CN101392250A - 一种非洲马瘟检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非洲马瘟检测试剂盒和检测方法，尤指采用ELISA方法检测非洲马瘟病毒抗体的抗原制备、纯化，检测试剂盒和方法，属于动物检验检疫领域。人工拼接一段含有非洲马瘟病毒VP7蛋白大多数线性表位的核酸片段，为序列表SEQ IDNo.29所示的核苷酸序列。本发明的优点是：1)简便快速：可快速的对马科动物的非洲马瘟病毒抗体作出评价。2)适用范围广：可检测9个型非洲马瘟病毒诱导的抗体，不仅可用于感染动物的检测，还可用于免疫动物的抗体评价。3)特异：与同属的蓝舌病病毒阳性血清不发生交叉反应。4)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好。5)安全：不接触病毒，不具有生物安全问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种非洲马瘟检测试剂盒和检测方法，尤指采用ELISA方法检测非洲马瘟病毒抗体的抗原制备、纯化，检测试剂盒和方法，不仅适用于感染后对马科动物血清中的非洲马瘟病毒抗体进行检测，也适用于非洲马瘟病毒疫苗免疫后的抗体评价，属于动物检验检疫领域。
背景技术
非洲马瘟(African horse sickness，AHS)是马科动物的一种由节肢动物传播的非接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重大传染病，我国也将其列为一类重大动物疫病。病原为非洲马瘟病毒(AHSV)，该病原属于呼肠孤病毒科环状病毒属(Orbivirusgenus，Reoviridae)。环状病毒属不同的血清群可根据主要的群特异性抗原VP7的抗原性来鉴别。对于易感马群，感染本病后致死率可达95％。以呼吸系统和循环系统的病理变化为特征；骡的易感性稍差，而驴感染后很少发生死亡。斑马感染后通常不出现症状，可成为自然贮存宿主携带和传播病原。病原的传播媒介为Cullicoides species。本病在非洲的撒哈拉地区呈地方流行，呈季节性发生，但历史上本病在摩洛哥(1992)，中东(1960)和欧洲(1992)的暴发给马业造成了巨大的经济损失。由于本病的巨大破坏性，在国际上进行马的运输过程中，尤其是在无AHS的地区，应执行严格的兽医卫生措施。南非在控制AHS时，主要采用给易感动物接种多价活疫苗的免疫措施，并定期进行检测。
目前已发现非洲马瘟病毒具有9个血清型。与环状病毒的原型病毒——蓝舌病(BTV)相似，非洲马瘟病毒没有囊膜，具有3层呈二十面体对称的衣壳。病毒基因组包含10个dsRNA片段，编码10种蛋白，其中的7种为结构蛋白和4种非结构蛋白。病毒粒子的外衣壳由VP2和VP5组成，内衣壳由VP3和VP7组成，其中VP7为主要的内衣壳蛋白，在9个血清型的病毒中最为保守，为群特异性抗原蛋白。
对AHSV感染马匹和免疫接种马匹进行快速的实验室评价对决定是否对马匹进行运输极为重要。病毒分离鉴定是对本病进行准确诊断的传统方法，但病毒分离鉴定费时费力，且需要一定的工作经验。传统的血清学诊断方法包括琼脂扩散试验(AGID)，补体结合试验(CF)以及病毒中和试验(VN)。但VN相当繁琐，而且需要有标准的参考毒株，特定型的血清，因此目前很少采用该方法，只有较少的国际参考实验室采用此方法。目前广泛采用CF检测AHS群特异性抗体，而且该方法也是(OfficeInternational des Epizooties，OIE)推荐的在国际贸易中使用的方法，但改方法同样需要标准化的抗原和血清，而且方法相对繁琐，不适于大批量血清的筛查。而检测群特异性抗体的ELISA方法和快速的核酸检测方法有望解决这些问题。
目前已有一些研究致力于建立可检测AHSV和其抗体的ELISA方法，大多数用于检测AHSV抗原的ELISA方法使用哺乳动物的多抗，单抗或禽源抗体。而抗体检测方法主要采用纯化病毒制备抗原的方法。同重组抗原方法相比，纯化等量的全病毒或病毒亚单位相对更为耗时和昂贵。VP7抗原稳定而且不具有感染性，适合于作为ELISA检测的抗原。Sonja Mareea等于2005采用昆虫细胞表达的VP7蛋白建立了ELISA检测方法，但目前尚未有采用原核表达的重组蛋白建立ELISA检测方法。
目前已报道的采用可溶性或重组抗原建立的ELISA方法尚有一些缺点：抗原制备费时且昂贵；抗原的特异性评价不充分等。
为进一步建立能满足国际贸易需求的标准化检测试剂，我们开展了本研究。本研究利用IPTG对含有VP7蛋白抗原域的原核表达载体pET-30a-VP7进行诱导表达，结果得到了目的融合蛋白，经包涵体的洗涤、溶解和复性，获得较高纯度的目的蛋白，同时，通过方阵滴定初步建立了检测AHSV抗体的间接ELISA方法，并对临床样品进行了检测，为试剂盒的标准化和商品化奠定基础。
本发明首次采用原核表达的重组蛋白应用于非洲马瘟病毒抗体的检测，制备纯化了重组蛋白，建立了间接ELISA检测方法，研制出了检测试剂盒。
发明内容
本发明的要解决的第一个技术问题是人工拼接一段含有非洲马瘟病毒VP7蛋白大多数线性表位的核酸片段，并实现其高效表达。
本发明要解决的另一个技术问题是将表达的重组蛋白纯化，作为包被抗原，建立重组间接ELISA方法。
本发明要解决的第三个技术问题是研制出重组间接ELISA检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
人工拼接一段含有非洲马瘟病毒VP7蛋白大多数线性表位的核酸片段，为序列表SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。
1)AHSV VP7编码基因的序列分析
本发明选择非洲马瘟病毒VP7基因编码区作为靶区域，采用在线软件NetNGlyc1.0Server，查询AHSV VP7编码基因中相对于大肠杆菌的稀有密码子，将查询得到的稀有密码子改为大肠杆菌所偏好的密码子，以利于基因的原核表达。
2)AHSV VP7编码基因拼接合成
根据已发表的AHSV VP7编码基因序列，合成25条长度为50nt的引物，相邻的正向和反向引物存在10bp的重叠，采用双不对称PCR(Dual asymmetrical PCR，DA-PCR)和重叠PCR(Overlap extension PCR，OE-PCR)进行序列的拼接，引物序列见表1。
表1 用于VP7基因拼接的引物
| 引物名称 | 序列 |
| F1 | 5′-att aga tct gac aga tgc gcg tgt tag ctt gga tcc agg agt gat gga ga-3′ |
| F2 | 5′-gtt taa cga atc att cgg tat cga tgc gtc cac aaa ccc aag cag aac gt-3′ |
| F3 | 5′-gtt tta gcg gca ttg aac gtc caa att ggg aat att tca cca gat tat ga-3′ |
| F4 | 5′-aac gac tga aat tcc ata taa tgt tca ggc cat gaa tga cat cgt tcg ta-3′ |
| F5 | 5′-gca aag tac aga cgg gac ctt atg cag gag cag ttg agg tgc aac aat ct-3′ |
| F6 | 5′-cgt ggt ggg tac att aat tca aat att gct gaa gtg tgt atg gat gca gg-3′ |
| F7 | 5′-ccc acg tcg tgg gga cgc agt cat gat cta ttt tgt ttg gcg tcc att gc-3′ |
| F8 | 5′-ttg aaa gcg ctc cag ggg ctc cag gga ctt ttg tca ccg ttg atg gag ta-3′ |
| F9 | 5′-aat acc att gca cca gtg aat gtt gga aat cct ggg gca cgc cgt tca at-3′ |
| F10 | 5′-ttt gga tcg ttc gct gga cac ggt tcc gga att ggc tcc aac gct cac ac-3′ |
| F11 | 5′-acg cat tac gcg ctg tca ttt ttc agc aga tga ata tgc agc cta tta at-3′ |
| F12 | 5′-gaa att gtt gcg tat ctg tta tta gta gct tct tta gct gat gtg tat gc-3′ |
| R1 | 5′-ctt gtc gac tta att cat acg gaa atc tgg acg caa agc cgc ata cac at-3′ |
| R2 | 5′-caa caa ttt cat tac gtt cag tcg gtg gaa aaa ttg gcg gat taa tag gc-3′ |
| R3 | 5′-cgt aat gcg tgc caa gtc gga gaa aca tac gca taa caa cgt gtg agc gt-3′ |
| R4 | 5′-acg atc caa aga cgt ata cca taa cac ttc aaa ctg taa aat tga acg gc-3′ |
| R5 | 5′-caa tgg tat tcc atg cga cga cat ctc cag ccg caa cat tta ctc cat ca-3′ |
| R6 | 5′-gcg ctt tca agt gac gca cct tga gga tca caa aag ata cgc aat gga cg-3′ |
| R7 | 5′-acg acg tgg ggc cag cag cgc att gac ctg tcc cgc agc gcc tgc atc ca-3′ |
| R8 | 5′-acc cac cac gtg tac gac ctt gcg gta cgt aat aac ggc cag att gtt gc-3′ |
| R9 | 5′-tgt act ttg ctt ggt ccg aat gtt tgc att tga ccc gtg ata cga acg at-3′ |
| R10 | 5′-ttc agt cgt tgc aag agc tcc cac agt tgc caa cgc ctg atc ata atc tg-3′ |
| R11 | 5′-ccg cta aaa cca tat cag tac aca taa aaa aca ttt cat tac gtt ctg ct-3′ |
| R12 | 5′-ttc gtt aaa cca ttg taa cga tta att gca atc cct aac gtc tcc atc ac-3′ |
采用三步法拼接目的片段。第一步为DA-PCR，在此骤中，每4条连续的引物混合用于合成12个分别为150bp的片段，4条引物分为2条外引物和2条内引物。外引物摩尔数是内引物摩尔数的5倍，这样可以充分消耗内引物，生成的主产物为最长的150bp的片段。在第二步中，将这些获得的12个片段混合后，经酚氯仿抽提后，用乙醇进行沉淀，由于DA-PCR产物长于寡核苷酸引物，因此纯化后的产物中DA-PCR产物比例显著高于寡核苷酸引物，这样在进行OE-PCR时可有效合成全长的目的片段，然后在第三步进行常规PCR时，就可扩增出全长的目的片段。
将经预测后含所有抗原位点的VP7基因片段分解成25个寡核苷酸片段，每个引物长50nt，相邻片段的5’端和3’端存在10nt的重叠，引物序列见表1，反应体系如下：
灭菌水 31.0μl
10×Pfu缓冲液(含Mg2+) 5.0μl
dNTPs(2.0Mm) 5.0μl
外正向引物(5μM) 2.0μl
外反向引物(5μM) 2.0μl
内正向引物(5μM) 0.4μl
内反向引物(5μM) 0.4μl
Pfu酶(5U/μl) 1.0μl
反应参数为：94℃/20s，45℃/15s，72℃/30s；共20个循环。反应结束后，取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下进行观察。
将上述DA-PCR各管中的扩增产物各5.0μl混合于一个管中，加入灭菌水至总体积300μl，然后用等体积的酚—氯仿—异戊醇(体积比为25:24:1)进行抽提，12000g离心5min，吸取上清加入900μl无水乙醇，于—20℃沉淀30min，然后12000g离心15min，吸弃上清后，于室温干燥10min，然后配成下述反应体系：
灭菌水 79.0μl
10×Pfu缓冲液(含Mg2+) 10.0μl
dNTPs(2.0Mm) 10.0μl
Pfu酶(5U/μl) 1.0μl
反应参数为：94℃/30s，68℃/2min；15个循环。
将上述产物作为模板，用2个最外侧引物进一步扩增全长目的片段，反应体系如下：
灭菌水 28.0μl
10×Pfu缓冲液(含Mg2+) 5.0μl
dNTPs(2.0Mm) 5.0μl
最外正向引物F1(5μM) 5.0μl
最外反向引物R1(5μM) 5.0μl
模板 1.0μl
Pfu酶(5U/μl) 1.0μl
反应参数为：94℃/20s，55℃/20s，72℃/90s；共30个循环。反应结束后，取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下进行观察。
3)AHSV VP7编码基因克隆和序列分析
将扩增得到的目的片段用DNA片段纯化试剂盒进行纯化后，分别用限制性内切酶SalI和BglII对扩增产物和pET—30a进行双酶切，酶切体系如下：
灭菌水 10.0μl
10×H缓冲液 3.0μl
PET—30a 15.0μl
Sal I 1.0μl
Bgl II 1.0μl
然后用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基中，于37℃条件下过夜培养。第2天挑取菌落于LB中37℃培养8h，然后吸取菌液分别用F1，R1；以及F3，R3引物进行扩增，反应体系同2.6.3。将鉴定为阳性的菌落送TaKaRa公司进行序列测定。将测得的序列与预计合成的序列片段进行比较。
4)AHSV VP7编码基因的改造和定点突变
根据拼接获得的AHSV VP7编码基因序列，合成以下4条引物(见表2)，采用3次PCR以突变序列中的插入突变。
表2 用于VP7基因序列突变的4条引物序列
| 引物名称 | 序列 |
| AHV-DF1 | 5′-GAC AGA TCT GCC ATA TAA TGT TCA GGC CAT GA-3′ |
| AHV-DMR1 | 5′-CGC AAC ATT TAC TCC ATC AAC GGT GAC AAA AG-3′ |
| AHV-DMF1 | 5′-GCG CTC CAG GGG CTC CAG GGA CTT TTG TCA CC-3′ |
| AHV-DR1 | 5′-CTG GTC GAC TTA GAC AGC GCG TAA TGC GTG CC-3′ |
第1次和第2次PCR分别用AHV-DF1和AHV-DMR1；AHV-DMF1和AHV-DR1扩增相互交叠的两个片段，反应体系如下：
灭菌水 28.0μl
10×Pfu缓冲液(含Mg2+) 5.0μl
dNTPs(2.0Mm) 5.0μl
AHV-DF1或AHV-DMF1(5μM)5.0μl
AHV-DMR1或AHV-DR1(5μM)5.0μl
模板 1.0μl
Pfu酶(5U/μl) 1.0μl
反应参数为：94℃/20s，55℃/20s，72℃/60s；共30个循环。反应结束后，取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下进行观察。将目的片段分别用琼脂糖凝胶进行回收，将两种片段的产物等体积混合，用引物AHV-DF1和AHV-DR1进行扩增，反应参数同上。反应结束后，取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下进行观察。将获得的目的片段和载体分别用克隆用限制性内切酶SalI和BglII酶切后，克隆于pET—30a，进行序列分析，将测得的序列与预计合成的序列片段进行比较。
下面为经过拼接获得的基因序列：
1 ATGCACCATC ATCATCATCA TTCTTCTGGT CTGGTGCCAC GCGGTTCTGG TATGAAAGAA
61 ACCGCTGCTG CTAAATTCGA ACGCCAGCAC ATGGACAGCC CAGATCTGCC ATATAATGTT
121 CAGGCCATGA ATGACATCGT TCGTATCACG GGTCAAATGC AAACATTCGG ACCAAGCAAA
181 GTACAGACGG GACCTTATGC AGGAGCAATT GAGGTGCAAC AATCTGGCCG TTATTACGTA
241 CCGCAAGGTC GTACACGTGG TGGGTACATT AATTCAAATA TTGCTGAAGT GTGTATGGAT
301 GCAGGCGCTG CGGGACAGGT CAATGCGCTG CTGGCCCCAC GTCGTGGGGA CGCAGTCATG
361 ATCTATTTTG TTTGGCGTCC ATTGCGTATC TTTTGTGATC CTCAAGGTGC GTCACTTGAA
421 AGCGCTCCAG GGGCTCCAGG GACTTTTGTC ACCGTTGATG GAGTAAATGT TGCGGCTGGA
481 GATGTCGTCG CAT GGAATAC CAT TGCACCA GTGAAT GT TG GAAATCCTGG GGCACGCCGT
541 TCAATTTTAC AGTTTGAAGT GTTATGGTAT ACGTCTTTGG ATCGTTCGCT GGACACGGTT
601 CCGGAATTGG CTCCAACGCT CACACGTTGT TATGCGTATG TTTCTCCGAC TTGGCACGCA
661 TTACGCGCTG TCTAA
5)重组AHSV VP7的诱导表达和纯化
将测序正确的重组质粒Pet-30a-AHSV VP7转化大肠杆菌BL21宿主菌后，挑取单菌落接种于3.0mL LB培养基中，活化过夜后，按1:100接种于100mL培养基中，37℃，250rpm振摇培养至对数生长期(OD600＝0.6左右)，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，分别在诱导前，诱导后1h，2h，3h，取菌液1.0mL，5000rpm离心10min，收集菌体，加入2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，用12％ SDS-PAGE胶检查。
取诱导表达菌100mL，5000rpm离心10min，收集菌体，用BugBuster ProteinExtraction Reagent(Novagen产品)洗涤菌块后，用包涵体溶解液(50mM Tris-Cl，100mM NaCl，1mM EDTA，0.5％ TritonX-100，8M尿素，pH9.0)溶解沉淀，冰上作用1—2h，其间不断振荡。
4℃12000g离心15min，收集上清和菌体裂解后的上清，加入2×SDS上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳，检查溶解包涵体后上清以及菌体裂解后上清中的蛋白。
将溶解的上清装入已经处理好的透析袋中，置于复性缓冲液中(1×PBS，1mMEDTA，尿素，pH8.0)在4℃条件下进行梯度透析，复性缓冲液中尿素浓度依次递减(尿素浓度分别为4.5M，3.5M，2.5M，1.5M，0.5M，0M)，换液间隔时间10～12h。
将透析后的蛋白溶液上清于4℃ 12000g离心15min，收集上清，过滤除菌后，小份分装，保存于—80℃。
将纯化的蛋白作1:100稀释后，用分光光度计分别测定260nm和280nm的吸光度值，按下式计算蛋白浓度：
蛋白质浓度＝(mg/ml)＝(1.45×A280—0.74×A260)×稀释倍数
6)重组蛋白的抗原性鉴定
将NC膜用蒸馏水浸泡后晾干，分别用2μL 87.4μg/mL的纯化蛋白滴加于上膜上，晾干，将NC膜置于含1％卵清蛋白的PBST封闭液中，室温轻摇3～5h后4℃封闭过夜。弃去封闭液，用PBST浸泡洗涤3遍，加入1:10的阳性血清中，室温下震荡1.5h。用PBST浸泡洗涤3遍，加入1:500稀释的HRP酶标蛋白G溶液中，室温振荡1h，用PBST浸泡洗涤3遍，置于底物中显色，至斑点清晰后，用蒸馏水终止显色。
用浓度分别为43.7μg/mL，21.9μg/mL，10.9μg/mL，5.45μg/mL，2.73μg/mL，1.36μg/mL，0.68μg/mL以及0.34μg/mL的蛋白包被酶标板，100μL/孔，包被条件为4℃条件下过夜，之后用含1％卵清蛋白的PBST封闭液37℃封闭2h，用用PBST洗涤3遍，拍干后，于4℃条件下备用。
分别用阳性血清和阴性血清作1:20稀释后，加100μL于板上，37℃作用1h，用PBST洗涤3遍，拍干后，加入1:2000稀释的HRP酶标蛋白G溶液100μL，37℃作用1h，用PBST洗涤3遍，加入ABT底物溶液100μL，室温避光作用15min，用100μL2M H2SO4终止反应，用405nm滤光片读取OD值。
7)重组ELISA方法的建立
用包被液将提纯得到的重组蛋白抗原分别作200倍(43.7μg/mL)，400倍(21.9μg/mL)，800倍(10.9μg/mL)，1600倍(5.45μg/mL)，3200倍(2.73μg/mL)，6400倍(1.36μg/mL)，12800倍(0.68μg/mL)，25600(0.34μg/mL)倍以及51200(0.17μg/mL)倍9个倍比稀释度，包被酶标反应板，包被条件为4℃条件下过夜，用血清稀释液将阳性血清及阴性血清作1:20，1:40，1:80，1:160倍比稀释，进行方针滴定，作ELISA测定，方法同上，从而确定抗原最适包被浓度和血清稀释度。
以最适浓度抗原包被酶标板，100μL/孔，分成2组：第1组：为37℃1h，然后于4℃条件下过夜；第2组，仅为4℃条件下过夜。作ELISA测定，方法同上，从而确定最佳包被条件。
由于我们采用的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的重组蛋白G，因此我们使用了两种适用于此酶标抗体的封闭液，比较封闭效果。一种为含1％明胶的PBST封闭液，另一种为含有1％卵清蛋白的PBST封闭液。100μL/孔，37℃封闭2h，对最适稀释的阴阳性血清作ELISA测定，方法同上，从而确定合适的封闭液。
随机取30份进口马血清，经非洲马瘟阻断ELISA试剂盒检测为非洲马瘟抗体阴性，作1:40稀释，用已经建立的间接ELISA方法检测，每份血清重复2孔，读取OD值，计算出血清的OD值平均值，和标准差(SD)，阴阳性临界值等于阴性血清OD平均值X+3×SD，从而算出阴阳性临界值。根据统计学原理，可以在99.9％的置信水平上判定为阳性。
以最适浓度抗原包被酶标板，对收集到的马传染性贫血病毒阳性血清，马鼻肺炎病毒阳性血清以及蓝舌病病毒阳性血清作1:40稀释，作ELISA测定，方法同上，从而验证方法的特异性。
用建立的间接ELISA方法检测2000年以来进口马血清184份，并与西班牙INGENASA公司生产的非洲马瘟阻断ELISA试剂盒进行比较。
一种检测血清中非洲马瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，由以下组分组成：
1)包被有非洲马瘟病毒抗原的重组酶标反应板：将纯化的重组蛋白用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释为0.20μg/mL，100μL/孔加入酶标反应板，包被条件为37℃1h，然后于4℃条件下过夜；弃去孔内液体，然后用洗涤液(PBST)洗涤3遍，排干反应板，加入1％明胶，100μL/孔，37℃封闭2h，弃去孔内液体，然后用洗涤液(PBST)洗涤3遍，排干反应板，然后真空包装，存于4℃；
2)样品稀释液：1％卵清蛋白溶液，取卵清蛋白1g，溶于100mL1×PBST缓冲液中；
3)10×浓缩洗涤液：10×浓缩的PBST洗涤液(含0.5％ Tween-20的0.01mol/L、pH7.4的PBS)；
4)阳性对照，非洲马瘟病毒阳性血清，用样品稀释液稀释至用本方法检测的OD值为1.0+/-0.1的范围内；
5)阴性对照，非洲马瘟病毒抗体呈阴性的马血清，用样品稀释液作1:40稀释；
6)底物稀释液，含0.15mg/mL尿素过氧化氢的磷酸盐柠檬酸缓冲液(PH 5.0，24.3ml 0.1M柠檬酸溶液加入到25.7ml 0.2M磷酸钠溶液中，用纯水定容至100mL)；
7)10×浓缩ABTs底物液：10mg ABTs溶于1mL的底物稀释液中；
8)2000×浓缩辣根过氧化物酶标记的重组蛋白G：HRP标记的rec Protein G；
9)终止液，1％ SDS溶液。
一种检测非洲马瘟病毒抗体的间接ELISA方法如下：
1)用样品稀释液40倍稀释被测样品(例如：10μl样品加390μl样品稀释液)；不稀释阳性和阴性对照。取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在添加到包被板前混匀；
2)使用前所用试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或振荡予以混合。浓缩洗涤液使用前应恢复至室温，并摇动使沉淀盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10倍稀释；
3)取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置；在A1孔内分别加入100μl没有稀释的阴性对照；在B1的孔内分别加入100μl没有稀释的阳性对照。在其余孔内分别加入100μl已稀释好的样本；
4)37℃下孵育1小时(湿盒内)；
5)吸取各孔的液体弃入废液筒；用大约350μl洗涤液洗涤板孔，重复4次；每次洗涤后应吸去孔内的液体；注意应避免包被板孔干燥；在最后一次洗涤液吸去后，将每块板中残留的洗涤液扣拍到吸水材料上；
6)稀释酶标二抗，酶标二抗用样品稀释液作1:2000稀释；每孔加入100μl稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗；
7)37℃下孵育1小时(湿盒内)。重复上面的步骤5)；
8)每孔加入100μLABTs底物液，室温下孵育15分钟；每孔加入100μL终止液，使反应终止；测量并且记录样本和对照的OD值(405nm)；
9)结果判定：符合下列条件，实验方能有效：阳性对照的值必须大于或等于0.5，阴性对照值必须小于或等于0.250。如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，试验应重做，并应全面的仔细核对各组份。AHSV抗体的临界值为计算为阴性对照+0.25。如果测定的OD值低于临界值，样品应判为AHSV抗体阴性。如果测定的OD值低于临界值，样品应判为AHSV抗体阳性。
本发明的优点是：本发明选择非洲马瘟病毒保守的VP7内衣壳蛋白作为目标，采用人工拼接的方式获得了含大多数线性表位的部分VP7蛋白，并实现了在原核系统的高效表达，建立了间接ELISA检测方法并研制出试剂盒，取得了优异的技术效果：
1)简便快速：可快速的对马科动物的非洲马瘟病毒抗体作出评价。
2)适用范围广：由于表达的蛋白为非洲马瘟的群特异性抗原蛋白，因此可检测9个型非洲马瘟病毒诱导的抗体，不仅可用于感染动物的检测，还可用于免疫动物的抗体评价。
3)特异：与同属的蓝舌病病毒阳性血清不发生交叉反应。
4)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好。
5)安全：不接触病毒，不具有生物安全问题。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为目的基因片段拼接原理图。
图2为DA-PCR扩增结果。
图3为OE-PCR及最终扩增产物扩增结果。
图4为重组质粒鉴定结果。
图5为用以纠正插入和缺失的PCR扩增结果。
图6为纠正插入和缺失后的测序结果。
图7为表达于BL21的重组AHSV VP7 SDS-PAGE电泳分析结果。
图8为Dot-ELISA评价重组蛋白的抗原性结果。
图9为ELISA评价重组蛋白的抗原性结果。
图10为研制的非洲马瘟抗体检测ELISA试剂盒外观。
具体实施方式
实施例1：试剂盒的配制和使用
1.试剂盒的外观见图1，配制组成见表3。
表3 试剂盒配制组成
| 组成(96tests×2/盒) | 数量 |
| 酶标反应板 | 2块 |
| 样品稀释液 | 50mL×2 |
| 10×浓缩洗涤液 | 50mL×2 |
| 阴性对照 | 0.3mL |
| 阳性对照 | 0.3mL |
| 底物稀释液 | 50mL |
| 10×浓缩ABTs底物液 | 5.0mL |
| HRP标记的重组蛋白G | 0.1mL |
| 终止液 | 50mL |
2.试剂盒的使用方法
1)用样品稀释液40倍稀释被测样品(例如：10μl样品加390μl样品稀释液)。不稀释阳性和阴性对照。取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在添加到包被板前混匀。
2)使用前所用试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或振荡予以混合。浓缩洗涤液使用前应恢复至室温，并摇动使沉淀盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10倍稀释。
3)取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置。在A1孔内分别加入100μl没有稀释的阴性对照。在B1的孔内分别加入100μl没有稀释的阳性对照。在其余孔内分别加入100μl已稀释好的样本。
4)37℃下孵育1小时(湿盒内)。
5)吸取各孔的液体弃入废液筒。用大约350μl洗涤液洗涤板孔，重复4次。每次洗涤后应吸去孔内的液体。注意应避免包被板孔干燥。在最后一次洗涤液吸去后，将每块板中残留的洗涤液扣拍到吸水材料上。
6)稀释酶标二抗，酶标二抗用样品稀释液作1∶2000稀释。每孔加入100μl稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗。
7)37℃下孵育1小时(湿盒内)。重复上面的步骤5)。
8)每孔加入100μLABTs底物液，室温下孵育15分钟。每孔加入100μL终止液，使反应终止。测量并且记录样本和对照的OD值(405nm)。
9)结果判定。符合下列条件，实验方能有效：阳性对照的值必须大于或等于0.5，阴性对照值必须小于或等于0.250。如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，试验应重做，并应全面的仔细核对各组份。AHSV抗体的临界值为计算为阴性对照+0.25。如果测定的OD值低于临界值，样品应判为AHSV抗体阴性。如果测定的OD值低于临界值，样品应判为AHSV抗体阳性。
实施例2：基因拼接与重组蛋白的表达
1.材料
Pfu DNA聚合酶，购自北京欣经科公司
Taq DNA聚合酶、dNTPs：购自上海Promega公司。
限制性内切酶Sal I，Bgl II购自TaKara公司。
胰蛋白胨及酵母粉：购自Oxiod公司。
IPTG，X-Gal等：购自GIBCO BRL公司。
T4DNA连接酶：购自TaKara公司。
DNA快速纯化回收试剂盒：购自TaKara公司。
质粒快速提取纯化试剂盒：购自TaKara公司。
三羟甲基氨基甲烷(Tris-碱)、甘氨酸：购自上海生物工程公司。
N’N’—二甲基甲叉双丙稀酰胺、丙烯酰胺：购自华美生物工程公司。
BugBuster Protein Extraction Reagent，购自Novagen公司。
2.方法
1)拼接原理见图2，采用三步法拼接目的片段。第一步为DA-PCR，生成的主产物为最长的150bp的片段。在第二步中，可合成全长的目的片段，然后在第三步进行常规PCR时，就可扩增出全长的目的片段。
2)将上述扩增产物双酶切后，与pET-30a载体连接后，转化大肠杆菌DH5α，于37℃条件下过夜培养。第2天挑取菌落于LB中培养8h后，吸取菌液分别用F1，R1；以及F3，R3引物进行扩增鉴定。
3)将上述克隆挑取5个进行序列测定比对，我们选取了插入和缺失相对最少的克隆进一步采取重叠PCR进行定点突变，突变后进行进一步的测序分析。
4)对序列正确的克隆转化BL21菌进行诱导表达，将诱导表达前以及诱导后不同时间，取菌液1.0mL，5000rpm离心10min，收集菌体，加入2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，用12％SDS-PAGE胶检查。包涵体重新溶解后，收集上清和菌体裂解后的上清，进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体溶解后重组蛋白的纯度。
5)将纯化的蛋白作1:100稀释后，用分光光度计分别测定260nm和280nm的吸光度值，计算蛋白浓度。
3.结果
1)将25个寡核苷酸片段，分解为11个反应体系，反应结束后，取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下进行观察，所有管中均形成了150bp的片段，见图3。将DA-PCR各管中的扩增产物混合反应结束后，将产物作为模板，用2个最外侧引物进一步扩增全长目的片段，扩增到了预期的1.1kb的片段，见图4。
2)将扩增产物双酶切后，与载体连接后，转化大肠杆菌DH5α，经鉴定，结果表明扩增产物已克隆入载体。图5为部分菌落的扩增结果。
3)将上述克隆挑取5个进行序列测定，经序列比对结果表明实际序列与预期序列存在多处插入和缺失。经过比对，我们选取了插入和缺失相对最少的克隆进一步采取重叠PCR进行定点突变。三次PCR扩增电泳图见图6。经序列分析表明，3处插入已经完全得到纠正，见图7。
4)诱导后不同时间均可观察到约24KD的重组蛋白，与预期大小一致。诱导后2h，蛋白量达到高峰。包涵体重新溶解后，收集上清和菌体裂解后的上清，进行SDS-PAGE电泳，检查包涵体溶解后重组蛋白的纯度。表明溶解后的包涵体为高纯度重组蛋白，结果见图8。
5)蛋白质浓度的测定结果为8.741mg/ml。
实施例3：重组蛋白的抗原性分析
1.材料
阳性血清和阴性血清，来自非洲马瘟阻断ELISA试剂盒，购自西班牙INGENASA公司。
2.方法
1)将NC膜用蒸馏水浸泡后晾干，分别用2μL 87.4μg/mL的纯化蛋白滴加于上膜上，晾干，将NC膜置于含1％卵清蛋白的PBST封闭液中，室温轻摇3～5h后4℃封闭过夜。弃去封闭液，用PBST浸泡洗涤3遍，加入1:10的阳性血清中，室温下震荡1.5h。用PBST浸泡洗涤3遍，加入1:500稀释的HRP酶标蛋白G溶液中，室温振荡1h，用PBST浸泡洗涤3遍，置于底物中显色，至斑点清晰后，用蒸馏水终止显色。
2)用浓度分别为43.7μg/mL，21.9μg/mL，10.9μg/mL，5.45μg/mL，2.73μg/mL，1.36μg/mL，0.68μg/mL以及0.34μg/mL的蛋白包被酶标板，100μL/孔，包被条件为4℃条件下过夜，之后用含1％卵清蛋白的PBST封闭液37℃封闭2h，用用PBST洗涤3遍，拍干后，于4℃条件下备用。
分别用阳性血清和阴性血清作1:20稀释后，加100μL于板上，37℃作用1h，用PBST洗涤3遍，拍干后，加入1:2000稀释的HRP酶标蛋白G溶液100μL，37℃作用1h，用PBST洗涤3遍，加入ABTs底物溶液100μL，室温避光作用15min，用100μL 1％ SDS终止反应，用405nm滤光片读取OD值。
3.结果
1)结果见图9。表明重组蛋白具有良好的抗原性。
2)结果见图10。进一步表明重组蛋白具有良好的抗原性。测得的ELISA试验结果(OD405)见表4。
表4 ELISA试验结果(OD405)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 0.214 | 0.217 | 0.213 | 0.211 | 0.228 | 0.207 | 0.218 | 0.214 |
| 1.258 | 1.199 | 1.219 | 0.768 | 0.553 | 0.424 | 0.443 | 0.341 |
| 0.124 | 0.121 | 0.118 | 0.119 | 0.121 | 0.132 | 0.116 | 0.123 |
| 2.784 | 2.794 | 2.879 | 2866 | 2.730 | 2.541 | 2.638 | 2.000 |
实施例4：ELISA方法的建立及对临床样品的检测
1.材料
非洲马瘟阻断ELISA试剂盒，购自西班牙INGENASA公司。
2000年以来进口马血清184份
2.方法
1)重组蛋白抗原最适包被浓度和待检血清稀释浓度的确定：用包被液将提纯得到的重组蛋白抗原分别作200倍(43.7μg/mL)，400倍(21.9μg/mL)，800倍(10.9μg/mL)，1600倍(5.45μg/mL)，3200倍(2.73μg/mL)，6400倍(1.36μg/mL)，12800倍(0.68μg/mL)，25600(0.34μg/mL)倍以及51200(0.17μg/mL)倍9个倍比稀释度，包被酶标反应板，包被条件为4℃条件下过夜。用血清稀释液将阳性血清及阴性血清作1:20，1:40，1:80，1:160倍比稀释，进行方针滴定，作ELISA测定。
2)重组蛋白抗原包被条件的确定：以最适浓度抗原包被酶标板，100μL/孔，分成2组：第1组：为37℃1h，然后于4℃条件下过夜；第2组，仅为4℃条件下过夜。作ELISA测定。
3)封闭液的确定：使用了两种适用于酶标重组蛋白G的封闭液，比较封闭效果。一种为含1％明胶的PBST封闭液，另一种为含有1％卵清蛋白的PBST封闭液。
4)间接ELISA方法阴阳临界值的确定：随机取30份进口马血清，经非洲马瘟阻断ELISA试剂盒检测为非洲马瘟抗体阴性，作1∶40稀释，用已经建立的间接ELISA方法检测，每份血清重复2孔，读取OD值。
5)间接ELISA方法特异性试验：以最适浓度抗原包被酶标板，对收集到的马传染性贫血病毒阳性血清，马鼻肺炎病毒阳性血清以及蓝舌病病毒阳性血清作1:40稀释，作ELISA测定。
6)用建立的间接ELISA方法检测2000年以来进口马血清184份，并与西班牙INGENASA公司生产的非洲马瘟阻断ELISA试剂盒进行比较。
3.结果
1)结果见表5。随着抗原浓度的减小和血清稀释倍数的增加，血清的OD405不断减小，当重组抗原蛋白浓度为0.17μg/mL～0.34μg/mL时，阳性血清OD405在1.0左右，而且阴性血清OD405值较低，P/N值高(4.49～4.77)。一般来说，酶标移在OD值为1时，误差相对最小。据此，我们确定抗原包被浓度为0.20μg/mL，血清稀释度为1:40。
表5 重组蛋白抗原最适包被浓度与血清稀释度的确定
注：“+”表示阳性血清OD405值，“—”表示阴性血清OD405值。
2)结果见表6。用重组蛋白在最适包被浓度包被酶标板，在为37℃1h，然后于4℃条件下过夜的条件下，所测得的OD405值相对较高，阴性值较低，P/N值高，因此选为37℃1h，然后于4℃条件下过夜作为最适包被条件。
表6 重组蛋白抗原包被条件的确定
注：“+”表示阳性血清OD405值，“—”表示阴性血清OD405值。
3)结果见表7。明胶封闭的效果明显优于卵清蛋白，因此选用1％明胶作为封闭液。
表7 封闭液的确定
| 封闭液种类 | 1％明胶平均值 | 1％卵清蛋白平均值 |
| 阳性血清 | 1.12 | 1.09 |
| 阴性血清 | 0.160 | 0.194 |
| P/N | 7.00 | 5.62 |
4)结果见表8。根据统计学原理，样本的OD405值>阴性血清OD平均值X+3×SD，可以在99.9％的置信水平上判定为阳性。计算30份血清的OD405值平均值＝0.159，标准差SD＝0.0243，因此，ELISA阴阳性临界值等于0.159+3×0.0243＝0.2319。为便于判定结果，确定样本临界值为阴性对照+0.25。
表8 间接ELISA阴阳性临界值的确定
5)结果见表9。结果表明，马传染性贫血、马鼻肺炎以及蓝舌病阳性血清的OD405值均小于0.25，判为阴性，初步说明重组蛋白与传染性贫血、马鼻肺炎以及蓝舌病阳性血清无交叉反应，有较好的特异性，可以用于非洲马瘟病毒抗体的检测。
表9 间接ELISA方法的特异性试验结果
6)用建立的间接ELISA方法检测2000年以来进口马血清184份，并与西班牙INGENASA公司生产的非洲马瘟阻断ELISA试剂盒进行比较，结果均为阴性，两个方法的检测结果完全符合。从此结果也可以看出，进口血清中尚无非洲马瘟抗体。
序列表
<110> 中华人民共和国北京出入境检验检疫局
<120> 一种非洲马瘟检测试剂盒和检测方法
<130>
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 8
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
<210> 29
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
Claims (4)
1.人工拼接一段含有非洲马瘟病毒VP7蛋白大多数线性表位的核酸片段，其特征在于：为序列表SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。
2.一种检测非洲马瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，96tests×2/盒，由以下组分组成：
1)包被有非洲马瘟病毒抗原的重组酶标反应板；
2)样品稀释液：1％卵清蛋白溶液；
3)10×浓缩洗涤液：10×浓缩的PBST洗涤液，含0.5％Tween-20的0.01mol/L、pH7.4的PBS；
4)阳性对照：非洲马瘟病毒阳性血清，用样品稀释液稀释至用本方法检测的OD值为1.0+/-0.1的范围内；
5)阴性对照：非洲马瘟病毒抗体呈阴性的马血清，用样品稀释液作1:40稀释；
6)底物稀释液：含0.15mg/mL尿素过氧化氢的磷酸盐柠檬酸缓冲液；
7)10×浓缩ABTs底物液：10mg ABTs溶于1mL的底物稀释液中；
8)2000×浓缩辣根过氧化物酶标记的重组蛋白G：HRP标记的rec Protein G；
9)终止液：1％SDS溶液。
3.根据权利要求2所述的检测非洲马瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：抗原为人工拼接合成的一段序列，于原核载体pET-30a中高效表达获得，其编码核苷酸序列为序列表SEQ ID No.29所示的核苷酸序列。
4.一种检测测非洲马瘟病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)用样品稀释液40倍稀释被测样品，不稀释阳性和阴性对照；
2)使用前所用试剂恢复至室温，使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10倍稀释；
3)取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置；在A1孔内分别加入100μl没有稀释的阴性对照；在B1的孔内分别加入100μl没有稀释的阳性对照；在其余孔内分别加入100μl已稀释好的样本；
4)37℃下孵育1小时；
5)吸取各孔的液体弃入废液筒；用大约350μl洗涤液洗涤板孔，重复4次；每次洗涤后应吸去孔内的液体；在最后一次洗涤液吸去后，将每块板中残留的洗涤液扣拍到吸水材料上；
6)稀释酶标二抗，酶标二抗用样品稀释液作1:2000稀释；每孔加入100μl稀释好的辣根过氧化物酶标记的二抗；
7)37℃下孵育1小时；重复上面的步骤5)；
8)每孔加入100μLABTs底物液，室温下孵育15分钟；每孔加入100μL终止液，使反应终止；波长405nm条件下测量并且记录样本和对照的OD值；
9)结果判定：阳性对照的值必须大于或等于0.5，阴性对照值必须小于或等于0.250；AHSV抗体的临界值为计算为阴性对照+0.25；如果测定的OD值低于临界值，样品判为AHSV抗体阴性；如果测定的OD值低于临界值，样品判为AHSV抗体阳性。
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