CN103602757A - 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用 - Google Patents

口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103602757A
CN103602757A CN201310385366.0A CN201310385366A CN103602757A CN 103602757 A CN103602757 A CN 103602757A CN 201310385366 A CN201310385366 A CN 201310385366A CN 103602757 A CN103602757 A CN 103602757A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
seq
foot
pcr
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310385366.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103602757B (zh
Inventor
王乃福
吴冬雪
王建华
陈本龙
黄晨
董志珍
赵祥平
王玉玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Original Assignee
Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center filed Critical Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority to CN201310385366.0A priority Critical patent/CN103602757B/zh
Publication of CN103602757A publication Critical patent/CN103602757A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103602757B publication Critical patent/CN103602757B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请基于口蹄疫病毒3D蛋白编码基因，水泡性口炎病毒N蛋白编码基因和猪水泡病病毒VP1蛋白编码基因的高保守区设计特异性引物和探针，建立了同时检测3种动物病毒的多重荧光RT-PCR检测方法。本方法可在1h内检测102个拷贝的含靶扩增序列质粒，灵敏度高，特异性好，可实现病毒单一感染或多种病毒混合感染荧光定量RT-PCR的快速、高通量检测。

Description

口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光RT-PCR检测方法的建立及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术应用领域，尤其是用于口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的同时检测与鉴定。 
背景技术
在过去的10多年里，在政府推动、加工和消费需求拉动下，中国奶牛业取得长足的发展，由一个贫奶国家逐步发展成一个奶业大国。首先进境奶牛数量逐年增多。自1997年至2007年中国奶牛存栏量增长了4.84倍；2009年全年进口奶牛4.5万头，2010年进口奶牛8万头，2011年进口奶牛10万头。其次国内奶牛规模化养殖程度大幅提高。2010年全国百头以上奶牛养殖存栏量占全国的28.48％，比2008年提高8.7个百分点，越来越多的以现代牧场为代表的万头以上的超大规模牧场也相继建成并投入使用。随着奶牛的大量进口、国内流通及奶牛饲养规模的不断扩大，给动物疫病防治带来前所未有的压力。 
口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病都是猪的重要病毒性传染病，以口和蹄部产生水疱性损伤为特征，其临床症状极为相似，引起严重的公共卫生问题，均被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。3种水疱性疾病在临床症状上无法区别，必须通过实验室检测进行鉴别诊断。目前，对3种疫病的诊断多采用病原分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长，也可使用PCR技术进行检测，但尚无稳定的操作性强的能同时鉴别3种病毒的方法。为此，有必要建立能同时进行3种疫病快速检测方法，以便动物疫情爆发时尽快采取有效的针对性防控措施。本研究针对口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒分别设计多对特异性引物及探针，经过前期试验筛选后选取灵敏度和特异性良好的引物及探针组合，优化反应条件和引物探针应用浓度，最终实现经过一次多重荧光RT-PCR试验同时鉴别检测三种动物疫病的目的。 
发明内容
我们成功设计和合成了针对口蹄疫病毒3D蛋白、水泡性口炎病毒N蛋白、猪水疱病病毒VP1蛋白的相应基因的特异性引物和探针。基于此引物和探针，我们建立了多重荧光RT-PCR检测方法。该方法通过对多种相关病毒的检测、标准曲线的构建、特异性实验与灵敏度试验等，说明该方法具有较高的特异性、灵敏度、稳定性和高效性。 
在本发明的第一方面，提供了一种针对口蹄疫病毒3D蛋白、水泡性口炎病毒N蛋白、 猪水疱病病毒VP1蛋白相应基因的的特异性引物和探针序列，如SEQ NO：1至9所示。 
在本发明的第二方面，提供一种同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面所述引物和探针。 
在一个实施方案中，所述试剂盒包括以下成份： 
1)SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8所示的引物； 
2)SEQ ID NO：3、6、9所示的探针； 
以及多重荧光PCR缓冲液、氯化镁、dNTP、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶和水。所述引物和所述探针在所述扩增检测中的终浓度均具体为0.2uM-0.4uM。 
其特征在于如SEQ NO：3所示的口蹄疫病毒3D蛋白的基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：6所示的水泡性口炎病毒N蛋白的基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：9所示的猪水疱病病毒VP1蛋白的基因探针5’端由HEX标记，3’端由BHQ2标记。 
所述试剂盒在检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病中的应用，其特征在于可以检测到102个拷贝的病毒。 
在本发明的第三方面，提供一种同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的PCR扩增方法，该方法使用第二方面所述的试剂盒。 
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤： 
1)提取病毒RNA； 
2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的PCR反应预混液，混匀后短暂离心分装到PCR管中； 
3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增； 
4)收集荧光信号，检测Ct值。 
所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下： 
成分 用量(μL)
PCR缓冲液(10×) 5
氯化镁(25m mol／L) 5
dNTPs(10mmol／L) 5
SEQ ID NO：1、2(15μmol／L) 各0.75
SEQ ID NO：4、5(15μmol／L) 各1
SEQ ID NO：7、8(15μmol／L) 各1
[0021] 
SEQ ID NO：3(10μmol／L) 1
SEQ ID NO：6(10μmol／L) 1
SEQ ID NO：9(10μmol／L) 1
Taq DNA聚合酶(5U／μL) 1
AMV反转录酶(5U／μL) 1
模板 各4
ddH2O 12.5
总计 50
扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。 
在本发明的第四方面，提供第一方面所述引物和探针在制备口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的检测试剂中的应用。 
附图说明
图1口蹄疫荧光定量RT-PCR检测 
图2标准质粒荧光RT-PCR结果 
图3构建的标准曲线 
图4口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR灵敏度 
图5水泡性口炎病毒荧光定量RT-PCR检测 
图6标准质粒荧光PCR结果 
图7构建的标准曲线 
图8水泡性口炎病病毒荧光RT-PCR灵敏度 
图9猪水泡病病毒荧光定量RT-PCR检测 
图10标准质粒荧光PCR结果 
图11构建的标准曲线 
图12猪水泡病病毒荧光RT-PCR灵敏度 
图13多重荧光RT-PCR检测三种病毒 
图14多重荧光RT-PCR检测混合阳性样本 
具体实施方式
1材料和仪器 
1.1毒株和质粒 
灭活口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型、Asia I型病毒液来自兰州兽医研究所，口蹄疫灭活疫苗为中牧实业股份有限公司出品；猪水泡病病毒反向间接血凝标准抗原，由中国农业科学院兰州兽医研究所出品；灭活水泡性口炎病毒液来自云南出入境检验检疫局技术中心；含扩增靶基因的阳性重组质粒由本实验室构建；赤羽病毒、牛白血病病毒、牛病毒性腹泻病毒、及副结核分枝杆菌由本实验室分离保存。480份奶牛及种猪血清为天津口岸送检。 
1.2主要试剂 
总RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒；
Figure BSA0000094519920000042
Taq DNA聚合酶、
Figure BSA0000094519920000043
定量PCR SuperMix-UDG with ROX、M-MULV反转录酶、Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂；大肠杆菌TOP10感受态细胞；MgSO4、dNTPs、DNA Marker。 
1.3主要仪器 
ABI 
Figure BSA0000094519920000044
7000HT荧光定量仪器、ABI 
Figure BSA0000094519920000045
7500HT荧光定量仪器、5417REPPENDORF冷冻离心机。PTC-200PCR扩增仪、HEAT TECH26恒温水浴箱，SIGMA30-3K台式低温冷冻离心机。 
2实验方法 
2.1引物设计与合成 
从GenBank数据库收集口蹄疫病毒(O型、A型、Asia I型)、水泡性口炎病毒(新泽西型和印第安型)及猪水疱病病毒基因序列，应用生物学软件进行序列比对，选取口蹄疫病毒3D蛋白编码基因，水泡性口炎病毒N蛋白编码基因及猪水疱病病毒VP1蛋白编码基因为扩增靶序列，针对靶序列分别设计引物和探针，所有探针、引物的合成修饰由英俊公司完成，序列见表1。 
表1引物和探针序列 
Figure BSA0000094519920000041
Figure BSA0000094519920000051
2.2样品RNA的提取 
取经DEPC水处理过的EP管，加入1mL TRIzol和200μL灭活病毒液或灭活疫苗样品，混匀后室温放置5min；加入200μL氯仿，用力摇晃30s，室温静置3min，4℃离心15min，得到分层液；取上层液移入干净的EP管，加入500μL异丙醇，-20℃静置30min，4℃离心15min；移去上层悬液；加入1mL75％的DEPC乙醇，涡旋振荡，4℃离心10min；去上清，空气中干燥5min；向试管中加入50μL DEPC水，-20℃备用。 
2.3单一荧光RT-PCR方法的建立 
2.3.1口蹄疫病毒荧光RT-PCR方法的建立 
2.3.1.1反应体系和反应条件 
针对口蹄疫病毒3D蛋白编码基因序列，设计并合成引物和探针。经过反应条件摸索，建立反应体系，反应体系共50μL，具体如下表2. 
表2.口蹄疫病毒荧光RT-PCR反应体系 
成分 用量(μL)
PCR缓冲液(10×) 5
氯化镁(25m mol／L) 5
dNTPs(10mmol／L) 6
上游引物P1-3D(15μmol／L) 1
下游引物P2-3D(15μmol／L) 1
探针(10μmol／L) 1
Taq DNA聚合酶(5U／μL) 1
AMV反转录酶(5U／μL) 1
模板 5
ddH2O 24
总计 50
[0059] 反应条件为： 
50℃，2min；1个循环； 
95℃，2min；1个循环； 
95℃，15s；58℃，35s；40个循环。 
2.3.1.2Taqman荧光PCR反应及结果判定 
将反应体系置于ABI 
Figure BSA0000094519920000061
7000HT，反应过程中，ABI 
Figure BSA0000094519920000062
7000HT将会在每一个循环的退火延伸间断的收集荧光信号，以监测是否扩增反应的发生。通常将3～15循环的荧光信号值定为基线，基线标准差的10倍定义为阈值，荧光信号值达到阈值时的PCR循环数定义为Ct值。当Ct值在10～35之间时，被认为是可信的，判定结果为阳性。 
2.3.1.3定量用标准品的制备 
利用针对口蹄疫病毒3D蛋白编码基因特异性引物，将病毒RNA在50μL体系中进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T easy载体中并转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，从纯化扩增的重组菌中提取质粒，经试剂盒纯化，质粒浓度用紫外反光光度计通过OD260测定，根据阿佛加德罗常数将浓度转换为基因拷贝数。质粒拷贝数计算公式如下： 
拷贝数(拷贝／μL)=[质粒浓度(g／μL)×6.02×1023)／[碱基对(bp)×660(g/mo1](公式1-1)。 
根据公式1-1，计算得出重组质粒pGEMT-3D拷贝数为1.21×1010拷贝／μL。 
重组质粒DNA提取过程按照试剂盒说明书操作，具体如下： 
(1)吸取200μL细菌悬液，加入20μL蛋白酶K，室温放置5min。 
(2)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 
(3)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀15s，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管内)，12，000r／min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 
(5)向吸附柱CB3中加入200μL缓冲液GD，12，000r／min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 
(6)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12，000r／min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 
(7)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12，000r／min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 
(8)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000r／min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以晾干吸附材料中的残余漂洗液。 
(9)将吸附柱CB3转移一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12，000r／min离心2min，将溶液收集到离心管中，备用。 
2.3.1.4口蹄疫病毒荧光RT-PCR标准曲线 
将定量后的质粒进行10倍梯度稀释，质粒拷贝数浓度梯度1.21×101～1.21×1010拷贝／μL。将5个浓度梯度(1.21×102～1.21×106拷贝／μL)用于荧光定量RT-PCR试验，以建立检测的标准曲线。 
2.3.1.5特异性试验 
以口蹄疫病毒(FMDV)RNA为阳性对照，以未感染口蹄疫病毒的细胞提取的基因组RNA作为阴性对照，以水作为空白对照，其他病毒如赤羽病毒RNA、牛白血病病毒cDNA、牛病毒性腹泻病毒RNA、水泡性口炎病毒RNA、猪水泡病病毒RNA及副结核分枝杆菌DNA来鉴定荧光定量RT-PCR检测方法的特异性。 
2.3.1.6灵敏度试验 
将质粒拷贝数浓度梯度1.21×101～1.21×106拷贝／μL用于荧光定量RT-PCR试验，获得检测的灵敏度。 
2.3.2水泡性口炎病毒荧光RT-PCR方法的建立 
2.3.2.1反应体系和反应条件 
针对水泡性口炎病毒N蛋白编码基因序列，设计并合成引物和探针，经过反应条件摸索，建立反应体系，反应体系共50μL，具体如下表3. 
表3.水泡性口炎病毒荧光RT-PCR反应体系 
成分 用量(μL)
PCR缓冲液(10×) 5
氯化镁(25m mol／L) 5
dNTPs(10mmol／L) 6
上游引物P3-N(15μmol／L) 1
下游引物P4-N(15μmol／L) 1
探针(10μmol／L) 1
Taq DNA聚合酶(5U／μL) 1
AMV反转录酶(5U／μL) 1
模板 5
ddH2O 24
[0090] 
总计 50
反应条件为： 
50℃，2min；1个循环； 
95℃，2min；1个循环； 
95℃，15s；60℃，30s；40个循环。 
2.3.2.2Taqman荧光PCR反应及结果判定 
将反应体系置于ABI 7500HT，反应过程中，ABI 
Figure BSA0000094519920000082
7500HT将会在每一个循环的退火延伸间断的收集荧光信号，以监测是否扩增反应的发生。通常将3～15循环的荧光信号值定为基线，基线标准差的10倍定义为阈值，荧光信号值达到阈值时的PCR循环数定义为Ct值。当Ct值在10～35之间时，被认为是可信的，判定结果为阳性。 
2.3.2.3定量用标准品的制备 
利用针对水泡性口炎病毒N蛋白编码基因特异性引物，将病毒RNA在50μL体系中进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T easy载体中并转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，从纯化扩增的重组菌中提取质粒，经试剂盒纯化，质粒浓度用紫外反光光度计通过OD260测定，根据阿佛加德罗常数将浓度转换为基因拷贝数。 
根据公式1-1，计算得出重组质粒pGEM T-N拷贝数为2.14×1010拷贝／μL。 
重组质粒提取过程同上述口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR方法建立部分2.3.1.3。 
2.3.2.4水泡性口炎病毒荧光RT-PCR标准曲线 
将定量后的质粒进行10倍梯度稀释，质粒拷贝数浓度梯度2.14×101～2.14×1010拷贝／μL。将6个浓度梯度(2.14×105～2.14×1010拷贝／μL)用于荧光定量RT-PCR试验，以建立检测的标准曲线。 
2.3.2.5特异性试验 
以水泡性口炎病毒(VSV)RNA为阳性对照，以未感染水泡性口炎病毒的细胞提取的基因组RNA作为阴性对照，以水作为空白对照，其他病毒如赤羽病毒RNA、牛白血病病毒cDNA、牛病毒性腹泻病毒RNA、及副结核分枝杆菌DNA、口蹄疫病毒RNA、猪水泡病病毒RNA鉴定荧光定量RT-PCR检测方法的特异性。 
2.3.2.6灵敏度试验 
将质粒拷贝数浓度梯度2.14×101～2.14×106拷贝／μL用于荧光定量RT-PCR试验，获得检测的灵敏度。 
2.3.3猪水泡病病毒荧光RT-PCR方法的建立 
2.3.3.1反应体系和反应条件 
针对猪水泡病病毒VP1蛋白编码基因序列，合成引物和探针，经过反应条件摸索，建立反应体系，反应体系共50μL，具体如下表4. 
表4.猪水泡病病毒荧光RT-PCR反应体系 
成分 用量(μL)
PCR缓冲液(10×) 5
氯化镁(25m mol／L) 5
dNTPs(10mmol／L) 6
上游引物P5-VP1(15μmol／L) 1
下游引物P6-VP1(15μmol／L) 1
探针(10μmol／L) 1
Taq DNA聚合酶(5U／μL) 1
AMV反转录酶(5U／μL) 1
模板 5
ddH2O 24
总计 50
反应条件为： 
50℃，2min；1个循环； 
95℃，2min；1个循环； 
95℃，15s；58℃，40s；40个循环。 
2.3.3.2Taqman荧光PCR反应及结果判定 
将反应体系置于ABI 7000HT，反应过程中，ABI 7000HT将会在每一个循环的退火延伸间断的收集荧光信号，以监测是否扩增反应的发生。通常将3～15循环的荧光信号值定为基线，基线标准差的10倍定义为阈值，荧光信号值达到阈值时的PCR循环数定义为Ct值。当Ct值在10～35之间时，被认为是可信的，判定结果为阳性。 
2.3.3.3定量用标准品的制备 
利用针对猪水泡病病毒VP1蛋白编码基因特异性引物，将病毒RNA在50μL体系中进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T easy载体中并转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，从纯化扩增的重组菌中提取质粒，经试剂盒纯化，质粒浓度用紫外反光光度计通过OD260测定，根据阿佛加德罗常数将浓度转换为基因拷贝数。 
根据公式1-1，计算得出重组质粒pGEM T-VP1拷贝数为1.68×1010拷贝／μL。 
重组质粒提取过程同上述口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR方法建立部分2.3.1.3。 
2.3.3.4猪水泡病病毒荧光RT-PCR标准曲线 
将定量后的质粒进行10倍梯度稀释，质粒拷贝数浓度梯度1.68×101～1.68×1010拷贝／μL。将6个浓度梯度(1.68×105～1.68×1010拷贝／μL)用于荧光定量RT-PCR试验，以建立检测的标准曲线。 
2.3.3.5特异性试验 
方法同口蹄疫病毒特异性试验，其他病毒如赤羽病毒RNA、牛白血病病毒cDNA、牛病毒性腹泻病毒RNA、及副结核分枝杆菌DNA、水泡性口炎病毒RNA、口蹄疫病毒RNA鉴定荧光定量RT-PCR检测方法的特异性。 
2.3.3.6灵敏度试验 
将质粒拷贝数浓度梯度1.68×101～1.68×106拷贝／μL用于荧光定量RT-PCR试验，获得检测的灵敏度。 
2.4多重荧光定量RT-PCR方法的建立 
将3对引物和3条探针组合起来，模板采用等比例混合的口蹄疫病毒RNA、水泡性口炎病毒RNA、猪水泡病病毒RNA，经过对引物、探针、dNTP、Mg2+浓度、Taq酶用量和反应条件进行优化，建立口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、猪水泡病病毒多重荧光定量RT-PCR检测方法。 
2.5多重荧光定量RT-PCR方法的灵敏度试验 
分别以口蹄疫病毒RNA、水泡性口炎病毒RNA、猪水泡病病毒RNA为模版，应用所建立的多重荧光定量RT-PCR方法进行检测，方法同单一荧光定量RT-PCR方法，进行灵敏度试验。 
2.6样本检测 
收集天津口岸进口奶牛及种猪样本480份，应用本研究所建立的方法及实验室常用的ELISA方法同时进行检测，考察两种方法的一致性。另应用本研究所建立方法检测口蹄疫(O型、A型、Asia I型)灭活病毒液各1份，水泡性口炎病毒(新泽西型)灭活病毒液及猪水疱病病毒VP1基因阳性重组质粒(人工合成)样本。 
实施例 
单一病毒荧光RT-PCR检测方法的建立 
实施例1口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立 
1.1方法建立及特异性 
针对口蹄疫病毒3D蛋白编码基因序列，合成引物和探针。经过反应条件摸索，建立反 应体系，反应体系共50μL。以口蹄疫病毒(FMDV)RNA为阳性对照，以未感染口蹄疫病毒的细胞提取的基因组RNA作为阴性对照，以水作为空白对照，其他病毒如赤羽病毒RNA、牛白血病病毒cDNA、牛病毒性腹泻病毒RNA、水泡性口炎病毒RNA、猪水泡病病毒RNA及副结核分枝杆菌DNA来鉴定荧光定量RT-PCR检测方法的特异性。检测结果见附图1. 
1.2标准曲线的建立 
根据系列稀释(1.21×106～1.21×1010个拷贝)不同浓度的质粒标准品在美国ABI公司的7000型荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR，反应数据被ABI7000型PCR仪收集并储存于计算机中，反应结束后该电脑根据定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。以1.21×106～1.21×1010拷贝做标准曲线时，线性关系良好(见附图2)，扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系R2为0.99，标准曲线回归方程y=-2.9931gx+41.718，其中y为Ct，x为质粒模板的拷贝数(见附图3)。通过标准曲线方程和样品的CT值便可计算出样品中所测基因的拷贝数。 
1.3灵敏度试验 
将质粒拷贝数浓度梯度1.21×101～1.21×106拷贝／μL用于荧光定量RT-PCR试验，获得检测的灵敏度。由附图4可见口蹄疫病毒检测灵敏度为101个质粒拷贝数。 
表5口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR灵敏度试验 
质粒拷贝数(拷贝／μL) 荧光PCR检测结果(Ct值)
1.21×106 28.9
1.21×105 32.4
1.21×104 35.4
1.21×103 37.3
1.21×102 38.2
1.21×101 40.28
1.21×100 N
实施例2水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法的建立 
2.1方法建立及特异性 
针对水泡性口炎病毒N蛋白编码基因序列，设计合成引物和探针。经过反应条件摸索，建立反应体系，反应体系共50μL。以水泡性口炎病毒(VSV)RNA为阳性对照，以未感染 水泡性口炎病毒的细胞提取的基因组RNA作为阴性对照，以水作为空白对照，其他病毒如赤羽病毒RNA、牛白血病病毒cDNA、牛病毒性腹泻病毒RNA、口蹄疫病毒RNA、猪水泡病病毒RNA及副结核分枝杆菌DNA来鉴定荧光定量RT-PCR检测方法的特异性。检测结果见附图5。 
2.2标准曲线的建立 
根据系列稀释(2.14×103～2.14×1010个拷贝)不同浓度的质粒标准品在美国ABI公司的7000型荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR(见附图6)，反应数据被ABI7000型PCR仪收集并储存于计算机中，反应结束后该电脑根据定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系R2为0.99，标准曲线回归方程y=-2.8401gx+40.800，其中y为Ct，x为质粒模板的拷贝数(见附图7)。通过标准曲线方程和样品的CT值便可计算出样品中所测基因的拷贝数。 
2.3灵敏度试验 
将质粒拷贝数浓度梯度(2.14×101～2.14×106拷贝／μL)用于荧光定量RT-PCR试验，获得检测的灵敏度。由附图8可见水泡型口炎病毒检测灵敏度为102个质粒拷贝数。 
表6水泡型口炎病毒检测灵敏度 
质粒拷贝数(拷贝／μL) 荧光PCR检测结果(Ct值)
2.14×106 25.44
2.14×105 29.76
2.14×104 33.13
2.14×103 38.20
2.14×102 42.37
2.14×101 N
实施例3猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法的建立 
3.1方法建立及特异性 
针对猪水泡病病毒VP1蛋白编码基因序列，合成引物和探针，经过反应条件摸索，建立反应体系，反应体系共50μL。以水作为空白对照，其他病毒如赤羽病毒RNA、牛白血病病毒cDNA、牛病毒性腹泻病毒RNA、口蹄疫病毒RNA、水泡型口炎病毒RNA及副结核分枝 杆菌DNA来鉴定荧光定量RT-PCR检测方法的特异性。检测结果见附图9。 
3.2标准曲线的建立 
根据系列稀释(1.68×106～1.68×1010个拷贝)不同浓度的质粒标准品在美国ABI公司的7000型荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR(见附图10)，反应数据被ABI7000型PCR仪收集并储存于计算机中，反应结束后该电脑根据定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系R2为0.99，标准曲线回归方程y=-2.69X+42.2，其中y为Ct，x为质粒模板的拷贝数(见附图11)。通过标准曲线方程和样品的CT值便可计算出样品中所测基因的拷贝数。 
3.3灵敏度试验 
将质粒拷贝数浓度梯度(1.68×101～1.68×106拷贝/μL)用于荧光定量RT-PCR试验，获得检测的灵敏度，结果见附图12。由附图12可见猪水泡病病毒检测灵敏度为102个质粒拷贝数。 
实施例4多重荧光RT-PCR检测方法的建立 
将3对引物和3条探针组合起来，经过对引物、探针、dNTP、Mg2+浓度、Taq酶用量和反应条件进行优化，最终确定50μL反应体系中各成分见下表6。 
表7.多重荧光RT-PCR反应体系 
成分 用量(μL)
PCR缓冲液(10×) 5
氯化镁(25m mol／L) 5
dNTPs(10mmol／L) 5
引物FMDV-3D(15μmol／L) 各0.75
引物VSV-N(15μmol／L) 各1
引物SVDV-VP1(15μmol／L) 各1
探针FMDV(10μmol／L) 1
探针VSV(10μmol／L) 1
探针SVDV(10μmol／L) 1
Taq DNA聚合酶(5U／μL) 1
AMV反转录酶(5U／μL) 1
[0165] 
模板 各4
ddH2O 12.5
总计 50
优化后确定的反应条件为： 
50℃，2min；1个循环； 
95℃，2min；1个循环； 
95℃，15s：59℃，35s；40个循环。 
对口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒RNA等比例混合模板进行多重实时荧光RT-PCR检测，能同时检测出3种动物病毒RNA(见附图13)。 
多重荧光定量RT-PCR方法的灵敏度试验 
按照方法2.3.1.6部分内容，经多次试验后，确定多重实时荧光RT-PCR方法对口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、猪水泡病病毒的最低检测限分别达到101、102、102个质粒拷贝浓度，同单一荧光定量RT-PCR方法检测低限一致。 
实施例5样本检测 
收集天津口岸进口奶牛及种猪样本480(牛血液样本400份，猪血液样本80份)，应用本研究所建立的方法及实验室常用的ELISA方法同时进行检测，从下表7可以看出，480份样本经ELISA检测全部为阴性，应用本研究建立的多重荧光RT-PCR方法检测结果也全部为阴性，与ELISA方法的一致性为100％。另应用本研究所建立方法检测口蹄疫(O型、A型、Asia I型)灭活病毒液各1份，猪水疱病病毒VP1基因阳性重组质粒(人工合成)样本，均为阳性检测结果，见附图14。 
表8多重荧光RT-PCR与ELISA方法检测结果 
Figure BSA0000094519920000141
Figure ISA0000094519940000021
Figure ISA0000094519940000031
Figure ISA0000094519940000041

Claims (8)

1.一组同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的引物和探针，其特征在于特异性引物和探针序列分别为：
1)SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8所示的引物；
2)SEQ ID NO：3、6、9所示的探针。
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于如SEQ NO：3所示的口蹄疫病毒3D蛋白的基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：6所示的水泡性口炎病毒N蛋白的基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：9所示的猪水疱病病毒VP1蛋白的基因探针5’端由HEX标记，3’端由BHQ2标记。
3.权利要求1所述的引物和探针序列在制备检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的检测试剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的检测试剂，由权利要求1或2所述的引物和探针、多重荧光PCR缓冲液、氯化镁、dNTP、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶和水组成；所述引物和所述探针在所述扩增检测中的终浓度均具体为0.2uM-0.4uM。
5.一种同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有如权利要求1所示的特异性引物和探针，其序列分别为：
1)SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8所示的引物；
2)SEQ ID NO：3、6、9所示的探针；
以及多重荧光PCR缓冲液、氯化镁、dNTP、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶和水。
6.权利要求4所述的试剂盒在检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病中的应用，其特征在于可以检测到102个拷贝的病毒。
7.一组同时检测口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病的方法，其特征在于，
1)提取病毒RNA；
2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中；
3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；
4)收集荧光信号，检测Ct值。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：
成分 用量(μL) PCR缓冲液(10×) 5
氯化镁(25m mo1／L) 5 dNTPs(10mmol／L) 5 SEQ ID NO：1、2(15μmol／L) 各0.75 SEQ ID NO：4、5(15μmol／L) 各1 SEQ ID NO：7、8(15μmol／L) 各1 SEQ ID NO：3(10μmol／L) 1 SEQ ID NO：6(10μmol／L) 1 SEQ ID NO：9(10μmo1／L) 1 Taq DNA聚合酶(5U／μL) 1 AMV反转录酶(5U／μL) 1 模板 各4 ddH2O 12.5 总计 50
扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。
CN201310385366.0A 2013-08-30 2013-08-30 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用 Expired - Fee Related CN103602757B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310385366.0A CN103602757B (zh) 2013-08-30 2013-08-30 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310385366.0A CN103602757B (zh) 2013-08-30 2013-08-30 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103602757A true CN103602757A (zh) 2014-02-26
CN103602757B CN103602757B (zh) 2015-08-12

Family

ID=50121020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310385366.0A Expired - Fee Related CN103602757B (zh) 2013-08-30 2013-08-30 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103602757B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104404170A (zh) * 2014-12-10 2015-03-11 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫病毒通用、a型二重实时荧光定量pcr检测引物及探针
CN105018641A (zh) * 2015-05-28 2015-11-04 四川农业大学 检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的基因芯片以及试剂盒
CN105420409A (zh) * 2015-10-30 2016-03-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于检测猪水泡病病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法
CN105671201A (zh) * 2016-03-03 2016-06-15 广西壮族自治区兽医研究所 用于鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用
CN106929605A (zh) * 2017-04-14 2017-07-07 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种能同时检测和鉴别口蹄疫和水泡性口炎的检测试剂盒及引物和探针
CN107326100A (zh) * 2017-07-17 2017-11-07 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN108070677A (zh) * 2017-12-07 2018-05-25 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法
CN108384893A (zh) * 2018-05-03 2018-08-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用
CN110358864A (zh) * 2019-07-24 2019-10-22 金宇保灵生物药品有限公司 Sva、fmdv、svdv和vsv的一步法多重实时荧光定量pcr检测引物和探针

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002095074A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 Tetracore, Inc. Foot and mouth disease virus diagnostic and methods
CN1840703A (zh) * 2006-01-06 2006-10-04 云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 动物水泡性疾病多重rt－pcr鉴别检测试剂及制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002095074A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-28 Tetracore, Inc. Foot and mouth disease virus diagnostic and methods
CN1840703A (zh) * 2006-01-06 2006-10-04 云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 动物水泡性疾病多重rt－pcr鉴别检测试剂及制备方法和应用

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104404170B (zh) * 2014-12-10 2016-06-29 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫病毒通用、a型二重实时荧光定量pcr检测引物及探针
CN104404170A (zh) * 2014-12-10 2015-03-11 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫病毒通用、a型二重实时荧光定量pcr检测引物及探针
CN105018641A (zh) * 2015-05-28 2015-11-04 四川农业大学 检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的基因芯片以及试剂盒
CN105420409A (zh) * 2015-10-30 2016-03-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于检测猪水泡病病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法
CN105671201B (zh) * 2016-03-03 2019-04-02 广西壮族自治区兽医研究所 用于鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用
CN105671201A (zh) * 2016-03-03 2016-06-15 广西壮族自治区兽医研究所 用于鉴定口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的引物组合及其应用
CN106929605A (zh) * 2017-04-14 2017-07-07 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种能同时检测和鉴别口蹄疫和水泡性口炎的检测试剂盒及引物和探针
CN106929605B (zh) * 2017-04-14 2020-12-25 中国海关科学技术研究中心 一种能同时检测和鉴别口蹄疫和水泡性口炎的检测试剂盒及引物和探针
CN107326100A (zh) * 2017-07-17 2017-11-07 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN108070677A (zh) * 2017-12-07 2018-05-25 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法
CN108070677B (zh) * 2017-12-07 2019-12-03 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法
CN108384893A (zh) * 2018-05-03 2018-08-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用
CN110358864A (zh) * 2019-07-24 2019-10-22 金宇保灵生物药品有限公司 Sva、fmdv、svdv和vsv的一步法多重实时荧光定量pcr检测引物和探针

Also Published As

Publication number Publication date
CN103602757B (zh) 2015-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103602757B (zh) 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用
CN107513584B (zh) 一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒
CN103789451B (zh) 一种检测柯萨奇病毒a6、a10型的荧光定量试剂盒
CN101886138A (zh) 肠道病毒71型、柯萨奇病毒a16型和肠道病毒其它各亚型三色荧光rt-pcr联合检测方法及其试剂盒
CN103160615B (zh) 用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重pcr引物及其设计方法
CN110699489B (zh) 非洲猪瘟病毒cd2v基因的实时荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及方法
CN110656187B (zh) 多重raa以及多重pcr检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒及检测方法
CN105331742A (zh) 一种用于同时检测绵羊和山羊六种病毒的多重pcr试剂盒
CN100359023C (zh) 动物水泡性疾病多重rt-pcr鉴别检测试剂及制备方法和应用
CN108060269A (zh) 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用
CN102586473B (zh) 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒
KR101064866B1 (ko) 소코로나바이러스, 소로타바이러스, 및 소바이러스성설사병바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 소 등 반추류의 설사유발 바이러스 동시 검출법
CN105734158A (zh) 一种马驽巴贝斯虫病荧光pcr检测试剂盒
CN108048589A (zh) 牛双芽巴贝斯虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法
Posuwan et al. Prevalence of respiratory viruses isolated from dogs in Thailand during 2008-2009
CN101381767B (zh) 旋毛虫通用型实时荧光pcr检测方法
CN105112558B (zh) 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒
CN102367488A (zh) 肠道病毒三联实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN101724712B (zh) 动物虫媒病多重rt-pcr鉴别检测试剂及制备方法和应用
CN110564882B (zh) 一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法
CN103074429B (zh) 解脲脲原体uu检测试剂盒
CN113249517A (zh) 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒
CN110205405A (zh) 一种检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒O、A和Asial型的试剂盒及引物和探针
CN104975077B (zh) 猪源附红细胞体荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
CN103224998A (zh) 轮状病毒pcr检测试剂盒及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150812

Termination date: 20150830

EXPY Termination of patent right or utility model