CN116041447A - 一种检测非洲马瘟病毒的试剂盒及其应用 - Google Patents
一种检测非洲马瘟病毒的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种检测非洲马瘟病毒的试剂盒及其应用。本发明基于非洲马瘟病毒VP7蛋白的结构特点以及大肠杆菌的密码子偏好对非洲马瘟病毒的氨基酸序列以及核苷酸进行了优化，在一定程度上提高了非洲马瘟病毒VP7蛋白通过大肠杆菌途径表达的表达水平，以及表达后得到的非洲马瘟病毒VP7重组蛋白的特异性和敏感性。优化后的非洲马瘟病毒VP7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将其作为发光抗原制备得到的试剂盒在检测非洲马瘟病毒时具有较高的特异性和灵敏度，在检测非洲马瘟病毒的领域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种检测非洲马瘟病毒的试剂盒及其应用。
背景技术
非洲马瘟病毒引起的非洲马瘟是马属动物的一种急性或亚急性虫媒传染病，呈地方性和季节性流行，以发热、皮下结缔组织和肺水肿以及内脏出血为特征。
非洲马瘟病毒属呼肠孤病毒科环状病毒属，现已知有9个血清型，各型之间没有交互免疫关系，不同型病毒的毒力强弱也不相同。环状病毒属不同血清群可根据主要的群特异性抗原VP7的抗原性来鉴别。该病毒无囊膜，直径约75nm，有两层20面体对称的衣壳，由32个壳粒组成。基因组由10个大小不等的双链RNA片段构成，3个大的为L1～L3，3个中等的为M4～M6，4个小的为S7～S10，编码10个蛋白(VP1～VP7和NS1，NS2，NS3/NS3A)。内衣壳由2个主要蛋白VP3和VP7以及3个次要蛋白VP1、VP4和VP6构成，外衣壳由2个蛋白VP2和VP5构成，其中VP7蛋白为主要的内衣壳蛋白，在9个血清型的病毒中高度保守，是病毒主要的群特异性抗原。目前检测非洲马瘟抗体的主要包括为中和试验，补体结合反应、琼脂凝胶免疫扩散反应、免疫荧光试验和普通ELISA方法。
病毒中和试验费时费力，且需要参考毒株、型特异性血清和细胞培养等才能完成，补体结合试验则广泛应用于检测非洲马瘟病毒群特异性抗体，是OIE推荐的检测方法之一，但也由于费时费力，加之某些血清的抗体补体效应也少有人用了，取而代之的是ELISA方法，ELISA方法具有操作试验操作简便、检测速度快的优点，目前市场上有检测抗体类型的商品化普通ELISA试剂盒，但这些普通ELISA方法常常不能满足临床检测的需求，商品化的普通ELISA试剂盒敏感性低，使这些低浓度的特异性蛋白很难被检测到，导致部分感染动物漏检，很容易出现假阴性。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种检测非洲马瘟病毒的试剂盒及其应用。
第一方面，本发明提供一种非洲马瘟病毒的重组蛋白，包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
进一步地，所述重组蛋白由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码得到。
本发明进一步提供一种核酸，所述核酸用于编码所述重组蛋白。
本发明进一步提供一种生物材料，所述生物材料包括所述的核酸；所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
进一步地，所述载体为原核载体pET-32a。
进一步地，所述转基因细胞为大肠杆菌BL21细胞。
第二方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述重组蛋白，或所述核酸，或所述生物材料。
进一步地，所述试剂盒为化学发光检测试剂盒；所述试剂盒以所述重组蛋白为发光抗原。
进一步地，包括：
化学发光抗原包被板、酶标抗体、血清稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液。
所述化学发光抗原包被板由如下方法制备得到：
将1～1.5ug/mL的重组VP7蛋白以95～105uL/孔的加样量进行包被，在2～8℃条件下孵育16～18小时。
本发明进一步提供所述重组蛋白，或所述核酸在提高检测非洲马瘟病毒的特异性中的应用。
本发明进一步提供所述重组蛋白，或所述核酸，或所述生物材料，或所述试剂盒在检测非洲马瘟病毒中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明基于非洲马瘟病毒VP7蛋白的结构特点(抗原表位以及分布的情况)以及大肠杆菌的密码子偏好对非洲马瘟病毒的氨基酸序列以及核苷酸进行了优化，在一定程度上提高了非洲马瘟病毒VP7蛋白通过大肠杆菌途径表达的表达水平，以及表达后得到的非洲马瘟病毒VP7重组蛋白的特异性和敏感性。
本发明提供的检测非洲马瘟病毒的微孔板式化学发光检测试剂盒，敏感性、特异性、稳定性好，特别是在低浓度样本的检测以及疫病的早期诊断发挥重要作用，避免检测非洲马瘟病毒时出现假阴性而导致非洲马瘟病毒的隐形传播，从而对非洲马瘟病毒的防控带来严重的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的诱导的PET-32a-VP7表达产物纯化后的SDS-PAGE分析结果；其中1为Marker，2为诱导的PET-32a，3为诱导的PET-32a-VP7。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种检测非洲马瘟病毒的试剂盒，包括：化学发光抗原包被板、酶标抗体、血清稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液。
1、化学发光抗原包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板；
包被过程为：将重组VP7蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到化学发光板中，4℃孵育16h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA-PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，4℃保存；
重组VP7蛋白获得方式为：依据非洲马瘟病毒VP7蛋白的结构特点以及大肠杆菌的密码子偏好对非洲马瘟病毒的氨基酸序列以及核苷酸进行了优化，得到的重组VP7蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将重组VP7蛋白的核苷酸序列插入到原核载体pET-32a中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行培养，接种后将培养基置37℃摇床振荡培养至OD600nm达到0.6，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，18℃180r/min过夜诱导16h；洗脱缓冲液组分分别为Binding Buffer：20MM Tris-HCl、5MM Imidazole、500MMNaCl；Washing Buffer为20MM Tris-HCl、35MM Imidazole、500MM NaCl；Elution Buffer：20MM Tris-HCl、400MM Imidazole、500MM NaCl；使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂柱子进行洗脱纯化，将纯化后的蛋白液加入提前处理好的纤维素透析袋，夹紧透析袋两端，放入PBS缓冲液(pH＝7.9)中，4℃低速搅拌条件下进行透析。间隔6h换液一次，共透析6次。将透析后的蛋白液用20mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、pH7.9的缓冲液再次透析，得到10倍浓缩的纯化蛋白。最终得到高浓度、高纯度、活性和稳定性较好的重组VP7蛋白(诱导的PET-32a-VP7表达产物纯化后的SDS-PAGE分析结果如图1所示)。
2、血清稀释液为含5％(v/v)酪蛋白和0.5％(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
3、发光底物A为含有0.1mmol/L的鲁米诺和质量体积分数为0.1％的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液。
4、发光底物B为含有0.07mmol/L的维生素C和3mmol/L氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/L、pH＝5.2的醋酸铵溶液。
5、10倍浓缩洗涤液为0.02mol/L的磷酸二氢钠、0.08mol/L的磷酸氢二钠、1.37mol/L的氯化钠和0.5％(v/v)Tween-20，pH＝7.4。
上述检测非洲马瘟病毒的试剂盒的检测方法如下：
将待检测血清用血清稀释液1：50倍稀释，取100uL加入到化学发光抗原包被板中，设置阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将化学发光抗原包被板于37℃反应30min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA-PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的兔抗马IgG抗体，37℃孵育30min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15-25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。
实施例2
本实施例用于确认实施例1所提供的检测非洲马瘟病毒的试剂盒的临界值，方法如下：
利用试剂盒对100份阳性样品和150份阴性样品(均是已知背景的血清样品)进行检测，计算每份样品的S/P值，采用SPSS 16.0软件对所有血清样本的S/P值进行分析。使用非参数法构建ROC曲线，并以Youden指数最大的切点作为阴阳性判断的临界点。同时确定该试剂盒的敏感性和特异性。最终将本试剂盒的判定标准定为：S/P值＜0.35，样品判定为抗体阴性；S/P值≥0.35，样品判定为抗体阳性。在此判定标准下，临界值对应的抗体检测敏感性为93.25％，特异性为94.96％。证明本诊断方法的准确率高，该试剂盒具有很高的诊断价值。
实施例3
本实施例用于确认实施例1所提供的检测非洲马瘟病毒的试剂盒的灵敏度和特异性，具体流程如下：
将非洲马瘟病毒阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将马鼻疽、马腺疫、马传染性贫血、马流感样品按1：50倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测，非洲马瘟病毒阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。
检测结果用S/P值来评价，S/P公式如下：S/P＝(检测样品发光值-阴性对照血清样品发光值)/(阳性对照血清样品发光值-阴性对照血清样品发光值)。
结果显示本发明提供的非洲马瘟病毒抗体微孔板式化学发光检测试剂盒具有良好的敏感性，检测非洲马瘟病毒VP7的灵敏度均能达到1:1024。此外本发明的非洲马瘟病毒抗体微孔板式化学发光检测试剂盒具有良好的特异性，与上述马鼻疽、马腺疫、马传染性贫血症、马流感阳性血清样品均无交叉反应。因此，本发明的化学发光试剂盒灵敏度高，特异性强，不会与其它马常见病毒发生血清交叉学反应。具体结果如下表所示。
表1试剂盒的特异性和敏感性检测结果
实施例4
本实施例用于确定实施例1所提供的检测非洲马瘟病毒的试剂盒的重复性，具体流程如下：
将5个背景清楚的血清在同一个化学发光抗原包被板上各做5个重复，计算其批内变异系数(CV)。同时将这5个背景清楚的血清在不同的3个批次化学发光抗原包被板上做重复，计算其批间变异系数(CV)。结果批内与批间CV均小于10％，具有良好的重复性。具体结果如下表所示。
表2试剂盒的重复性结果
实施例5
本实施例用于确定实施例1所提供的检测非洲马瘟病毒的试剂盒的稳定性，具体流程如下：
将化学发光包被板置于37℃，10天后，检测敏感性和特异性，将非洲马瘟病毒阳性血清用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，稀释好的样品直接进行检测。将马鼻疽、马腺疫、马传染性贫血症、马流感阳性血清样品按1：50倍进行稀释，稀释好的样品直接进行检测，设置非洲马瘟病毒阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。结果表明，37℃保存10天，化学发光包被板的敏感性和特异性不变。因此，化学发光包被板具有良好的稳定性。
实施例6
本实施例对比了多组试剂盒对已知非洲马瘟病毒抗体阳性样本的检测结果，具体如下：
实验组：实施例1提供的检测检测非洲马瘟病毒的试剂盒。
对照组1：市售非洲马瘟病毒抗体ELISA试剂盒。
对照组2：采用和实施例1相同的方法制备得到的检测试剂盒，区别在于发光抗原采用常规VP7蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
具体地，采用以上各组试剂盒检测收集的21份已知抗体阳性样本，结果如下表所示，化学发光试剂盒对阳性样本的检出率高于普通抗体ELISA试剂盒。
表3不同试剂盒阳性样本检测的对比结果
实施例7
本实施例对比了多组试剂盒对已知非洲马瘟病毒抗体阳性血清的敏感性检测结果，具体如下：
实验组：实施例1提供的检测非洲马瘟病毒的试剂盒。
对照组1：市售非洲马瘟病毒抗体ELISA试剂盒。
对照组2：采用和实施例1相同的方法制备得到的检测试剂盒，区别在于发光抗原采用常规VP7蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
具体将非洲马瘟病毒阳性血清分别用血清稀释液进行倍比稀释，梯度分别为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048。分别用如上各组的试剂盒检测各个稀释度的样本。结果如下表所示。
表4不同试剂盒的敏感性对比结果
结果显示本发明实施例1提供的化学发光试剂盒检测非洲马瘟病毒阳性血清的敏感性均能达到1:1024，普通非洲马瘟病毒抗体试剂盒检测非洲马瘟病毒阳性血清的敏感性能达到1:512。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种非洲马瘟病毒的重组蛋白，其特征在于，包括如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码得到。
3.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码如权利要求1所述的重组蛋白。
4.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求3所述的核酸；所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述载体为原核载体pET-32a；和/或，所述转基因细胞为大肠杆菌BL21细胞。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的重组蛋白、或权利要求3所述的核酸，或权利要求4或5所述的生物材料。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为化学发光检测试剂盒；所述试剂盒以权利要求1或2所述的重组蛋白为化学发光抗原。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括：
化学发光抗原包被板、酶标抗体、血清稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液。
9.权利要求1或2所述的重组蛋白，或权利要求3所述的核酸在提高检测非洲马瘟病毒的特异性和敏感性中的应用。
10.权利要求1或2所述的重组蛋白，或权利要求3所述的核酸，或权利要求4或5所述的生物材料，或权利要求6-8任一项所述的试剂盒在检测非洲马瘟病毒中的应用。
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