KR101064866B1 - 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 소 등 반추류의 설사유발 바이러스 동시 검출법 - Google Patents

소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 소 등 반추류의 설사유발 바이러스 동시 검출법 Download PDF

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Abstract

본 발병은 소 및 반추류에서 설사를 유발하는 주요 바이러스인 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 감별 검출할 수 있는 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 역전사 반응 및 PCR로 구성된 방법을 통하여 상기 바이러스들을 동시에 검출 및 감별할 수 있는 데에 활용될 수 있는 특이 프라미어들과, 이들 프라이머들을 이용한 상기 소 설사 유발 바이러스들을 동시에 감별 검출할 수 있는 PCR 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 소 및 반추류의 코로나바이러스, 로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 감별 검출이 가능하여 일차적으로 상기 바이러스들의 감염 진단 및 이들 바이러스들에 의해 유발되는 질환의 감별 진단에 효과적으로 활용될 수 있으며, 또한 상기 바이러스들의 감염 진단 키트로도 구현이 가능하다.
소, 반추류, 설사, 바이러스, 코로나바이러스, 로타바이러스, 소바이러스성설사병바이러스, 페스티바이러스, 검출, 감별, 질환, 동시, 진단, 프라이머, PCR

Description

소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 소 등 반추류의 설사유발 바이러스 동시 검출법{Primers capable of simultaneous detecting bovine coronavirus, bovine rotavirus and bovine viral diarrhea virus, and simultaneous detection method of diarrhea viruses in ruminants, including cattle, using the same}
본 발명은 역전사 반응(Reverse transcription; RT) 및 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 소에서 설사를 유발하는 바이러스성 질병 원인체인 소코로나바이러스(bovine Coronavirus; BCoV), 소로타바이러스(bovine Rotavirus; BRV), 및 소바이러스성설사병바이러스(bovine viral diarrhea virus; BVDV)를 동시에 감별 검출(detection)할 수 있는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스들을 동시에 효과적으로 검출할 수 있는 특이 프라이머(primer), 및 이들 프라이머들을 이용한 상기 소 설사 유발 바이러스들을 동시에 감별 검출할 수 있는 방법에 관한 것으로서, 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스들의 감염 진단에 활용될 수 있는 검출 기술에 관한 것이다.
PCR은 DNA의 원하는 부분의 복사본(copy)의 수를 기하급수적(exponentially)으로 증폭시킬 수 있는 분자생물학적(molecular biological) 방법이다. DNA의 어느 부분이든지 그 서열(sequence)만 알면 PCR을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 처음 고안된 후, 유전자를 연구 및 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 활용되었으며 현재에도 널리 이용되고 있는 실험 기법이다. PCR은 DNA 중합효소(polymerase)에 의한 DNA 복제(replication)의 특징을 이용한 기법이다. DNA 중합효소는 외가닥(single stranded) DNA를 주형(template)으로 해서 상보적인(complementary) DNA를 합성(synthesis)할 수 있는데, 이러한 외가닥 DNA는 두 가닥(double stranded) DNA를 끓임(boiling)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 이 과정을 DNA 변성(denaturation)이라 한다. DNA 중합효소가 DNA 합성을 시작하기 위해서는 시작 부위(start site)가 두 가닥 DNA 형태로 되어 있어야 한다. 따라서 PCR에서는 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단(terminus)에 주형 DNA와 상보적으로 결합(annealing)할 수 있는 작은 DNA 조각(fragment)을 함께 넣어 주어야 하며 이것이 특정 DNA 서열의 양 끝에 결합하여 특정 DNA의 양 끝이 두 가닥 DNA 형태가 된다. 이럴 경우에만 DNA 중합효소에 의한 DNA 합성이 개시될 수 있다. 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머 또는 줄여서 프라이머라 한다. 일단 프라이머가 주형 DNA에 결합한 후에는 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 신장(extension)된다. 이런 일련의 기작에 PCR 반응이 기반으로 하기 때문에 PCR 주기(cycle)는
1) 두 가닥 주형 DNA를 외가닥 DNA로 바꾸어 주는 변성 단계,
2) 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 결합 단계, 및
3) DNA 중합효소의 작용으로 주형 DNA에 상보적 DNA가 합성되는 신장 단계
의 3단계로 구성된다. 최초 1회의 PCR 주기가 끝난 후에 그 다음으로 이어지는 PCR 주기에서는 최초(original) 주형과 PCR에 의해 새로 합성된 DNA인 PCR 산물(PCR product) 모두가 다음 PCR 주기에서는 PCR 주형(PCR template)이 된다. 이렇게 PCR은 주기가 계속적으로 반복될수록 PCR 주형으로 작용할 수 있는 분자(molecule)의 수는 계속 늘어나게 된다. 따라서 n번의 PCR 주기 후에는 이론적으로 2n 개의 두 가닥 DNA가 존재하게 된다. 즉, 1 개의 최초 주형 DNA로부터 (2n -1) 개의 복사본이 합성된 꼴이다.
최근까지 개발된 PCR 기법으로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료(sample)의 정제 과정을 생략하고자 하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응(reverse transcription)과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용하게 한 역전사 효소-PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitoring)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR), 1차 PCR과 2차 PCR로 구성된 두 단계의 PCR을 통하여 민감도(sensitivity)를 개선시킨 네스티드 PCR(nested PCR), 다수의 표적 유전자를 동시에 증폭하는 다중(multiplex) PCR 등이 있다. 이외에도 매우 많은 PCR 기법들과 PCR 관련 기술들이 개발 되었다. 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 현재 PCR은 다양한 연구 및 응용 분야에서 활용 되고 있으며, 대부분의 생물학 관련 연구 분야에 있어 강력한 실험 기법이 되었다(Science 252: 1643-1651, 1991).
시료 중에 어떤 유전체(genome)의 존재 여부의 확인(identification)을 통하여 그 유전체를 가진 박테리아(bacteria)나 바이러스(virus)가 시료 속에 존재하고 있음을 판정하는 PCR에 기반한 박테리아나 바이러스의 검출 기술은 이제는 일반적인 기술이 되었다고 할 수 있으며, 현재 매우 널리 활용되고 있다. 이런 PCR에 기반한 박테리아나 바이러스의 검출 기술은 박테리아나 바이러스에 관련된 감염성 질환(infectious disease)의 진단 목적으로 질병 진단 분야에서 활발하게 활용되고 있다(Virol. Methods 66: 39-50, 1997; Clin. Microbiol. 35: 2076-2082, 1997). 이러한 감염 원인체의 유전체에 기반을 둔 진단법인 PCR 진단은 PCR 주형인 유전체로부터 다수의 증폭 산물을 만들 수 있는 PCR의 고유한 특징으로 인하여 타 진단 방법에 비하여 매우 높은 진단 민감도를 제공해 줄 수 있다. 높은 민감도를 제공해 줄 수 있다는 점과 진단에 필요한 소요 시간이 타 방법에 비교하여 매우 짧다는 이유로 인하여 PCR을 이용한 진단 방법이 점차적으로 다른 진단 방법을 대체해 가고 있다.
소코로나바이러스는 코로나 바이러스과의 코로나 바이러스에 속하는 바이러스로서 주로 소화기 감염을 통해 설사를 주증으로 하는 감염질환을 일으키는 RNA 바이러스이다. 일반적으로 임상형에 따라 신생송아지 설사(neonatal calf diarrhea; NCDV) 형, 성우설사(winter dysentery; WD) 형과 또한 최근에 보고된 형 으로 호흡기에 친화성을 가진 호흡기 코로나(respiratory coronavirus; BRCV) 형으로 나누어진다. 종래의 소코로나바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법으로는 MDBK 세포주에 계대 배양 후 세포 변성 효과를 관찰하거나, 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 이용한 형광 항체법 및 혈청 중화시험법이 사용되었다.
소로타바이러스는 이중나선 RNA 바이러스(dsRNA viruses)로 로타바이러스라는 이름은 전자 현미경으로 관찰 시 마치 바퀴처럼 보인다고 해서 붙여졌다. 이 바이러스의 전파는 분변에서 경구 감염으로 이루어진다. 다시 말하면 바이러스를 포함한 분변이 직접 또는 바이러스에 오염된 물체가 경구적으로 침입함으로써 이루어진다. 또한 모우의 불현성 바이러스도 분변에 배출되어 감염원으로 작용할 가능성도 있다. 축주가 소들을 관리하는 도중에 감염우의 분변을 장화 등에 묻혀 다른 우사의 소들에게 전파시킬 수 있으며, 심지어는 사료 운반차에 의해 다른 농장으로 전파되기도 한다. 1주령 미만의 어린 송아지에서 감염되며 대부분 2-3일간의 심한 유백색 설사와 급격한 탈수 증상을 보이며 항생제 치료에도 크게 호전되지 않는다. 1개월 이상 된 송아지에서는 감염되어도 증상이 심하지 않으며 대증요법 치료에 의해서 쉽게 호전된다. 병변은 소장에 한정되며, 병리조직학적으로 관찰해 보면 장융모 상피세포의 팽대, 변성 및 탈락 등이 보인다. 일반적으로 대규모 농장의 경우 계절 분만 프로그램을 시행하거나, 분만 간격이 좁으므로 어린 송아지에서의 유행 양상이 소규모 농장의 경우보다 더 폭발적이며, 특히 늦겨울부터 초봄까지가 심하다. 소로타바이러스는 임상 증상만으로는 진단이 불가능하며 여러 가지 질병과 감별 진단이 필요하다. 발병초기의 분변 중에는 다량의 바이러스가 포함되어 있으므로 분변에서 직접 바이러스나 유전자를 검출하든지, 배양세포를 이용하여 바이러스 분리를 시도할 수도 있다. 전자현미경을 이용한 바이러스 입자 검출이 가장 확실한 방법으로 한 번에 다른 설사 관련 바이러스도 검출할 수 있다. 바이러스 항원 특히 공통항원 검출법으로 효소면역검사법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 적혈구 응집반응, 라텍스(latex) 응집반응 등이 응용되고 있다. 로타바이러스에 대한 항체검출법으로는 간접 형광항체법, 보체결합방법, ELISA, 중화반응이 있다. 송아지에서는 초유를 통한 이행항체가 존재하기 때문에 발병 송아지의 혈청을 이용한 혈청학적 진단은 일반적으로 곤란하다. 로타바이러스의 경우는 종간의 전파가 비교적 용이하게 일어남으로 인해 다양한 혈청형을 갖는 것이 일반적이다. 따라서 기존의 RT-PCR 법으로는 한 번에 모든 로타바이러스를 검출할 수가 없었다. 다양한 혈청형을 갖는 로타바이러스를 한 번에 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.
소바이러스성설사병바이러스는 1946년 미국의 Olafson 등에 의하여 우역과 유사하면서 보다 증세가 가벼운 질병으로 처음 보고 되었으며, 1850년대에는 점막병(Mucosal Disease)이라 불렸으나 현재는 소 바이러스성 설사증(Bovine Viral Diarrhea: BVD) 또는 소 바이러스성 설사증/점막병으로 불리고 있다. 소바이러스성설사병바이러스는 단일사슬의 RNA 바이러스(ssRNA viruses)이며 세포주에서 세포 변성효과를 일으키는 지의 유무에 따라 세포 변성주와 비세포 변성주로 분류되며, 형태학적으로는 지름이 40~60 nm의 구형으로 껍질(envelope)을 가지고 있다. 바이러스의 감염경로는 분변으로 오염된 사료에 의한 경구 감염과 태반 감염이 주가 되나 호흡기 및 생식기 감염에 의해서도 가능하다. 생식기 감염은 정액과 수정란을 통하여 전염될 수 있다고 한다. 소바이러스성설사병바이러스의 진단은 증상이 다양하므로 임상 증상만으로는 완전한 진단이 불가능하고 여러 질병과의 감별 진단이 필요하다. 소화기계의 임상 증상으로는 로타바이러스, 코로나바이러스, 대장균, 살모넬라 등의 감염 증상과의 구별이 필요하며, 호흡기계의 임상 증상으로 소 전염성 비기관염, 파라인플루엔자-3, 소 합포체성 폐렴 등과의 구별이 필요하며, 번식장애 증상으로 아까바네병, 소 전염성 비기관염, 부루셀라병 등과의 구별이 필요하다. 실험실 진단 방법으로는 항체증명법으로 중화시험법, ELISA 등이 있으며, 항원(바이러스)증명법으로는 형광항체법, NPLA(Neutralization Peroxidase linked Immunosorbant Assay), 전자현미경법, 바이러스분리법 등이 있다.
일반적으로 바이러스에 의해 발병되는 소 설사병들은 나타내는 증상이 비슷하므로 그것의 임상 증상만으로 감별하기가 매우 곤란하다. 따라서 여러 가지 실험실 검사를 실시해야만 정확히 진단할 수 있었다.
종래의 바이러스에 의해 유발되는 소 설사병에 대한 진단법으로는 신선한 장이나 분변 재료를 이용한 ELISA, 전자현미경법, 형광항체법, 바이러스 분리법, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(polyacrylamide gel electrophoresis), 라텍스 응집 반응, 역수동적혈구응집(reversed passive hemagglutination; RPHA)법 등이 있고, 항체의 역가를 측정하는 방법에는 중화항체 검사법, 보체결합반응, ELISA 등이 개발되어 있다.
특히 로타바이러스는 세포 배양에서 잘 증식하지 않기 때문에 종래 방법으로 로타바이러스 항원을 검출하는 데에는 어려움이 많았었다. 기존의 로타바이러스 항원 검출방법은 냉동된 장조직을 이용한 형광항체법이 사용되어 왔었다. 그러나 상기 방법은 로타바이러스에 감염된 장상피 세포가 장관강 내로 탈락하기 때문에 설사가 시작된 후 24-72 시간 후에는 장조직으로부터 로타바이러스를 검출하는 데에 어려움이 있었다.
상기의 종래 방법들은 검사 과정이 복잡하여 검사에 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 시료를 처리하고 결과를 판독하는데 있어서 정밀기기와 함께 고도로 숙련된 전문기술을 요하는 문제점을 가지고 있었다. 따라서 보다 신속하고 판정이 용이한 새로운 검출법이 필요하다 할 수 있다. 물론 검출에 활용될 수 있을 뿐만 아니라 바이러스의 감별에까지 활용 가능한 새로운 방법이 개발된다면 매우 유용할 것이다.
이러한 요구에 부응하고자 바이러스의 유전자를 이용한 소 설사 유발 바이러스의 검사 기술이 개발된 바가 있으며, 이는 대한민국특허출원 10-2006-0050345호에 개시되어 있다. 상기 기술은 유전자칩을 이용하여 소 설사바이러스성 설사증 바이러스를 검사하는 기술 및 진단키트에 관한 것이다. 상기 기술은 한 번의 검사 과정을 통하여 돼지콜레라 바이러스 및 소 바이러스성 설사증 바이러스를 신속 정 확하게 감별 검출할 수 있는 장점을 제공할 수 있기 때문에 종래 검출 기술에 비교하여 편리함과 유용성을 제공한다고 할 수 있다. 그러나 상기 방법은 유전자칩을 반드시 필요로 하기 때문에 그 실시에 있어 비용이 많이 든다는 문제점을 갖고 있으며, 역전사 반응을 별도로 실시한 후 그 산물(product)을 이용하여 유전자칩에 교잡(hybridization) 시키는 등 일련의 복잡한 과정이 필요하여 비록 종래 기술들에 비해 획기적으로 간편화 되었다고는 할 수 있지만 여전히 불편함이 있다. 따라서 유전자칩에 기반하는 상기 방법보다도 더 실시가 쉽고 저렴하며 간편한 감별 검출 방법의 개발이 필요하다 할 것이다.
현재까지 유전자의 분석에 기반한 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 감별 검출할 수 있는 기술은 개발되어 있지 않다.
본 발명자들은 상기의 종래 방법들에 비교하여 그 실시가 간단하고 저렴하면서 또한 민감하고, 동시에 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스 모두를 감별 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 상기 요구를 충족시킬 수 있는 특이 프라이머들과 이를 이용한 RT-PCR 검출 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명 세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
따라서 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 검출할 수 있으며 이들 바이러스들을 감별까지 하는 데에 활용될 수 있는 검출용 프라이머들, 및 이 프라이머들을 이용한 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시 감별 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 유전체와 결합할 수 있는 특이 프라이머들을 제공하고, 이들 프라이머들을 이용하여 역전사 반응 및 PCR 과정을 단일 단계에서 실시할 수 있는 방법을 제공하고, 더 나아가 상기 프라이머들을 이용한 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시 감별 검출 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 소코로나바이러스의 적혈구응집 에스테라제(hemagglutinin esterase; HE)를 코딩(coding)하고 있는 유전자로부터 cDNA(complementary DNA)를 합성하고 이 합성된 cDNA로부터 특정 부분을 특이적으 로 PCR 증폭하는 데에 활용될 수 있는 특이 프라이머들로서 서열번호 1 내지 서열번호 2에 제시한 염기 서열로 이루어진 프라이머 서열들을 제공한다.
또한, 본 발명은 소로타바이러스의 캡시드(capsid) 단백질인 VP7을 코딩하고 있는 유전자로부터 cDNA를 합성하고 이 합성된 cDNA로부터 특정 부분을 특이적으로 PCR 증폭하는 데에 활용될 수 있는 특이 프라이머들로서 서열번호 3 내지 서열번호 4에 제시한 염기 서열로 이루어진 프라이머 서열들을 제공한다.
또한, 본 발명은 소바이러스성설사병바이러스의 5'-비번역 영역(5'-untranslated region; 5'-UTR) 부분을 코딩하고 있는 유전자로부터 cDNA를 합성하고 이 합성된 cDNA로부터 특정 부분을 특이적으로 PCR 증폭하는 데에 활용될 수 있는 특이 프라이머들로서 서열번호 5 내지 서열번호 6에 제시한 염기 서열로 이루어진 프라이머 서열들을 제공한다.
본 발명은 상기 프라이머 중 서열번호 3 내지 서열번호 6에 제시한 프라이머들은 PCR 주형과 결합할 프라이밍(priming) 서열로 구성된 최초 프라이머 서열과 이 최초 프라이머 서열의 5’-말단(terminus)의 5’-시작부위(start site)로부터의 일정 부분과 상보적인 서열이 상기 최초 프라이머의 5’-말단에 추가로 도입된 변형 프라이머들(modified primers)이다. 본 발명의 상기의 변형 프라이머들의 사용 목적은 상온에서의 의도하지 않은 PCR 증폭을 억제함으로 핫-스타트 PCR을 가능하게 해 주고, 또한 PCR 증폭 시 최초 주형으로부터의 증폭에 비해 PCR 산물로부터의 증폭을 우세화시켜 결과적으로 PCR에서의 비특이 증폭을 억제하기 위해서 이다.
또한, 본 발명은 상기 서열의 특이 프라이머들을 이용한 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 다중 PCR 동시 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열의 특이 프라이머들을 포함하는 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 PCR 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 서열의 특이 프라이머들을 포함하는 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스에 관련되는 질환 진단용 PCR 진단 키트를 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서의 특이 프라이머들은 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시 감별 검출을 위하여, 소코로나바이러스의 HE를 코딩하고 있는 유전자 부위, 소로타바이러스의 VP7을 코딩하고 있는 유전자 부위, 및 소바이러스성설사병바이러스의 5’-UTR 부위의 cDNA의 합성과 합성된 cDNA로부터 각각의 특정 부위를 증폭하는 데에 사용된다. 각각의 PCR에서 증폭되는 부위를 표시한 그림이 도 1, 도 2, 및 도 3에 제시되어 있다.
상기 소로타바이러스 검출용 특이 프라이머들은 소로타바이러스의 검출에만 국한되는 것이 아니고, 돼지로타바이러스, 개로타바이러스, 및 말로타바이러스 등의 다른 축종의 로타바이러스의 검출에도 효과적으로 활용될 수 있다.
또한, 상기 소바이러스성설사병바이러스 검출용 특이 프라이머는 소바이러스 성설사병바이러스 1형 (Bovine viral diarrhea virus type 1; pestivirus type 1) 및 2형 (Bovine viral diarrhea virus type 2; pestivirus type 4)의 검출에만 국한되는 것이 아니고, 보더바이러스(Border disease virus; pestivirus type 3), 돼지콜레라바이러스(Swine fever virus; pestivirus type 2)를 포함한 다른 페스티바이러스(pestivirus)의 검출에 활용될 수 있다. 소에는 현재까지 페스티바이러스 중 소바이러스성설사병바이러스 1형 및 2형의 감염만이 보고되어 있어, 페스티바이러스 공통항원 검출 프라이머로 검출된 바이러스는 소바이러스성설사병바이러스 1형 또는 2형이라고 판단할 수 있다.
보다 구체적으로는 본 발명의 특이 프라이머들은 RNA로부터 cDNA가 합성되는 역전사 반응에서 일차적으로 사용되며, 상기 역전사 반응을 통하여 합성된 cDNA로부터 PCR을 통하여 특정 유전자 부위를 증폭하는 데에도 이차적으로 사용된다.
상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 감별 검출할 수 있는 특이 프라이머들은 서열번호 1 내지 서열번호 6의 다양한 조합을 통해 구현될 수 있다. 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시 감별 검출에서 사용되는 특이 프라이머 조합은 정방향(forward) 프라이머 3개와 역방향(reverse) 프라이머 3개의 조합으로 이뤄져 있으며, 이를 이용한 다중 PCR 증폭 산물의 크기는 각각 660 bp, 400 bp, 297 bp이다.
본 발명의 역전사 반응 및 다중 PCR에 사용되는 특이 프라이머 조합에서의 각 프라이머들의 염기서열은 다음과 같다. 소코로나바이러스의 검출에 사용되는 정방향 프라이머는 5’-GCA CCA CTT CTG GTA GTA ATG A-3’ (22-mer, 서열번호 1)이고 소코로나바이러스의 검출에 사용되는 역방향 프라이머는 5’-CAG CAT CCC CAT GAT TGA TAT C-3’ (22-mer, 서열번호 2)이다. 또 소로타바이러스의 검출에 사용되는 정방향 프라이머는 5’-AAG CCG GCT TTA AAA GAG AGA AT-3’ (23-mer, 서열번호 3)이고 소로타바이러스의 검출에 사용되는 역방향 프라이머는 5’-GGA TCG AWC CWG TYG GCC AYC CYT-3’ (24-mer, 서열번호 4)이다. 마지막으로, 소바이러스성설사병바이러스의 검출에 사용되는 정방향 프라이머는 5’-GGC ATA TGC CCW TAG TAG GAC TAG C-3’ (25-mer, 서열번호 5)이고 소바이러스성설사병바이러스의 검출에 사용되는 역방향 프라이머는 5’-AGT TGC AAC TCC ATG TGC MAT GTA C-3’ (25-mer, 서열번호 6)이다. 본 명세서에는 프라이머의 서열을 나타냄에 있어 IUB 중의성(ambiguity) 코드(codes)를 사용했다. 따라서 프라이머 서열에서 A는 아데닌(adenine)을, G는 구아닌(guanine)을, C는 시토신(cytosine)을, T는 티민(thymine)을 나타내고, W는 아데닌과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, M은 아데닌과 시토신 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, Y는 시토신과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용하였다.
본 발명의 상기 각 특이 프라이머들은 구성염기의 일부가 변경될 수는 있다. 이와 같은 변경은 구성염기 서열의 일부결실, 부가, 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 구현될 수 있으나, 이러한 염기서열의 변경은 프라이머의 특이적 주형과의 결합을 깰 수 있기 때문에 적용에 있어 상당한 주의를 요한다. 따라서 특이성을 훼손하지 않는 범위 내에서 실험적 또는 경험적으로 결정되어야 한다. 이는 당업자에게는 일반적인 사항이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명에서 제시된 프라이머들의 서열을 유지하는 것이 가장 바람직하다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 6의 특이 프라이머들을 이용하여 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시 검출 및 진단하는 방법이 모식적으로 도 4에 제시되어 있으며, 구체적인 내용은 다음과 같다.
(1) RNA를 추출하는 단계;
(2) 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 6의 특이 프라이머들로부터 구성되어지는 프라이머 조합 및 상기 추출된 RNA를 이용하여 역전사 반응 및 PCR을 실시하는 단계;
(3) 상기 PCR 산물을 분석하는 단계.
보다 상세히 설명하면, 먼저 분변 및 장조직 등의 시료에서 공지의 방법에 따라 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA를 함유한 추출액은 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 검출할 수 있는 특이 프라이머 조합을 포함하고 있는 역전사 반응 및 PCR 반응액에 첨가한다. 이때, 상기 역전사 반응 및 PCR 반응액은 역전사 반응을 위한 역전사 효소와 PCR 증폭을 위한 DNA 중합효소를 동시에 포함하고 있어야 한다. 물론 역전사 반응과 PCR은 별도로 구분하여 실시할 수도 있으나, 이는 실제 실시에 있어 번거로움을 초래하므로 한 번의 반응 단계에서 연속적으로 실시하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 실시예에 제시한 결과에서 알 수 있듯이 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 유전체를 이용한 역전사 반응과 PCR 반응은 본 발명의 특이 프라이머들을 사용할 때 하나의 반응에서 일련의 과정으로 실시될 수 있었다. 따라서 본 발명을 따르면 역전사 반응을 별도의 과정으로 분리하여 수행해야 하는 번거로움을 제거할 수 있다.
그런데 이러한 역전사 반응과 PCR의 결합은 무조건 달성되는 것은 아니다. 적절한 프라이머들이 설계, 제작되어 적용되었을 경우에만 달성된다. 이는 실험적으로 결정되어야만 하며, 본 발명에서 개시된 특이 프라이머 조합은 여러 번의 실험의 결과로부터 결정된 것이다.
다음으로, 상기 역전사 반응 및 PCR 과정을 거친 반응액을 전기 영동하여 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 특이적 밴드가 있는가 또는 없는가에 대한 확인을 통하여 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 존재 여부를 판정한다. 즉, 660 bp 크기의 PCR 산물이 확인되면 최초 추출하여 준비한 시료에 소코로나바이러스의 RNA가 포함되어 있었다는 것을 나타내며, 이는 RNA 추출에 사용한 최초의 시료인 분변이나 조직 등이 소코로나바이러스에 감염되어 있었음을 나타낸다. 또한, 400 bp 크기의 PCR 산물이 확인되면 최초 추출하여 준비한 시료에 소로타바이러스의 RNA가 포함되어 있었다는 것을 나타내며, 이는 RNA 추출에 사용한 최초의 시료인 분변이나 조직 등이 소로타바이러스에 감염되어 있었음을 나타낸다. 또한, 297 bp 크기 의 PCR 산물이 확인되면 최초 추출하여 준비한 시료에 소바이러스성설사병바이러스의 RNA가 포함되어 있었다는 것을 나타내며, 이는 RNA 추출에 사용한 최초의 시료인 분변이나 조직 등이 소바이러스성설사병바이러스에 감염되어 있었음을 나타낸다. 상기 3 가지 PCR 증폭산물 중 어느 두 가지가 있든지 아니면 3 가지 모두가 있다면 최초 추출하여 준비한 시료에 해당되는 바이러스의 RNA가 2 종 또는 3 종 모두가 포함되어 있었다는 것을 나타내며, 이는 RNA 추출에 사용한 최초의 시료인 분변이나 조직 등이 해당되는 바이러스 2 종 또는 3 종 모두에 감염되어 있었음을 나타낸다.
따라서 본 발명에 의하면, 상기 본 발명의 특이 프라이머 조합을 이용한 역전사 반응 및 PCR을 통하여 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시 감별 검출을 실시할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 본 발명에서 제공된 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 특이 증폭용 프라이머들, 및 이들을 이용한 다중 PCR 방법을 통하여 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 감별 검출할 수 있다. 특히 종간의 전파 등에 의해 발생한 다양한 혈청형으로 인하여 종래의 방법에서는 로타바이러스를 한 번에 검출하기가 불가능하였으나, 본 발명을 따르면 한 번에 검출이 가능하다. 이에 더하여, 본 발명을 따르면 상기 3가지 바이러스 외에도 돼지로타바이러스, 개로타바이러스, 말로타바이러스와 보더바이러스 및 돼지콜레라바이러스를 포함한 페스티바이러스도 검출이 가능하다. 한편, 본 발명은 일정 염기 서열이 상보적으로 결합된 변형 프라이머를 제공함으로써 핫-스타트 PCR을 가능하게 해 준다. 이는 상온에서의 의도하지 않은 PCR 증폭의 억제를 통하여 실험 준비 과정 또는 PCR 증폭이 시작하기 전에 발생할 수 있는 비특이 증폭을 억제함으로써 높은 특이성을 제공한다. 따라서 본 발명은 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시 감별 검출 방법으로 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스 진단용 제품 개발에도 효과적으로 활용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 특이 프라이머들의 제작
상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스는 바이러스의 종류 및 바이러스 형에 따라 유전자 부위의 변이, 결손 및 치환 정도가 다르다. 본 발명에서의 소코로나바이러스의 유전자 증폭에서는 소코로나바이러스의 HE를 코딩하고 있는 유전자 부위 중 소코로나바이러스 간의 차이가 적고 가장 유사한 염기 서열을 나타내는 부위를 증폭범위로 사용하였고, 소로타바이러스의 유전자 증폭에서는 소로타바이러스의 VP7을 코딩하고 있는 유전자 부위 중 로타바이러스 간의 차이가 적고 가장 유사한 염기 서열을 나타내는 부위를 증폭범위로 사용하였으며, 소바이러스성설사병바이러스의 유전자 증폭에서는 소바이러스성설사병바이러스의 5'-UTR 부위 중 소바이러스성설사병바이러스 간의 차이가 적고 가장 유사한 염기 서열을 나타내는 부위를 증폭범위로 사용하였다.
표 1에는 본 발명에 따라 설계된 특이 프라이머들의 염기 서열이 제시되어 있으며, 서열번호 1 내지 서열번호 2의 소코로나바이러스의 유전자 증폭용 특이 프라이머들은 소코로나바이러스 strain 339/06(accession number: EF445634)을 기준으로 해당 위치를 나타내었다. 또한, 서열번호 3 내지 서열번호 4의 소로타바이러스의 유전자 증폭용 특이 프라이머들은 소로타바이러스 strain K158(accession number: EU541408)을 기준으로 해당 위치를 나타내었다. 또한, 서열번호 5 내지 서열번호 6의 소바이러스성설사병바이러스의 유전자 증폭용 특이 프라이머들은 소바이러스성설사병바이러스 2형 strain AU501(accession number: EF626629)을 기준으로 해당 위치를 나타내었다.
바이러스 서열번호 염기서열 위치(bp)
BCoV 1 5’-GCA CCA CTT CTG GTA GTA ATG A-3' 598-619
2 5’-CAG CAT CCC CAT GAT TGA TAT C-3’ 1236-1257
BRV 3 5’-AAG CCG GCT TTA AAA GAG AGA AT-3’ 1-18
4 5’-GGA TCG AWC CWG TYG GCC AYC CYT-3’ 374-392
BVDV 5 5’-GGC ATA TGC CCW TAG TAG GAC TAG C-3’ 33-52
6 5’-AGT TGC AAC TCC ATG TGC MAT GTA C-3’ 300-319
실시예 2: 분변 및 장조직에서의 RNA 준비
분변은 통상의 인산완충생리식염수(PBS)에 10%(w/v)가 되게 부유시킨 다음 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 장조직인 경우는 세포파쇄기(homogenizer)를 이용하여 PBS로 10%(w/v) 파쇄액을 만들고 난 후 이를 원심분리한 다음 상층액을 취한다. 이 상층액으로부터 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 RNA를 추출한다. RNA 추출은 (주)인트론바이오테크놀로지사의 Viral Gene-spinTM DNA/RNA Extraction Kit를 사용하여 제품 사용 설명에 따라 실시하였다.
실시예 3: 바이러스들의 검출
상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스들을 동시 검출하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 역전사 반응과 PCR의 실시를 위해 총 부피 20 μl로 반응액을 준비하였고, 그 구성 성분은, 실시예 2에서 준비된 RNA 추출액 2 μl, 10 pmol/μl의 서열번호 1 내지 서열번호 6의 각 특이 프라이머들, 역전사 효소, PCR 반응액, 및 증류수이다. 상기 구성 성분 중 하나인 PCR 반응액으로는 (주)인트론바이오테크놀로지사의 MaximeTM RT-PCR PreMix를 사용하였으며, 이는 제품의 사용 설명에 따라 사용하였다.
첫 번째 단계는 먼저 역전사 반응이 일어나게 하기 위하여 상기처럼 준비된 반응액을 45℃에서 30분간 정치시켰다. 이 과정에서 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성된다. 역전사 반응을 유도한 다음 95℃에서 5분간 정치하여 PCR에서 주형이 될 cDNA를 변성시켰다. 그 후 95℃에서 30초, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 구성된 PCR 주기를 40회 반복시키는 조건으로 PCR 반응을 실시하였다. 40회 반복 후 PCR 반응액은 72℃에서 5분간 더 정치하였다.
PCR이 완료되면 PCR 반응액의 DNA 염색을 위하여 DNA 염색 시료인 에티디움 브로마이드(Etidium Bromide; Et-Br)가 0.1 μg/ml의 농도로 포함된 1.5% 아가로즈 겔에 적하(loading)하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 PCR 산물을 분석하여 그 결과를 판독하였다.
(3-1) PCR 의 민감도 측정
본 발명에 따른 PCR 검출 방법에 있어 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 검출 민감도(sensitivity)를 조사해 본 결과, 소코로나바이러스는 1× 101 TCID50/ml, 소로타바이러스는 1× 101 TCID50/ml, 그리고 소바이러스성설사병바이러스는 1× 101 TCID50/ml를 각각 나타내었다. TCID50은 조직배양 감염량(tissue culture infectious dose)의 약자로서, 조직(tissue) 배양(culture)의 50%에서 세포병변효과가 유발되는 바이러스의 양을 지칭한다. 민감도 측정과 관련된 전기영동 사진 결과가 도 5(소코로나바이러스), 도 6(소로타바이러스) 및 도 7(소바이러스성설사병바이러스)에 제시되어 있다.
상기 결과에 의하면, 본 발명에 따른 프라이머들을 이용한 PCR 검출 방법은 상기 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시 검출에 활용되기에 충분한 정도의 민감도를 제공해 줄 수 있음을 확인할 수 있다.
(3-2) PCR 의 특이도 측정
본 발명에 따른 다중 PCR법의 특이도를 측정한 결과, 다른 종류의 설사바이러스인 엔테로바이러스(Enterovirus)에 대해서는 특이 밴드를 확인 할 수 없었으며 그 결과는 도 8에 제시되어 있다. 즉, 엔테로바이러스와 같이 다른 설사바이러스들과 구별하여 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 검출할 수 있음을 나타낸다. 따라서 본 발명을 따르면 임상 증상만으로는 판단하기가 어려웠던 감염의 원인 바이러스를 정확히 판단할 수 있다.
이에 반해 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스가 포함된 시료에서는 정확히 3 가지의 PCR 산물이 확인되었다 (도 9). 이로써 본 발명이 상기 소 설사 유발 바이러스들의 감별 검출을 위한 다중 PCR 방법으로 활용 가능함을 알 수 있다. 도 10은 3 가지 바이러스 중 2 가지만이 있을 경우에도 본 발명이 잘 활용될 수 있음을 보여 주는 결과이다.
(3-3) 유효성 조사
본 발명의 유효성을 다양한 바이러스에 대하여 조사해 보았다. 그 결과로서, 소코로나바이러스(BCoV KWD9주, BCoV KWD16주, BCoV KCD9주, BCoV 0516주, BCoV MLV주, BCoV NCDV주, BCoV Mebus주, BCoV A4주, BCoV BC94주), 소로타바이러스(04-56-5-1-2, 04-56-9-1-2, 04-56-285-1-2, 04-56-49-1-2, BRV-A, BRV0418, BRV-VMRI, BRV288, BRV-P44), 돼지로타바이러스(PRV-OSU, PRV-Gotfied, PRV-175) 및 소바이러스성설사병바이러스 1형(BVDV-1형 NADL주, Singer주, SO주, Nose주, KD26-1주, 32-9F주) 및 소바이러스성설사병바이러스 2형(BVDV-2형 95002주, 95411주, T20주, PHG주, BVDV2주), 보더바이러스(BDV-Averyon주, BDV-Lyon2주), 돼지콜레라바이러스(CSF-LOM주)에 대해서 본 발명에서 개시한 검출 방법이 잘 작동하는 것을 보여 주는 결과가 도 11, 도 12 및 도 13에 제시되어 있다.
또한 본 발명을 임상 시료에 적용한 결과가 도 14에 제시되어 있다. 야외 임상 시료 12건에 대하여 소코로나바이러스를 검사한 결과 2건이 양성으로 나왔으며, 소로타바이러스를 검사한 결과 9건이 양성으로 나타났으며, 소바이러스성설사병바이러스를 검사한 결과 8건이 양성으로 나타났다. 이상으로 본 발명이 소 설사 유발 바이러스의 동시 감별 진단에 유효하다는 것을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 소코로나바이러스 적혈구응집 에스테라제(hemagglutinin esterase)를 코딩하고 있는 유전자에서 역전사 반응 후 PCR에서 증폭되는 부위를 표시한 그림이다.
도 2는 소로타바이러스 캡시드 유전자 중 VP7을 코딩하고 있는 유전자에서 역전사 반응 후 PCR에서 증폭되는 부위를 표시한 그림이다.
도 3은 소바이러스성설사병바이러스 유전자 중 5’-UTR 부위에서 역전사 반응 후 PCR에서 증폭되는 부위를 표시한 그림이다.
도 4는 본 발명에 따른 다중 PCR 검출 방법을 이용한 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스 검출 과정을 나타내는 순서도이다. 도 4에서 제시된 역전사 반응과 PCR 반응은 따로 분리하여 개별적으로 실시할 수도 있고, 또 동일 반응 단계에서 함께 실시할 수도 있다. 동일 반응 단계에서 함께 실시하는 것이 보다 편리하다.
도 5는 본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용한 소코로나바이러스에 대한 검출 민감도를 조사한 전기영동 사진이다. 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 0은 BCoV 1× 106.0TCID50/ml, 레인 -1은 BCoV 1× 105.0TCID50/ml, 레인 -2는 BCoV 1× 104.0TCID50/ml, 레인 -3은 BCoV 1× 103.0TCID50/ml, 레인 -4는 BCoV 1× 102.0TCID50/ml, 레인 -5는 BCoV 1× 101.0TCID50/ml이다.
도 6은 본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용한 소로타바이러스에 대한 검출 민감도를 조사한 전기영동 사진이다. 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 0은 BRV 1× 104.0TCID50/ml, 레인 -1은 BRV 1× 103.0TCID50/ml, 레인 -2는 BRV 1× 102.0TCID50/ml, 레인 -3은 BRV 1× 101.0TCID50/ml, 레인 -4는 BRV 0.1× 101TCID50/ml이다.
도 7은 본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용한 소바이러스성설사병바이러스에 대한 검출 민감도를 조사한 전기영동 사진이다. 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 1은 BVDV 1× 106.0TCID50/ml, 레인 2는 BVDV 1× 105.0TCID50/ml, 레인 3은 BVDV 1× 104.0TCID50/ml, 레인 4는 BVDV 1× 103.0TCID50/ml, 레인 5는 BVDV 1× 102.0TCID50/ml, 레인 6은 BVDV 1× 101.0TCID50/ml이다.
도 8은 본 발명 대한 유효성을 조사해 본 결과로서 소에서 설사 및 유산을 일으키는 다른 바이러스와의 교차반응 여부를 확인한 결과이다. 레인 N은 음성 기준, 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 1은 아카바네 바이러스(Akabane virus), 레인 2는 아이노바이러스(Ainovirus), 레인 3은 슈잔바이러스(Chuzanvirus), 레인 4는 이바라키바이러스(Ibarakivirus), 레인 5는 소 엔테로바이러스(Bovine enterovrius)이다. 레인 P는 양성 기준으로서 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러 스성설사병바이러스가 모두 검출된 시료이다.
도 9는 본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용하여 실시한 다중 PCR 방법으로 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스가 모두 포함된 시료에서 상기 3 가지의 바이러스를 검출한 결과이다. 레인 M은 DNA 크기 마커를 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용하여 실시한 다중 PCR 방법으로 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스 중 2 가지씩이 포함된 시료에서 해당 바이러스들을 검출한 결과이다. 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 1은 BCoV + BVDV, 레인 2는 BRV + BVDV, 레인 3은 BCoV + BVDV, 레인 4는 BVDV, 레인 5는 BVDV, 레인 6은 BRV + BVDV이다.
도 11은 본 발명에 따른 페스티바이러스에 대한 유효성을 조사해 본 결과이다. 도 11-1은 BVDV-1형, 도 11-2는 BVDV-2형, 도 11-3은 돼지콜레라바이러스 및 보더바이러스에 대한 시험 결과로서 이는 페스티바이러스 1형, 2형, 3형, 및 4형을 모두 검출할 수 있음을 보여준다. 도 11-1의 레인 N은 음성 기준, 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 1은 BVDV-1형 NADL주, 레인 2는 BVDV-1형 Singer주, 레인 3은 BVDV-1형 SO주, 레인 4는 BVDV-1형 Nose주, 레인 5는 BVDV-1형 KD26-1주, 레인 6은 BVDV-1형 32-9F주이다. 레인 P는 양성 기준이다; 도 11-2의 레인 N은 음성 기준, 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 1은 BVDV-2형 95002주, 레인 2는 BVDV-2형 95411주, 레인 3은 BVDV-2형 T20주, 레인 4는 BVDV2주, 레인 5는 BVDV-2형 PHG주이다. 레인 P는 양성 기준이다; 도 11-3의 레인 N은 음성 기준, 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 1은 CSF-LOM주, 레인 2는 BDV-Averyon주, 레인 3은 BDV-Lyon2주이다. 레인 P는 양성 기준이다.
도 12는 본 발명에 따른 소코로나바이러스에 대한 유효성을 조사해 본 결과이다. BCoV 표준주, 국내 분리주, 및 백신주에 대해 공히 모두 검출할 수 있음을 보여준다. 레인 N은 음성 기준, 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 1은 BCoV KWD9주, 레인 2는 BCoV KWD16주, 레인 3은 BCoV KCD9주, 레인 4는 BCoV 0516주, 레인 5는 BCoV MLV주, 레인 6은 BCoV NCDV주, 레인 7은 BCoV Mebus주, 레인 8은 BCoV A4주, 레인 9는 BCoV BC94주이다. 레인 P는 양성 기준이다.
도 13은 본 발명에 따른 로타바이러스에 대한 유효성을 조사해 본 결과로서, 소 및 돼지의 로타바이러스의 적용 결과이다. 표준주, 국내 분리주, 및 백신주에 대하여 공히 모두 검출이 가능함을 보여준다. 레인 N은 음성 기준, 레인 M은 DNA 크기 마커이다. 레인 1에서 레인 9는 소로타바이러스에 대한 결과로서, 레인 1은 04-56-5-1-2, 레인 2는 04-56-9-1-2, 레인 3은 04-56-285-1-2, 레인 4는 04-56-49-1-2, 레인 5는 BRV-A, 레인 6은 BRV0418, 레인 7은 BRV-VMRI, 레인 8은 BRV288, 레인 9는 BRV-P44이다. 레인 10에서 레인 12는 돼지로타바이러스에 대한 결과로서, 레인 10은 PRV-OSU, 레인 11은 PRV-Gotfied, 레인 12는 PRV-175이다. 레인 P는 양성 기준이다.
도 14는 본 발명을 임상 시료에 적용한 결과이다. 도 14-1은 야외임상 시료 12건에 대한 소코로나바이러스 검사결과로 2건이 양성으로 나타났으며, 도 14-2는 야외임상 시료 12건에 대한 소로타바이러스 검사결과로 9건이 양성으로 나타났으 며, 도 14-3은 야외임상 시료 12건에 대한 소바이러스성설사병바이러스 검사결과로 8건이 양성으로 나타났다. 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 1에서 레인 12는 야외임상샘플, 레인 N은 음성 기준이다.
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Claims (17)

  1. 소코로나바이러스의 적혈구응집 에스테라제(hemagglutinin esterase)를 코딩하는 유전자에 해당하는 서열을 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 소코로나바이러스 검출용 프라이머, 로타바이러스의 캡시드 유전자 부위를 코딩하는 유전자 중 VP7에 해당하는 서열을 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 로타바이러스 검출용 프라이머 및 소바이러스성설사병바이러스의 5’-UTR 부위에 해당하는 서열을 증폭할 수 있는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열로 구성되는 소바이러스성설사병 바이러스 검출용 프라이머로 구성되는, 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 로타바이러스는 소로타바이러스, 돼지로타바이러스, 개로타바이러스 및 말로타바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 소바이러스성설사병바이러스는 소바이러스성설사병바이러스 1형(Bovine viral diarrhea virus type 1; pestivirus type 1), 소바이러스성설사병바이러스 2형(Bovine viral diarrhea virus type 2; pestivirus type 2)와 보더바이러스(Border disease virus; pestivirus type 3) 및 돼지콜레라바이러스(Swine fever virus; pestivirus type 2)를 포함하는 페스티바이러스(Pestivirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머.
  10. 제 1 항의 프라이머를 포함하는 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스 동시 검출용 PCR 키트.
  11. 삭제
  12. 제 1 항의 프라이머를 포함하는 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스 관련 질환 동시 진단용 키트.
  13. 삭제
  14. 제 1 항의 프라이머를 이용하는 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시검출법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 동시검출법은,
    (1) RNA를 추출하는 단계;
    (2) 소코로나바이러스, 로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 서열번호 6의 특이 프라이머들로부터 구성되어지는 프라이머 조합 및 상기 추출된 RNA를 이용하여 역전사 반응 및 PCR을 실시하는 단계;
    (3) 상기 PCR 산물을 분석하는 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는, 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시검출법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 로타바이러스는 소로타바이러스, 돼지로타바이러스, 개로타바이러스 및 말로타바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시검출법.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 소바이러스성설사병바이러스는 소바이러스성설사병바이러스 1형, 소바이러스성설사병바이러스 2형와 보더바이러스 및 돼지콜레라바이러스를 포함하는 페스티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스의 동시검출법.
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