JP2012506699A - アフリカウマ病ウイルスに対するワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願番号61/108,075(2008年10月24日出願)および米国仮特許出願番号61/163,517(2009年3月26日出願)の権利を主張する。
前述の出願、およびそれらにおいてまたはそれらに審査の間に引用された全ての文書(“出願引用文書”)並びに前記出願引用文書中の全ての文書および参考文献、並びに本明細書で引用または参照された全ての文書(“本明細書引用文書”)並びに本明細書引用文書中で引用または参照された全ての文書は、本明細書または参照により本明細書に含まれる一切の文書に記載された一切の製品についての一切の製造業者による指示、記載、製品明細書およびプロダクトシートとともに参照により本明細書に含まれ、さらに本発明の実施に利用することができる。
いくつかの刊行物が本明細書で引用される。これら文書の完全な引用は、特許請求の範囲に先行する詳細な説明の最後、および/または当該文書が引用されてある箇所で見出される。これらの文書は本発明の分野に属し、本明細書で引用または参照されるそれら文書(“本明細書引用文書”)の各々および本明細書引用文書で引用または参照される各文書は、参照により本明細書に含まれる。
アフリカウマ病は、アフリカウマ病ウイルス(レオウイルス科のオルビウイルス属のメンバー)の感染により生じる。今日までにアフリカウマ病ウイルスの9つの血清型が知られている。アフリカウマ病ウイルスの血清型9は固有の地域で広範囲に蔓延しているが、一方、血清型1から8は地理的に限定的な領域で主として見出される。血清型9はアフリカ以外の大半のアフリカウマ病流行の原因であった。血清型4は1987年から1990年の間にスペインおよびポルトガルで1つの流行を引き起こした(J. Lubroth, 1998, Equine Pract, 10:26-33)。
このワクチンの有効性にもかかわらず、前記ワクチンは以下を含む固有の限界を有する:個々の動物におけるワクチン反応(死亡を含む)、個々の動物における多様な免疫応答、母体由来受動免疫を有する若年動物の免疫の困難性、ワクチンウイルスのビルレンスへの復帰の可能性、およびビルレンスへの起こり得る復帰を伴うワクチン接種後のワクチン株の組換え(M. du Plessis et al. 1998, Onderstepoort Journal of Veterinary Research 65:321-329)。さらにまたMLVの使用に関して社会経済学的示唆が存在する。南アフリカは、欧州連合および他の多くの国へのウマの輸出を許容するプロトコルを有する。このプロトコルはまたウマが他国から南アフリカに入り多様な事象で競合するかまたは一時的に繁殖用となることを可能にする。前記プロトコルは、アフリカウマ病に対してウマが適切にワクチン接種されていることの保証を基本にしている。獣医機関はMLVワクチン使用により起こり得る危険性を認識している。これらの問題の多くは、代替アフリカウマ病ウイルスワクチンの開発によって大きく緩和されよう。
弱毒化ウイルスに由来する組換えカナリアポックスウイルスが、異種性ウイルス遺伝子の発現用ベクターとして開発された。爾来、これらの多数のカナリアポックス構築物が、多くの国々(南アフリカ、欧州連合およびアメリカ合衆国を含む)でウマ(JM Minke et al. 2004aおよび2004b;JM Minke et al. 2007;L Siger et al. 2006)および他の種(H Poulet et al. 2003)での使用について認可された。
以前の研究によって、ウマは、外因的に発現させたVP2および適切なアジュバントを接種されたときAHSに対する中和抗体を出現させることが示された(M Scanlen et al. 2002)。ヒツジでの研究によって、ブルータングウイルスに対する中和抗体の応答は、VP2およびVP5を同時発現するウイルス様粒子をヒツジに接種することによって強化されることが示された(LD Pearson, P Roy, 1993)。ブルータングウイルスのVP2およびVP5外側キャプシドタンパク質をコードする遺伝子を同時発現する組換えカナリア痘瘡ウイルスワクチンは、高レベルの防御を誘発することが最近示された(JD Boone et al. 2007)。
AHSV VP2およびVP5を含み、前記を同時発現するベクターを接種したとき、ウマはアフリカウマ病ウイルスに対する中和抗体を出現させることはまだ示されていない。したがって、組換えポックスウイルス(前記由来の組成物および生成物を含む)、特にALVAC系組換え体並びに前記由来の組成物および生成物、特にAHSV VP2および5またはその任意の組合せを発現する組換え体並びに前記に由来する組成物および生成物を提供することによって、本発明は当業界の要請を満たすことは理解し得よう。
本出願におけるいずれの文書の引用または検証も当該文書が本発明の先行技術として利用可能であることを容認するものではない。
本発明は、少なくとも1つの外因性核酸分子を含み、これを発現する組換えベクター、例えば組換えウイルス(例えば組換えポックスウイルス)を提供する。前記少なくとも1つの外因性核酸分子は、アフリカウマ病ウイルスに由来する問題の免疫原またはエピトープ、特にアフリカウマ病ウイルスのウイルスタンパク質またはその部分をコードする核酸分子を含むことができる。
本発明はさらに、前記アフリカウマ病ウイルス株が1、2、4または9であるである組換えベクターを提供する。
本発明はさらに、そのようなウイルスまたはそのようなウイルスの発現生成物を含む免疫学的(または免疫原性)またはワクチン組成物を提供する。
本発明はさらに、アフリカウマ病ウイルスに対抗する免疫学的(または免疫原性)または防御応答を誘発する方法、および、アフリカウマ病ウイルスまたはアフリカウマ病ウイルスによって引き起こされる症状を予防または治療する方法を提供する。前記方法は、前記ウイルスもしくは前記ウイルスの発現生成物、または前記ウイルスを含む組成物、または前記ウイルスの発現生成物を含む組成物を投与する工程を含む。
本発明はまた、前記ウイルスの発現生成物、前記発現生成物またはそのin vivo発現から生みだされる抗体、並びにそのような生成物および抗体の例えば診断的利用における使用を包含する。
本発明はさらに、AHSV VP2およびVP5ポリペプチド並びにAHSV VP2およびVP5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、新規なAHS株のAHSV4-Janeを提供する。
これらの実施態様および他の実施態様は以下の詳細な説明に記載されているか、または詳細な説明から明白であり前記に含まれている。
以下の詳細な説明(例示として提供されるが記載した特定の実施態様にのみ本発明を限定しようとするものではない)は、添付の図面と一緒にして最良の理解を提供しよう。
本開示および特に特許請求項および/または文書で、例えば“comprise”、“comprised”、“comprising”などの用語は、米国特許法で前記用語に帰された意味を有し、例えば、それらは“include”、“included”、“including”などを意味することができ、さらに、例えば“consisting essentially of”および“consists essentially of”、のような用語は、米国特許法でそれらに帰された意味を有し、例えば、それらは明示的に列挙されていない要素も考慮するが、先行技術において見出されたかまたは本発明の基礎的または新規な特徴に影響を及ぼす要素を排除することが特筆される。
特段の記載がなければ、技術用語は慣例にしたがって用いられる。分子生物学における一般的用語の定義は以下で見出すことができる:Benjamin Lewin, Genes V、1994年Oxford University Press発行(ISBN 0-19-854287-9);Kendrew et al.編、The Encyclopedia of Molecular Biology、1994年Blackwell Science Ltd.発行(ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers編、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、1995年VCH Publishers, Inc.発行(ISBN 1-56081-569-8)。
単数用語の“a”、“an”および“the”には、文脈が明白にそうでないことを示していないかぎり複数の対象が含まれる。同様に、“or”という語は、文脈が明白にそうでないことを示していないかぎり“and”を含むことが意図される。“or”という語は、具体的なリストの任意の1つのメンバーを意味し、当該リストのメンバーの任意の組合せもまた含む。
“ポリペプチド”および“タンパク質”という用語は本明細書では相互に用いられ、連続するアミノ酸残基のポリマーを指す。
“核酸”、“ヌクレオチド”および“ポリヌクレオチド”という用語はRNAまたはDNAおよびそれらの誘導体(例えば改変骨格を含むもの)を指す。本発明は、本明細書に記載した配列に相補的な配列を含むポリヌクレオチドを提供することは理解されよう。本発明のポリヌクレオチドは、種々の方法で(例えば化学的合成によって、遺伝子クローニングによって)調製することができ、多様な形態(例えば線状または分枝、一本鎖または二本鎖、または前記のハイブリッド、プライマー、プローブなど)をもつことができる。
本明細書で用いられる“免疫原性ポリペプチド”または“免疫原性フラグメント”という用語は、対立遺伝子特異的モチーフ、エピトープまたは他の配列を含むポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントであって、前記ポリペプチドまたはフラグメントがMHC分子と結合し、細胞傷害性Tリンパ球(“CTL”)応答、および/またはB細胞応答(例えば抗体産生)、および/またはT-ヘルパーリンパ球応答、および/または免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性フラグメントが由来した抗原に対する遅延型過敏(DTH)応答を誘発するようなものを指す。DTH応答は、T-細胞依存マクロファージ活性化および炎症が組織の損傷を引き起こす免疫反応である。抗原の皮下注射に対するDTH反応は、細胞媒介免疫のためのアッセイとしてしばしば用いられる。
本明細書で用いられる“精製”という用語は絶対的純度を要求せず、むしろ相対的用語とされる。したがって、例えば精製ポリペプチド調製物は、当該ポリペプチドがその天然の環境に存在する場合よりも濃縮されている調製物である。ポリペプチド調製物は、いくつかの実施態様では、当該ポリペプチドが調製物の全ポリペプチド含有量の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%を占めるように実質的に精製される。同じことがポリヌクレオチドにも当てはまる。本明細書に開示したポリペプチドは当分野で公知の任意の手段によって精製することができる。
ある特徴では、本発明はアフリカウマ病ウイルス由来のポリペプチドを提供する。別の特徴では、本発明は、配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63に記載の配列を有するポリペプチドおよびその変種またはフラグメントを提供する。
本明細書で用いられるように、“アフリカウマ病ウイルスタンパク質またはアフリカウマ病ウイルスポリペプチド(AHSV VP)”という用語には、AHSV VP1、VP2、VP3、VP4、NS1、VP5、VP6、VP7、NS2並びにそれらのホモローグ、フラグメントおよび変種が含まれる。
アフリカウマ病ウイルスのウイルスタンパク質のホモローグは本発明の範囲内にあると考える。本明細書で用いられるように、“ホモローグ”という用語は、オルトローグ、アナローグおよびパラローグを含む。“アナローグ”という用語は、同じまたは類似の機能を有するが無関係の生物で別個に進化した2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。“オルトローグ”という用語は、異なる種に由来するが共通の先祖遺伝子から種分化によって進化した2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。通常は、オルトローグは同じまたは類似の機能を有するポリペプチドをコードする。“パラローグ”という用語は、ゲノム内での重複によって関連性を有する2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。パラローグは通常異なる機能を有するが、これらの機能は関連を有することがある。野生型のアフリカウマ病ウイルスポリペプチドのアナローグ、オルトローグおよびパラローグは、翻訳後修飾により、アミノ酸配列の相違により、またはその両方により野生型アフリカウマ病ウイルスポリペプチドとは相違することがある。具体的には、本発明のホモローグは、野生型アフリカウマ病ウイルスポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の全部または部分に関して一般的少なくとも80−85%、85−90%、90−95%または95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を示し、類似の機能を示すであろう。
さらに別の特徴では、本発明は、上記に認定のAHSV VP(配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63)のフラグメントおよび変種を提供し、前記は当業者により周知の分子生物学的技術を用いて容易に調製することができる。
変種は、配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63に記載のアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一のアミノ酸配列を有する相同なAHSV VPである。
変種はワクチン接種した動物(例えばウマ)においてアフリカウマ病ウイルスによる刺激時にインターフェロンガンマ(IFN-ガンマ)の分泌を特徴とする特異的な細胞系免疫応答を誘導することができるアフリカウマ病ウイルス由来の任意のポリペプチドである。そのようなIFN-ガンマ分泌はin vitro方法論(すなわちR&D Systems Inc.のQUANTIKINE(商標)イムノアッセイ(カタログ番号CAIF00);JF Djoba Siawaya et al.)を用いて示すことができる。
アフリカウマ病ウイルスポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63に記載の配列を有するアフリカウマ病ウイルスポリペプチドまたはその変種の少なくとも8、10、15または20の連続するアミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、または少なくとも30アミノ酸を含む。別の実施態様では、アフリカウマ病ウイルスのフラグメントは完全長のアフリカウマ病ウイルスポリペプチドで見出される特異的な抗原性エピトープを含む。
別の特徴では、本発明は、AHSV VPをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63に記載の配列を有するAHSV VPをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63に記載の配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するポリペプチド、または保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグもしくはこれらポリペプチドの1つの少なくとも8つまたは少なくとも10の連続するアミノ酸を含むフラグメント、またはこれらのポリペプチドの組合せをコードするポリヌクレオチドを提供する。
これらのポリヌクレオチドには、AHSV VPをコードするDNA、cDNAおよびRNA配列が含まれ得る。アフリカウマ病ウイルスポリペプチドをコードするいずれのポリヌクレオチドも、それらが認知された活性(例えば当該ポリペプチドを認識する抗体との結合、当該ポリペプチドに対する免疫応答の誘発、またはアフリカウマ病ウイルスに暴露されたかもしくはアフリカウマ病の徴候もしくは症状の減退を示す対象動物に投与されたときアフリカウマ病で生存する効果)を有するポリペプチドをコードするかぎり本発明に含まれることは理解されよう。
2つのヌクレオチド間の配列同一性はまた、Myers and Miller(”Optimal Alignments in Linear Space”, CABIOS 4, 11-17, 1988)の“Align”プログラム(NCBIで入手可能)の他に、インターネットを介してそれらのサイト(例えばNCBIサイト)で利用できる同じまたは別のプログラムを用いて決定することができる。
前記とは別にまたは前記に加えて、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して“同一性”という用語は、2つの配列間の相同性の定量的測定値を示すことができる。パーセント配列相同性は以下のように計算することができる:(Nref−Ndif)*100/Nref、式中Ndifはアラインメントを実施したときの2つの配列中の非同一残基の総数であり、Nrefは当該配列の一方の残基の数である。したがって、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCについて75%の配列同一性を有するであろう(Nref=8;Ndif=2)。
2つのアミノ酸配列の配列同一性もしくは配列類似性、または2つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、Vector NTIソフトウェアパッケージ(Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA)を用いて決定することができる。
以下の文書は配列の相対的同一性または相同性を比較するためのアルゴリズムを提供し、さらにこれらの参考文献中の教示は、前述の記載に加えまたは前記とは別にパーセント相同性または同一性の決定に用いることができる:SB Needleman and CD Wunsch;TF Smith and MS Waterman;TF Smith, MS Waterman and JR Sadler;DF Feng and RF Dolittle;DG Higgins and PM Sharp;JD Thompson, DG Higgins and TJ Bibson;およびJ Devereux, P Haeberlie and O Smithies。さらに煩雑な実験を実施することなく、当業者はパーセント相同性の決定のために他のプログラムまたは参考文献を用いることができる。
本明細書に開示する組換えベクターは、ポリペプチド、その変種またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。組換えベクターにはプラスミドおよびウイルスベクターが含まれ、in vitroまたはin vivo発現に用いることができる。組換えベクターはさらにシグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは、ある細胞器官(例えば核、ミトコンドリアマトリックス、小胞体、葉緑体、アポプラストおよびペルオキシソーム)へのタンパク質(サイトゾルで合成される)の翻訳後輸送を指令する。シグナル配列は、アフリカウマ病ウイルスタンパク質由来の天然の配列であっても、または分泌タンパク質由来のペプチドシグナル、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質(pTA)、具体的にはヒトpTA由来のシグナルペプチド(S. Friezner Degen et al.;R. Rickles et al.))、またはインスリン様増殖因子1(IGF1)由来のシグナルペプチド、具体的にはウマIGF1(K Otte et al.)、イヌIGF1(P Delafontaine et al.)、ネコIGF1(WOO03/022886)、ウシIGF1(S Lien et al.)、ブタIGF1(M Muller et al.)、ニワトリIGF1(Y Kajimoto et al.)、シチメンチョウIGF1(GenBank accession No. AF084980)であってもよい。IGF1由来のシグナルペプチドは天然であっても最適化されてあってもよい。最適化は、隠ぺいスプラス部位の除去および/またはコドン使用頻度の調整によって達成することができる。翻訳に際して、プロセッシングを経ていないポリペプチドは切断部位で切断され成熟ポリペプチドを生じることができる。切断部位はVon Heijne(1986)の方法を用いて予測することができる。
さらに別の特徴ではワクチン組成物または医薬組成物に関し、前記は当該組成物を接種された宿主動物で免疫学的または防御的応答を誘発する。前記組成物は、担体または希釈剤または賦形剤および/またはアジュバント、並びに組換えベクター、例えば組換えウイルスを含む。前記組換えウイルスは、改変組換えウイルス、例えばウイルスがコードする遺伝的機能をその中で既に不活化(例えば破壊または欠失)させたウイルス組換え体であり得る。改変組換えウイルスは、例えば毒性が低下し安全性が強化されるように、ウイルスがコードする非本質的な遺伝的機能がその中で不活化されてもよい。本発明の組成物で用いられるウイルスは、有利にはポックスウイルス、例えばワクシニアウイルスまたはアライグマポックスウイルス、または好ましくはアビポックスウイルス、例えば鶏痘ウイルス、またはより好ましくはカナリアポックスウイルス、より有利にはALVACウイルスである。組換えベクターまたは組換えウイルスは哺乳動物種で複製されずに発現することが有利である。別の特徴では、1つまたは2つ以上のアフリカウマ病ウイルス(AHSV)抗原をコードする少なくとも1つの核酸分子を含む組換えベクターに関する。本発明はさらに、1つまたは2つ以上のアフリカウマ病ウイルス(AHSV)抗原をコードする少なくとも1つの核酸分子を含む組換えアビポックスベクターの、対象動物で防御的免疫応答を誘引するために有効な量を含むワクチンまたは免疫原性組成物に関する。本発明はさらに、アフリカウマ病ウイルスに対抗して対象動物にワクチン接種する対応する方法に関する。
別個の挿入部位を用いるかまたは同じ挿入部位を用いて多数の挿入を同じベクターで実施することができる。同じ挿入部位を用いるときは、各ポリヌクレオチド挿入物(前述の本発明の任意のポリヌクレオチドであり得る)を、同じおよび/または別個のプロモーターの制御下に挿入することができる。挿入は、尾尾、頭頭、尾頭または頭尾で実施できる。IRESエレメント(内部リボソーム侵入部位、EP0803537参照)もまた、同じおよび/または別個のプロモーターに作動できるように連結した多数の挿入物を分離させ、さらにそれらを発現させるために用いることができる。
ある実施態様では、本発明は上述の1つまたは2つ以上のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。前記発現ベクターはin vivo発現ベクターであってもin vitro発現ベクターであってもよい。
ある実施態様では、前記組換えベクターまたはウイルスは、1つまたは2つ以上のアフリカウマ病ウイルス(AHSV)抗原、免疫原(そのエピトープまたはフラグメントを含む)をコードする1つまたは2つ以上の異種核酸分子を含むことができる。前記組換えベクターまたは改変組換えウイルスは、例えばウイルスゲノム内に(例えばウイルスゲノムの非本質的領域内に)異種DNA配列を含むことができ、前記異種DNA配列は、例えばアフリカウマ病ウイルスのウイルスタンパク質、例えばAHSV VP1、VP2、VP3、VP4、NS1、VP5、VP6、VP7、NS2、NS3またはその任意の組合せ、好ましくはAHSV VP2および5に由来する免疫原性タンパク質をコードする(この場合、前記免疫原性タンパク質は、問題のエピトープ、例えばAHSV VP1、VP2、VP3、VP4、NS1、VP5、VP6、VP7、NS2、NS3の任意の1つまたは2つ以上によって発現されるタンパク質の問題のエピトープ、例えばAHSV VP2および/または5の問題のエピトープであり得る)。前記ベクターまたはウイルスは、有利にはポックスウイルス、例えばワクシニアウイルスまたは好ましくはアビポックスウイルス、例えば鶏痘ウイルスまたはより好ましくはカナリアポックスウイルスであり、より有利にはALVACウイルスである。
別の実施態様では、1つまたは2つ以上のアフリカウマ病ウイルス(AHSV)抗原、免疫原(そのエピトープまたはフラグメントを含み、前記は、例えばアフリカウマ病ウイルスのウイルスタンパク質、例えばAHSV VP1、VP2、VP3、VP4、NS1、VP5、VP6、VP7、NS2、NS3またはその任意の組合せ、好ましくはAHSV VP2および5に由来し、前記免疫原性タンパク質は、問題のエピトープ、例えばAHSV VP1、VP2、VP3、VP4、NS1、VP5、VP6、VP7、NS2またはNS3の任意の1つまたは2つ以上によって発現されるタンパク質の問題のエピトープ、例えばAHSV VP2および/または5の問題のエピトープであり得る)をコードする異種核酸分子はある挿入座位に挿入され、この場合、前記挿入座位はC5および/またはC6および/またはC3を含み、さらにC6、C5および/またはC3挿入座位のフランキング配列は、同族の挿入座位を有するアフリカウマ病ウイルス抗原の相同性組換えを促進し、さらに前記フランキング配列は、アビポックスのC3LおよびC3Rオープンリーディングフレームを含む。
特段の指示がなければ、本発明の実施には分子生物学、微生物学、細菌学、組換えDNA工学および免疫学の一般的な技術が用いられ、前記技術は当業者の技量範囲内である。そのような技術は刊行物に詳しく説明されている。例えば以下を参照されたい:Sambrook et al. 1989および1985;MJ Gait ed., 1984;BD Hames & SJ Higgins eds. 1984;RK Freshney ed. 1986;IRL Press, 1986;B Perbal, 1984;DM Weir and CC Blackwell eds. 1986。
ある特徴では、本発明は、組換えベクター、例えばウイルス、例えばアフリカウマ病ウイルスのDNA配列を、例えばウイルス(例えばポックスウイルス)ゲノム内に、有利にはウイルスの非本質的領域内、例えばポックスウイルスゲノム内に含む組換えポックスウイルスを提供する。前記ポックスウイルスはワクシニアウイルス、例えばNYVACまたはNYVAC系ウイルスを含むことができ、前記ポックスウイルスは、有利にはアビポックス、例えば鶏痘ウイルス(特に弱毒化鶏痘ウイルス、例えばTROVAC)、またはカナリアポックスウイルス(好ましくは弱毒化カナリアポックスウイルス、例えばALVAC)である。しかしながら、本発明のベクターは、任意の適切な組換えウイルスまたはウイルスベクター、例えばポックスウイルス(例えばワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、鶏痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、ブタポックスウイルスなど)、アデノウイルス(例えばイヌアデノウイルス)、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスなど(本明細書に参照により含まれる文書にあるとおり)であり得る。またはベクターはプラスミドでもよい。
ある具体的な実施態様では、ウイルスベクターはポックスウイルス、例えばワクシニアウイルスまたは弱毒化ワクシニアウイルス(例えばMVA、ニワトリ胚線維芽細胞でAnkaraワクチン株を570代より多く継代した後で得られた改変Ankara株(以下を参照されたい:Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113:1149-1153;Sutter et al. Proc Natl Acad Sci, USA, 1992, 89:10847-10851)で、ATCC VR-1508として入手できる;またはNYVAC(以下を参照されたい:米国特許5,494,807号、例えば同特許の実施例1から6およびその後続の記載、前記はNYVACの構築、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のゲノムから欠失させたORFが付加されたNYVACの変異とともにこの組換え体の複数部位への異種コード核酸分子の挿入並びに適合プロモーターの使用を考察する;WO96/40241もまた参照されたい)、アビポックスウイルスまたは弱毒化アビポックスウイルス(例えばカナリアポックス、鶏痘、ハトポックス、ピジョンポックス、ウズラポックス、ALVACまたはTROVAC;例えば米国特許5,505,941号、5,494,807号を参照されたい)、ブタポックス、アライグマポックス、ラクダポックスまたは粘液腫症ウイルスである。
特許出願WO90/11092、WO93/19183、WO94/21797およびWO95/20660は、最近開発されたポリヌクレオチドワクチンの技術を利用する。これらのワクチンは、プラスミドに挿入された抗原を宿主細胞で発現することができるプラスミドを使用することが分かっている。全ての投与ルート(腹腔内、静脈内、筋肉内、経皮、皮内、粘膜ルートなど)が提唱されている。多様なワクチン接種手段もまた用いることができる。前記は例えば、金粒子の表面に沈積させて動物の皮膚を貫通するように発射されるDNA(Tang et al. 1992)、および皮膚、筋肉、脂肪組織の他に乳房組織へのトランスフェクションを可能にする液体ジェットインジェクター(Furth et al. 1992)である。(さらにまた以下を参照されたい:米国特許5,846,946号、5,620,896号、5,643,578号、5,580,589号、5,589,466号、5,693,622号および5,703,055号;JB Ulmer et al. 1993;Robinson et al. 1997;Luke et al. 1997;Norman et al. 1997;Bourne et al. 1996;さらにまた一般的にワクチンまたは免疫学的組成物のためのプラスミドは、宿主細胞(例えば哺乳動物細胞)の抗原の発現または発現および分泌を制御する調節配列に作動できるように連結された抗原をコードするDNAを含むことができることに留意されたい(例えば上流から下流に、プロモーターのためのDNA、分泌のために真核細胞リーダーペプチドのためのDNA、抗原のためのDNAおよびターミネーターをコードするDNA))。
発現ベクターがワクシニアウイルスのとき、発現されるべきポリヌクレオチドのための挿入部位はチミジンキナーゼ(TK)遺伝子にあるか、または挿入部位はヘマグルチニン(HA)遺伝子であるか、または挿入部位はA型封入体(ATI)をコードする領域である(本明細書に引用した文書、特にワクシニアウイルスに関するものをまた参照されたい)。カナリアポックスの場合には、挿入部位はORF、C3、C5および/またはC6であり得る(本明細書に引用した文書、特にカナリアポックスウイルスに関するものをまた参照されたい)。鶏痘の場合、挿入部位はORF7および/またはF8であり得る(本明細書に引用した文書、特に鶏痘ウイルスに関するものをまた参照されたい)。MVAウイルス挿入部位領域は、多様な刊行物に記載されたとおりであり得る。前記刊行物には以下の文献が含まれ(MW Carroll et al., Vaccine 1997, 15(4):387-394;KJ Stittelaar et al., J Virol 2000, 74(9):4236-4243;G. Sutter et al., 1994, Vaccine, 12(11):1032-1040)、さらに前記に関連して、完全なMVAゲノムが以下の文献に記載されている:G. Antoine, Virology 1998, 244:365-396(前記文献は当業者が他の挿入部位または他のプロモータを使用することを可能にする)。
別の実施態様では、ウイルスベクターはアデノウイルス、例えばヒトアデノウイルス(HAV)またはイヌアデノウイルス(CAV)である。
組換えウイルスベクター系ワクチンは、fMLP(N-ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン;米国特許6,017,537号)および/またはCARBOMERアジュバント(Pharmeuropa Vol.)と併せることができる。
別の具体的な実施態様では、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、例えばウマヘルペスウイルス(EHV1−5)、ブタヘルペスウイルス(PRV)、イヌヘルペスウイルス(CHV)またはネコヘルペスウイルス(FHV)である。挿入部位は、チミジンキナーゼ遺伝子、ORF3またはUL43 ORF(CHVのためのUL43 ORF;米国特許6,159,477号を参照されたい)に存在し得る。ある実施態様では、発現されるべきポリヌクレオチドは、真核細胞で機能するプロモーター、有利にはCMV-IEプロモーター(ネズミまたはヒト)の制御下で挿入される。ポリ(A)配列およびターミネーター配列は発現されるべきポリヌクレオチドの下流に挿入でき、前記は例えばウシ成長ホルモン遺伝子またはウサギβグロビン遺伝子ポリアデニル化シグナルである。
より一般的には、本発明は任意のプラスミド(EP-A2-1001025;P. Chaudhuri)を含むin vivo発現ベクターを包含し、前記は、アフリカウマ病ウイルスポリペプチド、その変種またはそのフラグメントのポリヌクレオチドまたは遺伝子およびそのin vivo発現に必要なエレメントを含み、さらにこれを宿主細胞でin vivo発現させる。
本明細書で用いられるように、“プラスミド”という用語は、本発明のポリヌクレオチドおよび所望の宿主または標的の細胞でのそのin vivo発現に必要なエレメントを含む任意のDNA転写ユニットを含むことができる。前記に関連して、スーパーコイルまたは非スーパーコイル、環状プラスミドが、線状形と同様に本発明の範囲内に含まれることを特記しておく。プラスミドはまた、他の転写調節エレメント、例えばイントロン型の安定化配列を含むことができる。いくつかの実施態様では、プラスミドは、CMV-IEの第一のイントロン(WO89/01036)、ウサギベータグロビン遺伝子のイントロンII(van Ooyen et al.)、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA、Montgomery et al.)によってコードされるタンパク質のシグナル配列、および/またはポリアデニル化シグナル(ポリA)、具体的にはウシ成長ホルモン(bGH)遺伝子のポリA(米国特許5,122,458号)またはウサギベータグロビン遺伝子もしくはSV40ウイルスのポリAを含むことができる。
これらプロモーターのサブフラグメント、すなわち適切なプロモーター活性を維持するこれらプロモーターの部分は本発明の範囲内に含まれ、例えばPCT出願WO98/00166または米国特許6,156,567号の切端CMV-IEプロモーターを本発明の実施に用いることができる。結果として、本発明の実施で用いられるプロモーターには、誘導体および完全長のプロモーターのサブフラグメントであって、適切なプロモーター活性したがってプロモーターとしての機能、好ましくは、前記誘導体またはサブフラグメントが誘導された実際のまたは完全長のプロモーターの活性と実質的に類似するプロモーター活性を維持するもの、例えば、完全長のCMV-IEプロモーターの活性に匹敵する米国特許6,156,567号の切端CMV-IEプロモーターの活性と類似するものが含まれる。したがって、本発明の実施で用いられるCMV-IEプロモーターは、完全長プロモーターのプロモーター部分および/または完全長プロモーターのエンハンサー部分を誘導体およびサブフラグメントと同様に含むか、または本質的に前記から成るか、または前記から成り得る。
好ましくは、プラスミドは他の発現制御エレメントを含むかまたは本質的に前記から成る。安定化配列、例えばイントロン配列、好ましくはCMV-IEの第一のイントロン(PCT出願WO89/01036)、ウサギベータグロビン遺伝子のイントロンII(van Ooyen et al. Science 1979, 206:337-344)を含むことは特に有利である。
プラスミドおよびポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル(ポリA)に関しては、ウシ成長ホルモン(bGH)遺伝子のポリAシグナル(米国特許5,122,458号参照)またはウサギベータグロビン遺伝子のポリ(A)シグナルまたはSV40ウイルスのポリ(A)シグナルがより多く利用され得る。
組換え発現ポリペプチドの単離および精製は、調製用クロマトグラフィー(例えばサイズ排除、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィー)、選択性沈殿および限外濾過を含む慣用的な手段によって実施することができる。使用することができる当業界の技術の例は以下の文献で見出すことができるが、ただしこれらに限定されない:”Protein Purification Applications”, Second Edition, Simon Roe Ed., Oxford University Press。そのような組換え発現ポリペプチドは本発明の部分である。上記に記載の本発明の全てのポリペプチドの製造方法が、特に本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターの使用および宿主細胞の使用が包含される。
有利には、本発明の組成物またはワクチンはまた1つまたは2つ以上のアジュバントを含むことができる。
プラスミド系ワクチンは、陽イオン性脂質、有利にはDMRIE(N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム(WO96/34109)と、または中性脂肪、例えばDOPE(ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン;JP Behr)とDMRIE-DOPEを生成させて、一緒に処方することができる。ある実施態様では、混合物を即席的に作製し、さらに混合物の適切な複合体形成のために投与前に約10分から約60分、例えば約30分待つのが有利である。DOPEを用いるときは、DMRIE/DOPEのモル比は95/5から5/95であり、有利には1/1であり得る。プラスミド/DMRIEまたはDMRIE-DOPEアジュバントの重量比は、例えば50/1から1/10、10/1から1/5または1/1から1/2である。
“宿主細胞”は、外因性ポリヌクレオチド(例えば組換えプラスミドまたはベクター)の投与によって遺伝的に変異させた、または遺伝的に変異させることができる原核細胞または真核細胞を指す。遺伝的に変異させた細胞というとき、前記用語は最初に変異させた細胞とその子孫の両方を指す。有利な宿主細胞には、ベビーハムスター腎(BHK)細胞、大腸癌(Caco-2)細胞、COS7細胞、MCF-7細胞、MCF-10A細胞、Madin-Darbyイヌ腎(MDCK)株、ミンク肺(Mv1Lu)細胞、MRC-5細胞、U937細胞およびVERO細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。所望の配列を含むポリヌクレオチドは適切なクローニングまたは発現ベクターに挿入でき、当該ベクターを順次適切な宿主細胞に導入し複製および増幅させることができる。ポリヌクレオチドは当分野で公知の任意の手段によって宿主細胞に導入できる。問題のポリヌクレオチドを含むベクターは多数の適切な任意の手段によって宿主細胞に導入できる。前記手段には、直接取り込み;エンドサイトーシス;トランスフェクション;f-接合;エレクトロポレーション;塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランまたは他の物質を利用するトランスフェクション;微小発射体ボンバードメント;リポフェクション;および感染(この場合ベクターは感染性で例えばレトロウイルスベクターである)が含まれる。ベクターまたはポリヌクレオチドの導入の選択はしばしば宿主細胞の特性に左右される。
遺伝暗号の縮退により天然のアフリカウマ病ウイルス核酸とは相違する核酸もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、多数のアミノ酸が2つ以上のトリプレットによって指定される。同じアミノ酸を規定するコドンまたは同義コドン(例えばCAUおよびCACはヒスチジンの同義コドンである)は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない“サイレント”変異を生じる。本発明の組換えベクターによってコードされるアフリカウマ病ウイルスの対象タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすDNA配列変異体もまた本発明に包含される。そのようなヌクレオチド変異体並びに生成されるアミノ酸変異体のいずれかおよびいずれも本発明の範囲内に包含される。
本発明の組換えベクターによってコードされるアフリカウマ病ウイルスの対象ポリペプチドの構造を、治療的または予防的有効性を強化する(例えば前記ポリペプチドの免疫原性を高める)目的のために改変することもまた可能である。そのような改変ポリペプチドは、当該タンパク質の天然に存在する形態の少なくとも1つの活性を保持するように設計されるとき、本明細書でさらに詳細に記載するアフリカウマ病ウイルスポリペプチドの機能的等価物とみなされる。そのような改変ポリペプチドは、例えばアミノ酸置換、欠失または付加によって作製することができる。
好ましくは、DNA配列は少なくとも抗体応答またはT細胞応答を生じる領域をコードする。T細胞およびB細胞エピトープを決定するある方法はエピトープのマッピングを必要とする。問題のタンパク質は短いオーバーラップペプチドとして合成される(PEPSCAN)。続いて個々のペプチは、天然のタンパク質によって誘導された抗体との結合能力またはT細胞もしくはB細胞活性化を誘導する能力について試験される(Janis Kuby, 1992)。
問題のエピトープを決定する別の方法は親水性タンパク質領域の選別である。親水性残基はしばしばタンパク質の表面に存在し、したがって抗体が近づくことができるタンパク質の領域である(Janis Kuby, 1992)。T細胞応答を生じることができる問題のエピトープを選別するまた別の方法は、当該タンパク質配列から潜在的なHLAアンカー結合モチーフを認定することである(前記モチーフはMHC分子とおそらく結合することが知られているペプチド配列である)。
タンパク質がT細胞応答を刺激する問題のエピトープであるか否かを決定する際のいくつかの指針には以下が含まれる。ペプチドの長さ:ペプチドは、MHCクラスI複合体に適合するために少なくとも8または9アミノ酸長、MHCクラスII複合体に適合するために少なくとも13−25アミノ酸長である。この長さは、MHC複合体と結合するペプチドについて最小ある。細胞は発現されたペプチドを切断することができるので、ペプチドはこれらの長さよりも長いことが好ましい。種々のクラスIまたはクラスII分子と十分に強い特異性でペプチドを結合させて免疫応答を生じさせる適切なアンカーモチーフをペプチドは含むはずである(以下を参照されたい:M Bocchia et al.;VH Englehard, 1994)。前記は、問題のタンパク質の配列をMHC分子と密接に関連するペプチドの発表された構造と比較することによって煩雑な実験を行うことなく実施することができる。
さらにまた、当業者は、当該タンパク質配列をタンパク質データベースに列挙された配列と比較することによって問題のエピトープを確認することができる。
さらにまた別の方法は、単純に問題のタンパク質の部分を作製または発現させ、問題のタンパク質のそれらの部分に対するモノクローナル抗体を作製し、続いてそれら抗体が、当該タンパク質が由来した病原体のin vitro増殖を阻害するか否かを確認するものである。当業者は、問題のタンパク質の部分を作製または発現させ、前記タンパク質に対する抗体がin vitro増殖を阻害するか否かについて解析するために、本明細書または当分野で示された他の指針を用いてもよい。
本発明は、例えば天然の配列のアミノ酸残基の欠失および/または挿入および/または置換によってその天然の形態から改変されてある、1つまたは2つ以上のアフリカウマ病ウイルスタンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターおよび改変組換えウイルスを包含する。
“免疫原性組成物”、“免疫学的組成物”および“ワクチン”に関して、前記ベクター(またはその発現生成物)を含む免疫学的組成物は、免疫学的応答(局所的または全身的)を誘引する。前記応答は防御的であり得るが、かならずしも防御的である必要はない。本発明の組換え体またはベクター(またはその発現生成物)を含む免疫原性組成物は、同様に局所的または全身的免疫学的応答(防御的である得るが、そうであるとは限らない)を誘引する。ワクチン組成物は局所的または全身的防御応答を誘引する。したがって、“免疫学的組成物”および“免疫原性組成物”という用語は“ワクチン組成物”を含む(前の2つの用語は防御性組成物であり得るので)。本発明は免疫学的、免疫原性またはワクチン組成物を包含する。
組換えベクター、例えば組換えウイルス、例えば組換えポックスウイルス-AHSV、またはその発現生成物のための投与手段は、本発明の組成物、例えば免疫学的もしくはワクチン組成物または治療用組成物(例えば組換えベクターまたは組換えウイルス、例えばポックスウイルスまたはその発現生成物を含む)の投与のための投与手段と同様に、非経口的ルート(皮内、筋肉内または皮下)によることができる。
本発明の組換えベクターまたはウイルス-AHSV(例えばポックスウイルス-AHSV組換え体)免疫学的もしくはワクチン組成物または治療用組成物は、医薬または獣医分野の業者によく知られた標準的技術にしたがって調製することができる。そのような組成物は、年齢、性別、重量および投与経路のような因子を考慮しながら、獣医分野の業者によく知られた調剤および技術によって投与することができる。前記組成物は、単独で投与することができるが、また複数の組成物とともに、例えば“他の”免疫学的組成物または弱毒化、不活化組換えワクチンもしくは治療用組成物とともに同時投与、または連続投与することができ、それによって本発明の多価または“カクテル”またはコンビネーション組成物およびそれらを用いる方法を提供する。前記組成物は、アフリカウマ病ウイルス成分(例えば、アフリカウマ病ウイルスの免疫原もしくは問題のエピトープを発現する組換えベクター(例えばプラスミドまたはウイルス)、またはアフリカウマ病ウイルス免疫原もしくは問題のエピトープを発現するポックスウイルス、および/またはアフリカウマ病ウイルス免疫原もしくは問題のエピトープ)、および1つまたは2つ以上の無関係のウマ病原体ワクチン(例えば問題のエピトープ、免疫原および/またはそのような問題のエピトープまたは免疫原を発現する組換えベクターまたはウイルス(例えば組換えウイルス、例えば組換えポックスウイルス))の組合せを含むことができる。前記1つまたは2つ以上の無関係のウマ病原体ワクチンは、例えば1つまたは2つ以上のウマの細菌性および/またはウイルス性病原体の1つまたは2つ以上の免疫原または問題のエピトープであり、前記ウマの問題のエピトープまたは免疫原は、例えば以下の1つまたは2つ以上に由来する:ウマヘルペスウイルス(EHV)、ウマインフルエンザウイルス(EIV)、ウマ西ナイルウイルス(WNV)、東部ウマ脳脊髄炎(EEE)、西部ウマ脳脊髄炎(WEE)およびベネズエラウマ脳脊髄炎(VEE)、破傷風、狂犬病およびポトマックウマ熱+EPM。繰り返せば、成分および投与態様(連続投与または同時投与)は、投薬量と同様に年齢、生物、重量および投与ルートのような要件を考慮しながら決定することができる。これに関しては、米国特許5,843,456号を参照できる(前記特許は参照により本明細書に含まれ、前記は狂犬病組成物および組み合わせ組成物およびその使用に関する)。
組成物は以下から選択される少なくとも1つのアジュバント化合物を含むことができる:水酸化アルミニウム、代謝性油(テルペン炭化水素およびポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む)、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマー、および免疫刺激複合体マトリックス(ISCOM)(QUIL Aノグリコシド、コレステロール、抗原および/またはリン脂質を含む)。
無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーの中で、無水マレイン酸とエチレンのコポリマーであって線状または架橋(例えばジビニルエーテルで架橋)されているコポリマーEMA(商標)(Monsanto)が好ましい。以下の文献を参照することができる:J Fields et al. 1990(前記文献は参照により本明細書に含まれる)。
それらの構造を見れば、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびコポリマーEMA(商標)は、好ましくは以下の式の基本単位から形成される:
R1およびR2は同一でも異なっていてもよく、HまたはCH3を表し;
x=0または1で、好ましくはx=1であり;
y=1または2で、x+y=2である。
コポリマーEMA(商標)については、x=0で、y=2である。カルボマーについてはx=y=1である。
好ましくは、本発明のアジュバント溶液(特にカルボマー溶液)は、蒸留水中で、好ましくは塩化ナトリウムの存在下で調製され、得られる溶液は酸性pHである。このストック溶液は、前記をまたはその実質的部分を所望の量のNaCl含有水、好ましくは生理学的食塩水(NaCl 9g/L)にいくつかの部分に分けて一度に全部添加することによって稀釈され、同時にまたは引き続いて好ましくはNaOHで中和(pH7.3から7.4)される。この生理学的pHの溶液はそのままワクチンと混合するために用いられ、特に凍結乾燥形、液体形または凍結形で保存されるであろう。
最終ワクチン組成物におけるポリマー濃度は0.01%から2%w/v、より具体的には0.06%から1%w/v、好ましくは0.1%から0.6%w/vである。
本発明の組成物はまた、文献(V Ganne et al. 1994)に記載されているように、水中油としてまたは油中水として懸濁水状態で処方することができる。
標準的な成書、例えば”Remington’s Pharmaceutical Science”(17th, edition, 1985)(前記文献は参照により本明細書に含まれる)を参考にして、煩雑な実験を実施することなく適切な調製物を作製することができる。
多様な投与ルートに適した形態の組成物が本発明に包含される。さらにまた、有効な投与量および投与ルートは、既知の要件、例えば年齢、性別、重量、および公知でありさらに煩雑な実験を必要としない他のスクリーニング方法によって決定される。各活性物質の投与量は、本明細書に引用した文書(または本明細書に引用した文書に参照または引用された文書)に記載されたとおりであり得る。
アフリカウマ病ウイルス免疫原または問題のエピトープはアフリカウマ病ウイルスの9つの血清型のいずれかから入手するか、またはアフリカウマ病ウイルス遺伝子またはその部分のin vitro組換え体発現によって入手できる。発現用ベクター(または組換え体)の製造および/または使用の方法、並びに発現生成物およびそれらから得られる生成物(例えば抗体)の使用の方法は、本明細書に引用した文書および本明細書に引用した文書に参照または引用された文書に開示された方法によるかまたはそれらに類似することができる。
適切な投与量はまた下記の実施例を基準にすることができる。
具体的な特徴では、本発明は、アフリカウマ病ウイルス由来のDNA配列をその中に含む組換えポックスウイルス、有利にはポックスウイルスゲノムの非本質領域に前記DNA配列を含む組換えポックスウイルスを目的とする。前記組換えポックスウイルスは、外来性アフリカウマ病ウイルス遺伝子の遺伝子生成物を発現する。具体的には、アフリカウマ病ウイルスのウイルスタンパク質をコードするVP2およびVP5遺伝子を単離し、性状を決定してALVAC(カナリアポックスベクター)組換え体に挿入した。
本発明のある実施態様は新規なAHSV株、すなわちAHSV-Jane株に関する。
本発明の好ましい実施態様をこのように詳細に述べてきたが、上述の文書で規定した本発明は、多くの明確なそれらの変型が本発明の範囲を外れることなく可能であるので、上記に記載した具体的な内容に限定されないことは理解されよう。
以下の非限定的な実施例によって本発明をこれからさらに詳しく述べる。
更なる労作を必要とすることなく、当業者は前述の記載を用いて本発明を完全に実施できると考える。以下の詳細な実施例は単なる例示と解し、いかなる場合においても前述の開示を制限するものと解するべきではない。当業者は、反応物質並びに反応条件および技術に関して本方法から適切な変型を直ちに認識するであろう。
DNA挿入物、プラスミドおよび組換えウイルスベクターの構築は、以下のJ. Sambrookらの成書に記載された標準的な分子生物学技術を用いて実施した(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)。本発明で使用した全ての制限フラグメントは“Geneclean”キット(BIO 101 Inc., La Jolla, Calif)を用いて単離した。
アフリカウマ病ウイルスのVP1およびVP5をコードする合成遺伝子を組換えカナリアポックスウイルスベクターの構築で用いた。簡単に記せば、アフリカウマ病ウイルスの血清型4、5および9のVP2およびVP5をそれぞれコードするL2およびM5遺伝子セグメントを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、文献(KR Bonneau, BA Mullens(2001)、KR Bonneau et al.(1999))に以前に記載されたプロトコルを用いてシークェンシングを実施した。
AHSV-4のビルレント野外株(以後“AHSV4 Jane株”と称する)のL2/VP2(配列番号:48)およびM5/VP5(配列番号:50)遺伝子の配列を、GenBankで入手できるAHSV血清型4の他の株の同じ遺伝子の公表されている配列と比較し、続いてGeneOptimizer(商標)ソフト(Geneart GmbH)を用いて最適化合成配列を誘導し、個々の遺伝子の各々を包含するオリゴヌクレオチドアレーを化学的に合成した。PCRによる手法を用いて前記オリゴヌクレオチドをアッセンブリングさせ、完全な完全長合成VP2およびVP5コード配列を作製した。続いて、本質的にカナリアポックスウイルスベクター媒介西ナイルウイルス(WNV-CP)ワクチンについて以前に記載(JM Minke et al. 2004a)されたように、この合成VP2およびVP5コード遺伝子をカナリアポックスウイルスベクターに再クローニングし、AHSV-カナリアポックスウイルス組換え体(AHSV-CP)を作製した。
簡単に記せば、AHSV-4のVP2をコードする合成遺伝子(配列番号:4)をカナリアポックスC3挿入ベクター(ワクシニアウイルスH6プロモーターおよびカナリアポックスC3座位のフランキングアームを含むプラスミド)にサブクローニングし、H6プロモーターの制御下にVP2(配列番号:4)遺伝子を含む発現カセットを作製した。続いて、エントモポックスウイルスアムサクタ・ムーレイ(Amsacta moorei)の42Kプロモーターの制御下に合成VP5遺伝子(配列番号:5)を含む発現カセットを構築し、H6-VP2ドナープラスミドでクローニングした。得られた挿入プラスミドは、2つの発現カセット(H6プロモーターの制御下のVP2(配列番号:4)遺伝子および42Kプロモーターの制御下のVP5遺伝子(配列番号:5))を頭-尾の向きで含んでいた。
AHSV-CPウイルス組換え体を作製するために、前記挿入プラスミドを初代ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)にトランスフェクトし、続いて前記にカナリアポックスウイルスを感染させた。24時間後、トランスフェクトした感染細胞を採集し、超音波処理して組換えウイルスのスクリーニングに用いた(A Piccini et al, (1987)。AHSV-特異的プローブを用い、組換え体のプラークをin situプラークリフトハイブリダイゼーション法(Sambrook et al. 1982)によりスクリーニングした。4回連続プラーク精製の後、アフリカウマ病ウイルス挿入物について100%陽性であることをハイブリダイゼーションによって確認したこの組換え体を増幅させてワクチンストックの調製に用い、-80℃で保存した。
図1はpLHD3460.4(配列番号:6)の構築模式図を示す(pLHD3460.4はAHSV-4-VP2およびAHSV-4-VP5ウイルスタンパク質を発現するALVAC組換え体を作製するためのC3ドナープラスミドである)。AHSV-4-VP2(配列番号:4)およびAHSV-4-VP5(配列番号:5)をコードする遺伝子は、哺乳動物細胞における発現のためのコドン最適化を有する合成物である。合成AHSV-4-VP2(配列番号:4)遺伝子をワクシニアpC3H6プロモーターの制御下に置き、合成AHSV-4-VP5(配列番号:5)遺伝子をワクシニア42Kプロモーターの制御下に置いた。前記プラスミドはまたアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含む。
合成AHSV-4-VP2遺伝子を含むプラスミドをBamHIおよびNruIで消化した。得られた3.2KbのAHSV-4-VP2挿入物を単離し、pJY1107.5(pF8 AIV H7N2 HA)から調製したシャトルベクターのBamHI/NruI部位にクローニングし、pLHD3410.9(pF8 H6p AHSV-4-VP2)を作製した(前記はH6プロモーターのNruI部位およびその後ろにXhoI部位が続く完全長のAHSV-4-VP2を含む)。
pLHD3410.9を再度NruIおよびXhoIで消化し、H6プロモーターの3’NruIおよび完全長のAHSV-4-VP2遺伝子を含む3.2KbのDNAフラグメントを単離し、pJY1738.2から調製したALVAC C3ドナープラスミド(pC3 H6p CPV-VP2)のNruI/XhoI部位にクローニングし、pLHD3426.1(H6p-AHSV-4-VP2発現カセットを含むALVAC C3ドナープラスミド)を作製した。
AHSV-4-VP5を含むプラスミドを鋳型として、さらに用いプライマー対、13599.JY(配列番号:7)および13600.JY(配列番号:8)を用いて、SpeI部位にフランキングされる発現カセット42Kp-AHSV-4-VP5を増幅させた。プライマー3599.JY(配列番号:7)は、SpeI部位およびその後にVP5の5’配列が続く42Kプロモーターの配列を含む。プライマー13600.JY(配列番号:8)は、その後にT5NTおよびSpeI部位が続くVP5の3’配列から成る。続いて増幅発現カセットをpCR2.1(TOPOベクター)でクローニングし、pCR2.1 42Kp AHSV-4-VP5を作製した(前記が正確な配列を含むことを確認した)。
プラスミドpCR2.1 AHSV-4-VP5をSpeIで消化し、続いて42Kp-VP5発現カセットを単離し、プラスミドpLHD3426.1のSpeI部位でクローニングし、二重発現カセットH6p-AHSV-4-VP2/42Kp-Vp5を含むALVAC C3ドナープラスミド(pLHD3460.4)を作製した。前記をシークェンシングし、配列番号:6に示される正確な配列を含むことを確認した。
42Kp-AHSV-4-VP5発現カセットの増幅用プライマーは以下のとおりである:
13599.JY(配列番号:7)
5’TGACTAGTTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATGGGCAAGTTTACCAGCTTCCTGAAG
SpeI 42Kp
13600.JY(配列番号:8)
5’ TTAACTAGTAGAAAAATCATCAGGCGATCTTCACGCCGTACAG
SpeI T5NT
予想される分子量はAHSV-4-VP2(配列番号:1)については124.3kDaさらにAHSV-4-VP5(配列番号:2)については57kDaであった。等電点はAHSV-4-VP2については6.75さらにAHSV-4-VP5については5.8であった。両ウイルスタンパク質は主として細胞質で発現された。
vCP2377組換えウイルスベクターを作製するために、初代ニワトリ胚線維芽細胞(初代CEFまたはCEF)を用いドナープラスミド(pLHD3460.4(配列番号:6))および親ウイルス(ALVAC、4.4x1010 pfu/mL)のin vitro組換えを実施した。図3はこの方法の概略である。AHSV-4-VP5特異的プローブによるプラークハイブリダイゼーションを用いて組換えウイルスベクターを確認した。
Fugene試薬(Roche, Palo Alto, California 94304-1353)を用いNotI線状化ドナープラスミドpLHD3460.4(15μg)を初代CEF細胞にトランスフェクトすることによって、in vitro組換えを実施した。続いてこのトランスフェクトした細胞にレスキューウイルスとしてALVAC(4.4x1010 pfu/mL)を感染数(MOI)10で感染させた。24時間後に、このトランスフェクション-感染実施細胞を採集して超音波処理し、組換えウイルスのスクリーニングのために用いた。
AHSV-4-VP5特異的プローブを用いプラークリフトハイブリダイゼーション法(Sambrook et al. 1982)により組換え体プラークをスクリーニングした。前記プローブは、製造業者(Amersham, Alpharetta, GA 30058, Cat #RPN3001)のプロトコルにしたがいセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識した。3回連続プラーク精製の後、vCP2377.6.1.1(配列番号:17によって提供される部分配列)と称される組換え体が生成され、AHSV挿入物について100%陽性であることおよび空C3部位について100%陰性であることがハイブリダイゼーションによって確認された。
最終回のプラーク精製から単プラークを選択して増やし、vCP2377.6.1.1増幅のためにP1(T-25フラスコ)、P2(T-75フラスコ)およびP3(ローラーボトル)ストックを得た。P2レベルでハイブリダイゼーションにより組換え体を再確認し、挿入物について100%陽性であることおよび空C3座位について100%陰性であることを見出した。ローラーボトルから感染細胞培養液を採集し、濃縮してウイルスストックを作製した(1.2x1010 pfu/mLのvCP2377.6.1.1.が3.2mL)。マウス抗BTV4-VP2 mAbおよびマウス抗VP5 AHSV mAb 10AE12継代9(Martinez-Torrecuadrada et al. 1999, Virology 257:449-459)をウェスタンブロットおよびイムノプラークに用いた(それぞれ図7および図8)。
in vitro組換えに用いた細胞は初代ニワトリ胚線維芽細胞(初代CEF)であり、前記細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)(JRH bioscience, Lenexa, KS 66215:γ照射カタログ番号12107、ロット番号1L0232)、4mMグルタミン(Invitrogen/BRL/Gibco, Carlsbad, California, 92008-7321, cat#11960)および1mMピルビン酸ナトリウム(Invitrogen/BRL/Gibco, cat#11360-070)補充ダルベッコー改変イーグル培養液(DMEM)(Invitrogen/BRL/Gibco, Carlsbad, California, 92008-7321, cat#25030-081)で1x抗生物質/抗菌剤(P/S/A/A, Invitrogen/BRL/Gibco, cat#15240-062)、Fugene(Roche, Lot#181444)の存在下にて増殖させた。最終ウイルス濃縮物を1mMトリス(pH9.0)に再懸濁させた。
P3ストックが、AHSV-4-VP2およびAHSV-4-VP5挿入物について100%陽性であることおよび空C3座位について100%陰性であることをハイブリダイゼーションによって再確認した。ゲノムDNAの理論的制限マップ(図4)をベクターNTI(Invitrogen, Carlsbad, California)で作製した。実際の実験を行うために、ゲノムDNAをvCP2377.6.1.1.ウイルス濃縮物から抽出してBamHI、HindIIIまたはPstIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動によって分離した(図5)。前記の結果は、外来遺伝子配列が正確に挿入されていることを示した。
サザンブロット:BamHI、HindIIIまたはPstIで消化したゲノムDNAをナイロン膜に移し、AHSV-4-VP2プローブを用いることによってサザンブロット分析を実施した。予想サイズのバンドが観察された(すなわち16047bp、6971bp BamHI;20660bp HindIII;および13658bp、4061bp PstI)。前記の結果は、AHSV-4-VP2およびAHSV-4-VP5がC3座位に正確に挿入されていることを示した(図6)。
発現解析:初代CEF細胞にvCP2377.6.1.1.のP3ストックをMOI10で感染させ、37℃で24時間インキュベートした。続いて細胞および培養上清を採集した。サンプルタンパク質を10% SDS-PAGEで分離し、IMMOBILIONナイロン膜に移し、AHSV(アフリカウマ病ウイルス)10AE12継代9(Martinez-Torrecuadrada et al. 1999)のマウス抗VP5抗体の1:100希釈で別個に調べた。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗血清を二次抗体として用い、バンドはAmersham検出試薬を用いて可視化した。マウス抗AHSV VP5 mAbの使用により、55から70kDaの間のタンパク質バンドがvCP2377.6.1.1.の細胞ペレットで検出され、AHSV-4-VP5タンパク質の発現が示された(図7)。培養液ではAHSV-4-VP5タンパク質の発現は検出されなかった。AHSV-4-VP2の発現は抗BTV4-VP2 mAb(Merial私有物質)では検出されなかった。
イムノプラーク:vCP2377.6.1.1.集団の均質性は、マウス抗AHSV VP5 mAb 10AE12継代9(Martinez-Torrecuadrada et al. 1999)の1:100希釈を用いてイムノプラークアッセイによって証明されたように100%であった(図8)。抗AHSV VP2抗体は入手できなかった。
配列解析: PCR増幅並びにC3座位のフランキングアームおよびAHSV-4-VP2、AHSV-4-VP5挿入物の配列解析を用いることによって、P3ストックゲノムDNAのより詳細な解析を実施した。プライマー8103JY(配列番号:13)/13616.LH(配列番号:15)および13637.LH(配列番号:16)/8104JY(配列番号:14)を用いて全C3R-AHSV-4-VP2/VP5-挿入物-C3Lフラグメントを増幅した(図9)。得られた配列(すなわち配列番号:17)は、vCP2377.6.1.1.のAHSV-4-VP2およびAHSV-4-VP5挿入物、並びにAHSV挿入物の周辺のC3左および右アームの配列が正確であることを示した。
AHSV-4-VP2プローブを増幅するためのプライマー
13625.LH(配列番号:9)5’ TACGACCACGGCACCGACATCATCT 3’
13632.LH(配列番号:10)5’ TTTTCAGCTTCTTAAAGGCGTACTC 3’
AHSV-4-VP5プローブを増幅するためのプライマー
13615.LH(配列番号:11)5’ AAGAAGATGTACAAGCTGGCCGGCA 3’
13620.LH(配列番号:12)5’ GCCGCTCGTATTCCTGCTTCACGAT 3’
vCP2377 C3アーム+挿入物のPCR増幅のためのプライマー
8103.JY(配列番号:13)5’ GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3’
8104.JY(配列番号:14)5’ TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3’
13616.LH(配列番号:15)5’ TGCCGGCCAGCTTGTACATCTTCTT 3’
13637.LH(配列番号:16)5’ CACCACACTGAAGCTGGACAGAAGA 3’
pCXL2415.1(配列番号:22)の全体的な構築模式図は図10に示されている。合成AHSV-9-VP2(配列番号:28)を含むプラスミドをNruI/BamHIで消化して3188bpフラグメントを単離し、NruI/BamHI-線状化pJY1107.5(pF8 H6p-AIV H7N2 HA)でクローニングした。得られたプラスミド、pCXL2275.1(pF8 H6p-AHSV-9-VP2)はH6プロモーターのNruI部位および完全長AHSV-9-VP2とその後に続くXhoI部位を含んでいる。配列確認の後、pCXL2275.1をNruI/XhoIで消化して3194bpのAHSV-9-VP2フラグメントを単離し、NruI/XhoI消化pJY1378.2(C3 ALVACドナープラスミド)でクローニングした。得られたプラスミド、pCXL2328.4(pC3 H6p-AHSV-9-VP2)は発現カセットH6p-AHSV-9-VP2を含んでいる。
42Kp-AHSV-9-VP5発現カセットを作製するために、18020CXL(配列番号:23)および18021CXL(配列番号:24)プライマーを用いて、AHSV-9合成VP5遺伝子をコードするDNAを増幅した。続いて、このPCR生成物をTOPO pCR2.1ベクターを用いてクローニングし、プラスミドpCXL2313.2(pCR2.1 42Kp-VP5)を作製した。しかしながら、pCXL2313.2はプライマー18020CKLの設計に起因してVP5遺伝子の末端にTN5T配列を含まないことが判明した。したがって、新しいプライマーセット、18041CXL(配列番号:46)および18042CXL(配列番号:47)を合成し、前記を用いてプラスミドpCXL2313.2のVP5遺伝子の末端にT5NT配列を導入した。部位指定変異導入はStratagene社のQuickChangeキットを用いて実施し、得られたプラスミド、pCXL2399.3をシークェンシングして、SpeI部位にフランキングする正確な42K-AHSV-9-VP5を含むことを確認した。
続いて、プラスミドpCXL2399.3をSpeIで消化して42Kp-AHSV-9-VP5発現カセットを含む1556bpフラグメントを単離し、プラスミドpCXL2328.4のSpeI部位にクローニングしてpCXL2425.1(配列番号:22)を作製した。前記は、二重発現カセットH6p-AHSV-9-VP2/42Kp-AHSV-9-Vp5を頭尾の向きで含むALVAC C3ドナーである(図11)。AHSV-9-VP2およびAHSV-9-VP5の予想される分子量はそれぞれ123.5kDaおよび56.8kDaである。VP2およびVP5の等電点はそれぞれ8.14および5.96であり、タンパク質は主として細胞質で発現した。
図12に示されているin vitro組換え(IVR)模式図にしたがって、vCP2383組換えウイルスベクターを作製した。IVRは、初代ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)にFuGENE(商標)HDトランスフェクション試薬(Roche, Cat#04709705001)を用いて13.2μgのSapI-線状化ドナープラスミドpCXL2415.1をトランスフェクトすることによって実施した。続いてトランスフェクトした細胞にレスキューウイルスとしてALVAC(4.4x1010 pfu/mL)を感染多重度(MOI)10で感染させた。24時間後に、このトランスフェクション-感染実施細胞を採集して超音波処理し、組換えウイルスのスクリーニングのために用いた。
AHSV-9-VP5特異的プローブを用いプラークリフトハイブリダイゼーション法(Sambrook et al. 1982)により組換え体プラークをスクリーニングした。前記プローブは、製造業者(Amersham, Cat #RPN3001)のプロトコルにしたがいセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識した。4回連続プラーク精製の後、vCP2383.3.1.1.1およびvCP2383.9.1.1.1と称される組換え体が生成され、AHSV挿入物について100%陽性であることおよびC3座位について100%陰性であることがハイブリダイゼーションによって確認された。
最終回のプラーク精製から単プラークを選択して増やし、vCP2383.3.1.1.1増幅のためにP1(T-25フラスコ)、P2(T-75フラスコ)およびP3(6xローラーボトル)ストックを得た。ローラーボトルから感染細胞培養液を採集し、濃縮してウイルスストックを作製した(2.2x1010 pfu/mLのvCP2383.3.1.1.1が4.5mL)。
P3ストックが、AHSV-9-VP2およびAHSV-9-VP5挿入物について100%陽性であることおよびC3座位について100%陰性であることをハイブリダイゼーションによって再確認した。
ゲノム解析: ベクターNTIを用いてvCP2383ゲノムDNAの理論的制限酵素ゲルを作製した(図13)。実際の実験を行うために、ゲノムDNAをvCP2383.3.1.1.1およびvCP2383.9.1.1.1から抽出してBamHI、HindIIIまたはXbaIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動によって分離した。前記の結果は、外来遺伝子配列が正確に挿入されていることを示した(図14)。
サザンブロット:BamHI、HindIIIまたはXbaIで消化したゲノムDNAをナイロン膜に移し、AHSV-9-VP5プローブを用いることによってサザンブロット分析を実施した。予想サイズのバンドが観察された(すなわち4940bp BamHI;20633bp HindIII;および9559bp XbaI)。前記の結果は、AHSV-9-VP2およびAHSV-9-VP5がC3座位に正確に挿入されていることを示した(図15)。
発現解析:初代CEF細胞にvCP2383.3.1.1.1のP3ストックをMOI10で感染させ、37℃で26時間インキュベートした。細胞および培養上清を採集し、サンプルタンパク質を10% SDS-PAGEで分離し、IMMOBILIONナイロン膜に移し、AHSV(アフリカウマ病ウイルス)10AE12継代9(Martinez-Torrecuadrada et al. 1999)のマウス抗VP5抗体の1:100希釈で別個に調べた。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗血清を二次抗体として用い、バンドはAmersham検出試薬を用いて可視化した。マウス抗AHSV VP5 mAbの使用により、55から72kDaの間のタンパク質バンドがvCP2383.3.1.1.1の細胞ペレットで検出され、AHSV-9-VP5タンパク質の発現が示された(図16)。培養液中にはAHSV-9-VP5タンパク質の発現は検出されなかった。AHSV-9-VP2の発現はマウス抗BTV4-VP2 mAb(Merial私有物質)では検出されなかった。
イムノプラーク:マウス抗AHSV VP5 mAb 10AE12継代9(Martinez-Torrecuadrada et al. 1999)の1:100希釈を用いてイムノプラークアッセイによって証明されたように、vCP2383.3.1.1.1集団の均質性は100%であった(図17)。
配列解析: PCR増幅並びにC3座位のフランキングアームおよびAHSV-9-VP2(配列番号:28)とAHSV-9-VP5(配列番号:29)の挿入物の配列解析を用いることによって、P3ストックゲノムDNAのより詳細な解析を実施した。プライマー8103JY(配列番号:13)および8104JY(配列番号:14)(図18)を用いて全C3L−AHSV-9-VP2−42K-AHSV-9-VP5−C3Rフラグメントを増幅した。得られた配列(すなわち配列番号:27)は、vCP2383.3.1.1.1のAHSV-9-VP2(配列番号:28)およびAHSV-9-VP5(配列番号:29)挿入物、並びにAHSV挿入物の周辺のC3左および右アームの配列が正確であることを示した。
AHSV-9-VP5プローブを増幅するためのプライマー
18020CXL(配列番号:23)5’ CTAGACTAGTTTACTATCATTTCACGCCGAACAGCA
18021CXL(配列番号:24)5’ GCAAGGACCAGAGCGAGCGGATCA
AHSV-9-VP2プローブを増幅するためのプライマー
13660CXL(配列番号:25)5’ AGGCCTTCGCCGGCAACAGCCTGCT
13665CXL(配列番号:26)5’ AGGGCATCGATCAGGAACTCGCTCT
vCP2383 C3アーム+挿入物のPCR増幅のためのプライマー
8103.JY(配列番号:13)5’ GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3’
8104.JY(配列番号:14)5’ TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3’
pJSY2247.2(配列番号:32)の全体的な構築模式図は図22に示されている。合成AHSV-5-VP2(配列番号:33)遺伝子を含むプラスミドをXhoIおよびNruIで消化した。得られたAHSV-5-VP2(配列番号:33)挿入物を単離し、pJY1738.2(pC3 H6p CPV-VP2)から調製したALVAC C3ドナープラスミドのNruI/XhoI部位でクローニングし、pJSY2245.1 (H6p-AHSV-5-VP2発現カセットを含むALVAC C3ドナープラスミド)を作製した。
合成AHSV-5-VP5(配列番号:34)を含むプラスミドからSpeI部位にフランキングされる発現カセット42Kp-AHSV-5-VP5をSpeI消化によって単離し、続いてプラスミドpJSY2245.1のSpeI部位にクローニングして、二重発現カセットpJSY2247.2(配列番号:32、H6p-AHSV-5-VP2/42Kp-VP5)を含むALVAC C3ドナープラスミドを作製した。前記をシークェンシングして正確な配列を含むことを確認した。プラスミドpJSY2247.2 の図および対応する配列番号は図23に示されている。合成AHSV-5-VP2(配列番号:35)および合成AHSV-5-VP5(配列番号:36)の分子量はそれぞれ約122.9kDaおよび約57.1kDaである。合成AHSV-5-VP2(配列番号:35)および合成AHSV-5-VP5(配列番号:36)の等電点はそれぞれ約8.4および5.77である。両ウイルスタンパク質は主として細胞質で見出された。
図24に示されているin vitro組換え(IVR)の模式図にしたがって、vCP2398(配列番号:41)組換えウイルスベクターを作製した。IVRは、初代CEFにFuGENE試薬(Roche, Cat#04709705001)を用いて15μgのNotI-線状化pJSY2247.2(配列番号:32)ドナープラスミドをトランスフェクトすることによって実施した。続いてトランスフェクトした細胞にレスキューウイルスとしてALVAC(1)(2x1010 pfu/mL HM1355)を感染数(MOI)10で感染させた。24時間後に、このトランスフェクション-感染実施細胞を採集して超音波処理し、組換えウイルスのスクリーニングのために用いた。
製造業者(Amersham, Cat #RPN3001)のプロトコルにしたがいセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識したAHSV-5-VP2特異的プローブを用いプラークリフトハイブリダイゼーション法(Sambrook et al. 1982)により組換え体プラークをスクリーニングした。。3回連続プラーク精製の後、vCP2398.2.1.1と称される組換え体が生成され、AHSV挿入物について100%陽性であることおよび空C3座位について100%陰性であることがハイブリダイゼーションによって確認された。
最終回のプラーク精製から単プラークを選択して増やし、vCP2398.2.1.1増幅のためにP1(T-25フラスコ)、P2(T-75フラスコ)およびP3(ローラーボトル)ストックを得た。P2レベルでハイブリダイゼーションにより組換え体を再確認し、挿入物について100%陽性であることおよび空C3座位について100%陰性であることを見出した。ローラーボトルから感染細胞培養液を採集し、濃縮してウイルスストックを作製した(3.3x1010 pfu/mLのvCP2398.2.1.1が2.6mL)。
P3ストックが、AHSV-5-VP2およびAHSV-5-VP5挿入物について100%陽性であることおよび空C3座位について100%陰性であることをハイブリダイゼーションによって再確認した。
ゲノム解析:ゲノムDNAの理論的制限酵素ゲルをベクターNTIで作製し、図25に示した。ゲノムDNAをvCP2398.2.1.1から抽出してBamHI、HindIIIまたはPstIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動によって分離した。前記の結果は、外来遺伝子配列が正確に挿入されていることを示した(図26)。
サザンブロット:BamHI、HindIIIまたはPstIで消化したゲノムDNAをナイロン膜に移し、AHSV-5-VP2プローブを用いることによってサザンブロット分析を実施した。特異的な20975bpおよび11899bpのBamHI、4980bpのHindIII、および1818bpのPstIバンドが予想サイズで観察された。前記の結果は、AHSV-5-VP2およびAHSV-5-VP5がC3座位に正確に挿入されていることを示した(図27)。
発現解析:初代CEF細胞にvCP2398.2.1.1のP3ストックをMOI10で感染させ、37℃で24時間インキュベートした。続いて細胞および培養上清を採集した。サンプルタンパク質を10% SDS-PAGEで分離し、IMMOBILIONナイロン膜に移し、AHSV(アフリカウマ病ウイルス)10AE12継代9(Martinez-Torrecuadrada et al. 1999)のマウス抗VP5抗体の1:100希釈で別個に調べた。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗血清を二次抗体として用い、バンドはAmersham検出試薬を用いて可視化した。マウス抗AHSV VP5 mAbの使用により、55から72kDaの間のタンパク質バンドがvCP2398.2.1.1の細胞ペレットで検出され、AHSV-5-VP5タンパク質の発現が示された(図28)。培養液ではAHSV-5-VP5タンパク質の発現は検出されなかった。
イムノプラーク:マウス抗AHSV VP5 mAb 10AE12継代9(Martinez-Torrecuadrada et al. 1999)の1:100希釈を用いてイムノプラークアッセイによって証明されたように、vCP2398.2.1.1集団の均質性は100%であった(図29)。
配列解析: PCR増幅並びにC3座位のフランキングアームおよびAHSV-5-VP2とAHSV-5-VP5の挿入物の配列解析を用いることによって、P3ストックゲノムDNAのより詳細な解析を実施した。プライマー8103.JY/8104.JYを用いて全C3R-AHSV-5-VP2/VP5挿入物-C3Lフラグメントを増幅した。プライマーマップは図30に示されている。得られた配列(すなわち配列番号:41)は、vCP2398.2.1.1のAHSV-5-VP2およびAHSV-5-VP5挿入物、並びにAHSV挿入物の周辺のC3左および右アームの配列が正確であることを示した。
AHSV-5-VP2プローブを増幅するためのプライマー
18098.JY(配列番号:37)5’GGATCGAGCGGGACGAGCTGGACG 3’
18103.JY(配列番号:38)5’GCCAGCCGTACTGGAACTTGTAGC 3’
AHSV-5-VP5プローブを増幅するためのプライマー
18115.JY(配列番号:39)5’ TGCTGGACCTGAGCGCCGAGGTGA 3’
18120.JY(配列番号:40)5’ TCAGGCGATCTTCACGCCGAACAG 3’
vCP2398 C3アーム+挿入物のPCR増幅のためのプライマー
8103.JY(配列番号:13)5’ GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3’
8104.JY(配列番号:14)5’ TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3’
ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)のコンフルエントな単層でvCP2377(実施例6にしたがって作製)を4日間培養して採集し処理した後、種ウイルスマスターストックから5継代目(MSV+5)で得られた活性成分を用いて3種の異なるワクチンを作製した。MSV+5継代は、(ゲノム/遺伝子の構造安定性から)市販ワクチン製品の好例であり、典型的には市販バッチの製造に用いられる。3種のワクチン(GMP条件で作製)はアジュバントとしてCARBOMERを用い(4mg/mL)、それらはその抗原濃度が相違する。用いた具体的なCARBOMERは、CARBOMER(商標)/CARBOPOL(商標)974P(医薬品グレード、Goodrich Chemicals Europe NV(ベルギー)製)であった。使用濃度は、1用量=1mLの場合4mg/mLであった。本明細書を通じてCARBOMER(商標)974PはCARBOPOL(商標)974Pと互換的に用いられる。
ワクチン処方物で用いた活性成分vCP2377の感染力価は8.89 Log10 CCID50/mLであった。ワクチン処方物はまた以下の成分を含んでいた:0.1%のNaClを含む注射用水で1.5%カルボマー溶液で作製したアジュバント;pH7.1で生理学的に緩衝させた希釈液;pH調節のための0.1NのNaOH。
-70℃で保存した活性成分を水浴(37℃)で使用前72時間以内に融解させた。融解後直ちに、それらを+5℃で保存した。攪拌系を備えた滅菌容器に、処方物に対して80%の緩衝生理学的食塩水(pH7.1)を室温で導入した。活性成分を攪拌下で添加した。均質化後に、1NのNaOHを用いてpHを調節しながら、CARBOMER(商標)974Pの15%溶液をゆっくりと添加した。処方中に、pH値を好ましくは6.5から7.3に維持しCARBOMERの最終濃度を4mg/mLにした。CARBOMER(商標)974Pを全て添加したとき、緩衝生理学的食塩水(pH7.1)の残量を攪拌しながら添加して最終体積を完成させた。
必要ならば、水酸化ナトリウム(1N)または塩酸(1N)の添加によりpHを7.1±0.2に調整することができる。前記バルク物質を+2℃を下らない温度で少なくとも2時間攪拌することによって均質化させた。得られたバルク物質を+5℃(±3℃)で充填まで保存した。ワクチンの組成の要旨を表1に示す。
974Pアジュバント添加vCP2377を含む前記3種のワクチンは以下のとおりであった:バッチ87859A011、標的の力価:7.5 Log10 DICC50/mL、バッチ87859A021、標的の力価:7.2 Log10 DICC50/mLおよびバッチ87859A031、標的の力価:6.8 Log10 DICC50/mL。処方前のvCP2377はvCP2377-1-CEPI 7007/17/07/07で、力価は8.3 Log10 DICC50/mLであった。
CARBOPOL(商標)974Pアジュバントが添加された2つの“無関係”組換えカナリアポックスを含むワクチンを陰性コントロールとした用いた(バッチ-76435V191、力価7.34 Log10 DICC50/mL)。
方法:ウイルスタンパク質AHSV-4-VP2およびAHSV-4-VP5の発現は間接免疫蛍光およびウェスタンブロットによって立証し、さらにワクチンの同一性確認のために用いた。試薬には以下が含まれていた:抗AHSV VP5 10AE12(INGENASA, 28037 Madrid)、ブタポリクローナル血清抗VP2血清型4 AHSV(GENOVAC)、抗cMycクローン4A6(マウスモノクローナルIgG1、Upstate, Cat #05-724)、抗マウスIRDye800、抗モルモットIRDye800、抗マウスCy3および抗モルモットCy3。合成AHSV-4-VP2(配列番号:1)およびAHSV-4-VP5(配列番号:2)タンパク質をコードするプラスミドを陽性コントロールとして用いた:pVR1012(挿入物を含まないコントロールプラスミド);pCG050(pVR1012に合成AHSV-4-VP2(配列番号:4)を挿入);pCG042(pVR1012に合成AHSV-4-VP5(配列番号:5)を挿入);およびpCG049(pVR1012に合成AHSV-4-VP2(配列番号:4)+vMyc-タグを挿入)。
間接免疫蛍光のためには、組換えウイルスベクター感染/プラスミドトランスフェクションニワトリ胚線維芽細胞(CEF)を96ウェルプレートに播種した(25000細胞/ウェル)。トランスフェクションの約24時間後(感染後約72時間に匹敵する)に細胞を固定した。続いて細胞を抗VP2および抗VP5一次抗体を用いて標識し、続いてCy3結合二次抗体で標識した。標識細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
ウェスタンブロットのためには、組換えウイルスベクター感染/プラスミドトランスフェクションニワトリ胚線維芽細胞(CEF)を6 cmディッシュに播種した(1.10e6細胞/ディッシュ)。トランスフェクションの約24時間後(感染後約72時間に匹敵する)に細胞を採集した。貫通処理後、採集したサンプルをアクリルアミドトリス-グリシン4−20%ゲルに静置した。泳動後、ゲルをニトロセルロース膜に移し、抗VP2、抗VP5および抗cMyc一次抗体プローブで、その後IRDye800結合二次抗体プローブで調べた。読み取りはOdyssey-LiCorスキャナーを用いて実施した。
結果:図19に示した免疫蛍光の結果によれば、VP5タンパク質は、CARBOPOLアジュバント添加vCP2377の3バッチおよび処方前のvCP2377によってCEF感染細胞で発現した(陰性コントロールとしてvCP EIVを使用)。VP2は、処方前vCP2377およびvCPの3バッチの処方後にモルモットの3血清のプールを用いて正確に検出された。それにもかかわらず、抗VP5モノクローナル抗体と比較してポリクローナル抗体のプールを用いたときに蛍光は弱く、さらにvCP EIV陰性コントロールで少しのノイズが示された。
さらに、試薬の有効性は個々のタンパク質(挿入物を含まないコントロールプラスミド(pVR1012)、pVR1012中の合成AHSV-4-VP2(配列番号:4)(pCG050)、pVR1012中の合成AHSV-4-VP5(配列番号:5)(pCG042)およびpVR1012中の合成AHSV-4-VP2+his-タグ(pCG049)を含む)をコードするプラスミドをトランスフェクトしたCEFを用いて立証した。VP5タンパク質はpCG042プラスミドをトランスフェクトしたCEFでのみ示された。VP2タンパク質は、pCG050およびpCG049プラスミドをトランスフェクトしたCEFで正確に検出された。これらの結果は技術および試薬の有効性を立証した。
図20Aは、感染およびトランスフェクションCEFの溶解物で実施したウェスタンブロットであり、AHSV血清型4のVP2タンパク質の発現を示している。VP2タンパク質は、CARBOPOLアジュバント添加vCP2377の3バッチの各々(9A011、9A021および9A031)および処方前のvCP2377で検出された。プラスミドpCG050(pVR1012中のVP2)およびpCG049(pVR1012中のVP2+c-myc)は陽性コントロールとして用いられ、それらもまたVP2を発現した。pCG049プラスミドをトランスフェクトしたCEFの抗c-mycによる処理はトランスフェクション陽性コントロールとして用いられた。
予想した通り、vCP EIV感染CEFまたはpVR1012およびpCG042トランスフェクトCEFについてシグナルは検出されなかった。さらに、抗VP2ポリクローナル抗体はAHSV血清型4のVP2タンパク質に特異的であった。
図20Bは、感染およびトランスフェクションCEFの溶解物で実施したウェスタンブロットであり、AHSV血清型4のVP5タンパク質の発現を示している。
図20Aは感染およびトランスフェクションCEFの抗VP5ウェスタンブロットの結果を示す。VP5タンパク質は、CARBOPOL(登録商標)974Pアジュバント添加vCP2377の3バッチの各々および処方前のvCP2377で検出された。プラスミドpCG042(pVR1012中のVP5)をトランスフェクトしたCEFもまたVP5を発現した。
予想した通り、vCP EIV感染CEFでも、pVR1012、pCG050およびpCG049トランスフェクションCEFでもシグナルは検出されず、文献(Martinez-Torrecuadrada et al. 1999, Virology 257:449-459)に記載されているように、抗VP5抗体はAHSV血清型4のVP5タンパク質に明確に特異的であることを示した。
IV結論:間接免疫蛍光およびウェスタンブロットによって提供された結果はいずれも、CARBOPOL(商標)974Pアジュバントを添加した3種のvCP2377ワクチンはAHSV血清型4のVP2およびVP5タンパク質を発現することを示している。
A 実験動物
総数6頭の以前にワクチンを接種されていないウマを免疫原性実験に用いた。前記動物を標準的方法で飼養し取り扱った。
B ワクチン未接種動物における免疫原性
候補ワクチンに対するウマの免疫応答を評価するために、以前にワクチンを接種されていない6頭の仔馬を任意に2頭ずつの3グループに分けた。0日目に候補ワクチン(AHSV-CP)のそれぞれ別個の3種のバッチ調製物(バッチ:87859A011、87859A021および87859A031)の1つの3用量を2頭ずつの各群に接種した。それぞれのバッチは、図21に示すようにそれらの標的力価が異なっていた(すなわち7.3、6.96および6.28 Log10CCID50/mL)。各群で、該当用量のうち2用量を頸部の一方の側の筋肉内(IM)に投与し、さらに1用量を頸部の他方の側にIM投与した。0日目に投与したワクチンと同じバッチの1用量を用いて28日目に頸部筋肉内でウマを免疫した。ワクチンの初回用量の接種前に、頸静脈穿刺によって血液サンプルを2x7mLチューブ(SST VACUTAINERチューブ)に採取した。さらにまた、28日目および42日目に、全てのウマから頸静脈穿刺によって血液サンプルを2x7mLのSST VACUTAINERチューブに採取した。
C 解析
最初のワクチン接種の前、最初のワクチン接種期間中、2回目のワクチン接種時、および2回目のワクチン接種期間中に採集した血清サンプルを、アフリカウマ病ウイルスに対するグループ特異的ELISA試験(C Hamblin et al. 1990, Epidemiology and Infection 104:303-312)およびAHS血清型4特異的血清-ウイルス中和試験(PG Howell, 1962)に付した。
結果は図21に示されている。0日目には、全てのウマがAHSV-4に対して検出可能な血清抗体をもたず陰性であった。28日目(初回免疫後4週間)には、最高力価(Log10CCID50/mL 7.3)を含むバッチのワクチンで免疫されたウマの全てが中和力価を生じた。28日目には、中間力価(Log10CCID50/mL 6.96)を含むバッチのワクチンで免疫された2頭のウマの1頭が中和力価を生じた。最後に、最低力価(Log10CCID50/mL 6.28)を含むバッチのワクチンで免疫されたウマはいずれも中和力価を生じなかった。42日目(ブースター用量の投与後2週間)には、6頭のうち5頭が良好な抗体力価を生じた(図21)。最低力価のバッチ(87859A031)のワクチンで免疫された1頭のウマ(#53761)は、アフリカウマ病ウイルスに対する抗体が陰性であった。
9頭のボーアパード(Boerperd)馬(雄5頭、雌4頭)の1年子を南アフリカノザーンケーププロビンス(少なくとも先行する12ヶ月間はAHSが報告されていない地域)から入手した。これらのウマは、間接酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によってAHSV特異抗体をもたないことが確認された(前記ELISAは、AHSV血清グループのウイルスに共通のVP7コアタンパク質に対する抗体を検出する(S Maree and JT Paweska, 2005))。病原媒介動物を防ぐ隔離施設に前記のウマをこれらの実験を通して収容した。各々4頭のウマを含む2つのグループ(雄2頭および雌2頭)にCARBOPOLアジュバントを含むほぼ1mLの希釈液中の107.1または106.4 TCID50/用量のAHSV-CPをそれぞれ筋肉内接種した。動物愛護的理由から、チャレンジ接種物の病毒性の確認にはただ1頭のコントロールのウマを用いた(このウイルス株は、接種したウマで重篤または致死的な症状を引き起こすことが以前に示されたからである:JP Nurton et al. 2001)。コントロールのウマにはウマインフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質を発現する組換えカナリアポックスウイルス(EI-CP;PROTEQFLU(商標)ウマインフルエンザウイルスワクチン;Merial)が接種された(製造業者の指示にしたがって投与)。対応するワクチン構築物を28日後に全てのウマに再接種した。ワクチンのタイプに関係なく動物を一緒に収容した。全ての実験室試験はワクチン接種情報から独立して実施された。
A 方法
ウマのAHSV感染およびサンプル採集
2回目のワクチン接種から28日後に105.5 TCID50のAHSV-4を静脈内接種することによって、9頭全てのウマをチャレンジした。接種後毎日23日間、アフリカウマ病の症状発現についてウマを判定した。チャレンジ感染前並びに感染後2、5、7、9、12、14、16、19、21および23日(DPI)に完全血球算定(CBC)のために、血液をEDTA VACUTAINERTMチューブ(Becton Dickinson)に採集した。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)およびBHK-21細胞でのウイルス単離のために、血液サンプルはまた0日目から23DPIまでEDTA VACUTAINERTMチューブ(Becton Dickinson)に毎日採集した。ワクチン接種直前およびその後は2週間間隔で全てのウマからSST血清セパレーターチューブ(Becton Dickinson)に血清を採集した。
臨床検査室アッセイ
血液学的分析は細胞電子計測装置(Coulter Electronics Inc.)を用いて実施した。
ウイルス検出
ウマ血中のAHSVの存在は、AHSVのVP7およびNS2をコードする個々の遺伝子を検出するqRT-PCRを用いて決定した(M Quan and AJ Guthrie, 2009)。サンプルは、最大40サイクル以内で蛍光が0.1の閾値を越えた場合に陽性に分類した。血液のウイルス単離は、文献(M Quan et al. 2008)に記載されたようにBHK-21細胞で実施した。
血清学的アッセイ
AHSVの血清型特異的中和抗体は、文献(PG Howell et al. 2002)に記載されたように、チャレンジウイルスとしてAHSV-4を用いたマイクロ中和アッセイによって検出した。抗体力価は、BHK-21細胞の少なくとも50%防御を提供する最高の最終血清希釈の逆数として記録した。10を超える力価を有意とみなした。
統計解析
初回ワクチン接種から8週間後およびAHSV感染から6週間後のAHSV-4中和抗体力価をマン-ホイットニーU検定(P>0.05を有意とみなす)によってワクチングループ間で比較した。
B 解析
AHSV-CPの免疫原性
ワクチン接種前には、全てのウマがELISAおよびAHSV-4マイクロ中和アッセイの両方で血清陰性であった。さらに表2で2頭を除く全てが、AHSV-CP組換えベクターによる免疫後AHSV-4に対する中和抗体を生じたが、一方、EIV-CPで免疫したウマはAHSV-4に対する中和抗体を生じなかった(表2)。ワクチン接種後8週間で、AHSV-4力価は、低用量群の力価よりも高ワクチン用量を投与したウマで優位に高かったが(P=0.021)、この違いは感染後6週間では同様には明瞭でなかった(P=0.057)。全てのウマが健康を維持し、さらにワクチン接種後の副作用を示さなかった。
a BHK-21単層細胞の50%を越える防御を提供した最高希釈の逆数として表現
ウマに防御免疫を付与するAHSV-CPの能力を、AHSV-CP(ワクチン接種)およびEIV-CP(コントロール)で免疫したウマのチャレンジ感染後の血中AHSV核酸量(Ct値)を比較することによって判定した(図31、パネルA)。AHSV核酸はコントロールのウマ(EIV-CP)で感染後8日(DPI)から検出されたが、一方、ワクチン接種したウマの血液では全く検出されなかった。同様に、AHSV-4はコントロールのウマの血液からは繰り返し単離されたが、ワクチン接種したウマからは全く検出されなかった。
コントロール(EIV-CP)のウマは、“ディックコップ(dikkop)”またはアフリカウマ病の心臓形状と合致する臨床症状を発したが、一方、ワクチン接種したウマはいずれも実験中ずっと正常を維持した。特に、コントロールのウマは高熱および血小板減少症を発し、この症状は血中のウイルス負荷の上昇と一致した(図31、それぞれパネルBおよびC)。コントロールのウマはまた12DPIに眼窩上窩の著名な浮腫を発し、前記は21DPIまで持続した。
D AHSV-4チャレンジ暴露後のAHSV-CPワクチン接種およびコントロールのウマの血清学的応答
ワクチン接種(AHSV-CP)およびコントロール(EIV-CP)のウマの血清学的応答をAHSV-4チャレンジ感染後にSN(表2)およびELISA(データは示されていない)によって決定した。コントロールのウマは、SNアッセイで決定したときチャレンジ後4週間でAHSVに対して血清転換したが、一方、ワクチン接種ウマはいずれも血清転換を示さなかった。さらにまた、実験期間中ワクチン接種した全てのウマがELISAでVP7に対する抗体について陰性のままであった。ワクチン接種したウマのSNアッセイにおける血清転換の欠如およびELISAによるVP7に対する抗体検出の失敗は、ワクチン接種したウマではウイルス複製が起こらないかまたは極めて低いことを示唆している。同様に、チャレンジ前には血清が陰性であったコントロール(WNV-CP)のウマではチャレンジ感染後のAHSV-4中和抗体は、ワクチン接種ウマで感染から4および6週間後に観察された力価よりも顕著に高かった。
Claims (22)
- 以下のa)およびb)を含む医薬組成物:
a)AHSV VP、AHSV VPの変種またはフラグメント、およびその混合物から成る群から選択される1つまたは2つ以上のポリペプチドをコードする1つまたは2つ以上のポリヌクレオチドを含む発現ベクター;
および
b)医薬的または獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤または賦形剤。 - 発現ベクターがin vivoまたはin vitro発現ベクターである、請求項1に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドがAHSV VP2またはVP5をコードする、請求項1に記載の組成物。
- ベクターが、AHSV VP2およびAHSV VP5をコードする2つのポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドが、配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63に記載の配列を有するポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項1に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドが、配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項1に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドが、配列番号:3、4、5、6、17、18、19、22、27、28、29、32、33、34、41、42、43、48または50に記載の配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項1に記載の組成物。
- ベクターが、vCP2377(配列番号:17)、vCP2383(配列番号:27)、vCP2398(配列番号:41)およびその混合物から成る群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 医薬的または獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤または賦形剤がCARBOPOLである、請求項1に記載の組成物。
- AHSV VP、前記AHSV VPの変種またはフラグメント、およびその混合物から成る群から選択される1つまたは2つ以上のポリペプチドをコードする1つまたは2つ以上のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- ポリヌクレオチドが、
a)配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63に記載の配列を有するポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b)配列番号:1、2、20、21、30、31、35、36、44、45、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62または63に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド;および
c)配列番号:3、4、5、6、17、18、19、22、27、28、29、32、33、34、41、42、43、48または50に記載の配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも70%の配列同一性を有するポリヌクレオチドから成る群から選択され、
ベクターがin vivo発現ベクターまたはin vitro発現ベクターである、請求項10に記載のベクター。 - ベクターがウイルスベクターであり、前記ウイルスベクターがアビポックス、カナリアポックスまたは鶏痘ベクターである、請求項11に記載のベクター。
- ベクターが2つのポリヌクレオチドを含み、前記2つのポリヌクレオチドが、配列番号:4、42および18から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するAHSV VP2、並びに配列番号:5、43および19から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するAHSV VP5をコードする、請求項12に記載のベクター。
- ポリヌクレオチドが、H6ワクシニアプロモーター、13Lワクシニアプロモーター、42Kポックスウイルスプロモーター、7.5KワクシニアプロモーターおよびPiワクシニアプロモーターから成る群から選択されるプロモーターに作動できるように連結されている、請求項13に記載のベクター。
- AHSV VP2をコードするポリヌクレオチドがH6ワクシニアプロモーターに作動できるように連結され、さらにAHSV VP5をコードするポリヌクレオチドが42Kポックスウイルスプロモーターに作動できるように連結される、請求項14に記載のベクター。
- 請求項10に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項1に記載の組成物の有効量を宿主に投与する工程を含む、動物において免疫学的応答を誘発する方法。
- 請求項1に記載の組成物を少なくとも1回投与する工程を含む、アフリカウマ病感受性動物にワクチン接種する方法。
- 請求項1に記載の組成物を少なくとも2回投与する工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが
a)配列番号:48または50に記載の配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
b)配列番号:49または51に記載の配列を有するポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;または
c)配列番号:49または51に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド。 - 実質的に精製されたAHSV VPであって、
a)配列番号:49または51に記載の配列を有するポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列;
b)配列番号:49または51に記載のアミノ酸配列の保存的変種;
c)配列番号:49または51に記載のアミノ酸配列と特異的に結合する抗体と特異的に結合する、配列番号:49または51に記載のアミノ酸配列の少なくとも8つの保存アミノ酸を含む免疫原性フラグメント;または
d)配列番号:49または51に記載のアミノ酸配列を有し、
さらに前記ポリペプチドの対象動物への投与がAHSVに対する免疫応答を生じる、前記精製AHSV VP。 - 単離されたアフリカウマ病ウイルスAHSV4-Jane株。
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