TWI478723B - 犬利什曼原蟲疫苗 - Google Patents

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TWI478723B TW096144176A TW96144176A TWI478723B TW I478723 B TWI478723 B TW I478723B TW 096144176 A TW096144176 A TW 096144176A TW 96144176 A TW96144176 A TW 96144176A TW I478723 B TWI478723 B TW I478723B
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Description

犬利什曼原蟲疫苗
本發明係關於抵抗利什曼病(Leishmaniasis)、具體而言抵抗犬利什曼病之疫苗領域。
利什曼病係人類、犬科動物(狗、狼、狐、叢林狼、豺)及貓科動物(獅、虎、家貓、野貓、其他大型貓類、及包括獵豹及猞猁之其他貓類)之主要嚴重寄生蟲病。
利什曼病之媒介係寄生原生動物且屬於多氏利什曼原蟲(leishmania donovani )複合體。該寄生蟲廣泛分佈於南歐洲、非洲、亞洲、南美洲及中美洲之溫帶及亞熱帶國家(Desjeux P.,Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.,2001,95：239－43)。多氏利什曼原蟲嬰兒亞種(Leishmania donovani infantum )(L.infantum)係南歐洲、非洲及亞洲貓類及犬類疾病之主要病因。在南美洲及中美洲，媒介為多氏利什曼原蟲恰加斯亞種(Leishmania donovani chagasi )(L.chagasi )，其與L.infantum 密切相關。在人類中，媒介為多氏利什曼原蟲多氏亞種(Leishmania donovani donovani )(L.donovani )，其與L.infantum 及L.chagasi 密切相關。
該寄生蟲藉由白蛉傳播至人類、貓科及犬科動物，白蛉之種類端視地理位置而變化。阿氏白蛉(Phlebotomus ariasi )(P.ariasi )及惡毒白蛉(Phlebotomus perniciosus )(P.perniciosus )係南歐洲、非洲及亞洲之最常見攜帶者，而長須羅蛉(Lutzomyia longipalpis )(L.longipalpis )係南美洲及中美洲之最常見攜帶者。
利什曼病之家庭儲存宿主係狗，其可經受特徵為在少於50%經感染動物中發生之內臟－皮膚體徵之慢性演變之嚴重疾病(Lanotte G.等人，Ann.Parasitol.Hum.Comp.,1979,54：277－95)。另一方面，具有可檢測抗體之無症狀及有症狀狗二者皆可傳染白蛉載體(Molina R.等人，Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.,1994,88：491－3；Courtenay O.等人，J.Infect.Dis.,2002,186：1314－20)。貓可為寄生原生動物攜帶者且可視為第二潛在儲存宿主。
該等寄生蟲可引起內臟性利什曼病及/或皮膚性利什曼病。內臟性利什曼病導致諸如發燒、惡病質、肝脾大(肝臟及脾臟增大)及血細胞減少等臨床症狀。皮膚性利什曼病以多種不同表現形式發生，自自身限制性及甚至自體癒合性皮膚性形式至致死全身性疾病。皮膚性利什曼病之損傷可發生於身體上任何位置，但最常見位點為暴露於環境中且因此對白蛉叮咬更敏感之彼等。最初之丘疹迅速引起潰瘍。全身性利什曼病很罕見，但若不及時治療常常可致死。全身性利什曼病可影響身體內臟器官，具體而言影響脾臟及肝臟。
在犬類中，該疾病係與皮膚性症狀或內臟性症狀相關或同時與二者相關，且在不治療情況下可致死。
人們已闡述許多治療方法，但由於治療方法本身之毒性或動物易於復發，沒有一種令人完全滿意。
已顯示大規模檢測血清陽性狗後進行淘汰及/或藥物治療，或大量應用浸透第滅靈(deltamethrin)之頸圈對在南歐洲、非洲及亞洲之地方性區域降低人類及犬類利什曼病患病率有效果(Maroli M.等人，Med.Vet.Entomol.,2001,15：358－63；Mazloumi Gavgani A.S.等人，Lancet,2002,360：374－9)，但消滅血清陽性犬之有效性一直有爭議(Dietze R.等人，Clin.Infect.Dis.,1997,25：1240－2；Moreira Jr.E.D.等人，Vet.Parasitol.,2004,122：245－52)。人們認為該等控制措施不可接受、昂貴或無效(Gradoni L.等人，Vaccine,2005,23：5245－51)。
用於比較用於控制利什曼病之各種工具有效性之數學模型表明犬疫苗可能為最實用且最有效之方法(Dye C.,Am.J.Trop.Med.Hyg.,1996,55：125－30)。因此，人們高度期望研發出能保護犬科動物免受利什曼病侵襲及/或在經感染動物中防止疾病惡化之疫苗用於實施利什曼病控制程序以及用於獸醫學界(Gradoni L.等人，Vaccine,2005,23：5245－51)。
先前技術最佳概述於美國專利申請案第US－A－2006/0194753號中。該文件闡述包含編碼L.infantum KMP11(動基體膜蛋白11)蛋白之DNA表現載體之疫苗。然而，小鼠實驗結果(如第2006/0194753號中圖1所示)顯示，對於攻擊性感染後8週內發生之損傷，經表現KMP11之pMCV1.4質粒接種之小鼠之結果較對照小鼠更差(經接種小鼠及對照小鼠之損傷分數分別為約3.2及約1.6)。此外，第2006/0194753號中圖2之狗實驗顯示，投與一種表現L.infantum p36抗原之重組pMOK質粒及表現L.infantum TSA(巰基專一性抗氧化劑蛋白)、L.infantum gp63及L.infantum KMP11抗原之三種重組pMCV1.4質粒之混合物後，檢測不到任何抗體。在經接種組之結果與對照組之結果間不存在顯著差異。用107.7 L.infantum前鞭毛體實施攻擊性感染後，經接種組中經感染狗之數目與對照組僅顯示細微差異。
Basu等人(Basu R.等人，J.Immunol.,2005,174：7160－71)闡述一使用經包含pCMV－LIC哺乳動物表現載體之KMP11免疫之金倉鼠對經不包含KMP11(pCMV－LIC)之空白載體構成物免疫之對照動物之實驗。兩組動物皆接受相隔8日之兩次至後腿腿肌之肌內投與(使用28號針)，每次投與100微克溶於鹽水中之質粒。在第15日，使用兩種系L donovani AG83或L.donovani GE1F8R之一實施致死性寄生蟲攻擊。所有經KMP11 DNA免疫之經接種倉鼠皆在AG83及GE1F8R之致死攻擊後存活且保持健康直至感染後8個月實驗終止，而所有未經免疫及經空白載體免疫之倉鼠皆在6個月內死於L.donovani 之致命攻擊。
目前，沒有疫苗可用於利什曼原蟲(Leishmania )－易感患者，包括用於犬科動物。
因此，本發明係關於創新性疫苗策略，其係基於利什曼原蟲KMP11(動基體膜蛋白11)抗原以防止寄生蟲擴散並植入內臟器官中。
因此本發明目的係提供一種能保護患者(即犬科動物、貓科動物及人類)免受利什曼病侵襲及/或在經感染患者中防止疾病惡化之疫苗。
本發明之目的亦為提供使用該等疫苗之方法以保護犬科動物免受利什曼病侵襲及/或在經感染犬科動物中防止疾病惡化。
本發明之目的亦為提供使用該等疫苗之方法以保護貓科動物免受利什曼病侵襲及/或在經感染貓科動物中防止疾病惡化。
本發明之目的亦為提供使用該等疫苗之方法以保護人類免受利什曼病侵襲及/或在經感染人類中防止疾病惡化。
因此本發明另一目的係提供用於該等疫苗及/或該等使用方法之編碼利什曼原蟲KMP11抗原或免疫原或其抗原決定部位之活體內表現載體。
應注意在本發明中，尤其在申請專利範圍中，諸如"包括"("comprises"、"comprised"、"comprising")等術語及類似詞語可具有美國專利法中賦予其之意義；例如，其可意指"包含"("includes"、"included"、"including")及類似意義；且諸如"主要包含"("consisting essentially of"及"consists essentially of")等術語具有美國專利法中賦予其之意義，例如，其可包括未明確列述之成份，但不包括先前技術中發現之成份或影響本發明之基礎或新穎特徵之成份。
該等及其他實施例揭示於下述具體實施方式中或可自下列實施方式易知並涵蓋於下述具體實施方式中。
本發明一態樣係關於一種疫苗策略，其係基於初免(prime)－加強(boost)投與方案，其中初免投與及加強投與採用包含醫藥上或獸醫學上可接受賦形劑、稀釋劑或載劑及如本文所述之包含含有及表現利什曼原蟲抗原KMP11或免疫原或其抗原決定部位之多核苷酸序列之活體內表現載體之組合物。
利什曼原蟲KMP11抗原係衍生自(例如)L.infantum 或L.chagasi 。KMP11係存於動基體目(Kinetoplastidae)家族所有成員中之高度保守表面膜蛋白，且可以利什曼原蟲之無鞭毛體及前鞭毛體兩種形式有差異地表現(Jardim A.等人，Biochem.J.,1995,305：315－20；Jardim A.等人，Biochem.J.,1995,305：307－13；Berberich C.等人，Biochim.Biophys.Acta,1998,1442：230－7)。利什曼原蟲KMP11蛋白之基因核酸序列及胺基酸序列在公共數據庫中可獲得，尤其作為GenBank數據庫中存取號為X95627及X95626之L.infantum 。L.donovani 之核酸序列亦可自GenBank數據庫獲得，尤其以存取號S77039獲得。
本發明係關於活體內表現載體在初免－加強投與方案中之用途，包括初免投與在醫藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑中包含含有在活體內表現利什曼原蟲KMP11多肽、抗原、抗原決定部位或免疫原之多核苷酸序列之活體內表現載體之疫苗，之後加強投與在醫藥上可接受載劑或賦形劑中包含含有在活體內表現利什曼原蟲KMP11抗原、抗原決定部位或免疫原之多核苷酸序列之活體內表現載體之疫苗，以保護犬科動物、貓科動物及人類免受利什曼病侵襲及/或在經感染犬科動物、貓科動物及人類中防止疾病惡化。
根據定義，初免－加強方案包括使用至少一種常見多肽、抗原、抗原決定部位或免疫原之至少一次初免投與及至少一次加強投與。用於初免投與之疫苗之性質可與用作後續加強免疫疫苗之彼等不同。初免投與可包括一或多次投與。類似地，加強投與可包括一或多次投與。
本發明另一態樣係關於一疫苗組合物，其包含醫藥上或獸醫學上可接受賦形劑、稀釋劑或載劑及包含含有及表現如下所述之利什曼原蟲抗原KMP11或免疫原或其抗原決定部位之多核苷酸序列之活體內表現載體。
本文所用術語"抗原"或"免疫原"意指在宿主動物中引發專一性免疫反應之物質。抗原可包括已死亡、經減毒或活的完整生物體；生物體之亞單位或一部分；包含具有免疫原性特性之插入片段之重組載體；呈遞給宿主動物後能引發免疫反應之DNA碎片或DNA片段；蛋白質、多肽、肽、抗原決定部位、半抗原或其任一組合物。或者，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒素。
本文所用術語"免疫原性蛋白質或肽"亦包括免疫活性肽及多肽，意指一旦經投與至宿主其能引發針對該蛋白質之體液型及/或細胞型免疫反應。較佳地，蛋白質片段具有實質上與總蛋白相同之免疫活性。因此，本發明之蛋白質片段包括或主要包含或包含至少一個抗原決定部位或抗原決定簇。術語抗原決定部位係指能引發體液型(B細胞)及/或細胞型(T細胞)免疫反應之蛋白位點。
術語"免疫原性蛋白質或肽"另外涵蓋序列之缺失、增加及取代，只要多肽之功能可產生本文所定義之免疫反應即可。就此而言，尤其較佳之取代通常性質保守，即彼等取代在一胺基酸家族內發生。舉例而言，胺基酸通常分為四個家族：(1)酸性－－天冬胺酸及麩胺酸；(2)鹼性－－離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3)非極性－－丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及(4)不帶電極性－－甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸有時可歸類為芳族胺基酸。可合理地預測，用異白胺酸或纈胺酸單獨取代白胺酸或反之；用麩胺酸單獨取代天冬胺酸或反之；用絲胺酸單獨取代蘇胺酸或反之；或用結構上相關之胺基酸取代胺基酸之類似保守取代對生物學活性將不產生較大影響。因此，具有與參照分子實質上相同之胺基酸序列但具有實質上不影響蛋白質免疫原性之少量胺基酸取代之蛋白質涵蓋於參照多肽定義中。
術語"抗原決定部位"係指在抗原或半抗原上專一性B細胞及/或T細胞對其應答之位點。該術語亦可與"抗原決定簇"或"抗原決定簇位點"互換使用。可用一顯示一抗體阻斷另一抗體與目標抗原結合之能力之簡單免疫測定法鑒定識別相同抗原決定部位之抗體。
對組合物或疫苗之"免疫反應"係在宿主中出現對目標組合物或疫苗之細胞及/或抗體介導型免疫反應。通常，"免疫反應"包括(但不限於)一或多種下述效應：產生具體而言針對目標組合物或疫苗中所含抗原之抗體、B細胞、輔助細胞T細胞及/或細胞毒素T細胞。較佳地，宿主可表現治療性或保護性免疫反應以使得可增強對新感染之抵抗及/或可降低疾病之臨床嚴重性。該保護可藉由經感染宿主通常顯示之症狀減少或缺失、更快之治癒時間及/或經感染宿主中更低之病毒效價來表現。
本文所用術語"免疫原性"蛋白質或多肽亦指引發如上所述免疫反應之胺基酸序列。本文所用"免疫原性"蛋白質或多肽包括蛋白質之全長序列、其類似物或其免疫原性片段。"免疫原性片段"意指包括一或多個抗原決定部位且因此可引發上述免疫反應之蛋白質片段。可使用任一數量業內習知之抗原決定部位定位技術鑑別該等片段。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)。舉例而言，可藉由下述方法來確定線性抗原決定部位：例如在固態支撐體上同時合成大量肽，該等肽對應於蛋白質分子各部分，且在該等肽仍附著至支撐體上時使該等肽與抗體反應。該等技術係為業內熟知且闡述於例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986中，所有文獻全部內容皆以引用方式併入本文中。類似地，構象性抗原決定部位可藉由用(例如)x射線結晶照相術及二維核磁共振確定胺基酸空間構象容易地加以鑑別。參見例如上述Epitope Mapping Protocols。尤其可用於小泰來蟲(T.parva)蛋白質之方法全面闡述於PCT專利申請案第PCT/US2004/022605號中，其全文以引用方式併入本文中。
定義中亦可包括合成抗原，例如多抗原決定部位、側翼抗原決定部位及其他重組或合成衍生抗原。參見例如Bergmann等人，1993；Bergmann等人，1996；Suhrbier,1997；Gardner等人，1998。用於本發明目的之免疫原性片段通常可包含分子中之至少約3個胺基酸，較佳至少約5個胺基酸，更佳至少約10至15個胺基酸，且最佳約15至25個胺基酸或更多胺基酸。對片段長度不存在臨界上限，其可包含幾乎全長之蛋白質序列，或甚至包含含有至少一個蛋白質抗原決定部位之融合蛋白。
因此，表現抗原決定部位之多核苷酸最小結構係包括或主要包含或包含編碼流行性感冒蛋白或聚蛋白之抗原決定部位或抗原決定簇之核苷酸。更有利地，編碼總蛋白或聚蛋白片段之多核苷酸包括或主要包含或包含編碼該總蛋白或聚蛋白之序列之最少15個核苷酸，至少15至30個核苷酸，有利地約30至45個核苷酸，且較佳約45至75，至少57、87或150個保守或連續核苷酸。抗原決定部位測定程序，例如建立重疊肽文庫(Hemmer等人，1998)、肽掃描技術(Geysen等人，1984；Geysen等人，1985；Van der Zee R.等人，1989；Geysen,1990；Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)及算法(De Groot等人，1999)，及在PCT專利申請案第PCT/US2004/022605號中之方法，可用於本發明之實踐中而無需過多實驗，所有文獻全部內容皆以引用方式併入本文中。本文所引用及併入之其他文件亦可為用於測定免疫原或抗原之抗原決定部位且由此測定編碼該等抗原決定部位之核酸分子之方法提供咨詢。
本文中術語"疫苗組合物"或"疫苗"涵蓋一旦經注射入患者(包括犬科動物、貓科動物及人類)中能保護該患者免受皮膚性利什曼病及/或內臟性利什曼病侵襲(包括防止寄生蟲植入，及/或在經感染患者中防止疾病惡化，及/或限制失控寄生蟲擴散至內臟器官中)之組合物。此可藉由疫苗經由引發抵抗KMP11之體液型免疫反應，尤其引發抗－KMP11 IgG1，及/或經由引發抵抗KMP11之細胞介導型免疫反應，包括經由引發抵抗KMP11之CD8細胞介導型免疫反應及/或引發抵抗KMP11之CD4細胞介導型免疫反應來達成。在皮膚性利什曼病情況下期望引發體液型免疫反應，而在內臟性利什曼病情況下期望引發細胞介導型免疫反應。本發明疫苗策略及疫苗用途之優勢在於可引發體液型免疫反應及細胞介導型免疫反應二者，其既可保護患者免受皮膚性利什曼病侵襲亦可保護患者免受內臟性利什曼病侵襲。
醫藥上或獸醫學上可接受賦形劑、稀釋劑或載劑可為水、鹽水或緩衝液，或熟習此項技術者所習知及可由熟習此項技術者確認為可接受賦形劑之其他物質。
本發明另一態樣係關於如本文所述包含含有及表現利什曼原蟲抗原KMP11或免疫原或其抗原決定部位之多核苷酸序列之活體內表現載體。
該活體內表現載體包括包含目標多核苷酸或基因及彼等用於其活體內表現之主要元件之任一轉錄單元。該等表現載體可為質粒或重組病毒載體。
本文所用術語"多核苷酸"包括DNA及RNA及其衍生物，例如包含經修飾骨架之彼等。應瞭解本發明提供包含本文所述多核苷酸互補序列之多核苷酸。
本發明多核苷酸可以不同方法(例如藉由化學合成、藉由基因選殖等)加以製備且可採用各種形式(例如單鏈形式、雙鏈形式、引物形式、探針形式等)(參見Maniatis等人，Molecular Cloning：a Laboratory Manuel,Cold Spring Harbor Laboratory,1982)。
多核苷酸通常為開放讀碼框(ORF)，自起始密碼子(甲硫胺酸密碼子)起始且以終止信號(終止密碼子)終止。多核苷酸可包含調節其表現(例如轉錄起始、轉譯及轉錄終止)之區域。因此，多核苷酸亦包含啟動子及核糖體結合區(一般而言該等調節元件位於編碼序列或基因之起始密碼子上游約60至250個核苷酸之間；Doree S M等人，J.Bacteriol.2001,183(6)：1983－9；Pandher K等人，Infect.Imm.1998,66(12)：5613－9；Chung J Y等人，FEMS Microbiol letters 1998,166：289－296)、轉錄終止子(一般而言終止子位於編碼序列或基因之終止密碼子下游約50個核苷酸內；Ward C K等人，Infect.Imm.1998,66(7)：3326－36)。若為操縱子，該等調節區域可位於基因或編碼序列上游更遠處。
本文所用術語"衍生物"係指多肽或編碼多肽之核酸，其具有一或多個保守胺基酸變異或其他次要改變以致(1)與野生型多肽相比該對應多肽具有實質上相等功能，或(2)所產生抵抗該多肽之抗體與野生型多肽具有免疫反應性。
術語"保守性變異"意指一個胺基酸殘基由另一個生物學上相似之殘基替代，或核酸序列中一個核苷酸經替代使得所編碼胺基酸殘基不改變或為另一個生物學上相似之殘基。保守性變異之實例包括一個疏水性殘基(例如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一個疏水性殘基，或一個極性殘基取代另一個極性殘基，例如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸、或麩醯胺酸取代天冬醯胺酸，及諸如此類。術語"保守性變異"亦包括使用一個經取代之胺基酸替代一個未經取代之親代胺基酸，前提條件為對於經取代之多肽所產生之抗體亦與未經取代之多肽有免疫反應。
更一般而言，本發明涵蓋多核苷酸衍生物。本文所用術語"衍生物"係指多肽或編碼多肽之核酸，其與胺基酸序列SEQ ID N°2具有至少約50%一致性、至少約60%一致性、至少約70%一致性、至少約75%一致性、至少約80%一致性、至少約85%一致性、90%一致性、至少約95%一致性，及至少約96%、97%、98%或99%或更高一致性。具有此同源性或一致性之序列可涵蓋遺傳密碼簡併性(degen－eration)。兩種胺基酸序列間一致性之百分比可藉由NCBI(National Center for Biotechnology Information)成對blast 及blosum62矩陣使用標準參數確立(參見例如BLAST或BLASTX算法，可得自"National Center for Biotechnology Information"(NCBI,Bethesda,Md.,USA)服務器，以及Altschul等人，J.Mol.Biol.1990.215.403－410；因此，該文件以術語"blasts"提及使用該算法或BLAST或BLASTX及BLOSUM62矩陣)。
本文所用"密碼"並非表示多核苷酸限於實際編碼序列，而亦涵蓋包含非編碼序列之調節序列之整個基因。
序列同源性或一致性，諸如核苷酸序列同源性，亦可使用Myers及Miller("Optimal Alignments in Linear Space",CABIOS 4,11－17,1988，併入本文供參考)且可得自NCBI之"比對(Align)"程式以及可經由Internet網站諸如NCBI網站獲得之相同或其他程式測定。
或者或此外，舉例而言，術語"同源性"或"一致性"對於核苷酸或胺基酸序列而言可表示兩序列間同源性之定量量度。可如下式計算百分比序列同源性：(N ref －N dif )*100/N ref ，其中N dif 係經比對時兩序列中非一致殘基總數且其中N ref 係一序列中殘基數量。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC(N ref ＝8；N dif ＝2)之序列一致性可為75%。
或者或此外，"同源性"或"一致性"對序列而言可指具有相同核苷酸或胺基酸之位點之數量除以兩序列中較短者之核苷酸或胺基酸之數量，其中兩序列之比對可根據Wilbur及Lipman算法(Wilbur及Lipman,1983 PNAS USA 80：726，其以引用方式併入本文中)，例如使用20核苷酸之窗口尺寸、4核苷酸之字長及4分之空位罰分來確定，且使用市售程序(例如IntelligeneticsTM Suite,Intelligenetics Inc.CA)可便利地實施包括比對之序列數據之計算機輔助分析及闡釋。當稱RNA序列與DNA序列相似或具有一定程度之序列一致性或同源性時，認為DNA序列中之胸腺嘧啶(T)對等於RNA序列中之尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本發明範圍內且可藉由認為DNA序列中之胸腺嘧啶(T)對等於RNA序列中之尿嘧啶(U)自DNA序列導出。
有利地，諸如胺基酸序列一致性或同源性等序列一致性或同源性可使用在NCBI上可獲得之BlastP程序(Altschul等人，Nucl.Acids Res.25,3389－3402，其以引用方式併入本文中)以及經由因特網在諸如NCBI網站等站點上可獲得之相同或其他程序加以測定。
下列文件(各自以引用方式併入本文中)提供用於比較諸如兩蛋白質胺基酸殘基等序列相對一致性或同源性之算法，且另外或另一選擇為，對於上文而言，該等參考文獻中之教示可用於測定百分比同源性或一致性：Needleman SB及Wunsch CD，"A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins," J.Mol.Biol.48：444－453(1970)；Smith TF及Waterman MS,"Comparison of Bio－sequences," Advances in Applied Mathematics 2：482－489(1981)；Smith TF、Waterman MS及Sadler JR,"Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains," Nucleic Acids Res.,11：2205－2220(1983)；Feng DF及Dolittle RF,"Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees," J.of Molec.Evol.,25：351－360(1987)；Higgins DG and Sharp PM,"Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer," CABIOS,5：151－153(1989)；Thompson JD,Higgins DG and Gibson TJ,"ClusterW：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing,positions－specific gap penalties and weight matrix choice," Nucleic Acid Res.,22：4673－480(1994)；以及Devereux J,Haeberlie P and Smithies O,"A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX," Nucl.Acids Res.,12：387－395(1984)。而且，熟習此項技術者可咨詢許多其它程序或參考文獻以測定百分比同源性而不需過多實驗。
本發明疫苗包含編碼至少來自L.infantum 之KMP11多核苷酸或基因及/或來自L.chagasi 之KMP11多核苷酸或基因及/或來自L.donovani 之KMP11多核苷酸或基因之載體。有利地，在南歐洲、非洲及亞洲，疫苗包含編碼來自至少L.infantum 之KMP11多核苷酸或基因。有利地，在南美洲及中美洲，疫苗包含編碼來自至少L.chagasi 之KMP11多核苷酸或基因之載體。
不同物種中密碼子偏好可顯著不同。為增強外源蛋白之表現水平，重要的係使外源蛋白密碼子頻率與宿主表現系統之密碼子頻率匹配(Kim等人，Gene,1997,199(1－2)：293－301)。對於密碼子優化而言，可考慮除密碼子頻率外之其他因素，例如DNA基序及重複、二級結構、GC含量、重複密碼子、限制性內切核酸酶位點、類似剪接位點之功能性基序或終止子結構。已創建算法以幫助設計最優核酸序列。Geneart GmbH(Regensburg，德國)已研發出在單一作業中實施多參數優化之專利GeneOptimizerTM 軟體(WO－A－04/059556及WO－A－06/013103)。並行考慮最重要參數，該軟體在進化算法中可產生總計多達500,000個經優化目標序列變異體並選擇一最適宜者。已報導與初始基因序列相比該等經優化基因之表現產率增強多達100倍(Bradel－Tretheway等人，J.Virol.Methods,2003,111(2)：145－56；Disbrow等人，Virology,2003,311(1)：105－14)。
L.infantum 之KMP11蛋白之已公開核酸序列(NCBI GenBank數據庫存取號CAA64883)係藉由GeneOptimizerTM 軟體加以優化。
將L.infantum 之KMP11蛋白之密碼子經優化合成核酸序列命名為SEQ ID N°3。密碼子經優化核酸序列編碼含有與以GenBank CAA64883經揭示，亦命名為SEQ ID N°4之核酸序列相同之胺基酸序列之多肽。密碼子優化僅改變核酸序列而不改變所編碼胺基酸序列。
本發明另一目的係關於編碼利什曼原蟲KMP11抗原之密碼子經優化多核苷酸序列。本發明一實施例係密碼子經優化多核苷酸序列SEQ ID N°3，其編碼L.infantum KMP11抗原SEQ ID N°4。
另一目的係關於包含編碼利什曼原蟲KMP11抗原之密碼子經優化多核苷酸序列之活體內表現載體。該目的一實施例係包含編碼L.infantum KMP11抗原SEQ ID N°4之密碼子經優化多核苷酸序列SEQ ID N°3之活體內表現載體。
更一般而言，本發明涵蓋包含任一含有利什曼原蟲KMP11多核苷酸或基因及其活體內表現所需元件之質粒(歐洲專利第EP－A2－1001025號；Chaudhuri P Res.Vet.Sci.2001,70(3),255－6)之活體內表現載體。
本文所用術語"質粒"包括任一包含本發明多核苷酸及其在期望宿主或目標細胞中活體內表現所需元件之DNA轉錄單元；且就此而言，應注意本發明範圍意欲涵蓋超螺旋或非超螺旋、環狀質粒以及線性形式質粒。
在一具體非限制性實例中，pVR1020或pVR1012質粒(VICAL公司；Luke C.等人，Journal of Infectious Diseases,1997,175,91－97；Hartikka J.等人，Human Gene Therapy,1996,7,1205－1217)或pAB110(美國專利第6,852,705號)可用作多核苷酸序列之插入載體。pVR1020質粒係衍生自pVR1012且包含人類tPA信號序列。各質粒包括或包含或主要包含以可操作方式連接至啟動子或在啟動子控制下或依賴啟動子之本發明多核苷酸，其中該啟動子有利地毗連至本發明多核苷酸。一般而言，有利地採用在真核細胞中起作用的強啟動子。有用啟動子之一實例係人類或鼠類來源之立即早期巨細胞病毒啟動子(CMV－IE)，或視情況具有諸如大鼠或豚鼠等另一來源。CMV－IE啟動子可包括實際啟動子部分，其可與或不與增強子部分結合。可參照歐洲專利第EP－A－260148號、歐洲專利第EP－A－323 597號、美國專利第5,168,062號、第5,385,839號及第4,968,615號以及PCT專利申請案第WO－A－87/03905號。有利地，CMV－IE啟動子係人類CMV－IE(Boshart M.等人，Cell,1985,41,521－530)或鼠類CMV－IE。更一般而言，該啟動子源自病毒或細胞。可有效地用於實踐本發明之強病毒啟動子(CMV－IE除外)係SV40病毒之早期/晚期啟動子或勞斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒之LTR啟動子。可有效地用於實踐本發明之強細胞啟動子係細胞骨架基因之啟動子，例如結蛋白啟動子(Kwissa M.等人，Vaccine,2000,18,2337－2344)，或肌動蛋白啟動子(Miyazaki J.等人，Gene,1989,79,269－277)。本發明包括該等啟動子之功能性亞片段，即該等啟動子維持足夠啟動子活性之部分，例如，PCT專利申請案第WO－A－98/00166號或美國專利第6,156,567號之經截短CMV－IE啟動子可用於實踐本發明。因此，可用於實踐本發明之啟動子包括全長啟動子之維持足夠啟動子活性且因此可用作啟動子之衍生物及亞片段，有利地，該衍生物或亞片段之啟動子活性實質上類似於衍生出其之實際或全長啟動子之活性，例如，類似於美國專利第6,156,567號之經截短CMV－IE啟動子之活性而非全長CMV－IE啟動子之活性。因此，用於實踐本發明之CMV－IE啟動子可包括或主要包含或包含全長啟動子之啟動子部分及/或全長啟動子之增強子部分以及衍生物及亞片段。
有利地，質粒包括或主要包含其他表現控制元件。尤其有利地，引入穩定序列，例如內含子序列，例如hCMV－IE之第一內含子(PCT專利申請案第WO－A－89/01036號)、兔β－珠蛋白基因之內含子II(van Ooyen等人，Science,1979,206,337－344)。關於質粒及病毒載體(痘病毒除外)之聚腺苷酸化信號(polyA)，可更多使用牛生長激素(bGH)基因之poly(A)信號(參見美國專利第5,122,458號)或兔β－珠蛋白基因之poly(A)信號或SV40病毒之poly(A)信號。
在本發明一實施例中，質粒載體係如本文中實例1所述之pVR1020 KMP11。
更一般而言，本發明涵蓋包含含有利什曼原蟲KMP11之多核苷酸或基因及其活體內表現所需之所有彼等元件之任一重組病毒載體之活體內表現載體。
舉例而言，該等重組病毒載體可選自痘病毒，尤其禽痘病毒(avipoxvirus)，例如雞痘病毒或金絲雀痘病毒。在一實施例中，雞痘病毒係TROVAC(參見WO－A－96/40241)。在另一實施例中，金絲雀痘病毒係ALVAC。該等重組病毒載體之用途及目標多核苷酸或基因之插入全面闡述於美國專利第US－A－5,174,993號中；美國專利第US－A－5,505,941號及第US－A－5,766,599號闡述雞痘病毒，且在美國專利第US－A－5,756,103號中闡述金絲雀痘病毒。病毒基因組內一個以上插入位點可用於插入多個目標基因。
在一實施例中病毒載體係腺病毒，例如人類腺病毒(HAV)或犬腺病毒(CAV)。
在另一實施例中病毒載體係人類腺病毒，具體而言為血清型5腺病毒，其相比以存取號M73260揭示於Genbank中及揭示於參照出版物Chroboczek等人，1992中之hAd5序列缺失病毒基因組E1區，尤其缺失自約核苷酸459至約核苷酸3510，因而不能複製。使所缺失腺病毒在E1－表現293(Graham等人，1977)或PER細胞中增殖，尤其在PER.C6(Falloux等人，1998)中。此外或另一選擇為，人類腺病毒可在E3區缺失，尤其缺失約核苷酸28592至約核苷酸30470。在E1區之缺失可與E3區之缺失共同達成(參見例如Shriver等人，2002；Graham等人，1991；Ilan等人，1997；美國專利第6,133,028號及第6,692,956號；Tripathy等人，1994；Tapnell,1993；Danthinne等人，2000；Berkner,1988；Berkner等人，1983；Chavier等人，1996)。在E1及/或E3區部分或全部缺失後插入位點最終可為E1及/或E3基因座(區)。有利地，若表現載體為腺病毒，可在真核細胞中起作用啟動子控制下插入待表現多核苷酸，例如強啟動子，較佳巨細胞病毒立即早期基因啟動子(CMV－IE啟動子)，尤其在Boshart等人，1985中自約核苷酸－734至約核苷酸＋7之增強子/啟動子區或來自Promega公司pCI載體之增強子/啟動子區。CMV－IE啟動子較佳源自鼠類或人類。亦可使用延伸因子1α之啟動子。亦可使用肌肉專一性啟動子(Li等人，1999)。本文亦結合質粒載體討論強啟動子。在一實施例中，剪接序列可位於增強子/啟動子區下游。舉例而言，自CMV－IE基因分離之內含子1(Stenberg等人，1984)、自兔或人類β－珠蛋白基因分離之內含子，尤其來自b－珠蛋白基因之內含子2、自免疫球蛋白基因分離之內含子、來自SV40早期基因之剪接序列或自來自Promege公司之pCI載體分離之嵌合內含子序列，其包含人類β－珠蛋白基因供體序列，可將其融合至小鼠免疫球蛋白受體序列(以存取號CVU47120存於Genbank中之自約核苷酸890至約核苷酸1022)中。可將poly(A)序列及終止子序列插入待表現多核苷酸下游中，例如牛生長激素基因(尤其以存取號BOVGHRH存於Genbank中之自約核苷酸2339至約核苷酸2550)、兔β－珠蛋白基因或SV40晚期基因聚腺苷酸化信號。
在另一實施例中病毒載體為犬腺病毒，尤其為CAV－2(參見例如Fischer等人，2002；美國專利第5,529,780號及第5,688,920號；PCT專利申請案第WO95/14102號)。對於CAV，插入位點可在E3區及/或在位於E4區及右側ITR區之間之區域(參見美國專利第6,090,393號及第6,156,567號)。在一實施例中插入片段係在啟動子控制下，例如巨細胞病毒立即早期基因啟動子(CMV－IE啟動子)或已闡述用於人類腺病毒載體之啟動子。可將poly(A)序列及終止子序列插入待表現多核苷酸下游中，例如牛生長激素基因或兔β－珠蛋白基因聚腺苷酸化信號。
在另一實施例中，病毒載體為皰疹病毒，例如犬皰疹病毒(CHV)或貓皰疹病毒(FHV)。對於CHV，插入位點可在胸苷激酶基因中、在ORF3中、或在UL43 ORF(參見美國專利第6,159,477號)中。在一實施例中待表現多核苷酸係在真核細胞中起作用啟動子控制下插入，較佳為CMV－IE啟動子(鼠類或人類)。可將poly(A)序列及終止子序列插入待表現多核苷酸下游中，例如牛生長激素或兔β－珠蛋白基因聚腺苷酸化信號。
對於基於痘病毒載體之重組載體，可使用牛痘病毒或經減毒牛痘病毒(例如MVA，安卡拉(Ankara)疫苗株在雞胚成纖維細胞上傳代570次後獲得之經修飾安卡拉株；參見Stickl及Hochstein－Mintzel,Munch.Med.Wschr.,1971,113,1149－1153；Sutter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1992,89,10847－10851；以ATCC VR－1508獲得；或以NYVAC獲得，參見美國專利第5,494,807號，例如美國專利第5,494,807號之實例1至6以及下列等等，該等文獻討論NYVAC之構建、及NYVAC之變異形式，在該等變異形式中自哥本哈根(Copenhagen)株牛痘病毒基因組缺失另外的ORF以及異源性編碼核酸分子插入至該重組體之位點，亦論述經匹配啟動子之使用；亦參見WO－A－96/40241)、禽痘病毒或經減毒禽痘病毒(例如金絲雀痘、雞痘、斑鳩痘、鴿痘、鵪鶉痘、ALVAC或TROVAC；參見例如美國專利第5,505,941號、第5,494,807號)。經減毒金絲雀痘病毒闡述於美國專利第5,756,103號(ALVAC)及WO－A－01/05934中。亦可參考美國專利第5,766,599號，其係關於經減毒雞痘病毒株TROVAC。可參考可以存取號VR－111自ATCC獲得之金絲雀痘病毒。亦可利用許多雞痘病毒變異株，例如由MERIAL出售之DIFTOSEC CT株及由INTERVET出售之NOBILIS VARIOLE疫苗。對於用於生成其重組體之方法及如何投與其重組體之信息，熟習此項技術者可參考本文所引用文件及WO－A－90/12882，例如對於牛痘病毒尤其可提及美國專利第4,769,330號、第4,722,848號、第4,603,112號、第5,110,587號、第5,494,807號及第5,762,938號；對於雞痘病毒尤其可提及美國專利第5,174,993號、第5,505,941號及第5,766,599號及其它文獻；對於金絲雀痘病毒可提及美國專利第5,756,103號。當該表現載體係牛痘病毒時，待表現多核苷酸插入位點較佳位於胸苷激酶(TK)基因或插入位點、血凝素(HA)基因或插入位點、編碼A型包涵體(ATI)之區域；亦可參見本文所引用文獻，尤其關於牛痘病毒之彼等。倘若為金絲雀痘病毒，插入位點較佳為ORF C3、ORF C5及/或ORF C6；亦可參見本文所引用文獻，尤其關於金絲雀痘病毒之彼等。倘若為雞痘病毒，插入位點較佳為ORF F7及/或ORF F8；亦可參見本文所引用文獻，尤其關於雞痘病毒之彼等。MVA病毒區之插入位點較佳如各種出版物中所示，包括Carroll M.W.等人，Vaccine,1997,15(4),387－394；Stittelaar K.J.等人，J.Virol.,2000,74(9),4236－4243；Sutter G.等人，1994,Vaccine,12(11),1032－1040；且有鑒於此亦應注意完整MVA基因組闡述於Antoine G.,Virology,1998,244,365－396中，其使熟習此項技術者可使用其他插入位點或其它啟動子。有利地，在專一性痘病毒啟動子控制下插入待表現多核苷酸，例如牛痘啟動子7.5 kDa(Cochran等人,J.Virology,1985,54,30－35)、牛痘啟動子I3L(Riviere 等人，J.Virology,1992,66,3424－3434)、牛痘啟動子HA(Shida,Virology,1986,150,451－457)、牛痘啟動子ATI(Funahashi等人，J.Gen.Virol.,1988,69,35－47)、牛痘啟動子H6(Taylor J.等人，Vaccine,1988,6,504－508；Guo P.等人J.Virol.,1989,63,4189－4198；Perkus M.等人，J.Virol.,1989,63,3829－3836)及其它啟動子。
在另一實施例中，重組病毒載體為重組ALVAC金絲雀痘病毒vCP2350，如實例3中所述。
可將包含本發明重組病毒載體之疫苗冷凍乾燥，較佳使用穩定劑。可根據熟知標準冷凍乾燥程序實施冷凍乾燥。醫藥上或獸醫學上可接受之穩定劑可為碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、右旋糖、海藻糖)、麩胺酸鈉(Tsvetkov T等人，Cryobiology 1983,20(3)：318－23；Israeli E等人，Cryobiology 1993,30(5)：519－23)、蛋白質(例如蛋白腖、白蛋白、乳清蛋白或酪蛋白)、諸如脫脂奶等包含試劑之蛋白質(Mills C K等人，Cryobiology 1988,25(2)：148－52；Wolff E等人，Cryobiology 1990,27(5)：569－75)及緩衝液(例如磷酸鹽緩衝液、鹼金屬磷酸鹽緩衝液)。可使用佐劑以使經冷凍乾燥製劑可溶。
本發明之任何疫苗組合物較佳亦可包含一或多種佐劑。
對於質粒： 質粒基疫苗可使用陽離子脂質加以調配，較佳使用DMRIE(N－(2－羥乙基)－N,N－二甲基－2,3－雙(十四烷氧基)－1－丙銨；WO－A－96/34109)且較佳與中性脂質結合，例如DOPE(二油醯基－磷脂醯基－乙醇胺；Behr J.P.,Bioconjugate Chemistry,1994：5：382－389)，以形成DMRIE－DOPE。在一實施例中，當場製備混合物，且在其投與前較佳等待約10分鐘至約60分鐘(例如約30分鐘)以使該混合物適當錯合。倘若使用DOPE，DMRIE/DOPE之莫耳比可為自95/5至5/95且較佳為1/1。質粒/DMRIE或DMRIE－DOPE佐劑之重量比為(例如)自50/1至1/10、自10/1至1/5或自1/1至1/2。
視情況可向組合物添加細胞因子，尤其GM－CSF或誘導Th1之細胞因子(例如IL12)。可以編碼細胞因子蛋白之質粒形式將該等細胞因子添加至組合物。在一實施例中，細胞因子係源自犬，例如犬GM－CSF，其基因序列存於GenBank數據庫中(存取號為S49738)。可以與WO－A－00/77210(以引用方式併入本文中)中所述相似之方式使用該序列製備該質粒。
對於重組病毒載體： 可將重組病毒載體基疫苗與fMLP(N－甲醯基－甲硫胺醯基－白胺醯基－苯丙胺酸；以引用方式併入本文中之美國專利第US－A－6,017,537號)及/或卡波姆(Carbomer)佐劑(Phameuropa Vol.8,No.2,June 1996)組合。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號(以引用方式併入本文中)，其闡述與聚羥基化化合物交聯之該等丙烯酸聚合物，該聚羥基化化合物具有至少3個羥基，較佳不超過8個，且至少3個羥基之氫原子經具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團取代。舉例而言，該等基團係含有2－4個碳原子之彼等，例如乙烯基、烯丙基及其他乙烯系不飽和基團。不飽和基團自身可含有諸如甲基等其他取代基。以Carbopol(BF Goodrich,Ohio,USA)之名出售之產品適合使用。該等產品可與烯丙基蔗糖或與烯丙基異戊四醇交聯。其中較佳可提及Carbopol974P、934P及971P。
馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)較佳，其為馬來酸酐與乙烯之線性或經交聯共聚物，例如經二乙烯醚交聯。可參考J.Fields等人，Nature,186：778－780,4 June 1960，其以引用方式併入本文中。
舉例而言，由具有下式之基本單元形成丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物及共聚物EMA：其中：－R1 及R2 相同或不同，代表H或CH3 －x＝0或1，較佳地，x＝1－y＝1或2，其中x＋y＝2
對於共聚物EMA，x＝0且y＝2。對於聚羧乙烯製劑，x＝y＝1。
將該等聚合物溶解於水中生成酸溶液，較佳將其中和至生理pH以提供疫苗自身納入其中之佐劑溶液。則該聚合物之羧基基團部分為COO－ 形式。
在一實施例中，佐劑，尤其聚羧乙烯製劑之溶液較佳在氯化鈉存在下用蒸餾水製備，所獲得溶液pH為酸性。藉由將該母液以數份同時添加至期望量(以獲得期望終濃度)或其實質部分的含NaCl之水(較佳為生理鹽水(9克/升NaCl))中將其稀釋，同時或之後較佳用NaOH將其中和(pH 7.3－7.4)。將此生理性pH溶液用於與尤其可以經冷凍乾燥、液態或經冷凍形式儲存之疫苗混合。
最終疫苗組合物中之聚合物濃度可為0.01%－2% w/v、0.06－1% w/v或0.1－0.6% w/v。
本發明另一態樣係使用本發明疫苗組合物對利什曼原蟲易感患者實施初免－加強接種之方法。
就定義而言，利什曼原蟲易感患者涵蓋人類、貓科動物(舉例而言，即家貓、小貓、大貓及野貓)及犬科動物(舉例而言，即雄狗、雌狗、幼狗、狐、豺及狼)。在一實施例中，犬係投與本發明疫苗之適宜患者。
該等初免－加強投與方法包括至少兩次不同投與，其包括至少一次初免投與有效量之本發明疫苗組合物及一定時間段後至少一次加強投與有效量之本發明疫苗組合物，其中1)用於初免投與之疫苗組合物係質粒基疫苗，而用於加強投與之疫苗組合物係重組病毒載體基疫苗；及/或2)用於初免投與之疫苗組合物係與電轉移治療結合之質粒基疫苗，而用於加強投與之疫苗組合物係重組病毒載體基疫苗；及/或3)初免投與及加強投與之疫苗組合物相同但用於初免投與及加強投與之投與途徑及/或投與工具不同。舉例而言，投與途徑可為肌內(IM)或皮內(ID)或皮下投與。舉例而言，投與工具可為具針注射器，或無針裝置，或與電轉移(ET)治療結合之具針注射器，或與ET治療結合之無針裝置。
初免－加強投與較佳相隔2－6週，例如相隔約3週實施。根據一個實施例，亦可考慮半年一次加強投與或一年一次加強投與，較佳使用基於病毒載體之疫苗。首次投與時，動物較佳為至少6－8週齡。
初免－加強投與方案之另一個實施例包括初免投與基於質粒之疫苗及加強投與基於重組痘病毒載體之疫苗，例如具有金絲雀痘病毒載體。初免及加強投與二者較佳皆使用無針裝置經由皮內(ID)途徑實施。在一個實施例中，該基於質粒之疫苗係如實例1中所述包含pVR1020 KMP11之疫苗，該金絲雀痘病毒載體係如實例3中所述之vCP2350。
在本發明之另一個實施例中，初免投與係以基於質粒之疫苗使用無針裝置經由ID途徑進行，加強投與係以基於質粒之疫苗使用注射器及針經由肌內(IM)途徑結合ET治療進行。在另一個實施例中，該基於質粒之疫苗係如實例1中所述包含pVR1020 KMP11之疫苗。
初免－加強投與方案之另一個實施例包括初免投與基於質粒之疫苗結合ET治療，及加強投與基於重組痘病毒載體之疫苗，較佳具有金絲雀痘病毒載體。初免投與較佳經肌內途徑實施，而加強投與較佳使用無針裝置經由皮內(ID)途徑實施。在另一個實施例中，該基於質粒之疫苗係如實例1所述包含pVR1020 KMP11之疫苗，該金絲雀痘病毒載體係如實例3所述之vCP2350。
在另一個實施例中，初免投與包括基於質粒之疫苗使用注射器及針經由肌內(IM)途徑與ET治療結合，而加強投與包括基於質粒之疫苗使用無針裝置經由ID途徑。在一個實施例中，該基於質粒之疫苗係如實例1中所述包含pVR1020 KMP11之疫苗。
在初免－加強投與之一實施例中，初免投與使用無針裝置經由ID途徑投與質粒基疫苗，首次加強投與包括使用與ET治療結合之注射器及針經由IM途徑投與質粒基疫苗，而第二次加強投與使用無針裝置經由ID途徑投與較佳具有金絲雀痘病毒載體之重組病毒載體基疫苗。在另一實施例中，該質粒基疫苗係如實例1中所述包含pVR1020 KMP11之疫苗，且該金絲雀痘病毒載體係如實例3中所述vCP2350。
本發明另一態樣係本發明質粒基疫苗用於投與至利什曼原蟲易感動物之用途，其中該投與係與ET治療結合。較佳經肌內途徑投與質粒基疫苗。舉例而言，投與工具為注射器及針。可接連投與一或數次注射。倘若數次注射，其實施可相隔2－6週，例如相隔約3週。根據一實施例，亦可考慮半年一次加強免疫或一年一次加強免疫。
對於質粒基疫苗，較佳投與途徑為ID。該投與可藉由具針注射器或類似於Dermojet或Biojector(Bioject,Oregon,USA)或VetjetTM (Merial)或VitajetTM (Bioject Inc.)之無針裝置來達成，參見美國專利第US－A－2006/0034867號。劑量可為每質粒50微克至500微克。若添加DMRIE－DOPE，可採用100微克/質粒。若使用犬GM－CSF或其他細胞因子，編碼該蛋白質之質粒可以約200微克至約500微克之劑量存在且較佳可為200微克。劑量體積可為0.01毫升至0.5毫升，例如0.25毫升。可以多點注射提供投與。
用於質粒基疫苗之另一預想投與途徑可為與電轉移(ET)治療結合之IM途徑。可使用電轉移用裝置及廠商說明書(即Sphergen G250發生器(Sphergen SARL,Evry Genopole,France)；MedPulserDNA電穿孔系統(Innovio Biomedical Corporation,San Diego,California,USA))實施ET治療。在一實施例中，電轉移用裝置具有單極電場。場強可為約50至約250 V/公分、約50至約200 V/公分或約50至約175 V/公分。脈衝持續時間為約1至約50毫秒或約15至約25毫秒。頻率可為約1至約50 Hz或約5至約15 Hz。脈衝間歇可為約1至1000毫秒或約1至約200毫秒。脈衝數為1至20或5至10。組織內強度較佳高達約2A。電極間距離為約0.2至約1公分或約0.2至約0.5公分。
對於重組病毒載體基疫苗，投與途徑較佳為ID。該投與可藉由具針注射器或類似於Dermojet或Biojector(Bioject,Oregon,USA)或VetjetTM (Merial)或VitajetTM (Bioject Inc.)之無針裝置來達成。劑量為約103 pfu至約109 pfu/重組痘病毒載體。若載體為金絲雀痘病毒，劑量為(例如)約105 pfu至約109 pfu或約106 pfu至約108 pfu。劑量體積為約0.01毫升至0.2毫升，且較佳為0.1毫升。投與可包括多點注射。
對於IM途徑所提供疫苗體積為0.2至2毫升或約0.5至1毫升。相同劑量可用於本發明任一載體。
本發明另一態樣係用於本發明初免－加強接種之套組套組包含至少兩小瓶：第一瓶含有用於本發明初免接種之疫苗，而第二瓶含有用於本發明加強接種之疫苗。套組較佳可包含額外的第一或第二小瓶用於額外的初免接種或額外的加強接種。
在一實施例中，套組包含兩小瓶，一瓶含有用於本發明初免接種之質粒基疫苗，另一瓶含有用於本發明加強接種之重組病毒載體基疫苗。
在另一實施例中，套組包含兩小瓶，一瓶含有用於本發明初免接種之pVR1020 KMP11質粒基疫苗，另一瓶含有用於本發明加強接種之vCP2350載體基疫苗。
現在將藉由下列非限制性實例進一步闡述本發明。
實例
無需贅述，相信熟習此項技術者可利用前述內容充分實踐本發明。下文詳細實例應僅視為說明性而非以任一方式限制前述揭示內容。熟習此項技術者可自該等程序中迅速辨別出對於反應物及對於反應條件及技術之適宜變化方案。
DNA插入片段、質粒、重組病毒載體之構建係使用J.Sambrook等人所述標準分子生物學技術加以實施(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)。用於本發明之所有限制性片段皆係使用"Geneclean"套組(BIO 101公司,La Jolla,Calif.)加以分離。
實例1：構建表現L.infantum KMP11抗原之質粒
使用化學方式合成編碼L.infantum KMP11之核酸序列，其具有SEQ ID NO：1中所述序列且具有多腺嘌呤尾。將KMP11片段藉由PCR擴增且選殖入具有組織血纖維蛋白溶酶原激活子信號肽(TPA)之pVR2001－TOPA(或pVR2001－TOPO)之TOPO選殖位點(Oliveira F.等人，Vaccine(2006)24：374－90)中以獲得質粒pVR1020 KMP11。VR2001－TOPO係衍生自質粒VR1020。VR1020係可自Vical公司(Sandiego,CA)獲得之先前已使用之質粒骨架，參見例如美國專利第6,451,769號及第7,078,507號；如Oliveira等人所述，質粒VR2001－TOPO(或pVR2001－TOPA)係藉由添加側結選殖位點之拓撲異構酶修飾之VR1020且包含編碼或表現可增加產生分泌蛋白質可能性之信號分泌肽之編碼序列(參見Oliveira F.等人Vaccine(2006)24：374－90中之圖1)。
質粒pVR1020 KMP11一鏈之核酸序列闡述於SEQ ID NO：5中，且圖10提供質粒圖譜。根據本發明，VR1020 KMP11因此包含且表現編碼用於哺乳動物細胞中驅動表現之啟動子之DNA、編碼用於促進自哺乳動物細胞分泌/釋放原核蛋白質序列之前導肽之DNA(例如CMV啟動子)、編碼KMP11之DNA及編碼終止子之DNA。VR1020 KMP11另外包含側結編碼KMP11且包含增加產生分泌蛋白可能性之信號分泌肽之編碼序列之DNA之拓撲異構酶。
實例2：用質粒基疫苗實施抵抗利什曼病之狗初免－加強接種
用表現L.infantum KMP11抗原之質粒或用不含插入片段之對照質粒接種各有5只常見狗之兩組。在D0使用Merial VetjetTM 無針注射器經由皮內實施初免投與。
Merial VetjetTM 使用壓縮空氣作為動力源。與當前針之使用相比，無針注射可降低注射位點之損傷及創傷。藉由使噴嘴對著患者置放來啟動裝置且該裝置直至整個機構克服彈簧負載前進約0.30"才發射。
Merial VetjetTM 之操作循環具有三個基本步驟：(1)拉動觸發器，(2)將裝置按壓在目標注射位點上，及(3)將裝置自注射位點拉開且釋放觸發器。拉動觸發器時觸發器開啟啟動器閥門。觸發器將發射機構置入初免位點中。當將該裝置按壓至目標注射位點時，發射機構滑回並放開提升閥門且經由噴嘴發射藥物。當將裝置自注射位點拉走並放開觸發器時，發射機構縮回。將廢氣排出，啟動染色系統(若需要)。藥物填充系統裝填新劑量。
投與前將兩組各自5只常見狗之腿內側區域除毛並用聚維酮碘(Vetedine,Vetoquinol,Lure,France)消毒。經接種狗(n＝5)右腿內側接受存於0.2毫升體積pH 8之TE緩衝液中之400微克劑量經純化pVR1020 KMP11質粒(即2毫克/毫升)(參見實例1)。對照狗(n＝5)以相似方式接受空白表現質粒R1020。用於此投與之狗未經麻醉。
在D21使用與初免所用相同之質粒(即在經接種狗中使用pVR1020 KMP11而在對照狗中使用pVR1020)及相同劑量(2毫克/毫升之400微克)但使用與電轉移(ET)治療結合之肌內輸送實施加強投與。使用5毫克/公斤氯胺酮(ketamine)及10毫克/公斤美托咪定(medetomidine)經由肌內途徑將狗麻醉。
將IM投與及ET治療施用至左腿內側區域(即左側半膜肌)。治療前將該區域除毛且用聚維酮碘(Vetedine)消毒。使用各針相隔0.5公分之Sphergen 3針裝置INJ－1(Sphergen SARL,Evry Genopole,France)實施注射。注射後立即使用Sphergen G250發生器(Sphergen SARL,Evry Genopole,France)實施ET治療。使用下列ET規格：T1：20毫秒，T2：80毫秒，頻率：10 Hz，10脈衝。外施電壓為87.5 V，在肌肉內產生175 V/公分之電場。
在D0、D14、D41、D55及D76分析血清之CD8＋ 細胞頻率(參見圖1)、干擾素－γ－生成(IFN－γ)細胞頻率(參見圖2)、專一性CD8 T細胞增殖(參見圖3)及專一性CD4 T細胞增殖(參見圖4)。
藉由培養全血產生IFN－γ 在48孔平底培養板中用補加3%抗生素/抗真菌藥溶液之RPMI(GIBCO,Grand Island,NY,USA)將全血以1：8稀釋，終體積為1毫升/孔。藉由添加25微克/毫升溶於佛波醇(Phorbol)12－豆蔻酸酯13－乙酸酯(PMA,Sigma－Aldrich Co.,USA)之L.infantum 提取物(SLE)來刺激細胞。在37℃下培養48小時後，自每孔移出700微升上清液且在－20℃下保存直至需要將其用於細胞因子分析。根據廠商說明書使用狗ELISA捕獲分析(R&D系統,Minneapolis,MN,USA)量測IFN－γ。使用生物素標記檢測抗體，其使用抗生蛋白鏈菌素－HRP(Amersham Biosciences)及TMB底物(KPL,Gaithesburgh,MD,USA)揭示。藉由向各孔添加終止溶液(KPL)來終止反應。在450奈米處用自動微量ELISA讀數器(Thermo Multiskan EX,Waltham,MA,USA)讀取吸光度值。
外周血細胞特性及細胞因子染色 使用在指定日期採集之全血樣品實施外周血細胞群之表現型分析。簡言之，用固定劑溶液(10.0克/升低聚甲醛；10.2克/升卡可酸(cacodylic acid)；6.65克/升氯化鈉；pH 7.2)固定1毫升血液且溶解紅細胞。培養10分鐘後，用PBS－1% BSA緩衝液將細胞洗滌兩次。在96孔圓底微量培養板中用抗犬CD4－Alexa 647及抗犬CD8－PE實施表面染色。用FACScalibur流式細胞儀(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)獲取螢光標記細胞之數據。至少計得3萬次事件。在用皂苷透化後使用抗牛IFN－γ－PE(Serotec)對IFN－γ實施細胞內細胞因子染色。
外周血白血球(PBL)之淋巴組織增殖 使用在用聚蔗糖分離後獲得之PBL實施淋巴組織增殖分析。將PBMC稀釋於1毫升磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)中且用螢光染料羧基螢光素二乙酸鹽琥珀醯亞胺酯(CFSE,Molecular probes,Carlsbad,California,USA)染色。染色後，將細胞懸浮於200微升補加10% FBS及3%抗生素/抗真菌藥溶液之RPMI(GIBCO,Grand Island,NY,USA)中。所有測試皆在96孔平底培養板中使用25微克/毫升濃度之SLE及160微克/毫升伴刀豆球蛋白A(ConA)(Sigma－Aldrich Co.,USA)重複實施三次。在加濕5%之CO2 氣氛中於37℃下實施5天之培養。然後收集細胞並如上所述染色用於CD4或CD8表現。根據該等群中螢光強度之損失評估增殖百分比。
血清學分析 在不同時間點收集血液且將血清分離並在－20℃下儲存。藉由間接酶聯免疫吸附分析(ELISA)量測抗原專一性犬IgG、IgG1 及IgG2 。簡言之，將抗原塗敷至96孔微量培養板(MaxiSorpTM ,Nalge Nunc,Rochester,NY,USA)上，SLE濃度為8微克/毫升而重組抗原為5微克/毫升。以1：100、1：500之濃度添加血清，然後進行三倍連續稀釋，之後洗滌，並分別以1：8000、1：1500及1：3000之稀釋度添加過氧化物酶－偶聯之抗狗IgG、IgG1 及IgG2 (Bethyl Laboratories公司，Montgomery,TX,USA)。然後洗滌孔並添加底物及色原體(TMB,KPL)且在自動ELISA微量培養板讀數器上於450奈米處讀取吸光度。使用對照犬血清之平均吸光度作為基線。將高於基線三倍以上之最後血清稀釋度視為滴定終點。計算各組五隻狗該等終點之幾何平均數。
西方點漬分析 使用SLE(0.6毫克/毫升)實施西方點漬分析，將其在SDS樣品緩衝液中煮沸，在4－12%梯度Tris－甘胺酸SDS－PAGE凝膠(Invitrogen,Cal)上分離且將其轉移至PVDF膜(Pall Life Sciences,East Hills,NY)上。用封阻劑溶液(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)將點漬封阻過夜且用以1：1000稀釋之各單一血清加以探測。將辣根過氧化物酶－偶聯抗狗以1：2000稀釋度用作第二抗體。根據廠商說明書使用ECL試劑(Amersham Biosciences,Buckinghamshire,England)實施顯影。
圖1展示加強投與後經KMP11接種狗之血清與對照狗之血清之間存於外周血中總CD8 T細胞之顯著差異(p＝0.01)。
圖2展示初免投與後及加強投與後經KMP11接種狗之血清與對照狗之血清之間存於外周血中總IFN－γ－生成細胞之顯著差異(p＝0.04)。
圖3展示加強投與前(初免3週後)及加強投與後經KMP11接種狗之血清與對照狗之血清之間存於外周血中總抗KMP11 CD8 T細胞之顯著差異(p＝0.007)。
圖4展示加強投與前(初免3週後)及加強投與後經KMP11接種狗之血清與對照狗之血清之間存於外周血中總專一性抗KMP11 CD4 T細胞之顯著差異(p＝0.03)。
在D0、D14、D41、D55及D76，亦藉由西方點漬法使用6微克/10微升/泳道之L.infantum 溶解產物分析血清之抗體響應(參見圖5)。以1：1000之稀釋度測試血清。第二抗體為以1：2000稀釋度使用之HRP抗犬IgG試劑。繪示於圖5中之西方點漬分析結果顯示清晰的加強後KMP11專一性IgG響應(參見畫圈譜帶)。
實例3：構建表現L.infantum KMP11抗原之ALVAC金絲雀痘病毒載體
用於構建vCP2350之核苷酸插入片段係衍生自由GeneArt GmbH(Regensburg,Germany)提供之L.infantum KMP11基因。該核酸序列係合成序列，其中密碼子經優化以在哺乳動物細胞中表現(SEQ ID NO：3)。該核酸序列編碼L.infantum KMP11抗原(SEQ ID NO：4)。兩個不同酵素限制位點結合至該核苷酸插入片段兩側，編碼區之EcoRV位點5'及編碼區之XbaI位點3'。
為構建ALVAC供體質粒pALVAC C5 H6p－利什曼原蟲－11(pJSY1992.1)，使用EcoRV/XbaI消化劑消化該核苷酸插入片段以分離包含合成KMP11基因之片段。(關於質粒pALVAC及C5基因座之討論及實例參見例如美國專利第5,756,103號；第5,833,975號；及第6,780,407號)。先前人們已闡述牛痘病毒H6啟動子之序列(參見例如Taylor等人，Vaccine.6：497－503,1988a；Taylor等人，Vaccine.6：504－508,1988b；Guo等人，J Virol 63：4189－4198,1989)。
然後將該片段連接至經EcoRV/XbaI消化之pALVAC C5 H6p供體(pCXL148.2)上。對所得質粒pJSY1992.1(圖6)實施測序(SEQ ID NO：6)且確認其包含KMP11基因之正確核酸序列(SEQ ID NO：3)。
為生成vCP2350，用NotI限制酶使包含合成KMP11基因之質粒pJSY1992.1線性化。藉由使用先前所述磷酸鈣沈澱法(Panicali等人，Proc.Natl Acad Sci USA,1982,79：4927－4931；Piccini等人，Methods Enzymol.,1987,153：545－563)將經線性化片段獨立地轉染至經ALVAC感染之CEF原代細胞中。24小時後，將經轉染細胞收集、實施超音波處理且用於篩選重組病毒。
根據廠商規程(Amersham Cat# RPN－3001)基於噬菌斑轉印雜交方法使用經辣根過氧化物酶標記之利什曼原蟲合成KMP11專一性探針篩選重組噬菌斑。連續三輪噬菌斑純化後，生成命名為vCP2350.1.1.5之重組體且藉由雜交確認其對利什曼原蟲合成KMP11插入片段為100%陽性而對C5 ORF為100%陰性。
自第三輪噬菌斑純化中選擇一單噬菌斑且使其擴張以獲得P1(60毫米)、P2(T75燒瓶)、P3(滾瓶)原液以擴增vCP2350.1.1.5。自滾瓶收穫經感染細胞培養液且將其濃縮以產生病毒原液(約3.5毫升，1.3×1010 PFU/毫升)。
以Vector NTI創建基因組DNA之理論性限制酶凝膠且將其展示於圖7中。基因組DNA係自vCP2350.1.1.5提取且用BglII、HindIII及PstI將其消化，且藉由0.8%瓊脂糖凝膠電泳將其分離。結果顯示外源基因序列之正確插入(參見圖8)。
將經BglII、HindIII及PstI消化之基因組DNA轉移至耐綸膜且藉由用利什曼原蟲合成KMP11探針探測來實施Southern印迹分析。譜帶經觀察為所期望尺寸，表示利什曼原蟲合成KMP11正確插入C5基因座(圖9)。
藉由C5基因座側臂及利什曼原蟲合成KMP11插入片段之PCR擴增及序列分析實施對P3原液基因組DNA之更詳細分析。使用位於C5基因座臂以外之引物7931.DC(SEQ ID NO：7)及7932.DC(SEQ ID NO：8)來擴增整個C5R－利什曼原蟲合成KMP11插入片段－C5L片段。結果顯示vCP2350.1.1.5中利什曼原蟲合成KMP11插入片段之序列及利什曼原蟲合成KMP11插入片段附近C5左右臂係正確的。
因此本發明重組載體可包含重組禽痘病毒，例如金絲雀痘病毒載體(例如重組ALVAC載體)，其具有用於驅動表現之啟動子(例如H6啟動子)，其在諸如金絲雀痘病毒(例如ALVAC)之C3或C5基因座等禽痘病毒基因組中適宜位點以可操作方式連接至編碼KMP11之DNA。
實例4：用質粒基疫苗及ALVAC金絲雀痘病毒載體基疫苗實施抵抗利什曼病之狗初免－加強接種
在初免投與後第17週，向實例2經接種組動物投與存於0.2毫升體積pH 8之TE緩衝液(即2毫克/毫升)中之實例3ALVAC金絲雀痘病毒vCP2350載體疫苗。
同時，向實例2對照組動物投與存於0.2毫升體積pH 8之TE緩衝液(即2毫克/毫升)中之包含表現CDV抗原(vCP258，參見美國專利第US－A－5,756,102號之實例19)之對照ALVAC金絲雀痘病毒載體之疫苗。
用於經接種動物之vCP2350載體疫苗及用於對照動物之vCP258載體疫苗之疫苗劑量為108 PFU/動物。使用Merial VetjetTM 無針注射器在右腿內側經皮內途徑對各動物實施投與。投與前對腿內側區實施除毛並用聚維酮碘(Vetedine,Vetoquinol,Lure,France)消毒。
收集動物血清且如實例2中所述分析CD8＋ 細胞頻率、IFN－γ－生成細胞之頻率、專一性CD8 T細胞增殖及專一性CD4 T細胞增殖。
預定在初免投與後第22週用L.infantum 無鞭毛體攻擊。
現在藉由下列經編號段落進一步闡述本發明：1.一種活體內表現載體在初免－加強投與方案中之用途，包括初免投與一疫苗，其在醫藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑中包含含有用於活體內表現利什曼原蟲KMP11多肽、抗原、抗原決定部位或免疫原之多核苷酸序列之活體內表現載體，之後加強投與一疫苗，其在醫藥上可接受載體或賦形劑內包含含有用於活體內表現利什曼原蟲KMP11抗原、抗原決定部位或免疫原之多核苷酸序列之活體內表現載體，以保護犬類動物免受利什曼病侵襲及/或在經感染犬類動物中防止疾病惡化。
2.如段落1之用途，其中該保護係藉由防止寄生蟲擴散入及植入該等犬類動物之內臟器官加以顯示。
3.如段落1之用途，其係用於產生用於在犬類動物中引發抵抗KMP11之體液型免疫反應之疫苗。
4.如段落3之用途，其中該犬類動物中之引發係引發抗KMP11 IgG1。
5.如段落1至4中任一段之用途，其係用於產生用於在犬類動物中引發抵抗KMP11之細胞介導型免疫反應之疫苗。
6.如段落5之用途，其中該犬類動物中之引發係引發抵抗KMP11之CD8 T細胞介導型免疫反應。
7.如段落5或6之用途，其中該犬類動物中之引發係引發抵抗KMP11之CD4 T細胞介導型免疫反應。
8.如段落1至7中任一段之用途，其中用於初免投與之活體內表現載體係質粒，而用於加強投與之活體內表現載體係重組病毒載體。
9.如段落8之用途，其中用於初免投與之活體內表現載體係質粒，而用於加強投與之活體內表現載體係重組金絲雀痘病毒載體。
10.如段落9之用途，其中用於初免投與之活體內表現載體係質粒pVR1020 KMP11，而用於加強投與之活體內表現載體係重組金絲雀痘病毒載體vCP2350。
11.如段落1至10中任一段之用途，其中編碼利什曼原蟲KMP11之多核苷酸序列係密碼子經優化多核苷酸序列SEQ ID N°3，其編碼利什曼原蟲嬰兒亞種KMP11抗原SEQ ID N°4。
12.如段落1至11中任一段之用途，其中該初免投與係與電轉移治療結合。
13.如段落1至7中任一段之用途，其中用於初免投與及用於加強投與之活體內表現載體係質粒且包含編碼利什曼原蟲KMP11抗原或免疫原或其抗原決定部位之多核苷酸序列，且該初免投與係使用無針裝置經皮內途徑實施而該加強投與係使用注射器及針經肌內途徑實施且與電轉移治療結合。
14.如段落1至7中任一段之用途，其中用於初免投與及用於加強投與之活體內表現載體係質粒且包含編碼利什曼原蟲KMP11抗原或免疫原或其抗原決定部位之多核苷酸序列，且該初免投與係使用注射器及針經肌內途徑實施且與電轉移治療結合而該加強投與係使用無針裝置經皮內途徑實施。
15.如段落13或14之用途，其中該活體內表現載體係質粒pVR1020 KMP11。
16.如段落13或14之用途，其中編碼利什曼原蟲KMP11之多核苷酸序列係密碼子經優化多核苷酸序列SEQ ID N°3，其編碼利什曼原蟲嬰兒亞種KMP11抗原SEQ ID N°4。
17.一種用於如段落1至12中任一段之初免－加強投與方案之套組，其包括至少兩小瓶，一瓶包含用於初免接種之疫苗，其他瓶包含用於加強接種之疫苗。
18.如段落17之套組，其中該套組包括兩小瓶，一瓶含有用於初免接種之質粒基疫苗，另一瓶含有用於加強接種之重組病毒載體基疫苗。
可結合以引用方式併入本文中之附圖理解下述以實例方式給出且不欲將本發明限制為所述具體實施例之具體闡述，其中：圖1展示接種前、初次接種與後續加強接種之間、及加強接種後CD8之頻率；以外周血中所含CD8之百分比來表示該頻率。
圖2展示接種前、初次接種與後續加強接種之間、及加強接種後IFN－γ－生成細胞之頻率；以外周血中所存在IFN－gamma＋淋巴細胞之百分比來表示該頻率。
圖3展示接種前、初次接種與後續加強接種之間、及加強接種後專一性CD8 T細胞之增殖；以CD8 T細胞群中專一性抗－KMP11 CD8 T細胞之百分比來表示該增殖。
圖4展示接種前、初次接種與後續加強接種之間、及加強接種後專一性CD4 T細胞之增殖；以CD4 T細胞群中專一性抗－KMP11 CD4 T細胞之百分比來表示該增殖。
圖5係展示經KMP11接種狗之IgG應答之西方點漬法分析圖，其中第1欄係未經接種，第2欄係初免後經KMP11接種狗(D14)，第3欄係加強後經KMP11接種狗(D41)，第4欄係加強後經KMP11接種狗(D55)，第5欄係加強後經KMP11接種狗(D76)，第6欄係初免後對照狗(D14)，而第7欄係加強後對照狗(D41)。該研究採用6微克/10微升L.infantum 抗原、1/1000第一抗體(血清)及1/2000第二抗體(抗－狗IgG－HRP)。
圖6係ALVAC供體質粒pJSY1992.1之質粒示意圖。
圖7展示用於以Vector NTI創建之vCP2350.1.1.5基因組DNA之理論性限制酶凝膠。
圖8係在藉由BglII、HindIII及PstI消化及藉由0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離後vCP2350.1.1.5之限制性分析凝膠。
圖9係藉由用利什曼原蟲合成KMP11探針探測獲得之vCP2350.1.1.5之Southern印迹分析。
圖10係供體質粒VR2001－TOPA或VR2001－TOPO之質粒示意圖。
序列SEQ ID N°1及SEQ ID N°2分別展示實例中所用種系之L.infantum KMP11之核酸序列及由此核酸序列所編碼蛋白質之胺基酸序列。
序列SEQ ID N°3展示存於NCBI GenBANK數據庫，存取號為CAA64883且存於SEQ ID N°4中之編碼L.infantum KMP11蛋白之密碼子經優化核酸序列。
序列SEQ ID N°5展示質粒pVR1020 KMP11之一條鏈之核酸序列。
序列SEQ ID N°6展示ALVAC供體質粒pJSY1992.1之一條鏈之核酸序列。
<110> 美商龍馬躍公司<120> 犬利什曼原蟲疫苗<130> Leishmania KMP11 <140> 096144176 <141> 2007－11－21 <150> 60/866,848；PCT/US2007/085142 <151> 2006－11－21；2007－11－19 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 279 <212> DNA <213> 利什曼原蟲嬰兒亞種<400> 1<210> 2 <211> 92 <212> PRT <213> 利什曼原蟲嬰兒亞種<400> 2<210> 3 <211> 279 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> 密碼子經優化多核苷酸<400> 3<210> 4 <211> 92 <212> PRT <213> 利什曼原蟲嬰兒亞種<400> 4<210> 5 <211> 5338 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> pVR1020 KMP11質粒一條鏈之核酸序列<400> 5 <210> 6 <211> 5155 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> ALVAC供體質粒pJSY1992.1一條鏈之核酸序列pJSY1992.1 <400> 6 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> 作為PRC引物之寡多核苷酸<400> 7<210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> 作為PRC引物之寡多核苷酸<400> 8
(無元件符號說明)

Claims (29)

  1. 一種活體內表現之重組載體之用途，其係用於製備引發狗抗利什曼原蟲(Leishmania )之免疫反應之疫苗，其中該重組載體含有並於活體內表現包含編碼利什曼原蟲嬰兒亞種(Leishmania donovani infantum )KMP11多肽之SEQ ID NO：3序列之核酸序列，該核酸序列操縱性連接至啟動子，且其中該重組載體係用於利什曼原蟲(Leishmania)易感個體之接種疫苗，其包括初免(prime)-加強(boost)投藥，該投藥包括初免投與一種疫苗，該疫苗在醫藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑中包含一種活體內表現載體，其含有一個多核苷酸序列，在活體內表現利什曼原蟲KMP11多肽、抗原、抗原決定部位(epitope)或免疫原，之後加強投與一種疫苗，該疫苗在醫藥上可接受載劑或賦形劑中包含一種活體內表現載體，其含有一個多核苷酸序列，在活體內表現利什曼原蟲KMP11抗原、抗原決定部位或免疫原，以保護該個體免受利什曼病(leishmaniasis)侵襲及/或防止已感染個體疾病進行。
  2. 如請求項1之用途，其中該接種疫苗可防止該寄生蟲擴散入及植入該個體之內臟器官中。
  3. 如請求項1之用途，其中該接種疫苗引發抵抗KMP11之體液型免疫反應及/或引發抵抗KMP11之細胞介導型免疫反應。
  4. 如請求項3之用途，其中該接種疫苗引發抗KMP11 IgG1 之產生。
  5. 如請求項3之用途，其中該引發之反應係抵抗KMP11之CD8+ T細胞介導型免疫反應及/或抵抗KMP11之CD4+ T細胞介導型免疫反應。
  6. 如請求項1之用途，其中該用於初免投與之活體內表現重組載體係質粒(plasmid)，而該用於加強投與之活體內表現重組載體係重組病毒載體。
  7. 如請求項6之用途，其中該用於初免投與之活體內表現重組載體係質粒，而該用於加強投與之活體內表現重組載體係重組金絲雀痘病毒(canarypox virus)載體。
  8. 如請求項7之用途，其中該用於初免投與之活體內表現重組載體係質粒pVR1020 KMP11或具有pVR1020 KMP11之所有確認特徵之質粒，而該用於加強投與之活體內表現重組載體係重組金絲雀痘病毒載體vCP2350或具有vCP2350之所有確認特徵之重組金絲雀痘病毒載體。
  9. 如請求項1之用途，其中SEQ ID NO：3編碼利什曼原蟲嬰兒亞種KMP11抗原SEQ ID NO：4。
  10. 如請求項1之用途，其中該初免投與係與電轉移(elec-trotransfer)治療結合。
  11. 如請求項1之用途，其中該等用於初免投與及用於加強投與之活體內表現載體係質粒，且該用於初免投與之疫苗係用於無針裝置經皮內途徑投與，而該用於加強投與之疫苗係用於注射器及針經肌內途徑投與且與電轉移治療結合。
  12. 如請求項1之用途，其中該等用於初免投與及用於加強投與之活體內表現載體係質粒，且該用於初免投與之疫苗係用於注射器及針經肌內途徑投與且與電轉移治療結合，而該用於加強投與之疫苗係用於無針裝置經皮內途徑投與。
  13. 如請求項11或12之用途，其中該等活體內表現重組載體係質粒pVR1020 KMP11或具有pVR1020 KMP11之所有確認特徵之質粒。
  14. 如請求項13之用途，其中SEQ ID NO：3編碼利什曼原蟲嬰兒亞種KMP11抗原SEQ ID NO：4。
  15. 一種重組載體，其含有並於活體內表現包含編碼利什曼原蟲嬰兒亞種KMP11多肽之SEQ ID NO：3序列之核酸序列，該核酸序列操縱性連接至啟動子，其引發狗抗利什曼原蟲之免疫反應。
  16. 如請求項15之重組載體，其中該利什曼原蟲嬰兒亞種KMP11多肽包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列。
  17. 一種重組載體，其包含編碼KMP11蛋白質之聚核苷酸，該KMP11蛋白質包含SEQ ID NO：4之序列。
  18. 如請求項15或17之重組載體，其中該載體為選自由pVR1020及pVR1012所組成之群之質體。
  19. 如請求項18之重組載體，其中該啟動子係選自下列所組成之群：人類或鼠類巨細胞病毒之立即早期(IE)啟動子(CMV-IE)、SV40病毒之早期/晚期啟動子或勞斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒之LTR啟動子。
  20. 如請求項15或17之重組載體，其中該載體為重組病毒載體。
  21. 如請求項20之重組載體，其中該重組病毒載體係選自痘病毒、腺病毒及皰疹病毒所組成之群。
  22. 如請求項21之重組載體，其中該重組病毒載體為禽痘病毒(avipoxvirus)。
  23. 如請求項22之重組載體，其中該禽痘病毒為雞痘或金絲雀痘。
  24. 如請求項23之重組載體，其中該金絲雀痘載體為ALVAC。
  25. 如請求項23之重組載體，其中雞痘載體為TROVAC。
  26. 一種醫藥組合物，其包含如請求項15或17之重組載體，及醫藥上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑。
  27. 如請求項26之醫藥組合物，其中該組合物係以初免-加強方案投與動物。
  28. 一種用於初免-加強投與方案之套組，其包括至少兩小瓶，該第一瓶包含用於初免接種之疫苗，而另一瓶包含用於加強接種之疫苗，其中該等疫苗包含如請求項15至25中任一項之重組載體。
  29. 如請求項28之套組，其中該套組包括兩小瓶，一瓶含有用於初免接種之基於質粒之疫苗，另一瓶含有用於加強接種之基於重組病毒載體之疫苗。
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