度量。百分率序列同源性可计算为：

（N_ref-N_dif）*100/N_ref，

其中N_dif是比对的2个序列中非同一残基总数，且其中N_ref是序列之一的残基数。

因此，DNA序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC具有75%序列同一性（N_ref=8；N_dif=2）。

或者或另外，“同一性”（有关序列）可指有相同的核苷酸或氨基酸的位置数除以2个序列中较短者的核苷酸或氨基酸数，其中2个序列的比对可根据Wilbur及Lipman算法确定（Wilbur及Lipman），例如，使用20个核苷酸的窗口尺寸，4个核苷酸的字长，及空位罚分4，及计算机辅助的分析及包括比对的序列数据解读可使用商业可用程序简便进行（例如Intelligenetics^TMSuite，Intelligenetics Inc.CA）。当说道RNA序列相似，或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，认为DNA序列中的胸腺嘧啶（T）等同于RNA序列中的尿嘧啶（U）。因此，RNA序列在本发明的范围之内，且可通过考虑DNA序列中的胸腺嘧啶（T）等同于RNA序列中的尿嘧啶（U）来源于DNA序列。

2个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或2个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包确定（Invitrogen，1600Faraday Ave.，Carlsbad，CA）。

有利地，序列同一性或同源性（例如氨基酸序列同一性或同源性）可使用BlastP程序确定（Altschul et al.）及可在NCBI上确定，以及通过互联网的网站（例如NCBI网站）上的相同或其他程序确定。

根据文献提供用于比较序列相对同一性或同源性的算法，及另外或者有关前述，这些参考文献中的教导可用于确定同源性或同一性百分率：Needleman SB及Wunsch CD；Smith TF及Waterman MS；Smith TF，Waterman MS及Sadler JR；Feng DF及Dolittle RF；Higgins DG及Sharp PM；Thompson JD，Higgins DG及Gibson TJ；及，Devereux J，Haeberlie P及Smithies O。及无需过多的实验，本领域技术人员可咨询许多其他程序或参考文献用于确定同源性百分率。

长须罗蛉多核苷酸可包括重组DNA，其被并入载体，并入自主复制质粒或病毒，或并入原核生物或真核生物的基因组DNA，或其表现为独立于其他序列的独立的分子（例如，cDNA）。

本文公开的重组载体可包括编码多肽，其变体或其片段的多核苷酸。重组载体可包括质粒及病毒载体，且可用于体外或体内表达。重组载体还可包括信号肽。信号肽是引导蛋白（其在胞质溶胶中合成）翻译后转运到特定细胞器（例如核，线粒体基质，内质网，叶绿体，质外体及过氧化物酶体）的短肽链（3～60个氨基酸长）。一般而言，天然存在的唾液长须罗蛉多肽，例如LJM17及LJL143蛋白，可翻译为具有N-端信号肽序列及“成熟的”蛋白结构域的前体。信号肽可在翻译后快速被切割下。信号序列可为自唾液蛋白的天然序列或自分泌的蛋白的肽信号，例如自组织纤溶酶原活化剂蛋白（tPA）（尤其是人tPA）的信号肽（S.Friezner Degen et al.;R.Rickles et al.;D.Berg.etal.），或自胰岛素-样生长因子1（IGF1）（尤其是马科动物IGF1（K.Otte et al.），犬科动物IGF1（P.Delafontaine et al.），猫科动物IGF1（WO03/022886），牛IGF1（S.Lien et al.），猪IGF1（M.Muller etal.），鸡IGF1（Y.Kajimoto et al.），火鸡IGF1（GenBank accessionnumber AF074980））的信号肽。自IGF1的信号肽可为天然的或优化的，所述优化可通过除去隐含的剪接位点及/或通过适应密码子利用来实现。翻译后，未加工的多肽可在切割位点切割，产生成熟的多肽。切割位点可使用Von Heijne（1986）的方法预测。

质粒可包括DNA转录单位，例如使其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制原点（原核或真核）。质粒也可包括一种或多种可选择的标记物基因及现有技术中已知的其他遗传元件。环状及线性形式的质粒包括在本公开中。

还一方面，本发明涉及包括多核苷酸序列的体内表达载体，其含及在宿主中体内表达唾液长须罗蛉多肽及/或其变体或片段。

体内表达载体可包括含目的多核苷酸或基因及那些用于其体内表达的必要元件的任何转录单位。这些表达载体可为质粒或重组病毒载体。说到体内表达，启动子可为病毒或细胞来源的。在一实施方式中，启动子可为巨细胞病毒（CMV）早期启动子（CMV-IE启动子），SV40病毒早期或晚期启动子或劳斯肉瘤病毒LTR启动子，细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子（Kwissa M.et al.），或肌动蛋白启动子（Miyazaki J.et al.）。当几种基因存在于相同质粒中，它们可提供于相同转录单位或不同单位。

本文使用的术语“质粒”可包括任何包括本发明的多核苷酸及用于其在期望宿主细胞或靶细胞中体内表达的必要元件的DNA转录单位；且在这一点，需知超螺旋的或非超螺旋的，环状质粒，以及线性形式也旨在包括在本发明的范围之内。质粒也可包括其他转录-调控元件，例如，内含子型稳定序列。几个实施方式中，质粒可包括CMV-IE的第一内含子（WO89/01036），兔β-珠蛋白基因的内含子II（van Ooyenet al.），组织纤溶酶原活化剂编码的蛋白的信号序列（tPA；Montgomery et al.），及/或多聚腺苷酸化信号（多聚A），尤其是牛生长激素（bGH）基因的多聚A（美国5,122,458）或兔β-珠蛋白基因或SV40病毒的多聚A。

还一方面，本发明涉及疫苗组合物，其包括：（a）体内表达载体，其中载体包括编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽选自唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，及它们的混合物；及（b）药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂。

另一方面，本发明涉及疫苗组合物，其包括：（a）第一体内表达载体，其中载体包括编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽选自唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，及它们的混合物；（b）第二体内表达载体，其中载体包括编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽选自唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，及它们的混合物；及（c）药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂。

术语“疫苗组合物”或“疫苗”包括任何组合物，一旦将其注射给宿主（包括犬科动物，猫科动物及人），其保护宿主免于皮肤利什曼病及/或内脏利什曼病，及/或其可预防寄生虫植入，及/或其可预防感染的受试者中的疾病进展，及/或其可限制失控的寄生虫扩散到内部器官，及/或其可避免或限制通过白蛉叮咬疫苗接种的狗期间的摄取寄生虫。这可根据本发明免疫接种后通过诱导细胞因子分泌（显著地IFN-γ分泌）实现（作为测量IFN-γ分泌的方法例，可使用自R&D SystemsInc.的

immunoassay（货号#CAIF00）（Djoba Siawaya JFet al.））。

药学可接受的媒质或赋形剂的使用是常规的。由E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，15th Edition（1975）的Remington’sPharmaceutical Sciences描述了适宜药学递送本文公开的多肽，质粒，病毒载体的组合物及制剂。通常，媒质或赋形剂的性质将取决于所采用的施用的特定模式。例如，肠胃外制剂常包括可注射的流体，其包括药学及生理学可接受的流体，例如水，生理盐水，平衡的盐溶液，含水右旋糖，甘油等作为媒质。对于固体组合物（例如，冷冻干燥的锭剂，粉末，丸剂，片剂，或胶囊形式）而言，常规非毒性固体媒质或赋形剂可包括，例如，药品级的甘露醇，乳糖，淀粉，或硬脂酸镁。除了生物学中性媒质或赋形剂之外，待施用的免疫原性组合物可含少量的非毒性辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，防腐剂，及pH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂酸山梨坦。

本发明的疫苗可包括编码任何上述本发明的多核苷酸的载体。

可在使用不同插入位点或使用相同插入位点的相同载体中进行多插入。当使用相同插入位点时，可将各多核苷酸插入子（其可为上述任何本发明的多核苷酸）在相同及/或不同启动子控制下插入。插入可尾-尾，头-头，尾-头，或头-尾进行。也可使用IRES元件（内部核糖体进入位点，见EP0803573）来分离及表达可操作连接到相同及/或不同启动子的多个插入子。

在一实施方式中，本发明涉及包括上述多核苷酸的表达载体。表达载体可为体内表达载体，或体外表达载体。

更一般而言，本发明包括体内表达载体，其包括任何含及在宿主中体内表达长须罗蛉唾液多肽的多核苷酸或基因，其变体或其片段及用于其体内表达必要的元件的质粒（EP-A2-1001025；Chaudhuri P.）。

在特异的非限制性实施例中，可将pVR1020或pVR1012质粒（VICAL Inc.；Luke C.et al.；Hartikka J.et al.），pVR2001-TOPA（或pVR2001-TOPO）（Oliveira F.et al.）或pAB110（美国6,852,705）用作用于插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒源于pVR1012，且含人tPA信号序列。pVR1020是可从Vical，Inc.获得的质粒主链（SanDiego，CA），其已之前使用，见，例如美国专利No.6,451,769及7,078,507。如Oliveira et al.所述，质粒pVR2001-TOPO（或pVR2001-TOPA）是通过添加侧翼于克隆位点及含编码及表达信号分泌肽（例如，组织纤溶酶原活化剂信号肽（tPA））的拓扑异构酶（其增加产生分泌的蛋白的可能性）来修饰的pVR1020（见Oliveira F.etal.中的图1）。

各质粒可包括或含或基本上组成于可操作连接到启动子或在启动子控制下或依赖于启动子的本发明的多核苷酸，其中启动子可有利地相邻于期望表达的多核苷酸。通常，采用在真核细胞中有功能的强启动子是有利的。有用的启动子的一例可为人或鼠来源的立即早期巨细胞病毒启动子（CMV-IE），或其可任选具有其他来源，例如自大鼠或豚鼠。CMV-IE启动子可包括实际启动子部分，其可或可不相关于增强子部分。可参考EP260 148，EP323 597，美国5,168,062，5,385,839，及4,968,615，以及WO87/03905。CMV-IE启动子可有利地为人CMV-IE（Boshart M.et al.）或鼠CMV-IE。更通常而言，启动子可为病毒或细胞来源的。可有用地应用于本发明的实施的强病毒启动子（而非CMV-IE）是SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可有用地应用于本发明的实施的强细胞启动子是细胞骨架基因启动子，例如结蛋白启动子（Kwissa M.et al.），或肌动蛋白启动子（Miyazaki J.et al.）。这些启动子的功能性亚片段，即，保持足够的启动子活性的这些启动子的一部分包括在本发明之内，例如根据WO98/00166或美国6,156,567的截短的CMV-IE启动子，且可用于本发明的实施。有用于本发明的实施的启动子可包括保持足够的启动子活性及因此发挥启动子功能的全长启动子的衍生物及/或亚片段，及其可有利地具有基本上相似于衍生出衍生物或亚片段的实际或全长启动子的启动子活性，例如美国6,156,567的近于截短的CMV-IE启动子活性，相比全长CMV-IE启动子活性。因此，本发明的实施中的CMV-IE启动子可包括或基本上组成于或组成于：全长启动子的启动子部分及/或全长启动子的增强子部分，以及它们的衍生物及/或亚片段。

有利地，质粒包括或基本上组成于其他表达控制元件。合并稳定序列，例如内含子序列，例如，hCMV-IE的第一内含子（WO89/01036），兔β-珠蛋白基因的内含子II（van Ooyen et al.）是尤其有利的。对于质粒及除了痘病毒之外的病毒载体的多聚腺苷酸化（多聚A）信号，可使用牛生长激素（bGH）基因的多聚A信号（见美国5,122,458），或兔β-珠蛋白基因的多聚A信号或SV40病毒的多聚A信号。

在本发明的一实施方式中，质粒载体是包括LJM17多核苷酸的pVR2001，如本文实施例1所述。

本发明的另一实施方式中，质粒载体是包括LJL143多核苷酸的pVR2001，如本文实施例2所述。

本发明的另一实施方式中，质粒载体是pNBO002，如本文实施例9所述。

本发明的又一实施方式中，质粒载体是pNBO003，如本文实施例10所述。

更一般而言，本发明包括体内表达载体，其包括任何含编码一种或多种唾液长须罗蛉免疫原及/或其变体或片段的多核苷酸或基因的重组病毒载体，包括任何用于其体内表达的必要元件。

所述重组病毒载体可选自，例如，痘病毒，尤其是禽痘病毒，例如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒。在一实施方式中，鸡痘病毒是TROVAC（见WO96/40241）。另一实施方式中，金丝雀痘病毒载体是ALVAC。使用这些重组病毒载体及插入目的多核苷酸或基因完整描述于，对于鸡痘是：美国5,174,993；美国5,505,941及美国5,766,599，及对于金丝雀痘是：美国5,756,103。病毒基因组内多于一个插入位点可用于插入多个目的基因。

在一实施方式中，病毒载体是腺病毒，例如人腺病毒（HAV）或犬科动物腺病毒（CAV）。

另一实施方式中，病毒载体是人腺病毒，特异为血清型5腺病毒，通过病毒基因组的E1区缺失而无能力复制，尤其是从约核苷酸459至约核苷酸3510（参照Genbank中登录号M73260及参考的出版物Chroboczek et al，1992中公开的hAd5序列）。缺失的腺病毒在表达E1的293细胞（Graham et al.，1977）或PER细胞，尤其是PER.C6细胞（Falloux et al.，1998）中繁殖。人腺病毒可另外缺失E3区，尤其是从约核苷酸28592至约核苷酸30470。缺失E1区可与缺失E3区组合进行（见，例如Shriver et al.；Graham et al.；Ilan et al.；美国专利No.6,133,028及6,692,956；Tripathy et al.；Tapnell；Danthinneet al.；Berkner；Berkner et al.；Chavier et al.）。部分或完全缺失E1及/或E3区之后，插入位点可最终为E1及/或E3座位（区）。有利地，当表达载体是腺病毒，插入待表达的多核苷酸在真核细胞中有功能的启动子控制下，所述启动子例如为强启动子，有利地为巨细胞病毒立即-早期基因启动子（CMV-IE启动子），尤其是从约核苷酸-734至约核苷酸+7的增强子/启动子区（Boshart et al.），或自Promega Corp的pCI载体的增强子/启动子区。CMV-IE启动子有利地为鼠或人来源的。也可使用延伸因子1α启动子。也可使用肌肉特异启动子（Li et al.）。有关质粒载体，本文也讨论强启动子。在一实施方式中，剪接序列可位于增强子/启动子区下游。例如，内含子1分离自CMV-IE基因（Stenberg et al.），分离自兔或人β-珠蛋白基因的内含子，尤其是自β-珠蛋白基因的内含子2，分离自免疫球蛋白基因的内含子，自SV40早期基因的剪接序列或分离自自Promege Corp的pCI载体的嵌合内含子序列。可将多聚A序列及终止子序列插入到待表达的多核苷酸下游，例如牛生长激素基因，尤其是Genbank登录号BOVGHRH的从约核苷酸2339至约核苷酸2550，兔β-珠蛋白基因或SV40晚期基因多聚腺苷酸化信号。

另一实施方式中，病毒载体是犬科动物腺病毒，尤其是CAV-2（见，例如Fischer et al.；美国专利No.5,529,780及5,688,920；WO95/14102）。对于CAV而言，插入位点可在E3区内及/或位于E4区与右ITR区之间的区（见美国专利No.6,090,393及6,156,567）。在一实施方式中，插入子在启动子控制下，例如巨细胞病毒立即-早期基因启动子（CMV-IE启动子）或已描述的人腺病毒载体启动子。可将多聚A序列及终止子序列插入到待表达的多核苷酸下游，例如牛生长激素基因或兔β-珠蛋白基因多聚腺苷酸化信号。

另一实施方式中，病毒载体是疱疹病毒，例如犬科动物疱疹病毒（CHV）或猫科动物疱疹病毒（FHV）。对于CHV而言，插入位点可在胸腺嘧啶激酶基因内，在ORF3内，或在UL43ORF内（见美国6,159,477）。在一实施方式中，插入待表达的多核苷酸到在真核细胞中有功能的启动子的控制下，有利地为CMV-IE启动子（鼠或人）。可将多聚A序列及终止子序列插入到待表达的多核苷酸下游，例如牛生长激素或兔β-珠蛋白基因多聚腺苷酸化信号。

就基于痘病毒载体的重组载体而言，可使用牛痘病毒或减毒的牛痘病毒，（例如，MVA，安卡拉疫苗株在鸡胚胎成纤维细胞上传多于570代后获得的修饰的安卡拉株；见Stickl&Hochstein-Mintzel；Sutter et al.；可获自ATCC VR-1508；或NYVAC，见美国5,494,807，及美国专利No.5,494,807，其中讨论了NYVAC的构建，以及用从哥本哈根株牛痘病毒基因组缺失额外的ORF的NYVAC变异，以及异源编码核酸分子插入到此重组位点，而且，使用匹配的启动子；也见WO96/40241），禽痘病毒或减毒的禽痘病毒（例如金丝雀痘，鸡痘，斑鸠痘，鸽痘，鹌鹑痘，ALVAC或TROVAC；见，例如美国专利No.5,505,941，5,494,807）。减毒的金丝雀痘病毒描述于美国5,756,103（ALVAC）及WO01/05934。也参考涉及减毒的鸡痘株TROVAC的美国5,766,599。参考可获自ATCC登录号VR-111的金丝雀痘。也可用多种鸡痘病毒免疫接种株，例如MERIAL出售的DIFTOSEC CT株及INTERVET出售的NOBILIS VARIOLE疫苗。就用于产生其重组体及如何施用其重组体的方法信息而言，本领域技术人员可参考本文引用的文献及参考WO90/12882，例如就牛痘病毒而言，以上美国专利No.4,769,330，4,722,848，4,603,112，5,110,587，5,494,807，及5,762,938有提及；就鸡痘而言，以上美国专利No.5,174,993，5,505,941及5,766,599有提及；就金丝雀痘而言，以上美国专利No.5,756,103有提及。当表达载体是牛痘病毒时，多核苷酸或待表达的多核苷酸的插入位点有利地在胸腺嘧啶激酶（TK）基因或插入位点，血凝素（HA）基因或插入位点，编码A型包含体的区（ATI）；也见本文引用的文献，尤其是涉及牛痘病毒的那些。对于金丝雀痘情况，插入位点有利地为ORF C3，C5及/或C6；也见本文引用的文献，尤其是涉及金丝雀痘病毒的那些。对于鸡痘的情况，插入位点有利地为ORF F7及/或F8；也见本文引用的文献，尤其是涉及鸡痘病毒的那些。MVA病毒的插入位点有利地见于各种出版物，包括Carroll M.W.et al.；Stittelaar K.J.et al.；Sutter G.et al.；及，在这一点，也需知，完整的MVA基因组描述于Antoine G.，Virology，其能使本领域技术人员使用其他插入位点或其他启动子。有利地，将待表达的多核苷酸插入到特异痘病毒启动子控制下，例如以上牛痘启动子7.5kDa（Cochran etal.），牛痘启动子I3L（Riviere et al.），牛痘启动子HA（Shida），牛痘启动子ATI（Funahashi et al.），牛痘启动子H6（Taylor J.et al.；Guo P.et al.J.；Perkus M.et al.）。

进一步实施方式中，重组病毒载体是表达长须罗蛉唾液LJM17多肽的重组ALVAC金丝雀痘病毒vCP2390-SEQ ID NO：6，如实施例3所述。

进一步实施方式中，重组病毒载体是表达长须罗蛉唾液LJM17多肽的重组ALVAC金丝雀痘病毒vCP2390，如实施例11所述。

进一步实施方式中，重组病毒载体是表达长须罗蛉唾液LJL143多肽的重组ALVAC金丝雀痘病毒vCP2389-SEQ ID NO：2，如实施例4所述。

进一步实施方式中，重组病毒载体是表达长须罗蛉唾液LJL143多肽的重组ALVAC金丝雀痘病毒vCP2389，如实施例12所述。

进一步实施方式中，重组病毒载体是表达长须罗蛉唾液LJM17多肽的重组MVA病毒MVA-LJM17，如实施例5所述。

进一步实施方式中，重组病毒载体是表达长须罗蛉唾液LJL143多肽的重组MVA病毒MVA-LJL143，如实施例6所述。

本文公开的任何多核苷酸可通过DNA转移或表达载体到适宜宿主细胞中来体外表达。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。术语"宿主细胞"也包括任何受试者宿主细胞的后代。现有技术中已知稳定转移的方法，意指在宿主细胞中连续维持外源多核苷酸。宿主细胞可包括细菌（例如，大肠杆菌），酵母，昆虫细胞，及脊椎动物细胞。现有技术中熟知在真核细胞中表达DNA序列的方法。就体外表达方法而言，可将重组杆状病毒载体用于本文公开的核酸（例如，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV））。例如，可在昆虫细胞（例如，草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞，如ATCC登录号CRL1711的Sf9细胞，或Sf21细胞）中利用多角体蛋白启动子（见例如，Smithet al.；Pennock et al.；Vialard et al.；Verne.；O'Reilly et al.；Kidd I.M.&Emery V.C.；EP0370573；EP0265785；美国4,745,051）。对于表达，可使用自Pharmingen的BaculoGold Starter Package（Cat#21001K）（Becton Dickinson）。就体外表达方法而言，可将重组大肠杆菌用于载体。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用可诱导的启动子，例如阿拉伯糖启动子，λ噬菌体的pL，plac，ptrp，ptac（ptrp-lac杂交体启动子）等。用重组DNA转化宿主细胞可通过本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是原核宿主，例如大肠杆菌时，能摄取DNA的感受态细胞可从指数生长期之后收获、及随后通过使用现有技术中已知的过程的CaCl2方法处理的细胞制备。或者，可使用MgCl2或RbCl。转化也可通过电穿孔进行。当宿主是真核生物时，可使用的DNA转导方法例如有磷酸钙共沉淀，常规机械过程，例如微注射，电穿孔，插入包装进脂质体的质粒，或病毒载体。真核细胞也可与长须罗蛉多核苷酸序列，及编码可选择的表型的第二外源DNA分子（例如单纯疱疹胸腺嘧啶激酶基因）共转化。另一方法是使用真核病毒载体（见上），例如疱疹病毒或腺病毒（例如，犬科动物腺病毒2），以瞬时转导真核细胞及表达蛋白（Gluzman EA）。此外，可利用转染剂，例如二油酰基-磷脂酰基-乙醇胺（DOPE）。

重组表达的多肽的分离及纯化可通过常规手段进行，包括制备性层析（例如，大小排阻层析，离子交换层析，亲和层析），选择性沉淀及超滤。可使用现有技术中的例，但不限于，可见于Simon Roe编辑的“Protein Purification Applications”，第二版，且及可从OxfordUniversity Press得到。此重组表达多肽是本公开的一部分。也包括本发明的上述任何多肽的产生方法，尤其是使用包括本文公开的多核苷酸的重组表达载体及宿主细胞。

含本发明的重组病毒载体的疫苗可有利地为与稳定剂冷冻干燥的。冷冻干燥可根据熟知的标准冷冻干燥过程进行。药学或兽医学可接受的稳定剂可为碳水化合物（例如山梨醇，甘露醇，乳糖，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖，海藻糖），谷氨酸钠（Tsvetkov T et al.；Israeli E etal.），蛋白，例如蛋白胨，白蛋白，乳清蛋白或酪蛋白，含蛋白的剂，例如脱脂乳（Mills C K et al.；Wolff E et al.），及缓冲液（例如磷酸缓冲液，碱金属磷酸盐缓冲液）。佐剂可用于制备可溶性冷冻干燥的制剂。

本发明的任何疫苗组合物也可有利地含一种或多种佐剂。

基于质粒的疫苗可与阳离子脂质配制，有利地与DMRIE（N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四氧基)-1-戊烷铵；WO96/34109）配制，及有利地与中性脂质相关，例如DOPE（二油酰基-磷脂酰基-乙醇胺；Behr J.P.），以形成DMRIE-DOPE。在一实施方式中，临时制备混合物，及对于合适的混合物络合而言，在施用之前，等待约10分钟至约60分钟是有利的，例如，约30分钟。当使用DOPE时，DMRIE/DOPE摩尔比可为95/5～5/95，及有利地为1/1。质粒/DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂的重量比为例如，50/1～1/10，10/1～1/5或1/1～1/2。

可任选将细胞因子添加到组合物，尤其是诱导Th1的GM-CSF或细胞因子（例如IL12）。可将这些细胞因子添加到组合物作为编码细胞因子蛋白的质粒。在一实施方式中，细胞因子为犬科动物来源的细胞因子，例如犬科动物GM-CSF，其基因序列已登录在GenBank数据库（登录号S49738）。此序列可用于以类似于WO00/77210中所述的方式构建所述质粒。

基于重组病毒载体的疫苗可与fMLP（N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸；美国6,017,537）及/或卡波姆佐剂（Phameuropa Vol.8，No.2，June1996）组合。本领域技术人员也可参考美国2,909,462，其中描述了与聚羟基化的化合物交联的此丙烯酸聚合物，所述聚羟基化的化合物具有至少3个羟基基团，有利地不多于8个羟基，至少3个羟基的氢原子被不饱和的具有至少2个碳原子的脂肪族自由基取代。例如，自由基是含2～4个碳原子的自由基，例如乙烯，烯丙基及其他烯类（ethylenically）不饱和的基团。不饱和的自由基可本身含其他取代基，例如甲基。商品名为

的产品（BF Goodrich，Ohio，美国）是合适的。产品与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中，可有利地具有提及的

974P，934P及971P。

马来酸酐与烯基衍生物的共聚物之中，共聚物

（Monsanto）（马来酸酐与乙烯的共聚物）线性或交联（例如与二乙烯基醚交联）是有利的。可参考J.Fields et al.。

形成丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物及例如具有上式所示的基本单位的共聚物

其中：

·R₁及R₂，其相同或不同，表示H或CH₃

·x=0或1，优选地x=1

·y=1或2，且x+y=2

就共聚物

而言，x=0、且y=2。就卡波姆而言，x=y=1。

这些聚合物溶解于水中产生酸溶液，其有利地被中和至生理pH，以将佐剂溶液提供到其中，其中已掺入疫苗。聚合物的羧基基团则部分以COO^-形式存在。

在一实施方式中，佐剂溶液，尤其是卡波姆（Pharmeuropa，vol.8，No.2，June1996）制备于蒸馏水中，有利地在氯化钠存在下，获得的溶液为酸性pH。通过将其以几个部分一次全部添加到期望量或其实质部分的添加了NaCl的水（有利地为生理盐水（NaCl9g/l））中来稀释此储存溶液（获得期望的终浓度），且同时或随后有利地用NaOH中和（pH7.3～7.4）。将生理pH的此溶液用于与疫苗混合，其可尤其以冷冻干燥形式，液体形式或冷冻形式储存。

最终疫苗组合物中的聚合物浓度可为0.01%～2%w/v，0.06～1%w/v，或0.1～0.6%w/v。

亚基疫苗可与佐剂组合，如基于矿物油及/或植物油及非粒子表面活性剂（例如嵌段共聚物，

）的水包油，水包油包水乳液。此乳液特别是“Vaccine Design–The Subunit and AdjuvantApproach”，Pharmaceutical Biotechnology，1995的147页描述的那些，或TS乳液，特别是TS6乳液，及LF乳液，特别是LF2乳液（对于TS及LF乳液二者，见WO04/024027）。其他适宜佐剂为例如维生素E，皂苷，及

（Noveon；见WO99/51269；WO99/44633），氢氧化铝或磷酸铝（“Vaccine Design,The subunit and adjuvantapproach”，Pharmaceutical Biotechnology，vol.6，1995），生物学佐剂（即C4b，特别是鼠C4b（Ogata R T et al.）或马科动物C4b，GM-CSF，特别是马科动物GM-CSF（美国6,645,740）），毒素（即霍乱毒素CTA或CTB，大肠杆菌热不稳定毒素LTA或LTB（Olsen CW et al.；Fingerut E et al.；Zurbriggen R et al。Peppoloni S et al.），及CpG（即CpG#2395（见Jurk M et al.），CpG#2142（见EP1,221,955中的SEQ ID NO：890））。

疫苗也可含或包括一种或多种利什曼原虫抗原，例如，动基体目原生动物膜蛋白11（KMP11）。

利什曼原虫KMP11抗原源于，例如，婴儿利什曼原虫或恰加斯利什曼原虫。KMP11是存在于动基体目原生动物全部家族成员，且在无鞭毛体及前鞭毛体形式的利什曼原虫中差异表达的高度保守的表面膜蛋白（Jardim A.et al.；Jardim A.et al.；Berberich C.et al.）。利什曼原虫蛋白KMP11的基因核酸序列及氨基酸序列可从公共数据库获得，特别是GenBank数据库中登录号X95627及X95626的婴儿利什曼原虫。杜氏利什曼原虫的核酸序列也可获自GenBank数据库，特别是登录号S77039的。

有关KMP11的现有技术，表达KMP11的载体及疫苗最好总结于专利申请WO08/064181。包括pVR1020KMP11的基于质粒的疫苗描述于实施例1，而基于金丝雀痘病毒载体的疫苗包括vCP2350，其描述于实施例3。WO08/064181也给出有关佐剂，制剂，剂量及施用途径的信息。

KMP11多肽及其变体或片段可以与提供于白蛉唾液多肽体外表达的相同方式产生，分离及纯化。

在一实施方式中，疫苗包括长须罗蛉唾液多肽及/或其变体或片段，及/或包括编码长须罗蛉多肽及/或其变体或片段的多核苷酸的载体，及/或包括编码自利什曼原虫的KMP11多肽及/或其片段或变体的KMP11多核苷酸的载体。在本实施方式的一个特异、非限制性实施例中，长须罗蛉唾液多肽包括与具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽。在本实施方式的另一特异、非限制性实施例中，多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的长须罗蛉唾液多肽。再一特异、非限制性实施例中，多核苷酸与具有SEQ ID NO：2，4，6，8，12，14，16，18，21，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，89，90，或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性。

在特定实施方式中，疫苗包括长须罗蛉唾液LJM17多肽及/或其变体或片段，及/或包括编码长须罗蛉LJM17多肽及/或其变体或片段的多核苷酸的载体，及/或包括编码自利什曼原虫的KMP11多肽及/或其片段或变体的KMP11多核苷酸的载体。例如，用于LJM17的载体可选自：pVR2001LJM17，pNBO002，vCP2390，vCP2390-SEQ IDNO：6及MVA-LJM17。用于KMP11的载体可选自：pVR1020KMP11及vCP2350。在一实施方式中，疫苗包括质粒pVR2001LJM17及pVR1020KMP11。另一实施方式中，疫苗包括载体vCP2390及vCP2350。又一实施方式中，疫苗包括质粒pNBO002及pVR1020KMP11。又一实施方式中，疫苗包括vCP2390-SEQ ID NO：6及vCP2350。

另一特定实施方式中，疫苗包括长须罗蛉唾液LJL143多肽及/或其变体或片段，及/或包括编码长须罗蛉LJL143多肽及/或其变体或片段的多核苷酸的载体，及/或包括编码利什曼原虫KMP11多肽及/或其变体或片段的多核苷酸的载体。例如，用于LJL143的载体可选自：pVR2001LJL143，pNBO003，vCP2389，vCP2389-SEQ ID NO：2及MVA-LJL143。用于KMP11的载体可选自：pVR1020KMP11及vCP2350。在一实施方式中，疫苗包括质粒pVR2001LJL143及pVR1020KMP11。另一实施方式中，疫苗包括载体vCP2389及vCP2350。又一实施方式中，疫苗包括质粒pNBO003及pVR1020KMP11。又一实施方式中，疫苗包括载体vCP2389-SEQ ID NO：2及vCP2350。

另一特定实施方式中，疫苗包括长须罗蛉唾液LJL143多肽，其变体，其片段，及/或包括编码长须罗蛉LJL143多肽及/或其变体或片段的多核苷酸的载体，及/或长须罗蛉唾液LJM17多肽及/或其变体或片段，及/或包括编码长须罗蛉LJM17多肽及/或其变体或片段的LJM17多核苷酸的载体，及/或利什曼原虫KMP11多肽及/或其变体或片段，及/或包括KMP11多核苷酸或基因的载体。例如，用于LJL143的载体可选自：pVR2001LJL143，pNBO003，vCP2389，vCP2389-SEQID NO：2及MVA-LJL143。用于LJM17的载体可选自：pVR2001LJM17，pNBO002，vCP2390，vCP2390-SEQ ID NO：6及MVA-LJM17。用于KMP11的载体可选自：pVR1020KMP11及vCP2350。在一实施方式中，疫苗包括质粒pVR2001LJL143，pVR2001LJM17及pVR1020KMP11。另一实施方式中，疫苗包括载体vCP2389，vCP2390及vCP2350。又一实施方式中，疫苗包括质粒pNBO003，pNBO002及pVR1020KMP11。另一实施方式中，疫苗包括vCP2389-SEQ ID NO：2，vCP2390-SEQ ID NO：6及vCP2350载体。

疫苗也可相关于至少一种利什曼原虫抗原，例如灭活的利什曼原虫。

在特定实施方式中，利什曼原虫株可为婴儿利什曼原虫，及/或巴西利什曼原虫。在优选实施方式中，利什曼原虫株可为巴西利什曼原虫。

利什曼原虫的这些株可通过化学或物理方法灭活。化学方法特别是BPL，甲醛。物理方法可特别是超声处理。灭活用于疫苗的利什曼原虫的一种方法描述于R.Cordeiro Giunchetti et al.，Vaccine，2007。前鞭毛体在NNN/LIT培养基中培养6～14天，但更优选为10天，直到基于显微镜观察，前鞭毛体前循环形成至前鞭毛体后循环形式之间的分化实现。然后可通过离心收获培养物（2000Xg，20分钟，4℃）。当可应用时，丢弃上清，及将生物质在缓冲盐水中洗涤3次。无论培养物被澄清与否，前鞭毛体悬浮液（即离心之后粗培养物或前鞭毛体重悬浮于缓冲盐水中）随后使用10～375W，但更优选40W的电力，于0℃，通过超声处理破碎1分钟。此处理的批量体积在5与150mL之间，优选为30mL。处理之后，可将裂解物于-80℃储存。

疫苗制剂可从细胞裂解后获得的蛋白浓缩物制备。可用于免疫接种犬科动物的细胞裂解物蛋白量为从约50μg至约2000μg，优选地从约50μg至约600μg。蛋白浓度根据Lowry方法确定。

灭活的利什曼原虫疫苗可与佐剂组合，如之前描述用于亚基疫苗的那些。

在一实施方式中，疫苗包括长须罗蛉唾液多肽及/或其变体或片段，及/或包括长须罗蛉唾液多核苷酸及/或其变体或片段的载体，及/或灭活的利什曼原虫。在本实施方式的一个特异、非限制性实施例中，长须罗蛉唾液多肽包括与具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽。在本实施方式的另一特异、非限制性实施例中，多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的长须罗蛉唾液多肽。再一特异、非限制性实施例中，多核苷酸与具有SEQ ID NO：2，4，6，8，12，14，16，18，21，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，89，90，或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性。

在特定实施方式中，疫苗包括长须罗蛉唾液LJM17多肽及/或其变体或片段，及/或包括LJM17多核苷酸及/或其变体或片段的载体，及/或灭活的利什曼原虫。例如，用于LJM17的载体可选自：pVR2001LJM17，pNBO002，vCP2390，vCP2390-SEQ ID NO：6及MVA-LJM17，及可与灭活的利什曼原虫（选自超声处理的灭活的婴儿利什曼原虫，及/或巴西利什曼原虫）组合。例如，在一实施方式中，疫苗包括vCP2390载体及超声处理的灭活的巴西利什曼原虫。另一实施方式中，疫苗包括vCP2390-SEQ ID NO：6载体及超声处理的灭活的巴西利什曼原虫。

另一特定实施方式中，疫苗包括长须罗蛉唾液LJL143多肽及/或其变体或片段，及/或包括LJL143多核苷酸及/或其变体或片段的载体，及/或灭活的利什曼原虫。例如，用于LJL143的载体可选自：pVR2001LJL143，pNBO003，vCP2389，vCP2389-SEQ ID NO：2及MVA-LJL143。灭活的利什曼原虫可选自超声处理的灭活的婴儿利什曼原虫，及/或巴西利什曼原虫。例如，在一实施方式中，疫苗包括vCP2389载体及超声处理的灭活的巴西利什曼原虫。另一实施方式中，疫苗包括vCP2389-SEQ ID NO：2载体及超声处理的灭活的巴西利什曼原虫。

另一特定实施方式中，疫苗包括长须罗蛉唾液LJL143多肽及/或其变体或片段，及/或包括LJL143多核苷酸及/或其变体或片段的载体，及/或长须罗蛉唾液LJM17多肽及/或其变体或片段，及/或包括LJM17多核苷酸及/或其变体或片段的载体，及/或灭活的利什曼原虫。例如，用于LJL143的载体可选自：pVR2001LJL143，pNBO003，vCP2389，vCP2389-SEQ ID NO：2及MVA-LJL143。用于LJM17的载体可选自：pVR2001LJM17，pNBO002，vCP2390，vCP2390-SEQID NO：6及MVA-LJM17。灭活的利什曼原虫可选自超声处理的灭活的婴儿利什曼原虫，及/或巴西利什曼原虫。在一实施方式中，疫苗包括vCP2389及vCP2390载体及超声处理的灭活的巴西利什曼原虫。另一实施方式中，疫苗包括vCP2389-SEQ ID NO：2及vCP2390-SEQID NO：6载体及超声处理的灭活的巴西利什曼原虫。

本发明的另一方面涉及使用本文公开的疫苗组合物针对利什曼原虫疫苗接种宿主的方法。

宿主可为人，猫科动物（例如，家养猫，小猫，大型猫科动物及野生猫科动物）及犬科动物（例如，狗，母狗，小狗，狐狸，豺，及狼）中的任何一种或全部。在一实施方式中，宿主为犬科动物。

施用途径可为，例如，肌内（IM）或真皮内（ID）或经皮（TD）或皮下（SC）施用。施用手段可为，例如，有针注射器，或无针设备，或与电转移（ET）治疗结合的有针注射器，或与ET治疗结合的无针设备。

本发明的另一方面涉及本发明的基于质粒的疫苗用于施用于利什曼原虫，宿主的用途，其中此施用与ET治疗结合。基于质粒的疫苗有利地肌内施用。施用手段为例如，注射器及针。一个或几种注射可连续施用。几个注射的情况下，它们可相隔2～6周进行，例如，约相隔3周。在一实施方式中，还施用半-年度加强或年度加强。

对于基于质粒的疫苗，有利的施用途径可为ID或IM。此施用可为通过使用有针或有无针设备的注射器，如Dermojet或Biojector（Bioject，Oregon，美国）或Vetjet^TM（Merial）或Vitajet^TM（BiojectInc.），见美国2006/0034867。剂量可为每质粒50μg～500μg。当添加DMRIE-DOPE时，可利用每质粒100μg。当使用犬科动物GM-CSF或其他细胞因子时，编码此蛋白的质粒可以从约200μg至约500μg、且可有利地以200μg的剂量存在。剂量体积可在0.01ml与0.5ml之间，例如，0.25ml。施用可用多点注射提供。

或者，基于质粒的疫苗可通过与电转移（ET）治疗结合的IM途径施用。ET治疗可使用电转移用设备及生产商说明书（即SphergenG250generator（Sphergen SARL，Evry Genopole，France）；

DNA电穿孔系统（Innovio Biomedical Corporation，SanDiego，California，美国））进行。在一实施方式中，电转移用设备具有单极场。场强可为从约50至约250V/cm，从约50至约200V/cm，或从约50至约175V/cm。脉冲持续时间可为从约1至约50ms，或从约15至约25ms。频率可为从约1至约50Hz，或从约5至约15Hz。脉间间隔可为约1～1000ms，或约1～约200ms。脉冲数可为1～20，或5～10。内组织强度可有利地达约2A。电极之间的距离可为从约0.2至约1cm，或从约0.2至约0.5cm。

对于基于重组病毒载体的疫苗，施用途径可有利地为SC或IM或TD或ID。此施用可通过有针或有无针设备的注射器进行，如Dermojet或Biojector（Bioject，Oregon，美国）或Vetjet^TM（Merial）或Vitajet^TM（Bioject Inc.）。剂量可为从约10³pfu至约10⁹pfu每重组痘病毒载体。当载体是金丝雀痘病毒时，剂量可为，例如，从约10⁵pfu至约10⁹pfu，或从约10⁶pfu至约10⁸pfu。剂量体积可为从约0.01ml～0.2ml，及有利地为0.1ml。施用可包括多点注射。

对于IM途径，提供的疫苗体积可为0.2～2ml，尤其是从约0.5～1ml。对于任何本发明的载体利用相同剂量。

对于亚基疫苗，施用途径可有利地为通过SC或IM或TD或ID。此施用可通过有针或有无针设备的注射器进行，如Dermojet或Biojector（Bioject，Oregon，美国）或Vetjet^TM（Merial）或Vitajet^TM（Bioject Inc.）。剂量可为从约50至约500μg，尤其是从约50至约150μg，及更尤其从约50至约100μg。提供的亚基疫苗的体积为0.2～2ml，尤其是约0.5～1ml。

另一方面，本发明涉及疫苗策略，其基于初次-加强施用方案，其中初次-施用及加强施用利用组合物，所述组合物包括药学或兽医学可接受的赋形剂，稀释剂或媒质及包括含及表达长须罗蛉唾液多肽及/或其变体或片段的多核苷酸序列的体内表达载体。

本发明涉及体内表达载体在初次-加强施用方案中的用途，包括初次-施用包括药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂，及含用于体内表达长须罗蛉唾液多肽及/或其变体或片段的多核苷酸序列的体内表达载体的疫苗；之后加强施用包括药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂，含用于体内表达上述白蛉长须罗蛉多肽及/或其变体或片段的多核苷酸序列的体内表达载体的疫苗，以保护宿主免于利什曼病及/或以预防感染的宿主中的疾病进展。

初次-加强方案包括使用至少一种常见的多肽及/或其变体或片段的至少一次初次-施用及至少一次加强施用。用于初次-施用的疫苗可与用作加强疫苗的那些在性质上不同。初次-施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。

施用途径，剂量及体积如之前本文所公开。

初次-加强施用可有利地相隔2～6周进行，例如，相隔约3周。根据一个实施方式，也考虑有利地使用基于病毒载体的疫苗的半-年度加强或年度加强。在第一次施用时，动物有利地为至少6～8周龄。

在特定实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用本发明的基于质粒的疫苗，及至少一次加强-施用本发明的基于重组病毒载体的疫苗。

另一特定实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用本发明的基于重组病毒载体的疫苗，及至少一次加强-施用本发明的亚基疫苗。

另一特定实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用本发明的基于重组病毒载体的疫苗，及至少一次加强-施用本发明的基于质粒的疫苗。

在一实施方式中，本发明涉及疫苗接种易感利什曼原虫的受试者的方法，包括初次-加强施用方案，其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂中包括含用于体内表达唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或它们的混合物的多核苷酸的质粒；之后加强施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括重组病毒载体，所述重组病毒载体包括用于体内表达相同唾液长须罗蛉多肽、其变体、其片段的多核苷酸，以保护受试者免于利什曼病及/或预防感染的受试者的疾病进展。

另一实施方式中，本发明涉及疫苗接种易感利什曼原虫的受试者的方法，包括初次-加强施用方案，其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂中包括重组病毒载体，所述重组病毒载体包括用于体内表达唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或它们的混合物的多核苷酸；之后加强施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括质粒，所述质粒含用于体内表达相同唾液长须罗蛉多肽、其变体、其片段的多核苷酸，以保护受试者免于利什曼病及/或预防感染的受试者的疾病进展。

又一实施方式中，本发明涉及疫苗接种易感利什曼原虫的受试者的方法，包括初次-加强施用方案，其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂中包括重组病毒载体，所述重组病毒载体包括用于体内表达唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或它们的混合物的多核苷酸；之后加强施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括相同的唾液长须罗蛉多肽，其变体，其片段，以保护受试者免于利什曼病及/或预防感染的受试者的疾病进展。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于pVR2001LJM17或pNBO002质粒的疫苗，及至少一次加强-施用基于vCP2390或vCP2390-SEQ ID NO：6载体的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于pVR2001LJL143或pNBO003质粒的疫苗，及至少一次加强-施用基于vCP2389或vCP2389-SEQ ID NO：2载体的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于pVR2001LJL143及pVR2001LJM17质粒的疫苗，及至少一次加强-施用基于vCP2389及vCP2390载体的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于pNBO003及pNBO002质粒的疫苗，及至少一次加强-施用基于vCP2389-SEQ ID NO：2及vCP2390-SEQ ID NO：6载体的疫苗。

又一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于pVR2001LJM17或pNBO002质粒的疫苗，及至少一次加强-施用基于MVA-LJM17载体的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于pVR2001LJL143或pNBO003质粒的疫苗，及至少一次加强-施用基于MVA-LJL143载体的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于pVR2001LJL143及pVR2001LJM17质粒的疫苗，及至少一次加强-施用基于MVA-LJL143及MVA-LJM17载体的疫苗。

又一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于pNBO003及pNBO002质粒的疫苗，及至少一次加强-施用基于MVA-LJL143及MVA-LJM17载体的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于vCP2390或vCP2390-SEQ ID NO：6载体的疫苗，及至少一次加强-施用LJM17多肽亚基疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于vCP2389或vCP2389-SEQ ID NO：2载体的疫苗，及至少一次加强-施用LJL143多肽亚基疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于vCP2389或vCP2389-SEQ ID NO：2及vCP2390或vCP2390-SEQID NO：6载体的疫苗，及至少一次加强-施用LJL143多肽及LJM17多肽亚基疫苗。

又一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于MVA-LJM17载体的疫苗，及至少一次加强-施用LJM17多肽亚基疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于MVA-LJL143载体的疫苗，及至少一次加强-施用LJL143多肽亚基疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于MVA-LJL143及MVA-LJM17载体的疫苗，及至少一次加强-施用LJL143多肽及LJM17多肽亚基疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于vCP2390或vCP2390-SEQ ID NO：6载体的疫苗，及至少一次加强-施用基于pVR2001LJM17或pNBO002质粒的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于vCP2389或vCP2389-SEQ ID NO：2载体的疫苗，及至少一次加强-施用基于pVR2001LJL143或pNBO003质粒的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于vCP2389及vCP2390载体的疫苗，及至少一次加强-施用基于pVR2001LJL143及pVR2001LJM17质粒的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于vCP2389-SEQ ID NO：2及vCP2390-SEQ ID NO：6载体的疫苗，及至少一次加强-施用基于pNBO003及pNBO002质粒的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于MVA-LJM17载体的疫苗，及至少一次加强-施用基于pVR2001LJM17或pNBO002质粒的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于MVA-LJL143载体的疫苗，及至少一次加强-施用基于pVR2001LJL143或pNBO003质粒的疫苗。

另一实施方式中，初次-加强施用方案包括至少一次初次-施用基于MVA-LJL143及MVA-LJM17载体的疫苗，及至少一次加强-施用基于pNBO003及pNBO002质粒的疫苗。

本发明的另一方面涉及本发明的用于初次-加强免疫接种的试剂盒。试剂盒可包括至少2个瓶：第一瓶含本发明的初次-免疫接种用疫苗，及第二瓶含本发明的加强-免疫接种用疫苗。试剂盒可有利地含用于额外的初次-免疫接种或额外的加强-免疫接种的额外的第一或第二瓶。

在一实施方式中，试剂盒可包括2个瓶，一瓶含本发明的基于质粒的初次-免疫接种用疫苗，另一瓶含本发明的基于重组病毒载体的加强-免疫接种用疫苗。

另一实施方式中，试剂盒可包括2个瓶，一瓶含本发明的基于重组病毒载体的初次-免疫接种用疫苗，另一瓶含本发明的加强-免疫接种用亚基疫苗。

另一实施方式中，试剂盒可包括2个瓶，一瓶含本发明的基于重组病毒载体的初次-免疫接种用疫苗，另一瓶含本发明的基于质粒的加强-免疫接种用疫苗。

本文公开，经历抗-利什曼原虫DTH反应转变的个体的抗长须罗蛉唾液蛋白抗体也增加。因此，有或无对长须罗蛉唾液蛋白的抗体可用于确定受试者是否具有利什曼原虫感染。

本文公开了通过检测有特异性结合具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87所示的氨基酸序列的一种或多种多肽，或与这些多肽之一具有至少80%，至少90%，至少95%，或至少99%同源性的多肽，这些多肽之一的保守变体，同源物或免疫原性片段的抗体来诊断感染利什曼原虫的方法。所述方法可利用单个长须罗蛉多肽或这些多肽的组合。某些实施例中，所述诊断方法检测特异性结合这些多肽中的至少3，6，或10种，或其免疫原性片段的抗体。

在一实施方式中，一种或多种长须罗蛉多肽可结合到固体基材。例如，具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，或87所示的氨基酸序列的长须罗蛉多肽可结合到基材。这些多肽中的一种或多种可结合到基材，例如这些多肽中的至少3，6，或10种，或其免疫原性片段。在一实施例中，具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，25，33，39，47，或77所示的序列的一种或多种多肽可结合到基材。另一实施例中，具有SEQ ID NO：1，3，5，7，11，13，15，17，或57所示的序列的一种或多种长须罗蛉多肽可结合到基材。在一个特异、非限制性实施例中，至少6种长须罗蛉多肽结合到固体基材，其中多肽中的每一种包括SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：1（或3，或11，或13），SEQ ID NO：5（或7，或15，或17），SEQ IDNO：47，SEQ ID NO：73，或SEQ ID NO：77，或其免疫原性片段所示的氨基酸序列。在另一特异、非限制性实施例中，至少3种长须罗蛉多肽结合到固体基材，其中多肽中的每一种包括SEQ ID NO：1（或3，或11，或13），SEQ ID NO：5（或7，或15，或17），或SEQ ID NO：57，或其免疫原性片段所示的氨基酸序列。

在一实施方式中，将2种或多种（例如至少3，6，或10种）长须罗蛉多肽（或其免疫原性片段）施加于固体基材，例如成一系列“点”，例如以“点斑”试验。另一实施方式中，将2种或多种长须罗蛉多肽例如以线性阵列施加于基材。进一步实施方式中，将长须罗蛉多肽以2-维阵列施加于膜。此实施方式中，评估有针对多于一种长须罗蛉多肽的抗体。可将各长须罗蛉多肽以单个位置或以位置的组合直接施加于膜表面。

固体基材可为聚苯乙烯珠，膜，芯片或板。可利用塑料或玻璃基材。其他实施方式中，利用组成于多孔材料，例如尼龙，硝酸纤维素，醋酸纤维素，玻璃纤维，及其他多孔聚合物的膜。固体支持物表面可通过导致多肽与支持物共价键合的化学方法来活化。但是，可将任何其他适宜方法用于将多肽固定到固体支持物，包括，但不限于，粒子相互作用，疏水性相互作用，共价相互作用等。一旦将多肽施加于基材，基材可与物质接触，所述物质例如含蛋白的溶液，其非特异性饱和其上的结合位点。含蛋白的溶液的特异的，非限制性实施例包括由奶粉或血清白蛋白（例如牛血清白蛋白）制成的溶液。

然后将样本（例如，血清，血，血浆，尿，精液，唾液，痰，泪液，淋巴液）添加到基材，及将组合的样本与基材温育足够的时间，以使特异结合。然后使用本领域技术人员已知的任何手段检测抗体特异结合到本文公开的长须罗蛉多肽。在一实施方式中，将标记的第二抗体用于检测特异性结合长须罗蛉多肽的抗体。标记物可为放射性标记物（例如，¹²⁵I），酶标记物（例如，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶），或荧光标记物（例如，异硫氰酸荧光素）。用于这些标记物的检测系统是本领域技术人员已知的。样本或样本成分与长须罗蛉多肽的结合，如标记物的存在所指示，指示感染利什曼原虫。

另一实施方式中，样本吸附到含多肽（例如抗体分子）结合位点的固体基材。在一实施方式中，固体基材是聚苯乙烯珠，芯片，膜或板。之后基材与物质（例如非特异性饱和其上结合位点的含蛋白的溶液）接触。然后将基材用缓冲液洗涤。然后将一种或多种长须罗蛉多肽溶液添加到结合的样本。在一实施方式中，长须罗蛉多肽是直接标记的。可通过使用任何标记物实现长须罗蛉多肽的标记，例如通过掺入放射性同位素或基团，或通过将此成分与酶，染料，例如发色部分或荧光基团偶联。使用的酶是可通过色度法，分光光度法，或荧光法测定的酶。用于本发明的酶的非限制性实施例包括选自氧化还原酶的酶，例如过氧化氢酶，过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-葡萄糖醛酸糖苷酶，β-D-葡萄糖苷酶，β-D-半乳糖甘酶，尿素酶及半乳糖氧化酶。标记的长须罗蛉多肽与固体基材温育之后，通过洗涤除去任何未结合的标记的长须罗蛉多肽。然后通过合适的试验检测结合的标记的长须罗蛉多肽。标记的长须罗蛉多肽结合到样本，或样本成分，指示感染利什曼原虫。

通常，用于实施所述方法的温育步骤可用已知方式进行，例如通过于约4℃与约25℃之间的温度温育约30分钟至约48小时。洗涤可包括用水溶液例如缓冲液，其中缓冲液从约pH6至约pH8，例如通过使用pH约7的等渗盐水溶液。

比较结合试验也用于检测感染利什曼原虫。本领域技术人员基于本文公开的长须罗蛉多肽，将容易能设计额外的试验，例如，用于检测利什曼原虫感染的比较结合试验。

另一实施方式中，本文公开的长须罗蛉多肽可包括在诊断性测试试剂盒内。例如，用于检测利什曼原虫感染的诊断性测试试剂盒包括具有施加了一种或多种本文公开的长须罗蛉多肽的固体基材。其他实施方式中，试剂盒包括书面的使用说明及/或容器，所述容器包括针对免疫球蛋白（例如IgG或IgM）的指定量的标记的抗体，或结合自目的物种的抗体的标记的第二抗体。例如，可提供特异性检测狗或人免疫球蛋白的标记的抗体。标记的抗体可被荧光标记，酶标记，或放射性标记。用于上述测试试剂盒的标记的抗体可包装进溶液或适宜复原的冻干形式。

另一实施方式中，测试试剂盒在容器中包括指定量的本文所述的一种或多种长须罗蛉多肽，及书面使用说明。在一实施例中，长须罗蛉多肽被直接标记。另一实施例中，一种或多种长须罗蛉多肽未标记。如果长须罗蛉多肽未标记，容器也可包括特异性结合长须罗蛉多肽的检测剂，例如标记的单克隆抗体。试剂盒也可任选包括用于结合样本的固体基材。

用于检测针对本文公开的长须罗蛉多肽的抗体的上述方法及测试试剂盒可在许多应用中利用，包括，但不限于，使用本文公开的方法检测受试者的利什曼原虫感染。本文公开的测试及试剂盒可用于检测受试者中治疗性治疗的效力。又一实施方式中，本文公开的测试及试剂盒也可用于通过从感染的受试者取得体液（例如在感染后各次）及应用上述检测过程来评价首次感染利什曼原虫或预测从利什曼原虫感染恢复。

***

以下通过参照下列非限制性实施例进一步描述本发明。

【实施例】

无需进一步详述，本领域技术人员也可使用之前的说明充分实施本发明。以下的详细实施例仅旨在说明，不旨在以任何方式限制之前的公开。本领域技术人员将从涉及反应物及反应条件及技术的过程快速识别合适的变型。

DNA插入子，质粒及重组病毒载体的构建使用描述于J.Sambrook et al.的标准分子生物学技术进行（分子克隆：A LaboratoryManual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，1989）。用于本发明的全部限制性片段使用"Geneclean"试剂盒分离（BIO101Inc.，La Jolla，Calif.）。

【实施例1】表达长须罗蛉唾液LJM17多肽的pVR2001LJM17质粒的构建

合成编码长须罗蛉LJM17多肽的多核苷酸，及其具有描述于SEQID NO：8的序列，其含多聚A尾。通过PCR扩增LJM17片段，及克隆进pVR2001-TOPA供体质粒的TOPO克隆位点（也被称为pVR2001-TOPO）。

得到的质粒，pVR2001LJM17因此含及表达编码能驱动在哺乳动物细胞中表达的启动子，用于辅助原核蛋白序列从哺乳动物细胞分泌/释放的前导肽，LJM17，侧翼于编码LJM17的DNA的拓扑异构酶，以及终止序列的核苷酸。

质粒pVR2001LJM17的一条链的核酸序列描述于SEQ ID NO：9及图1，其中BamHI位点在位置〔4～9〕及〔5051～5056〕中，编码tPA信号肽的核苷酸序列在位置〔4976～5062〕中，及编码LJM17的核苷酸序列在位置〔5063～6247〕中。

【实施例2】表达长须罗蛉唾液LJL143多肽的pVR2001LJL143质粒的构建

合成编码长须罗蛉LJL143多肽的多核苷酸，及其具有描述于SEQ ID NO：4的序列，其含多聚A尾。通过PCR扩增LJL143片段，及克隆进如实施例1所述的pVR2001-TOPA质粒的TOPO克隆位点，以产生质粒pVR2001LJL143。

质粒pVR2001LJL143的一条链的核酸序列描述于SEQ ID NO：10及图2中，其中BamHI位点在位置〔4～9〕及〔5051～5056〕中，编码tPA信号肽的核苷酸序列在位置〔4976～5062〕中，及编码LJL143的核苷酸序列在位置〔5063～5899〕中。

【实施例3】表达长须罗蛉唾液LJM17多肽的ALVAC金丝雀痘病毒载体的构建

质粒pALVAC，及C3座位的讨论及实施例，见例如美国专利No.5,756,103；5,833,975；及6,780,407。牛痘病毒H6启动子序列已之前描述（见例如Taylor et al.；Taylor et al.；Guo et al.）。

合成编码长须罗蛉LJM17多肽的多核苷酸，及其具有描述于SEQID NO：6的序列。然后将此多核苷酸连接到pALVAC C3H6p供体质粒，产生含5737个碱基对的pALVAC C3H6p-LJM17（图3）。

为产生vCP2390-SEQ ID NO：6，用NotI限制性内切酶线性化pALVAC C3H6p-LJM17质粒。将线性化片段使用磷酸钙沉淀法个别转染进感染ALVAC的原代CEF细胞（见，Panicali et al.；Piccini etal.）。24h之后，收获转染细胞，超声处理及用于重组病毒筛选。

基于噬斑原位杂交法，使用用辣根过氧化物酶标记的长须罗蛉LJM17-特异探针，根据生产商提供的流程（AmershamCat#RPN-3001）筛选重组噬斑。相继3轮噬斑纯化之后，通过杂交确定对于长须罗蛉LJM17插入子为100%阳性，及对于C3ORF为100%阴性，则产生重组体。

从第三轮噬斑纯化挑选单个噬斑，及扩展以获得P1（60mm），P2（T75瓶），及P3（滚筒）储存液以扩增vCP2390-SEQ ID NO：6。从滚筒收获感染的细胞培养物流体及浓缩，以产生病毒储存液。

测序构建体，以确认vCP2390-SEQ ID NO：6中长须罗蛉LJM17插入子周围的长须罗蛉LJM17插入子及C3左及右臂序列。

【实施例4】表达长须罗蛉唾液LJL143多肽的ALVAC金丝雀痘病毒载体的构建

合成编码长须罗蛉LJL143多肽的多核苷酸，及其具有描述于SEQ ID NO：2的序列。然后将此序列连接到pALVAC C3H6p供体质粒。产生的质粒，pALVAC C3H6p-LJL143包括5400个碱基对（图5），及测序，以确认LJL143基因的核酸序列（SEQ ID NO：2）。

为产生vCP2389-SEQ ID NO：2，用NotI限制性内切酶线性化pALVAC C3H6p-LJL143质粒。通过使用磷酸钙沉淀法将线性化片段个别转染进感染ALVAC的原代CEF细胞（见，Panicali et al.；Picciniet al.）。24h之后，收获转染细胞，超声处理及用于重组病毒筛选。

基于噬斑原位杂交法，使用用辣根过氧化物酶标记的长须罗蛉LJL143-特异探针，根据生产商提供的流程（AmershamCat#RPN-3001）筛选重组噬斑。相继3轮噬斑纯化之后，通过杂交确定对于长须罗蛉LJL143插入子为100%阳性及对于C3ORF为100%阴性，则产生重组体。

从第三轮噬斑纯化挑选单个噬斑，及扩展以获得P1（60mm），P2（T75瓶），P3（滚筒）储存液以扩增vCP2389-SEQ ID NO：2。从滚筒收获感染的细胞培养物流体及浓缩，以产生病毒储存液。

测序构建体，以确认vCP2389-SEQ ID NO：2中长须罗蛉LJL143插入子周围的长须罗蛉LJL143插入子及C3左及右臂序列。

【实施例5】表达长须罗蛉唾液LJM17多肽的MVA载体的构建

MVA是将安卡拉疫苗株在鸡胚胎成纤维细胞上传多于570代之后获得的修饰的安卡拉株（见Stickl&Hochstein-Mintzel；Sutter etal.），其可从ATCC VR-1508获得。其适应于这些细胞导致在此细胞类型的发育及感染循环中非必需的6个区切除（约15%的病毒基因组消失；Meyer et al.）。可将外源遗传物质插入任何这些切除区。本发明中，外源遗传物质被插入切除物II及III，它们分别使用HindIII限制性片段N和A定位（Altenburger et al.）。

如之前描述于Staib C.et al.进行表达LJM17的重组MVA病毒的工程改造，除了723个碱基对的含gfp ORF的DNA片段被编码LJM17抗原的1239个碱基对DNA片段（SEQ ID NO：6）取代之外，产生MVA-LJM17。

【实施例6】表达长须罗蛉唾液LJL143多肽的MVA载体的构建

如之前描述于Staib C.et al.进行表达LJL143的重组MVA病毒的构建，除了723个碱基对的含gfp ORF的DNA片段被906个碱基对的编码LJL143抗原的DNA片段（SEQ ID NO：2）取代之外，产生MVA-LJL143。

【实施例7】长须罗蛉唾液蛋白的体外表达

构建含His-标记的源于质粒pVR2001LJM17（见实施例1）及pVR2001LJL143（见实施例2）的cDNA编码的长须罗蛉唾液抗原的表达质粒，及转染进HEK-293F细胞。使用镍柱及咪唑梯度，通过HPLC层析分析72h时收集的上清。用之前用相应原cDNA质粒免疫的小鼠的多克隆血清测试对C-端有6×His基序的重组唾液蛋白呈阳性的HPLC级分。通过SDS-PAGE及蛋白印迹测试重组蛋白，等分于PBS及储存于-70℃。

包括LJM17的亚基疫苗在本文称为rLJM17。通过组合100μg纯化的重组蛋白LJM17与20%

（MVP laboratories）中的300μg佐剂CpG#2142来制备疫苗（对于CpG#2142，见EP-B1-1,221,955中的SEQ ID NO：890）。

包括LJL143的亚基疫苗在本文称为rLJL143。通过组合100μg纯化的重组蛋白LJL143与20%

中的300μg佐剂CpG#2142来制备疫苗。

【实施例8】抗利什曼病免疫接种狗

将25只狗（1～2年龄雌性小猎犬）随机分为5组，每组5只狗。对自组1～4的全部狗，在D0（V1），将500μg纯化的表达LJM17的pVR2001LJM17质粒（实施例1）（组1及2）或表达LJL143的pVR2001LJL143质粒（实施例2）（组3及4），通过真皮内（ID）途径使用注射器及针疫苗接种到耳廓。

给自组1及组3的狗，在D14（V2）及D28（V3），将500μg与V1所用相同的质粒，通过经皮（TD）途径，使用VetJet^TM（Merial）无针递送装置，加强施用到两条后腿的内侧上部。给自组1及组3的狗，还在D42（V4），将500μg相同质粒，通过肌内途径，与电穿孔（ET/IM）结合，使用Sphergen装置及技术（参数：88V，T1=20，T2=80，N=10）加强施用到两条大腿外侧。

给自组2及4的狗，在D14（V2）及D28（V3），将500μg与V1所用相同的质粒，通过IM途径，与电穿孔（ET/IM）结合，如上所述加强。给自组2及4的狗，还在D42（V4），通过ID途径，如上所述分别将亚基疫苗（见实施例7）rLJM17（组2）或rLJL143（组4）加强施用到耳廓。

自组1及2的全部狗，在D192（V5），通过IM途径，在左四头肌，使用10⁸pfu的表达LJM17的重组金丝雀痘病毒vCP2390（实施例3）接受最终疫苗加强。自组3及4的全部狗在D192（V5），通过IM途径，在左四头肌，使用10⁸pfu的表达LJL143的重组金丝雀痘病毒vCP2389（实施例4）接受最终疫苗加强。

自组5的狗在D0通过ID，在D14通过TD，在D28通过TD及在D42通过ET/IM疫苗接种500μg纯化的亲源质粒pVR2001（其不表达抗原），及在D192，通过IM途径，使用10⁸pfu的对照重组金丝雀痘病毒（Purevax^TM）接受最终加强。

【实施例9】表达长须罗蛉唾液LJM17多肽的pNBO002质粒的构建

合成编码长须罗蛉LJM17多肽的核酸序列，及其具有描述于SEQID NO：18的序列，其含多聚A尾。通过PCR扩增LJM17片段，及如实施例1所述克隆进pVR2001-TOPA供体质粒的TOPO克隆位点，以产生质粒pNBO002。

质粒pNBO002的一条链的核酸序列描述于SEQ ID NO：19及图11，其中BamHI位点在位置〔1819～1824〕及〔3019～3024〕中，编码tPA信号肽的核苷酸序列在位置〔1744～1830〕中及编码LJM17的核苷酸序列在位置〔1831～3015〕中。pNBO002质粒的图谱显示于图12。

pNBO002类似于pVR2001LJM17。此情况中，此构建体及实施例1的构建体由于它们的插入子的核酸序列分别为SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：8而可区分。

【实施例10】表达长须罗蛉唾液LJL143多肽的pNBO003质粒的构建

合成编码长须罗蛉LJL143的核酸序列，及其具有描述于SEQ IDNO：14的序列，其含多聚A尾。通过PCR扩增LJL143片段，及如实施例1所述克隆进pVR2001-TOPA质粒的TOPO克隆位点，以产生质粒pNBO003。

质粒pNBO003的一条链的核酸序列描述于SEQ ID NO：20及图13，其中BamHI位点在位置〔1819～1824〕及〔2671～2676〕中，编码tPA信号肽的核苷酸序列在位置〔1744～1830〕中，及编码LJL143的核苷酸序列在位置〔1831～2667〕中。pNBO003质粒的图谱显示于图14。

pNBO003类似于pVR2001LJL143。此情况中，此构建体及实施例2的构建体由于它们的插入子的核酸序列分别为SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：4而可区分。

【实施例11】表达长须罗蛉唾液LJM17多肽的ALVAC金丝雀痘病毒载体的构建

质粒pALVAC及C3座位的讨论及实施例见例如美国专利No.5,756,103；5,833,975；及6,780,407。牛痘病毒H6启动子序列已之前描述（见例如Taylor et al.；Taylor et al.；Guo et al.）。

合成编码长须罗蛉LJM17多肽的核酸序列，及其具有描述于SEQID NO：6的序列。此序列经密码子优化，以通过Geneart GmbH（Regensburg，Germany）在哺乳动物中表达，产生描述于SEQ IDNO：91的序列，其编码LJM15多肽（SEQ ID NO：5）。

然后将此密码子-优化的序列连接到pALVAC C3H6p供体质粒，以产生含5737个碱基对的pALVAC C3H6p-LJM17（图3）。测序产生的质粒，pALVAC C3H6p-LJM17，及确认含LJM17基因的核酸序列（SEQ ID NO：91）。

为产生vCP2390，用NotI限制性内切酶线性化pALVAC C3H6p-LJM17质粒。将线性化片段通过使用之前描述的磷酸钙沉淀法个别转染进感染ALVAC的原代CEF细胞（Panicali et al.；Piccini et al.）。24h之后，收获转染细胞，超声处理及用于重组病毒筛选。

基于噬斑原位杂交法，使用长须罗蛉的合成的LJM17-特异探针（其经辣根过氧化物酶标记），根据生产商提供的流程（AmershamCat#RPN-3001）筛选重组噬斑。相继3轮噬斑纯化之后，通过杂交确认对于合成的LJM17插入子为100%阳性及对于C3ORF为100%阴性，则产生重组体。

从第三轮噬斑纯化挑选单个噬斑，及扩展以获得P1（60mm），P2（T75瓶），P3（滚筒）储存液以扩增vCP2390。从滚筒收获感染的细胞培养物流体及浓缩，以产生病毒储存液。

测序构建体，以确认vCP2390中密码子-优化的LJM17插入子周围的密码子-优化的LJM17插入子及C3左及右臂序列。

vCP2390载体显示于图4。两条vCP2390链的核酸序列描述于图4。

【实施例12】表达长须罗蛉唾液LJL143多肽的ALVAC金丝雀痘病毒载体的构建

合成编码长须罗蛉LJL143的核酸序列，及其具有描述于SEQ IDNO：2的序列。此序列经密码子优化，以通过Geneart GmbH（Regensburg，Germany）在哺乳动物中表达，产生的序列描述于SEQID NO：22，其编码LJL143蛋白（SEQ ID NO：1）。

然后将此密码子-优化的序列连接到pALVAC C3H6p供体质粒，产生含5400个碱基对的pALVAC C3H6p-LJL143（图5），对其测序及确认含LJL143基因的核酸序列（SEQ ID NO：22）。

为产生vCP2389，用NotI限制性内切酶线性化质粒pALVAC C3H6p-LJL143质粒。将线性化片段通过使用磷酸钙沉淀法个别转染进感染ALVAC的原代CEF细胞（见，Panicali et al.；Piccini et al.）。24h之后，收获转染细胞，超声处理及用于重组病毒筛选。

基于噬斑原位杂交法，使用长须罗蛉的合成的LJL143-特异探针（其经辣根过氧化物酶标记），根据生产商提供的流程（AmershamCat#RPN-3001）筛选重组噬斑。相继3轮噬斑纯化之后，确认通过杂交对合成的LJL143插入子为100%阳性及对于C3ORF为100%阴性，则产生重组体。

从第三轮噬斑纯化挑选单个噬斑，及扩展以获得P1（60mm），P2（T75瓶），P3（滚筒）储存液以扩增vCP2389。从滚筒收获感染的细胞培养物流体及浓缩，以产生病毒储存液。

测序之后，结果显示，vCP2389中合成的LJL143插入子周围的合成的LJL143插入子及C3左及右臂序列是正确的。

vCP2389载体显示于图6。

【实施例13】长须罗蛉唾液蛋白的体外表达

构建含His-标记的源于质粒pNBO002（见实施例9）及pNBO003（见实施例10）的cDNA编码的长须罗蛉唾液抗原的表达质粒，及转染进HEK-293F细胞。使用镍柱及咪唑梯度，通过HPLC层析分析72h时收集的上清。用之前用相应原cDNA质粒免疫的小鼠的多克隆血清测试对C-端有6×His基序的重组唾液蛋白呈阳性的HPLC级分。通过SDS-PAGE及蛋白印迹测试重组蛋白，等分于PBS及储存于-70℃。

包括LJM17的亚基疫苗在本文称为rLJM17。通过组合100μg纯化的重组蛋白LJM17与20%

（MVP laboratories）中的300μg佐剂CpG#2142来制备疫苗（对于CpG#2142，见EP1,221,955中的SEQ ID NO：890）。

包括LJL143的亚基疫苗在本文称为rLJL143。通过组合100μg纯化的重组蛋白LJL143与20%

中的300μg佐剂CpG#2142来制备疫苗。

【实施例14】抗利什曼病免疫接种狗

将25只狗（1～2年龄雌性小猎犬）随机分为5组，每组5只狗。对自组1～4的全部狗，在D0（V1），分别将500μg纯化的表达LJM17抗原的pNBO002质粒（实施例9）（组1及2）或表达LJL143抗原的pNBO003质粒（实施例10）（组3及4），通过真皮内（ID）途径，使用注射器及针疫苗接种到耳廓。

给自组1及组3的狗，在D14（V2）及在D28（V3），将500μg与V1所用相同的质粒，通过经皮（TD）途径，使用VetJet^TM（Merial）无针递送装置，加强施用到两条后腿的内侧上部。给自组1及组3的狗，还在D42（V4），将500μg相同质粒，通过肌内途径，与电穿孔（ET/IM）结合，使用Sphergen装置及技术（参数：88V，T1=20，T2=80，N=10）加强施用到两条大腿外侧。

给自组2及4的狗，在D14（V2）及在D28（V3），将500μg与V1所用相同的质粒，通过IM途径，与电穿孔（ET/IM）结合，如上所述加强。给自组2及4的狗，还在D42（V4），通过ID途径，如上所述分别将亚基疫苗（见实施例13）rLJM17（组2）或rLJL143（组4）加强施用到耳廓。

自组1及2的全部狗，在D192（V5），通过IM途径，在左四头肌，使用10⁸pfu的表达LJM17的重组金丝雀痘病毒vCP2390（实施例11，具有SEQ ID NO：21作为插入子）接受最终疫苗加强。自组3及4的全部狗，在D192（V5），通过IM途径，在左四头肌，使用10⁸pfu的表达LJL143的重组金丝雀痘病毒vCP2389（实施例12，具有SEQ ID NO：22作为插入子）接受最终疫苗加强。

自组5的狗在D0通过ID，在D14通过TD，在D28通过TD及在D42通过ET/IM疫苗接种500μg纯化的亲源质粒VR2001（其不表达抗原），及在D192，通过IM途径，使用10⁸pfu的对照重组金丝雀痘病毒（Purevax^TM）接受最终加强。

通过对疫苗接种的狗的ELISA证实了对LJM17及LJL143的特异及显著的体液免疫（见图7）。将96孔板（Maxisorp^TM，Nunc）用rLJM17蛋白（2μg/mL）或rLJL143（2μg/mL）于4℃包被过夜。与1/5000的缀合了碱性磷酸酶的AffiniPure兔抗-狗IgG（JacksonImmunoResearch）及对硝基苯磷酸酯（Sigma）一同，将狗血清1/50稀释液以一式三份连续添加到板。使用Spectramax Plus（MolecularDevices）测量405nm处的吸光度。

V4施用之后显著的抗体效价持续达6个月。vCP加强（V5）在疫苗接种的狗中有效重启特异抗体反应。vCP之后的既往症反应建立了分别从vCP2389及vCP2390的LJL143及LJM17表达，及载体加强体内体液免疫应答的能力。

通过2对唾液腺匀浆（SGH），LJL143（4μg），及LJM17（4μg），或通过ConA（4μg）刺激V5施用之后2周时从狗取得的PBMC。用培养基（med）非刺激的PBMC作为对照。通过测量72小时时培养基中IFN-γ分泌水平来评估IFN-γ产生（Quantikine ELISA；R&D系统）。

结果显示于图8。添加纯化的重组LJM17或LJL143蛋白导致自LJM17-或LJL143-疫苗接种的狗的PBMC增加IFN-γ分泌。在对照培养基（med）存在下PBMC被证明无IFN-γ的升高的分泌。

将ConA或SGH添加到自LJM17-或LJL143-疫苗接种的狗的PBMC也引发IFN-γ的升高的分泌。特别是，LJM17抗原在组2的在动物中引发非常强的INF-γ反应（1800pg/mL），及也在组1的动物中引发强反应（200pg/mL）。LJL143抗原也在组3及4的动物中引发非常强的INF-γ反应，大于2000pg/mL，其可与见于用ConA刺激PBMC的结果比较。

V5施用之后2周，从2只已疫苗接种LJM17及LJL143的狗分离PBMC。用25μg重组LJM17，25μg重组LJL143，或4μg ConA刺激自体T细胞淋巴细胞（5×10⁶细胞）。然后在感染恰加斯利什曼原虫无鞭毛体（以5:1比感染）的巨噬细胞存在下温育细胞。脂多糖（LPS）及非刺激T细胞（NT，无处理）作为对照。评估细胞的杀效率，其通过感染的巨噬细胞百分率显著减少来测量（图9）。

用重组LJM17或重组LJL143刺激的淋巴细胞如已用非特异性丝裂原ConA刺激的淋巴细胞一样对巨噬细胞有细胞毒性。

使疫苗接种LJL143及LJM17的狗及对照狗适合于Velcro颈环装置。Velcro颈环装置通过处理20只未感染的6日龄雌性长须罗蛉来制备，所述长须罗蛉在10mm-薄的Plexiglas装置中，所述装置在其一侧含固定用螺丝钉及尼龙网，从而白蛉能通过网探查。装置在暴露于限制浓缩之前保持在25℃，然后在疫苗接种LJL143及LJM17的狗及对照狗的刮了毛的腹部牢固附着到Velcro颈环10分钟。狗在整个暴露期间不受限制。从白蛉叮咬之后48小时时的麻醉的狗腹部取得4mm或6mm-皮肤钻取活组织检查（Acuderm）。

将活组织检查储存于中性-缓冲的甲醛（10%福尔马林），然后常规加工，以用苏木素/曙红（H&E），Luna氏，Toludine蓝及免疫组织化学过程就CD3及巨噬细胞/单核细胞标记物（Mac）染色。图10提供白蛉叮咬处的免疫组织化学结果。在疫苗接种的狗观察到特异免疫细胞渗入（照片中的暗斑），而在对照狗中观察到无渗入。

【实施例15】用LJL143及LJM17唾液蛋白免疫接种狗产生体外杀恰加斯利什曼原虫无鞭毛体的保护性免疫应答

此研究中，测试长须罗蛉唾液蛋白，以测定它们是否在狗中有免疫原性。此外，鉴定可在体外试验中产生保护性细胞免疫应答及杀婴儿利什曼原虫的长须罗蛉唾液蛋白。

为鉴定这些唾液成分，开发了体内高通量的基于DNA的反抗原-筛选试验。此筛选在长须罗蛉唾液腺中的35种最丰蛋白中鉴定了2种强DTH-诱导抗原。这些数据还用重组蛋白产生确定对于长须罗蛉唾液蛋白LJM17（SEQ ID NO：5）及LJL143（SEQ ID NO：1）的DTH-诱导潜力来确证。而且，用LJL143及LJM17疫苗接种的狗的外周血单核细胞在用唾液重组蛋白刺激后产生干扰素（IFN）-γ，及更重要的是，用重组蛋白刺激这些细胞导致体外杀婴儿利什曼原虫。因此，这些分子代表待用作控制狗中婴儿利什曼原虫的疫苗的强候选物。

【材料与方法】

狗：将1～2年龄雌性小猎犬（Marshall Farms）根据Animal Careand User Committee guidelines，关在美国，Bethesda，NIH的动物设施中。由兽医持续细察健康问题下将它们良好饲养，及全部接收常规免疫接种。白蛉暴露实验之前的4个月期间不施用外寄生治疗。

白蛉：使用发酵的兔排泄物及兔食物作为幼虫食物混合物来养育长须罗蛉，Jacobina株。给成年白蛉提供含20%蔗糖的棉签，但在暴露实验之前24小时从糖饥饿。出现后4～7天时将一些雌性用于唾液腺解剖，及如上所述制备唾液腺匀浆（SGH）。

暴露于白蛉叮咬：将6日龄雌性长须罗蛉放置在10mm-薄的Plexiglas装置中。装置在其一侧含固定用螺丝钉及尼龙网，用于白蛉通过其探查。暴露于限制浓缩之前，装置保持在25℃。及牢固附着在刮毛的狗颈上的Velcro颈环上20分钟。狗在整个暴露期间不受限制。

反抗原-筛选（RAS）：麻醉预暴露于白蛉叮咬的狗，及真皮内注射DNA质粒或重组蛋白。注射位点之间各离15mm。对于DNA质粒，编码分子，及在注射到腹部之前随机重组各狗。完成硬结及红斑测量之后就破坏编码。对于DNA-RAS，将38种样品以40μL总体积注射，包括：PBS，稀释在PBS中的1对长须罗蛉SGH，及20μg对照载体及稀释在PBS中的35种编码长须罗蛉个别唾液蛋白的重组DNA质粒。对于蛋白-RAS，将5种样品一式两份（40μL）注射，包括：PBS，稀释在PBS中的1对长须罗蛉SGH，及3种长须罗蛉唾液重组蛋白（300ng）。真皮内注射样品之后48小时时进行硬结及红斑直径测量。

对皮肤钻取活组织检查的组织学及实时PCR：从麻醉的狗颈或腹部取得4mm或6mm-皮肤钻取活组织检查（Acuderm），及均分为2半。一半储存在中性-缓冲的甲醛（10%福尔马林）中，然后常规加工用于用苏木素/曙红，Luna氏，Toludine蓝及免疫组织化学过程就CD3及巨噬细胞/单核细胞标记物染色。另一半，储存在RNAlater（Sigma）中，用于RNA提取（

RNAdvance^TM Tissue，BeckmanCoulter）。反转录（Transcriptor第一链cDNA合成，Roche）RNA，及使用LightCycler480（Roche），引物组（0.2μM最终浓度）及FAM/TAMRA双标记的探针达总15μl进行实时PCR，每反应一式三份。之前描述了犬科动物IL4，IL12，TGF-β，IFN-γ及GAPDH的引物及探针（Breathnach et al.）。如之前描述进行扩增条件，获得，熔解曲线分析及标准曲线（Breathnach et al.）。目的基因的表达水平标准化到内源性GAPDH水平，对RNA定量的对照。

重组cDNA：从cDNA文库（见上）选定自长须罗蛉的唾液腺的35种最丰分子，及通过标准克隆技术将它们的cDNA克隆进pVR2001-TOPO载体。使用GenElute^TM无内毒素质粒Megaprep（Sigma）制备质粒，使用Plus-20（Millipore）用超纯水清洗，及用PBS洗脱。35种纯化的质粒的质量控制包括内毒素测量，限制性图谱分析及测序。灭菌过滤纯化的唾液DNA质粒，及储存于-70℃。

重组蛋白：如上所述构建含编码源于亲源唾液DNA质粒的cDNA的His-标记的长须罗蛉唾液抗原的表达质粒（Oliveira et al.），及转染进HEK-293F细胞。将72h时收集的上清使用镍柱及咪唑梯度经历HPLC层析。用之前用相应原cDNA质粒免疫的小鼠的多克隆血清测试对C-端有6×His基序的重组唾液蛋白呈阳性的HPLC级分。通过SDS-PAGE及蛋白印迹测试重组蛋白，等分于PBS及储存于-70℃。

重组金丝雀痘病毒：使用标准方法产生源于分别表达LJL143（vCP2389）或LJM17（vCP2390）抗原的ALVAC载体的2种金丝雀痘病毒，及通过测序病毒DNA，对感染的细胞的mRNA的RT-PCR及感染的细胞上清的蛋白印迹来确证。将Purevax^TM ferret distemper疫苗（Merial）用作金丝雀痘病毒注射的对照。

用唾液疫苗免疫狗：25只狗随机分为5组，每组各5只狗。对自组1～4的全部狗，在D0（V1），分别将500μg纯化的表达LJM17（组1及2）抗原或LJL143（组3及4）抗原的质粒，通过真皮内（ID）途径，使用注射器及针，疫苗接种到耳廓。自组1及组3的狗，在D14（V2）及在D28（V3），将500μg与V1所用相同的质粒，通过经皮（TD）途径，使用VetJetTM（Merial）无针递送装置，加强施用到两条后腿的内侧上部。给自组1及组3的狗，还在D42（V4），将500μg相同质粒，通过肌内（IM）途径，与电穿孔结合，使用Sphergen装置及技术（参数：88V，T1=20，T2=80，N=10）加强施用到两条大腿外侧。给自组2及4的狗，在D14（V2）及在D28（V3），将500μg与V1所用相同的质粒，通过IM途径，与电穿孔结合，如上所述加强施用。给自组2及4的狗，还在D42（V4），将100μg上述纯化的重组蛋白LJM17（rLJM17）（组2）或LJL143（rLJL143）（组4）结合20%（MVP laboratories）中的300μgCpG ODN，通过ID途径，如上所述加强施用到耳廓。自组1～4的全部狗，在D192（V5），通过IM途径，在左四头肌，使用10⁸pfu的分别表达LJM17（组1及2）抗原或LJL143（组3及4）抗原的重组金丝雀痘病毒vCP2390及vCP2389，接受最终疫苗加强。自组5的狗，在D0，在D14，在D28及在D42，疫苗接种500μg纯化的亲源质粒VR2001（其不表达抗原），及在D192，通过IM途径，使用10⁸pfu的对照重组金丝雀痘病毒（Purevax^TM）接受最终加强。

ELISA：将96孔板（Maxisorp^TM，Nunc）用长须罗蛉SGH（5对/ml），rLJM17蛋白（2μg/mL）或rLJL143（2μg/mL）于4℃包被过夜。将一式三份的1/50稀释的狗血清，1/5000的缀合碱性磷酸酶的AffiniPure兔抗-狗IgG（Jackson ImmunoResearch）及对硝基苯磷酸酯（Sigma）连续添加到板。使用Spectramax Plus（分子装置）测量405nm处的吸光度。用SGH（1或2对），conA（4μg），rLJM17（2或10μg）或rLJL143（2或10μg）刺激之后，72h之后测量（Quantikine ELISA；R&D系统）了细胞上清中的IFN-γ产生。

抗-利什曼原虫活性：使用标准方法制备犬科动物单核细胞-衍生的巨噬细胞。用长须罗蛉SGH（2对），conA（4μg），rLJM17（25μg）或rLJL143（25μg）刺激1周之后从培养物取得自体T细胞（5×10⁶细胞），及在通过婴儿利什曼原虫感染（以5:1的比例感染）的巨噬细胞存在下放回。显微镜检查Giemsa-染色的制剂之后，通过感染的细胞的百分率及每巨噬细胞中无鞭毛体的量的变化来评估抗-利什曼原虫活性。

【长须罗蛉白蛉叮咬诱导狗中强延迟型超敏反应】

啮齿类模型中，特征在于是针对白蛉唾液蛋白的Th1延迟型超敏反应（DTH）的细胞免疫保护动物免于皮肤及内脏利什曼病。无有关狗（在欧洲及拉丁美洲由婴儿（恰加斯）利什曼原虫引发的内脏利什曼病的主要储蓄者）中针对白蛉唾液的细胞免疫的存在及性质的信息。因此，研究了暴露于长须罗蛉（拉丁美洲婴儿利什曼原虫恰加斯亚种的载体）叮咬后狗中抗-唾液免疫的早期动力学。9只小猎犬中的7只在第三次暴露于叮咬之后一周时显示特异抗-唾液抗体（图19A）。除了一只狗，这些动物在无IgG1的情况下显示强IgG2抗体反应（图19A）。一只狗显示混合的IgG2/IgG1抗体反应。为了调查狗暴露于白蛉叮咬是否发展DTH反应，测量了各暴露后达96小时的叮咬位点的皮肤硬结。第二次暴露于白蛉叮咬后，在产生显著水平的长须罗蛉IgG抗体的7只狗中观察到小硬结（图19B）。此特征在于局部红斑，隆起及最终皮肤增厚。白蛉叮咬后第三次暴露持续达96小时后观察到的硬结的强度及持续时间显著升高（图19B）。幼稚的动物中第一次暴露之后未观察到此硬结（图19B）。硬结位点的组织学分析显示最少炎症，其特征在于第一及第二次暴露后48小时时分散的血管周淋巴细胞及真皮浅表之内罕有嗜中性粒细胞（图19C）。第三次暴露后48小时时注意到细胞渗入显著增加。此特征在于表皮显著的增厚及有组成于淋巴细胞，巨噬细胞及嗜酸性粒细胞（图19D）的炎症细胞多病灶渗入物。基于反应时机，以及渗入性质，得出白蛉唾液在重复暴露之后狗皮肤中诱导延迟型超敏反应。

【在狗中诱导DTH的长须罗蛉唾液蛋白】

研究了导致在狗中产生DTH反应的长须罗蛉的唾液分子。以上鉴定了编码自此物种唾液腺的35种最丰分泌的蛋白的转录物。从大动物（例如狗）的大量抗原鉴定能诱导细胞免疫应答的候选物由于成本及空间被限制。为克服此障碍，开发了反抗原筛选方法，其组成于：将最少量的狗（5只）暴露于白蛉叮咬，及用达38种样品（编码唾液蛋白的35种DNA质粒及3种对照）注射各动物（图20A）。35种注射的DNA质粒中，仅4种（LJM17，LJM11，LJL143及LJL138）在攻击之后48小时时，在多于3只狗中诱导显著的红斑（图20B）；及仅2种DNA质粒（LJL143及LJM17）在攻击之后48小时时，在3只狗中产生强硬结（图20B）。大部分注射质粒不产生显著的红斑或硬结（图20B），及相比LJM17及LJL143，注射PBS及空载体对照在注射位点诱导最少的红斑（图20C）。注射的DNA质粒的特异性及反应性显示于图20D。基于这些结果，选择LJM17及LJL143用于进一步分析。LJL143及LJM17诱导细胞因子产生指示注射位点的Th1环境，包括IL-12及IFN-γ（图20E）。攻击之后48小时时取得的组织切片显示，LJL143及LJM17在注射位点募集淋巴细胞及巨噬细胞指示经典的延迟型超敏反应（DTH）（图20F）。为了确证此方法的特异性，在其他几种唾液重组蛋白之中，尤其制备了可溶性高度纯化的LJL143，LJM17及LJM111（图21A）。注射它们的相应DNA质粒后观察到LJL143及LJM17重组蛋白重现的DTH反应（图21B及21C），包括注射位点淋巴细胞及巨噬细胞的募集（图21D）。

【用LJL143及LJM17免疫的狗产生特异于重组唾液蛋白的IFN-γ】

用编码LJL143，LJM17的DNA质粒或对照DNA质粒，用相应重组唾液蛋白初次加强及用表达相应唾液蛋白的金丝雀痘病毒最终免疫来免疫狗（每组5只）（表1）。用达4μg的它们的相应重组蛋白，ConA及1对唾液腺匀浆（SGH）刺激自免疫的狗的PBMC。疫苗接种LJL143的狗在第四次免疫接种5周后及金丝雀痘注射之前产生显著水平的IFN-γ（图22A）。更重要的是，存在于1对唾液腺匀浆中的天然的LJL143蛋白能在疫苗接种LJL143的狗中产生相似反应（图22A）。疫苗接种LJM17的狗相比疫苗接种LJL143的狗产生显著更低水平的IFN-γ（图22A）。金丝雀痘免疫接种之后2周时观察到相似谱，其中相比它们的痘前状态，自疫苗接种LJL143的狗的PBMC产生2倍更高的IFN-γ（图22B）。

【表1】

组

抗原

D0(V1)

D14(V2)

D28(V3)

D42(V4)

D192(V5)

1

LJM17

ID-cDNA

TD-cDNA

TD-cDNA

IM/ET-cDNA

IM-vCP

2

LJM17

ID-cDNA

IM/ET-cDNA

IM/ET-cDNA

ID-蛋白

IM-vCP

3

LJL143

ID-cDNA

TD-cDNA

TD-cDNA

IM/ET-cDNA

IM-vCP

4

LJL143

ID-cDNA

IM/ET-cDNA

IM/ET-cDNA

ID-蛋白

IM-vCP

5

对照

ID-cDNA

TD-cDNA

TD-cDNA

IM/ET-cDNA

IM-vCP

【用LJL143及LJM17免疫接种产生体外杀恰加斯利什曼原虫无鞭毛体的保护性免疫应答】

自2只疫苗接种LJM17及LJL143的狗的PBMC的感染的巨噬细胞，在添加分别用LJM17及LJL143重组蛋白刺激的自体淋巴细胞后，有效杀恰加斯利什曼原虫无鞭毛体（图23）。通过感染的巨噬细胞百分率（图23A）以及每巨噬细胞无鞭毛体的量（图23B）的显著减少测量杀效率。此杀效果与添加非特异性丝裂原ConA后观察到的效果可比较（图23）。

【实施例16】狗中免疫应答的产生

有抗利什曼病的天然免疫的约3年龄的12只狗在刮毛之后通过真皮内途径（ID）背部注射100μg各悬浮于100μl PBS的个别质粒。各质粒在不同点注射。点相离至少3cm，以避免DTH反应之间的干扰。也通过ID途径接种阴性对照（100μl缓冲液）。

注射之后72小时时通过测量皮肤肿胀区更大直径来评估DTH反应。结果表示为全部狗的肿胀区的平均值，及表示为具有阳性DTH反应的狗的百分率。阳性DTH是注射之后72小时时肿胀区直径大于或等于4mm。

第二研究中，给10只4～6月龄的幼稚的狗，通过ID注射，在右耳中的10个点（每点100μl），免疫100μg各悬浮于1000μl PBS的编码长须罗蛉多肽的质粒。在第21天，给狗在左耳的10个点（每点100μl）及在腹部的10个点（每点100μl）注射100μg各悬浮于2000μlPBS的质粒。全部狗在第35天通过接种，通过ID途径在背部（刮毛之后），用100μg各悬浮于100μl PBS的个别质粒攻击。在不同点注射各质粒。点相离至少3cm，以避免干扰。作为阴性对照，真皮内接种100μl缓冲液。攻击之后72小时时，通过测量皮肤肿胀区的更大直径来评估DTH反应。结果表示为全部狗的肿胀区的平均值，及表示为具有阳性DTH反应的狗的百分率。阳性DTH是注射之后72小时时肿胀区直径大于或等于4mm。

此研究结果显示，质粒可在注射之后在狗中诱导细胞免疫，由DTH反应引发细胞免疫。DTH反应水平的变化可由插入子表达变化所致。

本领域技术人员明晰，在不脱离本发明的精神的范围内，可对本文描述的方法进行各种改变及修饰。所述全部改变及修饰在权利要求的范围及精神内。

本发明还涉及下列技术内容：

1.疫苗组合物，其包括：

（a）表达载体，其中所述载体包括编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽选自唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，及它们的混合物；及

（b）药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂。

2.技术内容1的疫苗，其中所述表达载体选自：pVR2001-TOPO、pVR2001-TOPA、pVR1020、pVR1012、pAB110、ALVAC、TROVAC、MVA、及杆状病毒载体。

3.技术内容1的疫苗，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。

4.技术内容1的疫苗，其中所述多核苷酸与编码具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性。

5.技术内容1的疫苗，其中所述多核苷酸与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。

6.技术内容1的疫苗，其中所述载体选自：pVR2001LJM17（SEQID NO：9）、pVR2001LJL143（SEQ ID NO：10）、vCP2390（SEQID NO：93或SEQ ID NO：92）、vCP2389（SEQ ID NO：94）、MVA-LJM17、MVA-LJL143、pNBO002（SEQ ID NO：19）、pNBO003（SEQ ID NO：20）、vCP2390-SEQ ID NO：6、vCP2389-SEQ ID NO：2、及它们的混合物。

7.疫苗组合物，其包括：

（a）第一表达载体，其中所述载体包括编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽选自：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，及它们的混合物；

（b）第二表达载体，其中所述载体包括编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽选自：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，及它们的混合物；及

（c）药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂。

8.技术内容7的疫苗，其中所述表达载体选自：pVR2001-TOPO、pVR2001-TOPA、pVR1020、pVR1012、pAB110、ALVAC、TROVAC、MVA、及杆状病毒载体。

9.技术内容7的疫苗，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。

10.技术内容7的疫苗，其中所述多核苷酸与编码具有SEQ IDNO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性。

11.技术内容7的疫苗，其中所述多核苷酸与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。

12.技术内容7的疫苗，其中所述第一或第二表达载体选自：pVR2001LJM17（SEQ ID NO：9）、pVR2001LJL143（SEQ ID NO：10）、vCP2390（SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：92）、vCP2389（SEQID NO：94）、MVA-LJM17、MVA-LJL143、pNBO002（SEQ ID NO：19）、pNBO003（SEQ ID NO：20）、vCP2390-SEQ ID NO：6、vCP2389-SEQ ID NO：2、及它们的混合物。

13.疫苗组合物，其包括：

（a）唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或者它们的混合物；及

（c）药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂。

14.技术内容13的疫苗，其中所述长须罗蛉多肽包括与具有SEQID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。

15.技术内容1～14中任一项的疫苗，其中所述疫苗还包括至少一种利什曼原虫抗原。

16.技术内容15的疫苗，其中所述利什曼原虫抗原是KMP11。

17.技术内容15的疫苗，其中所述利什曼原虫抗原是灭活的利什曼原虫。

18.载体，其包括选自下列的一种或多种多核苷酸：

（a）编码与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽的多核苷酸；

（b）与编码具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；及

（b）与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；

其中所述载体是体内表达载体或体外表达载体。

19.技术内容18的载体，其中所述载体是杆状病毒载体。

20.技术内容18的载体，其中所述载体是质粒。

21.技术内容18的载体，其中所述载体是病毒载体。

22.宿主细胞，其被技术内容18的载体转化。

23.疫苗接种易感利什曼原虫的受试者的方法，包括施用至少一次技术内容1～17中任一项的疫苗。

24.技术内容23的方法，其中所述受试者是人、犬科动物或猫科动物。

25.疫苗接种易感利什曼原虫的受试者的方法，包括初次-加强施用方案，继以加强施用疫苗。

26.技术内容25的方法，

其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂中包括含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸用于体内表达：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或者它们的混合物；及

其中所述加强施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括含多核苷酸的重组病毒载体，所述多核苷酸用于体内表达：相同唾液长须罗蛉多肽、其变体、其片段，

以保护所述受试者免于利什曼病及/或预防感染的受试者的疾病进展。

27.技术内容25的方法，

其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂中包括含多核苷酸的重组病毒载体，所述多核苷酸用于体内表达：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或者它们的混合物；及

其中所述加强施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸用于体内表达：相同唾液长须罗蛉多肽、其变体、其片段，

以保护所述受试者免于利什曼病及/或预防感染的受试者的疾病进展。

28.技术内容25的方法，

其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂中包括含多核苷酸的重组病毒载体，所述多核苷酸用于体内表达：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或者它们的混合物；及

其中所述加强施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括：相同唾液长须罗蛉多肽，其变体，其片段，

以保护所述受试者免于利什曼病及/或预防感染的受试者的疾病进展。

29.技术内容23～28中任一项的方法，其中所述唾液长须罗蛉多肽是LJL143多肽或LJM17多肽。

30.诊断受试者的利什曼原虫感染的方法，包括：

（a）接触包括至少3、6或10个多肽的固体基材，其中所述多肽中的每一种包括SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的一种氨基酸序列，或其免疫原性片段；

（b）使所述固体基材与获自所述受试者的样品接触；及

（c）检测所述样品成分与所述固体基材上的至少一个多肽的结合，其中所述成分与所述基材的结合的检测指示所述受试者感染利什曼原虫，由此诊断所述受试者的利什曼原虫感染。

31.分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括：

（a）与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的核苷酸序列；

（b）编码与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽的核苷酸序列；或

（c）与编码具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸。

32.技术内容31的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括与具有SEQID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的核苷酸序列。

33.技术内容31的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括编码与具有1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少90%序列同一性的多肽的核苷酸序列。

34.基本上纯化的唾液长须罗蛉多肽，其中所述多肽包括：

（a）与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；

（b）SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的保守变体；

（c）包括SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸的免疫原性片段，其与特异性结合SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的抗体特异性结合；或

（d）SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列，且

其中给受试者施用所述多肽产生对长须罗蛉的免疫应答。

35.技术内容34的多肽，其中所述多肽包括与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

36.技术内容34的多肽，其中所述多肽包括免疫原性片段，其包括SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸的，其与特异性结合具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的多肽的抗体特异性结合。

37.抗体，其与技术内容34的多肽特异性结合。

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Claims (37)

1.疫苗组合物，其包括：

（a）表达载体，其中所述载体包括编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽选自唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，及它们的混合物；及

（b）药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂。

2.权利要求1的疫苗，其中所述表达载体选自：pVR2001-TOPO、pVR2001-TOPA、pVR1020、pVR1012、pAB110、ALVAC、TROVAC、MVA、及杆状病毒载体。

3.权利要求1的疫苗，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。

4.权利要求1的疫苗，其中所述多核苷酸与编码具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性。

5.权利要求1的疫苗，其中所述多核苷酸与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。

6.权利要求1的疫苗，其中所述载体选自：pVR2001LJM17（SEQID NO：9）、pVR2001LJL143（SEQ ID NO：10）、vCP2390（SEQID NO：93或SEQ ID NO：92）、vCP2389（SEQ ID NO：94）、MVA-LJM17、MVA-LJL143、pNBO002（SEQ ID NO：19）、pNBO003（SEQ ID NO：20）、vCP2390-SEQ ID NO：6、vCP2389-SEQ ID NO：2、及它们的混合物。

7.疫苗组合物，其包括：

（a）第一表达载体，其中所述载体包括编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽选自：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，及它们的混合物；

（b）第二表达载体，其中所述载体包括编码一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽选自：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，及它们的混合物；及

（c）药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂。

8.权利要求7的疫苗，其中所述表达载体选自：pVR2001-TOPO、pVR2001-TOPA、pVR1020、pVR1012、pAB110、ALVAC、TROVAC、MVA、及杆状病毒载体。

9.权利要求7的疫苗，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。

10.权利要求7的疫苗，其中所述多核苷酸与编码具有SEQ IDNO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性。

11.权利要求7的疫苗，其中所述多核苷酸与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。

12.权利要求7的疫苗，其中所述第一或第二表达载体选自：pVR2001LJM17（SEQ ID NO：9）、pVR2001LJL143（SEQ ID NO：10）、vCP2390（SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：92）、vCP2389（SEQID NO：94）、MVA-LJM17、MVA-LJL143、pNBO002（SEQ ID NO：19）、pNBO003（SEQ ID NO：20）、vCP2390-SEQ ID NO：6、vCP2389-SEQ ID NO：2、及它们的混合物。

13.疫苗组合物，其包括：

（a）唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或者它们的混合物；及

（c）药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂。

14.权利要求13的疫苗，其中所述长须罗蛉多肽包括与具有SEQID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。

15.权利要求1～14中任一项的疫苗，其中所述疫苗还包括至少一种利什曼原虫抗原。

16.权利要求15的疫苗，其中所述利什曼原虫抗原是KMP11。

17.权利要求15的疫苗，其中所述利什曼原虫抗原是灭活的利什曼原虫。

18.载体，其包括选自下列的一种或多种多核苷酸：

（a）编码与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽的多核苷酸；

（b）与编码具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；及

（b）与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；

其中所述载体是体内表达载体或体外表达载体。

19.权利要求18的载体，其中所述载体是杆状病毒载体。

20.权利要求18的载体，其中所述载体是质粒。

21.权利要求18的载体，其中所述载体是病毒载体。

22.宿主细胞，其被权利要求18的载体转化。

23.疫苗接种易感利什曼原虫的受试者的方法，包括施用至少一次权利要求1～17中任一项的疫苗。

24.权利要求23的方法，其中所述受试者是人、犬科动物或猫科动物。

25.疫苗接种易感利什曼原虫的受试者的方法，包括初次-加强施用方案，继以加强施用疫苗。

26.权利要求25的方法，

其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂中包括含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸用于体内表达：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或者它们的混合物；及

其中所述加强施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括含多核苷酸的重组病毒载体，所述多核苷酸用于体内表达：相同唾液长须罗蛉多肽、其变体、其片段，

以保护所述受试者免于利什曼病及/或预防感染的受试者的疾病进展。

27.权利要求25的方法，

其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂中包括含多核苷酸的重组病毒载体，所述多核苷酸用于体内表达：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或者它们的混合物；及

其中所述加强施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括含多核苷酸的质粒，所述多核苷酸用于体内表达：相同唾液长须罗蛉多肽、其变体、其片段，

以保护所述受试者免于利什曼病及/或预防感染的受试者的疾病进展。

28.权利要求25的方法，

其中所述方案包括初次-施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质，稀释剂或赋形剂中包括含多核苷酸的重组病毒载体，所述多核苷酸用于体内表达：唾液长须罗蛉多肽，所述唾液长须罗蛉多肽的变体或片段，或者它们的混合物；及

其中所述加强施用疫苗，所述疫苗在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括：相同唾液长须罗蛉多肽，其变体，其片段，

以保护所述受试者免于利什曼病及/或预防感染的受试者的疾病进展。

29.权利要求23～28中任一项的方法，其中所述唾液长须罗蛉多肽是LJL143多肽或LJM17多肽。

30.诊断受试者的利什曼原虫感染的方法，包括：

（a）接触包括至少3、6或10个多肽的固体基材，其中所述多肽中的每一种包括SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的一种氨基酸序列，或其免疫原性片段；

（b）使所述固体基材与获自所述受试者的样品接触；及

（c）检测所述样品成分与所述固体基材上的至少一个多肽的结合，其中所述成分与所述基材的结合的检测指示所述受试者感染利什曼原虫，由此诊断所述受试者的利什曼原虫感染。

31.分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括：

（a）与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的核苷酸序列；

（b）编码与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的多肽的核苷酸序列；或

（c）与编码具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸。

32.权利要求31的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括与具有SEQID NO：2、4、6、8、12、14、16、18、21、22、89、90或91所示的序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的核苷酸序列。

33.权利要求31的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括编码与具有1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少90%序列同一性的多肽的核苷酸序列。

34.基本上纯化的唾液长须罗蛉多肽，其中所述多肽包括：

（a）与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；

（b）SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的保守变体；

（c）包括SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸的免疫原性片段，其与特异性结合SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的抗体特异性结合；或

（d）SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列，且

其中给受试者施用所述多肽产生对长须罗蛉的免疫应答。

35.权利要求34的多肽，其中所述多肽包括与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的序列的多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

36.权利要求34的多肽，其中所述多肽包括免疫原性片段，其包括SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的至少8个连续氨基酸，其与特异性结合具有SEQ ID NO：1、3、5、7、11、13、15或17所示的氨基酸序列的多肽的抗体特异性结合。

37.抗体，其与权利要求34的多肽特异性结合。

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